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CN111372600A - 治疗自身免疫性疾病的PantId - Google Patents

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CN111372600A
CN111372600A CN201880034180.1A CN201880034180A CN111372600A CN 111372600 A CN111372600 A CN 111372600A CN 201880034180 A CN201880034180 A CN 201880034180A CN 111372600 A CN111372600 A CN 111372600A
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CN
China
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molecule
seq
sequence
pantoid
cells
Prior art date
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Pending
Application number
CN201880034180.1A
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English (en)
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C·格尔贝尔
M·斯皮克
J·埃博里斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Orpheus Bioscience Inc
Original Assignee
Orpheus Bioscience Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

B和T细胞经常在自身免疫性疾病中靶向检查点受体及其同源配体，其中这些适应性免疫应答可能显著促进潜在的免疫病理。本文描述了靶向检查点受体及其配体的自身反应性B细胞的克隆消除的新技术。该技术的一个实施方案是与效应子结构域的检查点受体或配体胞外结构域分子嵌合体，其能够诱导B细胞凋亡、坏死和/或耐受/无反应：在本文中，该技术被称为PantId(多克隆抗独特型)。在其他实施方案中，该技术还包括与免疫调节细胞因子的效应分子嵌合体。还描述了新型的凋亡效应子。还描述了鉴定检查点受体/配体自身反应性B细胞反应、构建PantId及其体外和体内应用的方法。

Description

治疗自身免疫性疾病的PantId
发明背景
正常致耐受机制自身免疫性疾病的特征是耐受性的逐渐下降,通常是进行性下降,以及通常阻止对内源宿主蛋白的适应性免疫反应的致耐受机制。在正常B和T细胞发育过程中，自身反应性细胞分别在骨髓和胸腺中被消除，对宿主组织和蛋白质产生“中央耐受性”。对于B细胞，高亲和力B细胞受体(BCR)对骨髓(B细胞发育的位置)中存在的细胞表面蛋白的表达导致细胞凋亡。另外，对无处不在的可溶性配体有应答的B细胞因无反应性而失活。对于T细胞，在胸腺(T细胞发育的位置)中也发生类似的过程：T细胞受体(TCR)对MHC-I或MHC-II复合物中存在的自身抗原肽以高亲和力应答的T细胞也因细胞凋亡而删除。对于所述肽-MHC复合物具有中等或低亲和力的T细胞，这些细胞可发育为调节性T细胞(Tregs)，其有助于维持外周耐受性；或者，这些细胞可能变得无反应性或发生凋亡。
外周耐受性是指一套机制，其阻止对中枢免疫系统之外的宿主蛋白的适应性免疫反应。如前所述，这些包括中枢产生的Treg细胞，其通过表达对自身抗原肽-MHC复合物的免疫抑制效应子来帮助维持外周耐受性。Treg抑制的机制仍在确定中，但包括可溶性免疫抑制效应子和细胞接触特异性免疫抑制剂的分泌。在前一种机制中，Treg细胞分泌TGF-β、IL-10、腺苷(由CD39和CD73产生)和IL-35，从而产生可以阻止T细胞和B细胞活化的免疫抑制环境，并产生耐受性APC1。在细胞接触机制中，CTLA-4、PD-L1、LAG-3、膜结合的TGF-β以及穿孔素和颗粒酶有助于免疫抑制1。同样在外周，自身反应性T细胞可以通过耐受性APC(例如BTLA+树突状细胞)被凋亡或转化为外周Treg2。这些外周Tregs(pTregs)通过许多针对中枢或胸腺Tregs(cTregs或tTregs)描述的机制促进了外周耐受性。
外周耐受性的另外机制是对T细胞活化进行共同刺激的一般要求。当T细胞将其同源抗原作为肽-MHC复合物结合时，取决于共刺激的存在，有两种可能的结果：在共刺激激动剂的存在下，例如CD80或CD86与T细胞表达的CD28结合，T细胞变成激活，导致增殖和效应功能的参与；在另一种情况下，当缺乏共刺激或当T细胞代替共刺激信号或与共刺激信号结合而接受抑制信号时，T细胞可能发生凋亡、无反应性或转化为pTreg。对于B细胞，对于T细胞依赖性B细胞激活存在类似的共刺激要求，其中T细胞表达的CD40L必须与B细胞表达的CD40结合以进行B细胞激活。虽然对共刺激的这些规范模式(例如CD28和CD40)进行了最详尽的描述，但最近已阐明了其他共刺激剂和共抑制剂：这类受体及其配体(其累积决定抗原参与的结果)被指为免疫检查点受体或配体：目前，这些免疫检查点包括15个信号轴(图1)。
在针对检查点受体的基线调节自身反应性的一个例子中，Andersen等人(2013年)展示了自然识别免疫检查点配体PD-L1的CD8 T细胞的存在7。这些抗PD-L1细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答在健康患者中观察到，并且在更大范围内在肾细胞癌或恶性黑色素瘤患者中观察到：在炎症中，在肿瘤微环境中，推测天然存在的抗PD-L1 CTL对高水平的PD-L1表达有应答，导致癌症患者中抗PD-L1 CTL应答增加7。作者还指出，这些天然存在的抗PD-L1CD8 T细胞可通过调节表达PD-L1的细胞的频率在健康患者中发挥免疫调节作用：例如，抗PD-L1 CTL可通过消除了表达PD-L1的APC而降低自身免疫力。该同一小组观察到存在抗PD-L1 Th17细胞，它是CD4 T细胞的炎性子集：与抗PD-L1 CTL的情况一样，这些细胞也被假定既调节基线免疫力又调节抗癌免疫力8。
发明内容
本文描述和要求保护的发明具有许多属性和方面，包括但不限于在本发明内容中阐述、描述或参考的那些。不旨在是全部包含性的，并且本文描述和要求保护的发明不限于或不受该发明内容中所标识的特征或实施方案的限制，其仅出于说明而非限制的目的被包括在内。
一方面，本文描述的技术涉及PantId(多克隆抗独特型)、PantId的生产以及PantId用于特异靶向其同源抗原对应于检查点受体或其配体的自身反应性B细胞的用途：这些自身反应性B细胞是有贡献的，并且也许是自身免疫性疾病发病和进展的病因。在一个方面，PantId可以是分子嵌合体，其包含二至五个组分，例如两个、三个、四个或五个组分，例如，(1)选自检查点配体、受体或免疫调节细胞因子的第一组分；(2)包含效应子的第二成分，其中所述效应子引起白细胞凋亡、坏死、耐受或无反应性。PantId还可以在两个至五个，例如两个、三个、四个或五个组分中的每个组件之间包括接头，以为分子嵌合体提供柔性。PantId也可以包含额外的效应子和/或均二聚体、异二聚体、三聚体、四聚体或低聚结构域。
在一些方面，本公开的特征在于使用包含已知抗原及其抗体或其片段的PantId靶向患者中自身反应性B细胞的方法和载体。例如，PantId可包含Ab的Fc(可结晶片段)部分-所述Fc包含两条重链，取决于抗体的种类，每条重链各自包含两个或三个恒定结构域。人类具有五类不同的Fc受体(FcR)，每类抗体一类。FcR单倍型或遗传变体也已有报道。Fc结构域与FcR和其他抗体亚类的相互作用介导其他免疫细胞的募集和募集的细胞类型。因此，改造与选择的FcR和/或免疫球蛋白的其他类别和亚类结合的Fc结构域并仅募集所需类型的免疫细胞的能力对于治疗可能是重要的。一方面，可以将IgG的Fc区改造成与自身反应性B细胞上的IgD、IgM、IgG1-4等的跨膜同工型结合。当B细胞受体结合自身抗原-Fc融合蛋白时，B细胞靶向细胞溶解。在其他方面，本公开的PantId可以排除Fc结构域。
在本公开的一些方面，PantId组分靶向相同的细胞。在本公开的一些方面，PantId组分靶向相同的自反应性B细胞。在一些方面，PantId包含分子嵌合体，其包含检查点受体或其同源配体的细胞外结构域，以及效应子或效应子结构域，其中效应子或效应子结构域促进B细胞凋亡、坏死或耐受/无反应性。在一些方面，用PantId治疗导致自身反应性B细胞的克隆缺失。例如，在一个实施方案中，分子嵌合体包含PD-L1细胞外结构域和FasL细胞外结构域，其介导多克隆抗PD-L1自身反应性B细胞凋亡。在该实施方案中，施用PantId导致抗PD-L1自身反应性B细胞的克隆缺失。在一些实施方案中，本发明的PantId是无颗粒的。
一方面，包含PantId的治疗组合物可用于治疗或改善以自身反应性B细胞为特征的自身免疫疾病，所述自身反应性B细胞表现出对免疫检查点受体或其配体或免疫调节细胞因子的响应性。一方面，这些PantId将通过其B细胞受体(BCR)靶向自身反应性B细胞，导致克隆缺失。一方面，抗检查点蛋白自身反应性B细胞的克隆缺失将导致自身免疫相关的炎症、发病率和死亡率的显著减轻。在某些方面，施用PantId将导致与自身反应性B细胞在基础免疫病理学中的核心作用有关的自身免疫疾病症状的临床改善。更具体地，对于其中这些抗检查点自身反应性B细胞在自身免疫性疾病中起关键作用的自身免疫性疾病和病症，与其他针对下游事件的疗法相比，PantId对自身反应性B细胞的克隆缺失将带来更明显的临床益处。
在本公开的另一方面，PantId可以包括或排除免疫原性治疗药物抗体的一部分，所述免疫原性治疗药物抗体包含自身抗体结合的治疗性药物抗体上的表位。在这个方面，包含来自治疗性抗体的同源抗原的PantId可用于治疗针对治疗性抗体的免疫原性反应。
当抗检查点蛋白T细胞在基线免疫调节中发挥作用时，它们的调节异常可有助于自身免疫。例如，本文所述的检查点受体和配体的一个作用是检查点蛋白本身作为自身抗原的作用。以这种能力，针对免疫检查点蛋白的自身抗体和T细胞应答可以阻断检查点共同抑制剂、激活检查点共同刺激物或使精细平衡的细胞因子网络失调。这些免疫应答通过促进不受调节的T细胞和B细胞活化而加剧、增强和甚至可能诱发自身免疫病理。
一方面，本公开涉及通过抵抗针对临床上对自身免疫有贡献的免疫检查蛋白的自身反应性适应性免疫应答来治疗或改善自身免疫性疾病和病症的组合物和方法。作为一个非限制性实例，抗检查点蛋白的突然增加可能消除了检查点阳性的Treg，例如抗PD-L1 CTL和Th17应答可能消除了PD-L1阳性的Treg，从而破坏了外周耐受性的关键组分。在一个方面，本公开的PD-L1 PantId将在恢复耐受性方面有用。
本公开还涉及用于以下目的的检测和鉴定对检查点受体、其配体和免疫调节细胞因子的自身免疫应答的方法：(1)确定所述应答在特征充分的自身免疫性疾病(即系统性红斑狼疮)中的普遍性；(2)进一步定义和扩展候选PantId分子嵌合体配偶体清单，重点是检查点受体、它们的配体和免疫调节细胞因子；(3)和针对患者的PantId疗法的定制，其中可以基于患者血清的免疫反应性概况施用PantId的子集。
据此，描述了在体外、体内模型和患者中筛选患者血清、PantId的克隆和PantId施用的方法。一方面，本公开涉及筛选患者血清的方法，其包括使患者样品与两种或更多种检查点蛋白、检查点受体、它们的配体和免疫调节细胞因子或其部分的组合接触，以与患者样品中的自身抗体形成复合物；并检测任何复合物。在一些实施方案中，所述组合将包含两、三、四、五、六、七、八、九或十种或更多种检查点蛋白、检查点受体、它们的配体和免疫调节细胞因子或其部分或表位。在一些实施方案中，所述组合将包含至多或超过9,000种人蛋白质，其包括检查点蛋白质、检查点受体、它们的配体、免疫调节细胞因子和其他蛋白质。在一些实施方案中，使用反相蛋白质微阵列(RPMA)获得所述概况。在一些实施方案中，基于患者的免疫反应性概况对患者进行PantId疗法的定制和施用。在一些实施方案中，检查点蛋白、检查点受体、它们的配体和免疫调节细胞因子或其部分的所述组合可包含标记的多肽或其部分或标记的抗人抗体，并且检测标记的复合物以获得患者的免疫反应性概况，如本文进一步描述。在一些实施方案中，标记可以是例如酶、化学发光、荧光或纳米颗粒标记。
对检查点受体、其配体和免疫调节细胞因子的自身免疫反应的检测将确定普遍存在的抗检查点蛋白T和B细胞自身反应性是否有助于和/或完全负责全身性自身免疫。使用本公开的PantId，该确定可以从根本上改变关于自身免疫性疾病发生和治疗的当前范例。
例如，在患有自身免疫性疾病的患者中观察到了抗免疫检查点应答。如本文所示，反相蛋白质微阵列(RPMA)研究已在自身免疫患者的血清中检测到抗PD-L1和抗IL-10应答：相反，健康对照血清中没有这些应答。在此现象的另一个实例中，令人惊讶地检测到，系统性红斑狼疮(SLE)患者的8.2％、类风湿性关节炎患者的18.8％、系统性硬化症患者的3.1％、白塞病(
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disease)患者的31.8％、
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综合征患者的13.3％，而健康捐献者的0％对免疫抑制性检查点受体CTLA-4具有可检测到的自身抗体反应9。此外，这些CTLA-4自身抗体与免疫病理有关，因为它们与白塞病中的葡萄膜炎呈负相关9，并促进了体外T细胞的增殖10。
