CN111380968A - 一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，紫外检测器检测，检测波长为220nm～230nm，以pH值为3.0～5.5的缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，按梯度洗脱。本发明的有益效果是该方法能将奥达特罗及其工艺杂质和降解杂质有效分离和检出，专属性和灵敏度符合要求；有效控制奥达特罗含量和有关物质的水平，保证其用药有效性和安全性。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，尤其是涉及一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法。
背景技术
奥达特罗是一种新型选择性速效、长效β2-肾上腺能受体激动剂(LABA)，可迅速起效且维持24h的支气管扩张作用，全身性副作用很少。由于只需每天用药1次，故能提高患者的依从性，给以气道阻塞为特征的疾病治疗提供一种新的治疗选择。
奥达特罗在局部吸入给予后，化合物通过结合和激活β2-肾上腺素能受体发挥其药理学作用。在气道中这些受体的激活导致细胞内腺苷环化酶的刺激，一种酶介导环化-3'，5'单磷酸腺苷(cAMP)的合成。cAMP作为一种传递信使将信息传递给胞内的蛋白激酶A产生脱磷酸作用，并抑制肌球蛋白的磷酸化使肌球蛋白轻链激酶的活性降低，刺激胞内的钙离子泵，使胞内的钙离子排出细胞外、浓度下降，造成胞内粗细丝微细结构发生改变，导致肌节延长，使气道平滑肌松弛，从而达到支气管解痉的目的。用于治疗慢性阻塞性肺病(COPD)，上市剂型为喷雾剂，每天1次维持支气管扩张剂治疗气流阻塞，包括慢性支气管炎和/或肺气肿。
奥达特罗喷雾剂最早于2014年上市，目前国内外药典标准中均没有该品种的质量标准，随着药品审查的严格，对原料药及制剂中的含量和有关物质进行充分的检测是药品开发过程必须研究的，根据公司的奥达特罗合成工艺，和充分的降解试验，发现本公司奥达特罗原料药中含有的杂质包括：ZZ-1，ZZ-2，ZZ-3，ZZ-4，ZZ-5。
经过文献查询，发现文献Chromatographia(2017),80(12),1749-1760用到HPLC的方法同时检测奥达特罗、噻托溴铵和福莫特罗的含量，以及该方法用于检测奥达特罗降解试验研究；文献Asian Journal of Chemistry(2017),29(1),145-148用到HPLC方法同时检测奥达特罗和噻托溴铵的含量；这两篇文献中的方法都是侧重于奥达特罗含量的测定，我们在尝试用这两种方法检测有关物质时，发现都不能将有关物质充分检出，或者不能将有关物质进行有效分离，针对这一技术问题我们新开发了一种同时测定奥达特罗含量和有关物质的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、稳定可靠的检测奥达特罗含量和有关物质的方法，尤其适用于奥达特罗，盐酸奥达特罗原料药，含有奥达特罗的药物制剂中的含量和有关物质的检测。
本发明的技术方案是：
一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，紫外检测器检测，检测波长为220nm～230nm，以pH值为3.0～5.5的缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱，
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | A1 | B1 |
| 3-5 | A1 | B1 |
| 13-18 | A2 | B2 |
| 20-24 | A3 | B3 |
| 25-29 | A4 | B4 |
| 31-35 | A4 | B4 |
其中，
A1＝71-73％,A2＝60-62％,A3＝41-43％,A4＝9-11％；
B1＝27-29％,B2＝38-40％,B3＝57-59％,B4＝89-91％。
一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，紫外检测器检测，检测波长为220nm～230nm，以pH值为3.0～4.5的缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱，
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | A1 | B1 |
| 3 | A1 | B1 |
| 16 | A2 | B2 |
| 22 | A3 | B3 |
| 27 | A4 | B4 |
| 33 | A4 | B4 |
| 34 | A1 | B1 |
| 50 | A1 | B1 |
其中，
A1＝71-73％,A2＝60-62％,A3＝41-43％,A4＝9-11％；
B1＝27-29％,B2＝38-40％,B3＝57-59％,B4＝89-91％。
一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，紫外检测器检测，检测波长为220nm～230nm，以pH值为3.0～4.5的缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱，
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 72 | 28 |
| 3 | 72 | 28 |
| 16 | 61 | 39 |
| 22 | 42 | 58 |
