CN111374975A

CN111374975A - 去氢骆驼蓬碱的药物用途

Info

Publication number: CN111374975A
Application number: CN201811609823.9A
Authority: CN
Inventors: 熊敬维; 杜建勇; 郑丽霞; 朱小君
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2020-07-07

Abstract

本发明公开了去氢骆驼蓬碱的一种药物用途。所述用途为去氢骆驼蓬碱或其药学上可接受的盐、酯在制备促进心肌细胞增殖药物中的应用。本发明通过实验证明，去氢骆驼蓬碱可以促进大鼠心肌细胞增殖、还可以促进人诱导性多能干细胞诱导的心肌细胞(hiPSC‑derived cardiomyocytes)的增殖。因此，去氢骆驼蓬碱可以用于制备促进心肌细胞增殖药物以及治疗或预防心脏病的药物等相关领域，为治疗或预防心脏病例如心肌梗死提供一种新的药物和治疗思路。

Description

去氢骆驼蓬碱的药物用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种去氢骆驼蓬碱的药物用途。

背景技术

当前心血管疾病已成为威胁人类健康的头号杀手，仅心力衰竭患者全球就有4000万，已经成为人类死亡的主要原因。研究发现哺乳动物成年后心肌细胞逐渐失去增殖能力，一旦发生心梗，心肌细胞的损失将不可逆转。成年人约有20-40亿个心肌细胞，心梗发生后数小时内会造成约25％的心肌细胞损失，剩余的心肌细胞增殖能力非常有限，不足以恢复心脏的收缩功能，患者最终心衰死亡。为解决这一难题，除外科手术外，基础转化研究主要包括寻找心脏干细胞或前体细胞，通过诱导分化移植到心梗区域，然而缺乏足够确凿的分子标记物，移植效率低限制了这一技术的使用；利用重编程技术将成纤维细胞转分化为心肌细胞，或通过促进内源心肌细胞增殖的方式以补充丢失的心肌。已有的研究表明低等的脊椎动物如斑马鱼、蝾螈等心脏具有很强的再生能力，新生乳鼠也具有一定的再生能力，主要通过损伤诱导的心肌细胞增殖来实现，而这种能力在成年之后就消失了。以往人们认为成年心脏不能再生，但是大量证据表明哺乳动物心肌细胞存在缓慢的更新，并且研究发现新生的心肌细胞来源于已有的心肌。因此，越来越多的科学家们对诱导内源性心肌细胞的增殖这一策略感兴趣。因此寻找能够诱导内源性心肌细胞增殖的药物对于人类心血管疾病的治疗具有重大意义。

去氢骆驼蓬碱(Harmine，CAS No.442-51-3)目前主要公开的用途有促进骨生长(US2013315965A1)、促进白色脂肪细胞褐变，抵抗高脂肪饮食引起的脂肪、葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗(CN104224780A)、治疗肥胖及肥胖综合征，如2型糖尿病(WO2010080756A2)，治疗肾病，癌症(WO2010036567A2)以及荔枝霜疫霉菌病(CN105037350A)。但并没有去氢骆驼蓬碱在诱导内源性心肌细胞增殖方面的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种去氢骆驼蓬碱或其药学上可接受的盐、酯的新用途。

所述去氢骆驼蓬碱(Harmine)，CAS No.442-51-3，结构式如式I所示：

本发明所提供的去氢骆驼蓬碱或其药学上可接受的盐、酯的新用途是其在制备促进心肌细胞增殖药物中的应用。

所述心肌细胞可为哺乳动物心肌细胞。所述哺乳动物包括人类。

本发明还保护去氢骆驼蓬碱或其药学上可接受的盐、酯在制备预防和/或治疗心血管疾病药物中的应用。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述心血管疾病为心肌细胞缺失、损伤或死亡导致的心脏病。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述心脏病包括但不限于心肌梗死以及其他心肌细胞缺失、损伤或死亡导致的心肌病等。