在另一方面，本公开涉及产生PantId的方法。这样的方法可以包括克隆蛋白质/肽分子嵌合体，该蛋白质/肽分子嵌合体包含(1)选自以下的第一结构域：检查点受体、配体或免疫调节细胞因子或其任何部分，其结合至自身反应性B细胞，包括检查点受体、配体或免疫调节细胞因子的任何细胞外结构域或表位；和(2)包含效应子或其任何部分的第二结构域，或均二聚、异二聚、三聚、四聚或低聚结构域。分子嵌合体PantId的克隆可以使用任何核酸表达系统或表达系统的组合，具有或不具有IRES元件或P2A//T2A匹可纳病毒(Picornaviral)滑移位点或替代的多蛋白/多顺反子表达基序和形式。或者，可以通过化学连接两种或多种组分来产生分子嵌合体。例如，一方面，效应子或效应子分子嵌合体通过化学偶联剂共价连接至免疫检查点受体、配体或免疫调节细胞因子。
一方面，本公开涉及将PantId作为重组蛋白引入细胞培养物、动物模型和人中的方法，包括通过病毒和非病毒蛋白转导。本公开内容还包括用于治疗功效或生物活性评估和定量的方法，包括但不限于细胞生存力测定、细胞死亡测定、细胞代谢测定、细胞生长抑制测定、细胞增殖测定、靶向细胞杀死测定、免疫细胞杀死测定、流式细胞术测定、蛋白质印迹测定、细胞因子ELISA和蛋白质印迹测定、全血检查测定、白细胞计数、HPLC和质谱测定、ELISpot测定、荧光和化学发光连接的免疫吸附测定、体内成像等。
附图说明
图1：免疫检查点受体及其配体的描绘。当MHC-I或MHC-II：肽复合物结合T细胞受体(TCR)时，T细胞收到初级信号，称为“信号1”。该信号引发T细胞活化、无反应或凋亡。但是，T细胞的命运最终由刺激性和抑制性免疫检查点受体信号转导的特定组合决定，这可能使T细胞的反应偏向这三种结果之一。
图2A和2B：PantId技术的两个实例。图2A提供了PD-L1-FasL共价分子嵌合体的DNA片段图。图2B提供了分别编码PD-L1和FasL的两个DNA片段的图，它们作为与同源异二聚结构域的分子嵌合体。在一些实施方案中，在克隆成用于产生PD-L1-CC-BN4：FasL-CC-AN4异二聚体的表达构建体之后，将来自图2B的PantId共转染到哺乳动物细胞中。这实现了与(A)相同的治疗功能，但具有更简单的基因合成、克隆和体外表征。
图3A和3B：PD-L1-FasL分子嵌合片段并克隆到慢载体pLenti-C-Myc-DDK-IRES-Puro中的质粒图。图3A描绘了具有末端限制性位点的PD-L1-FasL分子嵌合体片段，其允许克隆到pLenti-C-Myc-DDK-IRES-Puro中。图3B提供了最终的pLenti-C-PD-L1-FasL-IRES-Puro载体的质粒图，其将被既用作表达载体，又用作慢病毒转导生产细胞的载体。
图4：氨基酸序列。
图5：描绘包含自身抗原-Fc的PantId的作用机理。自身抗原IgG-融合蛋白以IL-2RβECD-IgG1 Fc融合体代表，该融合体中和循环中的自身抗体至IL-2Rβ。还显示了自身抗原Fc融合蛋白与分泌自身抗体的B细胞的BCR(B细胞抗原受体)的结合，从而导致ADCC、补体激活和自身反应性B细胞凋亡。
图6：克隆进了PantId的pLenti-C-Myc/DDK-IRES-Puro的质粒图。显示的是SIN 3'LTR、5'LTR、Rev-应答元件(RRE)、中央多嘌呤束(cPPT)、内部核糖体进入位点(IRES)、嘌呤霉素抗性基因(PuroR)和土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)。该序列对应于序列ID 00132。
图7：克隆到载体pLenti-C-My/DDK-IRES-Puro中的CTLA-4-hIgG1 Fc的质粒图。显示的是与人IgG1铰链、CH2和CH3区融合的人CTLA-4-Fc的胞外结构域(ECD)。该序列被克隆到pLenti-C-Myc/DDK-IRES-Puro多克隆位点(MCS)的5'EcoRI和3'BamHI位点。该序列对应于序列ID 00133。
图8A和8B：PD-L1(8A)和FasL(8B)PantId异二聚体的质粒图，其克隆到pLenti-C-Myc/DDK-IRES-Puro中。这些序列分别对应于序列ID 00134和00135。
图9：图9显示了在与PantId构建体和对照构建体接触的HEK293T细胞的上清液中CTLA-4PantId的滴度的条形图。标记为克隆1-4的条(参见Y轴上的标记)显示了来自用四个pLenti-C-CTLA4-hIgG1 Fc-IRES-puro克隆的每一个转染的HEK293T细胞的上清液的CTLA-4PantId滴度；两个阴性对照包括与没有CTLA4-hIgG1插入片段的载体接触的细胞的滴度，以及仅与培养基接触的细胞的滴度。还显示了来自vLenti-C-CTLA-4-hIgG1 Fc-IRES-puro转导的HEK293T细胞的上清液中的滴度。
图10：图10显示了蛋白质印迹，其表明CTLA-4-hFc PantId采用了均二聚体结构。显示了CTLA-4-hFc的结果。将pLenti-C-CTLA-4-hIgG1 FC-IRES-Puro克隆1-4转染到HEK293T细胞中，并在存在或不存在还原剂的情况下分析上清液。左侧的前四个泳道标识了暴露于还原剂的四个克隆中每个克隆的样品。旁边的四个泳道是来自四个克隆中每个克隆的样品，标识了在不存在还原剂的情况下CTLA-4-hFc PantId的寡聚体、均二聚体和单体结构。空亲本pLenti-C-Myc/DDK-IRES-puro载体由“E”表示。另外，在还原的样品中，CTLA-4-HFC单体表现出43kDa的预测分子质量。较高的分子量带对应于其寡聚物和糖变体。
图11是免疫印迹，其显示与抗人CTLA-4、PD-1和PD-L1抗体结合的PantId的第一组分。通过SDS凝胶电泳分析PantId的纯化CTLA-4-Fc、PD-1-CCAN4和PD-L1-CCAN4第一组分，并将其转移至硝酸纤维素膜上。左侧小图显示了用小鼠抗人CTLA-4探测的硝酸纤维素膜。左侧中间小图显示了仅用山羊抗小鼠二抗探测的类似硝化纤维膜。右侧中间小图显示了用抗人PD-1抗体探测的类似硝酸纤维素膜。右侧小图显示了用抗人PD-L1抗体探测的类似硝酸纤维素膜。
图12描述了实验结果，其表明PantId的PD-1-CCAN4第一组分特异性中和了小鼠抗人PD-1与重组人PD-1蛋白的结合。
图13描述了实验结果，其表明PantId的PD-1-CCAN4第一组分特异性中和了小鼠抗人PD-1与重组人PD-1蛋白的结合。PantId的PD-1-CCAN4第一组分中和了1μg ml抗人PD-1，IC50为136ng或31.8nM，PantId的PD-1-CCAN4第一组分在SDS-PAGE中显示出观察到的分子量为43kDa。
图14显示了抗人CTLA-4抗体对还原的和非还原的CTLA-4-Fc PantId的特异性结合。
图15显示了用Strep-Tactin树脂纯化PD-L1-CCAN4-SBP多肽。
图16显示了通过Strep-Tactin树脂纯化PD-L1-CCAN4-SBP多肽以及在CHO细胞中表达PantId的FasL-CCBN4-SBP和TRAIL-CCBN4-SBP第二组分。
具体实施方式
在一个实施方案中，本公开涉及PantIda作为治疗自身免疫疾病的疗法的用途，其特征在于自身反应性B细胞表现出对免疫检查点受体或其配体或免疫调节细胞因子的响应性。
尽管对于大多数自身免疫疾病，对自我耐受和自身免疫的机制了解甚少，但很少有实例可以很好地表征初始耐受的机制。例如，在柯萨奇病毒B相关的心肌炎3中，最初的病毒感染后是涉及心肌和心包的炎性后遗症：这与单核细胞浸润、抗肌动蛋白和肌球蛋白的抗体以及相关的CD4 T细胞反应有关，其促进了心肌炎的临床表现3。在该实例中，与柯萨奇病毒相关的抗原在分子上模拟心脏肌球蛋白和肌动蛋白，并且由于心脏肌球蛋白和肌动蛋白激活这些自身反应性T和B细胞的能力，在没有病毒感染的情况下，所得的T细胞和B细胞反应仍在继续。同样，在链球菌引起的风湿性心脏病中，对链球菌M蛋白的适应性免疫反应与心肌肌球蛋白和肌动蛋白发生交叉反应，导致类似的免疫病理学4,5。值得注意的是，这些病原体相关的自身免疫疾病通常是急性的，并且因此，如本文所认识的，针对自身免疫的其他潜在的易感性可能与这种刺激性刺激相一致，以诱导慢性临床自身免疫疾病。
这样，在自我耐受的最初崩溃期间，病原体蛋白质和宿主蛋白质之间的分子模拟可以促进T细胞和B细胞对宿主蛋白质的反应性。更一般而言，内源性宿主组织中存在交替的炎症刺激会导致对这些组织的异常T和B细胞反应。这些炎性刺激可以导致免疫检查共刺激物的表达，而后者绕过了外周耐受的关键机制之一——共刺激的要求。更广泛地说，导致检查点共刺激物表达的初始炎症状态不一定是病原体衍生的，并且可能是由共生细菌、组织损伤、辐射或化学暴露引起的，它们可以通过病原体相关的分子模式受体(PAMP)或与损害相关的分子模式受体(DAMP)促进炎症。或者，暴露于半抗原(其共价结合到宿主蛋白上并使它们具有免疫原性)可能会在存在共同刺激的情况下导致自身免疫反应。耐受性破坏的这些机制之上是针对自身免疫的单基因和多基因易感性，包括但不限于以下：(1)特异性HLA单倍型，其与特定宿主肽的有效MHC呈递相关，从而使宿主易感于对这些肽的T细胞反应；(2)免疫检查点受体或配体表达或功能的遗传或表观遗传失调，其可能造成失衡，使适应性免疫系统偏向于系统性激活；和(3)促进慢性炎症的非检查点蛋白遗传突变(例如紧密连接蛋白突变，其可促进慢性接触共生细菌和慢性炎症)。当这些对自身免疫的潜在遗传易感性与上述刺激性刺激之一结合时，急性自身免疫可导致慢性自身免疫、发病率和死亡率。
在其他情况下，用于抗肿瘤或抗病毒疗法的检查点共刺激激动剂或检查点共同抑制剂拮抗剂的施用可以通过破坏中枢和外周耐受机制来促进机会性自身免疫性疾病：在这些情况下，在治疗性施用后，患者由于全身性免疫抑制作用呈现免疫相关的不良事件(IRAE)6。这些IRAE很常见，发生在90％的接受抗CTLA-4抗体的患者中，以及70％的接受PD-1/PD-L1阻断抗体的患者中6。虽然大多数IRAE被分类为I-II级(轻度症状，主要影响皮肤和胃肠道)，但更严重的III-V级症状并不罕见，影响1-10％的患者6。由于检查点阻断疗法的新颖性，其管理、慢性影响和IRAE持久性后治疗仍在表征中。因此，目前尚不清楚这些IRAE是否构成一类新的系统性、慢性自身免疫性疾病。
如前所述，检查点受体通过许可T细胞和B细胞对遗传易感人群中的宿主抗原作出反应而对自身免疫发挥重要作用。在这些情况下，与炎症相关的DAMP和PAMP受体信号传导驱动炎性细胞因子(例如IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α)的表达：结合起来，它们促进检查点受体表达，包括CD80/CD86和CD40L，从而消除了对外周刺激所需的共刺激的要求。此后，B和T细胞被活化、增殖并表现出有助于自身免疫的临床表现的免疫病理效应子功能，例如以下：(1)B细胞产生自身抗体；(2)自身抗体介导的细胞杀伤和免疫复合物的形成；(3)由活化的先天免疫细胞、受损的宿主组织和CD4T细胞介导的细胞因子相关的炎症和炎症相关的组织损伤；和(4)通过CD8 T细胞杀死靶向的宿主细胞。除了这些现象外，适应性免疫反应的范围也逐渐扩大，从一种抗原上的一个抗原决定簇到一个抗原上的多个抗原决定簇，再到多种抗原(分别称为抗原决定簇和抗原扩散)。这大致与耐受性和功能致耐受机制的逐渐下降相吻合。
在一个实施方案中，本公开涉及PantId及其作为治疗自身免疫疾病的治疗剂的用途，其特征在于自身反应性B细胞表现出对免疫检查点受体或其配体或免疫调节细胞因子的响应性。在一些实施方案中，PantId包含二至五种蛋白质、结构域或肽。例如，在一些实施方案中，PantId是包含两种或更多种组分的分子嵌合体，在一些实施方案中，其可以包含至少(1)选自检查点配体、受体或免疫调节细胞因子的第一组分；(2)选自效应子的第二成分，其中所述效应子引起白细胞凋亡、坏死、耐受或无反应性。分子嵌合体还可包含额外的效应子和/或均二聚体、异二聚体、三聚体、四聚体或低聚结构域。Pantid的第一组分与配体结合，并在白细胞或与淋巴样组织相关的细胞(例如自身反应性B细胞)内引发信号传导。所述Pantid还可以包含两个或更多个组分或结构域之间的接头。在本公开的一些方面，PantId组分靶向相同的细胞。在本公开的一些方面，PantId组分靶向相同的自反应性B细胞。在一些实施方案中，本公开的PantId是无颗粒的，例如，PantId不包含微粒、纳米颗粒或其他颗粒载体或珠。
接头可以是连接第一组分和第二组分的试剂、分子或大分子，使得a)PantId在生理条件下稳定；b)接头和PantId之间的连接不改变PantId结合其目标的能力。
在一个实施方案中，接头可以是肽键。PantId可以是融合多肽，其包含来自第一组分的一个或多个氨基酸区段和来自第二组分的一个或多个氨基酸区段。第一组分的氨基酸区段可以与第二组分的氨基酸区段邻接，或者它们可以被作为结构间隔子插入的氨基酸分开。间隔子区段可以是一种或多种氨基酸。一种或多种氨基酸可以包括相同或不同的氨基酸。还包括包含编码PantId的核苷酸序列的核酸。
在另一个实施方案中，可以通过化学合成或体内合成分别获得第一组分和第二组分，纯化，然后非共价或共价连接。非共价连接可以是例如离子键。共价连接可以通过化学交联剂，例如同双功能交联剂或异双功能交联剂。在另一个实施方案中，第一组分和第二组分可通过连接聚合物连接，所述连接聚合物包括例如直链或支链聚合物或共聚物(例如，聚亚烷基、聚(乙烯-赖氨酸)、聚甲基丙烯酸酯、聚氨基酸、多糖或寡糖或树状聚合物)。
