CN111344570A

CN111344570A - 分离和检测癌症干细胞的方法

Info

Publication number: CN111344570A
Application number: CN201880051345.6A
Authority: CN
Inventors: V·卡尔; A·拉克罗伊克斯
Original assignee: Cassidia Biotechnology
Current assignee: Cassidia Biotechnology
Priority date: 2017-06-08
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2020-06-26
Also published as: US20210080463A1; EP3635399A1; EP3635399B1; CA3066507A1; WO2018224761A1; JP2020523612A; EP3635399C0; US12455288B2

Abstract

本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1‑2半乳糖基元的凝集素用于在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外用途。在一个特别的实施方案中，所述至少一种凝集素选自下列凝集素：荆豆(Ulex europaeus)凝集素1(UEA‑1)或其同源物日本栝楼(Trichosanthes japonica)凝集素II(TJA‑II)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)凝集素(ABA)、尾穗苋(Amaranthus caudatus)凝集素(ACA)、榴莲凝素、单叶格里丰木(Griffonia simplicifolia)凝集素I(GSL‑I)和单叶格里丰木凝集素II(GSL‑II)。在一个特别的实施方案中，所述牵涉呼吸的器官选自肺、喉、咽、口、鼻、喉咙、舌、窦、气管和唾液腺，所述唾液腺包括扁桃体和腮腺。

Description

分离和检测癌症干细胞的方法

本发明涉及分离和检测牵涉呼吸的器官的癌症干细胞(Cancer Stem Cell；CSC)的方法。

在法国，肺癌在男性中是由癌症引起的死亡的第一原因和在女性中是第二原因，第一原因是乳腺癌。它每年触及37000人。5年存活率是非常低的，因此在该病理学状况中所介入的早期诊断的概念正是本发明具有其全部意义所在。

与其他类型的癌症一样，肺癌具有多种在所涉及的人群中导致高死亡率的因素，其中尤其是迟的诊断，由此同时带来所谓的转移性的更加晚期的癌症以及高的复发率。这是因为，该比率直接取决于检出该癌症时所处于的阶段。然而，应当知道即使检测阶段是早期，复发率仍然是高的，因为某些参数目前未被考虑到。

这是因为，该复发现象可以部分地用迄今未加考虑的肿瘤进展以及抗性机制(其基于癌症干细胞或肿瘤起始细胞或癌前细胞的存在)来进行解释。肿瘤对于放射治疗性处理和化学治疗性处理的治疗逃逸取决于在肿瘤内部这些细胞的存在。因此，在肿瘤组织中这些细胞的检测是用于确定肿瘤的侵袭性水平的一种手段。因此，对于癌症干细胞来说特异性的生物标志物的表征在肿瘤治疗中具有巨大的诊断和预后利益。但是，当前不存在允许确信地将癌症干细胞与其他肿瘤细胞相区别的对于癌症干细胞(CSC)来说特异性的标志物。

对于分离和表征CSC来说的主要困难在于其群体的有限的大小(肿瘤群体的3-4％)和特异性标志物的缺乏。

因此，存在重大的对于早期诊断癌症干细胞和开发新的用于检测和/或分离癌症干细胞的方法的需求。

癌症干细胞的存在的早期鉴定使得能够为临床医生提供该疾病的预测性因素。

此外，它还将会提供在癌症危险性的诊断中的新前景。这是因为，对于临床医生来说可得的补充信息应当允许通过治疗的适应调整来限制该疾病的复发或恶化的风险。

除了肺之外的牵涉呼吸的器官的癌症在法国是常见的癌症：其是在男性中第4的癌症类型，占癌症的10％。另外，观察到在法国的北部和南部地区之间的巨大的不均等，其中相对于全国平均值而言，在北部发病率高出20％多。还存在死亡率的巨大的社会不平等。

在2012年，除了肺癌之外的牵涉呼吸的器官的癌症的发病率据估计为11320个新病例，其中71％的病例影响男性。

按频率递减的顺序，其为：

·咽癌：47％

·口腔癌，包括舌癌：25％

·喉癌：25％

·唾液腺癌：6％

·面部的窦癌：<1％。

这些是主要触及男性(1名女性:7名男性)和尤其是吸烟者的疾患。

本发明涉及特异性的检测方法，因为它仅识别牵涉呼吸的器官的癌症干细胞并因此比传统方法更有效。此外，它的实施相对于现有的方法而言更快速，因为现有的方法由于其不可再现性而是不可普及的并且同时集中了癌症干细胞和癌症非干细胞。

“牵涉呼吸的器官”是指主动参与呼吸，即主动参与吸气和呼气的器官，和位于所呼吸的空气的通道上的器官。

因此，在本发明的范围内，“牵涉呼吸的器官”为肺、喉、咽、口、鼻、喉咙、舌、窦、气管和唾液腺(扁桃体和腮腺)。

在第一个方面，本发明涉及凝集素作为标记工具用于检测和/或分离牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的用途。

在第二个方面，本发明涉及分离和检测牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的方法，所述方法包括用至少一种凝集素对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记。

在第三个方面，本发明涉及诊断牵涉呼吸的器官的癌症的侵袭性和/或复发风险以确定用于牵涉呼吸的器官的癌症的治疗适应调整的预后值的方法，所述方法包括分离和/或检测牵涉呼吸的器官的癌细胞的步骤。

在第四个方面，本发明涉及试剂盒，其包含用于检测或分离牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的凝集素。

本发明基于由发明人阐明了岩藻糖α1-2半乳糖基元，和更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元在牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的表面上的存在以及其被凝集素识别的可能性，从而使得能够检测和分离这些细胞。

在本发明的范围内，“对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的工具”是指这样的物质，其能够特异性地结合至在牵涉呼吸的器官的癌症干细胞表面上的基元。

根据一个总的方面，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素用于在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外用途。

在一个特别的实施方案中，所述岩藻糖α1-2半乳糖基元更特别地为岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元。

因此，本发明还涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外用途。

在一个特别的实施方案中，根据本发明的凝集素选自下列凝集素：荆豆(Ulexeuropaeus)凝集素1(UEA-1)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)凝集素(ABA)、尾穗苋(Amaranthus caudatus)凝集素(ACA)、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II即单叶格里丰木(Griffonia simplicifolia)凝集素I(GSL-I)和单叶格里丰木凝集素II(GSL-II)以及其同源物。

例如，日本栝楼(Trichosanthes japonica)凝集素II(TJA-II)这种凝集素为凝集素UEA-1的同源物。

因此，本发明还涉及至少一种从下列凝集素中选择的凝集素用于在生物学样品中获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外用途：荆豆凝集素1(UEA-1)或其同源物日本栝楼凝集素II(TJA-II)、双孢蘑菇凝集素(ABA)、尾穗苋凝集素(ACA)、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II即单叶格里丰木凝集素I(GSL-I)和单叶格里丰木凝集素II(GSL-II)。

这些凝集素是专业人员熟知的并且是商购可得的(尤其是通过VectorLaboratories公司)。一些综述列出了其结构(Lectin Structure,Rini JM,Annu RevBiophys Biomol Struct,1995,24:551-77)，而更近期的其他综述描述了其整个历史(Insight of Lectins-A review,Singh等人,International Journal of Scientificand Engineering Research,第3卷,第4期,2012年4月)和在其用途(尤其是在免疫组织化学中)方面的进展(Lectin Histochemistry:Historical Perspectives,State of theArt,and the Future,Brooks SA,Methods Mol Biol,2017,1560:93-107)。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及凝集素UEA-1或其同源物TJA-II用于在生物学样品中获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外用途。

在本发明的范围内，所述生物学样品为在具有牵涉呼吸的器官的癌症或者可能具有牵涉呼吸的器官的癌症的患者上取得的样品。

在本发明的范围内，“牵涉呼吸的器官的癌症”可以为肺癌、喉癌、咽癌、口腔癌、鼻癌、喉咙癌、舌癌、窦癌、气管癌或唾液腺癌(即扁桃体癌和/或腮腺癌)。

在本发明中，术语“肺癌”和“肺部癌症”可以不加区别地进行使用。

该样品可能包含癌症干细胞。

与通常的以病理解剖学进行的分析相反地或作为其补充地，根据本发明的凝集素的用途使得能够最终在早期阶段将所述样品表征为肿瘤前的或肿瘤性的。

术语“肿瘤前的(pre-tumoral)”是指处于肿瘤上游，其具有可能或不会给样品带来肿瘤特征的潜力。

这是因为，病理解剖学通过活组织检查、涂片或即时活组织检查来研究在患病的或死亡的生物体上取得的组织的肉眼可见和显微的损伤。因此，该医学分支致力于所取得的生物学组织和病理学细胞的肉眼可见和显微的异常的形态学研究，而不致力于癌症干细胞的研究和因此不致力于细胞的自我复制特性。

病理解剖学不允许从形态学研究开始来建立样品的早期表征，因为所观察到的异常出现在癌细胞的自我复制特征已经表现出来的阶段。

相反地，本发明直接致力于检测癌症干细胞的存在，这使得能够表征处于比病理解剖学更早的阶段，即甚至在癌症干细胞已可以表现出它们的导致在组织水平上的形态学异常的自我复制特征之前的样品。

根据本发明的方法可以在病理解剖学分析的下游来进行实施。在该情况下，在病理解剖学研究之后将样品表征为肿瘤性的、可能是肿瘤性的或不被怀疑是肿瘤性的。由于根据本发明的方法特别关系到癌症干细胞，因此在该情况下，它使得能够确认以病理解剖学获得的诊断，或者撤销该诊断。

这是因为，在样品以病理解剖学方式不被怀疑是肿瘤性的情况下，本发明可以使得能够通过揭示所述样品的肿瘤性或肿瘤前特征而撤销该诊断，因为它基于不同于病理解剖学的参数(在这种情况下，癌症干细胞的存在和任选地定量)。

根据一个实施方案，本发明涉及至少两种选自UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II的凝集素的混合物的体外用途。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及从下列混合物中选择的两种凝集素的混合物的体外用途：(UEA-1、ABA)、(UEA-1、ACA)、(UEA-1、榴莲凝素)、(UEA-1、GSL-I)、(UEA-1、GSL-II)、(ABA、ACA)、(ABA、榴莲凝素)、(ABA、GSL-I)、(ABA、GSL-II)、(ACA、榴莲凝素)、(ACA、GSL-I)、(ACA、GSL-II)、(榴莲凝素、GSL-I)、(榴莲凝素、GSL-II)、(GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA)、(TJA-II、ACA)、(TJA-II、榴莲凝素)、(TJA-II、GSL-I)、(TJA-II、GSL-II)。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及两种凝集素GSL-I和GSL-II的混合物的体外用途。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及两种凝集素GSL-I和UEA-1或其同源物TJA-II的混合物的体外用途。

根据一个实施方案，本发明涉及至少三种选自UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II的凝集素的混合物，特别地，UEA-1或其同源物TJA-II、榴莲凝素和ABA的混合物，或者UEA-1或其同源物TJA-II、榴莲凝素和ACA的混合物的体外用途。

因此，在一个特别的实施方案中，本发明涉及从下列混合物中选择的三种凝集素的混合物的体外用途：(UEA-1、ABA、ACA)、(UEA-1、ABA、榴莲凝素)、(UEA-1、ABA、GSL-I)、(UEA-1、ABA、GSL-II)、(UEA-1、ACA、榴莲凝素)、(UEA-1、ACA、GSL-I)、(UEA-1、ACA、GSL-II)、(UEA-1、榴莲凝素、GSL-I)、(UEA-1、榴莲凝素、GSL-II)、(UEA-1、GSL-I、GSL-II)、(ABA、ACA、榴莲凝素)、(ABA、ACA、GSL-I)、(ABA、ACA、GSL-II)、(ABA、榴莲凝素、GSL-I)、(ABA、榴莲凝素、GSL-II)、(ABA、GSL-I、GSL-II)、(ACA、榴莲凝素、GSL-I)、(ACA、榴莲凝素、GSL-II)、(ACA、GSL-I、GSL-II)、(榴莲凝素、GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA、ACA)、(TJA-II、ABA、榴莲凝素)、(TJA-II、ABA、GSL-I)、(TJA-II、ABA、GSL-II)、(TJA-II、ACA、榴莲凝素)、(TJA-II、ACA、GSL-I)、(TJA-II、ACA、GSL-II)、(TJA-II、榴莲凝素、GSL-I)、(TJA-II、榴莲凝素、GSL-II)、(TJA-II、GSL-I、GSL-II)。

