CN111317739A - 依托红霉素在制备特异性抑制病毒感染的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种可用于特异性抑制三种黄病毒属病毒(寨卡病毒、登革病毒及黄热病病毒)感染的小分子药物及其应用，本发明所述的依托红霉素能够在无毒性范围内有效的抑制三种黄病毒属病毒(寨卡病毒、登革病毒及黄热病病毒)的活性，可制备高效安全的小分子药物，为三种黄病毒属病毒(寨卡病毒、登革病毒及黄热病病毒)感染提供有效的预防和/或治疗药物，以及制备用于三种黄病毒属病毒(寨卡病毒、登革病毒及黄热病病毒)感染相关病症或疾病的药物。

Description

依托红霉素在制备特异性抑制病毒感染的药物中的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及依托红霉素在制药中的新用途，具体涉依托红霉素在制备特异性抑制三种黄病毒属病毒(寨卡病毒、登革病毒及黄热病病毒)感染的小分子药物中的用途。

背景技术

现有技术公开了黄病毒属病毒是一群具有包膜的正向单链RNA病毒,主要包括寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)、登革病毒(dengue virus，DENV)和黄热病病毒(yellow fevervirus，YFV)等多种病毒。这类病毒的结构相似，表面为脂质包膜，内有20面体核衣壳蛋白，其中心含有基因组RNA，它们的基因组长约10kb，能够编码3个结构蛋白(PrM、Env、Capsid)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。

研究显示，黄病毒属病毒主要通过节肢动物传播，它们能在节肢动物体内增殖但不致病，再通过昆虫叮咬传染给人，从而引发疾病。据报道，目前，黄病毒属病毒流行范围广，几乎遍及全球，大多数国家和地区都至少流行一种黄病毒属病毒，给流行地区带来了沉重的经济负担，也给人类的生命健康带来了威胁。

据资料记载，1947年，人们在乌干达寨卡森林的恒河猴中，首次分离得到ZIKV。自此之后的数十年时间内，ZIKV未发生过大流行，只偶尔出现一些人类感染病例，其症状也并不严重。2007年，西太平洋地区首次爆发了ZIKV流行，在密克罗尼西亚的雅浦(Yap)岛出现了ZIKV感染病例。2013年-2014年，ZIKV又多次发生流行，波及多个太平洋岛屿相关地区。2015年底，ZIKV在巴西地区再次爆发，这次流行传播速度快、波及范围广，近百个国家和地区出现了感染病例，也因此引发了全球范围的关注。一般情况下，ZIKV感染属于自限性疾病；机体感染ZIKV后会出现发烧、关节肌肉疼痛、头痛以及结膜炎等症状，在2～7天后可自行好转，但是，通过近期研究的ZIKV流行发现，ZIKV危害极大，除了上述的一般症状，它还能引发各种严重的神经并发症：孕妇感染ZIKV会导致其胎儿发生小头症；成年人感染ZIKV会发生吉兰-巴雷(Guillain-Barre)综合征；另外，近期的研究还发现ZIKV还会损伤男性生殖系统，会导致雄性不育，等。

DENV由伊蚊传播，是引起登革热的病原体。目前在全球流行广泛，尤其是东南亚、西太平洋和中南美洲地区，在我国广东地区也有频繁流行。DENV感染机体后，出现的临床症状轻重不一，一般初次感染症状较轻，包括发热、头痛、淋巴结肿胀以及典型的麻疹样皮疹。再次感染者症状往往比较严重，将会发生危及生命的登革出血热，甚至进展为死亡率极高的休克综合征。

YFV通过伊蚊叮咬传播，感染后可引发急性传染病，黄热病死亡率高、传染性强，YFV在非洲和南美洲持续流行，我国也发现了黄热病输入性病例，YFV感染后，轻者会出现发烧、头痛的症状，经过卧床休息便可恢复，重者会经历感染期、缓解期、中毒期和恢复期，黄热病的病死率也因每次的流行情况而异，可高达30～50％。

黄病毒属病毒流行范围广、危害大，但目前还未见研发出有效的预防和/或治疗措施。YFV虽已有减毒活疫苗上市应用，但其效果和安全性还有待更多的验证，YFV有效的治疗药物也还未见研发出；ZIKV和DENV预防疫苗和治疗药物也未上市。目前，防蚊灭蚊等消灭传播途径的方法是预防黄病毒属病毒传播的主要措施，对症治疗是主要的治疗措施，但疗效并不尽人如意。

