CN111334867A - 一种病毒核酸的建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种病毒核酸的建库方法，包括以下步骤：样品处理，临床样品复杂多样,不仅含有大量的宿主基因还混杂有细菌等其他微生物，有必要采取措施减少无关序列的干扰同时进一步富集病毒，样品类型液体类样品包括血液、血清、脑脊、液、精液等正常情况下病原菌极少，新鲜的样品宿主gDNA和rRNA等背景核酸含量较低,可以直接用于建库测序；物质去除。本发明通过多重置换扩增的方法对病毒核酸进行扩增，多重置换扩增发操作简单、对实验仪器要求低，且使用非预变性的模板时也可取得良好的效果，解决了现有的病毒核酸建库时效率低成本高的问题。
Description
技术领域
本发明涉及病毒核酸技术领域，尤其涉及一种病毒核酸的建库方法。
背景技术
病毒是一种个体微小，结构简单，只含一种核酸(DNA或RNA)，必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。病毒是一种非细胞生命形态，它由一个核酸长链和蛋白质外壳构成，病毒没有自己的代谢机构，没有酶系统。因此病毒离开了宿主细胞，就成了没有任何生命活动、也不能独立自我繁殖的化学物质。它的复制、转录、和转译的能力都是在宿主细胞中进行，当它进入宿主细胞后，它就可以利用细胞中的物质和能量完成生命活动，按照它自己的核酸所包含的遗传信息产生和它一样的新一代病毒。
由于病毒容易产生变异所以现有的病毒库并不健全，每时每刻都能发现新病毒，现有的病毒在核酸检测时成本高检测效率低。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种病毒核酸的建库方法。
本发明提出的一种病毒核酸的建库方法，包括以下步骤：
S1：样品处理，临床样品复杂多样,不仅含有大量的宿主基因还混杂有细菌等其他微生物，有必要采取措施减少无关序列的干扰同时进一步富集病毒，样品类型液体类样品包括血液、血清、脑脊、液、精液等正常情况下病原菌极少，新鲜的样品宿主gDNA和rRNA等背景核酸含量较低,可以直接用于建库测序；
S2：物质去除，由于病毒颗粒远远小于细菌和其他细胞,可以通过离心、滤器过滤等物理方法去除样品中的细胞、细胞碎片及细菌等大颗粒物质；
S3：核酸提取，由于病毒颗粒具有一定的密度可以用超速离心处理样品，提高病毒的浓度和纯度然后提取病毒核酸，采用截留分子量为100kD的浓缩膜或超滤管对样品进行浓缩；
S4：核酸扩增，利用随机的6碱基引物在多位点和模板链结合,接着利用phi29DNA聚合酶很强的模板结合和置换能力实现对全基因组的扩增，扩增方法不依赖于病毒的核酸序列信息,且可对低浓度样品高效放大,因此在病毒核酸信息未知的情况下,可对临床样品进行高通量测序；
S5：核酸分析，对各个样本中核酸浓度、纯度和质量通过生物分析仪分析核酸，分别利用随机引物建库和oligo(dT)磁珠抓取建库的方法对病毒进行测序比较。
优选地，所述S1中，组织类样品,包括心脏、肝脏、肺脏等组织由于有大量宿主的核酸干扰测序前需要去掉宿主gDNA和rRNA等背景核酸；拭子类样品,包括咽拭子、鼻拭子、肛拭子等,不但有病原菌还存在大量正常寄生菌群,核酸背景复杂。
优选地，所述S2中，向样品中加入核酸酶不但能降解宿主的背景核酸同时也能降解游离的病原体核酸。由于大部分病毒核酸一般有衣壳包裹,存在于病毒颗粒内可以抵抗核酸酶的作用”，因此,可用DNase I降解游离的宿主gDNA,加入RNaseA降解游离的宿主rRNA。
优选地，所述S4中，核酸扩增的方案包括不依赖序列的单引物扩增、VIDISCA技术和随机PCR。。
本发明中的有益效果为：
本病毒核酸的建库方法，通过多重置换扩增的方法对病毒核酸进行扩增，多重置换扩增发操作简单、对实验仪器要求低，,且使用非预变性的模板时也可取得良好的效果，解决了现有的病毒核酸建库时效率低成本高的问题。
附图说明
图1为本发明提出的一种病毒核酸的建库方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1一种病毒核酸的建库方法，包括以下步骤：
