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CN111346225A - 含有蛋白质的药物制剂 - Google Patents

含有蛋白质的药物制剂 Download PDF

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CN111346225A
CN111346225A CN201811574466.7A CN201811574466A CN111346225A CN 111346225 A CN111346225 A CN 111346225A CN 201811574466 A CN201811574466 A CN 201811574466A CN 111346225 A CN111346225 A CN 111346225A
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CN
China
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protein
antibody
ser
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pharmaceutical formulation
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CN201811574466.7A
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郭怀祖
徐进
曹嘉伟
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Yuehai Baiao Pharmaceutical Shaoxing Co ltd
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Shanghai Biomabs Pharmaceuticals Co Ltd
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Abstract

本发明提供的一种含有蛋白质的药物制剂，所述药物制剂包含有效剂量的抗PD‑1抗体或其抗原结合片段、缓冲液、稳定剂及表面活性剂。

Description

含有蛋白质的药物制剂
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地本发明涉及含有蛋白质的药物制剂，更具体地涉及一种稳定的含有抗PD-1抗体及其抗原结合片段的药物制剂。
背景技术
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1：Programmed Cell Death Protein 1，也称为CD279)是表达于活化的T细胞和前B细胞(pro-B cells)上的一种细胞表面受体，是一种免疫检查点蛋白，对免疫系统有负调控作用，通过抑制T细胞炎性活动促进自身耐受，更具体而言，PD-1通过促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡和降低调节性T细胞的凋亡的双重机制防止自身免疫的发生，但也可以阻止免疫系统杀死癌细胞。
癌细胞的“免疫逃逸”被认为是肿瘤发生、发展和抗药的主要机制。肿瘤可通过直接或间接抑制T细胞的信号来保护自己躲过免疫系统的清除。肿瘤的免疫检查点疗法(immune chenkpoint therapy)是一类通过共抑制或共刺激信号等一系列途径调节T细胞活性来提高抗肿瘤免疫应答的治疗方法。
PD-1可与2种配体结合(B7家族成员PD-L1和PD-L2)。在小鼠上，PD-L1广泛表达于心、肺、胸腺、脾、肾等多种器官上，以及几乎所有的小鼠肿瘤细胞系，并在多种人类肿瘤细胞上高表达；而PD-L2的表达较为局限，主要是树突状细胞和少数肿瘤细胞系。因此， PD-1及其配体PD-L1成为抗肿瘤免疫治疗的靶点。
程序性细胞死亡蛋白-1(programmed death-1，PD-1)及其配体(PD-L1)抑制剂，是免疫检查点疗法的主要药物，其应答之广度、深度、和持久性均十分罕见，是近年来肿瘤免疫疗法研究的热点。目前已上市的纳武单抗(nivolumab)和帕博利珠单抗(pembrolizumab)属于PD-1抑制剂，主要用于黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、微卫星高不稳定性癌等恶性肿瘤的治疗。
PD-1抑制剂(抗PD-1抗体)是一类阻断PD-1的药物，激活免疫系统攻击肿瘤，并用于治疗某些类型的癌症。
不同的抗体药物，要保持其在冻融、储存、运输等过程中的稳定性，需要有不同的溶剂环境，即使相同靶点的抗体药物，由于抗体氨基酸序列以及翻译后修饰的不同，其需要的制剂配方也不相同。
发明内容
本发明提供了一种含有蛋白质的药物制剂，更具体地提供了一种稳定的含有抗PD-1抗体及其抗原结合片段的药物制剂。
本发明提供的一种含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含有效剂量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段、缓冲液、稳定剂及表面活性剂，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段具有SEQ ID NO：1(重链CDR1)、SEQ ID NO：2(重链CDR2)、SEQ ID NO： 3(重链CDR3)的重链可变区和含有SEQ ID NO：4(轻链CDR1)、SEQ ID NO：5(轻链 CDR2)和SEQ IDNO：6(轻链CDR3)的轻链可变区。
