CN111358777A - 一种提高外周血单个核细胞线粒体功能的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物化学和药学领域，本发明涉及丙戊酸作为制备治疗因外周血单个核细胞线粒体功能降低而引起的恶性肿瘤药物中的用途和方法。恶性肿瘤能够导致外周血单个核细胞线粒体膜电位的下降和ATP含量降低，以及ROS明显增高。本发明通过丙戊酸来提高人外周血单个核细胞的线粒体功能，可以起到对恶性肿瘤的治疗和预防作用。

Description

一种提高外周血单个核细胞线粒体功能的方法和应用

技术领域

本发明涉及生物化学和药学领域，具体而言，本发明涉及丙戊酸作为制备治疗因外周血单个核细胞线粒体功能降低而引起的恶性肿瘤药物中的用途。本发明还涉及制备因外周血单个核细胞线粒体功能降低而引起的恶性肿瘤的药物组合物的方法。

背景技术

丙戊酸及相关物质(丙戊酸，丙戊酸钠，丙戊酸镁，丙戊酸半钠和丙戊酰胺)自1967年以来已获许可治疗癫痫，1995年以来已获许可在欧洲治疗双相情感障碍。这些产品在全球范围内被批准并在120多个国家/地区销售。丙戊酸钠和相关物质已经通过在所有欧盟成员国、挪威和冰岛的国家程序的授权，在一些欧盟成员国(MSS)丙戊酸盐对预防偏头痛也有一定功效。对于丙戊酸反应良好的患者，可考虑躁狂发作后继续治疗。

丙戊酸在制备提高人外周血单个核细胞的线粒体功能的药物，以起到对恶性肿瘤的治疗和预防作用的研究，迄今为止尚无相关的研究报道。

发明内容

本发明的目的通过恶性肿瘤产生的机理的研究，提供通过丙戊酸作为制备治疗因外周血单个核细胞线粒体功能降低而引起的恶性肿瘤药物中的用途。

为了达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供丙戊酸作为制备治疗因外周血单个核细胞线粒体功能降低而引起的疾病的药物中的用途。

在本发明的一个优选例中，所述外周血单个核细胞包括包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞。

在本发明的一个优选例中，所述T淋巴细胞主要介导机体的细胞免疫，所述B淋巴细胞介导体液免疫，所述NK细胞、单核细胞及巨噬细胞介导非特异性免疫。

在本发明的一个优选例中，外周血单个核细胞线粒体来自外周血淋巴细胞分离液。

在本发明的一个优选例中，所述线粒体功能降低为过量的ROS导致的线粒体损伤。

在本发明的一个优选例中，所述线粒体功能降低为所述线粒体膜电位下降和线粒体ATP生成下降。

在本发明的一个优选例中，所述疾病为消化道恶性肿瘤或肺癌；

在本发明的一个优选例中，所述消化道恶性肿瘤为胃癌、肝癌或结直肠癌。

在本发明的一个优选例中，所述丙戊酸用于提高外周血单个核细胞线粒体功能。

在本发明的一个优选例中，所述丙戊酸用于提高外周血单个核细胞线粒体膜电位；

在本发明的一个优选例中，所述丙戊酸用于提高外周血单个核细胞线粒体ATP水平；

在本发明的一个优选例中，所述丙戊酸用于降低外周血单个核细胞线粒体ROS含量。

在本发明的另一方面，提供一种制备因外周血单个核细胞线粒体功能降低而引起的疾病的药物组合物的方法，所述方法包括：将丙戊酸与药学上可接受的载体或赋形剂混合，获得所述的药物组合物。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。

附图说明

图1是本申请实施例公开的不同干预措施小鼠肺恶性肿瘤(肺腺癌)发生情况图；

图2是本申请实施例公开的不同干预措施小鼠的体重变化柱状图；

图3是本申请实施例公开的不同干预措施小鼠的活性氧变化柱状图；

图4是本申请实施例公开的不同干预措施小鼠的膜电位变化柱状图；

图5是本申请实施例公开的不同干预措施小鼠的ATP变化柱状图；

图6是本申请实施例使用的丙戊酸的结构式。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式及附图对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