基于现有技术的现状，本申请发明人拟研究提供治疗ZIKV、DENV和/或YFV感染的特效药物，尤其是能够为孕妇等ZIKV特殊感染群体提供有效的治疗；同时，还希望能够预防或者治疗DENV和/或YFV感染。

发明内容

本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供依托红霉素在制药中的新用途，具体涉依托红霉素在制备特异性抑制三种黄病毒属病毒(寨卡病毒、登革病毒及黄热病病毒)感染的小分子药物中的用途。本发明所述的依托红霉素能够在无毒性范围内有效的抑制ZIKV、DENV和YFV的活性，可制备高效安全的小分子药物，为ZIKV、DENV和/或YFV感染提供有效的治疗药物。

在第一方面，本发明提供了依托红霉素在制药中的新用途，依托红霉素在制备治疗和/或预防三种黄病毒属病毒(ZIKV、DENV和YFV)感染药物中的用途。

在第二方面，本发明提供了依托红霉素体外抑制寨卡病毒的机制，所述药物作用在病毒进入细胞的前期阶段。

在第三方面，本发明提供了使用有效剂量的依托红霉素抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黄热病病毒感染的方法。

本发明经实验证实，通过使用依托红霉素，三种黄病毒属病毒(ZIKV、DENV和YFV)感染在细胞水平上均被有效地且特异地抑制，所述药物能在动物水平上抑制ZIKV感染。同时，使用BHK21的细胞毒性实验显示，依托红霉素毒性小，是一种安全有效的小分子治疗药物。

如上所述，本发明的目的在于提供一种可以特异性抑制三种黄热病病毒(ZIKV、DENV和YFV)感染的小分子药物。所述的依托红霉素能够在无毒性范围内有效的抑制ZIKV、DENV和YFV的活性，是一种高效安全的小分子药物，为ZIKV、DENV和/或YFV感染提供治疗。

为实现上述目的，本发明人对小分子药物库进行筛选，目的是筛选出能够抑制ZIKV感染的药物。经筛选，结果显示，依托红霉素在一定浓度下可以有效抑制ZIKV感染；另外，除了对ZIKV感染的抑制，依托红霉素还能够有效且特异的抑制DENV和YFV感染。

进一步，本发明研究了依托红霉素对ZIKV毒株SZ01、DENV-2毒株NEW Guinea C和YFV 17D感染BHK21的抑制作用，结果显示，所述药物可以有效抑制上述三种黄热病病毒的活性；依托红霉素抑制ZIKV感染BHK21细胞的半数抑制浓度(IC50)约为2.678μM；抑制DENV-2和YFV的IC50分别约为1.216μM，和3.37μM。

进一步，本发明在细胞水平上研究了依托红霉素对流感病毒V09H1毒株的抑制作用，结果显示，依托红霉素对流感病毒无明显的抑制活性，由此表明依托红霉素对上述三种黄病毒属病毒的抑制作用是特异的。

经实验表明，本发明所述的依托红霉素细胞毒性小，在本发明中，以BHK21细胞为例验证了依托红霉素的细胞毒性，显示所述药物对细胞无明显毒性，其半数毒性浓度(CC50)＞100μM，因此，依托红霉素具有较好的安全性。

基于以上发现，本发明由此达成了本申请要求保护的发明。

在对本发明进行详细描述之前，首先对依托红霉素作简单介绍。

依托红霉素的英文名为erythromycin estolate，其分子式为C52H97NO18S，化学结构式如下所示：

依托红霉素可透过细菌细胞膜，通过抑制蛋白的合成而起抗菌作用，依托红霉素在胃酸中比较稳定，还具有无味、耐酸、高效的特点，依托红霉素对大多数革兰阳性菌、部分革兰阴性菌及一些非典型致病菌有效；此外，依托红霉素还对梅毒螺旋体、肺炎支原体、钩端螺旋体、立克次体、衣原体等也有较好的抑制作用。

本发明提供了使用有效剂量的依托红霉素来抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黄热病病毒感染的方法。