如上所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述有效剂量的抗PD-1抗体具有SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列、具有SEQ ID NO：10所示的轻链氨基酸序列。
如上所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂中含有1～20g/L的有效剂量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
如上所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂中含有10g/L的有效剂量的抗PD-1抗体。
如上所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述缓冲液为0～20mM/L的组氨酸缓冲液。
如上所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述缓冲液为20mM/L的组氨酸-盐酸缓冲液。
如上所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述的稳定剂为0～80g/L的海藻糖。
如上所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述的稳定剂为40g/L的海藻糖。
如上所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述的表面活性剂为0～2g/L的聚山梨酯20。
如上所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述的表面活性剂为0.5g/L的聚山梨酯20。
如上所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述的药物制剂pH值为5.8～6.5。
如上所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述的药物制剂pH值为6.0。
如上所述的含有蛋白质的药物制剂，在制备用于改变受试者免疫应答的药物中的应用。
如上所述的含有蛋白质的药物制剂，在制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用。
蛋白质药物制剂的稳定性会因其所包含的蛋白质性质的不同而不同，本发明所述的稳定的含蛋白质的药物制剂也适用于抗PD-1抗体及其抗原结合片段的蛋白质药物制剂。
优选实施例所述的抗PD-1抗体具有SEQ ID NO：8所述重链氨基酸序列、具有SEQID NO：10所述轻链氨基酸序列。优选实施例中所述抗PD-1抗体表达后，其蛋白质的结构与现有抗PD-1抗体的蛋白质结构不同，经优选实施例中所述的制备方法获得的抗PD-1抗体，其Fc端不具有糖基化，与现有的抗PD-1抗体相比较，优选实施例中制备方法所述获得的抗PD-1抗的疏水性较强。因此，本发明优选实施例中所述的抗-PD-1抗体的稳定蛋白质制剂要求不同于现有制剂。
抗体结构中所具有的糖基化，在临床用药过程中，会造成不良反应，会引起超敏反应等副作用。为减少临床用药过程中不必要的副作用，对抗体进行糖基化改造是必然的，为糖基化改造后的具有治疗作用的抗体提供一种稳定的药物制剂更是必要的。本发明的一个优选实施例，提供了一种用于不含糖基化的抗PD-1抗体的稳定的蛋白质药物制剂。
优选实施例所述的抗PD-1抗体具有SEQ ID NO：8所述重链氨基酸序列、具有SEQID NO：10所述轻链氨基酸序列。优选实施例中所述抗PD-1抗体表达后，其蛋白质的结构与现有抗PD-1抗体的蛋白质结构不同，因此，本发明优选实施例中所述的抗-PD-1抗体的稳定蛋白质制剂要求不同于现有制剂。优选实施例中所述抗PD-1抗体的Fc端不具有糖基化，较现有的抗PD-1抗体具有较强的疏水性。
抗体中所具有的糖基化在临床用药过程中，会造成不良反应，引起超敏反应等。因此，对于抗体的糖基化改造的抗体，提供一种稳定的药物制剂是必要的。本发明的优选实施例，提供了一种用于不含糖基化的抗PD-1抗体的稳定的蛋白质制剂。
本发明经过多次、多参数条件筛选，确认可能的制剂处方条件(辅料添加、pH等)，最终获得优选的抗PD-1抗体的制剂配方。在优选实施例中，含具有治疗作用的蛋白质抗PD-1 抗体的药物制剂，优选稳定的制剂组成为含有治疗作用的蛋白抗PD-1抗体10g/L，20mM/L组氨酸-盐酸缓冲液，海藻糖40g/L，聚山梨酯20为0.5g/L，pH值为6.0。
制剂配方筛选依托于多种评估手段，进行全面的评估，使用的评估手段包括：冻融试验、影响因素(光照、高温)等试验，评估使用的检测方法包括：SEC/IEX/CE/LC-MSSubunit/ 粒度分布/DSC分析等，通过综合评估，平衡各指标参数，最终确认配方的组分及条件以及各组分的量，同时为各条件的范围提供依据。
本发明中涉及的缩略语含义：