很早人们就发现机体的免疫系统与健康密切相关，它对侵入机体的外源物质能够进行监视和清除，同时也可以杀灭或清除体内异常表达的自身物质或突变的各种细胞。在免疫与肿瘤的研究领域，人们提出了多种假说，其中“免疫监视”学说最具影响力。“免疫监视”学说是由Burnet等人在上世纪50年代提出的，该学说认为：机体免疫系统能够监视和杀灭体内的“异己”成分或着突变的细胞。当各种因素引起机体免疫功能下降时，导致其识别和清除突变细胞能力下降，会促进癌变细胞的侵袭和转移，引起肿瘤的发生、发展。随着“免疫监视”学说的不断发展，Dumn等在21世纪初提出“肿瘤免疫编辑(tumorimmunoeditting)”。该假说认为大部分的肿瘤细胞能够被免疫系统清除，然而会有少数肿瘤细胞存活下来而达到一种“平衡”状态，一旦平衡被打破，肿瘤细胞将成功“逃逸”免疫系统的监视，从而导致肿瘤细胞的大量增殖，继而形成肿瘤。

免疫系统是由免疫分子、免疫细胞、免疫器官和免疫组织共同组成，其中机体的免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞等。在外周血中，这些细胞统称为外周血单个核细胞(PBMC)。T淋巴细胞主要介导机体的细胞免疫，B淋巴细胞介导体液免疫，NK细胞、单核细胞及巨噬细胞介导非特异性免疫。其中，T细胞介导的细胞免疫是体内主要的抗肿瘤免疫。细胞免疫的效应形式主要有两种：一种是致敏T细胞的直接杀伤作用；另一种是通过淋巴因子相互配合、协同杀伤靶细胞。外周血中的成熟T淋巴细胞代表机体细胞免疫的总体水平。B淋巴细胞产生的抗体能促进效应细胞对肿瘤细胞进行识别和杀伤。NK细胞属非特异性免疫细胞，它不需抗体存在，也无需抗原致敏即可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞。测定肿瘤患者外周血NK细胞活性的高低，对判断疾病的发生、发展及预后转归有重要的意义。CD14⁺单核细胞是PBMC的重要组成部分。目前认为它是单核巨噬细胞的前身，具有明显的变形运动，能吞噬异物产生抗体，通过抗体依赖的细胞毒作用杀伤感染的宿主细胞。单核巨噬细胞可产生多种炎症性细胞因子，参与免疫调控及炎症反应。

近年来对肿瘤患者免疫水平变化的研究结果显示：机体的免疫机制与肿瘤的发生、发展、转移和预后密切相关。已有研究发现，肺癌患者外周血T淋巴细胞亚群均有不同程度改变，晚期患者较显著。在对肝癌的研究中发现，肝癌患者的免疫功能，尤其是细胞免疫功能普遍低于正常人，主要表现为CD3⁺T、CD4⁺T、CD4⁺/CD8⁺水平下降。Wang等分析了57例胃癌患者和27例健康人外周血T淋巴细胞亚群情况。结果发现，胃癌组患者外周血CD3⁺T、CD4⁺T淋巴细胞数量下降而CD8⁺显著升高，细胞CD4⁺/CD8⁺比例明显低于正常对照组，甚至倒置，说明机体免疫反应低下、紊乱或细胞毒作用加强，机体处于免疫抑制状态。NK细胞对肿瘤有直接杀伤作用，被认为是机体抗肿瘤和抗病毒免疫的第一道防线。在针对胃癌患者的研究中发现：NK细胞的活性显著低于正常人，机体免疫监视功能减弱。综上所述，恶性肿瘤患者体内存在免疫细胞活性或功能降低。

线粒体是由德国生物学家Altman于1890年在真核细胞内首次发现的一种细胞器。线粒体的基本功能是合成ATP为细胞供能。线粒体通过产生ATP来确保几乎所有细胞生理过程的需要，因此，线粒体被称为是细胞内供应能量的“动力工厂”，直接决定细胞的功能。线粒体由于缺少防护功能，因此，极易受到各种因素的攻击而导致其功能异常。线粒体功能异常是指由于线粒体内膜受到破坏、呼吸链受到抑制、酶活性降低等引起的能量代谢障碍，进而导致一系列相互作用的损伤过程，最终引起细胞功能降低或凋亡。