第一组分和第二组分特异性结合它们各自的靶标。通常，特异性结合靶标的组分表现出结合活性的阈值水平，和/或不与相关靶标分子显著交叉反应。组分的结合亲和力可以例如通过Scatchard分析来确定。例如，与紧密相关或不相关的靶标相比，第一组分或第二组分可以以至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍或更高倍的靶标亲和力结合至其各自的靶标。第一组分或第二组分可以以高亲和力(10-4M或更小、10-7M或更小、10-9M或更小)或以亚纳摩尔亲和力(0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1nM或甚至更低)结合其靶标。还可以根据它们与靶标的结合亲和力来描述或指定第一组分或第二组分，例如，结合亲和力包括Kd小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10- 5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10- 10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、或10-15M或更低的那些。
在一个实施方案中，嵌合体包含PD-L1的细胞外结构域和诱导凋亡的FasL细胞外结构域。在一个实例中，将PD-L1的胞外域克隆为分子嵌合体，并具有诱导凋亡的FasL胞外域：在抗PD-L1自反应性B细胞通过其BCR结合后，B细胞表达的Fas的FasL参与促进此自反应性克隆的B细胞凋亡和克隆缺失(图2A)。在该实施方案中，在动物模型或人类患者中静脉内施用包含具有一个或多个效应子类别的多个检查点受体、配体或免疫调节效应分子嵌合体的一种或多种PantId，以引起治疗效果。
在体外，将PantId添加到培养物上清液中以确定体外作用。
在一些实施方案中，分子嵌合体包含检查点配体、受体或免疫调节细胞因子和异二聚化结构域，如Thomas等，201311所述，或均二聚结构域、三聚结构域、四聚结构域，例如在Mittl等人，200012所述(序列131)。在一些实施方案中，同源异二聚化结构域也表达为具有本文公开的任何效应子的分子嵌合体，例如FasL。当克隆并共表达时，例如，PD-L1细胞外结构域和异二聚结构域CC-AN4(序列129)的分子嵌合体可与同源异二聚结构域例如CC-BN4 11(序列130)定向组装，在一些实施方案中，其表达为具有效应子(例如FasL)的分子嵌合体。这样，在翻译后完成功能性治疗药物(在此实例中为PD-L1-FasL)的组装(图2B)。这种构建PantId的方法减少了PantId的基因合成和克隆成本，并促进了效应子或效应子组合的体外功效筛选。该方法将在PantId优化过程中应用，因为可以轻松识别效应子和检查点蛋白的协同作用。
如在第一和第二实施方案或本文公开的任何其他实施方案中使用的效应子可以包括多类蛋白质、结构域、肽、脂质、聚糖和化学物质，以及其复合物和分子嵌合体，如以下非限制性实例所述的。
例如，在一些实施方案中，PantId的效应子组分可以选自或可以排除死亡受体配体，其包括PantId的效应子类别的CD95L(又名(a.k.a.)FasL，序列001)、TRAIL(又名Apo2L，序列002)和TWEAK(又名肿瘤坏死因子配体超家族成员12，序列003)。在一些实施方案中，效应子可包括或排除TNF受体超家族配体的任何其他成员，包括但不限于OX40L(序列004)、TNF-α(序列005)、淋巴毒素-β(又名TNF-C，序列006)及其结合配偶体淋巴毒素-α(又名TNF-β，序列007)、CD154(又名CD40L，序列008)、LIGHT(又名CD258序列009)、CD70(序列010)、CD153(序列011)、4-1BBL(又名CD137L，肿瘤坏死因子(配体)超家族成员9，(序列012)、RANKL(又名CD254，序列013)、APRIL(序列014)、神经生长因子配体(例如NGF序列015，BDNF(序列016)、NT-3(序列017)和NT-4(序列018)、BAFF(序列019)、GITR配体(序列020)、TL1A(序列021)和EDA-A2(序列022)。
在一些实施方案中，PantId的效应子组分选自以下任何一种或其配体，或可以排除以下任何一种或其配体：(a)白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)，一种抑制性受体，存在于外周单核细胞上，包括NK细胞、T细胞和B细胞；(b)唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素(Siglecs)，例如Siglec-1(CD169)、Siglec-2(CD22)、Siglec-3(CD33)、Siglec-4(髓磷脂相关糖蛋白)、Siglec-10、与CD33相关的Siglecs(Siglecs 5-12)；(c)Fc-γ受体，例如FcγRI、FcγRII、FcγRIII；(d)白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员3(LILRB3)、PIR-B、ILT-2、ILT-5；(e)CD5、CD66a、CD72。
在一些实施方案中，PantId的效应子组分可以选自或可以排除：(a)修饰的细菌毒素，包括A-B毒素和自转运蛋白，用于在细胞内递送细胞毒性效应子，其中所述细胞毒性效应子可以是胱天蛋白酶、细菌毒素或其他酶；(b)小于10,000道尔顿的细胞毒性或细胞抑制剂小分子，例如微管或肌动蛋白细胞骨架调节剂、DNA复制抑制剂、核糖体抑制剂、RNA合成抑制剂、放射性核素及其配位复合物等；(c)NK活化受体配体，包括：与NKG2D结合的MICA(序列023)和MICB(序列024)；与NKG2D结合的ULBP1-6(序列025-030)、Rae-1(序列031)、MULT1(序列032)、H60(序列033)；DNAM-1配体CD155(序列034)和CD112(序列035)；B7-H6(序列036)和BAT3(序列037)；其与NKp30结合；和CD27，其结合CD70；(d)免疫调节细胞因子，例如IL-1β、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-21、IL-35、TGF-β、TNF-α、I型干扰素、II型干扰素、III型干扰素，典型趋化因子(例如CC、CXC、C和CX3C类)和非典型趋化性或化学动力学试剂(例如Slit1、2和3)；或(e)人、鼠、猪或犬免疫球蛋白的Fc结构域，包括IgA、IgM、IgG、IgD、IgE及其亚类。在一些实施方案中，Fc可以增加PantId的生物利用度和/或半衰期。在一些实施方案中，PantId效应子组分可以排除上面列出的任何Fc结构域。
在本公开的一个实施方案中，在没有效应子的情况下，PantId中的检查点受体、配体或免疫调节细胞因子被寡聚。在这种情况的一个实例中，PD-L1寡聚物被治疗性应用，用于通过激活诱导的细胞死亡(AICD)消除抗PD-L1自体反应性B细胞。在该实施方案中，用均二聚、异二聚、三聚、四聚或寡聚化结构域克隆选自检查点受体、配体和免疫调节细胞因子的PantId的分子嵌合体的第一组分，以实现寡聚化。
在一个实施方案中，免疫检查点受体是与配体结合和/或与白细胞或与淋巴组织相关的细胞，例如自身反应性B细胞结合并引发信号传导的细胞内、跨膜或膜相关的蛋白。在一些实施方案中，白细胞或淋巴样组织相关细胞内的信号转导通过NF-κB、NFAT、JAK-STAT、PI-3K、PLC、PKC、cAMP-PKA、cGMP-PKG、MAPK、胱天蛋白酶、SMAD、Rho家族GTP酶、酪氨酸激酶或磷酸酶、脂质激酶或磷酸酶途径；或通过T和B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤T(NKT)细胞、粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞)、单核细胞、巨噬细胞或多种起源和表型的淋巴组织相关细胞(例如滤泡树突状细胞)中的其他信号传导途径介导免疫调节作用。
在本文的任何实施方案中，检查点受体可以选自或可以不包括以下任何蛋白质，以及与白细胞或淋巴样组织相关细胞结合和/或引起其内信号传导的任何活性部分、其肽或表位，例如，自身反应性B和/或T细胞自身反应性B细胞或T细胞：PD-1(序列038)；CD28(序列039)；CTLA-4(序列040)；ICOS(序列041)；BTLA(序列042)；KIR(杀死免疫球蛋白受体)，包括：KIR2DL1(序列043)、KIR2DL2(序列044)、KIR2DL3(序列045)、KIR2DL4(序列046)、KIR2DL5A(序列047)、KIR2DL5B(序列048)、KIR2DS1(序列049)、KIR2DS2(序列050)、KIR2DS3(序列051)、KIR2DS4(序列052)、KIR2DS5(序列053)、KIR3DL2(序列054)、KIR3DL3(序列055)和KIR3DS1(序列056)；LAG-3(序列057)；CD137(序列058)；OX40(序列059)；CD27(序列060)；CD40(序列061)；TIM-3(序列062)和其他T细胞免疫球蛋白以及包含1结构域的(TIM)受体，包括TIM-1(序列063)、TIM-2(序列064)和TIM-4(序列065)；A2Ar(序列066)；以及任何包含ITAM(基于免疫受体酪氨酸的活化基序，序列067)、ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序，序列068)或ITSM(基于免疫受体酪氨酸的开关基序，序列069)基序、结构域或肽例如CD244(2B4，序列070)和TIGIT受体(序列071)的跨膜、外周膜、膜相关或胞质蛋白。在一些实施方案中，当检查点受体是CTLA-4、CD27、ICOS或其部分时，效应子不是FasL、TRAIL、TWEAK或其部分。在一些实施方案中，检查点受体不是CTLA-4。在一个实施方案中，PantId分子包含免疫检查点配体，其可以是能够在免疫检查点受体中引发信号传导和/或结合白细胞或淋巴样组织相关细胞例如自身反应性B细胞并引发其内的信号传导的蛋白质、结构域或肽。在一些实施方案中，该信号传导是反向信号传导，通过该反向信号传导，使与检查点配体结合的检查点受体与表达配体的细胞信号传导相关联，或者当配体同时表现出受体或配体的性质时，使用常用的配体科学共识术语。
在本公开的任何实施方案中，检查点配体可以选自或可以排除以下任何蛋白质，以及在免疫检查点引发信号和/或与白细胞或淋巴样组织相关细胞(例如自身反应性B细胞和/或自身反应性T细胞)结合并在其内引发信号传导的任何活性部分、肽或表位：PD-L1(序列072)和PD-L2(序列073)；CD80(序列074)和CD86(序列075)；B7RP1(序列076)；B7-H3(序列B7-H3)；B7-H4(序列B7-H4)；HVEM(序列079)；任何等位基因的MHC-I(序列080)和MHC-II(序列081)、CD137L(序列082)；OX40(序列083)；CD70(序列084)；GAL9(序列085)；或与包含ITAM；ITIM或ITSM基序的跨膜、外周膜、膜相关或胞质受体/蛋白结合的任何蛋白质、肽、脂质、聚糖、糖脂、糖蛋白、脂蛋白、核酸、核糖核蛋白或脱氧核糖核蛋白。
在本公开的任何实施方案中，免疫调节细胞因子可以是以下任何蛋白质，以及其结合白细胞或淋巴样组织相关细胞(例如自身反应性B细胞和/或T细胞)和/或引发其内的信号传导的任何活性部分、肽或表位：IL-1家族的成员，包括IL-1α(序列086)、IL-1β(序列087)、IL-1Ra(序列088)、IL-33(序列089)、IL-18(序列090)、IL-36Ra(序列091)、IL-36α(序列092)、IL-36β(序列093)、IL-36γ(序列094)、IL-37(序列095)和IL-38(序列096)；IL-2(序列097)、IL-3(序列098)、IL-4(序列099)、IL-5(序列100)、IL-6(序列101)、IL-7(序列102)、IL-8(序列103)、IL-9(序列104)、IL-10(序列105)、IL-11(序列106)、IL-12(序列107)、IL-13(序列108)、IL-14(序列109)、IL-15(序列110)、IL-16(序列111)、IL-17(序列112)、IL-19(序列113)、IL-20(序列114)、IL-21(序列115)、IL-22(序列116)、IL-23(序列117)、IL-24(序列118)、IL-25(序列119)、IL-26(序列120)、IL-27(序列121)、IL-28(序列122)、IL-29(序列123)、IL-30(序列124)、IL-31(序列125)、IL-32(序列126)、IL-35(序列127)；干扰素，例如I、II或III型干扰素；C、CC、CXC和CX3C类的趋化因子；TNF受体超家族配体，如OX40L、CD40L、TNF-α、CD70和4-1BBL；或非规范的化学动力学试剂和趋化剂，例如Slit1、Slit2和Slit3；或TGF-β(序列128)。
示例性的PantId可以包括检查点受体PD-L1和效应子FasL。示例性的PantId可以包括细胞因子受体IL2Rβ和效应子IgG1H恒定区1-3。示例性的PantId可以包括检查点受体CTLA-4和效应子IgG1H恒定区1-3、IgG1H恒定区2-3或IgG1H Fc区。
如本文和整个文件中所用，分子嵌合体是一种或多种配偶体的任何共价连接或非共价结合的复合物，其由蛋白质、结构域、肽、聚糖、脂质、核酸、糖蛋白、脂蛋白、核糖核蛋白、脱氧核糖核蛋白和共价修饰的肽构成。