| 27 | 10 | 90 |
| 33 | 10 | 90 |
一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，紫外检测器检测，检测波长为220nm～230nm，以pH值为3.0～4.5的缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱，
所用的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸-三乙胺缓冲液或甲酸盐缓冲液。
一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，所述磷酸盐缓冲液的pH值为3.0～3.5。
一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，所述磷酸盐缓冲液包括磷酸二氢钾的缓冲液或磷酸二氢钠的缓冲液。
一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，检测波长为225nm；
一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，流速为0.5～1.0ml/min。
一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，柱温为30～40℃。
一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，用于检测含有奥达特罗原料药和制剂产品。
该方法能将本品的工艺杂质和降解杂质有效分离和检出，专属性和灵敏度符合要求；有效控制本品含量和有关物质的水平，保证其用药安全性。
附图说明
图1是发明实施例1的HPLC图。
图2是发明实施例2的HPLC图。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明的技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1
空白溶液：溶剂，磷酸盐缓冲液(pH3.2)：乙腈为1:1。
系统适用性溶液：取盐酸奥达特罗对照品、ZZ-1对照品、ZZ-2对照品、ZZ-3对照品、ZZ-4对照品、ZZ-5对照品适量，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，配置成含盐酸奥达特罗对照品1.0mg/ml、ZZ-1对照品20.0μg/ml、ZZ-2对照品20.0μg/ml、ZZ-3对照品20.0μg/ml、ZZ-4对照品20.0μg/ml、ZZ-5对照品20.0μg/ml的系统适用性溶液。
按照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(150mm×4.6mm，4μm)色谱柱；以18mM磷酸二氢钾缓冲液(pH3.2)为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为225nm；柱温35℃；流速为0.7ml/min。精密量取空白溶液、系统适用性溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，按梯度进行洗脱。
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 72 | 28 |
| 3 | 72 | 28 |
| 16 | 61 | 39 |
| 22 | 42 | 58 |
| 27 | 10 | 90 |
| 33 | 10 | 90 |
| 34 | 72 | 28 |
| 50 | 72 | 28 |
系统适用性溶液的检测结果见图1，ZZ-1、ZZ-2、ZZ-3、奥达特罗、ZZ-4、ZZ-5依次出峰，相邻杂质峰与主成分之间的分离度均符合要求，具体结果见图1和表1。
表1系统适用性结果
实施例2
供试品溶液：取AD01批次的盐酸奥达特罗适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含1.0mg的溶液，作为供试品溶液。
对照品溶液：取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，加溶剂稀释定容至刻度，摇匀，作为对照溶液。
空白溶液：以溶剂为空白溶液。溶剂：磷酸盐缓冲液(pH3.2)：乙腈为1:1。
色谱条件如下：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(150nm×4.6nm，4μm)或效能相当色谱柱；以20mM磷酸二氢钾缓冲液(pH3.2)为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为225nm；柱温38℃；流速为1.0ml/min。精密量取空白溶液、对照品溶液与供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，按以下梯度进行洗脱。
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 72 | 28 |
| 3 | 72 | 28 |
| 16 | 61 | 39 |
| 22 | 42 | 58 |
| 27 | 10 | 90 |
| 33 | 10 | 90 |
| 34 | 72 | 28 |
| 50 | 72 | 28 |
供试品的检测结果见图2，ZZ-1、ZZ-2、ZZ-3、奥达特罗、ZZ-4、ZZ-5依次出峰，相邻杂质峰与主成分之间的分离度均符合要求，具体结果见下表。