免疫细胞的功能直接依赖于细胞内ATP的能量供应，由于线粒体是细胞能量的主要来源，对维护细胞正常生理功能起着重要作用。线粒体功能异常将导致免疫细胞功能的下降。大量的研究表明线粒体功能障碍与氧化应激有关。氧化应激是指当机体受到各种有害刺激时，产生的活性氧物质(ROS)超出了机体抗氧化系统对其的清除能力，而过量的ROS会导致线粒体损伤，使其功能下降。线粒体膜电位下降和线粒体ATP生成下降，是氧化应激导致线粒体损伤的最早表现。大量研究表明，各种致癌因素包括环境因素(紫外线、X射线、重金属、细菌、病毒等)、社会心理因素(心理紧张、精神压力过大、抑郁悲伤等)、生理因素(缺乏体育锻炼、不当饮食)等都可以刺激机体产生过高的ROS产物，将降低机体抗氧化物酶的活性，最终导致血液中的免疫细胞的线粒体功能下降。

前期，我们提出了人外周血单个核细胞的线粒体功能降低与恶性肿瘤的发生密切相关的假说，并加以验证。结果发现，与正常对照人群比较，消化道恶性肿瘤者无论是T细胞、B细胞、NK细胞还是单核细胞，均存在线粒体膜电位的下降和ATP含量降低；与正常对照人群比较，肺癌患者外周血单个核细胞线粒体ROS明显增高，单个核细胞线粒体膜电位显著下降，肺癌患者外周血单个核细胞线粒体产生ATP含量显著减少。

在此，我们提出通过各种物理、化学或生物学方法提高人外周血单个核细胞的线粒体功能，可以起到对恶性肿瘤的治疗和预防作用。

实施例1

本实施例中，通过实验来具体验证人外周血单个核细胞的线粒体功能降低与消化道肿瘤的发生密切相关。其中用到的具体实验有：

1.外周血单个核细胞分离

(1)塑料试管中加入4mL受试者(人或动物)外周血淋巴细胞分离液，将去除血浆后的全血细胞与PBS溶液1：1混匀后，缓慢加入分离液的液面上，注意保持清楚的界面。20℃下，以2000r/min，密度梯度离心20min，离心机加减速度最小；

(2)离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层，分离液层，PBMC层和血浆层；

(3)收集第三层环状乳白色淋巴细胞层移至新的2mL离心管中，加入等体积的PBS溶液，以3000r/min，离心5min；

(4)弃去上清，加入红细胞裂解液2mL充分混匀，常温静置约5min，3000r/min，离心5min；

(5)加入1mL PBS溶液使细胞重悬，3000r/min，离心5min，弃上清，加入1mL PBS即可得PBMC。

3.外周血单个核细胞线粒体膜电位检测

罗丹明123(Rhodamine 123)是一种没有细胞毒性的阳离子荧光探针，能够透过细胞膜进入细胞内，很容易被有活性的线粒体摄取，并在线粒体内聚集而发出绿色荧光。线粒体膜电位(ΔΨΜ)越高，能够吸附聚集的Rh123总量越高，展现出的荧光强度也越强，可用流式细胞仪检测，通过荧光信号的强弱来检测线粒体膜电位的变化。方法如下：

(1)收集细胞PBS漂洗两遍后，调整细胞浓度为1×10⁶/mL；

(2)向各组细胞中加入0.5mL Rh123(用1640培养基稀释至最终浓度为5μg/mL)；同时设置空白对照(未染色的裸细胞)，用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。空白对照组加入0.5mL 1640培养基，混匀，37℃避光温育30min；

(3)PBS洗涤2次，每次3000r/min，5min，100μL PBS重悬，本实验需分选人外周血T细胞(CD3⁺CD19^-)、B细胞(CD3^-CD19⁺)、NK细胞(CD3^-CD56⁺)、单核细胞(CD14⁺)，进行后续线粒体膜电位实验。因此，T、B细胞组加5μL CD3与5μL CD19；NK细胞组加5μL CD3与5μL CD56；单核细胞加5μL CD14。混匀后室温孵育20min，1mL PBS重悬，200目筛网过滤后用流式细胞仪检测；

(4)取10000个细胞荧光强度值的平均值为各组测定值，其平均荧光强(meanfluorescence intensity，MFI)代表细胞线粒体膜电位的大小，Rhl23的激发波长为488nm，发射波长为525nm，Cell Quest软件分析。

4外周血单个核细胞ATP含量检测

萤火虫荧光素酶化荧光素产生荧光时需ATP提供能量。萤火虫荧光素酶和荧光素都过量时，在一定的浓度范围内荧光的产生和ATP的浓度成正比。可高灵敏地检测溶液中ATP浓度。方法如下：