在一个实施方案中，本公开的特征在于用于产生PantId的方法。这样的方法可以包括将(1)作为蛋白质/肽分子嵌合体的检查点受体、配体或免疫调节细胞因子或其任何活性部分肽或表位与(2)效应子或其引起白细胞例如B细胞细胞凋亡、坏死、耐受的任何活性部分和/或均二聚、异二聚、三聚、四聚或寡聚化结构域一起克隆。克隆和表达可以使用任何核酸表达系统或表达系统的组合，其具有或不具有IRES元件或P2A//T2A匹可纳病毒滑移位点或替代的多蛋白/多顺反子表达基序和形式。这样的核酸表达系统可以包括线性或环状的双链或单链RNA或DNA。这样的表达系统可以包括或排除含有细菌或真核复制起点、抗生素或亲和力选择标记和/或原核或真核启动子的质粒。在一个潜在的实施方案中，这样的质粒可以包括HIV、逆转录病毒或泡沫状的孢子病毒衍生的病毒序列，包括但不限于病毒长末端重复序列(LTR)和转录后病毒调控序列，其包括HIV Rev-应答元件(RRE)，以及由此产生的病毒或亚病毒颗粒。或者，表达可以构成合成的肽及其分子嵌合体。
编码PantId的核酸可以包含表达质粒、病毒载体、慢病毒载体或mRNA。Pantid可以是合成的蛋白质、合成的肽，或在包含核酸、蛋白质或肽的转导或转染的细胞中表达。
用于PantId的表达系统包括体外系统，例如核糖体翻译，或基于细胞的系统，例如细菌培养物、古细菌培养物、真菌培养物、植物培养物或动物细胞培养物，包括CHO细胞培养物。另外，在一些实施方案中，PantId在人细胞表达系统中表达。在一些实施方案中，PantId在人细胞异种表达系统中的表达降低了PantId组合物的抗原性。
在一个实施方案中，本公开的特征在于通过任何柱色谱、溶剂排除、沉淀、或磁性或非磁性的纳米/微粒颗粒方法，包括但不限于亲和色谱、高效液相色谱、尺寸排阻色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法、反相色谱法和任何尺寸磁性或非磁性颗粒和珠子的免疫亲和力，纯化PantId蛋白的方法。
在另一个实施方案中，本公开的特征在于将PantId作为重组蛋白引入细胞培养物、动物模型和人中的方法，包括通过病毒和非病毒蛋白转导。另外，在该实施方案中，本发明包括用于治疗功效或生物活性评估和定量的方法，包括但不限于细胞生存力测定、细胞死亡测定、细胞代谢测定、细胞生长抑制测定、细胞增殖测定、靶向细胞杀死测定、免疫细胞杀死测定、流式细胞术测定、蛋白质印迹测定、细胞因子ELISA和蛋白质印迹测定、全血检查测定、白细胞计数、HPLC和质谱测定、ELISpot测定、荧光和化学发光连接的免疫吸附测定、体内成像等。
本公开的另一个实施方案涉及通过反相蛋白质微阵列(RPMA)、正相蛋白质微阵列、免疫吸附测定法(包括酶联的、荧光的和发光的)、颗粒凝集测定法、电泳迁移率变化和毛细管电泳测定法、电化学或电致发光测定法或单个或多重组织或细胞阵列、或流式细胞仪来发现、定量和表征对检查点受体、其配体和免疫调节细胞因子的自身免疫B细胞反应的方法。
在本公开的实施方案中还特征在于在自身免疫性疾病和癌症的动物模型中递送PantId和PantId与其他治疗剂的组合的方法。
在一个实施方案中，本公开的特征在于通过静脉内、舌下、鼻内、皮内、肌内、眼内或眼周、透皮或皮下递送方法在包括人类或动物的受试者中递送PantId以及PantId与其他治疗剂的组合，用于治疗自身免疫性疾病或病症或癌症。
组合物可以采取任何标准已知剂型的形式，包括片剂、丸剂、胶囊剂、半固体剂、粉剂、缓释制剂、溶液、混悬剂。作为进一步的实例，组合物还可包含防腐剂、增溶剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂。
根据本公开的治疗或药物组合物可以包含Pantid和药物载体。所述Pantid优选是基本上纯的并且期望是基本上均质的(即，没有污染蛋白质等)。“基本上纯的”蛋白质是指基于组合物的总重量，包含至少约90重量％的蛋白质的组合物，优选至少约95重量％。“基本上均质的”蛋白质是指基于组合物的总重量，包含至少约99重量％的蛋白质的组合物。在某些实施方案中，蛋白质是抗体。可选的组合物包括介导蛋白质或核酸转导的慢病毒、逆转录病毒、其他病毒和非病毒颗粒。在一个潜在的实施方案中，“组合物”还可包括哺乳动物或宿主来源的转导或转染的细胞，其在施用后产生PantId。
考虑到所需剂量体积、施用方式等来确定制剂中Pantid的量。PantId制剂可以包含药学上可接受的载体或稀释剂。在一些方面，合适的载体和稀释剂包括缓冲水溶液、等渗盐溶液，例如磷酸盐缓冲盐水、等渗水、无菌水、溶液、溶剂、分散介质、延迟剂、聚合物和脂质剂、乳剂等。Pantid可以在pH约4-8，优选约5-7的pH缓冲溶液中存在。示例性的缓冲剂包括组氨酸、磷酸盐、Tris、柠檬酸盐、琥珀酸盐和其他有机酸。缓冲剂浓度可以为约1mM至约20mM，或约3mM至约15mM，这取决于例如缓冲剂和制剂的所需等渗性。作为进一步的实例，合适的液体载体，特别是用于注射溶液的液体载体，包括水、盐水溶液、右旋糖水溶液等，其中等渗溶液优选用于静脉内、脊髓内和脑池内给药，并且载体例如脂质体也特别适合于药剂的施用。
其他药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，例如第16版Remington'sPharmaceutical Sciences,Osol,A.Ed.(1980)中描述的那些，可包括在预冻干制剂(和/或冻干制剂和/或重构制剂)中，条件是它们不会不利地影响制剂的所需特性。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括：其他缓冲剂；防腐剂；助溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；螯合剂，如EDTA；可生物降解的聚合物，例如聚酯；和/或成盐的抗衡离子，例如钠。
在一个实施方案中，本公开的治疗组合物包含载体，如本文所用，“载体”包括在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。生理上可接受的载体通常是pH缓冲水溶液。生理上可接受的载体的实例包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
“治疗”或“处理”或“改善”是指治疗性处理和预防性或预防性措施；其中目的是预防或减慢(减轻)靶向的自身免疫性疾病或病症或癌症。需要治疗的对象包括那些已经患有该疾病的人，以及那些容易患该疾病的人或需要预防该疾病的人，例如患有白细胞的受试者，例如对检查点受体、配体或免疫调节细胞因子有反应的自身反应性B细胞。
如果在根据本发明的方法接受治疗量的本公开的Pantid之后，受试者在存在或不存在一种或多种以下情况下显示出可观察到的和/或可测量的减少：自身反应性B细胞的数量或一种或多种自身免疫症状减少或癌症减少，则受试者或哺乳动物成功地“治疗”了感染。
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物中的疾病或病症的Pantid的量。
实施例
本领域技术人员将理解，以下实施例是克隆和表达PantId的非限制性实施例，并且其他方法、载体和表达系统也可用于克隆本公开的PantId。如本公开中所描述的，本领域技术人员还将理解，所述方法、载体和表达系统也可以用于克隆包含其他组分的PantId。
实施例1–PantId克隆
将检查点受体、配体或免疫调节性细胞因子或任何胞外域，或其活性部分肽或表位(带有或不带有信号肽)从mRNA序列反向翻译。例如，使用智人密码子使用选项，使用www.jcat.de上可用的密码子适应工具，将对应于氨基酸1-239的PD-L1反向翻译。复制得到的序列并将其粘贴到新的SnapGene.dna文件中，用于最终PantId序列的计算机。
在反向翻译后，将对应于氨基酸1-18的PD-L1信号肽去除并替换为人血清白蛋白信号肽(氨基酸序列MKWVTFISLLFLFSSAYS)。将其复制到PD-L1序列的5'末端。
将效应子的胞外结构域反向翻译并复制到检查点受体、配体或免疫调节细胞因子或其任何活性部分肽或表位的3'末端。例如，对应于氨基酸103-281的FasL被反向翻译并复制到PD-L1序列的3'末端。
接头也可以置于两个组分之间。例如，可以使用GGGGS接头或其他合适的柔性接头。例如，随后将GGGGS接头粘贴在两个特征之间，从而使分子嵌合体在最终蛋白质中具有柔韧性。可替换地，该接头的数倍，包括(GGGGS)2、(GGGGS)3、(GGGGS)4、(GGGGS)5，或含有大于或等于2个氨基酸的任何长度的甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸含量总计为50％或更多的任何肽。
在一些实施方案中，亲和肽也可包括在分子嵌合体中，以促进纯化。例如，可以使用生物素、抗生物素蛋白或链酶亲和素结合肽(SBP，氨基酸序列MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)。例如，将(SBP，氨基酸序列MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)附加到FasL末端以进行免疫亲和纯化。
将终止密码子(DNA序列5'TGA 3')插入分子嵌合序列的末端，例如SBP的末端，以终止蛋白质。
可以将适当的限制酶位点添加到相应的DNA末端以克隆到表达载体中。例如，将5'末端EcoRI位点(5'GAATTC 3')和3'BamHI位点(5'GGATCC 3')复制到各自的DNA末端以克隆到合适的载体中，例如pLenti-C-Myc-DDK-IRES-Puro。最终的计算机生成的图如图3A所示。
该序列作为用于GENEWIZ进行基因合成的文本输出，为克隆到pUC57-Amp中的纯化质粒。
将pUC57-Amp转化至具有化学活性的DH5α细菌细胞，筛选后产生单个克隆。
将该克隆在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB肉汤中培养，并使用QIAGEN质粒提取微量制备试剂盒提取质粒。
用来自New England Biolabs的EcoRI-HF和BamHI消化该DNA，以释放PD-L1-FasL片段，该片段通过琼脂糖凝胶电泳和提取进行分离。
该片段以3：1摩尔比与SAP-脱磷酸化的、BamHI-HF/EcoRI-HF双重消化的和PCR柱纯化的pLenti-C-Myc-DDK-IRES-Puro线性化DNA混合。
使用来自New England Biolabs的1-100U的T4 DNA连接酶连接片段。
将得到的DNA转化到DH5α中，并通过BamHI-HF/EcoRI-HF双重消化针对插入物的存在筛选克隆。选择单个插入物阳性克隆用于重组PantId的后续转染、表征和纯化。阳性克隆质粒图谱的一个例子显示在图3B中。
实施例2–PantId表达载体的转染
将HEK293T细胞在37℃在由FBS中的7％DMSO组成的低温培养基中融化3分钟。
用另外的5ml具有10％FBS的DMEM稀释细胞悬液，通过颠倒试管进行混合，然后在室温下以300xg离心5分钟。
倒出上清液，并将细胞重悬于15ml具有10％FBS的DMEM中。
将细胞在T-75烧瓶中培养1-3天，直到达到70％以上的融合度为止。
此时，除去细胞培养基，并用3ml的0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃下胰蛋白酶消化细胞5分钟。
在用含10％FBS的7ml DMEM稀释之前，用移液器将细胞剧烈研磨30秒。
计数细胞，将3·106个细胞移入10cm培养皿中，总体积为10ml的DMEM，含10％FBS，具有pen/strep。转染前将细胞再培养12-18小时。
第二天，将细胞培养物上清液替换为7ml无血清DMEM。
为了生产慢病毒颗粒，将10μg的pLenti-C-PD-L1-FasL-IRES-Puro与7.5μg的pCMVΔ8.2和2.5μg的pHCMV-G和1.5ml无血清DMEM混合。为了表达蛋白质，将20μg的pLenti-C-PD-L1-FasL-IRES-Puro与1.5ml无血清DMEM混合。与此同时，将60μl的Lipofectamine-2000试剂(Life Technologies)与1.5ml的无血清DMEM混合。
将两种混合物在室温下温育5分钟。
之后，将DNA和Lipofectamine溶液混合并在室温下温育20分钟。
将脂质体-DNA混合物滴加到10cm培养皿中的细胞上。
在除去转染上清液并用含10％FBS和pen/strep的10ml DMEM替换之前，将细胞在37℃和5％CO2下转染4-6小时。
在收获蛋白质或慢病毒颗粒之前，将细胞再培养48小时。
对于慢病毒颗粒，将上清液等分为0.5或1ml等分试样，并在-80℃下保存。为了产生蛋白质，收获上清液并与蛋白酶抑制剂混合物混合，然后储存于-80℃。
实施例3–PantId免疫亲和纯化
使用磁性颗粒浓缩器(MPC)，用2ml含0.1％BSA的PBS将0.1mg的链霉亲和素磁珠(Life Technologies)洗涤3次。
将含有PantId的上清液与1mg洗涤过的链霉亲和素珠混合。
通过在室温下颠倒摇动将带珠的样品混合30分钟。
将珠在磁性颗粒浓缩器(MPC)上浓缩1分钟，然后用含0.1％BSA的PBS洗涤3次。
轻轻摇动温育10分钟后，将样品在含1-10mM生物素的0.5ml PBS中洗脱。
通过MPC去除链霉亲和素磁珠，从而收集洗脱的蛋白质。
使用Zeba旋转脱盐柱(Life Technologies)对PD-L1-FasL PantId进行脱盐，以去除残留的生物素。
储存前通过BCA蛋白质测定法估算蛋白质浓度。
对于长期存储，在-80℃下存储之前，将PantId用甘油稀释50％。或者，将PantId等分为50μl等分试样，然后在-20℃下保存。
实施例4–PantId介导的细胞杀伤的体外表征
将50ml患者外周血在1X DPBS中稀释2倍，然后覆盖在等体积的Ficoll淋巴细胞分离培养基上。
以400xg离心30-45分钟，然后吸出上层。
抽吸外周血单核细胞(PBMC)层，并将其转移到新的50ml锥形管中。
通过以300xg离心5分钟，用50ml 1X DPBS洗涤3次。
将细胞重悬于RPMI+10％FBS中每毫升1·105个细胞，然后以每孔100-200μl的密度接种到96孔板中。