R-CE-SDS：Reduce Capillary ElectroPhoresis，还原毛细管电泳纯度；NR-CE-SDS： Non-Reduce Capillary ElectroPhoresis，非还原毛细管电泳纯度；NR/R-CE-chip-SDS：Capillary Electrophoresis，非还原/还原毛细管电泳法；SEC-UPLC：Size-ExclusionChromatograPhy，体积排阻液相色谱聚合体；IEX-HPLC/UPLC：Ion ExchangeChromatograPhy，电荷异质体分布；IEX：Ion Exchange Chromatography，离子交换液相色谱法；HIC-HPLC/UPLC：HydroPhobic Interaction-HighPerformance LiquidChromatograPhy/Ultra Performance Liquid ChromatograPhy，疏水作用高效液相色谱/超高效液相色谱；LC-MS Subunit： Liquid Chromatography-Mass Spectrum Subunit，液相-质谱；DSC：Differential Scanning Calorimeter，热分析法；UFT-NC：Ultrafiltration，含目标蛋白的超滤浓缩液；UFT-EB： Ultrafiltration ExchangBuffer，超滤置换缓冲液；TM值：Melting Temperature，熔解温度。
C：Cycle，循环；h：Hour，小时；d：Day，天；m：Month，月；UV：UV Stability Test /UVExposed Sample，紫外试验，总照度不小于200W/hr·cm2；L1：Light Stability Test/Photostability Exposed Sample，光照试验，总照度不小于1.2·106·小时；L2：DarkControl，避光；P1：Upright Position，正置；P2：Horizontal Position，平置；S1：ShakingStress，震荡；S3：Saccharification Test，糖化试验；O2：Oxidation Test，氧化试验；T2：2～8℃；T3： 25℃±2℃，湿度75％±5％；T4：40℃±2℃，湿度75％±5％；T5：-18℃以下至25℃±2℃冻融；T7：-70℃以下至25℃±2℃冻融；T8：室温；T10：50℃±2℃，湿度75％±5％。
附图说明
图1、实施例1制备获得的抗PD-1抗体的轻链质谱图见图1；
图2、实施例1制备获得的抗PD-1抗体的重链质谱图见2；
图3、现有抗PD-1抗体Opdivo的重链质谱图见图3；
图4、现有抗PD-1抗体Keytruda的重链质谱图见图4。
具体实施方式
实施例1：抗PD-1抗体的制备
人工合成重组抗PD-1抗体的核苷酸序列，将其核苷酸序列经过酶切后与质粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)进行连接，构建含有抗PD-1抗体轻链、重链的真核表达载体， SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8分别显示了抗PD-1抗体的重链核苷酸及氨基酸序列；SEQID NO:9和SEQ ID NO:10分别显示了抗PD-1抗体轻链核苷酸及氨基酸序列。于3.5cm组织培养皿中接种3×105CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养至90％-95％融合时进行转染。
将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养：针对无血清培养经过反复比较优化，最终确定了适于抗PD-1抗体的培养基和补充培养基，工程细胞在经优化的培养基中表达量大于30pg/cell.day，利用Fed-batch培养模式，2周培养周期收获的培养上清中，目的抗体的产量可在3g/L以上。进一步分离、纯化，获得抗PD-1抗体，经过该制备方法获得的抗PD-1 抗体与现有抗PD-1抗体相比，其Fc端没有糖基化位点，不含糖基化修饰。
经上述制备方法获得的抗PD-1抗体，进行质谱检测，所述抗PD-1抗体轻链质谱图见图1，抗PD-1抗体重链质谱图见图2。现有抗PD-1抗体Opdivo重链质谱图见图3，Keytruda重链质谱图见图4。
由质谱图分析可知，经过上述制备方法获得的抗PD-1抗体与现有抗PD-1抗体Opdivo、 Keytruda相比，本发明所获得的抗体重链质谱中未检测出有糖基化修饰。本发明提供的抗 PD-1抗体重链质谱图图2中未检测出糖基，Opdivo重链质谱图图3中明显有G0F糖基化修饰，Keytruda重链质谱图图4中同样检测出Keytruda具有G0F糖基化修饰。(见图2、图3、图4)。
实施例2：样品的制备
将由实施例1获得抗PD-1抗体按不同组分、不同比例配置成不同的制剂配方的样品进行制剂稳定性相关实验的检测。
配置海藻糖二水合物母液360g/L，甘露醇母液180g/L，聚山梨酯20母液50g/L。按照表1中的配置方法，对不同的pH、具有治疗作用的蛋白质浓度、海藻糖浓度、甘露醇浓度、聚山梨酯20(PS20)浓度，进行不同制剂配方的样品制备。
取UFT-NC抗PD-1抗体样品50mg、100mg到50ml离心管内，使用20mM/L组氨酸- 盐酸缓冲液溶解，聚山梨酯20：0.025g，甘露醇2g，定容至50ml，使各组分终浓度：治疗作用蛋白质抗PD-1抗体浓度为10mg/ml、20mg/ml，组氨酸缓冲液20mM，聚山梨酯20： 0.5g/L、1g/L、2g/L，甘露醇40g/L。
按照不同的制剂配方组成将样品供分为160份，详细的样品制剂配方组分及其比例见表 1。其中UFT-NC为：含有抗PD-1抗体的超滤浓缩液；UFT-EB为：20mM组氨酸-盐酸缓冲液。
表1、样品处方筛选条件配置表
Figure RE-GDA0001969197430000051