(1)样品测定的准备：离心收集单个核细胞后，PBS洗涤两遍，调整细胞浓度为1×10⁶/mL，每管细胞加入200μL裂解液，样品裂解需在4℃或冰上操作；

(2)制备ATP标准曲线：

a.把ATP检测试剂在冰上溶解，将ATP标准溶液用ATP裂解液按20、10、8、5、2、1μM浓度梯度稀释；

b.按照每个标准品需100μL ATP检测工作液的比例配制适当量的ATP检测工作液(ATP检测试剂：ATP检测试剂稀释液＝1：9)，冰浴暂时保存；

c.加100μL ATP检测工作液到检测管内，室温放置3～5min，以使本底性的ATP全部被消耗掉，从而降低本底；

d.在检测孔或检测管内加上20标准品，迅速用移液器混匀，至少间隔2秒后，立即用荧光和化学发光检测仪测定相对光单位(relative light unit)RLU值；制作标准曲线，其中纵坐标代表RLU值，横坐标代表ATP浓度。

(3)建立蛋白质标准曲线：

a.将5mg/mL标准品牛血清白蛋白用PBS稀释，使其终浓度为1mg/mL；

b.将标准品按照下表加入96孔板标准品孔中，并用稀释液补足至20μL；

表1 96孔板加入标准品试剂剂量

c.将BCA反应试剂A与试剂B按照50：1的比例混合，制成工作液；

d.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μL，每孔加入200μLBCA工作液，震荡混匀，37℃孵育30min；

e.酶标仪读取595nm吸光度(A)值；

f.以吸光度值为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线，计算样品的浓度。

(4)样品ATP浓度检测：

a.裂解细胞(每管细胞加200μL裂解液)后，4℃12,000×g离心5～10min，取上清，用于后续的测定；

b.检测过程同标准品；根据标准曲线计算出样品ATP浓度；为了消除样品制备时由于蛋白量的差异而造成的误差，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品中蛋白浓度；

c.取10μL样品加入到96孔板的样品孔中，加入10μL PBS，然后各孔再加入200μLBCA工作液，37℃静置30min，以生理盐水作为空白对照，测定595nm处吸光光度值，根据前面所得标准曲线计算样品蛋白的浓度。然后把ATP的浓度换算nmol/mg protein的形式。

上述实验中测量膜电位、活性氧和ATP的仪器为BD FACS Calibur。

具体地，我们发现，外周血单个核细胞线粒体降低是恶性肿瘤发生的原因之一。各种恶性肿瘤患者(癌症、肉瘤、白血病等)的外周血单个核细胞线粒体功能(此处只给出线粒体膜电位和ATP含量)与正常对照组相比均明显降低，说明，外周血单个核细胞线粒体降低是恶性肿瘤发生的原因之一。此处，只以消化道常见恶性肿瘤为例，但不仅限于此。

一)针对消化道肿瘤的统计结果如下：

1.恶性肿瘤患者外周血单个核细胞线粒体膜电位明显降低：

(1)恶性肿瘤患者外周血总单个核细胞线粒体功能明显降低

正常对照组外周血总单个核细胞线粒体膜电位为2809.96±311.54，消化道恶性肿瘤组为：1125.88±313.99，显著低于正常对照组(P<0.01)。胃癌、肝癌与结直肠癌组也均显著低于正常对照组(表2)。胃癌、肝癌、结直肠癌患者外周血单个核细胞线粒体膜电位间无统计学差异(P>0.05)，并且不同肿瘤患者外周血单个核细胞线粒体膜电位在不同年龄组、性别间均无统计学差异(P>0.05)。

表2不同组单个核细胞线粒体膜电位

注：*与正常对照比较

(2)恶性肿瘤患者外周血每种单个核细胞线粒体功能明显降低：

与正常对照组比，恶性肿瘤患者的外周血CD3⁺T细胞(T细胞)、B细胞、NK细胞核单核细胞等线粒体膜电位均显著低于正常对照组(P<0.01)。而胃癌、肝癌、结直肠癌患者之间的外周血各种单个核细胞线粒体膜电位无统计学差异(P>0.05)，并且不同年龄、性别间均无统计学差异(P>0.05)。

2.恶性肿瘤患者外周血单个核细胞ATP含量明显降低：

(1)恶性肿瘤患者外周血总单核细胞线粒体ATP含量明显降低：

线粒体的最主要的功能是通过氧化憐酸化生成ATP。结果发现：与正常对照组相比，消化道恶性肿瘤患者外周血单个核细胞ATP水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)(表3)。胃癌、肝癌、结直肠癌患者外周血单个核细胞ATP水平间无统计学差异(P>0.05)，并且不同肿瘤患者外周血单个核细胞ATP水平在不同年龄、性别间均无统计学差异(P>0.05)。