将细胞在37℃和5％CO2下培养过夜。
第二天，将各列分配给不同的治疗组，第1列为未处理的对照，第2-4列以1.5-100μg/ml PantId作为连续2倍稀释液一式三份进行处理，第5列为细胞毒性的阳性对照并含有0.1％的Triton X-100。类似地处理第6-10列以同时进行B和T细胞染色。第11和12列保留用于同型对照和单染色对照。
在37℃和5％CO2下温育6小时。
除去上清液并在37℃下用50-100μl的胰蛋白酶替换5分钟。
加入150μl含10％FBS的RPMI，然后用FACS缓冲液(含0.5％BSA和0.1％叠氮化钠的PBS)洗涤两次。
用200μl FACS缓冲液重悬细胞，然后每孔添加5μl的7-AAD，5μl缀合有AlexaFluor488的抗人CD19(BioLegend)以进行B细胞染色，或5μl缀合有AlexaFluor 488的抗人CD3(BioLegend)以进行T细胞染色，或5μl适当的同型对照(BioLegend)。
用FACS缓冲液洗涤细胞两次以除去残留的抗体和7-AAD。
将细胞重悬于200μl的FACS缓冲液中，并进行流式细胞仪分析。死细胞表现为7-AAD阳性事件，并且这些事件在CD19阳性、CD3阳性和CD19或CD3阴性人群中的相对分布可用于初步评估特异性。
实施例5–患者血清的筛选
在一些实施方案中，蛋白质阵列用于筛选患者血清。在一些实施方案中，阵列可以是例如
Figure BDA0002284920980000244
人蛋白质微阵列。该阵列还可包含多种选择的检查点受体、配体或免疫调节细胞因子或任何细胞外结构域或其活性部分肽或表位。例如，当使用
Figure BDA0002284920980000242
人蛋白质微阵列时，应立即将包含
Figure BDA0002284920980000241
人蛋白质微阵列的邮件封套从-20℃的存储中取出后置于4℃，并在使用前至少在4℃平衡邮件封套15分钟。
将
Figure BDA0002284920980000243
人蛋白质微阵列的条形码朝上放在4腔培养箱的底部，以使微阵列的条形码末端靠近包含缩格数字的托盘末端。托盘底部的凹部用作去除缓冲液的位置。
使用无菌移液器，向每个腔室中加入5mL封闭缓冲液。避免将缓冲液直接移液到阵列表面。
在4℃下在设定50rpm(圆形摇动)的摇动器上温育托盘1小时。使用在旋转期间将阵列保持在一个平面中的振动器。由于会增加孔间污染的风险，因此不使用摇床。
温育后，通过真空或用移液管吸出封闭缓冲液。将抽吸器或移液器的尖端置于缩格数字中，并从每个孔中抽吸缓冲液。倾斜托盘，以使剩余的缓冲液积聚在具有缩格数字的托盘末端。吸出累积的缓冲液。重要：请勿放置尖端或从微阵列表面抽吸，因为这可能会导致刮擦。立即开始添加下一溶液，以防止阵列表面的任何部分干燥，干燥可能会产生高背景或不均匀的背景。
探测阵列：
用镊子从4孔托盘中取出载玻片。将镊子的尖端插入缩格数字中，然后轻轻向上撬动载玻片的边缘。用戴手套的手拿起阵列，注意只能触摸阵列的边缘。在纸巾上轻轻擦干阵列的背面和侧面，以去除多余的缓冲液。注意：为确保阵列表面保持湿润，在添加稀释的探针之前，一次干燥不要超过2个阵列，在某些情况下，稀释的探针可包含标记的抗人抗体，例如荧光或化学发光标记的抗人抗体，和LifterSlipTM盖玻片。
将血清I：1000稀释到洗涤缓冲液中，然后将5ml稀释的血清在洗涤缓冲液中放入容器的适当腔室中。
在4℃下温育90分钟，使4孔板平坦，阵列面朝上(不晃动)。
加入5mL冷洗涤缓冲液。
在4℃轻轻搅拌下洗涤5分钟。
抽吸除去洗涤缓冲液。
重复洗涤步骤4次以上。
将5mL在洗涤缓冲液中稀释的二抗添加到温育托盘编号末端的凹部中，并使液体流过载玻片表面。为了避免荧光强度和背景的局部变化，请避免与阵列直接接触。不要将抗体溶液直接倒在载玻片上。
不同于初级染色，在4℃下伴随温和圆形摇动(～50rpm)温育90分钟。
抽吸去除二抗。
在4℃下伴随温和搅拌，用5mL新鲜洗涤缓冲液洗涤5分钟。抽吸除去洗涤缓冲液。
重复洗涤步骤4次以上。
干燥阵列：
使用镊子从4孔托盘中取出阵列。将镊子的尖端插入缩格数字中，然后轻轻向上撬动载玻片的边缘(见下图)。用戴手套的手拿起载玻片，注意仅触摸载玻片边缘。轻敲载玻片的侧面以去除多余的液体，但要避免干燥阵列。放在平坦的表面或台面上。
将阵列放置在载玻片支架(或无菌50mL锥形管)中。确保将载玻片正确放置并固定在支架中，以防止在离心过程中损坏阵列。将包含阵列的载玻片支架短暂浸入室温蒸馏水中一次，以去除盐分。如果不使用载玻片支架，则将阵列浸入装有室温蒸馏水的50mL锥形管中一次。
在室温下，在离心机(如果正使用载玻片支架，其配有平板转子)中，以200×g将载玻片支架或50mL锥形管中的阵列离心1分钟。确认阵列完全干燥。探测并干燥载玻片后，可将它们垂直或水平存放。4.干燥后，将阵列垂直或水平存放在避光的载玻片箱中。避免长时间暴露在光线下，因为它会降低信号强度。为了获得最佳结果，在探测后的24小时内扫描阵列。
将阵列插入荧光微阵列扫描仪。
扫描阵列：
调整扫描仪设置。
预览微阵列并根据需要调整设置。
扫描微阵列。
保存图像数据。
导出并分析结果
分析阵列：
对对照血清和自身免疫患者血清之间的阵列重复进行学生t检验，以鉴定P值小于或等于0.05的样品。
从该子集中，排除那些高于或低于自身免疫患者血清荧光强度与对照患者血清荧光强度之比的临界值阈值的抗原：这是要排除阵列中高显著性、低倍变化的命中值。
排除低于本地阵列背景3倍、5倍或10倍的样品，以排除仅略高于背景的自身抗原。
通过使用PubMed数据库查找其关联的RefSeq ID来注释自身抗原。
实施例6–功效的小鼠模型证明
在一些实施方案中，可以使用动物模型，例如小鼠模型，证明本公开的PantId的功效。作为功效模型的非限制性实例，修饰载体，例如慢病毒载体，例如pLenti-C-Myc/DDK-IRES-Puro，以包括强力霉素诱导的Cre重组酶和第二转录单位，其包含编码本发明的PantId分子嵌合体的核酸，例如CD22启动子-5'UTR-LoxP1-PolyA信号1-LoxP2-PD-1-IgGFc-3'UTR-PolyA信号2。将强力霉素引入小鼠水或食物中或通过注射引起Cre重组酶的表达。在没有Cre的情况下，CD22启动子驱动空的mRNA的表达，在该非限制性实例中，由于早期的PolyA信号，其在分子嵌合体例如PD-IgG Fc之前终止转录。在存在Cre的情况下，LoxP位点之间的重组导致去除第一个polyA信号，并允许PD-1-IgG Fc分子嵌合体。此后，PD-1-IgGFc与细胞上的PD-L1和PD-L2结合，拮抗这些配体的致癌作用：此外，PD-1-IgG Fc与表达PD-1的Tregs细胞结合，并靶向它们用于细胞杀伤，从而消除了另一种致耐受机制。此外，CD22启动子驱动B细胞特异性表达。结果，产生了完全模仿自身反应性B细胞介导的检查点受体去抑制的自身免疫疾病。该模型将允许在具有明确终点(诱发的自身免疫性疾病的缓解)的生理相关系统中测试PantId。下述方法可用于证明通过其B细胞受体(BCR)靶向自身反应性B细胞从而导致克隆缺失的任何PantId的功效。抗检查点蛋白自身反应性B细胞的克隆缺失将显著减轻自身免疫相关的炎症、发病率和死亡率。
如上所述，通过与辅助质粒共转染到HEK293T细胞中来生产慢病毒颗粒。
小鼠BALB/C胚泡购自Jackson实验室，并使用干细胞培养基在饲养细胞上培养。
在6孔板中以1的MOI转导胚泡。
24小时后，更换培养基。
48小时后，使用1μg/ml嘌呤霉素选择胚泡。
再过48小时后，将胚泡用PBS洗涤两次，然后重悬。
然后通过移液管将胚泡转移到假孕BALB/c子宫中13。
出生后，对幼犬进行基因分型并进行近交，以产生纯合的F2代用于研究。
将这些小鼠分成5组，每组5只。第1组将接受强力霉素、未经治疗，第2组将不接受强力霉素，第3组将接受强力霉素和每周两次100μg/kg PD-L1-FasL PantId，第4组将接受强力霉素和每周两次500μg/kg PD-L1-FasL PantId，第5组将接受强力霉素和每周两次1mg/kg PD-L1-FasL PantId。用强力霉素诱导自身免疫2周后，将通过静脉内注射给予PantId。通过静脉内尾静脉注射治疗3周后，将收集小鼠尾静脉血液用于IL-2、IL-4、IL-17、TGF-β和IFN-γELISA。此外，免疫相关症状将以1-5级评分，在PantId治疗1周后每周进行监测。研究结束后，将分析终点以确定相对于非自身免疫对照的PantId治疗功效。
可以使用本文公开的任何PantId来执行此实施例中描述的方法。
实施例7–克隆包含自身抗原-Fc的示例性PantId。
通过在慢病毒表达载体中表达示例性CTLA-4-hFc构建体，在HEK293T细胞中产生CTLA-4-Fc PantId。PantId包含与hIgG1 Fc片段融合的CTLA-4。通过将CTLA-4-hIgG1 Fc片段NheI-HF/BamHI-HF定向克隆到pLenti-C-Myc/DDK-IRES-Puro(Origene)中，制备了CTLA-4-hFc慢病毒表达质粒。形成四个pLenti-C-CTLA-4-hIgG1 FC-IRES-Puro克隆(表示为克隆1-4)。然后将该表达载体通过Lipofectamine 2000(Life Technologies)转染到人HEK293T中进行转染。48小时转染后，收集上清液，然后连续稀释，并使用专有ELISA测试进行Fc融合PantId生产的定量。图9显示了从四个慢病毒克隆到人HEK293T细胞中的每一个中获得的上清液CTLA-4-hFc PantId的滴度。对照样品的附加滴度也示于图9中，其中包括以下：两个阴性对照(即稀释的培养基和pLenti-C-Myc/DDK-IRES-puro载体)，二者均给出表达PantId的预期的阴性结果。还示出了来自vLenti-C-CTLA-4-的hIgG1 FC-IRES-Puro慢病毒转导的HEK293T细胞的上清液中的滴度，与转染的细胞相比，其提供适度的表达。
在其他实施方案中，可以使用该方法克隆、表达和表征本说明书全文中描述的任何Pant-Id。例如，在本文的一些实施方案和任选特征中，克隆和表达的PantId包括例如选自但不限于以下的免疫检查点受体、免疫检查点配体和/或免疫调节细胞因子：PD-1(序列038)；CD28(序列039)；CTLA-4(序列040)；ICOS(序列041)；BTLA(序列042)；杀死免疫球蛋白受体(KIR)，包括：KIR2DL1(序列043)、KIR2DL2(序列044)、KIR2DL3(序列045)、KIR2DL4(序列046)、KIR2DL5A(序列047)、KIR2DL5B(序列048)、KIR2DS1(序列049)、KIR2DS2(序列050)、KIR2DS3(序列051)、KIR2DS4(序列052)、KIR2DS5(序列053)、KIR3DL2(序列054)、KIR3DL3(序列055)和KIR3DS1(序列056)；LAG-3(序列057)；CD137(序列058)；OX40(序列059)；CD27(序列060)；CD40(序列061)；TIM-3(序列062)和其他T细胞免疫球蛋白以及包含1结构域的(TIM)受体，包括TIM-1(序列063)、TIM-2(序列064)和TIM-4(序列065)；A2aR(序列066)；或者任何包含ITAM(基于免疫受体酪氨酸的活化基序，序列067)、ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序，序列068)或ITSM(基于免疫受体酪氨酸的开关基序，序列069)基序、结构域或肽例如CD244(2B4，序列070)和TIGIT受体(序列071)的跨膜、外周膜、膜相关或胞质蛋白。
在一些实施方案和任选特征中，PantId可以包含选自但不限于：免疫检查点受体、免疫检查点配体和/或免疫调节细胞因子，其选自CTLA-4、PD-1、BTLA、LAG-3、TIM-3、LAIR、TIGIT、Siglec-2、Siglec-3、Siglec-4、Siglec-10、FcγRII、CD5、CD66a、PIR-B、ILT-2和CD72。
在一些实施方案中，克隆并表达的PantId的效应子组分可以是贯穿本说明书描述的任何效应子，并且可以选自例如以下任一项或其配体，或可以排除以下任一项；在白细胞(可选地T细胞和B细胞)中能够诱导凋亡、坏死、细胞凋亡、抑制、耐受或无反应的任何蛋白质、结构域、肽、聚糖、脂质、核酸、糖蛋白、脂蛋白、核糖核蛋白、脱氧核糖核蛋白、共价修饰的肽或小于10,000道尔顿的小分子或其组合或分子嵌合体。在一些实施方案中，本文克隆、表达和/或表征的PantId的效应子组分可以选自或可以不包括以下任何或其结合配偶体：死亡受体配体，其包括PantId的效应子类别的CD95L(又名FasL，序列001)、TRAIL(又名Apo2L，序列002)和TWEAK(又名肿瘤坏死因子配体超家族成员12，序列003)。在一些实施方案中，效应子可包括或排除TNF受体超家族配体的任何其他成员，包括但不限于OX40L(序列004)、TNF-α(序列005)、淋巴毒素-β(又名TNF-C，序列006)及其结合配偶体淋巴毒素-α(又名TNF-β，序列007)、CD154(又名CD40L，序列008)、LIGHT(又名CD258序列009)、CD70(序列010)、CD153(序列011)、4-1BBL(又名CD137L，肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员9，(序列012)、RANKL(又名CD254，序列013)、APRIL(序列014)、神经生长因子配体(例如NGF序列015，BDNF(序列016)、NT-3(序列017)和NT-4(序列018)、BAFF(序列019)、GITR配体(序列020)、TL1A(序列021)和EDA-A2(序列022)，修饰的细菌毒素，包括A-B毒素和自转运蛋白，用于在细胞内递送细胞毒性效应子，其中所述细胞毒性效应子可以是胱天蛋白酶、细菌毒素或其他酶；小于10,000道尔顿的细胞毒性或细胞抑制剂小分子，例如微管或肌动蛋白细胞骨架调节剂、DNA复制抑制剂、核糖体抑制剂、RNA合成抑制剂、放射性核素及其配位复合物等；NK活化受体配体，包括：与NKG2D结合的MICA(序列023)和MICB(序列024)；与NKG2D结合的ULBP1-6(序列025-030)、Rae-1(序列031)、MULT1(序列032)、H60(序列033)；DNAM-1配体CD155(序列034)和CD112(序列035)；B7-H6(序列036)和BAT3(序列037)；其与NKp30结合；和CD27，其结合CD70；免疫调节细胞因子，例如IL-1β、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-21、IL-35、TGF-β、TNF-α、I型干扰素、II型干扰素、III型干扰素，典型趋化因子(例如CC、CXC、C和CX3C类)和非典型趋化性或化学动力学剂(例如Slit1、2和3)；或人、鼠、猪或犬免疫球蛋白的Fc结构域，包括IgA、IgM、IgG、IgD、IgE及其亚类。在一些实施方案中，Fc可以增加PantId的生物利用度和/或半衰期。在一些实施方案中，PantId效应子组分可以排除上面列出的任何Fc结构域。
