CN111386346A

CN111386346A - 修饰型转谷氨酰胺酶

Info

Publication number: CN111386346A
Application number: CN201880076952.8A
Authority: CN
Inventors: 吉田和典
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2020-07-07
Also published as: EP3719131A4; JP2025015662A; BR112020009793A2; JP7590508B2; US20240052323A1; WO2019107288A1; JPWO2019107288A1; EP3719131A1; JP2023129554A; US20200370026A1

Abstract

本发明的课题在于发现对转谷氨酰胺酶的改良有效的新的变异并提供有用性高的修饰型转谷氨酰胺酶。公开了实施了带来温度稳定性的降低、耐热性的提高、抗氧化性的提高、反应性的提高或脱酰胺酶化的氨基酸取代而成的有用性高的修饰型转谷氨酰胺酶。

Description

修饰型转谷氨酰胺酶

技术领域

本发明涉及一种转谷氨酰胺酶。详细而言，涉及一种特性发生变化或提高的修饰型转谷氨酰胺酶和其用途等。本申请要求基于2017年11月30日提出申请的日本专利申请第2017－231192号的优先权，该专利申请的全部内容通过参照而被援引。

背景技术

转谷氨酰胺酶是催化位于肽链内的谷氨酰胺残基的γ－羧基酰胺基的酰基转移反应的酶，蛋白质中的赖氨酸残基的ε－氨基作为酰基受体发挥作用时，在蛋白质分子的分子中或分子间形成ε－(γ－Gln)－Lys交联键。因此，如果利用转谷氨酰胺酶的作用，则能够进行蛋白质或肽的改性，因此，来自链霉菌属的转谷氨酰胺酶(例如参照专利文献1)被用于肉的粘结、香肠、豆腐、面包、面类的制造。另外，不限于食品领域，还研究了在纤维领域、医疗领域、香料化妆品领域等中利用转谷氨酰胺酶。随着这样的利用扩大，尝试了对转谷氨酰胺酶的特性(耐热性、比活性、底物特异性、稳定性等)进行改良(例如参照专利文献2、3、非专利文献1～4)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平4－108381号公报

专利文献2：日本特开2002－253272号公报

专利文献3：日本特开2008－194004号公报

非专利文献

非专利文献1：Marx CK et al.,J Biotechnol.2008 Sep 10；136(3-4):156-62.

非专利文献2：Tagami U et al.,Protein Eng Des Sel.2009 Dec；22(12):747-752.

非专利文献3：Yokoyama K et al.,Appl Microbiol Biotechnol(2010)87:2087-2096.

非专利文献4：Buettner K et al.,Amino Acids.2012Feb；42(2-3):987-96.

发明内容

如上所述，迄今为止，出于提高耐热性、比活性等尝试了转谷氨酰胺酶的改良，但从其有用性的高度、用途进一步扩大等理由出发，针对转谷氨酰胺酶的改良的需求依然较高。因此，本发明发现了对转谷氨酰胺酶的改良有效的新的变异，课题在于提供有用性高的修饰型转谷氨酰胺酶(变异体)和其用途等。

为了解决上述课题，本发明人等尝试了基于氨基酸取代(将特定的氨基酸残基转换为其它氨基酸)的来自茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的转谷氨酰胺酶的改良。经过反复试验最终成功确定了对其特性的变化(温度稳定性的降低、耐热性的提高、抗氧化性的提高、反应性的提高、脱酰胺酶化)有效的多个变异(氨基酸残基和取代后的氨基酸的组合)。应当注意的是，还发现了带来两个以上的特性变化的变异。进而，在实现了这样的复合性改良的变异中，还存在发生了温度稳定性的降低和抗氧化性的提高这样的也可以说是相反的特性变化的变异。该事实是极其出乎意料且超出预期的，值得一提。另一方面，以上的成果在提供用于设计、获取可实现转谷氨酰胺酶的改良这样的目的的修饰型转谷氨酰胺酶的信息·手段方面也很重要。

然而，通过组合有效的两个变异而产生相加或协同效果的可能性高这种经验很多。另外，鉴于同种酶的结构(一级结构、立体结构)的类似性高、同样的变异产生同样的效果的可能性高这样的技术常识，如果将来自具有序列号1的氨基酸序列的茂源链霉菌的转谷氨酰胺酶中发现的有用的变异应用于在与该转谷氨酰胺酶之间结构上类似性高的其它转谷氨酰胺酶，则起到同等效果的可能性高，另外，本领域技术人员可认识到这样的应用是有效的。

以下的发明基于以上的成果和考察。

[1]一种修饰型转谷氨酰胺酶，具有在序列号1的氨基酸序列中包含以下(1)～(134)中任一个氨基酸取代的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示80％以上的同源性的氨基酸序列(其中，在所述氨基酸取代的位置以外的部分产生氨基酸序列的差异)，并且确认到与所述氨基酸取代对应的特性变化，

(1)变异点为V6，取代后的氨基酸为Q、I、M、S、C、K、L、H、F、G、N、P、R、W或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(2)变异点为R26，取代后的氨基酸为K、Q、M、H、Y、D、G、N、P或S，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(3)变异点为E28，取代后的氨基酸为V、Q、W、R、K、M、N、F、G、L、P或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(4)变异点为V30，取代后的氨基酸为P、C、A、E、F、G、H、K、N、Q、R、W、Y或L，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(5)变异点为Y34，取代后的氨基酸为A，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(6)变异点为Y42，取代后的氨基酸为F、A、C、D、E、G、I、L、M、Q、S、T、V或W，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(7)变异点为E58，取代后的氨基酸为Y、M、A、F、I、V、R、K、N、L、S、Q、G或H，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(8)变异点为W59，取代后的氨基酸为R、N、Y、A、S、I、V、D、G或P，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(9)变异点为L60，取代后的氨基酸为I、M、V、A、C、E、F、Q、S、T、W或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(10)变异点为Y62，取代后的氨基酸为C、R、G、K或S，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(11)变异点为V65，取代后的氨基酸为N、L、M、F、W或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(12)变异点为V67，取代后的氨基酸为L、N、A、C、M、Q或S，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(13)变异点为T68，取代后的氨基酸为C、L、A、S、M、F、N、Q或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(14)变异点为W69，取代后的氨基酸为H、M、I、C、E、F、G、K、L、N、Q、R、S、T或V，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(15)变异点为Q74，取代后的氨基酸为W、D、G或K，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(16)变异点为Y75，取代后的氨基酸为R、Q、T或G，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(17)变异点为T77，取代后的氨基酸为M、H、E、C或G，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(18)变异点为F85，取代后的氨基酸为M，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(19)变异点为F90，取代后的氨基酸为C、M、H、L或V，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(20)变异点为F108，取代后的氨基酸为R、L、T、A、I、K、N或V，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(21)变异点为F117，取代后的氨基酸为M或L，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(22)变异点为S199，取代后的氨基酸为G、M、N、K或V，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(23)变异点为F202，取代后的氨基酸为L或W，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(24)变异点为W203，取代后的氨基酸为F，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(25)变异点为F254，取代后的氨基酸为Y或M，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(26)变异点为T273，取代后的氨基酸为I、V、M、C、S、L、R、G、A、E、F、Y、D、K、W或H，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(27)变异点为N276，取代后的氨基酸为C、E、K、L、S、T或V，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(28)变异点为Y278，取代后的氨基酸为M、L、H、I、K、R、W、C、G、N、Q、S、T或V，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(29)变异点为S284，取代后的氨基酸为W、Y、M、F或N氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(30)变异点为Y291，取代后的氨基酸为I、W、L、A、C、K、N、Q、R、S或V，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(31)变异点为S299，取代后的氨基酸为I、Y、V、K、M、Q、A、F、G或E，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(32)变异点为S303，取代后的氨基酸为N、G、C、V、P或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(33)变异点为Y310，取代后的氨基酸为C、M或I，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

(34)变异点为D3，取代后的氨基酸为Q、P、E、S或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高，

(35)变异点为R26，取代后的氨基酸为V，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高，

(36)变异点为Y34，取代后的氨基酸为W，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高，

(37)变异点为V67，取代后的氨基酸为H，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高，

(38)变异点为T68，取代后的氨基酸为V或I，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高，

(39)变异点为Q74，取代后的氨基酸为F，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高，

(40)变异点为T77，取代后的氨基酸为Q，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高，

(41)变异点为S199，取代后的氨基酸为C或Q，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高，

(42)变异点为T273，取代后的氨基酸为Q，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高，

(43)变异点为S284，取代后的氨基酸为L、H、K、P或R，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高，

(44)变异点为S299，取代后的氨基酸为N，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高，

(45)变异点为S303，取代后的氨基酸为K，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高，

(46)变异点为D3，取代后的氨基酸为E、Q、S或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高，

(47)变异点为V6，取代后的氨基酸为P，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高，

(48)变异点为R26，取代后的氨基酸为M、K、W、C、Q、G、Y、E、T、N、D、I、S、P或V，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高，

(49)变异点为E28，取代后的氨基酸为L、M、K、C、V、R、W、G、N、F、Y或H，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高，

(50)变异点为Y42，取代后的氨基酸为L、N或F，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高，

(51)变异点为E58，取代后的氨基酸为Q、A、I、V、L、T、M、K、Y、W、F或R，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高，

(52)变异点为V67，取代后的氨基酸为T、S或A，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高，

(53)变异点为T68，取代后的氨基酸为L、I、V或M，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高，

(54)变异点为Q74，取代后的氨基酸为V，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高，

(55)变异点为T77，取代后的氨基酸为D，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高，

(56)变异点为S199，取代后的氨基酸为C，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高，

(57)变异点为T273，取代后的氨基酸为E，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高，

(58)变异点为S284，取代后的氨基酸为R或H，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高，

(59)变异点为Y291，取代后的氨基酸为I、S、F、L、C、N、V或M，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高，

(60)变异点为S284，取代后的氨基酸为M、K或V，氨基酸取代所带来的特性变化是反应性提高，

(61)变异点为F251，取代后的氨基酸为Y，氨基酸取代所带来的特性变化是反应性提高，

(62)变异点为V6和Y75，变异点V6的取代后的氨基酸为E，变异点Y75的取代后的氨基酸为F，氨基酸取代所带来的特性变化是反应性提高，

(63)变异点为D3和T77，变异点D3的取代后的氨基酸为P，变异点T77的取代后的氨基酸为Q，氨基酸取代所带来的特性变化是反应性提高，

(64)变异点为D3，取代后的氨基酸为Q、S或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高和抗氧化性提高，

(65)变异点为D3，取代后的氨基酸为P，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高和反应性提高，

(66)变异点为D3，取代后的氨基酸为E，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高、抗氧化性提高和反应性提高，

(67)变异点为V6，取代后的氨基酸为P，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高，

(68)变异点为R26，取代后的氨基酸为K、Q、M、Y、D、G、N、P或S，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高，

(69)变异点为R26，取代后的氨基酸为V，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高和抗氧化性提高，

(70)变异点为R26，取代后的氨基酸为H，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低、抗氧化性提高和反应性提高，

(71)变异点为E28，取代后的氨基酸为V、R、K、M、N、F、G、L或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高，

(72)变异点为V30，取代后的氨基酸为P、G、N、R或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和反应性提高，

(73)变异点为Y42，取代后的氨基酸为F、L或M，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高，

(74)变异点为E58，取代后的氨基酸为Y、M、A、F、I、V、R、K、L或Q，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高，

(75)变异点为L60，取代后的氨基酸为I，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和反应性提高，

(76)变异点为V67，取代后的氨基酸为A或S，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高，

(77)变异点为T68，取代后的氨基酸为C、L或M，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高，

(78)变异点为T68，取代后的氨基酸为V或I，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高和抗氧化性提高，

(79)变异点为Q74，取代后的氨基酸为V，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高和反应性提高，

(80)变异点为T77，取代后的氨基酸为C，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高，

(81)变异点为T77，取代后的氨基酸为E，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和反应性提高，

(82)变异点为T77，取代后的氨基酸为D，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高和反应性提高，

(83)变异点为S199，取代后的氨基酸为G，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和反应性提高，

(84)变异点为S199，取代后的氨基酸为C，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高、抗氧化性提高和反应性提高，

(85)变异点为T273，取代后的氨基酸为E，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高，

(86)变异点为S284，取代后的氨基酸为M或F，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和反应性提高，

(87)变异点为S284，取代后的氨基酸为L或K，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高和反应性提高，

(88)变异点为S284，取代后的氨基酸为H或R，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高和抗氧化性提高，

(89)变异点为Y291，取代后的氨基酸为I、L、C、N、S或V，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高，

(90)变异点为S299，取代后的氨基酸为V、K、M或A，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和反应性提高，

(91)变异点为S303，取代后的氨基酸为K，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高和反应性提高，

(92)变异点为R5，取代后的氨基酸为Q、P、C、M、I、V、Y、F、S、N、T或G，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(93)变异点为Y34，取代后的氨基酸为H或M，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(94)变异点为W59，取代后的氨基酸为K或E，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(95)变异点为S61，取代后的氨基酸为T、V、Y、D、I、L、N、E、M、F、W、Q、P、H或K，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(96)变异点为Y62，取代后的氨基酸为D或P，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(97)变异点为G63，取代后的氨基酸为D、Q、Y、R、K、H、P、M、N、C、F、L、W、T、V或S，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(98)变异点为V65，取代后的氨基酸为C、T或K，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(99)变异点为G66，取代后的氨基酸为W或K，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(100)变异点为T68，取代后的氨基酸为P或H，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(101)变异点为W69，取代后的氨基酸为Y、D或P，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(102)变异点为Q74，取代后的氨基酸为R或P，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(103)变异点为F85，取代后的氨基酸为Y、W、L、I、Q、C、T、A、V、S、R、H或N，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(104)变异点为F108，取代后的氨基酸为Q、C、E、S或N，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(105)变异点为F117，取代后的氨基酸为C、I、W、V、A、G、T或N，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(106)变异点为Y198，取代后的氨基酸为F、H、L、S、M或I，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(107)变异点为S199，取代后的氨基酸为Q或P，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(108)变异点为K200，取代后的氨基酸为Y、M、I、R、L或V，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(109)变异点为H201，取代后的氨基酸为K、R、M、L或Q，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(110)变异点为F202，取代后的氨基酸为Y、M、H、V或C，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(111)变异点为W203，取代后的氨基酸为Y，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(112)变异点为F223，取代后的氨基酸为Y、M、L、W、V、H、G或A，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(113)变异点为R238，取代后的氨基酸为A、D、V、G、H或S，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(114)变异点为F251，取代后的氨基酸为H、N、C、M、R、S、A、T、L、P、G、V或Q，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(115)变异点为V252，取代后的氨基酸为M、L、T或C，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(116)变异点为N253，取代后的氨基酸为T、V、K、C或R，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(117)变异点为Y256，取代后的氨基酸为L、V或I，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(118)变异点为G257，取代后的氨基酸为A或C，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(119)变异点为W258，取代后的氨基酸为Y、F或N，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(120)变异点为T273，取代后的氨基酸为N，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(121)变异点为G275，取代后的氨基酸为A、C、S、V、K、I、F、H、R、L、P、Q、Y、N、M或T，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(122)变异点为N276，取代后的氨基酸为G、M、Q或H，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(123)变异点为H277，取代后的氨基酸为N、S、Q、C、E、K、D、I、R、M、P、L、W、V、Y、G、F或T，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(124)变异点为Y278，取代后的氨基酸为P或D，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(125)变异点为H279，取代后的氨基酸为N，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(126)变异点为S284，取代后的氨基酸为C，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(127)变异点为M288，取代后的氨基酸为V、Q或T，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(128)变异点为V290，取代后的氨基酸为T、C、L、M、A、S或N，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(129)变异点为Y291，取代后的氨基酸为H、T、E或G，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(130)变异点为W298，取代后的氨基酸为F、Y、I、L或M，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(131)变异点为S299，取代后的氨基酸为N或P，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(132)变异点为Y302，取代后的氨基酸为L、H、M、V、C、T、P、S或W，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(133)变异点为S303，取代后的氨基酸为I、Q、D、H或E，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化，