表3正常对照与肿瘤患者单个核细胞ATP含量

注：*与正常对照比较

(2)恶性肿瘤患者外周血每种单个核细胞ATP含量明显降低：

与正常对照组比，恶性肿瘤患者的外周血CD3⁺T细胞(T细胞)、B细胞、NK细胞核单核细胞等ATP含量均显著低于正常对照组(P<0.01)。而胃癌、肝癌、结直肠癌患者之间的外周血各种单个核细胞ATP含量无统计学差异(P>0.05)，并且不同年龄、性别间均无统计学差异(P>0.05)。

实施例2

本实施例中，通过小鼠实验，验证通过提升外周血单个核细胞线粒体来治疗和预防肺癌。

1.溶液配制

1.1苯并芘橄榄油溶液配制

配制3μmol/0.1mL苯并芘橄榄油溶液，将0.76mg苯并芘(BaP)溶于0.1mL橄榄油中，小鼠每20g体重灌胃0.1mL。

1.2西洋参水溶液的配制

配制10g/100mL中药溶液，先称取10g药材放入烧杯中，向其中加入100mL纯水，记号笔标记水位，浸泡30min，之后煮沸30min。

1.3丙戊酸(VPA)溶液配制

配制150mg/kg的VPA溶液，1g VPA溶于33mL的橄榄油中，每20g灌胃0.1mL，即得150mg/kg的VPA溶液。

1.4辅酶Q10橄榄油溶液配制

配制10mg/kg辅酶Q10橄榄油溶液，0.2mg辅酶Q10粉末溶于0.1mL橄榄油中，每20g灌胃0.1mL。

2.清洗灌胃针

灌胃针需要仔细地依次经泡沫水、自来水、超纯水清洗浸泡，确保上次实验残渣清洗干净，之后将其分别转移至10mL离心管中，每管一只，防止交叉污染。

3.实验分组

采用随机数法进行分组，确保各组之间体重无统计学意义，分为油对照组、苯并芘组、西洋参组、VPA组、辅酶Q10组。体重恢复到油对照组水平，相比于苯并芘组有统计学意义。具体实验结果见表4和附图2，通过使用丙戊酸后，体重与油对照组没有变化。由于肿瘤的发生能够降低显著降低体重，通过体重的对比，也从另外一个侧面显示出肿瘤的发生率。

4.灌胃方法

采用上午BaP染毒灌胃进行刺激(除油对照组外，其余组灌BaP)，下午灌胃药物进行治疗(油对照组和苯并芘组灌水，其余组灌药)，每周灌胃5天，连续灌胃8周，之后进行观察，每周进行称重，于灌胃结束后14周处理。

5.动物处理

5.1取血称重

首先是动物称重记录，之后摘眼球取血，本方法取血量多，无需麻醉，防止麻醉剂对血液的影响，操作简单，容易上手；

5.2血液分装

因检测指标多样，需要将血液进行分装，一份血液需要分为三份，分别进行膜电位、活性氧、ATP的检测，每份约150μL血液。

5.3膜电位检测

需要准备小鼠PE-CD3、PE/Cy5-CD19抗体；罗丹明荧光染料母液(5mg/mL,5mg固体粉末溶解于1mL DMSO)；1640培养基；PBS缓冲液；10×红细胞裂解液。

1)首先每个样本血样中分别加入2μL的PE-CD3、PE/Cy5-CD19抗体，室温孵育30min；

2)加入3mL BD的1×红细胞裂解液(需提前配制)，吸管吹打混合均匀，室温静置10min，之后300×g，离心5min，弃上清；

3)加入3mL PBS缓冲液，清洗残留的裂解液，之后300×g，离心5min，弃上清；

4)加入500μL罗丹明工作液(母液：1640＝1：1000)重悬，于37℃恒温培养箱避光孵育30min(每10min摇晃一次)；

5)于300×g，离心5min，弃上清，加入1mL PBS洗涤一次；

6)于300×g，离心5min，加入300μL PBS重悬细胞，转移至流式管中上机检测。

5.4活性氧检测

需要准备MitoSOX荧光染料母液(5mM,每管加入13μL DMSO)；PBS缓冲液；10×红细胞裂解液。

1)加入3mL BD的1×红细胞裂解液(需提前配制)，吸管吹打混合均匀，室温静置10min，之后300×g，离心5min，弃上清；

2)加入3mL PBS缓冲液，清洗残留的裂解液，之后300×g，离心5min，弃上清；

3)加入200μL配制好的MitoSOX染料工作液(母液：PBS＝1：1000)重悬，于37℃恒温培养箱避光孵育30min(每10min摇晃一次)；

4)于300×g，离心5min，弃上清，加入1mL PBS洗涤一次；

5)于300×g，离心5min，加入300μL PBS重悬并转移至流式管中，用流式细胞仪测荧光强度。

5.5单位蛋白ATP含量

需要准备碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒、碧云天ATP检测试剂盒、PBS缓冲液、酶标板(96孔黑、白)、淋巴细胞分离液、红细胞裂解液。