在一个实施方案中，本发明涉及三种凝集素(UEA-1、榴莲凝素、ABA)的混合物，或者(UEA-1、榴莲凝素、ACA)的混合物的体外用途。

两种或三种凝集素的使用在某些情况下允许更好的对癌症干细胞进行标记的特异性。

在检测和分离CSC中，两种GSL或者UEA-1和GSL-I或者TJA-II和GSL-I的组合是有利的实施方案。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及至少一种从下列凝集素中选择的识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素用于在生物学样品中对肺癌症干细胞进行标记以获得经标记的肺癌症干细胞的体外用途：UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II，

尤其是至少两种选自UEA-1、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II的凝集素，特别是GSL-I和GSL-II的混合物，或者UEA-1和GSL-I的混合物，

尤其是至少三种选自UEA-1、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II的凝集素，特别是UEA-1、榴莲凝素和ABA的混合物，或者UEA-1、榴莲凝素和ACA的混合物。

在本发明的情景下所使用的凝集素可以是经缀合的。

在本发明的范围内，术语“经缀合的”是指凝集素以共价方式连接至另一个分子。

根据一个实施方案，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素用于对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的体外用途，其中所述对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记用与选自荧光团、放射性同位素、酶、金珠粒或生物素的标记物相缀合的凝集素来施行。

根据一个实施方案，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的体外用途，其中所述对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记用与选自荧光团、放射性同位素、酶、金珠粒或生物素的标记物相缀合的凝集素来施行。

根据一个实施方案，所述凝集素选自下列凝集素：UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II。

因此，在一个特别的实施方案中，所述凝集素与荧光团相缀合。

在本发明的范围内，荧光团可以为任何能够用于流式细胞术的荧光团。此类荧光团是商购可得的。它为例如Alexa fluor，特别地Alexa fluor 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700、750或790，异硫氰酸荧光素(FITC)，罗丹明，别藻蓝蛋白(APC)，和藻红蛋白(PE)。

有利地，所述荧光团选自罗丹明、FITC或Alexa fluor，特别地Alexa fluor 488、Alexa fluor 594或Alexa fluor 633。

在本发明的范围内，荧光团的该表征适用于涉及荧光团的本发明的任何实施方案。

在另一个特别的实施方案中，所述凝集素与放射性同位素相缀合。

在本发明的范围内，放射性同位素选自碘125、氚或锝。

在另一个特别的实施方案中，所述凝集素与酶相缀合。

在本发明的范围内，所述酶为催化有色产物形成的酶，即使用生色底物的酶，或者催化发光产物形成的酶，即使用化学发光底物的酶。

在本发明的范围内，“生色底物”意指在由酶进行转化后提供有色产物的底物。

在本发明的范围内，“化学发光底物”意指在由酶进行转化后提供发光产物的底物。

在本发明的一个特别的情况下，所述催化有色产物形成的酶选自辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或β-半乳糖苷酶。

在HRP的特别的情况下，所述生色底物选自3,3’-二氨基联苯胺(DAB)、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)或2,2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)。

在碱性磷酸酶的特别的情况下，所述生色底物为NBT(氮蓝四唑)和BCIP(溴氯吲哚基磷酸盐)。

在本发明的一个特别的情况下，所述催化发光产物形成的酶为HRP并且所述发光底物为鲁米诺。

在另一个特别的实施方案中，所述凝集素与金珠粒相缀合。

在另一个特别的实施方案中，所述凝集素与生物素相缀合。

还由发明人阐明了，牵涉呼吸的器官的癌症干细胞可以通过使用识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素以对所述牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记来进行检测。

在一个特别的实施方案中，所述岩藻糖α1-2半乳糖基元为岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元。因此，牵涉呼吸的器官的癌症干细胞可以通过使用识别岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素以对所述牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记来进行检测。

在本发明的范围内，“检测”是指通过UV/可见光、发光、荧光、放射性、酶学的方法来鉴别在生物学样品内牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的存在这一事件。

因此，本发明还涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元，更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记和随后通过检测所述经缀合的凝集素来检测癌症干细胞的用途。

在一个实施方案中，所述凝集素可以以共价方式与荧光团相缀合。

因此，根据一个实施方案，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元，更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的体外用途，其中所述对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记用与荧光团相缀合的凝集素来施行，并且随后为通过荧光显微术或通过荧光阅读器来检测所述牵涉呼吸的器官的癌症干细胞。

在一个实施方案中，所述凝集素可以与放射性同位素相缀合。

因此，根据一个实施方案，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元，更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的体外用途，其中所述对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记用与放射性同位素相缀合的凝集素来施行，并且随后为通过γ照相机来检测所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞。

在一个实施方案中，所述凝集素可以与使用生色底物或化学发光底物的酶相缀合。

因此，根据一个实施方案，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元，更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的体外用途，其中所述对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记用与辣根过氧化物酶相缀合的凝集素来施行，并且随后为经由添加化学发光底物(例如，鲁米诺)通过发光显微术或通过发光阅读器来检测所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞。

在另一个实施方案中，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元，更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的体外用途，其中所述对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记用与辣根过氧化物酶相缀合的凝集素来施行，并且随后为经由添加选自3,3’-二氨基联苯胺(DAB)、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)或2,2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)的生色底物通过UV/可见光显微术或通过吸光阅读器来检测所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞。

在一个实施方案中，所述凝集素可以与金珠粒相缀合。

因此，根据一个实施方案，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元，更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的体外用途，其中所述对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记用与金珠粒相缀合的凝集素来施行，并且随后为通过电子显微术来检测所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞。

在一个实施方案中，所述凝集素可以与生物素相缀合，以提供经生物素化的凝集素。

因此，根据一个实施方案，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元，更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的体外用途，其中所述对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记用与生物素相缀合的凝集素来施行，并且随后为通过前面所描述的方式之一来检测所述被与生物素相缀合的凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞，其中所述标记物，荧光团、放射性同位素、酶、金珠粒，本身与链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白进行缀合。

当对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记用与生物素相缀合的凝集素来施行并且随后为检测所述被与生物素相缀合的凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞时，所述检测通过下列方式来进行：

о通过荧光显微术，当采用与链霉抗生物素蛋白或与抗生物素蛋白相缀合的荧光团时，

о通过发光阅读器，当采用与链霉抗生物素蛋白或与抗生物素蛋白相缀合的使用化学发光底物的酶时，

о通过γ照相机，当采用与链霉抗生物素蛋白或与抗生物素蛋白相缀合的放射性同位素时，

о通过电子显微术，当采用与链霉抗生物素蛋白或与抗生物素蛋白相缀合的金珠粒时，

о通过UV/可见光显微术，当采用与链霉抗生物素蛋白或与抗生物素蛋白相缀合的使用生色底物的酶时。

还已由发明人阐明了，牵涉呼吸的器官的癌症干细胞可以通过使用识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素以对所述牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记来进行分离。

在一个特别的实施方案中，所述岩藻糖α1-2半乳糖基元为岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元。因此，牵涉呼吸的器官的癌症干细胞可以通过使用识别岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素以对所述牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记来进行分离。

“分离牵涉呼吸的器官的癌症干细胞”是指从生物学样品中提取牵涉呼吸的器官的癌症干细胞，其不含任何其他细胞类型。

因此，本发明还涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元，更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记和随后分离癌症干细胞的用途，所述凝集素是经缀合的。

该分离允许使样品富集牵涉呼吸的器官的癌症干细胞。

术语“富集”是指相对于在样品中所包含的总细胞而言牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的比例由于样品耗损了癌症非干细胞而增加。

那么，用富含牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的样品这个词。

因此，在本发明的情景下，表述“分离牵涉呼吸的器官的癌症干细胞”是指“使样品富集牵涉呼吸的器官的癌症干细胞”。

因此，在本发明的范围内，“分离”也指从生物学样品开始获得富含牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的细胞群体这一事件。在本发明的范围内,术语“经富集的(富含...的)”意指这样的细胞群体，其中癌症干细胞数目/总细胞数目这一比例为至少8，如通过流式细胞术经由Epcam high+细胞/Epcam high-细胞这一比例所测定的。

使样品富集癌症干细胞允许癌症干细胞的更可靠且更容易的检测和定量，这是由于所研究的细胞群体那么会以更大的比例存在于样品中。

因此，已由发明人阐明了，可以通过使用识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素以特别有效的方式来使生物学样品富集癌症干细胞。

在一个特别的实施方案中，所述岩藻糖α1-2半乳糖基元为岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元。因此，已由发明人阐明了，可以通过使用识别岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素以特别有效的方式来使生物学样品富集癌症干细胞。

在一个特别的实施方案中，在分离被至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元，更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素标记的癌症干细胞随后可以为细胞扩增的步骤。因此，在分离细胞后，可以将它们在培养基中进行培养，从而使得能够增加牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的数量。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元，更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的体外用途，其中所述对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记用经缀合的凝集素来施行，并且随后为分离所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞。

在一个特别的实施方案中，所述凝集素与生物素相缀合，并且经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的分离通过用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白进行官能化的支持物来施行。

在该实施方案中，将用与生物素相缀合的凝集素进行标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞通过生物素-链霉抗生物素蛋白或生物素-抗生物素蛋白亲和力固定在用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白进行官能化的支持物上。

所述支持物也可以是由下列制成的：玻璃，聚二甲基硅氧烷(PDMS)，有机硅，或者塑料例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯(PS)或环烯烃共聚物(COC)。

合适的支持物的例子提供在Kim等人的综述(Protein immobilizationtechniques for microfluidics assays,Kim等人,Biomicrofluidics,7,041501,2013)中。

术语“官能化”是指以化学方法对支持物进行修饰以使其被经固定化的链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白覆盖。

前面所引用的Kim等人的综述提供了支持物官能化的实例。

在一个更特别的实施方案中，所述支持物由磁性珠粒构成。

因此，根据本发明的一个特别的实施方案，所述支持物由磁性珠粒构成，并且所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的分离通过在磁铁存在下的磁力分选来施行。

在该实施方案中，将具有与生物素相缀合的凝集素的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞通过生物素-链霉抗生物素蛋白或生物素-抗生物素蛋白亲和力固定在用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白进行官能化的磁性珠粒上。

在磁铁的作用下，在样品内固定在磁性珠粒上的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞被分离。

在该分离随后可以为通过去除上清液，然后通过洗脱与所述支持物相连接的癌症干细胞来回收富含癌症干细胞的样品。

所述洗脱可以在酸性条件下进行以打断链霉抗生物素蛋白-生物素或抗生物素蛋白-生物素键。

在所述支持物由磁性珠粒构成并且链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白通过DNA键连接至磁性珠粒的特殊情况下，所述洗脱通过用DNA酶进行处理来施行。

根据另一个实施方案，用于进行标记的凝集素为与荧光团相缀合的凝集素，并且所述分离通过以流式细胞术的细胞分选来施行。

因此，通过流式细胞术的细胞分选使得能够获得富含牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的样品的级分。

流式细胞术是一种专业人员熟知的技术，其尤其使得能够根据其荧光标记将细胞分选为不同的级分。

因此，在本发明的情景下，通过流式细胞术的细胞分选使得能够获得：

-一方面，包含被与荧光团相缀合的凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的样品的级分，和

-另一方面，包含在起始样品中所包含的其他细胞类型的样品的级分。

本发明还使得能够通过使用至少一种经缀合的凝集素来对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记、分离和然后检测。

在另一个实施方案中，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素用于对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的体外用途，其中在所述用经缀合的凝集素对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记随后为分离所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞，然后通过用与选自荧光团、放射性同位素、酶、金珠粒或生物素的标记物相缀合的凝集素对所述经分离的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行再次标记来检测所述经分离的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的体外用途，其中在所述用经缀合的凝集素对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记随后为分离所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞，然后通过用与选自荧光团、放射性同位素、酶、金珠粒或生物素的标记物相缀合的凝集素对所述经分离的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行再次标记来检测所述经分离的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞。

因此，在另一个实施方案中，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元，更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的体外用途，其中所述对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记用与生物素或与荧光团相缀合的凝集素来施行，并且随后为

-分离所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞，

通过用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白进行官能化的支持物，在与生物素相缀合的凝集素的情况下，如在本发明中所描述的那样，或者