(134)变异点为F305，取代后的氨基酸为W、H或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是脱酰胺酶化。

[2]根据[1]所述的修饰型转谷氨酰胺酶，其中，所述同源性为82％以上。

[3]根据[1]所述的修饰型转谷氨酰胺酶，其中，所述同源性为85％以上。

[4]根据[1]所述的修饰型转谷氨酰胺酶，其中，所述同源性为90％以上、。

[5]根据[1]所述的修饰型转谷氨酰胺酶，由序列号2～10中的任一氨基酸序列构成。

[6]一种基因，编码[1]～[5]中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。

[7]根据[6]所述的基因，其中，包含序列号18～26中的任一碱基序列。

[8]一种重组DNA，包含[6]或[7]所述的基因。

[9]一种微生物，保有[8]所述的重组DNA。

[10]一种酶剂，包含[1]～[5]中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。

[11]一种修饰型转谷氨酰胺酶的制备方法，包括以下的步骤(I)～(III)，

(I)准备编码[1]～[5]中的任一项的修饰型转谷氨酰胺酶的氨基酸序列的核酸的步骤，

(II)使所述核酸表达的步骤，以及

(III)回收表达产物的步骤。

[12]根据[11]所述的制备方法，其中，所述氨基酸序列为序列号2～10中的任一氨基酸序列。

[13]根据[12]所述的制备方法，其中，所述核酸包含序列号18～26中的任一碱基序列。

附图说明

图1－1是对温度稳定性降低有效的变异点。将各变异点取代为各种氨基酸，通过将取代后的酶(变异体)的活性残留率与野生型酶进行比较来确定有效的氨基酸取代。由活性测定值算出变异株的每1mL培养液的TG(转谷氨酰胺酶)活性，用于评价。

图1－2是图1的延续。

图1－3是图1的延续。

图1－4是图1的延续。

图1－5是图1的延续。

图1－6是图1的延续。

图1－7是图1的延续。

图2－1是对耐热性提高有效的变异点。通过将各变异点取代为各种氨基酸并将取代后的酶(变异体)的活性残留率与野生型酶进行比较来确定有效的氨基酸取代。由活性测定值算出变异株的每1mL培养液的TG(转谷氨酰胺酶)活性，用于评价。

图2－2是图2的延续。

图3－1是对抗氧化性提高有效的变异点。通过将各变异点取代为各种氨基酸并将取代后的酶(变异体)的活性残留率与野生型酶进行比较来确定有效的氨基酸取代。由活性测定值算出变异株的每1mL培养液的TG(转谷氨酰胺酶)活性，用于评价。

图3－2是图3的延续。

图3－3是图3的延续。

图4是对反应性提高有效的变异点。通过将各变异点取代为各种氨基酸并将取代后的酶(变异体)的活性与野生型酶进行比较来确定有效的氨基酸取代。由活性测定值算出变异株的每1mL培养液的TG(转谷氨酰胺酶)活性，用于评价。V6E/Y75F和D3P/T77Q是在2个位置进行了氨基酸取代的双重变异体。

图5－1是对两个以上的特性变化有效的变异点。每个变异点显示对复合性改良有效的变异(氨基酸取代)。

图5－2是图5的延续。

图5－3是图5的延续。

图6－1是对脱酰胺酶化有效的变异点。将各变异点取代为各种氨基酸，将取代后的酶(变异体)的脱酰胺活性和转谷氨酰胺酶活性分别作为相对于野生型酶的相对值而算出后，求出脱酰胺活性(相对于野生型比率)/转谷氨酰胺酶活性(相对于野生型比率)的值，用于评价。

图6－2是图6的延续。

图6－3是图6的延续。

图6－4是图6的延续。

图6－5是图6的延续。

图6－6是图6的延续。

图6－7是图6的延续。

图6－8是图6的延续。

图6－9是图6的延续。

具体实施方式

为了方便说明，以下对与本发明相关而使用的术语的一部分进行定义。

(术语)

术语“修饰型转谷氨酰胺酶”是将作为基准的转谷氨酰胺酶(以下，称为“基准转谷氨酰胺酶”)进行修饰或变异而得到的酶。基准转谷氨酰胺酶典型而言是具有序列号1的氨基酸序列的来自茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的转谷氨酰胺酶。

术语“来自茂源链霉菌的转谷氨酰胺酶”是指其起源为茂源链霉菌的转谷氨酰胺酶，包括茂源链霉菌产生的转谷氨酰胺酶或利用该转谷氨酰胺酶的遗传信息使其在其它微生物等中表达的转谷氨酰胺酶等。

本发明中，作为修饰或变异，进行“氨基酸取代”。因此，将修饰型转谷氨酰胺酶与基准转谷氨酰胺酶进行比较时，确认到一部分氨基酸残基有差异。应予说明，在本说明书中，将修饰型转谷氨酰胺酶也称为修饰型酶或变异体。

在本说明书中，按照惯例，如下所示将各氨基酸用1个字母表示。

甲硫氨酸：M、丝氨酸：S、丙氨酸：A、苏氨酸：T、缬氨酸：V、酪氨酸：Y、亮氨酸：L、天冬酰胺：N、异亮氨酸：I、谷氨酰胺：Q、脯氨酸：P、天冬氨酸：D、苯丙氨酸：F、谷氨酸：E、色氨酸：W、赖氨酸：K、半胱氨酸：C、精氨酸：R、甘氨酸：G、组氨酸：H

在本说明书中，将成熟体转谷氨酰胺酶的N末端的氨基酸残基作为第1位，通过从N末端向C末端标注的编号来确定变异点的位置。

按照惯例，用表示氨基酸的种类的1个字母与表示氨基酸的位置的数字的组合来表示实施氨基酸取代的氨基酸残基、即“变异点”。另外，通过在表示变异点的右侧追加表示取代后的氨基酸的种类的1个字母的组合来表达基于氨基酸取代的变异。因此，例如，如果6位的缬氨酸为变异点，则表达为“V6，”如果是6位的缬氨酸被取代为谷氨酰胺的变异，则表达为“V6Q”。

1.修饰型转谷氨酰胺酶

本发明的第1方面涉及一种修饰型转谷氨酰胺酶(以下，称为“修饰型酶”)。本发明的修饰型酶典型而言具有在序列号1的氨基酸序列中包含一或两个以上的特定氨基酸取代(变异)的氨基酸序列。根据该特征，相对于由序列号1的氨基酸序列构成的转谷氨酰胺酶，确认到温度稳定性降低、耐热性提高、抗氧化性提高、反应性提高、脱酰胺酶化(相对于转谷氨酰胺酶活性而言脱酰胺活性的比率提高)或者它们中的两个以上的特性变化。温度稳定性降低了的修饰型酶具有在酶的热失活工序中的防止食品的变性这样的实用上的优点，例如在酸奶、芝士的制造等用途中的利用价值高。另一方面，耐热性提高了的修饰型酶即使在高温下也发挥高活性，特别适于例如在肽化合物的合成等用途中使用。另外，抗氧化性提高了的修饰型酶存在具有高保存稳定性等优点，可期待防止酶的制造、保存、使用时的失活的效果。对于反应性提高了的修饰型酶，具有可期望高反应效率、减少酶使用量等优点，不论用途如何，其利用价值均高。脱酰胺酶化改变了底物特异性，特别是关系到用途的扩大(例如在蛋白质的增溶、乳化、起泡性的提高等用途中的利用)或创造。转谷氨酰胺酶是催化位于肽链内的谷氨酰胺残基的γ－羧基酰胺基与伯胺之间的酰基转移反应的酶，但如果不存在伯胺，则水作为酰基受体发挥作用，催化将谷氨酰胺残基转换为谷氨酸残基的脱酰胺反应。经脱酰胺酶化的修饰型酶显示高的脱酰胺化催化能力，作为脱酰胺化中利用的酶而更优选。应予说明，序列号1的氨基酸序列是来自茂源链霉菌的转谷氨酰胺酶的序列。

在本说明书中，“包含氨基酸取代”是指变异点(即，产生特定的氨基酸取代的氨基酸残基的位置)成为取代后的氨基酸。因此，如果将包含氨基酸取代的氨基酸序列(变异氨基酸序列)与不含氨基酸取代的序列号1的氨基酸序列(基准氨基酸序列)进行比较，则在该氨基酸取代的位置确认到氨基酸残基的差异。

温度稳定性可以基于例如在50℃进行30分钟处理时的残留活性进行评价。对于温度稳定性降低了的修饰型酶，其活性残留率比基准转谷氨酰胺酶低。修饰型酶的活性残留率为基准转谷氨酰胺酶的活性残留率的例如90％以下，优选为30％以下，进一步优选为10％以下。应予说明，活性残留率如下算出。

活性残留率(％)＝(热处理后的酶活性)/(热处理前的酶活性)×100

耐热性与温度稳定性同样地可以基于例如在50℃进行30分钟处理时的残留活性进行评价。对于耐热性提高了的修饰型酶，其活性残留率比基准转谷氨酰胺酶高。修饰型酶的活性残留率为基准转谷氨酰胺酶的活性残留率的例如110％以上，优选为120％以上，进一步优选为130％以上。

抗氧化性可以基于用作为氧化剂的过氧化氢进行处理时的残留活性进行评价。详细的评价方法进行后述。对于抗氧化性提高了的修饰型酶，其活性残留率比基准转谷氨酰胺酶高。修饰型酶的活性残留率为基准转谷氨酰胺酶的活性残留率的例如110％以上，优选为120％以上，进一步优选为130％以上。应予说明，活性残留率如下算出。

活性残留率(％)＝(过氧化氢处理后的酶活性)/(处理前的酶活性)×100

上述的特性(温度稳定性、耐热性、抗氧化性)变化了的修饰型酶在变化了的特性的方面比基准转谷氨酰胺酶更有用，但从能够减少使用量(酶量)的方面考虑，其反应性越高越好。例如，修饰型酶的反应性优选为基准转谷氨酰胺酶的反应性的50％以上。

反应性可以基于例如由后述的实施例所示的测定法算出的活性进行评价。反应性提高了的修饰型酶显示比基准转谷氨酰胺酶高的活性。修饰型酶的反应性(活性)为基准转谷氨酰胺酶的反应性(活性)的110％以上，优选为120％以上，进一步优选为130％以上。

脱酰胺酶化可以基于脱酰胺活性(相对于基准转谷氨酰胺酶比率)相对于转谷氨酰胺酶活性(相对于基准转谷氨酰胺酶比率)的比率(脱酰胺活性/转谷氨酰胺酶活性)进行评价。详细的评价方法进行后述。对于产生了脱酰胺酶化的修饰型酶，脱酰胺活性(相对于基准转谷氨酰胺酶比率)/转谷氨酰胺酶活性(相对于基准转谷氨酰胺酶比率)成为超过1的值，优选为1.2以上，更优选为2以上，进一步优选为10以上。