所述方法可以直接在动物体或者人体上实施，用于直接抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黄热病病毒感染，进而实现对上述黄病毒属病毒感染的预防和/或治疗；所述方法也可以在组织或者细胞水平上实施，用于例如进行科学研究之目的；换言之，所述方法可以实施用于预防目的和/或治疗目的，也可以实施用于非预防目的和/或非治疗目的。

在此使用的术语“有效量”是指依托红霉素能够有效地抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黄热病病毒感染的量。本领域技术人员可以根据实验对象、实验目的、给药方式等因素来确定所述有效量。

本发明提供了依托红霉素体外抑制寨卡病毒的机制，所述药物作用在病毒进入细胞的前期阶段。

在一个实施方案中，依托红霉素通过作用在ZIKV进入细胞的前期阶段来抑制病毒感染。

本发明提供了依托红霉素在制备治疗和/或预防三种黄病毒属病毒(ZIKV、DENV和YFV)感染药物中的用途。

在一个实施方案中，所述寨卡病毒感染相关病症或疾病是寨卡病毒感染孕妇引起的胎儿小头症或成年人感染引起的吉兰-巴雷综合征。

在本发明中，所述的用于治疗和/或预防寨卡病毒感染孕妇引起的胎儿小头症时，是指将有效剂量的依托红霉素直接用于寨卡病毒感染的孕妇，从而能够间接地治疗感染孕妇的胎儿患小头症和/或间接地预防胎儿发展成小头症。

小头症的主要表现为头顶部小而尖、头围小；在脑发育完成后，脑的重量明显轻于正常，脑回过小；前额与枕部平坦，前囟提早闭合早；体格发育明显异常，智力发育显著迟缓。小头症的症状程度不一，从轻微到严重不等。引发小头症的原因有许多，其中包括寨卡病毒感染。

吉兰-巴雷综合征是一种自身免疫性周围神经疾病，以周围神经和神经根的脱髓鞘病变及小血管炎性细胞浸润为病变特征，临床表现为急性对称性迟缓性肢体瘫痪。此疾病虽然少见，但后果比较严重；吉兰-巴雷综合征往往在病毒感染后的几天到几周内发生，急性或亚急性起病，常见症状有迟缓性肌肉无力和感觉障碍，严重的情况下会进展为肢体瘫痪；经典型的吉兰-巴雷综合征被称为急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(AIDP)，临床表现为急性对称性弛缓性肢体瘫痪，伴有轻度感觉异常和自主神经功能障碍。

在一个实施方案中，所述登革病毒感染相关病症或疾病是登革热。

如前文所描述，登革热是由DENV感染引起传染病，是由蚊子传播的热带疾病。DENV感染机体后，会有3到14天的潜伏期。DENV感染机体后出现的临床症状轻重不一，一般初次感染症状较轻，包括发热、头痛、淋巴结肿胀以及典型的麻疹样皮疹；再次感染者症状往往比较严重，可能会发生危及生命的登革出血热，甚至进展为死亡率极高的休克综合征，也会出现凶险的低血压休克。

在一个实施方案中，所述黄热病病毒感染相关病症或疾病是黄热病。

如前文所描述，YFV在非洲和南美洲持续流行，我国也发现了黄热病输入性病例。黄热病是由YFV感染引发的急性病，通过伊蚊叮咬传播；黄热病死亡率高、传染性强；YFV感染后，轻者会出现发烧、头痛的症状，经过卧床休息便可恢复；重者会经历感染期、缓解期、中毒期和恢复期。黄热病的病死率也因每次的流行情况而异，可高达30～50％。

在本发明中，实施例的结果表明，依托红霉素能够在细胞水平特异性抑制三种黄病毒属病毒(ZIKV、DENV和YFV)的感染，另外，ZIKV的体内感染能被依托红霉素有效地抑制；细胞毒性实验结果表明，依托红霉素没有明显的细胞毒性；因此，可以使用依托红霉素抑制三种黄热病病毒(ZIKV、DENV和YFV)感染，进而预防和/或治疗病毒感染相关病症或疾病，例如小头症、吉兰-巴雷综合征、登革热或黄热病。

本发明中，依托红霉素与其它药物联合用于制备所述用于抑制三种黄病毒属病毒ZIKV、DENV和YFV感染的药物以及抑制三种黄病毒属病毒ZIKV、DENV和YFV感染相关病症或疾病的药物；