1)用1mL吸管向采血管中加入适量PBS稀释混匀(根据血量多少总体积到离心管的1刻度即可)；

2)将稀释的血液加入到提前准备的装有1mL的淋巴细胞分离液的软管中；

3)离心机500×g，离心20min；

4)1mL吸管吸取白膜细胞层细胞至5mL离心管中，再加入PBS至总体积为5mL；

5)离心机300×g，离心10min；

6)弃上清，加入3mL红细胞裂解液，放置10min；

7)之后离心300×g，离心5min；

8)弃上清，加入2mL PBS洗裂解液，之后300×g，离心5min；

9)弃上清，得到单个核细胞，可4℃保存，也可以之后加入50μL ATP检测裂解液用力吹打重悬，于12000×g，4℃，离心5min,上清备用；

10)按下表取500μM的ATP标准液和ATP检测裂解液配置0、1、2、5、8、10、20μM的ATP标准液；

11)取ATP检测试剂和ATP检测试剂稀释液按1：9配置ATP检测工作液，每孔加入100μL ATP检测工作液，室温放置3min，加入20μL各浓度ATP标准液或样品并混匀；

12)化学发光仪测定RLU值；

13)按下表取1mg/mL的蛋白标准和PBS配置浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1mg/mL的蛋白标准；

孔编号	标准品/μL	PBS/μL	浓度(mg/mL)
				A	0	20	0
B	2	18	0.1
				C	4	16	0.2
D	8	12	0.4
				E	16	4	0.8
F	20	0	1

14)各孔加入20μL上述蛋白标准品或样品，取BCA蛋白检测试剂A和B按50：1配置蛋白检测工作液，各孔加入200μL蛋白检测工作液，37℃恒温孵育20～30min(F孔变为深蓝色)；

15)酶标仪测定A562的吸光度。

本实施例中，测量膜电位、活性氧和ATP采用的仪器为BD FACS Celesta 2。

本实施例中，通过苯并[a]芘诱发受试者(昆明小鼠)肺癌并降低外周血单个核细胞线粒体功能。

采用150只雄性昆明小鼠，染毒苯并[a]芘(BaP)，末次染毒14周后，BaP组小鼠的肿瘤数(0.72±1.01)和肺癌发病率(46.0％)与对照组的肿瘤数(0.26±0.64)和肺癌发病率(12.0％)相比，均明显增加(P＜0.05)。

(图1)。

图1为不同干预措施小鼠肺恶性肿瘤(肺腺癌)发生情况。干预措施包括苯并[a]芘(BaP)染毒，以及BaP染毒同时给予西洋参水提物、或丙戊酸(ATP合成/氧化磷酸化反应过程中的底物)、或辅酶Q10(ATP合成/氧化磷酸化反应过程中的催化酶)。BaP染毒可以显著促进受试物(昆明小鼠)肺部恶性肿瘤的形成，肿瘤发生率明显高于对照组，而给予西洋参水提物、或丙戊酸、或辅酶Q10干预组受试物(昆明小鼠)肺部恶性肿瘤的发生率明显低于BaP染毒组，而与对照组比，没有明显差别。*：与对照组比，p<0.05；#：与BaP组比，p<0.05。说明西洋参水提物、或丙戊酸、或辅酶Q10干预可以有效降低BaP诱导的受试动物肺部恶性肿瘤的发生。

末次染毒14周后，对照组小鼠单个核细胞线粒体ROS荧光值为158.39±47.76，BaP组198.52±58.97，明显高于对照组(P<0.05)；对照组外周血单个核细胞线粒体膜电位值为1195.30±232.80，BaP组为953.95±232.57，显著低于对照组(P<0.01)；对照组外周血单个核细胞ATP含量为16.65±5.73，BaP组为12.27±3.69，显著低于对照组(P<0.01)。