以下，列举带来上述各特性变化的氨基酸取代(变异点和取代后的氨基酸)。

＜对温度稳定性降低有效的氨基酸取代＞

(1)变异点为V6，取代后的氨基酸为Q、I、M、S、C、K、L、H、F、G、N、P、R、W或Y

(2)变异点为R26，取代后的氨基酸为K、Q、M、H、Y、D、G、N、P或S

(3)变异点为E28，取代后的氨基酸为V、Q、W、R、K、M、N、F、G、L、P或Y

(4)变异点为V30，取代后的氨基酸为P、C、A、E、F、G、H、K、N、Q、R、W、Y或L

(5)变异点为Y34，取代后的氨基酸为A

(6)变异点为Y42，取代后的氨基酸为F、A、C、D、E、G、I、L、M、Q、S、T、V或W

(7)变异点为E58，取代后的氨基酸为Y、M、A、F、I、V、R、K、N、L、S、Q、G或H

(8)变异点为W59，取代后的氨基酸为R、N、Y、A、S、I、V、D、G或P

(9)变异点为L60，取代后的氨基酸为I、M、V、A、C、E、F、Q、S、T、W或Y

(10)变异点为Y62，取代后的氨基酸为C、R、G、K或S

(11)变异点为V65，取代后的氨基酸为N、L、M、F、W或Y

(12)变异点为V67，取代后的氨基酸为L、N、A、C、M、Q或S

(13)变异点为T68，取代后的氨基酸为C、L、A、S、M、F、N、Q或Y

(14)变异点为W69，取代后的氨基酸为H、M、I、C、E、F、G、K、L、N、Q、R、S、T或V

(15)变异点为Q74，取代后的氨基酸为W、D、G或K

(16)变异点为Y75，取代后的氨基酸为R、Q、T或G

(17)变异点为T77，取代后的氨基酸为M、H、E、C或G

(18)变异点为F85，取代后的氨基酸为M

(19)变异点为F90，取代后的氨基酸为C、M、H、L或V

(20)变异点为F108，取代后的氨基酸为R、L、T、A、I、K、N或V

(21)变异点为F117，取代后的氨基酸为M或L

(22)变异点为S199，取代后的氨基酸为G、M、N、K或V

(23)变异点为F202，取代后的氨基酸为L或W

(24)变异点为W203，取代后的氨基酸为F

(25)变异点为F254，取代后的氨基酸为Y或M

(26)变异点为T273，取代后的氨基酸为I、V、M、C、S、L、R、G、A、E、F、Y、D、K、W或H

(27)变异点为N276，取代后的氨基酸为C、E、K、L、S、T或V

(28)变异点为Y278，取代后的氨基酸为M、L、H、I、K、R、W、C、G、N、Q、S、T或V

(29)变异点为S284，取代后的氨基酸为W、Y、M、F或N

(30)变异点为Y291，取代后的氨基酸为I、W、L、A、C、K、N、Q、R、S或V

(31)变异点为S299，取代后的氨基酸为I、Y、V、K、M、Q、A、F、G或E

(32)变异点为S303，取代后的氨基酸为N、G、C、V、P或Y

(33)变异点为Y310，取代后的氨基酸为C、M或I

以上的氨基酸取代中，下述的氨基酸取代的温度稳定性降低的程度大，是更优选的氨基酸取代。

V6S、V6C、V6K、V6L、V6H、V6F、V6G、V6N、V6P、V6R、V6W、V6Y

R26M、R26H、R26Y、R26D、R26G、R26N、R26P、R26S

E28N、E28F、E28G、E28L、E28P、E28Y

V30P、V30C、V30A、V30E、V30F、V30G、V30H、V30K、V30N、V30Q、V30R、V30W、V30Y、V30L

Y34A

Y42A、Y42C、Y42D、Y42E、Y42G、Y42I、Y42L、Y42M、Y42Q、Y42S、Y42T、Y42V、Y42W

E58G、E58H

W59S、W59I、W59V、W59D、W59G、W59P

L60M、L60V、L60A、L60C、L60E、L60F、L60Q、L60S、L60T、L60W、L60Y

Y62C、Y62R、Y62G、Y62K、Y62S

V65N、V65L、V65M、V65F、V65W、V65Y

V67L、V67N、V67A、V67C、V67M、V67Q、V67S

T68M、T68F、T68N、T68Q、T68Y

W69M、W69I、W69C、W69E、W69F、W69G、W69K、W69L、W69N、W69Q、W69R、W69S、W69T、W69V

Y75T、Y75G

F85M

F90V

F108T、F108A、F108I、F108K、F108N、F108V

F117L

S199K、S199V

F202W

T273L、T273R、T273G、T273A、T273E、T273F、T273Y、T273D、T273K、T273W、T273H

N276C、N276E、N276K、N276L、N276T、N276V、N276S

Y278L、Y278H、Y278I、Y278K、Y278R、Y278W、Y278C、Y278G、Y278N、Y278Q、Y278S、Y278T、Y278V

Y291W、Y291L、Y291A、Y291C、Y291K、Y291N、Y291Q、Y291R、Y291S、Y291V

S299E

Y310I

下述的氨基酸取代的温度稳定性降低的程度特别大，是特别优选的氨基酸取代。

V6H、V6F、V6G、V6N、V6P、V6R、V6W、V6Y

R26H、R26Y、R26D、R26G、R26N、R26P、R26S

E28F、E28G、E28L、E28P、E28Y

V30C、V30A、V30E、V30F、V30G、V30H、V30K、V30N、V30Q、V30R、V30W、V30Y、V30L

Y34A

W59I、W59V、W59D、W59G、W59P

L60V、L60A、L60C、L60E、L60F、L60Q、L60S、L60T、L60W、L60Y

Y62C、Y62R、Y62G、Y62K、Y62S

V65M、V65F、V65W、V65Y

V67A、V67C、V67M、V67Q、V67S

T68F、T68N、T68Q、T68Y

Y75T、Y75G

F108A、F108I、F108K、F108N、F108V

F117L

F202W

T273F、T273Y、T273D、T273K、T273W、T273H

N276C、N276E、N276K、N276L、N276S、N276T、N276V

Y278K、Y278R、Y278W、Y278C、Y278G、Y278N、Y278Q、Y278S、Y278T、Y278V

Y291L、Y291A、Y291C、Y291K、Y291N、Y291Q、Y291R、Y291S、Y291V

S299E

下述的氨基酸取代的温度稳定性降低的程度特别大，此外，反应性也高，是极其优选的氨基酸取代。

V6H、V6G、V6N、V6W

R26H、R26Y、R26N、R26S

E28F、E28G、E28L、E28Y

Y42C、Y42L、Y42M、Y42Q、Y42S、Y42W

W59I、W59V、W59G

L60V、L60C、L60F

Y62C、Y62R

V67C、V67M

W69M、W69I、W69C、W69F、W69L、W69T、W69V

Y75T

T273F、T273Y、T273H

Y278W

Y291L、Y291K、Y291R

＜对耐热性提高有效的氨基酸取代＞

(34)变异点为D3，取代后的氨基酸为Q、P、E、S或Y

(35)变异点为R26，取代后的氨基酸为V

(36)变异点为Y34，取代后的氨基酸为W

(37)变异点为V67，取代后的氨基酸为H

(38)变异点为T68，取代后的氨基酸为V或I

(39)变异点为Q74，取代后的氨基酸为F

(40)变异点为T77，取代后的氨基酸为Q

(41)变异点为S199，取代后的氨基酸为C或Q

(42)变异点为T273，取代后的氨基酸为Q

(43)变异点为S284，取代后的氨基酸为L、H、K、P或R

(44)变异点为S299，取代后的氨基酸为N

(45)变异点为S303，取代后的氨基酸为K

以上的氨基酸取代中，下述的氨基酸取代的耐热性提高的程度大，是更优选的氨基酸取代。

D3P、D3E、D3S、D3Y

R26V

Y34W

V67H

T77Q

S199C、S199Q

T273Q

S284H、S284K、S284P、S284R

S303K

下述的氨基酸取的耐热性提高的程度特别大，是特别优选的氨基酸取代。

D3E、D3S、D3Y

R26V

Y34W

V67H

S199Q

T273Q

S284H、S284K、S284P、S284R

下述的氨基酸取代是耐热性提高的程度特别大，此外，反应性也高，是极其优选的氨基酸取代。

D3E、D3S、D3Y

R26V

Y34W

T273Q

S284H、S284K、S284P、S284R

＜对抗氧化性提高有效的氨基酸取代＞

(46)变异点为D3，取代后的氨基酸为E、Q、S或Y

(47)变异点为V6，取代后的氨基酸为P

(48)变异点为R26，取代后的氨基酸为M、K、W、C、Q、G、Y、E、T、N、D、I、S、P或V

(49)变异点为E28，取代后的氨基酸为L、M、K、C、V、R、W、G、N、F、Y或H

(50)变异点为Y42，取代后的氨基酸为L、N或F

(51)变异点为E58，取代后的氨基酸为Q、A、I、V、L、T、M、K、Y、W、F或R

(52)变异点为V67，取代后的氨基酸为T、S或A

(53)变异点为T68，取代后的氨基酸为L、I、V或M

(54)变异点为Q74，取代后的氨基酸为V

(55)变异点为T77，取代后的氨基酸为D

(56)变异点为S199，取代后的氨基酸为C

(57)变异点为T273，取代后的氨基酸为E

(58)变异点为S284，取代后的氨基酸为R或H

(59)变异点为Y291，取代后的氨基酸为I、S、F、L、C、N、V或M

以上的氨基酸取代中，下述的氨基酸取代的抗氧化性提高的程度大，是更优选的氨基酸取代。

D3S、D3Y

V6P

R26W、R26C、R26Q、R26G、R26Y、R26E、R26T、R26N、R26D、R26I、R26S、R26P、R26V

E28L、E28M、E28K、E28C、E28V、E28R、E28W、E28G、E28N、E28F、E28Y、E28H

E58A、E58I、E58V、E58L、E58T、E58M、E58K、E58Y、E58W、E58F、E58R

V67S、V67A

T68I、T68V、T68M

T273E

S284R、S284H

Y291C、Y291N、Y291V、Y291M

下述的氨基酸取代的抗氧化性提高的程度特别大，是特别优选的氨基酸取代。

V6P

R26C、R26Q、R26G、R26Y、R26E、R26T、R26N、R26D、R26I、R26S、R26P、R26V

E28V、E28R、E28W、E28G、E28N、E28F、E28Y、E28H

Y42F

E58I、E58V、E58L、E58T、E58M、E58K、E58Y、E58W、E58F、E58R

T68I、T68V、T68M

S284H

下述的氨基酸取代的抗氧化性提高的程度特别大，此外，反应性也高，是极其优选的氨基酸取代。

R26C、R26Q、R26Y、R26E、R26T、R26N、R26I、R26S、R26V

E28V、E28R、E28W、E28G、E28N、E28F、E28Y

Y42F

E58I、E58V、E58L、E58T、E58M、E58K、E58Y、E58W、E58F、E58R

S284H

＜对反应性提高有效的氨基酸取代＞

(60)变异点为S284，取代后的氨基酸为M、K或V

(61)变异点为F251，取代后的氨基酸为Y

(62)变异点为V6和Y75，变异点V6的取代后的氨基酸为E，变异点Y75的取代后的氨基酸为F

(63)变异点为D3和T77，变异点D3的取代后的氨基酸为P，变异点T77的取代后的氨基酸为Q

以上的氨基酸取代中，下述的氨基酸取代的反应性提高的程度大，是更优选的氨基酸取代。

S284V

F251Y

V6E和Y75F的双重变异

D3P和T77Q的双重变异

下述的氨基酸取代的反应性提高的程度特别大，是特别优选的氨基酸取代。

V6E和Y75F的双重变异

D3P和T77Q的双重变异

如后述的实施例所示，几个氨基酸取带来两个以上的特性变化。即，确定了对复合性改良有效的氨基酸取代。以下，与对应的特性变化一并列举成功确定的氨基酸取代(变异点和取代后的氨基酸)。

(64)变异点为D3，取代后的氨基酸为Q、S或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高和抗氧化性提高

(65)变异点为D3，取代后的氨基酸为P，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高和反应性提高

(66)变异点为D3，取代后的氨基酸为E，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高、抗氧化性提高和反应性提高

(67)变异点为V6，取代后的氨基酸为P，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高

(68)变异点为R26，取代后的氨基酸为K、Q、M、Y、D、G、N、P或S，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高

(69)变异点为R26，取代后的氨基酸为V，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高和抗氧化性提高

(70)变异点为R26，取代后的氨基酸为H，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低、抗氧化性提高和反应性提高

(71)变异点为E28，取代后的氨基酸为V、R、K、M、N、F、G、L或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高

(72)变异点为V30，取代后的氨基酸为P、G、N、R或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和反应性提高

(73)变异点为Y42，取代后的氨基酸为F、L或M，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高

(74)变异点为E58，取代后的氨基酸为Y、M、A、F、I、V、R、K、L或Q，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高

(75)变异点为L60，取代后的氨基酸为I，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和反应性提高

(76)变异点为V67，取代后的氨基酸为A或S，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高

(77)变异点为T68，取代后的氨基酸为C、L或M，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高

(78)变异点为T68，取代后的氨基酸为V或I，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高和抗氧化性提高

(79)变异点为Q74，取代后的氨基酸为V，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高和反应性提高

(80)变异点为T77，取代后的氨基酸为C，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高

(81)变异点为T77，取代后的氨基酸为E，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和反应性提高

(82)变异点为T77，取代后的氨基酸为D，氨基酸取代所带来的特性变化是抗氧化性提高和反应性提高

(83)变异点为S199，取代后的氨基酸为G，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和反应性提高

(84)变异点为S199，取代后的氨基酸为C，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高、抗氧化性提高和反应性提高

(85)变异点为T273，取代后的氨基酸为E，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高

(86)变异点为S284，取代后的氨基酸为M或F，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和反应性提高

(87)变异点为S284，取代后的氨基酸为L或K，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高和反应性提高

(88)变异点为S284，取代后的氨基酸为H或R，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高和抗氧化性提高

(89)变异点为Y291，取代后的氨基酸为I、L、C、N、S或V，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高

(90)变异点为S299，取代后的氨基酸为V、K、M或A，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和反应性提高