通过流式细胞术，在与荧光团进行缀合的凝集素的情况下，如在本发明中所描述的那样，

以获得经标记和经分离的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞，

-然后用根据本发明的经缀合的凝集素对所述经标记和经分离的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行再次标记，随后为根据在本申请中所描述的检测方式来检测所述细胞。

根据本发明的一个实施方案，从其开始分离或检测癌症干细胞的所述生物学样品为牵涉呼吸的器官的生物学样品。

所述牵涉呼吸的器官的生物学样品可以尤其为在罹患牵涉呼吸的器官的癌症的患者中取得的肿瘤活组织检查物或者在被怀疑具有此类癌症的患者中取得的活组织检查物。

所述牵涉呼吸的器官的生物学样品还可以为牵涉呼吸的器官的癌细胞系，或者通过注射癌细胞系在动物中(例如在小鼠或大鼠中)诱导出的肿瘤。所述细胞系优选地为牵涉呼吸的器官的癌细胞系。根据该实施方案，所诱导出的肿瘤包含牵涉呼吸的器官的癌症干细胞，其有利地与肿瘤的其他细胞相分离以便进行研究。

根据一个实施方案，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素用于在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外用途，其中所述生物学样品由悬浮细胞构成。

在一个特别的实施方案中，本发明还涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外用途，其中所述生物学样品由悬浮细胞构成。

在一个特别的实施方案中，所述至少一种凝集素选自下列凝集素：UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II。

因此，本发明涉及至少一种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素用于在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外用途，其中所述生物学样品由悬浮细胞构成。

根据另一个实施方案，本发明涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素用于在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外用途，其中所述生物学样品由细胞组织构成。

在一个特别的实施方案中，本发明还涉及至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外用途，其中所述生物学样品由细胞组织构成。

因此，本发明涉及至少一种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素用于在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外用途，其中所述生物学样品由细胞组织构成。

根据一个实施方案，本发明涉及至少两种凝集素的上面所描述的体外用途，所述至少两种凝集素处于等摩尔量。

根据一个实施方案，本发明涉及至少两种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素的体外用途，所述至少两种凝集素处于等摩尔量。

根据一个实施方案，本发明涉及两种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素的混合物的体外用途，所述两种凝集素在所述混合物中处于等摩尔量。

“等摩尔量”是指所述两种凝集素中的每一种以相对于另一种而言相同的量进行使用。其为在所述两种凝集素之间1:1的重量比。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及从下列混合物中选择的两种凝集素的混合物的体外用途：(UEA-1、ABA)、(UEA-1、ACA)、(UEA-1、榴莲凝素)、(UEA-1、GSL-I)、(UEA-1、GSL-II)、(ABA、ACA)、(ABA、榴莲凝素)、(ABA、GSL-I)、(ABA、GSL-II)、(ACA、榴莲凝素)、(ACA、GSL-I)、(ACA、GSL-II)、(榴莲凝素、GSL-I)、(榴莲凝素、GSL-II)、(GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA)、(TJA-II、ACA)、(TJA-II、榴莲凝素)、(TJA-II、GSL-I)、(TJA-II、GSL-II)，所述两种凝集素在所述混合物中处于等摩尔量。

根据一个实施方案，本发明涉及两种凝集素的体外用途，所述两种凝集素为混合物(GSL-I、GSL-II)，其中所述凝集素中的每一种处于等摩尔量。

根据一个实施方案，本发明涉及两种凝集素的体外用途，所述两种凝集素为混合物(UEA-1、GSL-I)，其中所述凝集素中的每一种处于等摩尔量。

根据一个实施方案，本发明涉及至少两种凝集素的上面所描述的体外用途，所述至少两种凝集素处于非等摩尔量。

根据一个实施方案，本发明涉及至少两种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素的体外用途，所述至少两种凝集素处于非等摩尔量。

根据一个实施方案，本发明涉及两种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素的混合物的体外用途，所述两种凝集素在所述混合物中处于非等摩尔量。

“非等摩尔量”是指所述凝集素中的每一种以相对于另一种而言不同的量存在。特别地，其为在所述两种凝集素之间2:1、3:1或4:1的重量比。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及从下列混合物中选择的两种凝集素的混合物的体外用途：(UEA-1、ABA)、(ABA、UEA-1)、(UEA-1、ACA)、(ACA、UEA-1)、(UEA-1、榴莲凝素)、(榴莲凝素、UEA-1)、(UEA-1、GSL-I)、(GSL-I、UEA-1)、(UEA-1、GSL-II)、(GSL-II、UEA-1)、(ABA、ACA)、(ACA、ABA)、(ABA、榴莲凝素)、(榴莲凝素、ABA)、(ABA、GSL-I)、(GSL-I、ABA)、(ABA、GSL-II)、(GSL-II、ABA)、(ACA、榴莲凝素)、(榴莲凝素、ABA)、(ACA、GSL-I)、(GSL-I、ACA)、(ACA、GSL-II)、(GSL-II、ACA)、(榴莲凝素、GSL-I)、(GSL-I、榴莲凝素)、(榴莲凝素、GSL-II)、(GSL-II、榴莲凝素)、(GSL-I、GSL-II)、(GSL-II、GSL-I)、(TJA-II、ABA)、(ABA、TJA-II)、(TJA-II、ACA)、(ACA、TJA-II)、(TJA-II、榴莲凝素)、(榴莲凝素、TJA-II)、(TJA-II、GSL-I)、(GSL-I、TJA-II)、(TJA-II、GSL-II)、(GSL-II、TJA-II)，所述两种凝集素在所述混合物中处于非等摩尔量，特别地以2:1、3:1或4:1，更特别地2:1的重量比。

根据一个特别的实施方案，本发明涉及两种凝集素的体外用途，所述两种凝集素为混合物(UEA-1、GSL-I)，其中所述凝集素以2:1的重量比处于非等摩尔量，即2UEA-1:1GSL-I。

根据一个特别的实施方案，本发明涉及两种凝集素的体外用途，所述两种凝集素为混合物(UEA-1、GSL-I)，其中所述凝集素以3:1的重量比处于非等摩尔量，即3UEA-1:1GSL-I。

根据一个特别的实施方案，本发明涉及两种凝集素的体外用途，所述两种凝集素为混合物(UEA-1、GSL-I)，其中所述凝集素以4:1的重量比处于非等摩尔量，即4UEA-1:1GSL-I。

根据一个实施方案，本发明涉及至少三种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素的体外用途，所述至少三种凝集素处于等摩尔量。

根据一个实施方案，本发明涉及三种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素的混合物的体外用途，所述三种凝集素每一种在所述混合物中处于等摩尔量。

“等摩尔量”是指所述三种凝集素中的每一种以相对于其他而言相同的量进行使用。其为在所述三种凝集素之间1:1:1的重量比。

因此，根据一个实施方案，本发明涉及从下列混合物中选择的三种凝集素的混合物的体外用途：(UEA-1、ABA、ACA)、(UEA-1、ABA、榴莲凝素)、(UEA-1、ABA、GSL-I)、(UEA-1、ABA、GSL-II)、(UEA-1、ACA、榴莲凝素)、(UEA-1、ACA、GSL-I)、(UEA-1、ACA、GSL-II)、(UEA-1、榴莲凝素、GSL-I)、(UEA-1、榴莲凝素、GSL-II)、(UEA-1、GSL-I、GSL-II)、(ABA、ACA、榴莲凝素)、(ABA、ACA、GSL-I)、(ABA、ACA、GSL-II)、(ABA、榴莲凝素、GSL-I)、(ABA、榴莲凝素、GSL-II)、(ABA、GSL-I、GSL-II)、(ACA、榴莲凝素、GSL-I)、(ACA、榴莲凝素、GSL-II)、(ACA、GSL-I、GSL-II)、(榴莲凝素、GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA、ACA)、(TJA-II、ABA、榴莲凝素)、(TJA-II、ABA、GSL-I)、(TJA-II、ABA、GSL-II)、(TJA-II、ACA、榴莲凝素)、(TJA-II、ACA、GSL-I)、(TJA-II、ACA、GSL-II)、(TJA-II、榴莲凝素、GSL-I)、(TJA-II、榴莲凝素、GSL-II)、(TJA-II、GSL-I、GSL-II)，所述三种凝集素在所述混合物中处于等摩尔量。

根据一个实施方案，本发明涉及三种凝集素的前面所描述的体外用途，所述三种凝集素选自UEA-1或其同源物TJA-II、榴莲凝素和ABA的混合物，或者UEA-1或其同源物TJA-II、榴莲凝素和ACA的混合物，并且所述三种凝集素每一种在所述混合物中以等摩尔量存在。

根据一个实施方案，本发明涉及至少三种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素的体外用途，所述至少三种凝集素处于非等摩尔量。

根据一个实施方案，本发明涉及三种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素的混合物的体外用途，所述三种凝集素在所述混合物中处于非等摩尔量。

在使用三种凝集素的情况下，“非等摩尔量”是指所述三种凝集素不以相对于彼此而言等摩尔的量进行使用，并且所述三种凝集素中的至少两种凝集素以不同的量进行使用。特别地，其为在所述三种凝集素之间2:1:1的重量比。

因此，根据一个特别的实施方案，本发明涉及从下列混合物中选择的三种凝集素的混合物的体外用途：(UEA-1、ABA、ACA)、(UEA-1、ABA、榴莲凝素)、(UEA-1、ABA、GSL-I)、(UEA-1、ABA、GSL-II)、(UEA-1、ACA、榴莲凝素)、(UEA-1、ACA、GSL-I)、(UEA-1、ACA、GSL-II)、(UEA-1、榴莲凝素、GSL-I)、(UEA-1、榴莲凝素、GSL-II)、(UEA-1、GSL-I、GSL-II)、(ABA、ACA、榴莲凝素)、(ABA、ACA、GSL-I)、(ABA、ACA、GSL-II)、(ABA、榴莲凝素、GSL-I)、(ABA、榴莲凝素、GSL-II)、(ABA、GSL-I、GSL-II)、(ACA、榴莲凝素、GSL-I)、(ACA、榴莲凝素、GSL-II)、(ACA、GSL-I、GSL-II)、(榴莲凝素、GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA、ACA)、(TJA-II、ABA、榴莲凝素)、(TJA-II、ABA、GSL-I)、(TJA-II、ABA、GSL-II)、(TJA-II、ACA、榴莲凝素)、(TJA-II、ACA、GSL-I)、(TJA-II、ACA、GSL-II)、(TJA-II、榴莲凝素、GSL-I)、(TJA-II、榴莲凝素、GSL-II)、(TJA-II、GSL-I、GSL-II)，所述三种凝集素在所述混合物中处于非等摩尔量，特别地以2:1:1、1:2:1或1:1:2的重量比。

本发明还涉及在体外对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的方法，所述方法包括用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的步骤。

在一个特别的实施方案中，本发明还涉及在体外对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的方法，所述方法包括用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的步骤。

因此，本发明还涉及在体外对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记的方法，所述方法包括用至少一种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的步骤。

可以将该标记方法整合到通过使用与选自荧光团、放射性同位素、酶、生物素或金珠粒的标记物相缀合的凝集素来检测牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的方法之内。

本发明还涉及在生物学样品中检测牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外方法，所述方法包括下列步骤：

(a)用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得其中牵涉呼吸的器官的癌症干细胞被至少一种凝集素标记的生物学样品的步骤，所述凝集素与选自荧光团、放射性同位素、酶、金珠粒或生物素的标记物相缀合，

随后为(b)检测所述被至少一种凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的步骤。

在一个特别的实施方案中，所述被本发明的凝集素所识别的岩藻糖α1-2半乳糖基元更特别地为岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元。

因此，在一个特别的实施方案中，本发明涉及上面所描述的体外检测方法，其中所述至少一种凝集素选自下列凝集素：UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II，

尤其是至少两种选自UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II的凝集素，特别是GSL-I和GSL-II的混合物，或者UEA-1和GSL-I的混合物，

尤其是至少三种选自UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II的凝集素，特别是UEA-1、榴莲凝素和ABA的混合物，或者UEA-1、榴莲凝素和ACA的混合物。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及上面所描述的体外检测方法，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于等摩尔量。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及上面所描述的体外检测方法，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于非等摩尔量。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及上面所描述的体外检测方法，其中使用两种凝集素，所述2种凝集素是以2:1、3:1或4:1的重量比的处于非等摩尔量的UEA-1和GSL-I。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及上面所描述的体外检测方法，其中所述生物学样品为牵涉呼吸的器官的生物学样品。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及上面所描述的体外检测方法，其中所述牵涉呼吸的器官选自肺、喉、咽、口、鼻、喉咙、舌、窦、气管和唾液腺(扁桃体和腮腺)。