Figure RE-GDA0001969197430000061
Figure RE-GDA0001969197430000071
Figure RE-GDA0001969197430000081
Figure RE-GDA0001969197430000091
Figure RE-GDA0001969197430000101
实施例3：制剂稳定性试验-反复冻融试验
经过实施例2进行样品分组后，对1～160号样品分别进行1次循环、2次循环、3次循环、8次循环的反复冻融试验，反复冻融试验条件为：T5：-18℃至25℃±2℃，反复冻融。
经过反复冻融后，取样品溶液进行样品的稳定性检测，经过反复冻融试验后进行SEC-UPLC检测，检测结果见表2。
表2、冻融试验SEC-UPLC检测结果
Figure RE-GDA0001969197430000111
Figure RE-GDA0001969197430000121
Figure RE-GDA0001969197430000131
Figure RE-GDA0001969197430000141
Figure RE-GDA0001969197430000151
Figure RE-GDA0001969197430000161
根据表2检测结果显示，含有40g/L甘露醇的样品，随着冻融次数增加，其聚合体峰面积显著增加，因此，在抗PD-1抗体的稳定的药物制剂中，需要避免辅料中甘露醇的存在。
除去含有甘露醇试验样品后，其余128个样品继续进行8次循环反复冻融试验，再经过SEC-UPLC检测，其结果显示，去除甘露醇的其余样品均不显著增加蛋白质聚体(结果如表2所示)。
因此，在含有效剂量的抗PD-1抗体的稳定制剂中，不能有甘露醇的存在。
实施例4：制剂稳定性试验-高温、光照试验
经过实施例3筛选后，除去含有甘露醇辅料的样品32组，剩余128组样品。将剩余的128组样品进行高温、光照试验，高温试验条件为T4P1：温度40℃、湿度60％，正置；光照条件为T2L1P2：温度2～8℃、湿度60～75％，光照，平置。
样品经过高温及光照后放置0～10天，并分别于第5天、第10天高温光照后取样，对各样品中聚体、酸性变异体、碱性变异体等参数进行检测，经SEC/CE-chip-SDS/IEX检测，其检测结果见表3(5天)、表4(10)。
表3、样品高温及光照放置5天后，SEC/CE-chip-SDS/IEX检测结果
Figure RE-GDA0001969197430000171
Figure RE-GDA0001969197430000181
Figure RE-GDA0001969197430000191
Figure RE-GDA0001969197430000201
样品经过高温及光照后放置第5天，取样进行SEC/CE-chip-SDS/IEX检测，检测结果见表3。
根据表3检测结果分析可知，样品在高温及光照影响因素条件下放置5天， SEC/CE-chip-SDS/IEX纯度检测及R-CE-chip-SDS检测小分子片段等结果显示，其中48、49、53、54、88、89、93、94这8个样品制剂配方中治疗作用的抗PD-1抗体的纯度、小分子片段及酸性变异体变化与其他样品相比变化较小。
将经过5天高温、光照试验后，筛选出48、49、53、54、88、89、93、94这8个样品继续高温、光照试验，放置至第10天，取样进行对各样品中聚体、酸性变异体、碱性变异体等参数进行检测，经SEC/CE-chip-SDS/IEX检测结果见表4。
表4、样品高温及光照放置10天后，SEC/CE-chip-SDS/IEX检测结果
Figure RE-GDA0001969197430000211
经过高温、光照试验0～10天的检测，经过对试验结果的分析，筛选出含有抗PD-1抗体的药物制剂的较优组合配方为：治疗作用蛋白质抗PD-1抗体浓度10g/L，pH为6.0～6.2，海藻糖40～80g/L、聚山梨酯20为0.5g/L～1g/L。
实施例5：含抗PD-1抗体的药物制剂配方优化
根据上述实施例试验结果，对制剂配方中pH、海藻糖二水合物浓度、聚山梨醇20浓度等条件进行进一步细化调整。
配置海藻糖二水合物母液360g/L，甘露醇母液180g/L，聚山梨酯20母液50g/L。按照表5中的配置方法，对不同的pH、具有治疗作用的蛋白质浓度、海藻糖浓度、甘露醇浓度、聚山梨酯20(PS20)浓度，进行不同制剂配方的样品制备。
样品配置方法见表5。
表5、样品制剂配方优化配置表
Figure RE-GDA0001969197430000221
将含有效剂量的治疗作用蛋白质抗PD-1抗体浓度10g/L的样品进行分组：pH为6.0、 6.1、6.2，海藻糖40g/L、60g/L、80g/L、聚山梨酯20为0.5g/L、1g/L，共计分组18组，编号为161～178。
对样品161～178样品进行0～10天的高温、光照试验，分别于第5天、第10天取样，并对具有治疗作用的蛋白质抗PD-1抗体含量、小分子蛋白含量、聚体含量、酸性变异体、碱性变异体等进行SEC/CE-chip-SDS/IEX检测，其检测结果见表6、表7。
表6为5天、10天的高温试验SEC/CE-chip-SDS/IEX检测结果，表7为5天、10天的光照试验SEC/CE-chip-SDS/IEX检测结果。
表6、高温SEC/CE-chip-SDS/IEX检测结果
Figure RE-GDA0001969197430000222
Figure RE-GDA0001969197430000231
表7、光照SEC/CE-chip-SDS/IEX检测结果
Figure RE-GDA0001969197430000232
Figure RE-GDA0001969197430000241
