CN111366732B

CN111366732B - 一种游离性间皮素检测试剂盒

Info

Publication number: CN111366732B
Application number: CN201811600850.XA
Authority: CN
Inventors: 金华君; 张亚军; 宋姗姗; 张志伟; 黄晨; 师传胤; 钱其军
Original assignee: Shanghai Cell Therapy Research Institute; Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Cell Therapy Research Institute; Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2024-08-06
Anticipated expiration: 2038-12-26
Also published as: CN111366732A

Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，具体而言，涉及一种游离性间皮素检测试剂盒。一种游离性间皮素检测试剂盒，所述试剂盒包括第一结合分子和第二结合分子，所述试剂盒以“支持物‑第一结合分子‑待检测物‑第二结合分子‑标记物”形式完成检测；所述第一结合分子为靶向间皮素Ⅰ区的单链抗体；所述第二结合分子为靶向间皮素Ⅲ区的单链抗体。本发明提供的游离性间皮素检测试剂盒，选用靶向间皮素Ⅰ区的单链抗体和靶向间皮素Ⅲ区的单链抗体分别作为第一结合分子和第二结合分子，能有效的抓获抗原，实现抗原的有效检测。

Description

一种游离性间皮素检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，具体而言，涉及一种游离性间皮素检测试剂盒。

背景技术

恶性胸膜间皮瘤(Malignant Pleuric Mesothelioma,MPM)是一种高度侵袭性恶性肿瘤，生存率非常低。其特征为潜伏期长，但其侵袭性临床结果显现得十分迅速。因此，要有效地预防恶性间皮瘤，需要进行长时期(如数十年跨度)的、频繁的诊断检测。因而，使用早期高灵敏度和高特异性的诊断标志物是一种被强烈推荐的手段。目前，针对MPM的筛选和早期诊断还没有有效的工具，而其临床监控主要依赖放射性检测。此外，MPM治疗应答的评估一直以来难度都非常大，主要是由于放射性检测的灵敏度不高，而且高度依赖于操作人员的熟练程度。并且在大多数病例中MPM复发的特征均为时间上的进程非常快。

多种MPM生物标志物已经被深入研究。研究者们特别地通过ELISA研究血清、血浆和胸腔积液。肿瘤标志物的价值对于临床医生而言更加切实可用。只有当结合其他临床背景信息一起考虑时，对肿瘤标志物的需求和解释才有作用。对肿瘤标志物表达状态不正确的解释可能会引发一系列不正确的诊断，给患者带来不必要的压力和开支。

间皮素源于分子量大小71kDa的前体蛋白，其在正常间皮细胞中被发现，并且被发现在多种癌症中过表达。该前体蛋白被切割成为两种成熟蛋白：聚合细胞增强因子(Megakaryote Potentiating Factor,MPF)和一种细胞表面糖蛋白(分子量大约40kDa)，即膜表面间皮素，其通过糖基磷脂酰肌醇键与细胞膜表面相连。在卵巢癌、恶性间皮瘤、鳞状细胞癌以及正常的间皮细胞上都发现有膜表面间皮素表达。而MPF则被分泌到血液中。膜表面间皮素也可以被释放到血液中，成为可溶的间皮素(soluble mesothelin)。