在一个特别的实施方案中，在生物学样品中检测肺癌症干细胞的体外方法，所述方法包括下列步骤：

(a)用至少一种从UEA-1、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素对肺癌症干细胞进行标记以获得其中肺癌症干细胞被至少一种凝集素标记的生物学样品的步骤，所述凝集素与选自荧光团、放射性同位素、酶、金珠粒或生物素的标记物相缀合，

随后为(b)检测所述被至少一种凝集素标记的肺癌症干细胞的步骤。

在所述方法的一个其中所述凝集素与荧光团相缀合的实施方案中，所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞通过荧光显微术或荧光阅读器来进行检测。

在所述方法的一个其中所述凝集素与放射性同位素相缀合的实施方案中，所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞通过γ照相机来进行检测。

在所述方法的一个其中所述凝集素与催化有色产物形成的酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或β-半乳糖苷酶)相缀合的实施方案中，所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞在添加生色底物后通过UV/可见光显微术或吸光阅读器来进行检测。

在所述方法的一个其中所述凝集素与催化发光产物形成的酶(例如，HRP)相缀合的实施方案中，所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞在添加化学发光底物(例如，鲁米诺)后以发光显微术或通过发光阅读器来进行检测。

在所述方法的一个其中所述凝集素与金珠粒相缀合的实施方案中，所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞通过电子显微术来进行检测。

在所述方法的一个其中所述凝集素与生物素进行缀合的实施方案中，所述牵涉呼吸的器官的癌症干细胞通过上面所描述的检测方式之一来进行检测，其中所述标记物与链霉抗生物素蛋白或与抗生物素蛋白相缀合。

也可以将所述标记方法整合到通过使用与选自荧光团、放射性同位素、酶、生物素或金珠粒的标记物相缀合的凝集素来分离牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的方法之内。

在一个实施方案中，根据本发明的方法使得能够分离牵涉呼吸的器官的癌症干细胞。该分离步骤特别地使得能够研究在牵涉呼吸的器官的肿瘤样品中检测出的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞，以便例如发现能够去除经常是复发和转移的起因的这些癌症干细胞的新治疗法。

“体外分离方法”是指，通过耗损牵涉呼吸的器官的癌症非干细胞(CNSC)来使生物学样品富集牵涉呼吸的器官的癌症干细胞(CSC)。

通过使用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素，将牵涉呼吸的器官的癌症干细胞特异性地与在样品中存在的其他细胞类型(例如任选地，牵涉呼吸的器官的癌症非干细胞(CNSC))分开。

在一个特别的实施方案中，通过使用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素，将牵涉呼吸的器官的癌症干细胞特异性地与在样品中存在的其他细胞类型(例如任选地，牵涉呼吸的器官的癌症非干细胞(CNSC))分开。

在一个特别的实施方案中，通过使用至少一种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素，将牵涉呼吸的器官的癌症干细胞特异性地与在样品中存在的其他细胞类型(例如任选地，牵涉呼吸的器官的癌症非干细胞(CNSC))分开。

该所述的样品富集CSC使得能够获得这样的生物学样品，其中牵涉呼吸的器官的癌症干细胞占多数，即它们以相对于其他细胞类型而言，尤其是相对于CNSC而言更高的数量存在。

因此，本发明还涉及在生物学样品中分离牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外方法，所述方法包括下列步骤：

(a)用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得其中牵涉呼吸的器官的癌症干细胞被至少一种凝集素标记的生物学样品的步骤，所述凝集素与生物素或与荧光团相缀合，

随后为(b)分离所述被至少一种凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的步骤。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及在样品中分离牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外方法，所述方法包括下列步骤：

(a)用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得其中牵涉呼吸的器官的癌症干细胞被至少一种凝集素标记的生物学样品的步骤，所述凝集素与生物素相缀合，

随后为(b)通过用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白进行官能化的支持物来分离所述被至少一种凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的步骤。

所述洗脱可以在酸性条件下进行以打断链霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白-生物素键。

根据一个实施方案，所述支持物由用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白进行官能化的磁性珠粒构成，并且所述分离步骤通过在磁铁存在下的磁力分选来施行。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及在生物学样品中分离牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外方法，所述方法包括下列步骤：

(a)用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得其中牵涉呼吸的器官的癌症干细胞被至少一种凝集素标记的生物学样品的步骤，所述凝集素与荧光团相缀合，

随后为

(b)通过以流式细胞术的细胞分选来分离所述被至少一种凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的步骤。

在一个特别的实施方案中，本发明还涉及上面所描述的体外分离方法，其中所述至少一种凝集素选自下列凝集素：UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II，尤其是至少两种选自UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II的凝集素，特别是GSL-I和GSL-II的混合物，或者UEA-1和GSL-I的混合物，尤其是至少三种选自UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II的凝集素，特别是UEA-1、榴莲凝素和ABA的混合物，或者UEA-1、榴莲凝素和ACA的混合物。

在一个特别的实施方案中，本发明还涉及上面所描述的体外分离方法，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于相等的量或不等的量。

在一个特别的实施方案中，本发明还涉及上面所描述的体外分离方法，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于非等摩尔量。

在一个特别的实施方案中，本发明还涉及上面所描述的体外分离方法，其中使用两种凝集素，所述2种凝集素是以2:1、3:1或4:1的重量比的处于非等摩尔量的UEA-1和GSL-I。

在一个特别的实施方案中，本发明还涉及上面所描述的体外分离方法，其中所述生物学样品为牵涉呼吸的器官的生物学样品。

在一个特别的实施方案中，本发明还涉及上面所描述的体外分离方法，其中所述牵涉呼吸的器官选自肺、喉、咽、口、鼻、喉咙、舌、窦、气管和唾液腺(扁桃体和腮腺)。

在一个特别的实施方案中，在生物学样品中分离肺癌症干细胞的体外方法，所述方法包括下列步骤：

(a)用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素(UEA-1、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素)对肺癌症干细胞进行标记以获得其中肺癌症干细胞被至少一种凝集素标记的生物学样品的步骤，所述凝集素与生物素或与荧光团相缀合，

随后为

(b)分离所述被至少一种凝集素标记的肺癌症干细胞的步骤，

当将所述凝集素与生物素相缀合时，所述分离步骤通过由磁性珠粒构成的用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白进行官能化的支持物并且在磁铁存在下来施行，

和当将所述凝集素与荧光团相缀合时，所述分离步骤通过以流式细胞术的细胞分选来施行。

因此，所述以流式细胞术的细胞分选使得能够获得富含癌症干细胞的样品的级分。

在步骤(a)中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记之前，有利地，使样品的细胞相互解离。该细胞解离可以按照常规程序来施行，例如通过使用一种或几种能够使细胞相互分开而不改变在细胞表面上所表达的聚糖，特别地岩藻糖α1-2半乳糖基元，更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的酶。所述细胞解离可以例如用由RocheDiagnostic公司销售的混合物

来实施。

因此，本发明还涉及根据本发明的方法，其在标记步骤之前包括使样品的细胞相互解离的预先步骤。

当今，为了研究和诊断目的而对癌症干细胞进行研究是必要的，特别地为了揭示出能够针针对这些细胞起作用的新物质。对这些细胞的研究在个体化医学的情景下也是特别有用的。

牵涉呼吸的器官的癌症干细胞是一群特殊的细胞，它们由于其对于化学疗法治疗的抵抗性而导致肿瘤重新形成和肿瘤复发。因此，本发明通过检测或分离牵涉呼吸的器官的癌症干细胞而使得能够评价牵涉呼吸的器官的癌症的复发风险。

检测牵涉呼吸的器官的癌症干细胞(其随后任选地为其定量)使得能够评价肿瘤的进展风险。

因此，本发明还涉及识别岩藻糖α1-2半乳糖基元，更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素用于在体外诊断牵涉呼吸的器官的癌症的复发风险和/或侵袭性以确定用于牵涉呼吸的器官的癌症的治疗适应调整的预后值的用途。

因此，本发明还涉及在体外诊断牵涉呼吸的器官的癌症的复发风险和/或牵涉呼吸的器官的癌症的侵袭性以确定用于牵涉呼吸的器官的癌症的治疗适应调整的预后值的方法，所述方法包括用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素对牵涉呼吸的器官的生物学样品的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以在所述样品中获得被至少一种凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的步骤。

在一个特别的实施方案中，本发明还涉及在体外诊断牵涉呼吸的器官的癌症的复发风险和/或牵涉呼吸的器官的癌症的侵袭性以确定用于牵涉呼吸的器官的癌症的治疗适应调整的预后值的方法，所述方法包括用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素对牵涉呼吸的器官的生物学样品的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以在所述样品中获得被至少一种凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的步骤。

因此，本发明还涉及在体外诊断牵涉呼吸的器官的癌症的复发风险和/或牵涉呼吸的器官的癌症的侵袭性以确定用于牵涉呼吸的器官的癌症的治疗适应调整的预后值的方法，所述方法包括用至少一种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素对牵涉呼吸的器官的生物学样品的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以在所述样品中获得被至少一种凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的步骤。

根据一个特别的实施方案，根据本发明的诊断方法包括下列步骤：

(a)用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以在所述生物学样品中获得被至少一种凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞，所述凝集素与选自荧光团、放射性同位素、酶、金珠粒或生物素的标记物相缀合；

(b)通过下列方式来检测所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞：

-荧光显微术或荧光阅读器，当所述凝集素与荧光团相缀合时，或者当所述凝集素与生物素相缀合并且通过与链霉抗生物素蛋白或与抗生物素蛋白相缀合的荧光团来进行检测时；

-发光显微术或发光阅读器，当所述凝集素与使用化学发光底物的酶相缀合时，或者当所述凝集素与生物素相缀合并且通过与链霉抗生物素蛋白或与抗生物素蛋白相缀合的使用化学发光底物的酶来进行检测时；

-γ照相机，当所述凝集素与放射性同位素相缀合时，或者当所述凝集素与生物素相缀合并且通过与链霉抗生物素蛋白或与抗生物素蛋白相缀合的放射性同位素来进行检测时；

-UV/可见光显微术或吸光阅读器，当所述凝集素与使用生色底物的酶相缀合时，或者当所述凝集素与生物素相缀合并且通过与链霉抗生物素蛋白或与抗生物素蛋白相缀合的使用生色底物的酶来进行检测时；

-电子显微术，当所述凝集素与金珠粒相缀合，或者当所述凝集素与生物素相缀合并且通过与链霉抗生物素蛋白或与抗生物素蛋白相缀合的金珠粒来进行检测时；

(c)任选地，定量牵涉呼吸的器官的癌症干细胞；

(d)将在所述生物学样品中的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的检测强度与在邻近所述生物学样品的健康样品中的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的检测强度进行比较，

和任选地，将在所述生物学样品中的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的定量与在邻近所述生物学样品的健康样品中的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的定量进行比较；

(e)从牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的存在和任选地数量开始来推断牵涉呼吸的器官的癌症的复发风险和/或牵涉呼吸的器官的癌症的侵袭性以确定用于牵涉呼吸的器官的癌症的治疗适应调整的预后值。

在一个特别的实施方案中，所述被凝集素所识别的岩藻糖α1-2半乳糖基元更特别地为岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元。

根据一个特别的实施方案中，根据本发明的诊断方法包括下列步骤：

(a)用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以在所述生物学样品中获得被至少一种凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞，所述凝集素与选自荧光团或生物素的标记物相缀合；

(b)分离被至少一种经缀合的凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞：

-当用与生物素相缀合的凝集素进行标记时，所述分离通过用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白进行官能化的支持物来进行，特别地所述经官能化的支持物由用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白进行官能化的磁性珠粒构成并且所述分离通过在磁铁存在下的磁力细胞分选来进行，或者

-当用与荧光团相缀合的凝集素进行标记时，所述分离通过以流式细胞术的细胞分选来进行；

(c)用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素对经分离的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行再次标记以获得经分离和通过该再次标记而经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞，所述凝集素与选自荧光团、放射性同位素、酶、金珠粒或生物素的标记物相缀合；

(d)通过下列方式来检测所述经分离和通过该再次标记而经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞：

