CN111323603A - 时间分辨流式荧光分析检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了时间分辨流式荧光分析检测试剂盒，包括时间分辨荧光微球，信号放大系统，第一蛋白，待测物，第二蛋白和高分子荧光编码微球。本申请还公开了所述试剂盒的使用方法，包括，加入待测样本，孵育震荡处理，形成高分子荧光编码‑第一蛋白+待测物+第二蛋白‑时间分辨荧光微球的反应混合物，用时间分辨流式荧光检测装置进行高通量测试，样本液与鞘液一起输送到流动室，待测液微粒依次通过流动室毛细管检测区域，第一激光器激发，第一激光器荧光检测器通过集光器收集荧光信号，同时第二激光器激发，待短寿命的背景荧光衰变消失后，第二激光器时间分辨荧光检测单元开启通过集光器记录采集荧光信号，采集的信号经数据采集系统分析处理。
Description
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种时间分辨流式荧光分析检测试剂盒及其应用。
背景技术
在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的，荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有非常少的稀土金属(Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法。时间分辨荧光技术目前是主要用在临床和科研上，它利用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素发光的特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分析，可以有效抵排除非特异性荧光，极大地提高分析的灵敏度，降低本底干扰，重复性好。目前时间分辨荧光技术不能有高通量一次检测多个指标，实现样本的批量处理。
流式荧光技术流式荧光技术，是基于编码微球和流式技术的一种临床应用型的高通量发光检测技术，又被称为液态芯片、悬浮阵列及
xMAP技术等。平台中包含一种直径5.6μm的聚苯乙烯编码微球，其被两种光谱特性不同的荧光染料染色。通过精确控制两种荧光染料的浓度配比(10×10)，理论上可以获得一个100种荧光编码的微球阵列，每种微球表面可结合一种反应物。微球表面有活化羧基基团，可以与蛋白抗体的氨基或核酸探针的氨基共价交联。由于微球可通过其编码荧光被识别，因而可以实现在一个混合反应体系中同时进行100项反应的检测。另一种荧光物质(一般是澡红蛋白，非时间分辨荧光微球)与报告分子交联，用于测定微球表面生物反应的量。应用时，直接混合不同检测物的编码微球，再加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的分子进行特异性地结合，在一个反应孔内即可以同时完成数十上几百种不同的生物学反应，而不相互干扰。最后用流式荧光检测类仪器进行分析，微球逐颗被两束激光进行分析。一束635nm的红色激光激发微球自身的荧光物质(聚苯乙烯编码微球)，而另一束532nm的绿色激光激发结合在微球表面的报告荧光物质(藻红蛋白、Alexa 532或Cy3，非时间分辨荧光微球)。高速的激光信号处理读取微球编码对其分类，同时对其表面的反应进行定量。每种检测物的检测读取100颗微球的信号值，取中位值。
目前流式荧光检测荧光虽具有高通量、速度快、精度高、准确性好的特点，但信号影响因素很多，受到非特异性荧光的干扰，本底值高，检测灵敏度低，可重复性不高。
实用新型内容
本申请的主要目的在于提供一种高通量时间分辨流式荧光分析检测试剂盒及其应用，以解决相关技术中时间分辨荧光和流式细胞技术难以互补结合的问题。
为了实现上述目的，第一方面，本申请提供了一种时间分辨流式荧光分析检测试剂盒，包括能够进行时间分辨的荧光微球，信号放大系统，第一蛋白，待测物，第二蛋白和高分子荧光编码微球。
优选地，所述第一蛋白和第二蛋白分别独立地选自抗体、抗原中的至少一种。
优选地，所述信号放大系统包括链霉亲和素和生物素。
优选地，所述能够进行时间分辨的荧光微球或量子点荧光微球与所述第二蛋白直接或间接相连，优选地，所述能够进行时间分辨的荧光微球或量子点荧光微球通过信号放大系统与所述第二蛋白相连。
优选地，所述高分子荧光编码微球与所述第一蛋白直接或间接相连，优选地，所述高分子荧光编码微球通过信号放大系统与所述第一蛋白相连。
优选地，所述能够进行时间分辨的荧光微球的荧光物质为稀土镧系元素或其螯合物的液体或固体微球，优选为铕、铽、钐之一或其任意组合。