(91)变异点为S303，取代后的氨基酸为K，氨基酸取代所带来的特性变化是耐热性提高和反应性提高

以上的氨基酸取代中，下述的氨基酸取代伴有温度稳定性的降低和抗氧化性的提高这样的也可以说是相反的两个特性变化。

V6P

R26K、R26Q、R26M、R26Y、R26D、R26G、R26N、R26P、R26S

E28V、E28R、E28K、E28M、E28N、E28F、E28G、E28L、E28Y

Y42F、Y42L、Y42M

E58Y、E58M、E58A、E58F、E58I、E58V、E58R、E58K、E58L、E58Q

V67A、V67S

T68C、T68L、T68M

T77C

T273E

Y291I、Y291L、Y291C、Y291N、Y291S、Y291V

＜对脱酰胺酶化有效的氨基酸取代＞

(92)变异点为R5，取代后的氨基酸为Q、P、C、M、I、V、Y、F、S、N、T或G

(93)变异点为Y34，取代后的氨基酸为H或M

(94)变异点为W59，取代后的氨基酸为K或E

(95)变异点为S61，取代后的氨基酸为T、V、Y、D、I、L、N、E、M、F、W、Q、P、H或K

(96)变异点为Y62，取代后的氨基酸为D或P

(97)变异点为G63，取代后的氨基酸为D、Q、Y、R、K、H、P、M、N、C、F、L、W、T、V或S

(98)变异点为V65，取代后的氨基酸为C、T或K

(99)变异点为G66，取代后的氨基酸为W或K

(100)变异点为T68，取代后的氨基酸为P或H

(101)变异点为W69，取代后的氨基酸为Y、D或P

(102)变异点为Q74，取代后的氨基酸为R或P

(103)变异点为F85，取代后的氨基酸为Y、W、L、I、Q、C、T、A、V、S、R、H或N

(104)变异点为F108，取代后的氨基酸为Q、C、E、S或N

(105)变异点为F117，取代后的氨基酸为C、I、W、V、A、G、T或N

(106)变异点为Y198，取代后的氨基酸为F、H、L、S、M或I

(107)变异点为S199，取代后的氨基酸为Q或P

(108)变异点为K200，取代后的氨基酸为Y、M、I、R、L或V

(109)变异点为H201，取代后的氨基酸为K、R、M、L或Q

(110)变异点为F202，取代后的氨基酸为Y、M、H、V或C

(111)变异点为W203，取代后的氨基酸为Y

(112)变异点为F223，取代后的氨基酸为Y、M、L、W、V、H、G或A

(113)变异点为R238，取代后的氨基酸为A、D、V、G、H或S

(114)变异点为F251，取代后的氨基酸为H、N、C、M、R、S、A、T、L、P、G、V或Q

(115)变异点为V252，取代后的氨基酸为M、L、T或C

(116)变异点为N253，取代后的氨基酸为T、V、K、C或R

(117)变异点为Y256，取代后的氨基酸为L、V或I

(118)变异点为G257，取代后的氨基酸为A或C

(119)变异点为W258，取代后的氨基酸为Y、F或N

(120)变异点为T273，取代后的氨基酸为N

(121)变异点为G275，取代后的氨基酸为A、C、S、V、K、I、F、H、R、L、P、Q、Y、N、M或T

(122)变异点为N276，取代后的氨基酸为G、M、Q或H

(123)变异点为H277，取代后的氨基酸为N、S、Q、C、E、K、D、I、R、M、P、L、W、V、Y、G、F或T

(124)变异点为Y278，取代后的氨基酸为P或D

(125)变异点为H279，取代后的氨基酸为N

(126)变异点为S284，取代后的氨基酸为C

(127)变异点为M288，取代后的氨基酸为V、Q或T

(128)变异点为V290，取代后的氨基酸为T、C、L、M、A、S或N

(129)变异点为Y291，取代后的氨基酸为H、T、E或G

(130)变异点为W298，取代后的氨基酸为F、Y、I、L或M

(131)变异点为S299，取代后的氨基酸为N或P

(132)变异点为Y302，取代后的氨基酸为L、H、M、V、C、T、P、S或W

(133)变异点为S303，取代后的氨基酸为I、Q、D、H或E

(134)变异点为F305，取代后的氨基酸为W、H或Y

以上的氨基酸取代中，下述的氨基酸取代的脱酰胺酶化的程度大，是更优选的氨基酸取代。

R5Q、R5P、R5C、R5M、R5I、R5V、R5Y、R5F、R5S、R5N、R5T、R5G

Y34H、Y34M

W59K、W59E

S61T、S61V、S61Y、S61D、S61I、S61L、S61N、S61E、S61M、S61F、S61W、S61Q、S61P、S61H、S61K

Y62D、Y62P

G63D、G63Q、G63Y、G63R、G63K、G63H、G63P、G63M、G63N、G63C、G63F、G63L、G63W、G63T、G63V、G63S

V65C、V65T、V65K

G66W、G66K

T68P、T68H

W69Y、W69D、W69P

Q74R、Q74P

F85Y、F85W、F85L、F85I、F85Q、F85C、F85T、F85A、F85V、F85S、F85R、F85H、F85N

F108Q、F108C、F108E、F108S、F108N

F117C、F117I、F117W、F117V、F117A、F117G、F117T、F117N

Y198F、Y198H、Y198L、Y198S、Y198M、Y198I

S199Q、S199P

K200Y、K200M、K200I、K200R、K200L、K200V

H201K、H201R、H201M、H201L、H201Q

F202Y、F202M、F202H、F202V、F202C

W203Y

F223Y、F223M、F223L、F223W、F223V、F223H、F223G、F223A

R238A、R238D、R238V、R238G、R238H、R238S

F251H、F251N、F251C、F251M、F251R、F251S、F251A、F251T、F251L、F251P、F251G、F251V、F251Q

V252M、V252L、V252T、V252C

N253T、N253V、N253K、N253C、N253R

Y256L、Y256V、Y256I

G257A、G257C

W258Y、W258F、W258N

T273N

G275A、G275C、G275S、G275V、G275K、G275I、G275F、G275H、G275R、G275L、G275P、G275Q、G275Y、G275N、G275M、G275T

N276G、N276M、N276Q、N276H

H277N、H277S、H277Q、H277C、H277E、H277K、H277D、H277I、H277R、H277M、H277P、H277L、H277W、H277V、H277Y、H277G、H277F、H277T

Y278P、Y278D

H279N

S284C

M288V、M288Q、M288T

V290T、V290C、V290L、V290M、V290A、V290S、V290N

Y291H、Y291T、Y291E、Y291G

W298F、W298Y、W298I、W298L、W298M

S299N、S299P

Y302L、Y302H、Y302M、Y302V、Y302C、Y302T、Y302P、Y302S、Y302W

S303I、S303Q、S303D、S303H、S303E

F305W、F305H、F305Y

下述的氨基酸取代的脱酰胺酶化的程度格外大，是进一步优选的氨基酸取代。

R5Y、R5F、R5S、R5N、R5T、R5G

Y34M

Y62P

V65C、V65T、V65K

G66K

T68P、T68H

W69D、W69P

F85L、F85I、F85Q、F85C、F85T、F85A、F85V、F85S、F85R、F85H、F85N

F108C、F108E、F108S、F108N

F117C、F117I、F117W、F117V、F117A、F117G、F117T、F117N

Y198L、Y198S、Y198M、Y198I

S199Q、S199P

K200Y、K200M、K200I、K200R、K200L、K200V

H201K、H201R、H201M、H201L、H201Q

F202M、F202H、F202V、F202C

W203Y

F223M、F223L、F223W、F223V、F223H、F223G、F223A

R238H、R238S

F251N、F251C、F251M、F251R、F251S、F251A、F251T、F251L、F251P、F251G、F251V、F251Q

V252L、V252T、V252C

N253T、N253V、N253K、N253C、N253R

Y256L、Y256V、Y256I

G257A、G257C

W258Y、W258F、W258N

T273N

G275C、G275S、G275V、G275K、G275I、G275F、G275H、G275R、G275L、G275P、G275Q、G275Y、G275N、G275M、G275T

N276G、N276M、N276Q、N276H

H277S、H277Q、H277C、H277E、H277K、H277D、H277I、H277R、H277M、H277P、H277L、H277W、H277V、H277Y、H277G、H277F、H277T

Y278P、Y278D

M288Q、M288T

V290M、V290A、V290S、V290N

Y291T、Y291E、Y291G

W298F、W298Y、W298I、W298L、W298M

S299P

Y302L、Y302H、Y302M、Y302V、Y302C、Y302T、Y302P、Y302S、Y302W

F305H、F305Y

下述的氨基酸取代的脱酰胺酶化的程度特别大，是特别优选的氨基酸取代。

S61Y、S61D、S61I、S61L、S61N、S61E、S61M、S61F、S61W、S61Q、S61P、S61H、S61K

Y62P

V65T、V65K

G66K

T68P、T68H

W69D、W69P

F85H、F85N

F117G、F117T、F117N

Y198S、Y198M、Y198I

S199P

K200M、K200I、K200R、K200L、K200V

H201M、H201L、H201Q

F202V、F202C

W203Y

F223W、F223V、F223H、F223G、F223A

F251L、F251P、F251G、F251V、F251Q

N253T、N253V、N253K、N253C、N253R

Y256L、Y256V、Y256I

G257C

W258N

G275V、G275K、G275I、G275F、G275H、G275R、G275L、G275P、G275Q、G275Y、G275N、G275M、G275T

N276G、N276M、N276Q、N276H

Y278P、Y278D

M288T

V290S、V290N

Y291G

W298Y、W298I、W298L、W298M

F305Y

作为本发明的修饰型酶的具体例，可举出由序列号2～10中的任一氨基酸序列构成的转谷氨酰胺酶(依次与R26N变异体、R26Y变异体、R26S变异体、E28N变异体、E28G变异体、E28F变异体、E28Y变异体、E58R变异体、E58L变异体对应)。如后述的实施例所示，确认到这些变异体的温度稳定性降低且抗氧化性提高。

通常，使某一蛋白质的氨基酸序列的一部分变异时，有时变异后的蛋白质与变异前的蛋白质具有同等的功能。即，有时氨基酸序列的变异对蛋白质的功能不造成实质的影响，蛋白质的功能在变异前后被维持。另一方面，两个蛋白质的氨基酸序列的同源性高时，两者显示同等的特性的可能性高。考虑到这些技术常识，虽然不与上述修饰型酶的氨基酸序列、即“在序列号1的氨基酸序列中包含上述(1)～(134)中的任一氨基酸取代的氨基酸序列(该氨基酸序列的具体例为序列号2～10的氨基酸序列)”完全相同(即100％的同源性)，但只要是具有显示高同源性的氨基酸序列且确认到期望的特性变化的修饰型酶，则可以看作是与上述修饰型酶实质上相同的酶(实质相同的转谷氨酰胺酶)。在此的同源性为70％以上、80％以上、82％以上、85％以上、90％以上、93％以上、95％以上、98％或99％以上。同源性越高越优选。因此，在最优选的方案中，同源性为99％以上。

如果将上述修饰型酶与实质相同的转谷氨酰胺酶进行比较，则确认到氨基酸序列的细微差异。但是，氨基酸序列的差异在实施了上述氨基酸取代的位置以外的位置产生。因此，例如，同源性的基准为序列号2的氨基酸序列时，在26位N以外的位置产生氨基酸序列的差异，同源性的基准为序列号3的氨基酸序列时，在26位Y以外的位置产生氨基酸序列的差异，同源性的基准为序列号4的氨基酸序列时，在26位S以外的位置产生氨基酸序列的差异，同源性的基准为序列号5的氨基酸序列时，在28位N以外的位置产生氨基酸序列的差异，同源性的基准为序列号6的氨基酸序列时，在28位G以外的位置产生氨基酸序列的差异，同源性的基准为序列号7的氨基酸序列时，在28位F以外的位置产生氨基酸序列的差异，同源性的基准为序列号8的氨基酸序列时，在28位Y以外的位置产生氨基酸序列的差异，同源性的基准为序列号9的氨基酸序列时，在58位R以外的位置产生氨基酸序列的差异，同源性的基准为序列号10的氨基酸序列时，在58位L以外的位置产生氨基酸序列的差异。换言之，在与序列号2的氨基酸序列显示上述同源性(70％以上、80％以上、82％以上、85％以上、90％以上、93％以上、95％以上、98％或99％以上)的氨基酸序列中，26位氨基酸为N。同样地，在与序列号3的氨基酸序列显示上述同源性的氨基酸序列中，26位氨基酸为Y，在与序列号4的氨基酸序列显示上述同源性的氨基酸序列中，26位氨基酸为S，在与序列号5的氨基酸序列显示上述同源性的氨基酸序列中，28位氨基酸为N，在与序列号6的氨基酸序列显示上述同源性的氨基酸序列中，28位氨基酸为G，在与序列号7的氨基酸序列显示上述同源性的氨基酸序列中，28位氨基酸为F，在与序列号8的氨基酸序列显示上述同源性的氨基酸序列中，28位氨基酸为Y，在与序列号9的氨基酸序列显示上述同源性的氨基酸序列中，58位氨基酸为R，在与序列号10的氨基酸序列显示上述同源性的氨基酸序列中，58位氨基酸为L。

在此的“氨基酸序列的细微差异”通过氨基酸的缺失、取代、附加、插入或它们的组合而产生。典型而言，是指通过构成氨基酸序列的1～多个(上限例如为3个、5个、7个、10个)的氨基酸的缺失、取代、或1～多个(上限例如为3个、5个、7个、10个)的氨基酸的附加、插入、或它们的组合而在氨基酸序列产生变异(变化)。“氨基酸序列的细微差异”优选通过保守性氨基酸取代而产生。在此的“保守性氨基酸取代”是指将某一氨基酸残基取代成具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链而分类为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)之类的几个族。保守性氨基酸取代优选为同一族内的氨基酸残基间的取代。应予说明，已知来自茂源链霉菌的转谷氨酰胺酶(序列号1)的活性残基为64位半胱氨酸，因此，在实施变异时对该氨基酸残基没有影响即可。

然而，两个氨基酸序列或两个碱基序列(以下，使用“两个序列”作为包含它们的术语)的同源性(％)例如可以通过以下的步骤来确定。首先，以能够进行最佳比较的方式排列两个序列(例如，可以向第一序列导入空位而将与第二序列的比对优化)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基或核苷酸)与第二序列中的对应的位置的分子相同时，可以说该位置的分子是相同的。两个序列的同源性是在该两个序列共同的同一位置的数量的函数(即，同源性(％)＝同一位置的数量/位置的总数×100)，优选也将比对的优化所需的空位的数量和尺寸考虑在内。

两个序列的比较和同源性的确定可以使用数学算法来实现。作为可用于序列的比较的数学算法的具体例，有在Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68中记载、在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77中改变的算法，但并不限定于此。这样的算法被整合到Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中记载的NBLAST程序和XBLAST程序(版本2.0)中。为了得到等价的核苷酸序列，只要用例如NBLAST程序，设为score＝100、wordlength＝12进行BLAST核苷酸检索即可。为了得到等价的氨基酸序列，只要用例如XBLAST程序，设为score＝50、wordlength＝3进行BLAST多肽检索即可。为了得到用于比较的空位比对，可以利用Altschul等人(1997)Amino AcidsResearch 25(17)：3389-3402中记载的Gapped BLAST。利用BLAST和Gapped BLAST时，可以使用对应的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。详细而言，请参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov。作为可用于序列的比较的其它数学算法的例子，有Myers和Miller(1988)Comput Appl Biosci.4：11-17中记载的算法。这样的算法被整合到例如可以在GENESTREAM网站服务器(IGH Montpellier、法国)或ISREC服务器中利用的ALIGN程序中。氨基酸序列的比较利用ALIGN程序时，例如可以使用PAM120残基质量表，设为空位长度罚分＝12、空位罚分＝4。

可以使用GCG软件包的GAP程序，使用Blossom62 Matrix或PAM250 Matrix，设为空位权重＝12、10、8、6或4、空位长度权重＝2、3或4来确定两个氨基酸序列的同源性。另外，可以使用GCG软件包(可以在http://www.gcg.com中利用)的GAP程序，设为空位权重＝50、空位长度权重＝3来确定两个碱基序列的同源性。

典型而言，通过由序列号1的氨基酸序列构成的转谷氨酰胺酶、即来自茂源链霉菌的转谷氨酰胺酶发生变异(上述(1)～(134)中的任一氨基酸取代)，成为本发明的修饰型酶。对于上述的实质相同的转谷氨酰胺酶，可以通过对由序列号1的氨基酸序列构成的转谷氨酰胺酶发生变异了(上述(1)～(134)中的任一氨基酸取代)的转谷氨酰胺酶进一步加入变异、对来自与产生由序列号1的氨基酸序列构成的转谷氨酰胺酶的茂源链霉菌株同种同属的转谷氨酰胺酶等由与序列号1的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列构成的转谷氨酰胺酶加入同等的变异、或者对通过该变异而得到的转谷氨酰胺酶进一步加入变异而得到。对于在此的“同等的变异”，在与序列号1的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列中，与本发明中的变异点(上述(1)～(134)中的任一氨基酸取代的变异点)的氨基酸残基相当的氨基酸残基被取代。应予说明，作为由与序列号1的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列构成的转谷氨酰胺酶的例子，可举出来自茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)(以前被分类为拉达卡轮枝链霉菌(Streptoverticillium ladakanum))且具有序列号11的氨基酸序列的转谷氨酰胺酶(氨基酸序列的同源性93％)、来自白网链霉菌(Streptomyces albireticuli)且具有序列号12的氨基酸序列的转谷氨酰胺酶(氨基酸列的同源性82％)、来自叶状链霉菌(Streptomyces luteireticuli)且具有序列号13的氨基酸序列的转谷氨酰胺酶(氨基酸列的同源性82％)、来自肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)且具有序列号14的氨基酸序列的转谷氨酰胺酶(氨基酸列的同源性81％)、来自普拉特链霉菌(Streptomycesplatensis)且具有序列号15的氨基酸序列的转谷氨酰胺酶(氨基酸列的同源性80％)、来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)且具有序列号16的氨基酸序列的转谷氨酰胺酶(氨基酸列的同源性80％)。

在本说明书中关于氨基酸残基使用时的术语“相当”是指在被比较的蛋白质(酶)之间对其功能的发挥带来同等的贡献。例如，以考虑一级结构(氨基酸序列)的部分相同性并且能够进行最佳比较的方式将比较对象的氨基酸序列相对于基准转谷氨酰胺酶的氨基酸序列(序列号1的氨基酸序列)进行排列时(此时也可以根据需要导入空位而将比对优化)，可以将与基准的氨基酸序列中的特定的氨基酸对应的位置的氨基酸确定为“相当的氨基酸”。也可以代替一级结构彼此的比较或在此基础上通过立体结构(三维结构)彼此的比较来确定“相当的氨基酸”。通过利用立体结构信息，可得到可靠性高的比较结果。此时，可以采用一边比较多个酶的立体结构的原子坐标一边进行比对的方法。变异对象酶的立体结构信息例如能够从Protein Data Bank(http://www.pdbj.org/index_j.html)获得。

以下示出通过X射线结晶结构解析来确定蛋白质立体结构的方法的一个例子。

(1)将蛋白质结晶化。结晶化是为了进行立体结构确定所必不可少的，除此以外，作为蛋白质的高纯度的纯化法、高密度下稳定的保存法也具有产业上的有用性。此时，可以将结合有底物或其类似化合物作为配体的蛋白质结晶化。

(2)对制作的结晶照射X射线来收集衍射数据。应予说明，蛋白质结晶通过X射线照射而受到破坏、衍射能力劣化的情形较多。此时，将结晶急剧地冷却到－173℃左右，在该状态下收集衍射数据的低温测定技术最近已经普及。应予说明，最终，为了收集用于结构确定的高分辨率数据，利用亮度高的同步辐射光。

(3)在进行结晶结构解析中，除衍射数据以外，还需要相位信息。对于目标蛋白质，在近缘蛋白质的结晶结构未知时，利用分子取代法进行结构确定是不可能的，必须通过重原子同晶取代法解决相位问题。重原子同晶取代法是将汞、铂等原子序号大的金属原子导入结晶，利用金属原子大的X射线散射能力对于X射线衍射数据的贡献而得到相位信息的方法。被确定的相位可以通过将结晶中的溶剂区域的电子密度平滑化而改善。由于溶剂区域的水分子波动大而几乎观察不到电子密度，因此，通过将该区域的电子密度近似为0，能够接近真正的电子密度，进而能够改善相位。另外，非对称单元含有多个分子时，通过将这些分子的电子密度平均化，能够进一步大幅地改善相位。在使用如此改善的相位进行计算而得到的电子密度图中将蛋白质的模型拟合。该工艺在计算机绘图上使用MSI公司(美国)的QUANTA等程序进行。然后，使用MSI公司的X-PLOR等程序进行结构精密化，完成结构解析。对于目标蛋白质，近缘蛋白质的结晶结构已知时，可以使用已知蛋白质的原子坐标并通过分子取代法来确定。分子取代和结构精密化可以使用程序CNS_SOLVE ver.11等进行。

2.编码修饰型转谷氨酰胺酶的核酸等

本发明的第2方面提供与本发明的修饰型酶相关的核酸。即，提供编码修饰型酶的基因、能够作为用于鉴定编码修饰型酶的核酸的探针使用的核酸、能作为用于使编码修饰型酶的核酸扩增或突变等的引物使用的核酸。

编码修饰型酶的基因典型而言被用于修饰型酶的制备。根据使用了编码修饰型酶的基因的基因工程制备方法，能够得到更均质状态的修饰型酶。另外，该方法在制备大量的修饰型酶时也可以说是优选的方法。应予说明，编码修饰型酶的基因的用途并不限于修饰型酶的制备。例如，作为以阐明修饰型酶的作用机制等为目的的实验用工具或者作为用于设计或制作酶的进一步修饰体的工具，也可以利用该核酸。

本说明书中，“编码修饰型酶的基因”是指使其表达时可得到该修饰型酶的核酸，当然包括具有与该修饰型酶的氨基酸序列对应的碱基序列的核酸，也包括对这样的核酸附加不编码氨基酸序列的序列而成的核酸。另外，还考虑了密码子的简并。