经过上述试验，对单体峰面积、酸性变异体、碱性变异体、纯度等参数综合分析后，筛选获得较好的161、162、164、165、167这5个条件，并对161、162、164、165、167 这5个样品进行DSC热分析，检测在该种制剂条件下，治疗作用的蛋白质抗PD-1抗体的热稳定性，结果见表8。
表8、DSC热稳定性分析
Figure RE-GDA0001969197430000242
经热稳定性检测分析后，筛选获得161、162、164、165、167这5个条件的样品热稳定性较好。
经过一系列筛选后确定最优制剂配方为：含有治疗作用的蛋白抗PD-1抗体10g/L，20mM/L组氨酸-盐酸缓冲液，海藻糖40g/L，聚山梨酯20为0.5g/L，pH值为6.0。
序列表
<110> 上海张江生物技术有限公司
<120> 含有蛋白质的药物制剂
<130> 201812
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cccggtggaa gtctccggct gagctgcgcc gctagtgggt tcactttttc tacttacggg 180
atgtcttggg tccgacaggc accaggcaag gggctggagt gggtggctac tatttctgga 240
ggaggccgag acacctacta ccccgacacc gtcaagggac gttttactat cagccgtgac 300
aacagcaaga ataccctcta ccttcagatg tcttcactgc gagctgaaga caccgctgtg 360
tactattgtg cccgtcagga ctacggtaac tacgtgtggt tcgcttactg gggacaggga 420
accctggtca ccgtctcctc ggctagcacc aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc 480
tgctccagga gcacctccga gagcacagcc gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 540
cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 600
ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 660
agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc aacgtagatc acaagcccag caacaccaag 720
gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt cccccatgcc caccctgccc agcacctgag 780
ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc 840
tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc 900
cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 960
gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1020
ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag 1080
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagagccac aggtgtacac cctgccccca 1140
tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac 1200
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1260
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac 1320
aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc tcatgctccg tgatgcacga ggctctgcac 1380
aaccactaca cacagaagag cctctccctg tctctgggta aatgagaatt c 1431
<210> 8
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Tyr Gly Asn Tyr Val Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 9
<211> 742
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
aagcttgccg ccaccatgga ttttcaggtg cagattttca gcttcctgct aatcagtgcc 60
tcagtcataa tatccagagg agatattgtt ctgacccagt cccccgcttc actggctgtg 120
agtcctgggc agcgagctac catcagctgc cgggcttcag agtccgtgga tagctacgga 180