本申请的另一个方面提供所述的时间分辨流式荧光分析检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法的步骤包括，加入待测样本，进行孵育震荡处理，形成高分子荧光编码-第一蛋白+待测物+第二蛋白-能够进行时间分辨的荧光微球的反应多元混合物，用时间分辨流式荧光检测装置进行高通量测试，样本液与鞘液一起输送到流动室，待测液微粒依次通过流动室毛细管检测区域，第一激光器激发，第一激光器荧光检测器通过集光器收集荧光信号，同时第二激光器激发，待短寿命的背景荧光衰变消失后，第二激光器时间分辨荧光检测单元开启通过集光器记录采集荧光信号，采集的信号经数据采集系统分析处理。
本申请具有以下优点：
本申请的试剂盒是基于把时间分辨荧光和高通量流式荧光互补结合的理论设计的，结合适用的设备进行使用时，能够有效排除非特异性荧光，降低本底背景干扰，并极大地提高分析的灵敏度10-18mol/L，与化学发光相媲美。本发明的试剂盒用法简单，生产过程中不需要透析，重复性好，试剂稳定性高。
本申请的时间分辨流式荧光技术可避免非特异性荧光本底的干扰，并且可以高通量批量处理样本，一次检测多个指标。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是根据本申请实施例提供的一种高通量时间分辨流式荧光分析检测试剂盒中各组分的结构示意图；
能够进行时间分辨的荧光微球或量子点荧光微球1，链霉亲和素2，生物素3，第二蛋白4，待测物5、第一蛋白6，高分子荧光编码微球7。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例一
不同种类的高分子荧光编码微球7分别与1到50种第一蛋白进行偶联，然后按一定比例混合，形成高分子编码微球悬液A，能够进行时间分辨的荧光微球或量子点荧光微球1也分别与对应的1到50种第二蛋白交联，按照一定比例，形成时间分辨微球悬液B，由于高分子编码微球可通过其编码荧光被识别，因而可以实现在一个混合反应体系中同时进行多项反应的检测。另一种二抗或抗原与能够进行时间分辨的荧光微球交联，用于测定生物反应的量。应用时，直接混合不同检测物的高分子编码微球，再加入待检样本，然后在加入时间分辨微球悬液B，形成微球混合液(高分子荧光编码-第二一蛋白+待测物+第一二蛋白-能够进行时间分辨的荧光微球的反应多元混合物)，在悬液中靶分子与微球表面交联的分子进行特异性地结合，最后用时间分辨流式荧光检测分析装置进行测定，微球混合液被两束激光进行分析。一束635nm的红色激光激发微球自身的荧光物质，用于分辨检测的不同项目，而另一束365nm的激光激发能够进行时间分辨的荧光微球(镧系元素如铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)等或其螯合物)，用于检测反应结合的量。高速的激光信号处理读取微球编码对其分类，同时对其表面的反应进行定量。不同之处在于，检测中在365nm激发光脉冲过后采用延缓测量时间的方式，待短寿命的背景荧光衰变消失后，再打开取样门仪器记录长寿命时间分辨荧光微球发射的特异性荧光，可以避免本底荧光干扰，提高检测的精密度。过程为：第一激光器激发的高分子编码微球与第一蛋白交联，第二激光器激发的时间分辨荧光物质与第二蛋白交联，加入待测样本后，经前置系统进行孵育震荡处理，形成的高分子荧光编码-第一蛋白+待测物+第二蛋白-时间分辨荧光微球的反应多元混合物与鞘液一起输送到流动室，微球混合液依次通过流动室毛细管检测区域，第一激光器激发，第一激光器荧光检测器通过集光器收集荧光信号，同时第二激光器激发，延迟一定时间后，通常10纳秒到1500毫秒，第二激光器时间分辨荧光检测单元开启通过集光器记录采集荧光信号，采集的信号经数据采集系统分析处理。
实施例二
不同种类的高分子荧光编码微球7分别与1到100种第一蛋白进行偶联，然后按一定比例混合，形成高分子编码微球悬液A，时间分辨荧光微球与链霉亲和素偶联，形成时间分辨荧光微球-链霉亲和素复合物。与高分子编码微球蛋白对应的1到100种第二蛋白分别与生物素交联，形成生物素化的第二蛋白，然后按照一定比例，把生物素化的第二蛋白和时间分辨荧光微球-链霉亲和素复合物混合，形成时间分辨微球悬液B，再加入待检样本，形成微球混合液(高分子荧光编码-第一蛋白+待测物+链霉亲和素-时间分辨荧光微球+生物素化的第二蛋白的反应多元混合物)，最后用时间分辨流式荧光检测分析装置进行测定，过程为：第一激光器激发的高分子编码微球与第一蛋白交联，第二激光器激发的时间分辨荧光物质与第二蛋白交联，加入待测样本后，经前置系统进行孵育震荡处理，形成的反应多元混合物与鞘液一起输送到流动室，微球混合液依次通过流动室毛细管检测区域，第一激光器激发，第一激光器荧光检测器通过集光器收集荧光信号，同时第二激光器激发，延迟一定时间后，通常10纳秒到1500毫秒，第二激光器时间分辨荧光检测单元开启通过集光器记录采集荧光信号，采集的信号经数据采集系统分析处理。