将编码修饰型酶的基因的序列(碱基序列)的例子示于序列号18～26。这些序列如下所述编码后述的实施例所示的变异体。

序列号18：R26N变异体

序列号19：R26Y变异体

序列号20：R26S变异体

序列号21：E28N变异体

序列号22：E28G变异体

序列号23：E28F变异体

序列号24：E28Y变异体

序列号25：E58R变异体

序列号26：E58L变异体

使本发明的基因在宿主内表达时，通常为了作为表达产物的修饰型酶的结构稳定化等，向宿主导入在上述的序列(例如，序列号18～26中的任一个)的5'末端侧附加了编码前肽(前序列)的序列的基因构建体。另外，作为分泌型蛋白质进行表达时，进一步准备在编码前序列的序列的5'末端侧附加了编码预序列(信号序列)的序列的基因构建体。使用该基因构建体时，作为连接有预序列和前序列的预前(Pre-pro)型转谷氨酰胺酶而表达后，经过预(Pre)序列的切断(向前(Pro)型转谷氨酰胺酶的转换)和前序列的切断而得到成熟型转谷氨酰胺酶。编码预序列的序列和编码前序列的序列可以使用原本的序列、即基准转谷氨酰胺酶(修饰前的转谷氨酰胺酶)的序列。将预序列的具体例示于序列号27(来自茂源链霉菌的转谷氨酰胺酶的预序列)，将前序列的具体例示于序列号28(来自茂源链霉菌的转谷氨酰胺酶的前序列)，将编码预序列的序列的具体例示于序列号29(编码来自茂源链霉菌的转谷氨酰胺酶的预序列的序列)，将编码前序列的序列的具体例示于序列号30(编码来自茂源链霉菌的转谷氨酰胺酶的前序列的序列)。

本发明的核酸可以通过参考本说明书或添加的序列表所公开的序列信息并使用标准的基因工程方法、分子生物学方法、生化学方法、化学合成等而制备成分离的状态。

在本发明的其它方案中，提供与编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列进行比较时其所编码的蛋白质的功能同等但一部分碱基序列有差异的核酸(以下，也称为“相同核酸”。另外，将规定相同核酸的碱基序列称为“相同碱基序列”)。作为相同核酸的例子，可举出将编码本发明的修饰型酶的核酸的碱基序列作为基准由包含1或多个碱基的取代、缺失、插入、附加或倒位的碱基序列构成且编码具有修饰型酶特征性的酶活性(即转谷氨酰胺酶活性)的蛋白质的DNA。碱基的取代、缺失等可以在多个部位产生。在此的“多个”也根据该核酸编码的蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位置、种类而不同，例如为2～40碱基，优选为2～20碱基，更优选为2～10碱基。

相同核酸相对于作为基准的碱基序列，具有例如60％以上、优选70％以上、更优选80％以上、更进一步优选85％以上、进一步优选约90％以上、更进一步优选95％以上、最优选99％以上的同源性。

如上所述的相同核酸例如通过限制性内切酶处理、利用核酸外切酶、DNA连接酶等的处理、利用位置指定突变导入法(Molecular Cloning,Third Edition,Chapter 13,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York)、随机突变导入法(Molecular Cloning,Third Edition,Chapter 13,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)的变异导入等而得到。另外，也可以通过紫外线照射等其它方法而得到相同核酸。

本发明的其它方案涉及具有与编码本发明修饰型酶的基因的碱基序列互补的碱基序列的核酸。本发明的再一其它方案提供相对于编码本发明修饰型酶的基因的碱基序列或与其互补的碱基序列具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％相同的碱基序列的核酸。

本发明的再一其它方案涉及具有对编码本发明修饰型酶的基因的碱基序列或与该相同碱基序列互补的碱基序列在严格的条件下进行杂交的碱基序列的核酸。在此的“严格的条件”是指形成所谓的特异性杂交、不形成非特异性杂交的条件。这样的严格的条件是本领域技术人员公知的，例如可以参照Molecular Cloning(Third Edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York)、Current protocols in molecular biology(edited by Frederick M.Ausubel et al.,1987)进行设定。作为严格的条件，例如可举出使用杂交液(50％甲酰胺、10×SSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))，在约42℃～约50℃孵育，然后，使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃～约70℃进行清洗的条件。作为进一步优选的严格的条件，例如可举出作为杂交液使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15MNaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))的条件。

本发明的再一其它方案提供具有编码本发明修饰型酶的基因的碱基序列或与其互补的碱基序列的一部分的核酸(核酸片段)。这样的核酸片段能够用于对具有编码本发明修饰型酶的基因的碱基序列的核酸等进行检测、鉴定和/或扩增等。核酸片段例如以至少包含与编码本发明修饰型酶的基因的碱基序列中连续的核苷酸部分(例如约10～约100碱基长、优选为约20～约100碱基长、进一步优选为约30～约100碱基长)进行杂交的部分的方式进行设计。作为探针进行利用时，可以将核酸片段标记化。标记化例如可以使用荧光物质、酶、放射性同位素。

本发明的再一其它方面涉及包含本发明的基因(编码修饰型酶的基因)的重组DNA。本发明的重组DNA例如以载体的形态提供。本说明书中，术语“载体”是指能够将插入其中的核酸运输至细胞等靶内的核酸性分子。

根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，还考虑宿主细胞的种类而选择适当的载体。作为以大肠杆菌作为宿主的载体，可例示M13噬菌体或其修饰体、λ噬菌体或其修饰体、pBR322或其修饰体(pB325、pAT153、pUC8等)、pET21等，作为以酵母作为宿主的载体，可例示pYepSec1、pMFa、pYES2、pPIC3.5K等，作为以昆虫细胞作为宿主的载体，可例示pAc、pVL等，作为以哺乳类细胞作为宿主的载体，可例示pCDM8、pMT2PC等。

本发明的载体优选为表达载体。“表达载体”是指能够将插入其中的核酸导入目标细胞(宿主细胞)内且在该细胞内能够表达的载体。表达载体通常包含对插入的核酸的表达所需要的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用包含选择标记物的表达载体。使用该表达载体时，可以利用选择标记物来确认表达载体有无导入(和其程度)。

本发明的核酸向载体的插入、选择标记物基因的插入(需要时)、启动子的插入(需要时)等可以使用标准的重组DNA技术(例如，可以参照Molecular Cloning,ThirdEdition,1.84,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York的、使用限制性内切酶和DNA连接酶的众所周知的方法)来进行。

作为宿主细胞，从处理容易性的方面考虑，可以使用曲霉(例如米曲霉)、芽孢杆菌属细菌(例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌)、短芽孢杆菌属细菌(例如短芽胞杆菌)、大肠杆菌(大肠杆菌)、出芽酵母(酿酒酵母)等微生物，只要是重组DNA能够复制且修饰型酶的基因能够表达的宿主细胞就可以利用。可以优选使用大肠杆菌(大肠杆菌)、出芽酵母(酿酒酵母)。也可以使链霉菌属微生物(例如茂源链霉菌)为宿主。另外，作为大肠杆菌的例子，利用T7系启动子时，可举出大肠杆菌BL21(DE3)，不是这种情况时，可举出大肠杆菌JM109。另外，作为出芽酵母的例子，可举出出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22或出芽酵母INVSc1(Invitrogen公司)。

本发明的其它方面涉及保有本发明的重组DNA的微生物(即转化体)。本发明的微生物可以通过使用了上述本发明载体的转染或转化而得到。例如，可通过氯化钙法(Journal of Molecular Biology(J.Mol.Biol.)、第53卷、第159页(1970))、Hanahan法(Journal of Molecular Biology、第166卷、第557页(1983))、SEM法(Gene、第96卷、第23页(1990))、Chung等的方法(Proceedings of the National Academy of Sciences of theUSA、第86卷、第2172页(1989))、磷酸钙共沉降法、电穿孔(Potter,H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,7161-7165(1984))、脂转染(Felgner,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,7413-7417(1984))等来实施。应予说明，本发明的微生物能够用于生产本发明的修饰型酶。

3.包含修饰型转谷氨酰胺酶的酶剂

本发明的修饰型酶例如可以以酶剂的形态提供。酶剂除有效成分(本发明的修饰型酶)以外，还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水、各种蛋白质、各种蛋白质的分解物、各种提取物类、各种盐类、各种抗氧化剂、半胱氨酸、谷胱甘肽、谷氨酸钠、肌苷酸钠、鸟苷酸钠、贝壳煅烧钙、二氧化硅等。作为赋形剂，可以使用淀粉、糊精、麦芽糖、海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖、甘油等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。蛋白质的例子为大豆蛋白质、小麦蛋白质、玉米蛋白质、乳蛋白质、动物来源蛋白质等。提取物类的例例子为肉提取物、植物提取物、酵母提取物等。盐类的例子为氯化盐、磷酸盐、聚磷酸盐、焦磷酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、碳酸盐等。抗氧化剂的例子为L-抗坏血酸盐、亚硫酸氢钠等。本发明的酶制剂的形状没有特别限定，例如为粉末状、颗粒状、液体状、胶囊状等。

4.修饰型转谷氨酰胺酶的制备方法

本发明的又一方面涉及一种修饰型酶的制备方法。在本发明的制备方法的一个方案中，通过基因工程方法制备本发明的修饰型酶。在该方案的情况下，准备编码本发明的修饰型酶的氨基酸序列(例如序列号2～10中的任一个)的核酸(步骤(I))。在此，“编码特定的氨基酸序列的核酸”是使其表达时得到具有该氨基酸序列的多肽的核酸，当然可以是由与该氨基酸序列对应的碱基序列构成的核酸，也可以对这样的核酸附加多余的序列(可以为编码氨基酸序列的序列，也可以为不编码氨基酸序列的序列)。另外，还考虑了密码子的简并。“编码本发明的修饰型酶的氨基酸序列的核酸”可以通过参考本说明书或添加的序列表所公开的序列信息并使用标准的基因工程方法、分子生物学方法、生物化学方法等而制备成分离的状态。在此，本发明的修饰型酶的氨基酸序列是对基准转谷氨酰胺酶的氨基酸序列实施变异而得的。因此，通过对编码基准转谷氨酰胺酶的基因施加必要的变异，也能够得到“编码本发明的修饰型酶的氨基酸序列的核酸”。用于位置特异性碱基序列取代的方法在该技术领域中已知有很多(例如，参照Molecular Cloning,Third Edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York)，可以从其中选择适当的方法而使用。作为位置特异性变异导入法，可以采用位置特异性氨基酸饱和变异法。位置特异性氨基酸饱和变异法是以蛋白质的立体结构为基础，推定与所要求的功能相关的位置，导入氨基酸饱和变异的“Semi-rational,semi-random”方法(J.Mol.Biol.331,585-592(2003))。例如可以使用Quick change(Stratagene公司)等试剂盒、Overlap extention PCR(Nucleic AcidRes.16,7351-7367(1988))导入位置特异性氨基酸饱和变异。PCR中使用的DNA聚合酶可以使用Taq聚合酶等。其中，优选使用KOD-PLUS-(东洋纺公司)、Pfu turbo(Stratagene公司)等精度高的DNA聚合酶。

步骤(I)之后，使准备的核酸表达(步骤(II))。例如，首先准备插入有上述核酸的表达载体，使用其将宿主细胞进行转化。

接着，在产生作为表达产物的修饰型酶的条件下培养转化体。转化体的培养只要依照常规方法进行即可。作为培养基中使用的碳源，只要是可同化的碳化合物即可，例如可以使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、丙酮酸等。另外，作为氮源，只要是可利用的氮化合物即可，例如可以使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、豆粕碱性提取物等。此外，可以根据需要使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等的盐类、特定的氨基酸、特定的维生素等。

另一方面，培养温度可以在30℃～40℃的范围内(优选为33～37℃附近)进行设定。培养时间可以考虑培养对象的转化体的生长特性、修饰型酶的产生特性等而进行设定。培养基的pH在转化体生长且产生酶的范围内进行制备。优选使培养基的pH为6.0～9.0左右(优选为pH7.0附近)。

接下来，回收表达产物(修饰型酶)(步骤(III))。虽然也可以将包含培养后的菌体的培养液直接或者在经过浓缩、杂质除去等后作为酶溶液进行利用，但通常从培养液或菌体暂时回收表达产物。表达产物如果为分泌型蛋白质，则可以从培养液回收，如果是其以外的蛋白质，则可以从菌体内回收。从培养液回收时，例如过滤培养上清液，进行离心处理而除去不溶物后，通过将减压浓缩、膜浓缩、利用硫酸铵或硫酸钠的盐析、利用甲醇、乙醇或丙酮等的分别沉淀法、透析、加热处理、等电点处理、凝胶过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等各种色谱法(例如，利用葡聚糖(Sephadex)凝胶(GE Healthcare Science)等的凝胶过滤、DEAE琼脂糖CL-6B(GE Healthcare Science)、辛基琼脂糖CL-6B(GEHealthcare Science)、CM琼脂糖CL-6B(GE Healthcare Science))等组合而进行分离、纯化，由此能够得到修饰型酶的纯化品。另一方面，从菌体内回收时，通过将培养液进行过滤、离心处理等而采取菌体，接着，通过加压处理、超声波处理、物理破碎处理等机械方法或利用溶菌酶等的酶方法将菌体破坏后，与上述同样地进行分离、纯化，由此能够得到修饰型酶的纯化品。

也可以将如上得到的纯化酶通过例如冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥等进行粉末化而提供。此时，可以将纯化酶预先溶解于磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris盐酸缓冲液、GOOD的缓冲液。可以优选使用磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液。应予说明，在此作为GOOD的缓冲液，可举出PIPES、MES或MOPS。

通常如上利用适当的宿主－载体系统进行基因的表达～表达产物(修饰型酶)的回收，但也可以利用无细胞合成系统。在此，无细胞合成系统(无细胞转录系统、无细胞转录/翻译系统)”是指不使用活细胞，使用来自活细胞的(或通过基因工程方法得到的)核糖体、转录·翻译因子等，根据作为模板的核酸(DNA、mRNA)在体外合成其所编码的mRNA、蛋白质。在无细胞合成系统中，通常使用根据需要将细胞破碎液纯化而得到的细胞提取液。在细胞提取液中通常包含蛋白质合成所需要的核糖体、起始因子等各种因子、tRNA等各种酶。进行蛋白质的合成时，在该细胞提取液中添加各种氨基酸、ATP、GTP等能量源、磷酸肌酸等蛋白质的合成所需要的其它物质。当然，在蛋白质合成时，可以根据需要补充另外准备的核糖体、各种因子和/或各种酶等。

也报告了将蛋白质合成所需要的各分子(因子)重建的转录/翻译系统的开发(Shimizu,Y.et al.：Nature Biotech.,19,751-755,2001)。在该合成系统中，从大肠杆菌基因组将由构成细菌的蛋白质合成系统的3种起始因子、3种延伸因子、与终止相关的4种因子、使各氨基酸与tRNA结合的20种氨基酰基tRNA合成酶以及甲硫氨酰tRNA甲酰转移酶构成的31种因子的基因进行扩增，使用它们在体外重建蛋白质合成系统。在本发明中可以利用这样的经重建的合成系统。

术语“无细胞转录/翻译系统”可以与无细胞蛋白质合成系统、体外翻译系统或体外转录/翻译系统交换使用。在体外翻译系统中，使用RNA作为模板来合成蛋白质。作为模板RNA，可使用总RNA、mRNA、体外转录产物等。在其它体外转录/翻译系统中，使用DNA作为模板。模板DNA应包含核糖体结合区域，另外，优选包含适当的终止子序列。应予说明，在体外转录/翻译系统中，以转录反应和翻译反应连续进行的方式设定添加各反应所需要的因子的条件。

实施例

＜对特性的提高有效的变异点的探索＞

为了获得有用性高的修饰型的转谷氨酰胺酶，使用蛋白质工程学尝试了来自茂源链霉菌的转谷氨酰胺酶(野生型酶，序列号1)的酶功能的改良(温度稳定性的降低、耐热性的提高、抗氧化性的提高、反应性的提高、脱酰胺酶化)。首先，导入基于氨基酸取代的变异，利用CASTing library(例如参照Angew Chem Int Ed Engl.2006Feb 13；45(8):1236-41.)和丙氨酸扫描(Ala scanning)(例如参照J Mol Biol.1995Feb 17；246(2):317-30.)来选出变异点的候补。接着，通过以下的方法向各变异点导入变异，制备变异酶。