(e)任选地，定量牵涉呼吸的器官的癌症干细胞；

(f)将在所述生物学样品中的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的检测强度与在邻近所述生物学样品的健康样品中的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的检测强度进行比较，

(g)从牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的存在和任选地数量开始来推断牵涉呼吸的器官的癌症的复发风险和/或牵涉呼吸的器官的癌症的侵袭性以确定用于牵涉呼吸的器官的癌症的治疗适应调整的预后值。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及上面所描述的诊断方法，其中所述至少一种凝集素选自下列凝集素：UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II，

在一个特别的实施方案中，本发明涉及上面所描述的诊断方法，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于相等的量或不等的量。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及上面所描述的诊断方法，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于非等摩尔量。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及上面所描述的诊断方法，其中使用两种凝集素，所述2种凝集素是以2:1、3:1或4:1的重量比的处于非等摩尔量的UEA-1和GSL-I。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及上面所描述的诊断方法，其中所述生物学样品为牵涉呼吸的器官的生物学样品。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及上面所描述的诊断方法，其中所述牵涉呼吸的器官选自肺、喉、咽、口、鼻、喉咙、舌、窦、气管和唾液腺(扁桃体和腮腺)。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及上面所描述的诊断方法，其中所述癌症选自肺癌、喉癌、咽癌、口腔癌、鼻癌、喉咙癌、舌癌、窦癌、气管癌和唾液腺癌(即扁桃体癌和/或腮腺癌)。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及在体外诊断肺部癌症的复发风险和/或肺部癌症的侵袭性以确定用于肺部癌症的治疗适应调整的预后值的方法，所述方法包括用至少一种从UEA-1、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素对肺生物学样品的肺癌症干细胞进行标记以在所述样品中获得被至少一种凝集素标记的肺癌症干细胞的步骤。

术语“肺部癌症”是指肺癌。

将牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的检测强度和任选地其定量结果相对于邻近所述生物学样品的健康样品而言进行比较。

将邻近所述生物学样品的健康样品用作对照。

“邻近所述生物学样品的健康样品”是指这样的样品，其是在与所述生物学样品相同的个体上取得的，但是在与所述生物学样品所取得自的组织相邻的组织中，并且在病理解剖学分析中不具有肿瘤细胞且通过根据本发明的方法不具有癌症干细胞。

因此，所述健康样品为以在通过病理解剖学进行的分析中不存在肿瘤细胞和通过根据本发明的方法不存在癌症干细胞为特征的样品。

牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的定量使得能够测定牵涉呼吸的器官的癌症的侵袭性。该定量可以通过各种不同的方法来建立，例如：流式细胞术，Western印迹，使用遗传标志物例如Oct-4、cMyc1、Gli-1或EpCam的定量PCR，或者克隆发生测试。

还可以平行地使用这些方法中的几种以便形成一系列的CSC存在并因此增加定量的可靠性。

在一个特别的实施方案中，牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的定量通过克隆发生测试来施行。

克隆发生测试在于培养生物学样品以观察细胞重新形成肿瘤球的能力。该自我更新和自我复制的特性对于癌症干细胞来说是固有的，因此唯一的癌症干细胞是所形成的肿瘤球的起因。因此，所形成的肿瘤球的记录使得能够定量在所述样品中的癌症干细胞。

这些方法(有利地，使用遗传标志物例如Oct-4、c-Myc、Gli-1或EpCam的qPCR，和克隆发生测试)还使得能够检测癌症干细胞，以便在分离癌症干细胞的步骤后测定这些细胞的存在或不存在。

因此，这些方法作为上述步骤(c)和(d)(分别相应于重新标记和检测经分离的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞)的备选方案来呈现。

该检测通过使样品富集癌症干细胞而得到促进和变得更可靠。

通过这些方法进行检测还使得能够验证通过根据本发明的方法来使样品富集牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的效能，即所述方法分离牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的效能。

在本发明的诊断方法中，在所述生物学样品中的检测强度相对于邻近所述生物学样品的健康样品而言越高，牵涉呼吸的器官的癌症的复发风险就越大并且癌症就越具有侵袭性。

以同样的方式，在所述生物学样品中的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的数量相对于邻近所述生物学样品的健康样品而言越高，牵涉呼吸的器官的癌症的复发风险就越大并且癌症就越具有侵袭性。

因此，在生物学样品中牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的检测和定量使得能够测定牵涉呼吸的器官的癌症的侵袭性和其发展的能力。

牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的检测和定量也属于个体化医学的措施。这是因为，使得能够评价治疗的预后值的在所述生物学样品中牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的检测因此使得能够对该治疗进行适应调整。

本发明还涉及用于在体外在生物学样品中检测牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素，所述凝集素与选自荧光团、放射性同位素、酶、金珠粒或生物素的标记物相缀合。

本发明还涉及用于在体外在生物学样品中分离牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素，所述凝集素与生物素相缀合，和用链霉抗生物素蛋白进行官能化的磁性珠粒。

本发明还涉及用于在体外在生物学样品中分离牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素，所述凝集素与荧光团相缀合。

本发明还涉及用于在体外诊断牵涉呼吸的器官的癌症的复发风险和/或牵涉呼吸的器官的癌症的侵袭性以确定用于牵涉呼吸的器官的癌症的治疗适应调整的预后值的试剂盒，所述试剂盒包含：

-至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素，所述凝集素与生物素相缀合，和用链霉抗生物素蛋白进行官能化的磁性珠粒，

-和任选地，至少一种与荧光团、放射性同位素、酶或金珠粒相缀合的凝集素。

-至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素，所述凝集素与荧光团相缀合，

-和任选地，至少一种与生物素、放射性同位素、酶或金珠粒相缀合的凝集素。

因此，在一个特别的实施方案中，本发明涉及上面所描述的诊断试剂盒，其中所述至少一种凝集素选自下列凝集素：UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II，尤其是至少两种选自UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II的凝集素，特别是GSL-I和GSL-II的混合物，或者UEA-1和GSL-I的混合物，尤其是至少三种选自UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II的凝集素，特别是UEA-1、榴莲凝素和ABA的混合物，或者UEA-1、榴莲凝素和ACA的混合物。

根据本发明的诊断在生物学样品(特别是牵涉呼吸的器官的样品)上施行。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及用于在体外诊断肺部癌症的复发风险和/或肺部癌症的侵袭性以确定用于肺部癌症的治疗适应调整的预后值的试剂盒，所述试剂盒

包含至少一种从UEA-1、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素，所述凝集素与生物素相缀合，和用链霉抗生物素蛋白进行官能化的磁性珠粒，和任选地，至少一种与荧光团、放射性同位素、酶或金珠粒相缀合的从UEA-1、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素，或者

包含至少一种从UEA-1、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素，所述凝集素与荧光团相缀合，和任选地，至少一种与生物素、放射性同位素、酶或金珠粒相缀合的从UEA-1、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素。

上面所描述的根据本发明的试剂盒可以包含至少两种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的经缀合的凝集素，所述至少两种经缀合的凝集素处于等摩尔量。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含两种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素，所述两种凝集素处于等摩尔量。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含从下列混合物中选择的两种凝集素：(UEA-1、ABA)、(UEA-1、ACA)、(UEA-1、榴莲凝素)、(UEA-1、GSL-I)、(UEA-1、GSL-II)、(ABA、ACA)、(ABA、榴莲凝素)、(ABA、GSL-I)、(ABA、GSL-II)、(ACA、榴莲凝素)、(ACA、GSL-I)、(ACA、GSL-II)、(榴莲凝素、GSL-I)、(榴莲凝素、GSL-II)、(GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA)、(TJA-II、ACA)、(TJA-II、榴莲凝素)、(TJA-II、GSL-I)、(TJA-II、GSL-II)，所述两种凝集素处于等摩尔量。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含两种凝集素，所述两种凝集素为混合物(GSL-I、GSL-II)，其中所述凝集素中的每一种处于等摩尔量。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含两种凝集素，所述两种凝集素为混合物(UEA-1、GSL-I)，所述凝集素中的每一种处于等摩尔量。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含至少两种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素，所述至少两种凝集素处于非等摩尔量。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含两种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素，所述两种凝集素处于非等摩尔量。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含从下列混合物中选择的两种凝集素：(UEA-1、ABA)、(ABA、UEA-1)、(UEA-1、ACA)、(ACA、UEA-1)、(UEA-1、榴莲凝素)、(榴莲凝素、UEA-1)、(UEA-1、GSL-I)、(GSL-I、UEA-1)、(UEA-1、GSL-II)、(GSL-II、UEA-1)、(ABA、ACA)、(ACA、ABA)、(ABA、榴莲凝素)、(榴莲凝素、ABA)、(ABA、GSL-I)、(GSL-I、ABA)、(ABA、GSL-II)、(GSL-II、ABA)、(ACA、榴莲凝素)、(榴莲凝素、ABA)、(ACA、GSL-I)、(GSL-I、ACA)、(ACA、GSL-II)、(GSL-II、ACA)、(榴莲凝素、GSL-I)、(GSL-I、榴莲凝素)、(榴莲凝素、GSL-II)、(GSL-II、榴莲凝素)、(GSL-I、GSL-II)、(GSL-II、GSL-I)、(TJA-II、ABA)、(ABA、TJA-II)、(TJA-II、ACA)、(ACA、TJA-II)、(TJA-II、榴莲凝素)、(榴莲凝素、TJA-II)、(TJA-II、GSL-I)、(GSL-I、TJA-II)、(TJA-II、GSL-II)、(GSL-II、TJA-II)，所述两种凝集素处于非等摩尔量，特别地以2:1、3:1或4:1，更特别地2:1的重量比。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含两种凝集素，所述两种凝集素为混合物(UEA-1、GSL-I)，其中所述凝集素以2:1的重量比处于非等摩尔量，即2UEA-1:1GSL-I。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含两种凝集素，所述两种凝集素为混合物(UEA-1、GSL-I)，其中所述凝集素以3:1的重量比处于非等摩尔量，即3UEA-1:1GSL-I。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含两种凝集素，所述两种凝集素为混合物(UEA-1、GSL-I)，其中所述凝集素以4:1的重量比处于非等摩尔量，即4UEA-1:1GSL-I。

上面所描述的根据本发明的试剂盒可以包含至少三种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的经缀合的凝集素，所述至少三种经缀合的凝集素处于等摩尔量。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含三种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素，所述三种凝集素每一种处于等摩尔量。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含从下列混合物中选择的三种凝集素：(UEA-1、ABA、ACA)、(UEA-1、ABA、榴莲凝素)、(UEA-1、ABA、GSL-I)、(UEA-1、ABA、GSL-II)、(UEA-1、ACA、榴莲凝素)、(UEA-1、ACA、GSL-I)、(UEA-1、ACA、GSL-II)、(UEA-1、榴莲凝素、GSL-I)、(UEA-1、榴莲凝素、GSL-II)、(UEA-1、GSL-I、GSL-II)、(ABA、ACA、榴莲凝素)、(ABA、ACA、GSL-I)、(ABA、ACA、GSL-II)、(ABA、榴莲凝素、GSL-I)、(ABA、榴莲凝素、GSL-II)、(ABA、GSL-I、GSL-II)、(ACA、榴莲凝素、GSL-I)、(ACA、榴莲凝素、GSL-II)、(ACA、GSL-I、GSL-II)、(榴莲凝素、GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA、ACA)、(TJA-II、ABA、榴莲凝素)、(TJA-II、ABA、GSL-I)、(TJA-II、ABA、GSL-II)、(TJA-II、ACA、榴莲凝素)、(TJA-II、ACA、GSL-I)、(TJA-II、ACA、GSL-II)、(TJA-II、榴莲凝素、GSL-I)、(TJA-II、榴莲凝素、GSL-II)、(TJA-II、GSL-I、GSL-II)，所述三种凝集素处于等摩尔量。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含三种凝集素，所述三种凝集素选自UEA-1或其同源物TJA-II、榴莲凝素和ABA的混合物，或者UEA-1或其同源物TJA-II、榴莲凝素和ACA的混合物，并且所述三种凝集素每一种在所述混合物中以等摩尔量存在。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含至少三种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素，所述至少三种凝集素处于非等摩尔量。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含三种从UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II这些凝集素中选择的凝集素，所述三种凝集素处于非等摩尔量。