所述其它药物为恩利卡生、7-去氮-2’-C-甲基腺苷、2’-C-甲基腺苷、2’-C-甲基胞苷、2’-C-甲基鸟苷、2’-C-甲基尿苷、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯或氯硝柳胺。

附图说明

图1示出依托红霉素对ZIKV毒株SZ01感染BHK21细胞的抑制；IC50值约为2.678μM。

图2示出依托红霉素对DENV毒株NEW Guinea C感染BHK21细胞的抑制；IC50值约为1.216μM。

图3示出依托红霉素对YFV毒株17D感染BHK21细胞的抑制；IC50值约为3.37μM。

图4示出依托红霉素在体外对流感病毒V09H1的抑制；显示了依托红霉素对该毒株无明显的抑制活性。

图5示出依托红霉素体外抑制ZIKV的机制；显示了依托红霉素通过作用在病毒进入细胞的前期阶段抑制ZIKV感染。

图6示出依托红霉素在体内对A129小鼠感染致死剂量ZIKV的保护效果；显示了依托红霉素对ZIKV具有明显的体内保护作用。

图7示出依托红霉素在体外对BHK21毒性作用，显示了依托红霉素对该细胞无明显的毒性作用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的具体技术方案作进一步清楚和完整的描述。需要理解的是，下文中具体描述的技术方案仅用于示例目的，无意于以任何方式对本发明的保护范围进行限制。在不背离本发明的精神和宗旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。本发明的保护范围由随附的权利要求书来进行限定。

实施例1.依托红霉素在体外对ZIKV、DENV和YFV感染的抑制

(1)用无血清DMEM将依托红霉素进行梯度稀释，药物浓度分别是40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.312Μm和0.156μM；

(2)将ZIKV毒株SZ01、DENV-2和YFV-17D分别与(1)种梯度稀释的依托红霉素混合，并将由此得到的混合液在37℃条件下孵育60分钟；

(3)将ZIKV、DENV-2和YFV病毒与药物混合液加入铺有单层BHK21细胞的96孔板中，每个浓度设置3个重复。将所述96孔板于37℃条件下孵育10小时。之后更换新鲜培养基；

(4)将CCK8试剂稀释成5％的检测液，在阳性组细胞出现明显CPE(致细胞病变效应)时，弃去培养基，将CCK8检测液加入96孔板，100μl每孔。将加入CCK8检测液的96孔板于37℃条件下孵育1.5小时，测每孔的OD450值；

抑制试验结果显示：依托红霉素对ZIKV(图1)、DENV(图2)和YFV(图3)均有明显的抑制效果。

实施例2.依托红霉素在体外对流感病毒V09H1感染的抑制

(1)将MDCK细胞按2*10⁴个/孔接种于96孔板中，在37℃、5％CO2的恒温细胞培养箱中培养至单层；

(2)每孔加入50μl梯度稀释的化合物和50μl 100TCID50的流感病毒液混合后感染细胞，37℃孵育8h；

(3)弃病毒感染液，加入DMEM(含2μg/ml TPCK)空白培养基，200μl/孔，继续培养48h；

(4)结合CCK-8法，通过药物对细胞的保护作用测定药物的抗病毒活性；

抑制试验结果显示：依托红霉素对流感病毒V09H1(图4)无明显的抑制活性；结合实施例1的结果，可以得出如下结论：依托红霉素对上述三种黄病毒属病毒(ZIKV、DENV和YFV)的抑制具有一定的特异性。

实施例3.依托红霉素体外抑制ZIKV感染的机制

(1)将BHK21细胞按2*10⁵/孔接种于24孔板中，在37℃、5％CO2的恒温细胞培养箱中培养至单层；

(2)在不同时间点加入药物：记录ZIKV(MOI＝0.1)加入细胞的时间点为0。病毒感染细胞2h后，去除感染液，换成2％FBS DMEM；

(3)分别在-2h、0h、1h、2h、4h、8h、12h加入依托红霉素，并记录为对应的时间点。上述实验孔记为药物孔，同时设置病毒感染的阳性对照孔(有病毒无药物，即病毒孔)和阴性对照孔(无病毒无药物，即无药物孔)，每组设置3个重复。药物浓度为50μM；