1.变异酶的制备

1－1.变异的导入

(1)设计变异导入用的PCR引物。

(2)使用各变异点用的引物组，以整合有转谷氨酰胺酶基因(序列号17)的质粒pET20b作为模板进行PCR(将在98℃反应1分钟后、在98℃反应10秒、在60℃反应15秒、在68℃反应2分钟进行15个循环，在68℃反应5分钟后，在4℃放置)。

(3)在PCR反应液(25μL/管)中添加DpnI(1.5μL/管)进行处理(37℃、3小时以上)。

(4)使用T4激酶进行连接处理(16℃、一夜)。

(5)利用连接反应液(11μL/管)转化E.coli BL21(DE3)，在含有氨苄青霉素的LB培养基中进行培养(37℃、一夜)。

1－2.酶提取液的获得

(1)将导入了变异的菌株(变异株)接种于含有氨苄青霉素的TB培养基，在33℃培养48小时培养。在自培养开始起24小时的时刻添加IPTG(最终浓度0.1mM)。

(2)将培养液进行离心分离(3000g×10分钟)后，除去上清液而回收菌体。

(3)添加溶菌剂使菌体溶菌。

(4)将溶菌液进行离心分离(3000g×10分钟)后，回收上清液作为酶提取液。

1－3.成熟体化(前肽序列的除去)

(1)将酶提取液和2mg/mL蛋白酶(分散酶)溶液等量混合，使其反应(30℃、2小时以上)。

(2)将混合液进行离心分离(3000g×10分钟)后，回收上清液作为成熟体化酶。

2.变异酶的特性评价

在评价制备的各变异酶的特性时，使用以下的活性测定法。

＜活性测定法＞

将成熟体化酶用200mM Tris-HCl pH6.0稀释成适当的浓度(样品溶液)。在样品溶液10μL中添加底物溶液(R-1)100μL并混合后，在37℃反应10分钟。加入显色溶液(R-2)100μL使反应停止的同时形成Fe络合物后，测定525nm的吸光度。作为对照，使用预先进行了热失活的酶液测定同样地进行了反应的溶液的吸光度，求出与样品溶液的吸光度差。另外，使用L－谷氨酸－γ－单异羟肟酸代替酶液而制作标准曲线，由上述吸光度差求出生成的异羟肟酸的量。将1分钟内生成1μ摩尔的异羟肟酸的酶活性设为1单位(1U)。

(底物溶液(R-1))

将2-氨基-2-羟基甲基-1,3-丙二醇2.42g、盐酸羟铵0.70g、还原型谷胱甘肽0.31g、Z-Gln-Gly(苄氧羰基-L-谷氨酰胺基甘氨酸)1.01g溶解于蒸馏水并使总量为100mL(pH 6.0)。

(底物溶液(R-2))

将3M盐酸溶液30mL、12％三氯乙酸溶液30mL、5％氯化铁(III)溶液30mL混合。

2－1.温度稳定性/耐热性的评价

将成熟体化酶用200mM Tris-HCl pH6.0稀释2倍，以规定的温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)进行30分钟处理。处理后进行活性测定，通过与处理前的活性进行比较来算出活性的残留率。

通过以下的计算式算出在50℃进行30分钟处理时的活性残留率和相对于野生型的相对值，确定对温度稳定性的降低有效的氨基酸取代和对耐热性提高有效的氨基酸取代。

相对于野生型的相对值(％)＝(变异酶的活性残留率)/(野生型酶的活性残留率)×100

将温度稳定性的评价结果示于图1。将相对于野生型的相对值(％)为90％以下的以下(1)～(33)判断为有效的氨基酸取代。

(5)变异点为Y34，取代后的氨基酸为A

(10)变异点为Y62，取代后的氨基酸为C、R、G、K或S

(11)变异点为V65，取代后的氨基酸为N、L、M、F、W或Y

(12)变异点为V67，取代后的氨基酸为L、N、A、C、M、Q或S

(13)变异点为T68，取代后的氨基酸为C、L、A、S、M、F、N、Q或Y

(15)变异点为Q74，取代后的氨基酸为W、D、G或K

(16)变异点为Y75，取代后的氨基酸为R、Q、T或G

(17)变异点为T77，取代后的氨基酸为M、H、E、C或G

(18)变异点为F85，取代后的氨基酸为M

(19)变异点为F90，取代后的氨基酸为C、M、H、L或V

(20)变异点为F108，取代后的氨基酸为R、L、T、A、I、K、N或V

(21)变异点为F117，取代后的氨基酸为M或L

(22)变异点为S199，取代后的氨基酸为G、M、N、K或V

(23)变异点为F202，取代后的氨基酸为L或W

(24)变异点为W203，取代后的氨基酸为F

(25)变异点为F254，取代后的氨基酸为Y或M

(27)变异点为N276，取代后的氨基酸为C、E、K、L、S、T或V

(29)变异点为S284，取代后的氨基酸为W、Y、M、F或N

(32)变异点为S303，取代后的氨基酸为N、G、C、V、P或Y

(33)变异点为Y310，取代后的氨基酸为C、M或I

作为更优选的氨基酸取代，确定了相对于野生型的相对值(％)为30％以下的下述的氨基酸取代。

V6S、V6C、V6K、V6L、V6H、V6F、V6G、V6N、V6P、V6R、V6W、V6Y

R26M、R26H、R26Y、R26D、R26G、R26N、R26P、R26S

E28N、E28F、E28G、E28L、E28P、E28Y

Y34A

E58G、E58H

W59S、W59I、W59V、W59D、W59G、W59P

L60M、L60V、L60A、L60C、L60E、L60F、L60Q、L60S、L60T、L60W、L60Y

Y62C、Y62R、Y62G、Y62K、Y62S

V65N、V65L、V65M、V65F、V65W、V65Y

V67L、V67N、V67A、V67C、V67M、V67Q、V67S

T68M、T68F、T68N、T68Q、T68Y

Y75T、Y75G

F85M

F90V

F108T、F108A、F108I、F108K、F108N、F108V

F117L

S199K、S199V

F202W

N276C、N276E、N276K、N276L、N276T、N276V、N276S

Y291W、Y291L、Y291A、Y291C、Y291K、Y291N、Y291Q、Y291R、Y291S、Y291V

S299E

Y310I

作为特别优选的氨基酸取代，确定了相对于野生型的相对值(％)为10％以下的下述的氨基酸取代。

V6H、V6F、V6G、V6N、V6P、V6R、V6W、V6Y

R26H、R26Y、R26D、R26G、R26N、R26P、R26S

E28F、E28G、E28L、E28P、E28Y

Y34A

W59I、W59V、W59D、W59G、W59P

L60V、L60A、L60C、L60E、L60F、L60Q、L60S、L60T、L60W、L60Y

Y62C、Y62R、Y62G、Y62K、Y62S

V65M、V65F、V65W、V65Y

V67A、V67C、V67M、V67Q、V67S

T68F、T68N、T68Q、T68Y

Y75T、Y75G

F108A、F108I、F108K、F108N、F108V

F117L

F202W

T273F、T273Y、T273D、T273K、T273W、T273H

N276C、N276E、N276K、N276L、N276S、N276T、N276V

Y278K、Y278R、Y278W、Y278C、Y278G、Y278N、Y278Q、Y278S、Y278T、Y278V

Y291L、Y291A、Y291C、Y291K、Y291N、Y291Q、Y291R、Y291S、Y291V

S299E

将耐热性的评价结果示于图2。将相对于野生型的相对值(％)为110％以上的以下(34)～(45)判断为有效的氨基酸取代。

(34)变异点为D3，取代后的氨基酸为Q、P、E、S或Y

(35)变异点为R26，取代后的氨基酸为V

(36)变异点为Y34，取代后的氨基酸为W

(37)变异点为V67，取代后的氨基酸为H

(38)变异点为T68，取代后的氨基酸为V或I

(39)变异点为Q74，取代后的氨基酸为F

(40)变异点为T77，取代后的氨基酸为Q

(41)变异点为S199，取代后的氨基酸为C或Q

(42)变异点为T273，取代后的氨基酸为Q

(43)变异点为S284，取代后的氨基酸为L、H、K、P或R

(44)变异点为S299，取代后的氨基酸为N

(45)变异点为S303，取代后的氨基酸为K

作为更优选的氨基酸取代，确定了相对于野生型的相对值(％)为120％以上的下述的氨基酸取代。

D3P、D3E、D3S、D3Y

R26V

Y34W

V67H

T77Q

S199C、S199Q

T273Q

S284H、S284K、S284P、S284R

S303K

作为特别优选的氨基酸取代，确定了相对于野生型的相对值(％)为130％以上的下述的氨基酸取代。

D3E、D3S、D3Y

R26V

Y34W

V67H

S199Q

T273Q

S284H、S284K、S284P、S284R

2－2.抗氧化性的评价

将过氧化氢(30～35％)(Wako，特级试剂)用200mM Tris-HCl pH6.0进行稀释，制备作为氧化剂的过氧化氢溶液(0.03％)。将成熟体酶用过氧化氢溶液稀释2倍后，在30℃反应1小时。在反应后进行活性测定，通过与处理前的活性进行比较来算出活性的残留率。

通过以下的计算式算出进行了过氧化氢处时的活性残留率和相对于野生型的相对值，确定了对抗氧化性的提高有效的氨基酸取代。

将抗氧化性的评价结果示于图3。将相对于野生型的相对值(％)为110％以上的以下(46)～(59)判断为有效的氨基酸取代。

(46)变异点为D3，取代后的氨基酸为E、Q、S或Y

(47)变异点为V6，取代后的氨基酸为P

(50)变异点为Y42，取代后的氨基酸为L、N或F

(52)变异点为V67，取代后的氨基酸为T、S或A

(53)变异点为T68，取代后的氨基酸为L、I、V或M

(54)变异点为Q74，取代后的氨基酸为V

(55)变异点为T77，取代后的氨基酸为D

(56)变异点为S199，取代后的氨基酸为C

(57)变异点为T273，取代后的氨基酸为E

(58)变异点为S284，取代后的氨基酸为R或H

(59)变异点为Y291，取代后的氨基酸为I、S、F、L、C、N、V或M

D3S、D3Y

V6P

E58A、E58I、E58V、E58L、E58T、E58M、E58K、E58Y、E58W、E58F、E58R

V67S、V67A

T68I、T68V、T68M

T273E

S284R、S284H

Y291C、Y291N、Y291V、Y291M

V6P

E28V、E28R、E28W、E28G、E28N、E28F、E28Y、E28H

Y42F

E58I、E58V、E58L、E58T、E58M、E58K、E58Y、E58W、E58F、E58R

T68I、T68V、T68M

S284H

2－3.反应性的评价

将成熟体化酶用200mM Tris-HCl pH6.0稀释成适当的浓度(样品溶液)，进行活性测定。通过以下的计算式算出相对于野生型的相对值，确定了对反应性的提高有效的氨基酸取代。

相对于野生型的相对值(％)＝(变异酶的活性)/(野生型酶的活性)×100

应予说明，在求出比活性时，测定样品溶液的吸光度280nm而算出蛋白质浓度，由活性测定值和蛋白质浓度算出比活性。

将反应性的评价结果示于图4。将相对于野生型的相对值(％)为110％以上的以下的(60)～(63)判断为有效的氨基酸取代。

(60)变异点为S284，取代后的氨基酸为M、K或V

(61)变异点为F251，取代后的氨基酸为Y

S284V

F251Y

V6E和Y75F的双重变异

D3P和T77Q的双重变异

V6E和Y75F的双重变异

D3P和T77Q的双重变异

如图5所示，以下的(64)～(91)是带来两个以上的特性变化，对复合性改良有效的氨基酸取代。

(71)变异点为E28，取代后的氨基酸为V、S、R、K、M、N、F、G、L或Y，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低和抗氧化性提高

以上的氨基酸取代中，下述的氨基酸取代伴有温度稳定性的降低和抗氧化性的提高这样的也可以说是相反这样的两个特性变化。鉴定了这样的氨基酸取代是出乎预料的成果。伴有这样的特征性氨基酸取代的修饰型酶可期待在需要以低温使酶失活的食品用途中利用。

R26K、R26Q、R26M、R26Y、R26D、R26G、R26N、R26P、R26SE28V、E28R、E28K、E28M、E28N、E28F、E28G、E28L、E28Y

Y42F、Y42L、Y42M

E58Y、E58M、E58A、E58F、E58I、E58V、E58R、E58K、E58L、E58Q

V67A、V67S

T68C、T68L、T68M

T77C

T273E

Y291I、Y291L、Y291C、Y291N、Y291S、Y291V

2－4.脱酰胺酶化的评价

将成熟体酶的脱酰胺活性和转谷氨酰胺酶活性分别作为相对于野生型酶的相对值通过以下的计算式而算出后，通过脱酰胺活性(相对于野生型比率)/转谷氨酰胺酶活性(相对于野生型比率)的值来评价底物特异性的变化(即，脱酰胺酶化)的程度，确定了对脱酰胺酶化有效的氨基酸取代。应予说明，脱酰胺活性通过以下的方法进行测定，对于转谷氨酰胺酶活性，通过使用底物溶液(R-1)的上述活性测定法进行测定。

脱酰胺活性(相对于野生型比率)(％)＝(变异酶的脱酰胺活性)/(野生型酶的脱酰胺活性)×100

转谷氨酰胺酶活性(相对于野生型比率)(％)＝(变异酶的转谷氨酰胺酶活性)/(野生型酶的转谷氨酰胺酶活性)×100

＜脱酰胺活性的测定方法＞

将成熟体化酶用200mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)稀释成适当的浓度(样品溶液)。在样品溶液20μL中添加底物溶液(1％Z-Gln-Gly、200mM磷酸钾缓冲液、pH7.0)80μL并混合后，在37℃反应24小时。使用Ammonia Test Wako(WAKO)，在反应样品20μL中添加显色试剂A 40μL、显色试剂B 20μL、显色试剂C 40μL，在37℃反应10分钟。将显色样品50μL和除蛋白液50μL混合，进行离心分离后，回收上清液，测定630nm的吸光度。