根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒可以包含从下列混合物中选择的三种凝集素的混合物：(UEA-1、ABA、ACA)、(UEA-1、ABA、榴莲凝素)、(UEA-1、ABA、GSL-I)、(UEA-1、ABA、GSL-II)、(UEA-1、ACA、榴莲凝素)、(UEA-1、ACA、GSL-I)、(UEA-1、ACA、GSL-II)、(UEA-1、榴莲凝素、GSL-I)、(UEA-1、榴莲凝素、GSL-II)、(UEA-1、GSL-I、GSL-II)、(ABA、ACA、榴莲凝素)、(ABA、ACA、GSL-I)、(ABA、ACA、GSL-II)、(ABA、榴莲凝素、GSL-I)、(ABA、榴莲凝素、GSL-II)、(ABA、GSL-I、GSL-II)、(ACA、榴莲凝素、GSL-I)、(ACA、榴莲凝素、GSL-II)、(ACA、GSL-I、GSL-II)、(榴莲凝素、GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA、ACA)、(TJA-II、ABA、榴莲凝素)、(TJA-II、ABA、GSL-I)、(TJA-II、ABA、GSL-II)、(TJA-II、ACA、榴莲凝素)、(TJA-II、ACA、GSL-I)、(TJA-II、ACA、GSL-II)、(TJA-II、榴莲凝素、GSL-I)、(TJA-II、榴莲凝素、GSL-II)、(TJA-II、GSL-I、GSL-II)，所述三种凝集素在所述混合物中处于非等摩尔量，特别地以2:1:1、1:2:1或1:1:2的重量比。

在另一个方面，本发明涉及治疗牵涉呼吸的器官的癌症的方法，所述方法包括下列步骤：

a)检测在牵涉呼吸的器官中肿瘤损伤的存在或不存在的步骤，

b)诊断牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的存在或不存在的步骤，

所述诊断癌症干细胞的存在或不存在的步骤b)可以在检测肿瘤损伤的存在或不存在的步骤a)之前、之后或同时施行，

c)在牵涉呼吸的器官的癌症干细胞存在和肿瘤损伤存在的情况下，施用一种或多种化学治疗试剂以治疗牵涉呼吸的器官的癌症的步骤，

所述一种或多种化学治疗试剂的施用可以与放射疗法和/或定向疗法相联合。

“检测肿瘤损伤的存在或不存在”是指任何使得能够检测肿瘤损伤的存在或不存在的测试。它尤其可以为传统的病理解剖学分析，其包括：HES(苏木精-伊红-藏红花)染色，其使得能够确定器官的构造；KI-67蛋白的标记，其使得能够测定所分析的组织的细胞增殖指数；或者癌胚抗原(CEA)(其是肿瘤标志物)的标记。

“诊断牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的存在或不存在的步骤”是指施行根据本发明的和如前面所定义的诊断方法的步骤。

“定向疗法”是指通过在癌细胞中定位出准确的靶标例如受体、基因或蛋白质来攻击癌细胞的选择性疗法。定向疗法通常在治疗失败的情况下以第二或第三线治疗来进行使用。在定向疗法的情况下，所推荐的药物为属于下列类别的药物：

-抗-VEGF，即靶向血管内皮生长因子的试剂，

-抗-EGF，即靶向表皮生长因子的试剂，

-抗-ALK，即靶向激酶“ALK”(退行发育淋巴瘤激酶)的试剂。

在一个实施方案中，本发明涉及治疗牵涉呼吸的器官的癌症的方法，所述方法包括下列步骤：

c)在牵涉呼吸的器官的癌症干细胞存在和肿瘤损伤存在的情况下，施用一种或多种化学治疗试剂以治疗牵涉呼吸的器官的癌症的步骤。

所述一种或多种化学治疗试剂的施用与放射疗法相联合。

所述诊断癌症干细胞的存在或不存在的步骤b)在检测肿瘤损伤的存在或不存在的步骤a)之后施行，

所述一种或多种化学治疗试剂的施用与放射疗法相联合。

所述诊断癌症干细胞的存在或不存在的步骤b)与检测肿瘤损伤的存在或不存在的步骤a)同时施行，

所述一种或多种化学治疗试剂的施用与放射疗法相联合。

根据本发明，所述化学治疗试剂选自：长春瑞滨(Navelbine^TM)、顺铂、吉西他滨(Gemzar^TM)、卡铂、紫杉醇(Taxol^TM)、多西他赛(Taxotère^TM)、培美曲赛(Alimta^TM)、厄洛替尼(Tarceva^TM)、纳武单抗(nivolumab)或贝伐珠单抗(Avastin)，或者两两联合。

在一个特别的实施方案中，所使用的两种化学治疗试剂为：长春瑞滨(Navelbine^TM)和顺铂，吉西他滨(Gemzar^TM)和顺铂，吉西他滨(Gemzar^TM)和卡铂，紫杉醇(Taxol^TM)和顺铂，紫杉醇(Taxol^TM)和卡铂，多西他赛(Taxotère^TM)和顺铂，多西他赛(Taxotère^TM)和卡铂，或者培美曲赛(Alimta^TM)和顺铂。

在另一个方面，本发明涉及预防牵涉呼吸的器官的癌症的方法，所述方法包括下列步骤：

c)在牵涉呼吸的器官的癌症干细胞存在和肿瘤损伤不存在的情况下，实施监测在步骤a)中检测出的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的演变的步骤。

“监测牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的演变”是指再次施行上面的预防方法，其使得能够借助于根据本发明的特异性地识别岩藻糖α1-2半乳糖基元，更特别地岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元的凝集素来检测牵涉呼吸的器官的癌症干细胞或者施行伴随有牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的再次标记的新的活组织检查。该监测将在如前面所描述的用化学治疗试剂、用放射疗法和/或用定向疗法的各种不同治疗之后进行，以便观察对于侵袭性负有责任的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的存在和/或数量是否消退。该检测将会使得能够更准确地指导监测和/或待推进的治疗，并且这以对于患者来说个体化的方式。

在一个实施方案中，本发明涉及预防牵涉呼吸的器官的癌症的方法，所述方法包括下列步骤：

c)在肿瘤损伤存在的情况下，施用一种或多种化学治疗试剂以治疗牵涉呼吸的器官的癌症的步骤，

c)在肿瘤损伤存在的情况下，施用一种或多种化学治疗试剂以治疗牵涉呼吸的器官的癌症的步骤。

所述一种或多种化学治疗试剂的施用与放射疗法相联合。

附图描述

图1显示了在使用在其上接枝有链霉抗生物素蛋白的磁性珠粒以及下列物质后，在来自A549细胞系并且借助于Epcam High+/Epcam High-这一比例鉴定出的细胞的样品上分开肺癌症干细胞(呼吸道癌症的主导式例子)的结果：经生物素化的UEA-1(凝集素UEA-1)，经生物素化的ABA(凝集素ABA)，经生物素化的ACA(凝集素ACA)，经生物素化的榴莲凝素(凝集素榴莲凝素)，经生物素化的GSL-I(凝集素GSL-I)，经生物素化的GSL-II(凝集素GSL-II)，经生物素化的凝集素的混合物“UEA-1/榴莲凝素/ABA”(混合物1：处于等摩尔量的UEA-1、榴莲凝素、ABA)，经生物素化的凝集素的混合物“UEA-1/榴莲凝素/ACA”(混合物2：处于等摩尔量的UEA-1、榴莲凝素、ACA)，经生物素化的凝集素的混合物“GSL-I/GSL-II”(混合物3：处于等摩尔量的GSL-I和GSL-II)，经生物素化的凝集素的混合物“UEA-1/GSL-I”(混合物4：处于等摩尔量的UEA-1和GSL-I)，经生物素化的凝集素的混合物“2UEA-1/GSL-I”(混合物5：处于非等摩尔量的UEA-1和GSL-I，UEA-1的量是GSL-I的量的2倍)，经生物素化的凝集素的混合物“3UEA-1/GSL-I”(混合物6：处于非等摩尔量的UEA-1和GSL-I，UEA-1的量是GSL-I的量的3倍)，和最后，经生物素化的凝集素的混合物“4UEA-1/GSL-I”(混合物7：处于非等摩尔量的UEA-1和GSL-I，UEA-1的量是GSL-I的量的4倍)。

图2显示了通过处于等摩尔量的混合物“UEA-1/GSL-I”进行标记并且来源于两位不同患者的两种具有肺起源的肿瘤组织(呼吸道癌症的主导式例子)的图像(标注为2A的上部图像相应于第一位患者，而标注为2B的下部图像相应于第二位患者)。代表了通过凝集素的混合物“UEA-1/GSL-I”简单地进行标记的肿瘤组织的图像2B呈现出重大数目的肺癌症干细胞，其通过标记出该含糖靶标的存在的栗色标记(使所述细胞轮廓突出的暗颜色，参见箭头)而突出了轮廓(2B)。相反地，图像2A呈现出完全的阴性。因此，在呈现出基本上相同的病理学状况的患者上，根据全靠凝集素的混合物“UEA-1/GSL-I”的仅仅靶向癌症干细胞的标记的特异性，来确定侵袭性标准。

图3显示了一组通过处于等摩尔量的混合物“UEA-1/GSL-I”进行标记的属于呼吸道的组织(A：舌，B：喉，C：鼻)。相应于通过凝集素的混合物“UEA-1/GSL-I”进行标记的肿瘤组织的图像呈现出重大数目的癌症干细胞，其通过标记出癌症干细胞的存在的栗色标记(使所述细胞轮廓突出的暗颜色，参见箭头)而突出了轮廓。与肺相似，因此在罹患涉及呼吸道的癌症的患者上，根据全靠处于等摩尔量的凝集素的混合物“UEA-1/GSL-I”的仅仅靶向癌症干细胞的标记的特异性，来确定侵袭性标准。

实施例

实施例1：分离肺癌症干细胞(呼吸道癌症的主导式例子)的实验方案

I.所需材料

试剂和材料

-特异性地对肺癌症干细胞进行标记的独个的经生物素化的凝集素或者经生物素化的凝集素的混合物(从独个的凝集素开始进行制备的，Vector Laboratories)

-CELLection Biotin Binder试剂盒(Invitrogen)，其包含通过DNA键与链霉抗生物素蛋白相偶联的磁性珠粒

-磁铁

缓冲液

-Versene(Invitrogen)，其包含磷酸缓冲盐水(PBS)和EDTA

-缓冲液1：具有0.1％BSA(牛血清白蛋白)的PBS(没有Ca²⁺和Mg²⁺的磷酸缓冲盐水)，pH 7.4

-缓冲液2：具有0.1％BSA(牛血清白蛋白)和0.6％柠檬酸钠的PBS(没有Ca²⁺和Mg²⁺的磷酸缓冲盐水)

-缓冲液3：具有1％FCS(胎牛血清)、1mM CaCl₂和5mM MgCl₂的RPMI 1640，pH 7.0-7.4

II.实验的持续时间

-20分钟，用于制备细胞

-20分钟，用于对细胞进行标记

-20分钟，用于温育用珠粒进行标记的细胞

-10分钟，用于回收不富含CSC的悬浮液

-15分钟，用于打断CSC/珠粒连接

-5分钟，用于回收富含目的CSC的悬浮液

-总共：1小时30分钟

III.通过磁力分选的操作方式：

1.制备细胞。在37℃下用Versene使A549细胞系(来源于罹患肺癌的患者的取样物的肺癌永生化细胞系)的细胞从其支持物上脱落10分钟。

2.对细胞进行计数并且在样品中将细胞数目调整至1×10⁷。

3.将细胞悬浮液以300g离心10分钟，然后去除上清液。

4.封闭非特异性位点。添加1mL的缓冲液2。

5.对细胞进行标记。添加10μg的总的凝集素量，以便在多种凝集素之时，每一种的量是相同的。

因此，添加：

-10μg的选自UEA-1、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II的经生物素化的独个凝集素，或者

-3.33μg的每种凝集素，对于混合物1(UEA-1/ABA/榴莲凝素)，或者

-3.33μg的每种凝集素，对于混合物2(UEA-1/ACA/榴莲凝素)，或者

-5μg的每种凝集素，对于混合物3(GSL-I/GSL-II)，或者

-5μg的每种凝集素，对于混合物4(UEA-1/GSL-I)，或者

-6.66μg的UEA-1和3.33μg的GSL-I，对于混合物5，或者

-7.5μg的UEA-1和2.5μg的GSL-I，对于混合物6，或者

-8μg的UEA-1和2μg的GSL-I，对于混合物7。

将在该情况下获得的混合物在4℃下温育10分钟。

6.添加500μL的缓冲液2以便洗涤细胞，并且将悬浮液以300g离心10分钟并去除上清液。

7.添加珠粒。将细胞重悬浮在1mL的缓冲液2中，然后添加25μL的事先经洗涤的与链霉抗生物素蛋白相偶联的磁性珠粒并且借助于缓冲液1进行重悬浮。将混合物在4℃下在轻柔摇动下温育20分钟。