实施例8–PantId的低聚/均二聚结构的证明
如所预期的，确定CTLA-4-hFc PantId的寡聚/均二聚体结构为均二聚的。通过蛋白质印迹分析确认了CTLA-4-hFc PantId的结构和大小。将CTLA-4-hFc与pLenti-C-CTLA-4-hIgG1 FC-IRES-Puro克隆1-4一起转染到HEK293T细胞中，并在存在或不存在还原剂的情况下分析上清液。这允许鉴定单体、均二聚体和更高阶的低聚物。克隆编号由数字表示，而空的亲本pLenti-C-Myc/DDK-IRES-puro载体被用作对照。适当的均二聚体形式是未还原样品中的主要条带，表明结构适当。此外，在还原的样品中，CTLA-4-hFc单体的预测分子量为43kDa。较高的分子量带对应于其寡聚物和糖变体。结果示于图10中。
实施例9-与抗人CTLA-4、PD-1和PD-L1抗体结合的PantId的第一组分。
在LDS样品缓冲液中制备PantId的纯化的CTLA-4-Fc、PD-1-CCAN4和PD-L1-CCAN4第一组分并在80℃加热，然后与标记梯带一起加载在Bis-Tris SDS-PAGE凝胶上。电泳后，将多肽电泳转移到硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜在含0.1％Tween 20和5％脱脂乳5％脱脂乳的Tris缓冲盐水(TBS)中封闭，然后在具有5％脱脂乳的TBS-T中在4℃用1μg/ml小鼠抗人CTLA-4(Abcam目录号：ab177523)、小鼠抗人PD-1(Abcam目录号：ab52587)或兔抗人PD-L1(ProSci目录号：4059)染色过夜。仅接受二次染色的对照膜在封闭剂中放置过夜。第二天，在TBS-T中清洗3次后，在具有5％脱脂乳的TBS-T中，用1：4,000稀释的山羊抗小鼠HRP缀合物(Thermo Fisher目录号：A16078)或山羊抗兔HRP缀合物(Jackson ImmunoResearch目录号：111-035-003)染色膜1小时。在用SuperSignalTMWest Femto最大灵敏度底物：(ThermoFisher目录号：34096)进行ECL显影之前，将膜清洗3次，然后在Azure Biosystems成像站成像。结果示于图11中。如图11所示，抗CTLA-4抗体与PantId的CTLA-4-Fc第一组分特异性结合(左小图)。仅暴露在抗小鼠IgG二抗下的对照膜显示在相邻的左中小图中。在30秒的暴露中几乎没有或没有观察到非特异性结合。同样如图11所示，抗PD-1和抗PD-L1抗体分别特异性结合PantId的PD-1-CCAN4和PD-L1-CCAN4第一组分(见右中小图和最右小图)
实施例10-通过PantId的PD-1-CCAN4第一组分体外中和抗PD-1抗体
重组人PD-1蛋白(Abcam目录号：174035)在PBS中重构为0.5mg/ml。将该储备液在BupH碳酸盐/碳酸氢盐ELISA包被缓冲液中稀释500倍，以产生1μg/ml重组PD-1工作试剂，其中将100μl(100ng重组PD-1)添加到ELISA板的每个孔中。在4℃包被过夜后，将板用具有与0.05％吐温20的PBS洗涤三次，然后用具有5％脱脂乳的PBS在室温下封闭两小时。在此期间，在PBS中制备了1μg/ml的小鼠抗人PD-1溶液(Abcam目录号：ab52587)。将1μg的PantId的PD-1-CCAN4第一组分、1μg人IgG阴性对照及其连续两倍稀释液与抗PD-1抗体混合，在室温下进行一小时过程的中和。此后，洗涤板，并且将中和的抗体混合物添加至其适当的孔中以在室温下结合1小时。随后洗涤板，然后在室温下用山羊抗小鼠HRP缀合物(Thermo Fisher目录号：A16078)染色1小时，然后再次洗涤。将TMB底物(Thermo Fisher目录号：34028)添加到每个孔中，直到明显出现色素细胞，然后用2N H2SO4终止反应。在Beckman Coulter DTX多模检测器上于450nm读取板。
如图12所示，PantId的PD-1-CCAN4第一组分特异性中和了小鼠抗人PD-1与重组人PD-1蛋白的结合。中和活性是剂量依赖性的，并且对于人IgG对照抗体没有观察到。
实施例11-通过PantId的PD-1-CCAN4第一组分体外中和抗PD-1抗体
重组人PD-1蛋白(Abcam目录号：174035)在PBS中重构为0.5mg/ml。将该储备液在BupH碳酸盐/碳酸氢盐ELISA包被缓冲液中稀释500倍，以产生1μg/ml重组PD-1工作试剂，其中将100μl(100ng重组PD-1)添加到ELISA板的每个孔中。在4℃包被过夜后，将板用具有与0.05％吐温20的PBS洗涤三次，然后用具有5％脱脂乳的PBS在室温下封闭两小时。在此期间，在PBS中制备了1μg/ml的小鼠抗人PD-1溶液(Abcam目录号：ab52587)。将2μg的PantId第一组分的PD-1-CCAN4、2μg人IgG阴性对照和2μg的BSA阴性对照及其连续两倍稀释液与抗PD-1抗体混合，在室温下进行一小时过程的中和。此后，洗涤板，并且将中和的抗体混合物添加至其适当的孔中以在室温下结合1小时。随后洗涤板，然后在室温下用山羊抗小鼠HRP缀合物(Thermo Fisher目录号：A16078)染色1小时，然后再次洗涤。将TMB底物(ThermoFisher目录号：34028)添加到每个孔中，直到明显出现色素细胞，然后用2N H2SO4终止反应。在Beckman Coulter DTX多模检测器上于450nm读取板。对质量(单位μg)进行了对数转换，以进行进一步分析。
如图13所示，PantId的PD-1-CCAN4第一组分特异性中和了小鼠抗人PD-1与重组人PD-1蛋白的结合。中和活性是剂量依赖性的，并且对于含有人IgG对照抗体或BSA的样品没有观察到。PantId的PD-1-CCAN4第一组分中和了1μg ml抗人PD-1，IC50为136ng或31.8nM，PantId的PD-1-CCAN4第一组分在SDS-PAGE中显示出观察到的分子量为43kDa。
实施例12-将PantId的CTLA-4-Fc第一组分与抗人CTLA-4单克隆抗体结合
在4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上分析了含有840ng PantId的还原或未还原CTLA-4-Fc第一组分的样品。为了还原，将样品用含有β-巯基乙醇的SDS样品缓冲液处理。将凝胶在含0.1％Tween-20和5％脱脂乳的Tris缓冲盐水(TBS)中以1μg/ml抗人CTLA-4(Abcam目录号ab177523)染色过夜。洗涤后，在具有5％脱脂乳的TBS-T中以1：4,000稀释度，将凝胶用山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP缀合物(Thermo Fisher目录号：A16066)染色。使用SuperSignalWest Femto最大灵敏度底物产生化学发光。
如图14所示，CTLA-4-Fc PantId被抗人CTLA-4特异性结合。观察了未还原和还原的CTLA-4-Fc PantId的结合。
实施例13-由Strep-Tactin树脂纯化PD-L1-CCAN4-SBP多肽
将编码与CCAN4异二聚结构域融合的PD-L1胞外结构域和Strep Tag II链霉亲和素结合肽(SBP)的慢病毒表达载体pLenti-PD-L1-CCAN4-SBP转染到HEK293T细胞中。收获上清液(2ml)，并使用Strep-Tactin树脂(QIAGEN目录号：30002)进行纯化。在SDS-PAGE凝胶上分析级分。通过考马斯亮蓝染色使多肽可视化。
如图15所示，在第一和第二洗脱级分中从Strep-Tactin树脂中回收了PD-L1-CCAN4-SBP多肽(“PD-L1异二聚体PantId”)。
实施例14–通过Strep-Tactin树脂和CHO细胞中PantId表达的FasL和TRAIL异二聚 第二组分纯化PD-L1-CCAN4-SBP多肽
将编码与CCAN4异二聚结构域融合的PD-L1胞外结构域和Strep Tag II链霉亲和素结合肽(SBP)的慢病毒表达载体pLenti-PD-L1-CCAN4-SBP转染到HEK293T细胞中。收获上清液(2ml)，并使用Strep-Tactin树脂(QIAGEN目录号：30002)进行纯化。将pLenti-PD-1-CCAN4-SBP(一种慢病毒表达载体)转染到HEK293T细胞中，该慢病毒表达载体编码与CCAN4异二聚结构域和Strep Tag II链霉亲和素结合肽(SBP)融合的PD-1细胞外结构域。收获2ml上清液，并使用Strep-Tactin树脂(QIAGEN目录号：30002)进行纯化。在使用抗-Strep TagII抗体-HRP缀合物(EMD Milipore目录号：71591-3)进行免疫印迹之前，将级分在SDS-PAGE凝胶上电泳。类似地，用pLent-FasL-CCBN4-SBP和pLenti-TRAIL-CCBN4-SBP转染CHO细胞。pLent-FasL-CCBN4-SBP表达了与同源CCBN4异二聚结构域和Strep Tag II SBP融合的FasL。pLenti-TRAIL-CCBN4-SBP表达了与同源CCBN4异二聚结构域和Strep Tag II SBP融合的TRAIL细胞外结构域。收获球粒和上清液，并通过SDS-PAGE和抗Strep Tag II免疫印迹进行分析。
如图16所示，在第一和第二洗脱级分中从Strep-Tactin树脂中回收了PD-L1-CCAN4-SBP多肽(“PD-L1异二聚体PantId”)。也如图16所示，表达FasL-CCBN4-SBP或TRAIL-CCBN4-SBP的CHO细胞产生预期质量的多肽。
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在此已经广泛和概括地描述了本发明。落入一般公开范围内的每个较窄的种类和亚类分组也构成本发明的一部分。这包括对本发明的一般性描述，其附带条件或否定性限制从该类中去除了任何主题，无论所去除的材料是否在本文中被具体叙述。
其他实施方案在以下权利要求书之内。另外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此本发明也根据马库什组的任何单个成员或成员的子组进行了描述。
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本公开中引用的参考文献：
1.Sojka,D.K.,Huang,Y.-H.&Fowell,D.J.Mechanisms of regulatory T-cellsuppression–a diverse arsenal for a moving target.Immunology 124,13–22(2008)。
2.Jones,A.等人，Immunomodulatory Functions of BTLA and HVEM GovernInduction of Extrathymic Regulatory T Cells and Tolerance by DendriticCells.Immunity 45,1066–1077(2016)。
3.Ercolini,A.M.&Miller,S.D.The role of infections in autoimmunedisease.Clin.Exp.Immunol.155,1–15(2009)。
4.Faé,K.C.等人，How an autoimmune reaction triggered by molecularmimicry between streptococcal M protein and cardiac tissue proteins leads toheart lesions in rheumatic heart disease.J.Autoimmun.24,101–109(2005)。
5.Root-Bernstein,R.Rethinking Molecular Mimicry in Rheumatic HeartDisease and Autoimmune Myocarditis:Laminin,Collagen IV,CAR,and B1AR asInitial Targets of Disease.Front.Pediatr.2,(2014)。