经过时间分辨荧光微球测得的本底信号值很低，与仪器的背景信号类似，大大低于普通的流式荧光检测试剂的信号值。
实施例三
使用本发明的试剂盒进行分析检测，步骤如下
一、高分子荧光编码微球蛋白偶联
取100微升高分子荧光编码微球放到1.5毫升离心管中，离心,沉淀用去离子水和活化缓冲液各洗一次(洗时漩涡振荡并超声处理20s),重悬于活化缓冲液中。在微球中先后加入新鲜配制的偶联剂,轻轻混匀,室温下避光轻微振摇，中间漩涡振荡一次。然后将微球离心,沉淀用交联缓冲液洗涤,重悬于交联缓冲液中。在已活化的微球悬液中加入蛋白,并用交联缓冲液补足体积,室温避光温和振荡,然后4℃振荡过夜。离心微球,加入封闭液,室温避光振荡，取少量微球悬液用水适当稀释,显微镜下计数微球个数,计算微球悬液的浓度。最后避光保存于4℃。
二、时间分辨荧光微球或量子点荧光微球与蛋白偶联
取100微升时间分辨荧光微球或量子点荧光微球放到1.5毫升离心管中，离心,沉淀用去离子水和活化缓冲液各洗一次(洗时漩涡振荡并超声处理20s),重悬于活化缓冲液中。在微球中先后加入新鲜配制的偶联剂,轻轻混匀,室温下避光轻微振摇，中间漩涡振荡一次。然后将微球离心,沉淀用交联缓冲液洗涤,重悬于交联缓冲液中。在已活化的微球悬液中加入蛋白,并用交联缓冲液补足体积,室温避光温和振荡,然后4℃振荡过夜。离心微球,加入封闭液，最后避光保存于4℃。
三、生物素标记抗体的制备
取出待标记的生物素，平衡至室温，称取生物素1mg，溶于200uL超纯水，配制成5mg/mL的溶液，根据生物素试剂盒推荐的所需蛋白量，加入5mg/mL生物素溶液，4℃旋转2h，将标记好的生物素化蛋白，分装-80摄氏度保存备用。
四、检测方法
以双抗夹心的检测为例，检测过程反应在96孔板进行，将偶联了抗体的微球稀释为2000个/50uL,加入到96孔板中，50uL/孔，真空抽去液体，然后加入待测样品，室温震荡1.5h，用含有0.1％的吐温-20的磷酸缓冲液洗涤2次并抽滤，加入生物素标记的蛋白，50uL/孔，混匀后室温避光震荡1h，洗涤，加入时间分辨荧光微球或量子点荧光微球的蛋白偶联液，混匀，洗涤。用在时间分辨流式荧光仪器上检测。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种时间分辨流式荧光分析检测试剂盒，其特征在于，包括能够进行时间分辨的荧光微球，信号放大系统，第一蛋白，待测物，第二蛋白和高分子荧光编码微球，其中所述能够进行时间分辨的荧光微球选自时间分辨荧光微球和量子点荧光微球中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的时间分辨流式荧光分析检测试剂盒，其特征在于，所述第一蛋白和第二蛋白分别独立地选自抗体、抗原中的至少一种。
3.如权利要求1所述的时间分辨流式荧光分析检测试剂盒，其特征在于，所述信号放大系统包括链霉亲和素和生物素。
4.如权利要求1所述的时间分辨流式荧光分析检测试剂盒，其特征在于，所述能够进行时间分辨的荧光微球与所述第二蛋白直接或间接相连，优选地，所述能够进行时间分辨的荧光微球通过信号放大系统与所述第一蛋白相连。
5.如权利要求1所述的时间分辨流式荧光分析检测试剂盒，其特征在于，所述高分子荧光编码微球与所述第一蛋白直接或间接相连，优选地，所述高分子荧光编码微球通过信号放大系统与所述第二蛋白相连。
6.如权利要求1所述的时间分辨流式荧光分析检测试剂盒，其特征在于，所述能够进行时间分辨的荧光微球的荧光物质为量子点荧光物质或稀土镧系元素或其螯合物的液体或固体微球，优选为铕、铽、钐之一或其任意组合。
7.如权利要求1-6中任一项所述的时间分辨流式荧光分析检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法的步骤包括，加入待测样本，进行孵育震荡处理，形成高分子荧光编码-第一蛋白+待测物+第二蛋白-能够进行时间分辨的荧光微球的反应多元混合物，用时间分辨流式荧光检测装置进行高通量测试，样本液与鞘液一起输送到流动室，待测液微粒依次通过流动室毛细管检测区域，第一激光器激发，第一激光器荧光检测器通过集光器收集荧光信号，同时第二激光器激发，待短寿命的背景荧光衰变消失后，第二激光器时间分辨荧光检测单元开启通过集光器记录采集荧光信号，采集的信号经数据采集系统分析处理。
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