8.回收不富含CSC的悬浮液。在该情况下，将管放置在磁铁上2分钟。被经生物素化的凝集素标记并连接至与链霉抗生物素蛋白相偶联的磁性珠粒的细胞朝磁铁方向沉淀(磁力细胞分选)，并且那么与未经标记的细胞分开。然后，通过将管保持放置在磁铁上来取出包含未经标记的细胞的上清液，并且将其保存在Falcon管中。

9.从磁铁上取回在该情况下包含经标记的癌症干细胞的管，添加1mL的缓冲液1，将管通过涡旋振荡进行摇动并且重新放置在磁铁上2分钟，然后再次将上清液保存在与在步骤8中相同的falcon中。重复该步骤两次。

10.借助于200μl的预热至37℃的缓冲液3来重悬浮仍连接至磁性珠粒的经标记的癌症干细胞。添加4μL的由DNA酶I组成的细胞/珠粒连接的切割缓冲液。将该混合物在环境温度下在轻柔摇动下温育15分钟。

11.用移液管剧烈搅动悬浮液5至10次以便促进细胞的释放。

12.回收富含CSC的悬浮液。将管放置在磁铁上2分钟。在该情况下，将磁性珠粒与经标记的癌症干细胞分开，并且将包含经标记的癌症干细胞的上清液转移到包含200μL的预热至37℃的缓冲液3的管中。步骤11和12可以重复再一次以便丰富产量。

这些实验在相似的条件下用下列中的每一种来进行：独个地经生物素化的凝集素(UEA-1、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I、GSL-II)、两种经生物素化的凝集素的混合物(GSL-I/GSL-II＝混合物3；UEA-1/GSL-I＝混合物4；2UEA-1/GSL-I＝混合物5；3UEA-1/GSL-I＝混合物6；4UEA-1/GSL-I＝混合物7)或三种经生物素化的凝集素的混合物(UEA-1/ABA/榴莲凝素＝混合物1；UEA-1/ACA/榴莲凝素＝混合物2)。

这些各种不同试验的结果呈现在图1中。需注意的是，采取了肺的例子来表征属于呼吸道的癌症干细胞。正如这些试验的结果所显示的，使用处于等摩尔量的混合物“UEA1/GSL-I”使得能够分离肺的和更广泛地呼吸道的癌症干细胞，并且这以占优势的方式。

用单独的凝集素GSL-II和单独的凝集素UEA-1以及用混合物3(由处于等摩尔量的凝集素的混合物“GSL-I/GSL-II”组成)、混合物5(由处于2:1的非等摩尔量的凝集素UEA-1和GSL-I的混合物组成)和混合物6(由处于3:1的非等摩尔量的凝集素UEA-1和GSL-I的混合物组成)也获得了良好的结果。

还按照在实施例1中所描述的实验方案进行了喉、咽、口、鼻、喉咙、舌、窦、气管和唾液腺(扁桃体和/或腮腺)的癌症干细胞的分离。所获得的结果与在分离肺癌症干细胞后获得的那些结果相一致。

实施例2：克隆发生测试

克隆发生测试的目标是观察细胞重新形成球的能力(在患者中相应于肿瘤块的重新形成)和因此其增殖能力。

克隆发生测试在本实施例中用于在样品中确认肺癌症干细胞的存在和定量所述细胞，在通过在本发明中所描述的分离方法来分离肺癌症干细胞后。因此，这使得能够证明根据本发明的分离方法的效能，相对于未经历该方法的对照样品(未经分选的细胞)而言。

在6-孔平板中，在补充有50单位/mL的青霉素、50单位/mL的链霉素(Gibco)和2.4g/L的碳酸氢钠、1M的HEPES缓冲液(Sigma Aldrich,Saint-Quentin-Fallavier,France)、1X孕酮(Sigma Aldrich)、1X腐胺(Sigma)、0.025g/mL肝素(Sigma Aldrich)、30％(m/v)葡萄糖(Sigma Aldrich,)、1X生长补充物B27(Invitrogen,Carlsbad,CA)、20ng/mLEGF(Sigma Aldrich)、20ng/mL碱性人FGF(Sigma Aldrich)、1X胰岛素-运铁蛋白-亚硒酸钠补充物(Roche diagnostics,Meylan,France)的复合培养基DMEM(Gibco)中，以500个细胞/cm²的密度进行克隆发生测试。

在37℃下在CO₂气氛中温育三周后观察到集落的演变，并且用

软件进行定量。

与对照相反，从在本发明中所描述的富集方法开始分离出的来自牵涉呼吸的器官的癌症的癌症干细胞导致形成球。这是这样的克隆发生测试，其用未经分选的细胞(T-)作为对照，针对通过下列物质进行正分选的细胞：经生物素化的UEA-1(凝集素UEA-1)，经生物素化的ABA(凝集素ABA)，经生物素化的ACA(凝集素ACA)，经生物素化的榴莲凝素(凝集素榴莲凝素)，经生物素化的GSL-I(凝集素GSL-I)，经生物素化的GSL-II(凝集素GSL-II)，经生物素化的凝集素的混合物“UEA-1/榴莲凝素/ABA”(混合物1：处于等摩尔量的UEA-1、榴莲凝素、ABA)，经生物素化的凝集素的混合物“UEA-1/榴莲凝素/ACA”(混合物2：处于等摩尔量的UEA-1、榴莲凝素、ACA)，和经生物素化的凝集素的混合物“GSL-I/GSL-II”(混合物3：处于等摩尔量的GSL-I和GSL-II)，经生物素化的凝集素的混合物“UEA-1/GSL-I”(混合物4：处于等摩尔量的UEA-1和GSL-I)，经生物素化的凝集素的混合物“2UEA-1/GSL-I”(混合物5：处于非等摩尔量的UEA-1和GSL-I，UEA-1的量是GSL-I的量的2倍)，经生物素化的凝集素的混合物“3UEA-1/GSL-I”(混合物6：处于非等摩尔量的UEA-1和GSL-I，UEA-1的量是GSL-I的量的3倍)，和最后，经生物素化的凝集素的混合物“4UEA-1/GSL-I”(混合物7：处于非等摩尔量的UEA-1和GSL-I，UEA-1的量是GSL-I的量的4倍)。因此，根据本发明的方法使得能够获得能够重新形成肿瘤的干细胞(结果未呈现)。

实施例3：在用石蜡处理的组织学切片上凝集素的可见标记：肺部癌症的例子

所使用的材料：石蜡块、冰、切片机、

载玻片、具有计算机的BondMax自动机(Leica Microsystems)、Leica消耗品(酒精、洗涤缓冲液、ER1缓冲液、脱蜡缓冲液、标签、盖玻片、管)、PBS-BSA 5％缓冲液、经生物素化的凝集素(UEA-1、榴莲凝素、ABA、ACA、GSL-I和GSL-II)(Vector Lab)、Bond Intense R detection试剂盒(Leica)、Leica封固剂、盖玻片和显微镜。

将包含来源于通过其编号(由病理解剖学部门来给出)来进行辨别的患者中的每一位的肺部癌症取样物的石蜡块放置在冰中大约1小时以便进行冷却，这是为了便于用切片机将其切成5μm的厚度。

所谓的“Superfrost”载玻片(这是为了所切出的组织的最大粘附)通过与存在于石蜡块上的那些相同的编号来进行辨别。将一滴水放置在这些载玻片中的每一个的中央。

用切片机制作切片并放置在预先放下的水滴上。然后，将载玻片安放在处于37℃的加热板上以便促进其粘附，并且撤除过量的水。将所制作的所有载玻片放置在处于37℃的烘箱中以便使其干燥。

操作的后续部分涉及使用与具有操控自动机的软件的计算机相连的Leica的BondMax自动机。

在载玻片在烘箱中时的时间期间，准备整个的免疫组织化学标记操作，其中以检验对于施行该操作来说必需的产品中的每一个在自动机上的水平开始，然后用其相同的编码来辨别载玻片(这在操控自动机的软件上)。产生了允许标准化实验方案的标签。计算了凝集素的稀释度和其量，并且准备了必需的试剂盒。需要注意的是，所使用的产品中的每一个都应当进行扫描，并且在进行每一个实验之前将水平重置为零。

然后，在烘箱的出口处将标签贴在其相应的载玻片上，并且将盖玻片(放置在切片上的塑料部件，其允许全靠接触特性来使所述产品在操作过程中均匀分布在载玻片的整个表面上)放置在每个载玻片上。

将载玻片支架放置在自动机中，并且在由阅读器识别每个部件和通过存在于标签上的其条形码来辨别的载玻片后，开始进行操作。

操作以全靠Leica的Dewax产品的热脱石蜡开始，其然后允许抗体可接近。该步骤以及所有其他步骤随后为洗涤(全靠预先经稀释的Bond Wash 10X)，这重复三次。

该步骤随后为用pH＝6的柠檬酸盐缓冲液(Leica的ER1缓冲液)预处理5分钟，这使得能够在该简单标记的范围内暴露待到达的抗原，即使得所述抗原可接近。

借助于稀释剂PBS-BSA 5％，将以1/80的经生物素化的凝集素UEA-1和以1/200000的经生物素化的凝集素GSL-I同时放置在切片上20分钟。

全靠起着二抗作用的链霉抗生物素蛋白-HRP的介入的Bond Intense Rdetection试剂盒(Leica)通过其特性而使得能够全靠DAB(酶HRP(辣根过氧化物酶)的底物)的特性来以栗色揭示这些经生物素化的凝集素，从而使得能够揭示生物素/链霉抗生物素蛋白-HRP复合物。

然后，进行全靠苏木精存在的微蓝的对比染色的步骤7分钟，以便使整个取样物可辨别。

将载玻片从自动机上取回。然后，通过以手动方式将载玻片浸入酒精浴中两次(持续5分钟)来使切片再水化。该再水化步骤之后接着还有5分钟的甲苯浴。

此后，可以通过放上一滴封固剂(Leica)来安装载玻片。

最后，用显微镜观察载玻片并且以20的放大倍数拍摄照片。

结果呈现在图2A和2B中。

所获得的结果阐明了本发明的凝集素选择性地对具有肺起源的肿瘤组织的癌症干细胞进行标记的能力。

用处于等摩尔量的经生物素化的凝集素的混合物“UEA-1/GSL-I”对两种肺肿瘤组织进行简单标记使得能够观察到，组织尽管具有相同的病理学状况，但是可以呈现出非常不同的侵袭性标准。

实际上，靶向癌症干细胞的根据本发明的标记物的特异性在此很好地得到了利用，因为在观察第一位患者的具有肺起源的肿瘤组织的情景下，它显示出完全的阴性(在所述细胞周围不存在暗颜色)(显示在图2A中)，而在当观察第二位患者的具有肺起源的肿瘤组织时，注意到非常强的阳性(使所述细胞轮廓突出的暗颜色，参见箭头)(图2B)。在救助患者中应当考虑增加的侵袭性(由于存在癌症干细胞)。