早期的研究表明，与良性积液相比，这种可溶的间皮素在恶性间皮瘤病人的胸腔积液和腹腔积液中的表达水平有提升。Canessa et al.确证在72％的上皮间皮瘤病例中存在积液中间皮素表达水平的提升(Canessa PA,Ferro P,Manta C,et al.Clinical valueof mesothelin in pleural effusions versus histology by medical thoracoscopy:brief report.Med Oncol 2013；30:649)。近期的研究将可溶间皮素作为病人诊断的指标之一作了进一步探索，并确证了体内积液中可溶间皮素表达水平的提升对于间皮素瘤具有高度的可预测性，即使当细胞学手段都无法作出诊断时也可以。由于大多数间皮瘤患者都有积液，积液中可溶间皮素蛋白水平的升高能够作为进行进一步侵入性诊断的提示，并提升早期诊断的准确性。MPF又被称为N-间皮素或N-ERC。血液和积液中的可溶间皮素与MPF之间有紧密的相关性。这两种标志物在区分良性与恶性肿瘤上具有相似的效力，并且近期报道了定量检测血液和积液中MPF水平的多种方法，也有报道表明MPF检测具有良好的诊断效力(Sato T,Suzuki Y,Mori T,et al.Newly established ELISA for N-ERC/mesothelinimproves diagnostic accuracy in patients with suspected pleuralmesothelioma.Cancer Med 2014；3:1377–1384.)。

因此，可溶间皮素是恶性肿瘤，特别是恶性间皮瘤早期诊断的重要标志物，对于恶性肿瘤特别是恶性间皮瘤的早期非侵入性检测具有重要意义。因此需要开发更多的人血液和积液中可溶间皮素的检测手段。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种游离性间皮素检测试剂盒，选用特定的第一结合分子和第二结合分子进行检测，检测特异性强，灵敏度高，稳定性好。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种游离性间皮素检测试剂盒，所述试剂盒包括第一结合分子和第二结合分子，所述试剂盒以“支持物-第一结合分子-待检测物-第二结合分子-标记物”形式完成检测；

所述第一结合分子为靶向间皮素Ⅰ区的抗体；所述第二结合分子为靶向间皮素Ⅲ区的抗体。

优选地，所述第一结合分子与所述第二结合分子中的任一种或两种为单链抗体。

在一优选实施方案中，本发明提供的游离性间皮素检测试剂盒，选用含有靶向间皮素Ⅰ区的单链抗体的分子和含有靶向间皮素Ⅲ区的单链抗体的分子分别作为第一结合分子和第二结合分子，能有效的抓获抗原，实现抗原的有效检测。

支持物包括但不限于聚苯乙烯、聚乙烯、纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素、硅化物等材料制备的酶标板、小球、微粒子、玻片、芯片、塑料、薄膜等。

本发明提供的试剂盒以“支持物-第一结合分子-待检测物-第二结合分子-标记物”形式完成检测，主要检测流程如下：

包被：将第一结合分子包被到支持物上，并清洗。

封闭：将支持物上没有包被上第一结合分子的空位点用惰性蛋白封闭，以免后续反应中的非特异性吸附。

第一结合分子捕获抗原：加入待测样品后孵育，第一结合分子捕获样品中的抗原。

抗原捕获第二结合分子：加入第二结合分子后孵育，抗原捕获第二结合分子。

检测：通过一步或几步引入标记物进行检测。

进一步地，所述第一结合分子的序列如SEQ ID NO.1所示；所述第二结合分子的序列如SEQ ID NO.2所示。

如SEQ ID NO.1所示的第一结合分子为mesoCAR1-Fc，其为靶向间皮素I区的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)，从N端到C端依次包含靶向间皮素I区的单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区和信号传导结构域；如SEQ ID NO.2所示的第二结合分子为mesoCAR3-Fc，其为靶向间皮素III区的嵌合抗原受体，从N端到C端依次包含靶向间皮素III区的单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区和信号传导结构域。

进一步地，所述标记物选自荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。

在一些实施方式中，所述放射性同位素包括¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb和⁸³Sr中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。

进一步地，所述标记物后还包括识别信号，所述标记物与所述识别信号通过生物素-亲合素系统显色。

本发明采用生物素亲合素生物素-亲合素系统显色，提高灵敏度。亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者结合的亲和常数比抗原与抗体的亲和常数至少高1万倍以上，因此二者能快速结合，而且反应不受外界干扰。