| 保留时间(min) | 化合物名称 | 相对保留时间RRT | 分离度 | |
| 1 | 12.547 | ZZ-1 | 0.50 | |
| 3 | 22.595 | ZZ-3 | 0.90 | 20.05 |
| 3 | 25.218 | 奥达特罗 | 1.00 | 5.79 |
| 4 | 29.638 | ZZ-4 | 1.18 | 6.57 |
| 5 | 30.528 | ZZ-5 | 1.21 | 2.03 |
实施例3
空白溶液：溶剂，磷酸盐缓冲液(pH3.2)：乙腈为1:1。
系统适用性溶液：取盐酸奥达特罗对照品、ZZ-1对照品、ZZ-2对照品、ZZ-3对照品、ZZ-4对照品、ZZ-5对照品适量，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，配置成含盐酸奥达特罗对照品1.0mg/ml、ZZ-1对照品20.0μg/ml、ZZ-2对照品20.0μg/ml、ZZ-3对照品20.0μg/ml、ZZ-4对照品20.0μg/ml、ZZ-5对照品20.0μg/ml的系统适用性溶液。
按照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(150mm×4.6mm，4μm)色谱柱；以18mM磷酸二氢钾缓冲液(pH3.2)为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为225nm；柱温30℃；流速为0.7ml/min。精密量取空白溶液、系统适用性溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，按梯度进行洗脱。
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 71 | 29 |
| 3 | 71 | 29 |
| 16 | 60 | 40 |
| 22 | 41 | 59 |
| 27 | 9 | 91 |
| 33 | 9 | 91 |
| 34 | 71 | 29 |
| 50 | 71 | 29 |
具体结果见表2。
表2系统适用性结果
实施例4
空白溶液：溶剂，磷酸盐缓冲液(pH3.2)：乙腈为1:1。
系统适用性溶液：取盐酸奥达特罗对照品、ZZ-1对照品、ZZ-2对照品、ZZ-3对照品、ZZ-4对照品、ZZ-5对照品适量，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，配置成含盐酸奥达特罗对照品1.0mg/ml、ZZ-1对照品20.0μg/ml、ZZ-2对照品20.0μg/ml、ZZ-3对照品20.0μg/ml、ZZ-4对照品20.0μg/ml、ZZ-5对照品20.0μg/ml的系统适用性溶液。
按照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(150mm×4.6mm，4μm)色谱柱；以18mM磷酸二氢钾缓冲液(pH3.2)为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为225nm；柱温40℃；流速为0.7ml/min。精密量取空白溶液、系统适用性溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，按梯度进行洗脱。
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 73 | 27 |
| 3 | 73 | 27 |
| 16 | 62 | 38 |
| 22 | 43 | 57 |
| 27 | 11 | 89 |
| 33 | 11 | 89 |
| 34 | 73 | 27 |
| 50 | 73 | 27 |
具体结果见表3。
表3系统适用性结果
对照实施例1-1
空白溶液：溶剂，磷酸盐缓冲液(pH3.2)：乙腈为1:1。
系统适用性溶液：取盐酸奥达特罗对照品、ZZ-1对照品、ZZ-2对照品、ZZ-3对照品、ZZ-4对照品、ZZ-5对照品适量，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，配置成含盐酸奥达特罗对照品1.0mg/ml、ZZ-1对照品20.0μg/ml、ZZ-2对照品20.0μg/ml、ZZ-3对照品20.0μg/ml、ZZ-4对照品20.0μg/ml、ZZ-5对照品20.0μg/ml的系统适用性溶液。
高效液相色谱法，按照文献Chromatographia(2017),80(12),1749-1760中的高效液相色谱方法测定，采用Eurospher II C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为20mM的无水KH2PO4(包括0.2％的三乙胺)：甲醇(55:45，v/v)，流动相中磷酸盐缓冲液的pH为6，流速为1ml/min，25℃，紫外检测器波长为220nm，
含量和有关物质测定结果见下表：
| 保留时间min | 化合物名称 | 分离度 | |
| 1 | 4.637 | ZZ-1 | |
| 2 | 4.963 | ZZ-3 | ＜1.5 |
| 3 | 5.134 | ZZ-2 | ＜1.5 |
| 4 | 9.123 | 奥达特罗 | 4.85 |
| 5 | 10.568 | ZZ-4 | 1.64 |
| 6 | 10.571 | ZZ-5 | ＜1.5 |
ZZ-1和ZZ-3，ZZ-3和ZZ-2，ZZ-4和ZZ-5均不能有效的分离。
对照实施例1-2