以去氢骆驼蓬碱或其药学上可接受的盐、酯为活性成分制备的促进心肌细胞增殖药物或预防和/或治疗心血管疾病药物也属于本发明的保护范围。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

上述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式；上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

本发明通过实验证明，去氢骆驼蓬碱可以促进大鼠心肌细胞增殖、还可以促进人诱导性多能干细胞诱导的心肌细胞(hiPSC-derived cardiomyocytes)增殖。因此，去氢骆驼蓬碱可以用于制备促进心肌细胞增殖药物以及治疗或预防心脏病的药物等相关领域，为治疗或预防心脏病例如心肌梗死提供一种新的药物和治疗思路。

附图说明

图1为小分子去氢骆驼蓬碱对新生大鼠心肌细胞增殖的促进作用图。

图2为小分子去氢骆驼蓬碱对人诱导性多能干细胞诱导的心肌细胞(hiPSC-derived cardiomyocytes)细胞增殖的促进作用图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的Harmine，为Harmine的DMSO溶液。

下述实施例中“FBS”为胎牛血清。

下述实施例中使用的cTnT-mAG-hGeminin(1/110)病毒的构建方法如下：

cTnT心肌特异性启动子(如序列表中序列1所示)和mAG-hGeminin(1/110)(GenBank:NM_015895)通过pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(全式金CU101-01)组装克隆到pShuttle载体(Addgene 16402)上，然后采用限制性内切酶PmeI进行酶切，收集线性化质粒；将线性化质粒和pAdEasy1DNA(Addgene 16400)共转化BJ5183感受态，筛选重组质粒并扩增，然后用重组质粒转染293A细胞(转染前一天将7.5×10⁵个293A细胞在60mm培养皿中铺板，用含5％胎牛血清的DMEM培养液培养，至细胞数量达到1.0-1.5×10⁶，然后利用磷酸钙共沉淀法将重组质粒转染细胞，转染后第二天，去除含共沉淀颗粒的培养液，用PBS缓冲液清洗)，然后将细胞分装入一块6孔板中(每孔加入3ml含5％胎牛血清的DMEM培养液)，静置6小时使其贴壁；6小时后覆盖琼脂糖以供形成病毒空斑(空斑应在10-21天内形成，每4-5天或培养基变黄时追加琼脂糖/DMEM混合物)；得到初始病毒后经过2-3轮扩增，氯化铯密度梯度离心纯化腺病毒。

下述实施例中使用的人诱导性多能干细胞诱导的心肌细胞(hiPSC-derivedcardiomyocytes)按照下述文献的方法制备得到：Cell Res.2017Aug；27(8):1002-1019.doi:10.1038/cr.2017.84.Epub 2017Jun 16。

下述实施例中使用的山羊抗兔IgG(H+L)高度交叉吸附的二级抗体为Invitrogen公司生产的货号为A32731、商品名称为Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa Fluor Plus 488的二抗。

下述实施例中使用的山羊抗鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二级抗体为Lifetechnologies公司生产的货号为A21424、商品名称为Goat anti-Mouse IgG(H+L)HighlyCross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa Fluor 555的二抗。

实施例1、去氢骆驼蓬碱促进大鼠心肌细胞增殖的体外试验

(1)SD大鼠的心肌细胞的培养

分离出生3天SD大鼠的心肌细胞进行培养，DMEM高糖培养基(Hyclone)+5％马血清(GIBCO)，在37度，5％二氧化碳培养箱培养。

(2)实验分组和处理

分离SD大鼠的心肌细胞，加入5％马血清(GIBCO)+DMEM高糖培养基培养液(Hyclone)，加阿糖胞苷(终浓度20umol/L)处理以抑制非心肌细胞的生长，细胞贴壁48h后感染cTnT-mAG-hGeminin(1/110)病毒(病毒感染的MOI值＝100)，再过24小时后换成含0.5％FBS的DMEM培养液，分组加药处理，分组如下：

a、实验组：加Harmine小分子处理(培养基中的终浓度为5μmol/l)24小时。

b、空白对照组：加与a实验组等量DMSO处理。

c、阳性对照组：加FBS至终浓度为10％，加与a实验组等量DMSO处理。

(3)试验方法

上述3个分组分别处理24h后，用hoechst荧光染料染细胞核，然后用高内涵活细胞分析仪(Molecular Device)进行拍照，并分析mAG-hGeminin(1/110)阳性心肌细胞及总细胞数。