atttcattta tgcactggtt ccagcagaag ccaggccaac cacctcagtt gctgatatat 240
tcgacatcta atcggggaag cggtgtgcca gcccggttta gtggtagcgg ctctggtaca 300
gatttctctc ttacaattaa cccagtggag gcggatgaca ctgccaatta cttttgtcag 360
cagagccagg aagtgccttg gacttttggt cagggcacga aggtagagat taaacggact 420
gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 480
gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag 540
gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag 600
gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac 660
aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 720
aacaggggag agtgttgaat tc 742
<210> 10
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Gln
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (16)

1.一种含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含有效剂量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段、缓冲液、稳定剂及表面活性剂， 所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段具有SEQ ID NO：1（重链CDR1）、SEQ ID NO：2（重链CDR2）、SEQ ID NO：3（重链CDR3）的重链可变区和含有SEQ ID NO：4（轻链CDR1）、SEQ ID NO：5（轻链CDR2）和SEQ ID NO：6（轻链CDR3）的轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述有效剂量的抗PD-1抗体具有SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列、具有SEQ ID NO：10所示的轻链氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂中含有1～20g/L的有效剂量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
4.根据权利要求2、3所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂中含有10g/L的有效剂量的抗PD-1抗体。
5.根据权利要求1所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述缓冲液为0～20mM/L的组氨酸缓冲液。
6.根据权利要求5所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述缓冲液为20mM/L的组氨酸-盐酸缓冲液。
7.根据权利要求1所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述的稳定剂为0～80g/L的海藻糖。
8.根据权利要求7所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述的稳定剂为40g/L的海藻糖。
9.根据权利要求1所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述的表面活性剂为为0～2g/L的聚山梨酯20。
10.根据权利要求9所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述的表面活性剂为0.5g/L的聚山梨酯20。
11.根据权利要求1所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述的药物制剂pH值为5.8～6.5。
12.根据权利要求11所述的含有蛋白质的药物制剂，其特征在于，所述的药物制剂pH值为6.0。
13.一种权利要求1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12所述的含有蛋白质的药物制剂在制备用于改变受试者免疫应答的药物中的应用。
14.一种权利要求1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12所述的含有蛋白质的药物制剂在制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用。
15.一种权利要求4所述的含有蛋白质的药物制剂在制备用于改变受试者免疫应答的药物中的应用。
16.一种权利要求4所述的含有蛋白质的药物制剂在制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用。
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