本实施例的一具体实施方式中，通过丙戊酸(VPA)提高外周血单个核细胞线粒体功能并降低癌症发生率。

采用100只雄性昆明小鼠，染毒BaP的同时给予不同量的VPA，末次灌胃14周后，检测小鼠肺癌发生率及外周血单个核细胞线粒体功能。结果发现，BaP组小鼠的肿瘤数和发病率均明显高于对照组(P＜0.05)，而同时给予0.1mL VPA(50mg/kg或以上剂量)组小鼠的肿瘤数和发病率均明显低于BaP组(P＜0.05)，与对照组无明显差别(P>0.05)。(图1)。

如图3-5所示，BaP组小鼠外周血单个核细胞线粒体ROS含量明显高于对照组(P<0.05)，外周血单个核细胞线粒体膜电位显著低于对照组(P<0.01)，外周血单个核细胞ATP含量也显著低于对照组(P<0.01)。VPA干预组小鼠外周血单个核细胞线粒体ROS含量明显低于BaP组(P<0.05)，而与对照组无明显差别(P>0.05)；VPA干预组单个核细胞线粒体膜电位显著高于BaP组(P<0.05)，而与对照组无明显差别(P>0.05)；外周血单个核细胞ATP含量显著高于BaP组(P<0.05)，而与对照组无明显差别(P>0.05)。具体地，膜电位测量数据见表5，活性氧测量数据见表6，单位蛋白ATP测量数据见表7。

表4体重记录表

表5膜电位数据表

表6活性氧数据表

表7单位蛋白ATP数据表

本实施例的一个具体实施方式中，通过西洋参提高外周血单个核细胞线粒体功能并降低癌症发生率。

采用100只雄性昆明小鼠，染毒BaP的同时给予一定量的西洋参水提物(浓度10g/100mL)，末次灌胃14周后，检测小鼠肺癌发生率及外周血单个核细胞线粒体功能。结果发现，BaP组小鼠的肿瘤数和发病率均明显高于对照组(P＜0.05)，而同时给予0.1mL西洋参水提物组或更高剂量组小鼠的肿瘤数和发病率均明显低于BaP组(P＜0.05)，与对照组无明显差别(P>0.05)。(图1)。

如图3-5所示，BaP组小鼠外周血单个核细胞线粒体ROS含量明显高于对照组(P<0.05)，周血单个核细胞线粒体膜电位显著低于对照组(P<0.01)，外周血单个核细胞ATP含量也显著低于对照组(P<0.01)。西洋参干预组小鼠外周血单个核细胞线粒体ROS含量明显低于BaP组(P<0.05)，而与对照组无明显差别(P>0.05)；西洋参组单个核细胞线粒体膜电位显著高于BaP组(P<0.05)，而与对照组无明显差别(P>0.05)；外周血单个核细胞ATP含量显著高于BaP组(P<0.05)，而与对照组无明显差别(P>0.05)。

也就是说，西洋参可以作为制备治疗因外周血单个核细胞线粒体功能降低而引起的疾病的药物。

具体地，所述外周血单个核细胞包括包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞。

其中，所述T淋巴细胞主要介导机体的细胞免疫，所述B淋巴细胞介导体液免疫，所述NK细胞、单核细胞及巨噬细胞介导非特异性免疫。

上述的外周血单个核细胞线粒体来自外周血淋巴细胞分离液。

进一步地，所述线粒体功能降低为过量的ROS导致的线粒体损伤。

进一步地，所述线粒体功能降低为所述线粒体膜电位下降和线粒体ATP生成下降。

进一步地，所述疾病为消化道恶性肿瘤或肺癌。

进一步地，所述消化道恶性肿瘤为胃癌、肝癌或结直肠癌。

所述西洋参用于提高外周血单个核细胞线粒体功能。

所述西洋参用于提高外周血单个核细胞线粒体膜电位；

所述西洋参用于提高外周血单个核细胞线粒体ATP水平；

所述西洋参用于降低外周血单个核细胞线粒体ROS含量。

本实施例的另一具体实施方式中，通过辅酶Q10提高外周血单个核细胞线粒体功能并降低癌症发生率。

采用100只雄性昆明小鼠，染毒BaP的同时给予不同量的辅酶Q10，末次灌胃14周后，检测小鼠肺癌发生率及外周血单个核细胞线粒体功能。结果发现，BaP组小鼠的肿瘤数和发病率均明显高于对照组(P＜0.05)，而同时给予0.1ml辅酶Q10(10mg/kg或以上剂量)组小鼠的肿瘤数和发病率均明显低于BaP组(P＜0.05)，与对照组无明显差别(P>0.05)。