将脱酰胺酶化的评价结果示于图6。如果脱酰胺活性/转谷氨酰胺酶活性的值超过1，则产生脱酰胺酶化。将以下的(92)～(134)判断为有效的氨基酸取代。

(93)变异点为Y34，取代后的氨基酸为H或M

(94)变异点为W59，取代后的氨基酸为K或E

(96)变异点为Y62，取代后的氨基酸为D或P

(98)变异点为V65，取代后的氨基酸为C、T或K

(99)变异点为G66，取代后的氨基酸为W或K

(100)变异点为T68，取代后的氨基酸为P或H

(101)变异点为W69，取代后的氨基酸为Y、D或P

(102)变异点为Q74，取代后的氨基酸为R或P

(104)变异点为F108，取代后的氨基酸为Q、C、E、S或N

(105)变异点为F117，取代后的氨基酸为C、I、W、V、A、G、T或N

(106)变异点为Y198，取代后的氨基酸为F、H、L、S、M或I

(107)变异点为S199，取代后的氨基酸为Q或P

(108)变异点为K200，取代后的氨基酸为Y、M、I、R、L或V

(109)变异点为H201，取代后的氨基酸为K、R、M、L或Q

(110)变异点为F202，取代后的氨基酸为Y、M、H、V或C

(111)变异点为W203，取代后的氨基酸为Y

(112)变异点为F223，取代后的氨基酸为Y、M、L、W、V、H、G或A

(113)变异点为R238，取代后的氨基酸为A、D、V、G、H或S

(115)变异点为V252，取代后的氨基酸为M、L、T或C

(116)变异点为N253，取代后的氨基酸为T、V、K、C或R

(117)变异点为Y256，取代后的氨基酸为L、V或I

(118)变异点为G257，取代后的氨基酸为A或C

(119)变异点为W258，取代后的氨基酸为Y、F或N

(120)变异点为T273，取代后的氨基酸为N

(122)变异点为N276，取代后的氨基酸为G、M、Q或H

(124)变异点为Y278，取代后的氨基酸为P或D

(125)变异点为H279，取代后的氨基酸为N

(126)变异点为S284，取代后的氨基酸为C

(127)变异点为M288，取代后的氨基酸为V、Q或T

(128)变异点为V290，取代后的氨基酸为T、C、L、M、A、S或N

(129)变异点为Y291，取代后的氨基酸为H、T、E或G

(130)变异点为W298，取代后的氨基酸为F、Y、I、L或M

(131)变异点为S299，取代后的氨基酸为N或P

(133)变异点为S303，取代后的氨基酸为I、Q、D、H或E

(134)变异点为F305，取代后的氨基酸为W、H或Y

作为更优选的氨基酸取代，确定了脱酰胺活性/转谷氨酰胺酶活性的值为1.2以上的下述的氨基酸取代。

R5Q、R5P、R5C、R5M、R5I、R5V、R5Y、R5F、R5S、R5N、R5T、R5G

Y34H、Y34M

W59K、W59E

Y62D、Y62P

V65C、V65T、V65K

G66W、G66K

T68P、T68H

W69Y、W69D、W69P

Q74R、Q74P

F108Q、F108C、F108E、F108S、F108N

F117C、F117I、F117W、F117V、F117A、F117G、F117T、F117N

Y198F、Y198H、Y198L、Y198S、Y198M、Y198I

S199Q、S199P

K200Y、K200M、K200I、K200R、K200L、K200V

H201K、H201R、H201M、H201L、H201Q

F202Y、F202M、F202H、F202V、F202C

W203Y

F223Y、F223M、F223L、F223W、F223V、F223H、F223G、F223AR238A、R238D、R238V、R238G、R238H、R238S

V252M、V252L、V252T、V252C

N253T、N253V、N253K、N253C、N253R

Y256L、Y256V、Y256I

G257A、G257C

W258Y、W258F、W258N

T273N

N276G、N276M、N276Q、N276H

Y278P、Y278D

H279N

S284C

M288V、M288Q、M288T

V290T、V290C、V290L、V290M、V290A、V290S、V290N

Y291H、Y291T、Y291E、Y291G

W298F、W298Y、W298I、W298L、W298M

S299N、S299P

Y302L、Y302H、Y302M、Y302V、Y302C、Y302T、Y302P、Y302S、Y302W

S303I、S303Q、S303D、S303H、S303E

F305W、F305H、F305Y

作为进一步优选的氨基酸取代，确定了脱酰胺活性/转谷氨酰胺酶活性的值为2以上的下述的氨基酸取代。

R5Y、R5F、R5S、R5N、R5T、R5G

Y34M

Y62P

V65C、V65T、V65K

G66K

T68P、T68H

W69D、W69P

F85L、F85I、F85Q、F85C、F85T、F85A、F85V、F85S、F85R、F85H、F85N

F108C、F108E、F108S、F108N

F117C、F117I、F117W、F117V、F117A、F117G、F117T、F117N

Y198L、Y198S、Y198M、Y198I

S199Q、S199P

K200Y、K200M、K200I、K200R、K200L、K200V

H201K、H201R、H201M、H201L、H201Q

F202M、F202H、F202V、F202C

W203Y

F223M、F223L、F223W、F223V、F223H、F223G、F223A

R238H、R238S

V252L、V252T、V252C

N253T、N253V、N253K、N253C、N253R

Y256L、Y256V、Y256I

G257A、G257C

W258Y、W258F、W258N

T273N

N276G、N276M、N276Q、N276H

Y278P、Y278D

M288Q、M288T

V290M、V290A、V290S、V290N

Y291T、Y291E、Y291G

W298F、W298Y、W298I、W298L、W298M

S299P

Y302L、Y302H、Y302M、Y302V、Y302C、Y302T、Y302P、Y302S、Y302W

F305H、F305Y

作为特别优选的氨基酸取代，确定了脱酰胺活性/转谷氨酰胺酶活性的值为10以上的下述的氨基酸取代。

Y62P

V65T、V65K

G66K

T68P、T68H

W69D、W69P

F85H、F85N

F117G、F117T、F117N

Y198S、Y198M、Y198I

S199P

K200M、K200I、K200R、K200L、K200V

H201M、H201L、H201Q

F202V、F202C

W203Y

F223W、F223V、F223H、F223G、F223A

F251L、F251P、F251G、F251V、F251Q

N253T、N253V、N253K、N253C、N253R

Y256L、Y256V、Y256I

G257C

W258N

N276G、N276M、N276Q、N276H

Y278P、Y278D

M288T

V290S、V290N

Y291G

W298Y、W298I、W298L、W298M

F305Y

产业上的可利用性

本发明的修饰型转谷氨酰胺酶改善了实用上重要的特性，产业价值高。因此，在现有的用途中的利用自不必言，还可期待应用于新的用途。

本发明并不受上述发明的实施方式和实施例的说明任何限定。在不脱离权利要求书的记载且本领域技术人员能够容易地想到的范围内的各种变形方案也包含在本发明中。本说明书中明示的论文、公开专利公报和专利公报等内容通过援引其全部内容而进行引用。

序列表自由文本

序列号2：人工序列的说明：R26N变异体

序列号3：人工序列的说明：R26Y变异体

序列号4：人工序列的说明：R26S变异体

序列号5：人工序列的说明：E28N变异体

序列号6：人工序列的说明：E28G变异体

序列号7：人工序列的说明：E28F变异体

序列号8：人工序列的说明：E28Y变异体

序列号9：人工序列的说明：E58R变异体

序列号10：人工序列的说明：E58L变异体

序列号18：人工序列的说明：R26N变异体

序列号19：人工序列的说明：R26Y变异体

序列号20：人工序列的说明：R26S变异体

序列号21：人工序列的说明：E28N变异体

序列号22：人工序列的说明：E28G变异体

序列号23：人工序列的说明：E28F变异体

序列号24：人工序列的说明：E28Y变异体

序列号25：人工序列的说明：E58R变异体

序列号26：人工序列的说明：E58L变异体

序列表

<110> 天野酶制品株式会社

<120> 修饰型转谷氨酰胺酶

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Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr

340 345 350

His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His

355 360 365

Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Asp Gly Tyr Ser Asp Phe

370 375 380

Asp Arg Gly Ala Tyr Val Val Thr Phe Val Pro Lys Ser Trp Asn Thr

385 390 395 400

Ala Pro Asp Lys Val Thr Gln Gly Trp Pro

405 410

<210> 12

<211> 418

<212> PRT

<213> 白网链霉菌

<400> 12

Met Tyr Lys Arg Pro Arg Phe Leu Thr Phe Ala Ala Ala Gly Ala Val

1 5 10 15

Ile Cys Thr Ala Gly Phe Thr Pro Ser Val Ser Gln Ala Ala Gly Gly

20 25 30

Gly Asp Val Val Thr Lys Gly Ser Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr

35 40 45

Ala Asp Asp Ile Lys Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Arg Ala Met Ala

50 55 60

Val Gly Gln Pro Asp Lys Pro Pro Thr Glu Thr Pro Pro Ser Ala Gly

65 70 75 80

Pro Pro Ser Arg Thr Pro Asp Ser Asp Asp Asp Arg Glu Thr Pro Pro

85 90 95

Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Ala Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly

100 105 110

Arg Ala Thr Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val

115 120 125

Tyr Ser His Arg Asp Gly Lys Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg

130 135 140

Glu Met Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly

145 150 155 160

Leu Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asn Lys

165 170 175

Tyr Lys Asn Asp Leu Thr Asn Thr Ser Pro Arg Pro Gly Glu Thr Arg

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195 200 205

Gly Phe Lys Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu

210 215 220

Glu Asn Ala His Asp Glu Gly Thr Tyr Ile Ser Asn Leu Lys Ala Asp

225 230 235 240

Leu Thr Asn Lys Asn Asp Ala Leu Leu His Glu Asp Ser Arg Ser Asn

245 250 255

Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Arg Glu Arg Asp Gly

260 265 270

Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His

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Phe Trp Ser Gly Gln Asp Gln Arg Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr

290 295 300

Gly Asp Ala Glu Ala Phe Arg Pro Asp Gln Gly Thr Gly Leu Val Asp

305 310 315 320

Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu

325 330 335

Gly Trp Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala

340 345 350

Asp Ala Asp Lys Thr Thr Trp Thr His Gly Asp His Tyr His Ala Pro

355 360 365

Asn Ser Asp Leu Gly Pro Met His Val His Glu Ser Lys Phe Arg Asn

370 375 380

Trp Ser Ala Gly Tyr Ala Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr

385 390 395 400

Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Gly Lys Val Glu Gln Gly

405 410 415

Trp Pro

<210> 13

<211> 400

<212> PRT

<213> 叶状链霉菌

<400> 13

Phe Ala Thr Val Ser Ala Val Val Cys Thr Ala Gly Leu Met Pro Ser

1 5 10 15

Val Ser Gln Ala Ala Gly Asn Arg Glu Gly Glu Glu Lys Pro Ser Tyr

20 25 30

Ala Glu Thr His Gly Leu Thr Ala Ala Asp Val Glu Asn Ile Asn Ala

35 40 45

Leu Asn Glu Arg Ala Leu Thr Leu Gly Arg His Gly Ala Thr Pro Ser

50 55 60

Phe Arg Ala Pro Asp Ser Ala Asn Val Arg Glu Thr Pro Pro Ala Glu

65 70 75 80

Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Ala Tyr Arg Ala Arg Gly Gly Arg Ala

85 90 95

Thr Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser

100 105 110

His Leu Asp Gly Lys Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Lys

115 120 125

Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Pro Tyr

130 135 140

Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ser Phe Phe Asp Glu Asp Lys Tyr Lys

145 150 155 160

Asn Asp Leu Lys Asn Thr Arg Pro Leu Ala Gly Glu Thr Arg Ala Glu

165 170 175

Phe Glu Gly Arg Ile Ala Lys Ala Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly Phe

180 185 190

Lys Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser Ile Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn

195 200 205

Ala His Asp Glu Gly Ala Tyr Leu Asp Lys Leu Lys Thr Glu Leu Thr

210 215 220

Asn Asn Asn Asp Ala Leu Leu His Glu Asp Ser Arg Ser Asn Phe Tyr

225 230 235 240

Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asp Gly Gly Asn

245 250 255

Tyr Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp

260 265 270

Ser Gly Gln Asp Gln Arg Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp

275 280 285

Pro Glu Ala Phe Arg Pro Asp Arg Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser

290 295 300

Lys Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Ala Asn Pro Gly Glu Gly Trp

305 310 315 320

Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala

325 330 335

Asp Lys Thr Ile Trp Thr His Gly Asp His Tyr His Ala Pro Asn Gly

340 345 350

Asp Leu Gly Pro Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser

355 360 365

Ala Gly Tyr Ala Asp Phe Asp Arg Gly Thr Tyr Met Ile Ala Leu Ile

370 375 380

Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Ala Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro

385 390 395 400

<210> 14

<211> 418

<212> PRT

<213> 肉桂链霉菌

<400> 14

Met His Gln Arg Arg Arg Leu Leu Ala Phe Ala Thr Val Gly Ala Phe

1 5 10 15

Ile Cys Thr Ala Gly Leu Thr Pro Ser Val Ser Gln Ala Ala Gly Ser

20 25 30

Gly Asp Gly Lys Glu Lys Gly Ser Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr

35 40 45

Ala Asp Asp Val Lys Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala Leu Thr

50 55 60

Leu Gly Gln Pro Gly Lys Pro Pro Ala Glu Leu Pro Pro Ser Ala Ser

65 70 75 80

Ala Ser Ser Arg Ala Pro Ala Ser Asp Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro

85 90 95

Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Ala Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly

100 105 110

Arg Ala Thr Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val

115 120 125

Tyr Ser His Arg Asp Gly Lys Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg

130 135 140

Glu Lys Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly

145 150 155 160

Pro Tyr Pro Thr Asn Lys Leu Ala Phe Ala Phe Phe Asp Glu Asn Lys

165 170 175

Tyr Lys Asn Asp Leu Lys Asn Thr Ser Pro Arg Pro Gly Glu Thr Arg

180 185 190

Ala Glu Phe Glu Gly Arg Ile Ala Lys Asp Ser Phe Asp Glu Gly Lys

195 200 205

Gly Phe Lys Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser Ile Met Asn Lys Ala Leu

210 215 220

Glu Asn Ala His Asp Glu Gly Thr Tyr Ile Asp His Leu Lys Thr Glu

225 230 235 240

Leu Thr Asn Lys Asn Asp Ala Leu Leu His Glu Asp Ser Arg Ser Asn

245 250 255

Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asp Gly

260 265 270

Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His

275 280 285

Phe Trp Ser Gly Gln Asp Gln Arg Gly Pro Ser Asp Lys Arg Lys Tyr

290 295 300

Gly Asp Pro Glu Ala Phe Arg Pro Ala Gln Gly Thr Gly Leu Val Asp

305 310 315 320

Met Ser Lys Asp Lys Ser Ile Pro Arg Ser Pro Ala Asn Pro Gly Glu

325 330 335

Gly Trp Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala

340 345 350

Asp Ala Asp Asn Thr Thr Trp Thr His Gly Asp His Tyr His Ala Pro

355 360 365

Asn Ser Asp Leu Gly Pro Met His Val His Glu Ser Lys Phe Arg Lys

370 375 380

Trp Ser Ala Gly Tyr Glu Asp Phe Asp Arg Gly Ser Tyr Val Ile Thr

385 390 395 400

Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Ala Ala Val Lys Gln Gly

405 410 415

Trp Pro

<210> 15

<211> 418

<212> PRT

<213> 普拉特链霉菌

<400> 15

Met Tyr Lys Arg Arg Ser Leu Leu Ala Phe Ala Thr Val Ser Ala Ala

1 5 10 15

Ile Phe Thr Ala Gly Val Met Pro Ser Val Ser His Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Gly Asp Gly Glu Thr Glu Gly Ser Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr

35 40 45

Ala Glu Asp Val Lys Asn Ile Asn Ala Leu Asn Lys Arg Ala Leu Thr

50 55 60

Ala Gly Gln Pro Gly Asn Ser Leu Ala Glu Leu Pro Pro Ser Val Ser

65 70 75 80

Ala Leu Phe Arg Ala Pro Asp Ala Ala Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro

85 90 95

Ala Glu Pro Leu Asn Arg Met Pro Asp Ala Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly

100 105 110

Arg Ala Thr Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val

115 120 125

Tyr Ser His Arg Asp Gly Ile Gln Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg

130 135 140

Glu Lys Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly

145 150 155 160

Pro Tyr Pro Thr Asn Lys Leu Ala Phe Ala Phe Phe Asp Glu Asp Lys

165 170 175

Tyr Lys Ser Asp Leu Glu Asn Ser Arg Pro Arg Pro Asn Glu Thr Gln

180 185 190

Ala Glu Phe Glu Gly Arg Ile Val Lys Asp Ser Phe Asp Glu Gly Lys

195 200 205

Gly Phe Lys Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu

210 215 220

Asp Ser Ala His Asp Glu Gly Thr Tyr Ile Asp Asn Leu Lys Lys Glu

225 230 235 240

Leu Ala Asn Lys Asn Asp Ala Leu Arg Tyr Glu Asp Ser Arg Ser Asn

245 250 255

Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asp Gly

260 265 270

Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala Val Val Tyr Ser Lys His

275 280 285

Phe Trp Ser Gly Gln Asp Gln Arg Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr

290 295 300

Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Asp Gln Gly Thr Gly Leu Val Asp

305 310 315 320

Met Ser Lys Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Ala Arg Pro Gly Glu

325 330 335

Ser Trp Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala

340 345 350

Asp Ala Asp Lys Thr Ile Trp Thr His Ala Asn His Tyr His Ala Pro

355 360 365

Asn Gly Gly Val Gly Pro Met Asn Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn

370 375 380

Trp Ser Ala Gly Tyr Ala Asp Phe Asp Arg Gly Thr Tyr Val Ile Thr

385 390 395 400

Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Ala Glu Val Lys Gln Gly

405 410 415

Trp Ser

<210> 16

<211> 418

<212> PRT

<213> 吸水链霉菌

<400> 16

Met Tyr Lys Arg Arg Ser Leu Leu Ala Phe Ala Thr Val Ser Ala Ala

1 5 10 15

Ile Phe Thr Ala Gly Val Met Pro Ser Val Ser His Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Gly Asp Gly Glu Arg Glu Gly Ser Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr

35 40 45

Ala Glu Asp Val Lys Asn Ile Asn Ala Leu Asn Lys Arg Ala Leu Thr

50 55 60

Ala Gly Gln Pro Gly Asn Ser Leu Ala Glu Leu Pro Pro Ser Val Ser

65 70 75 80

Ala Leu Phe Arg Ala Pro Asp Ala Ala Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro

85 90 95

Ala Glu Pro Leu Asn Arg Met Pro Asp Ala Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly

100 105 110

Arg Ala Thr Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val

115 120 125

Tyr Ser His Arg Asp Gly Ile Gln Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg

130 135 140

Glu Lys Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly

145 150 155 160

Pro Tyr Pro Thr Asn Lys Leu Ala Phe Ala Phe Phe Asp Glu Asp Lys

165 170 175

Tyr Lys Ser Asp Leu Glu Asn Ser Arg Pro Arg Pro Asn Glu Thr Gln

180 185 190

Ala Glu Phe Glu Gly Arg Ile Val Lys Asp Ser Phe Asp Glu Gly Lys

195 200 205

Gly Phe Lys Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser Ile Met Asn Lys Ala Leu

210 215 220

Asp Ser Ala His Asp Glu Gly Thr Tyr Ile Asp Asn Leu Lys Lys Glu

225 230 235 240

Leu Ala Asn Lys Asn Asp Ala Leu Arg Tyr Glu Asp Ser Arg Ser Asn

245 250 255

Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asp Gly

260 265 270

Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala Val Val Tyr Ser Lys His

275 280 285

Phe Trp Ser Gly Gln Asp Gln Arg Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr

290 295 300

Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Asp Gln Gly Thr Gly Leu Val Asp

305 310 315 320

Met Ser Lys Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Ala Arg Pro Gly Glu

325 330 335

Ser Trp Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala

340 345 350

Asp Ala Asp Lys Thr Ile Trp Thr His Ala Asn His Tyr His Ala Pro

355 360 365

Asn Gly Gly Val Gly Pro Met Asn Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn

370 375 380

Trp Ser Ala Gly Tyr Ala Asp Phe Asp Arg Gly Thr Tyr Val Ile Thr

385 390 395 400

Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Ala Glu Val Lys Gln Gly

405 410 415

Trp Ser

<210> 17

<211> 1134

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌

<400> 17

atggacaatg gcgcggggga agagacgaag tcctacgccg aaacctaccg cctcacggcg 60

gatgacgtcg cgaacatcaa cgcgctcaac gaaagcgctc cggccgcttc gagcgccggc 120

ccgtcgttcc gggcccccga ctccgacgac agggtcaccc ctcccgccga gccgctcgac 180

aggatgcccg acccgtaccg tccctcgtac ggcagggccg agacggtcgt caacaactac 240

atacgcaagt ggcagcaggt ctacagccac cgcgacggca ggaagcagca gatgaccgag 300

gagcagcggg agtggctgtc ctacggctgc gtcggtgtca cctgggtcaa ttcgggtcag 360

tacccgacga acagactggc cttcgcgtcc ttcgacgagg acaggttcaa gaacgagctg 420

aagaacggca ggccccggtc cggcgagacg cgggcggagt tcgagggccg cgtcgcgaag 480

gagagcttcg acgaggagaa gggcttccag cgggcgcgtg aggtggcgtc cgtcatgaac 540

agggccctgg agaacgccca cgacgagagc gcttacctcg acaacctcaa gaaggaactg 600

gcgaacggca acgacgccct gcgcaacgag gacgcccgtt ccccgttcta ctcggcgctg 660

cggaacacgc cgtccttcaa ggagcggaac ggaggcaatc acgacccgtc caggatgaag 720

gccgtcatct actcgaagca cttctggagc ggccaggacc ggtcgagttc ggccgacaag 780

aggaagtacg gcgacccgga cgccttccgc cccgccccgg gcaccggcct ggtcgacatg 840

tcgagggaca ggaacattcc gcgcagcccc accagccccg gtgagggatt cgtcaatttc 900

gactacggct ggttcggcgc ccagacggaa gcggacgccg acaagaccgt ctggacccac 960

ggaaatcact atcacgcgcc caatggcagc ctgggtgcca tgcatgtcta cgagagcaag 1020

ttccgcaact ggtccgaggg ttactcggac ttcgaccgcg gagcctatgt gatcaccttc 1080

atccccaaga gctggaacac cgcccccgac aaggtaaagc agggctggcc gtga 1134

<210> 18

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R26N 变异体

<400> 18

gactccgacg acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc cgacccgtac 60

cgtccctcgt acggcaacgc cgagacggtc gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag 120

gtctacagcc accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg ggagtggctg 180

tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc aattcgggtc agtacccgac gaacagactg 240

gccttcgcgt ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg 300

tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag 360

aagggcttcc agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct ggagaacgcc 420

cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc 480

ctgcgcaacg aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc 540

aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag 600

cacttctgga gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta cggcgacccg 660

gacgccttcc gccccgcccc gggcaccggc ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt 720

ccgcgcagcc ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcggc 780

gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg 840

cccaatggca gcctgggtgc catgcatgtc tacgagagca agttccgcaa ctggtccgag 900

ggttactcgg acttcgaccg cggagcctat gtgatcacct tcatccccaa gagctggaac 960

accgcccccg acaaggtaaa gcagggctgg ccgtga 996

<210> 19

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R26Y 变异体

<400> 19

gactccgacg acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc cgacccgtac 60

cgtccctcgt acggctacgc cgagacggtc gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag 120

gtctacagcc accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg ggagtggctg 180

tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc aattcgggtc agtacccgac gaacagactg 240

gccttcgcgt ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg 300

tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag 360

aagggcttcc agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct ggagaacgcc 420

cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc 480

ctgcgcaacg aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc 540

aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag 600

cacttctgga gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta cggcgacccg 660

gacgccttcc gccccgcccc gggcaccggc ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt 720

ccgcgcagcc ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcggc 780

gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg 840

cccaatggca gcctgggtgc catgcatgtc tacgagagca agttccgcaa ctggtccgag 900

ggttactcgg acttcgaccg cggagcctat gtgatcacct tcatccccaa gagctggaac 960

accgcccccg acaaggtaaa gcagggctgg ccgtga 996

<210> 20

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R26S 变异体

<400> 20

gactccgacg acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc cgacccgtac 60

cgtccctcgt acggcagcgc cgagacggtc gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag 120

gtctacagcc accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg ggagtggctg 180

tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc aattcgggtc agtacccgac gaacagactg 240

gccttcgcgt ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg 300

tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag 360

aagggcttcc agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct ggagaacgcc 420

cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc 480

ctgcgcaacg aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc 540

aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag 600

cacttctgga gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta cggcgacccg 660

gacgccttcc gccccgcccc gggcaccggc ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt 720

ccgcgcagcc ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcggc 780

gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg 840

cccaatggca gcctgggtgc catgcatgtc tacgagagca agttccgcaa ctggtccgag 900

ggttactcgg acttcgaccg cggagcctat gtgatcacct tcatccccaa gagctggaac 960

accgcccccg acaaggtaaa gcagggctgg ccgtga 996

<210> 21

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E28N 变异体

<400> 21

gactccgacg acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc cgacccgtac 60

cgtccctcgt acggcagggc caacacggtc gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag 120

gtctacagcc accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg ggagtggctg 180

tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc aattcgggtc agtacccgac gaacagactg 240

gccttcgcgt ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg 300

tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag 360

aagggcttcc agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct ggagaacgcc 420

cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc 480

ctgcgcaacg aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc 540

aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag 600

cacttctgga gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta cggcgacccg 660

gacgccttcc gccccgcccc gggcaccggc ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt 720

ccgcgcagcc ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcggc 780

gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg 840

cccaatggca gcctgggtgc catgcatgtc tacgagagca agttccgcaa ctggtccgag 900

ggttactcgg acttcgaccg cggagcctat gtgatcacct tcatccccaa gagctggaac 960

accgcccccg acaaggtaaa gcagggctgg ccgtga 996

<210> 22

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E28G 变异体

<400> 22

gactccgacg acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc cgacccgtac 60

cgtccctcgt acggcagggc cggcacggtc gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag 120

gtctacagcc accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg ggagtggctg 180

tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc aattcgggtc agtacccgac gaacagactg 240

gccttcgcgt ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg 300

tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag 360

aagggcttcc agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct ggagaacgcc 420

cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc 480

ctgcgcaacg aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc 540

aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag 600

cacttctgga gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta cggcgacccg 660

gacgccttcc gccccgcccc gggcaccggc ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt 720

ccgcgcagcc ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcggc 780

gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg 840

cccaatggca gcctgggtgc catgcatgtc tacgagagca agttccgcaa ctggtccgag 900

ggttactcgg acttcgaccg cggagcctat gtgatcacct tcatccccaa gagctggaac 960

accgcccccg acaaggtaaa gcagggctgg ccgtga 996

<210> 23

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E28F 变异体

<400> 23

gactccgacg acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc cgacccgtac 60

cgtccctcgt acggcagggc cttcacggtc gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag 120

gtctacagcc accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg ggagtggctg 180

tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc aattcgggtc agtacccgac gaacagactg 240

gccttcgcgt ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg 300

tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag 360

aagggcttcc agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct ggagaacgcc 420

cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc 480

ctgcgcaacg aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc 540

aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag 600

cacttctgga gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta cggcgacccg 660

gacgccttcc gccccgcccc gggcaccggc ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt 720

ccgcgcagcc ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcggc 780

gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg 840

cccaatggca gcctgggtgc catgcatgtc tacgagagca agttccgcaa ctggtccgag 900

ggttactcgg acttcgaccg cggagcctat gtgatcacct tcatccccaa gagctggaac 960

accgcccccg acaaggtaaa gcagggctgg ccgtga 996

<210> 24

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E28Y 变异体

<400> 24

gactccgacg acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc cgacccgtac 60

cgtccctcgt acggcagggc ctacacggtc gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag 120

gtctacagcc accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg ggagtggctg 180

tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc aattcgggtc agtacccgac gaacagactg 240

gccttcgcgt ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg 300

tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag 360

aagggcttcc agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct ggagaacgcc 420

cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc 480

ctgcgcaacg aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc 540

aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag 600

cacttctgga gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta cggcgacccg 660

gacgccttcc gccccgcccc gggcaccggc ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt 720

ccgcgcagcc ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcggc 780

gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg 840

cccaatggca gcctgggtgc catgcatgtc tacgagagca agttccgcaa ctggtccgag 900

ggttactcgg acttcgaccg cggagcctat gtgatcacct tcatccccaa gagctggaac 960

accgcccccg acaaggtaaa gcagggctgg ccgtga 996

<210> 25

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E58R 变异体

<400> 25

gactccgacg acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc cgacccgtac 60

cgtccctcgt acggcagggc cgagacggtc gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag 120

gtctacagcc accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg gaggtggctg 180

tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc aattcgggtc agtacccgac gaacagactg 240

gccttcgcgt ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg 300

tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag 360

aagggcttcc agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct ggagaacgcc 420

cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc 480

ctgcgcaacg aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc 540

aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag 600

cacttctgga gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta cggcgacccg 660

gacgccttcc gccccgcccc gggcaccggc ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt 720

ccgcgcagcc ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcggc 780

gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg 840

cccaatggca gcctgggtgc catgcatgtc tacgagagca agttccgcaa ctggtccgag 900

ggttactcgg acttcgaccg cggagcctat gtgatcacct tcatccccaa gagctggaac 960

accgcccccg acaaggtaaa gcagggctgg ccgtga 996

<210> 26

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E58L 变异体

<400> 26

gactccgacg acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc cgacccgtac 60

cgtccctcgt acggcagggc cgagacggtc gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag 120

gtctacagcc accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg gctgtggctg 180

tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc aattcgggtc agtacccgac gaacagactg 240

gccttcgcgt ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg 300

tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag 360

aagggcttcc agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct ggagaacgcc 420

cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc 480

ctgcgcaacg aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc 540

aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag 600

cacttctgga gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta cggcgacccg 660

gacgccttcc gccccgcccc gggcaccggc ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt 720

ccgcgcagcc ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcggc 780

gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg 840

cccaatggca gcctgggtgc catgcatgtc tacgagagca agttccgcaa ctggtccgag 900

ggttactcgg acttcgaccg cggagcctat gtgatcacct tcatccccaa gagctggaac 960

accgcccccg acaaggtaaa gcagggctgg ccgtga 996

<210> 27

<211> 31

<212> PRT

<213> 茂源链霉菌

<400> 27

Met Arg Ile Arg Arg Arg Ala Leu Val Phe Ala Thr Met Ser Ala Val

1 5 10 15

Leu Cys Thr Ala Gly Phe Met Pro Ser Ala Gly Glu Ala Ala Ala

20 25 30

<210> 28

<211> 45

<212> PRT

<213> 茂源链霉菌

<400> 28

Asp Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg

1 5 10 15

Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala

20 25 30

Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro

35 40 45

<210> 29

<211> 93

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌

<400> 29

atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc gccactatga gtgcggtgtt atgcaccgcc 60

ggattcatgc cgtcggccgg cgaggccgcc gcc 93

<210> 30

<211> 135

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌

<400> 30

gacaatggcg cgggggaaga gacgaagtcc tacgccgaaa cctaccgcct cacggcggat 60

gacgtcgcga acatcaacgc gctcaacgaa agcgctccgg ccgcttcgag cgccggcccg 120

tcgttccggg ccccc 135

Claims

1.一种修饰型转谷氨酰胺酶，具有在序列号1的氨基酸序列中包含以下(1)～(134)中的任一个氨基酸取代的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示80％以上的同源性的氨基酸序列，其中，与该氨基酸序列显示80％以上的同源性的氨基酸序列在所述氨基酸取代的位置以外的部分产生氨基酸序列的差异，

并且确认到与所述氨基酸取代对应的特性变化，

(29)变异点为S284，取代后的氨基酸为W、Y、M、F或N，氨基酸取代所带来的特性变化是温度稳定性降低，

2.根据权利要求1所述的修饰型转谷氨酰胺酶，其中，所述同源性为82％以上。

3.根据权利要求1所述的修饰型转谷氨酰胺酶，其中，所述同源性为85％以上。

4.根据权利要求1所述的修饰型转谷氨酰胺酶，其中，所述同源性为90％以上。

5.根据权利要求1所述的修饰型转谷氨酰胺酶，由序列号2～10中任一氨基酸序列构成。

6.一种基因，编码权利要求1～5中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。

7.根据权利要求6所述的基因，其中，包含序列号18～26中任一碱基序列。

8.一种重组DNA，包含权利要求6或7所述的基因。

9.一种微生物，保有权利要求8所述的重组DNA。

10.一种酶剂，包含权利要求1～5中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。

11.一种修饰型转谷氨酰胺酶的制备方法，包括以下的步骤(I)～(III)，

(I)准备编码权利要求1～5中任一项的修饰型转谷氨酰胺酶的氨基酸序列的核酸的步骤，

(II)使所述核酸表达的步骤，以及

(III)回收表达产物的步骤。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其中，所述氨基酸序列为序列号2～10中的任一氨基酸序列。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其中，所述核酸包含序列号18～26中的任一碱基序列。