进一步地，所述标记物为生物素，所述识别信号包括依次亲和素标记的催化酶以及与所述催化酶相适的底物。

进一步地，所述催化酶选自辣根过氧化酶或碱性磷酸酶；

相应地，所述底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺或邻苯二胺。

底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺时，因为显色液的批次不同，所以显色的时间不固定，一般标准是浓度最高的标准品的OD值在2.0左右。

进一步地，所述第一结合分子的摩尔数多于所述第二结合分子的摩尔比。

进一步地，所述第一结合分子的摩尔数与所述第二结合分子的摩尔比为5:1-4，优选为5:2-3。

进一步地，所述试剂盒包括包被有第一结合分子的反应板、生物素标记的第二结合分子、亲和素标记的催化酶以及底物。

本发明试剂盒的优选方案是将链霉亲合素进行辣根过氧化物酶的标记，采用该标记物识别生物素化的第二结合分子，即借助生物素-亲合素放大系统实现更灵敏的检测。

进一步地，所述试剂盒还包括间皮素标准品、样品稀释液、洗涤液和终止液中的任一种或多种。

进一步地，所述洗涤液为PBST。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提出特异性的检测游离性间皮素。

(2)本发明以靶向间皮素Ⅰ区的单链抗体和靶向间皮素Ⅲ区的单链抗体分别作为第一结合分子和第二结合分子，能有效的抓获抗原游离性间皮素，实现游离性间皮素的有效检测。

(3)本发明提供的游离性间皮素检测试剂盒，检测特异性强，灵敏度高，稳定性好。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

游离性间皮素检测试剂盒，包括以下材料：

包被有第一结合分子的反应板、生物素标记的第二结合分子、链霉亲和素-辣根过氧化物酶耦合物(Streptavidin-HRP)、TMB显色液、间皮素标准品、样品稀释液、洗涤液和终止液；

第一结合分子的序列如SEQ ID NO.1所示，第二结合分子的序列如SEQ ID NO.2所示。

1)包被液：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加双蒸水定容1L，调节pH为9.6(灭菌)；

2)终止液：蒸馏水178.3ml，98％浓硫酸21.7ml；

3)10×PBS缓冲液：NaCl 80.0g，KCl 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 35.8g,KH₂PO 2.4g，加双蒸水定容1L，调节pH为6.8(灭菌)；

4)PBST:PBS+0.05％吐温(500ml PBS+250μl吐温)；

5)封闭液：1％BSA(10ml PBST+0.1g的BSA)；

6)样品稀释液：PBS+0.08％吐温+1％BSA；

7)TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)：购自ThermoFisher，货号：002023；

8)Streptavidin-HRP：购自ThermoFisher，货号：S911；

间皮素标准品为表达的meso胞外段全长的蛋白。

包被有第一结合分子的反应板采用以下方法制备：

1)用包被液将抗体稀释至1μg/ml(0.51μl+4ml包被液)，100μl/孔包被酶标反应板，4℃过夜。

2)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。

3)每孔加封闭液300μl，37℃生化培养箱孵育2小时。

4)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。

实施例2

采用实施例1提供的试剂盒制备标准曲线，步骤如下：

1)用封闭液稀释标准品，从140ng/ml开始(实际活性浓度为12.7ng/ml)，向下设置4个梯度及0ng/ml，每孔加入标准品100μl；同时，样品根据实际情况进行稀释，一般第一次检测设置三个浓度，即原液、10倍稀释液和100倍稀释液，每孔加入100μl；37℃生化培养箱孵育2小时。