(4)结果

试验结果如图1所示。由图1可知，去氢骆驼蓬碱处理后mAG-hGeminin(1/110)阳性心肌细胞相比于空白对照组(0.5％FBS+DMSO)增加了7倍，相比于阳性对照组(10％FBS+DMSO)增加了3.5倍。

实施例2、去氢骆驼蓬碱促进人诱导性多能干细胞诱导的心肌细胞(hiPSC-derived cardiomyocytes)增殖的体外试验

获得hiPSC-derived cardiomyocytes，加Harmine(培养基中的终浓度为5μmol/l)处理48h，以RPMI1640+DMSO作为对照(control)，48h后用PBS洗三次，4％PFA(多聚甲醛)室温固定15min，PBS洗三次，1％BSA/PBS/0.1％Triton室温封闭1h，1h后加一抗:Ctnt(1:200，abcam,ab8295)，Phospho-Histone H3(Ser10)抗体(1:200,CST,9701S)4℃过夜，用1％BSA/PBS/0.02％Tween洗4次，加二抗：山羊抗兔IgG(H+L)高度交叉吸附的二级抗体(1:300,Invitrogen,A32731)，山羊抗鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二级抗体(1:300,Lifetechnologies,A21424)，室温放置1h，用PBS/0.02％Tween洗3次，用DAPI染细胞核，用高内涵活细胞分析仪(Molecular Device)拍照，分析PH3阳性的心肌细胞数及细胞总数。

试验结果如图2所示。由图2可知，去氢骆驼蓬碱处理组PH3阳性人诱导性多能干细胞诱导的心肌细胞(hiPSC-derived cardiomyocytes)比对照组增加了接近3倍。

序列表

<110> 北京大学

<120> 去氢骆驼蓬碱的药物用途

<130> GNCZJ182500

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 836

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus domestiaus)

<400> 1

tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg atcctctaga 60

actatagcta gaattcgccc ttacgggccc cccctcgagg tcgggataaa agcagtctgg 120

gctttcacat gacagcatct ggggctgcgg cagagggtcg ggtccgaagc gctgccttat 180

cagcgtcccc agccctggga ggtgacagct ggctggcttg tgtcagcccc tcgggcactc 240

acgtatctcc gtccgacggg tttaaaatag caaaactctg aggccacaca atagcttggg 300

cttatatggg ctcctgtggg ggaaggggga gcacggaggg ggccggggcc gctgctgcca 360

aaatagcagc tcacaagtgt tgcattcctc tctgggcgcc gggcacattc ctgctggctc 420

tgcccgcccc ggggtgggcg ccggggggac cttaaagcct ctgcccccca aggagccctt 480

cccagacagc cgccggcacc caccgctccg tgggacgatc cccgaagctc tagagcttta 540

ttgcggtagt ttatcacagt taaattgcta acgcagtcag tgcttctgac acaacagtct 600

cgaacttaag ctgcagaagt tggtcgtgag gcactgggca ggtaagtatc aaggttacaa 660

gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcttgtcgag acagagaaga ctcttgcgtt 720

tctgataggc acctattggt cttactgaca tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc 780

actcccagtt caattacagc tcttaaggct agagtactta atacgactca ctatag 836

Claims

1.去氢骆驼蓬碱或其药学上可接受的盐、酯在制备促进心肌细胞增殖的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述心肌细胞为哺乳动物心肌细胞。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述哺乳动物包括人类。

4.去氢骆驼蓬碱或其药学上可接受的盐、酯在制备预防和/或治疗心血管疾病药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述心血管疾病为各种原因导致的心肌细胞缺失或死亡造成的心脏病。