实施例4：在用石蜡处理的组织学切片上凝集素的可见标记：喉癌的例子

该实施例显示了用处于等摩尔量的混合物“UEA-1/GSL-I”来对喉肿瘤组织进行标记。所述标记按照在实施例3中所描述的实验方案来施行。

所获得的结果阐明了本发明的凝集素选择性地对喉肿瘤组织的癌症干细胞进行标记的能力。

实际上，图3B显示出非常强的阳性(使所述细胞轮廓突出的暗颜色，参见箭头)，在当观察喉肿瘤组织时。在救助患者中应当考虑增加的侵袭性(由于存在癌症干细胞)。

实施例5：在用石蜡处理的组织学切片上凝集素的可见标记：鼻癌的例子

该实施例显示了用处于等摩尔量的混合物“UEA-1/GSL-I”来对来源于鼻的肿瘤组织进行标记。所述标记按照在实施例3中所描述的实验方案来施行。

所获得的结果阐明了本发明的凝集素选择性地对来源于鼻的肿瘤组织的癌症干细胞进行标记的能力。

实际上，图3C显示出非常强的阳性(使所述细胞轮廓突出的暗颜色，参见箭头)，在当观察来源于鼻的肿瘤组织时。在救助患者中应当考虑增加的侵袭性(由于存在癌症干细胞)。

实施例6：在用石蜡处理的组织学切片上凝集素的可见标记：舌癌的例子

该实施例显示了用处于等摩尔量的混合物“UEA-1/GSL-I”来对来源于舌的肿瘤组织进行标记。所述标记按照在实施例3中所描述的实验方案来施行。

所获得的结果阐明了本发明的凝集素选择性地对来源于舌的肿瘤组织的癌症干细胞进行标记的能力。

实际上，图3A显示出非常强的阳性(使所述细胞轮廓突出的暗颜色，参见箭头)，在当观察来源于舌的肿瘤组织时。在救助患者中应当考虑增加的侵袭性(由于存在癌症干细胞)。

实施例7：在用石蜡处理的组织学切片上凝集素的可见标记：咽癌的例子

该实施例显示了用处于等摩尔量的混合物“UEA-1/GSL-I”来对来源于咽的肿瘤组织进行标记。所述标记按照在实施例3中所描述的实验方案来施行。

所获得的结果阐明了本发明的凝集素选择性地对来源于咽的肿瘤组织的癌症干细胞进行标记的能力。

实施例8：在用石蜡处理的组织学切片上凝集素的可见标记：口腔癌的例子

该实施例显示了用处于等摩尔量的混合物“UEA-1/GSL-I”来对来源于口的肿瘤组织进行标记。所述标记按照在实施例3中所描述的实验方案来施行。

所获得的结果阐明了本发明的凝集素选择性地对来源于口的肿瘤组织的癌症干细胞进行标记的能力。

实施例9：在用石蜡处理的组织学切片上凝集素的可见标记：喉咙癌的例子

该实施例显示了用处于等摩尔量的混合物“UEA-1/GSL-I”来对来源于喉咙的肿瘤组织进行标记。所述标记按照在实施例3中所描述的实验方案来施行。

所获得的结果阐明了本发明的凝集素选择性地对来源于喉咙的肿瘤组织的癌症干细胞进行标记的能力。

实施例10：在用石蜡处理的组织学切片上凝集素的可见标记：气管癌的例子

该实施例显示了用处于等摩尔量的混合物“UEA-1/GSL-I”来对来源于气管的肿瘤组织进行标记。所述标记按照在实施例3中所描述的实验方案来施行。

所获得的结果阐明了本发明的凝集素选择性地对来源于气管的肿瘤组织的癌症干细胞进行标记的能力。

实施例11：在用石蜡处理的组织学切片上凝集素的可见标记：窦癌的例子

该实施例显示了用处于等摩尔量的混合物“UEA-1/GSL-I”来对来源于窦的肿瘤组织进行标记。所述标记按照在实施例3中所描述的实验方案来施行。

所获得的结果阐明了本发明的凝集素选择性地对来源于窦的肿瘤组织的癌症干细胞进行标记的能力。

实施例12：在用石蜡处理的组织学切片上凝集素的可见标记：扁桃体癌(唾液腺癌的例子)的例子

该实施例显示了用处于等摩尔量的混合物“UEA-1/GSL-I”来对来源于扁桃体的肿瘤组织进行标记。所述标记按照在实施例3中所描述的实验方案来施行。

所获得的结果阐明了本发明的凝集素选择性地对来源于扁桃体的肿瘤组织的癌症干细胞进行标记的能力。

实施例13：在用石蜡处理的组织学切片上凝集素的可见标记：腮腺癌(唾液腺癌的例子)的例子

该实施例显示了用处于等摩尔量的混合物“UEA-1/GSL-I”来对来源于腮腺的肿瘤组织进行标记。所述标记按照在实施例3中所描述的实验方案来施行。

所获得的结果阐明了本发明的凝集素选择性地对来源于腮腺的肿瘤组织的癌症干细胞进行标记的能力。

实施例3至13显示，用处于等摩尔量的经生物素化的凝集素的混合物“UEA-1/GSL-I”对属于呼吸道的肿瘤组织进行简单标记使得能够观察到，组织尽管具有相同的病理学状况，但是可以呈现出非常不同的侵袭性标准。在救助患者中应当考虑增加的侵袭性，在呈现出各种各样的癌症病理学状况但均属于呼吸道的这些情况下。

Claims

1.至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素用于在生物学样品中对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以获得经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外用途。

2.根据权利要求1的体外用途，其中所述岩藻糖α1-2半乳糖基元为岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元。

3.根据权利要求1或2中任一项的体外用途，其中所述至少一种凝集素选自下列凝集素：荆豆凝集素1(UEA-1)或其同源物日本栝楼凝集素II(TJA-II)、双孢蘑菇凝集素(ABA)、尾穗苋凝集素(ACA)、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II即单叶格里丰木凝集素I(GSL-I)和单叶格里丰木凝集素II(GSL-II)，

4.根据权利要求1至3之一的体外用途，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于等摩尔量。

5.根据权利要求1至3之一的体外用途，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于非等摩尔量。

6.根据权利要求5的体外用途，其中使用两种凝集素，所述2种凝集素是以2:1、3:1或4:1的重量比的处于非等摩尔量的UEA-1和GSL-I。

7.权利要求1至6中任一项的体外用途，其中所述对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记用与选自下列各项的标记物相缀合的凝集素来施行：

-荧光团，其特别地选自罗丹明、FITC或Alexa Fluor，

-放射性同位素，其特别地选自碘125、氚或锝，

-使用生色或发光底物的酶，所述酶特别地选自辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或β-半乳糖苷酶，

-金珠粒，或

-生物素。

8.根据权利要求1至7中任一项的体外用途，其中所述对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记用经缀合的凝集素来施行，并且随后为通过检测所述经缀合的凝集素来检测所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞。

9.根据权利要求1至8中任一项的体外用途，其中所述用与标记物相缀合的凝集素对牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记随后为分离所述经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞，

其中所述标记物为生物素，并且所述分离通过由磁性珠粒构成的用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白进行官能化的支持物并且在磁铁存在下来施行，或者

其中所述标记物为荧光团，并且所述分离以流式细胞术来施行。

10.根据权利要求1至9中任一项的体外用途，其中所述生物学样品为牵涉呼吸的器官的生物学样品。

11.根据权利要求1至10中任一项的体外用途，其中所述牵涉呼吸的器官选自肺、喉、咽、口、鼻、喉咙、舌、窦、气管和唾液腺，所述唾液腺包括扁桃体和腮腺。

12.在生物学样品中检测牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外方法，所述方法包括下列步骤：

随后为

(b)检测所述被至少一种凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的步骤。

13.根据权利要求12的体外检测方法，其中所述岩藻糖α1-2半乳糖基元为岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元。

14.根据权利要求12或13中任一项的体外检测方法，其中所述至少一种凝集素选自下列凝集素：UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II，

15.根据权利要求12至14之一的体外检测方法，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于等摩尔量。

16.根据权利要求12至14之一的体外检测方法，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于非等摩尔量。

17.根据权利要求16的体外检测方法，其中使用两种凝集素，所述2种凝集素是以2:1、3:1或4:1的重量比的处于非等摩尔量的UEA-1和GSL-I。

18.根据权利要求12至17中任一项的体外检测方法，其中所述生物学样品为牵涉呼吸的器官的生物学样品。

19.根据权利要求12至18中任一项的体外检测方法，其中所述牵涉呼吸的器官选自肺、喉、咽、口、鼻、喉咙、舌、窦、气管和唾液腺，所述唾液腺包括扁桃体和腮腺。

20.在生物学样品中分离牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的体外方法，所述方法包括下列步骤：

随后为

(b)分离所述被至少一种凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的步骤，

21.根据权利要求20的体外分离方法，其中所述岩藻糖α1-2半乳糖基元为岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元。

22.根据权利要求20或21中任一项的体外分离方法，其中所述至少一种凝集素选自下列凝集素：UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II，

23.根据权利要求20至22之一的体外分离方法，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于相等的量或不等的量。

24.根据权利要求20至22之一的体外分离方法，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于非等摩尔量。

25.根据权利要求24的体外分离方法，其中使用两种凝集素，所述2种凝集素是以2:1、3:1或4:1的重量比的处于非等摩尔量的UEA-1和GSL-I。

26.根据权利要求20至25中任一项的体外分离方法，其中所述生物学样品为牵涉呼吸的器官的生物学样品。

27.根据权利要求20至26中任一项的体外分离方法，其中所述牵涉呼吸的器官选自肺、喉、咽、口、鼻、喉咙、舌、窦、气管和唾液腺，所述唾液腺包括扁桃体和腮腺。

28.在体外诊断牵涉呼吸的器官的癌症的复发风险和/或牵涉呼吸的器官的癌症的侵袭性以确定用于牵涉呼吸的器官的癌症的治疗适应调整的预后值的方法，所述方法包括用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素对牵涉呼吸的器官的生物学样品的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行标记以在所述样品中获得被至少一种凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞的步骤。

29.根据权利要求28的诊断方法，所述方法包括下列步骤：

(b)分离被所述至少一种经缀合的凝集素标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞：

(c)用至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素对经分离的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞进行再次标记以获得经分离和经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞，所述凝集素与选自荧光团、放射性同位素、酶、金珠粒或生物素的标记物相缀合；

(d)通过下列方式来检测所述经分离和经标记的牵涉呼吸的器官的癌症干细胞：

(e)任选地，定量牵涉呼吸的器官的癌症干细胞；

30.根据权利要求28的诊断方法，所述方法包括下列步骤：

(c)任选地，定量牵涉呼吸的器官的癌症干细胞；

31.根据权利要求28至30中任一项的诊断方法，其中所述岩藻糖α1-2半乳糖基元为岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元。

32.根据权利要求28至31中任一项的诊断方法，其中所述至少一种凝集素选自下列凝集素：UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II，

33.根据权利要求28至32之一的诊断方法，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于相等的量或不等的量。

34.根据权利要求28至32之一的诊断方法，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于非等摩尔量。

35.根据权利要求34的诊断方法，其中使用两种凝集素，所述2种凝集素是以2:1、3:1或4:1的重量比的处于非等摩尔量的UEA-1和GSL-I。

36.根据权利要求28至35中任一项的诊断方法，其中所述生物学样品为牵涉呼吸的器官的生物学样品。

37.根据权利要求28至36中任一项的诊断方法，其中所述牵涉呼吸的器官选自肺、喉、咽、口、鼻、喉咙、舌、窦、气管和唾液腺，所述唾液腺包括扁桃体和腮腺。

38.根据权利要求28至36中任一项的诊断方法，其中所述癌症选自肺癌、喉癌、咽癌、口腔癌、鼻癌、喉咙癌、舌癌、窦癌、气管癌和唾液腺癌例如扁桃体癌和/或腮腺癌。

39.用于在体外诊断牵涉呼吸的器官的癌症的复发风险和/或牵涉呼吸的器官的癌症的侵袭性以确定用于牵涉呼吸的器官的癌症的治疗适应调整的预后值的试剂盒，所述试剂盒

包含至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素，所述凝集素与生物素相缀合，和用链霉抗生物素蛋白进行官能化的磁性珠粒，和任选地，至少一种与荧光团、放射性同位素、酶或金珠粒相缀合的识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素，或者

包含至少一种识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素，所述凝集素与荧光团相缀合，和任选地，至少一种与生物素、放射性同位素、酶或金珠粒相缀合的识别岩藻糖α1-2半乳糖基元的凝集素。

40.根据权利要求39的诊断试剂盒，其中所述岩藻糖α1-2半乳糖基元为岩藻糖α1-2半乳糖β1-4N-乙酰葡糖胺基元。

41.根据权利要求39或40中任一项的诊断试剂盒，其中所述至少一种凝集素选自下列凝集素：UEA-1或其同源物TJA-II、ABA、ACA、榴莲凝素、GSL-I和GSL-II，

42.根据权利要求40至41之一的诊断试剂盒，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于相等的量或不等的量。

43.根据权利要求40至41之一的诊断试剂盒，其中使用至少两种凝集素，所述至少两种凝集素处于非等摩尔量。

44.根据权利要求43的诊断试剂盒，其中使用两种凝集素，所述2种凝集素是以2:1、3:1或4:1的重量比的处于非等摩尔量的UEA-1和GSL-I。