6.Michot,J.M.等人，Immune-related adverse events with immunecheckpoint blockade:a comprehensive review.Eur.J.Cancer 54,139–148(2016)。
7.Munir,S.等人，HLA-Restricted CTL That Are Specific for the ImmuneCheckpoint Ligand PD-L1 Occur with High Frequency in Cancer Patients.CancerRes.73,1764–1776(2013)。
8.Munir,S.,Andersen,G.H.,Svane,I.M.&Andersen,M.H.The immunecheckpoint regulator PD-L1 is a specific target for naturally occurring CD4+Tcells.Oncoimmunology 2,(2013)。
9.Matsui,T.等人，Autoantibodies to T cell costimulatory molecules insystemic autoimmune diseases.J.Immunol.Baltim.Md 1950 162,4328–4335(1999)。
10.Matsui,T.,Nishioka,K.,Kato,T.&Yamamoto,K.Autoantibodies to CTLA-4enhance T cell proliferation.J.Rheumatol.28,220–221(2001)。
11.Thomas,F.,Boyle,A.L.,Burton,A.J.&Woolfson,D.N.A Set of de NovoDesigned Parallel Heterodimeric Coiled Coils with Quantified DissociationConstants in the Micromolar to Sub-nanomolar Regime.J.Am.Chem.Soc.135,5161–5166(2013)。
12.Mittl,P.R.E.等人，The retro-GCN4 leucine zipper sequence forms astable three-dimensional structure.Proc.Natl.Acad.Sci.97,2562–2566(2000)。
13.Cho,A.,Haruyama,N.&Kulkarni,A.B.Generation of TransgenicMice.Curr.Protoc.Cell Biol.Editor.Board Juan Bonifacino Al CHAPTER,Unit-19.11(2009)。

Claims (72)

1.一种用于治疗自身免疫性疾病或病症的PantId分子，其中自身反应性B细胞对免疫检查点受体、免疫检查点配体和/或免疫调节细胞因子有反应，所述分子包含：二、三、四或五个蛋白质、结构域或肽的分子嵌合体：
其中所述蛋白质、结构域或肽中的第一个是免疫检查点受体、检查点配体或免疫调节细胞因子中的一种；和
其中所述蛋白质、结构域或肽中的第二个是效应子。
2.根据权利要求1所述的PantId分子，其中所述蛋白质、结构域或肽中的第一个是免疫检查点受体。
3.根据权利要求2所述的PantId分子，其中所述免疫检查点受体是与配体结合并在白细胞或淋巴样组织相关细胞内引发信号传导的细胞内、跨膜或膜相关的蛋白。
4.根据权利要求3所述的PantId分子，其中白细胞或淋巴样组织相关细胞内的信号转导通过NF-κB、NFAT、JAK-STAT、PI-3K、PLC、PKC、cAMP-PKA、cGMP-PKG、MAPK、胱天蛋白酶、SMAD、Rho家族GTP酶、酪氨酸激酶或磷酸酶、脂质激酶或磷酸酶途径；或通过T和B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤T(NKT)细胞、粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞)、单核细胞、巨噬细胞或淋巴组织相关细胞中的其他信号传导途径，介导免疫调节作用。
5.根据权利要求2所述的PantId分子，其中所述免疫检查点受体是以下之一：PD-1(序列038)；CD28(序列039)；CTLA-4(序列040)；ICOS(序列041)；BTLA(序列042)；杀死免疫球蛋白受体(KIR)，包括：KIR2DL1(序列043)、KIR2DL2(序列044)、KIR2DL3(序列045)、KIR2DL4(序列046)、KIR2DL5A(序列047)、KIR2DL5B(序列048)、KIR2DS1(序列049)、KIR2DS2(序列050)、KIR2DS3(序列051)、KIR2DS4(序列052)、KIR2DS5(序列053)、KIR3DL2(序列054)、KIR3DL3(序列055)和KIR3DS1(序列056)；LAG-3(序列057)；CD137(序列058)；OX40(序列059)；CD27(序列060)；CD40(序列061)；TIM-3(序列062)和其他T细胞免疫球蛋白以及包含1-结构域的(TIM)受体，包括TIM-1(序列063)、TIM-2(序列064)和TIM-4(序列065)；A2aR(序列066)；或者任何包含ITAM(基于免疫受体酪氨酸的活化基序，序列067)、ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序，序列068)或ITSM(基于免疫受体酪氨酸的开关基序，序列069)基序、结构域或肽例如CD244(2B4，序列070)和TIGIT受体(序列071)的跨膜、外周膜、膜相关或胞质蛋白。
6.根据权利要求1所述的PantId分子，其中所述蛋白质、结构域或肽中的第一个包括免疫检查点配体。
7.根据权利要求6所述的PantId分子，其中所述免疫检查点配体是能够引发免疫检查点受体中信号传导的蛋白质、结构域或肽。
8.根据权利要求7所述的PantId分子，其中所述信号传导是反向信号传导，通过该反向信号传导，与检查点配体结合的检查点受体与表达配体的细胞信号传导相关联。
9.根据权利要求6所述的PantId分子，其中所述免疫检查点配体是源自以下任何一种的全部、部分或肽：PD-L1(序列072)和PD-L2(序列073)；CD80(序列074)和CD86(序列075)；B7RP1(序列076)；B7-H3(序列B7-H3)；B7-H4(序列B7-H4)；HVEM(序列079)；任何等位基因的MHC-I(序列080)和MHC-II(序列081)；CD137L(序列082)；OX40(序列083)；CD70(序列084)；GAL9(序列085)；或与包含ITAM；ITIM或ITSM基序的跨膜、外周膜、膜相关或胞质受体/蛋白结合的蛋白质、肽、脂质、聚糖、糖脂、糖蛋白、脂蛋白、核酸、核糖核蛋白或脱氧核糖核蛋白。
10.根据权利要求1所述的PantId分子，其中所述蛋白质、结构域或肽中的第一个是免疫调节细胞因子。
11.根据权利要求10所述的PantId分子，其中所述免疫调节细胞因子是能够在白细胞中引起信号传导的蛋白质、结构域或肽。
12.根据权利要求11所述的PantId分子，其中所述免疫调节细胞因子是白介素。
13.根据权利要求12所述的PantId分子，其中所述白介素(IL)是：IL-1家族的成员，包括IL-1α(序列086)、IL-1β(序列087)、IL-1Ra(序列088)、IL-33(序列089)、IL-18(序列090)、IL-36Ra(序列091)、IL-36α(序列092)、IL-36β(序列093)、IL-36γ(序列094)、IL-37(序列095)和IL-38(序列096)；IL-2(序列097)、IL-3(序列098)、IL-4(序列099)、IL-5(序列100)、IL-6(序列101)、IL-7(序列102)、IL-8(序列103)、IL-9(序列104)、IL-10(序列105)、IL-11(序列106)、IL-12(序列107)、IL-13(序列108)、IL-14(序列109)、IL-15(序列110)、IL-16(序列111)、IL-17(序列112)、IL-19(序列113)、IL-20(序列114)、IL-21(序列115)、IL-22(序列116)、IL-23(序列117)、IL-24(序列118)、IL-25(序列119)、IL-26(序列120)、IL-27(序列121)、IL-28(序列122)、IL-29(序列123)、IL-30(序列124)、IL-31(序列125)、IL-32(序列126)、或IL-35(序列127)。
14.根据权利要求10所述的PantId分子，其中所述免疫调节细胞因子是干扰素。
15.根据权利要求14所述的PantId分子，其中所述干扰素是I型、II型或III型干扰素。
16.根据权利要求10所述的PantId分子，其中所述免疫调节细胞因子是趋化因子。
17.根据权利要求16所述的PantId分子，其中所述趋化因子是C、CC、CXC或CX3C趋化因子。
18.根据权利要求10所述的PantId分子，其中所述免疫调节细胞因子是TNF受体超家族配体。
19.根据权利要求18所述的PantId分子，其中所述TNF受体超家族配体是OX40L、CD40L、TNF-α和CD70或4-1BBL之一。
20.根据权利要求10所述的PantId分子，其中所述免疫调节细胞因子是非经典的化学动力学剂或趋化剂。
21.根据权利要求20所述的PantId分子，其中所述非经典的化学动力学剂或趋化剂是Slit1、Slit2和Slit3之一。
22.根据权利要求1所述的PantId分子，其中所述效应子包含在白细胞——可选地T细胞和B细胞——中能够诱导凋亡、坏死、细胞凋亡、耐受或无反应的蛋白质、结构域、肽、聚糖、脂质、核酸、糖蛋白、脂蛋白、核糖核蛋白、脱氧核糖核蛋白、共价修饰的肽或小于10,000道尔顿的小分子或其组合或分子嵌合体。
23.根据权利要求22所述的PantId分子，其中所述效应子包含死亡受体配体，其包含CD95L(又名FasL，序列001)、TRAIL(又名Apo2L，序列002)或TWEAK(又名肿瘤坏死因子配体超家族成员12，序列003)。
24.根据权利要求22所述的PantId分子，其中所述效应子是修饰的细菌毒素。
25.根据权利要求24所述的PantId分子，其中所述修饰的细菌毒素是A-B毒素或自转运蛋白，用于在细胞内递送细胞毒性效应子，其中所述细胞毒性效应子可以是胱天蛋白酶、细菌毒素或其他酶。
26.根据权利要求22所述的PantId分子，其中所述效应子是NK活化受体配体。
27.根据权利要求26所述的PantId分子，其中所述NK活化受体配体包括结合NKG2D的MICA(序列023)或MICB(序列024)；结合NKG2D的ULBP1-6(序列025-030)、Rae-1(序列031)、MULT1(序列032)或H60(序列033)；DNAM-1配体CD155(序列034)或CD112(序列035)；结合NKp30的B7-H6(序列036)或BAT3(序列037)；或结合CD70的CD27。
28.根据权利要求22所述的PantId分子，其中所述效应子是小于10,000道尔顿的细胞毒性或细胞抑制剂小分子。
29.根据权利要求28所述的PantId分子，其中所述细胞毒性或细胞抑制剂小分子是微管或肌动蛋白细胞骨架调节剂、DNA复制抑制剂、核糖体抑制剂、RNA合成抑制剂、放射性核素或其配位复合物。
30.根据权利要求22所述的PantId分子，其中所述效应子是免疫调节细胞因子。
31.根据权利要求30所述的PantId分子，其中所述免疫调节细胞因子是IL-1β、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-21、IL-35、TGF-β、TNF-α、I型干扰素、II型干扰素、III型干扰素、典型趋化因子(例如CC、CXC、C和CX3C类)或非典型趋化剂或化学动力学剂(例如Slit1、2和3)。
32.根据权利要求22所述的PantId分子，其中所述效应子是人、鼠、猪或犬免疫球蛋白的Fc结构域。
33.根据权利要求32所述的PantId分子，其中所述免疫球蛋白是IgA、IgM、IgG、IgD、IgE免疫球蛋白或它们的亚类之一。
34.根据权利要求1的PantId分子，其中所述分子嵌合体的二、三、四或五个蛋白质、结构域或肽是共价连接或非共价结合的复合物。
35.一种PantId分子，其由以下组成：(1)免疫检查点受体、免疫检查点配体或免疫调节细胞因子；和(2)异二聚结构域、三聚结构域、四聚结构域或低聚结构域或其组合的分子嵌合体，其中所述分子嵌合体与效应子与异二聚结构域、均二聚结构域、三聚结构域、四聚结构域或低聚结构域或其组合的分子嵌合体混合或可混合。
36.一种用于治疗自身免疫性疾病的PantId分子，其中自身反应性B细胞对免疫检查点受体、免疫检查点配体和/或免疫调节细胞因子有反应，所述分子包含：免疫检查点受体、免疫检查点配体和/或免疫调节细胞因子与异二聚结构域、均二聚结构域、三聚结构域、四聚结构域或低聚结构域或其组合的分子嵌合体，其中所述嵌合体诱导B细胞活化诱导的细胞死亡(AICD)。
37.一种PantId分子，其由针对效应子的B或T细胞自身抗原的分子嵌合体组成，其中所述嵌合体通过非共价或共价嵌合形成。
38.一种PantId分子，其由以下组成：(a)对应于效应分子的核酸、合成蛋白质或肽中的一种；和(b)免疫检查点受体、免疫检查点配体或免疫调节细胞因子。
39.根据根据权利要求38所述的PantId分子，其中与所述效应子分子相对应的核酸、合成蛋白质或肽包括表达质粒、病毒载体、慢病毒载体、mRNA、合成蛋白质、合成肽、或包含所述核酸、蛋白质或肽的转导或转染的细胞。
40.根据权利要求1所述的PantId分子，所述分子已通过核糖体翻译、细菌培养、古细菌培养、真菌培养、植物培养、动物培养或人细胞培养在体外表达。