2)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。

3)用封闭液将biotin标记的mesoCAR3-Fc稀释至终浓度为100ng/ml，100μl/孔，37℃生化培养箱孵育30分钟。

4)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。

5)用商品化PBS将Streptavidin(HRP)按1：40，000的比例稀释，100μl/孔，37℃孵育30分钟。

6)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。

7)加入显色液TMB，100μl/孔，室温避光显色15min。

8)加入终止液50μl/孔，终止反应。

得到的标准曲线有较好的线性关系，符合抗原检测的要求。

根据标准品的检测曲线，计算待检测样品中的游离性间皮素含量。

实施例3

采用实施例1提供的试剂盒检测样品，步骤如下：

1)待检测样品进行稀释，设置5个浓度，以10倍进行稀释，每孔加入100μl；37℃生化培养箱孵育2小时。

2)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。

3)用封闭液将biotin标记的mesoCAR3-Fc稀释，100μl/孔，37℃生化培养箱孵育30分钟。

4)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。

6)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。

7)加入显色液TMB，100μl/孔，室温避光显色15min。

8)加入终止液50μl/孔，终止反应。

检测了5个样本。

阳性对照：5ng/ml的间皮素标准品。

阴性对照：膜表面间皮素

空白对照：水。

表1检测结果

从表1可以看出，本发明提供的试剂盒，特异性强，检测灵敏度佳。

实施例4

按照实施例3的方法选用样本1的10倍稀释液进行重复检测，步骤如下：

1)每孔加入100μl待检测样品，37℃生化培养箱孵育2小时。

2)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。

4)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。

6)用PBST清洗3遍，200μl/孔，每次1分钟，用吸水纸拍干。

7)加入显色液TMB，100μl/孔，室温避光显色15min。

8)加入终止液50μl/孔，终止反应。

待检测样品设置有3个重复，检测结果如表2所示。

表2检测结果

从表2可以看出，本发明提供的试剂盒，检测稳定性好。

对比例1

采用市售人间皮素(MSLN)检测试剂盒进行检测，品牌:BioLegend,Cygnus。经检测，其最高检测的限度为微克级别。并且，它还检测其他形态的间皮素如膜间皮素。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海细胞治疗集团有限公司、上海细胞治疗研究院

<120> 一种游离性间皮素检测试剂盒

<130> 2018

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

130 135 140

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

145 150 155 160

Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

165 170 175

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

180 185 190

Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

210 215 220

Ser Lys His Pro Leu Thr Tyr Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235 240

<210> 2

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Gly Phe Tyr

20 25 30

Phe Tyr Ala Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser

50 55 60

Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Asn Thr Arg Ser Thr Tyr Tyr Leu Asn

100 105 110

Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

130 135 140

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

145 150 155 160

Thr Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr

180 185 190

Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr

210 215 220

Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp Ser Asn Asn Trp His Ala

225 230 235 240

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

245 250

Claims

1.一种游离性间皮素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有第一结合分子的反应板、生物素标记的第二结合分子、亲和素标记的催化酶、底物、间皮素标准品、样品稀释液、洗涤液和终止液；

第一结合分子和第二结合分子，所述试剂盒以“支持物-第一结合分子-待检测物-第二结合分子-标记物”形式完成检测；所述标记物后还包括识别信号，所述标记物与所述识别信号通过生物素-亲合素系统显色；

所述标记物为生物素，所述识别信号包括亲和素标记的催化酶以及与所述催化酶相适的底物；

所述催化酶选自辣根过氧化酶；所述底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺；

所述第一结合分子包含靶向间皮素Ⅰ区的抗体；所述第二结合分子包含靶向间皮素Ⅲ区的抗体；所述第一结合分子和所述第二结合分子中的任一种或两种为单链抗体；

所述第一结合分子的序列如SEQ ID NO.1所示；所述第二结合分子的序列如SEQ IDNO.2所示。

2.根据权利要求1所述的游离性间皮素检测试剂盒，其特征在于，所述第一结合分子的摩尔数多于所述第二结合分子的摩尔数。

3.根据权利要求1所述的游离性间皮素检测试剂盒，其特征在于，所述第一结合分子的摩尔数与所述第二结合分子的摩尔比为5:1-4。

4.根据权利要求1所述的游离性间皮素检测试剂盒，其特征在于，所述第一结合分子的摩尔数与所述第二结合分子的摩尔比为5:2-3。

5.根据权利要求1所述的游离性间皮素检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为PBST。