空白溶液：溶剂，磷酸盐缓冲液(pH3.2)：乙腈为1:1。
系统适用性溶液：取盐酸奥达特罗对照品、ZZ-1对照品、ZZ-2对照品、ZZ-3对照品、ZZ-4对照品、ZZ-5对照品适量，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，配置成含盐酸奥达特罗对照品1.0mg/ml、ZZ-1对照品20.0μg/ml、ZZ-2对照品20.0μg/ml、ZZ-3对照品20.0μg/ml、ZZ-4对照品20.0μg/ml、ZZ-5对照品20.0μg/ml的系统适用性溶液。
按照文献Asian Journal of Chemistry(2017),29(1),145-148中的高效液相色谱方法测定，采用Hypersil C8柱(150mm×4.6mm，5μm)流动相为pH 4.4的磷酸盐缓冲液：甲醇(55:45，v/v)，流速为1ml/min，柱温30℃，紫外检测器波长为225nm。
含量和有关物质测定结果见下表：
| 保留时间min | 化合物名称 | 分离度 | |
| 1 | 2.563 | ZZ-1 | |
| 2 | 2.934 | ZZ-2 | ＜1.5 |
| 3 | 4.234 | ZZ-3 | 5.13 |
| 4 | 4.536 | 奥达特罗 | 1.84 |
| 5 | 4.721 | ZZ-5 | ＜1.5 |
ZZ-1和ZZ-2；ZZ-5与奥达特罗；均不能有效的分离。ZZ-4未检出。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (10)
1.一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，其特征在于：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，紫外检测器检测，检测波长为220nm～230nm，以pH值为3.0～5.5的缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱，
其中，
A1＝71-73％,A2＝60-62％,A3＝41-43％,A4＝9-11％；
B1＝27-29％,B2＝38-40％,B3＝57-59％,B4＝89-91％。
2.根据权利要求1所述的一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，其特征在于：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，紫外检测器检测，检测波长为220nm～230nm，以pH值为3.0～4.5的缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱，
其中，
A1＝71-73％,A2＝60-62％,A3＝41-43％,A4＝9-11％；
B1＝27-29％,B2＝38-40％,B3＝57-59％,B4＝89-91％。
3.根据权利要求1所述的一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，其特征在于：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，紫外检测器检测，检测波长为220nm～230nm，以pH值为3.0～4.5的缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱，
。
4.根据权利要求2所述的一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，其特征在于：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，紫外检测器检测，检测波长为220nm～230nm，以pH值为3.0～4.5的缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱，
。
5.根据权利要求1-4所述的一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液的pH值为3.0～3.5。
6.根据权利要求1-4所述的一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，其特征在于：所用的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸-三乙胺缓冲液或甲酸盐缓冲液。
7.根据权利要求6所述的一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾缓冲液或磷酸二氢钠缓冲液。
8.根据权利要求1-4所述的一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，其特征在于检测波长为225nm。
9.根据权利要求1-4所述的一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，其特征在于，流速为0.5～1.0ml/min。
10.根据权利要求1-4所述的一种奥达特罗含量和有关物质的检测方法，其特征在于，柱温为30～40℃。
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| 王术兰等: "梯度洗脱HPLC测定奥达特罗的有关物质", 《中国新药杂志》 * |
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