41.根据根据权利要求1所述的Pantid分子，所述分子已经由整个生物体表达。
42.一种用于治疗自身免疫疾病或病症的组合物，所述组合物包含一种或多种纯化的权利要求1所述的PantId分子。
43.一种方法，包括：
将权利要求1所述的PantId分子加入细胞培养上清液中；和
表征所述PantId分子。
44.一种方法，包括：
将权利要求1所述的PantId分子显微注射到细胞中；和
表征所述PantId分子。
45.一种治疗自身免疫性疾病或病症的方法，包括：
将权利要求1所述的Pantid分子或权利要求41所述的组合物引入需要其的动物中；和
治疗所述疾病或病症。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述动物是人或小鼠。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述引入通过施用。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述施用通过注射、鼻内递送、透皮或经上皮递送。
49.根据权利要求45所述的方法，其中所述Pantid分子被配制成丸剂，或处于贴剂中或为颗粒。
50.一种生产Pantid的方法，包括克隆所述Pantid。
51.一种通过化学连接Pantid的两个或多个组分生产Pantid的方法。
52.根据权利要求1或5中任一项所述的PantId，或用于前述权利要求中任一项所述的组合物和方法中的PantId，条件是当所述检查点受体、检查点配体或免疫调节细胞因子选自CTLA-4、CD27、ICOS及其部分时，所述效应子不选自FasL、TRAIL、TWEAK及其部分。
53.在前述权利要求所述的任何组合物或方法中使用的PantId，条件是所述检查点受体不是CTLA-4。
54.一种用于治疗自身免疫性疾病或病症的PantId分子，其中自身反应性B细胞对免疫检查点受体、免疫检查点配体和/或免疫调节细胞因子有反应，所述分子包含：二、三、四或五个或至五个蛋白质、结构域或肽的分子嵌合体：
其中所述蛋白质、结构域或肽中的第一个是免疫检查点受体、检查点配体或免疫调节细胞因子中的一种；和
其中所述蛋白质、结构域或肽中的第二个是效应子。
55.一种用于通过自身反应性B细胞的克隆缺失来治疗自身免疫疾病或病症的PantId分子，所述PantId分子包含第一蛋白、结构域或肽，其选自免疫检查点受体、检查点配体、免疫调节细胞因子或本文所述的任何其他同源抗原；并且第二蛋白质、结构域或肽效应子是Fc，例如IgG1或IgG3的铰链、CH2和CH3区域。
56.根据权利要求54所述的PantId分子，其中所述PantId的第一或第二结构域、蛋白质或肽包含在T和B细胞上表达的ITIM受体或其部分的配体。
57.根据权利要求56所述的PantId分子，其中所述ITIM受体的配体是CTL4、PD-1、BTLA、LAG-3、TIM-3、LAIR-1、TIGIT、CD33、CD22、Siglec-4、Siglec-10、FcγRII、CD5、CD66a、PIR-B、ILT-2、或CD72。
58.根据权利要求54所述的PantId分子，其中所述第二蛋白质、结构域或肽是死亡受体或其部分的配体。
59.根据权利要求58所述的PantId分子，其中所述死亡受体是TRAIL1、TRAILR1、TRAILR2或FasL。
60.根据权利要求54所述的PantId分子，其中所述PantId包含亲和纯化表位V5或HA肽。
61.根据权利要求54所述的PantId分子，其中所述PantId包括异二聚化序列。
62.根据权利要求54所述的PantId分子，其中所述PantId结合对B细胞表面标志物特异性的肽或配体。
63.根据权利要求54所述的PantId分子，其中所述PantId与细菌、真菌或病毒毒素缀合。
64.根据权利要求54所述的PantId分子，其中所述PantId与抗代谢物、放射性核素、细胞毒剂、信号转导途径调节剂、溶酶体剂或内体破坏剂缀合。
65.根据权利要求54所述的PantId分子，其中所述PantId是自身抗原-Fc融合蛋白，并且其中所述PantId形成均二聚体或异二聚体，或更高阶的异寡聚体，用于自身反应性B细胞的克隆缺失。
66.根据权利要求65所述的PantId分子，其中异二聚或更高阶的异低聚由异二聚化结构域定向。
67.一种慢病毒或其他表达载体，其编码权利要求54所述的PantId分子。
68.一种高通量鉴定自身抗原以创建用于自身反应性B细胞克隆缺失的PantId的方法。
69.一种表达和纯化所述PantId的方法。
70.自身抗原-Fc PantId在人、宠物和/或家养动物中用于自身反应性B细胞缺失或用于自身抗原-Fc融合蛋白的药代动力学或药效学性质的用途。
71.自身抗原-Fc PantId在具有或不具有血浆置换的动物——包括人和非人灵长类动物——中用于消除内源性循环抗体的用途。
72.根据权利要求68或69中任一项所述的方法，其中所述PantId是自身抗原-Fc。
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IL (1) IL269604A (zh)
WO (1) WO2018175993A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114426584A (zh) * 2022-02-11 2022-05-03 黄凯旋 一种靶向清除特异性b淋巴细胞的融合蛋白及其应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113811549A (zh) 2019-02-21 2021-12-17 Xencor股份有限公司 非靶向和靶向性il-10 fc融合蛋白
CN109651514A (zh) * 2019-02-26 2019-04-19 王仁喜 p28-Fc融合蛋白及其编码核酸分子、重组表达载体、重组细胞和应用
WO2021034727A1 (en) 2019-08-16 2021-02-25 Applied Molecular Transport Inc. Compositions, formulations, and interleukin production and purification
CA3211686A1 (en) * 2021-02-26 2022-09-01 Bayer Aktiengesellschaft Inhibitors of il-11 or il-11ra for use in the treatment of abnormal uterine bleeding

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120121640A1 (en) * 2009-03-13 2012-05-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania OX40/TRAIL Fusion Proteins
US20130209514A1 (en) * 2009-06-09 2013-08-15 Eli Gilboa Aptamer-targeted costimulatory ligand aptamer
US20130217864A1 (en) * 2010-10-20 2013-08-22 Handok Pharmaceuticals Co., Ltd. Human interleukin-1 receptor antagonist - hybrid fc fusion protein
CN103965361A (zh) * 2013-02-06 2014-08-06 上海细胞治疗工程技术研究中心有限公司 一种t细胞信号的嵌合分子转换器及其用途
CN104411818A (zh) * 2012-04-30 2015-03-11 英塞斯股份有限公司 诱导抗原特异性调节性t细胞的方法
CN104479018A (zh) * 2008-12-09 2015-04-01 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途
US20150361155A1 (en) * 2013-01-31 2015-12-17 Thomas Jefferson University Pd-l1 and pd-l2-based fusion proteins and uses thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100453877B1 (ko) * 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
BG65954B1 (bg) * 2005-01-05 2010-07-30 Чавдар ВАСИЛЕВ Средство за селективно подтискане активността на патологични автореактивни в-клетки
PL2542590T5 (pl) * 2010-03-05 2020-08-10 The Johns Hopkins University Kompozycje i sposoby dla ukierunkowanych immunomodulatorowych przeciwciał i białek fuzyjnych
AU2012262491A1 (en) * 2011-06-01 2014-01-16 Jyant Technologies Chemokine-immunoglobulin fusion polypeptides, compositions, method of making and use thereof
US9624310B2 (en) * 2011-11-17 2017-04-18 Gundram Jung Methods of using bi-specific antibodies for treating B-cell-mediated autoimmune diseases or auto-reactive B-cells
CN105722860A (zh) * 2013-09-24 2016-06-29 梅迪塞纳医疗股份有限公司 白介素-2融合蛋白及其应用
JP2017514522A (ja) * 2014-05-02 2017-06-08 エモリー ユニバーシティー ヒト化可変性リンパ球受容体（ｖｌｒ）および組成物ならびにそれに関連する使用
TWI614264B (zh) * 2015-05-20 2018-02-11 免疫功坊股份有限公司 含胜肽核的多臂接合物及其應用
SG10201913573UA (en) * 2015-10-01 2020-03-30 Heat Biologics Inc Compositions and methods for adjoining type i and type ii extracellular domains as heterologous chimeric proteins

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104479018A (zh) * 2008-12-09 2015-04-01 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途
US20120121640A1 (en) * 2009-03-13 2012-05-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania OX40/TRAIL Fusion Proteins
US20130209514A1 (en) * 2009-06-09 2013-08-15 Eli Gilboa Aptamer-targeted costimulatory ligand aptamer
US20130217864A1 (en) * 2010-10-20 2013-08-22 Handok Pharmaceuticals Co., Ltd. Human interleukin-1 receptor antagonist - hybrid fc fusion protein
CN104411818A (zh) * 2012-04-30 2015-03-11 英塞斯股份有限公司 诱导抗原特异性调节性t细胞的方法
US20150361155A1 (en) * 2013-01-31 2015-12-17 Thomas Jefferson University Pd-l1 and pd-l2-based fusion proteins and uses thereof
CN103965361A (zh) * 2013-02-06 2014-08-06 上海细胞治疗工程技术研究中心有限公司 一种t细胞信号的嵌合分子转换器及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABUL AZAD ET AL.: "PD-L1 blockade enhances response of pancreatic ductal adenocarcinoma to radiotherapy", 《EMBO MOL MED.》 *
郭虹敏等: "小鼠PD-L1胞外段基因的原核表达及活性分析", 《细胞与分子免疫学杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114426584A (zh) * 2022-02-11 2022-05-03 黄凯旋 一种靶向清除特异性b淋巴细胞的融合蛋白及其应用

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