如图3-5所示，BaP组小鼠外周血单个核细胞线粒体ROS含量明显高于对照组(P<0.05)，周血单个核细胞线粒体膜电位显著低于对照组(P<0.01)，外周血单个核细胞ATP含量也显著低于对照组(P<0.01)。辅酶Q10干预组小鼠外周血单个核细胞线粒体ROS含量明显低于BaP组(P<0.05)，而与对照组无明显差别(P>0.05)；辅酶Q10干预组单个核细胞线粒体膜电位显著高于BaP组(P<0.05)，而与对照组无明显差别(P>0.05)；外周血单个核细胞ATP含量显著高于BaP组(P<0.05)，而与对照组无明显差别(P>0.05)。

也就是说，辅酶Q10可以作为制备治疗因外周血单个核细胞线粒体功能降低而引起的疾病的药物。

具体地，所述外周血单个核细胞包括包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞。

其中，所述T淋巴细胞主要介导机体的细胞免疫，所述B淋巴细胞介导体液免疫，所述NK细胞、单核细胞及巨噬细胞介导非特异性免疫。

上述的外周血单个核细胞线粒体来自外周血淋巴细胞分离液。

进一步地，所述线粒体功能降低为过量的ROS导致的线粒体损伤。

进一步地，所述线粒体功能降低为所述线粒体膜电位下降和线粒体ATP生成下降。

进一步地，所述疾病为消化道恶性肿瘤或肺癌。

进一步地，所述消化道恶性肿瘤为胃癌、肝癌或结直肠癌。

所述辅酶Q10用于提高外周血单个核细胞线粒体功能。

所述辅酶Q10用于提高外周血单个核细胞线粒体膜电位；

所述辅酶Q10用于提高外周血单个核细胞线粒体ATP水平；

所述辅酶Q10用于降低外周血单个核细胞线粒体ROS含量。

实施例3

本实施例提供了一种制备因外周血单个核细胞线粒体功能降低而引起的疾病的药物组合物的方法，所述方法包括：将丙戊酸与药学上可接受的载体或赋形剂混合，获得所述的药物组合物。

本实施例中，所述丙戊酸(valproic acid)为无色液体。分子式为C₈H₁₆O₂，分子量为144.21100，沸点219.5℃，相对密度1.1(24.5/4℃)，折光率1.4250(24.5℃)。结构式如图6所示。

丙戊酸及相关物质几乎完全被肝脏代谢。在接受单药治疗的成年患者中，尿液中30％至50％的葡萄糖苷酸结合物出现。线粒体氧化是另一种主要的代谢途径，通常占剂量的40％以上。通常，少于15-20％的剂量通过其他氧化机制消除。少于3％的给药剂量会原样排泄到尿中。所述丙戊酸的选取的浓度(50-150mg/kg)为安全剂量。

作为可以变化的实施方式，可以将西洋参或辅酶Q10与药学上可接受的载体或赋形剂混合，获得所述的药物组合物。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.丙戊酸作为制备治疗因外周血单个核细胞线粒体功能降低而引起的疾病的药物中的用途。

2.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，

所述外周血单个核细胞包括包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞。

3.如权利要求2中所述的用途，其特征在于，

所述T淋巴细胞主要介导机体的细胞免疫，所述B淋巴细胞介导体液免疫，所述NK细胞、单核细胞及巨噬细胞介导非特异性免疫。

4.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，

外周血单个核细胞线粒体来自外周血淋巴细胞分离液。

5.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，

所述线粒体功能降低为过量的ROS导致的线粒体损伤。

6.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，

所述线粒体功能降低为所述线粒体膜电位下降和线粒体ATP生成下降。

7.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，

所述疾病为消化道恶性肿瘤或肺癌；

所述消化道恶性肿瘤为胃癌、肝癌或结直肠癌。

8.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，

所述丙戊酸用于提高外周血单个核细胞线粒体功能。

9.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，

所述丙戊酸用于提高外周血单个核细胞线粒体膜电位；

所述丙戊酸用于提高外周血单个核细胞线粒体ATP水平；

所述丙戊酸用于降低外周血单个核细胞线粒体ROS含量。

10.一种制备因外周血单个核细胞线粒体功能降低而引起的疾病的药物组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：将丙戊酸与药学上可接受的载体或赋形剂混合，获得所述的药物组合物。

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