S1：样品处理，临床样品复杂多样,不仅含有大量的宿主基因还混杂有细菌等其他微生物，有必要采取措施减少无关序列的干扰同时进一步富集病毒，样品类型液体类样品包括血液、血清、脑脊、液、精液等正常情况下病原菌极少，新鲜的样品宿主gDNA和rRNA等背景核酸含量较低,可以直接用于建库测序；
S2：物质去除，由于病毒颗粒远远小于细菌和其他细胞,可以通过离心、滤器过滤等物理方法去除样品中的细胞、细胞碎片及细菌等大颗粒物质；
S3：核酸提取，由于病毒颗粒具有一定的密度可以用超速离心处理样品，提高病毒的浓度和纯度然后提取病毒核酸，采用截留分子量为100kD的浓缩膜或超滤管对样品进行浓缩；
S4：核酸扩增，利用随机的6碱基引物在多位点和模板链结合,接着利用phi29DNA聚合酶很强的模板结合和置换能力实现对全基因组的扩增，扩增方法不依赖于病毒的核酸序列信息,且可对低浓度样品高效放大,因此在病毒核酸信息未知的情况下,可对临床样品进行高通量测序；
S5：核酸分析，对各个样本中核酸浓度、纯度和质量通过生物分析仪分析核酸，分别利用随机引物建库和oligo(dT)磁珠抓取建库的方法对病毒进行测序比较。。
本发明中，S1中，组织类样品,包括心脏、肝脏、肺脏等组织由于有大量宿主的核酸干扰测序前需要去掉宿主gDNA和rRNA等背景核酸；拭子类样品,包括咽拭子、鼻拭子、肛拭子等,不但有病原菌还存在大量正常寄生菌群,核酸背景复杂，S2中，向样品中加入核酸酶不但能降解宿主的背景核酸同时也能降解游离的病原体核酸。由于大部分病毒核酸一般有衣壳包裹,存在于病毒颗粒内可以抵抗核酸酶的作用”，因此,可用DNase I降解游离的宿主gDNA,加入RNaseA降解游离的宿主rRNA，S4中，核酸扩增的方案包括不依赖序列的单引物扩增、VIDISCA技术和随机PCR。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种病毒核酸的建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：样品处理，临床样品复杂多样,不仅含有大量的宿主基因还混杂有细菌等其他微生物，有必要采取措施减少无关序列的干扰同时进一步富集病毒，样品类型液体类样品包括血液、血清、脑脊、液、精液等正常情况下病原菌极少，新鲜的样品宿主gDNA和rRNA等背景核酸含量较低,可以直接用于建库测序；
S2：物质去除，由于病毒颗粒远远小于细菌和其他细胞,可以通过离心、滤器过滤等物理方法去除样品中的细胞、细胞碎片及细菌等大颗粒物质；
S3：核酸提取，由于病毒颗粒具有一定的密度可以用超速离心处理样品，提高病毒的浓度和纯度然后提取病毒核酸，采用截留分子量为100kD的浓缩膜或超滤管对样品进行浓缩；
S4：核酸扩增，利用随机的6碱基引物在多位点和模板链结合,接着利用phi29DNA聚合酶很强的模板结合和置换能力实现对全基因组的扩增，扩增方法不依赖于病毒的核酸序列信息,且可对低浓度样品高效放大,因此在病毒核酸信息未知的情况下,可对临床样品进行高通量测序；
S5：核酸分析，对各个样本中核酸浓度、纯度和质量通过生物分析仪分析核酸，分别利用随机引物建库和oligo(dT)磁珠抓取建库的方法对病毒进行测序比较。
2.根据权利要求1所述的一种病毒核酸的建库方法，其特征在于，所述S1中，组织类样品,包括心脏、肝脏、肺脏等组织由于有大量宿主的核酸干扰测序前需要去掉宿主gDNA和rRNA等背景核酸；拭子类样品,包括咽拭子、鼻拭子、肛拭子等,不但有病原菌还存在大量正常寄生菌群,核酸背景复杂。
3.根据权利要求1所述的一种病毒核酸的建库方法，其特征在于，所述S2中，向样品中加入核酸酶不但能降解宿主的背景核酸同时也能降解游离的病原体核酸。由于大部分病毒核酸一般有衣壳包裹,存在于病毒颗粒内可以抵抗核酸酶的作用”，因此,可用DNase I降解游离的宿主gDNA,加入RNaseA降解游离的宿主rRNA。
4.根据权利要求1所述的一种病毒核酸的建库方法，其特征在于，所述S4中，核酸扩增的方案包括不依赖序列的单引物扩增、VIDISCA技术和随机PCR。
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