(4)孵育24h后，去除培养液，PBS洗三遍，加Trizol 500μl/孔冰上静置5min，使细胞充分裂解；

(5)将细胞裂解液加入无RNA酶的EP管，再向管中加100μl氯仿，震荡混匀后，冰上静置5min，于4℃预冷的离心机中12000rpm离心15min；轻轻吸出200μl上层无机相，再加入200μl异丙醇，上下轻轻颠倒混匀，冰上静置10min，于4℃预冷的离心机中12000rpm离心15min，可见RNA沉于管底；弃上清，用1ml75％乙醇漂洗RNA沉淀，再次弃上清，加无RNA酶水于每管中，充分溶液RNA；

(6)将得到的RNA样本进行荧光定量PCR检测，检测每孔所含ZIKV RNA拷贝数；

试验结果显示：依托红霉素在细胞感染0h、1h、2h、4h具有明显的抑制效果，而在之后的时间点却几乎没有抑制效果，因此，依托红霉素主要在ZIKV进入细胞的前期阶段发挥抑制作用(图5)。

实施例4.依托红霉素对A129小鼠的保护实验

(1)将1*10⁵PFU ZIKV通过腹腔注射A129(I型干扰素缺陷小鼠，4周)16只。分为2组，8只/组；

(2)一组病毒感染1h后，腹腔注射依托红霉素(50mg/kg)，连续注射7天；另外一组同样腹腔注射对照药物(50mg/kg)，连续注射7天；

(3)对小鼠进行为期21天的观察，记录小鼠状态，计算存活率；

动物保护试验结果显示：依托红霉素能够明显提高小鼠的存活率，有明显的体内保护效果(图6)，统计学方法log-rank(Mantel Cox)分析P＝0.0102。

实施例5.依托红霉素对BHK21细胞的毒性检测

(1)铺板96孔板，每孔BHK21细胞3*10⁴个，过夜培养；

(2)用2％FBS DMEM将依托红霉素进行梯度稀释，浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.13μM、1.56μM、0.78μM和0.39μM；

(3)将上述各浓度的依托红霉素加入过夜培养的BHK21细胞；

(4)在37℃条件下孵育3天，使用CCK8检测依托红霉素对BHK21的毒性，CCK8检测的具体操作参见实施例1；

毒性实验结果显示：依托红霉素对BHK21细胞无明显毒性，其半数毒性浓度CC50＞100μM(图7)。

对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明并不限于上述示例的细节，在不背离本发明的精神和宗旨的情况下，本领域技术人员能够想到本文所描述技术方案的变化方案，并且该变化方案也在本发明的保护范围内。本发明的保护范围由随附权利要求所限定。

另外，应当理解，虽然本说明书通过实施方式对本发明进行了描述，但是并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案。本说明书的这种叙述方案仅为清楚起见，本领域技术人员应当将本说明书当作一个整体，各个实施方式中的技术方案可以适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。

Claims (10)

1.依托红霉素在制备用于抑制三种黄病毒属病毒寨卡病毒ZIKV、登革病毒DENV和/或黄热病病毒YFV感染的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，其中依托红霉素与其它药物联合用于制备所述用于抑制三种黄病毒属病毒ZIKV、DENV和YFV感染的药物。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，其中所述其它药物为恩利卡生、7-去氮-2’-C-甲基腺苷、2’-C-甲基腺苷、2’-C-甲基胞苷、2’-C-甲基鸟苷、2’-C-甲基尿苷、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯或氯硝柳胺。

4.依托红霉素在制备用于治疗和/或预防三种黄病毒属病毒ZIKV、DENV和YFV感染相关病症或疾病的药物中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，其中所述寨卡病毒感染相关病症或疾病是寨卡病毒感染孕妇引起的胎儿小头症或成年人感染引发的吉兰-巴雷综合征。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，其中所述登革病毒感染相关病症或疾病是登革热。

7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，其中所述黄热病病毒感染相关病症或疾病是黄热病。

8.根据权利要求4-7任一项所述的用途，其特征在于，其中依托红霉素与其它药物联合用于制备所述药物。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，其中所述其它药物为恩利卡生、7-去氮

-2’-C-甲基腺苷、2’-C-甲基腺苷、2’-C-甲基胞苷、2’-C-甲基鸟苷、2’-C-甲基尿苷、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯或氯硝柳胺。

10.一种使用有效剂量的依托红霉素抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黄热病病毒感染的方法，其特征在于，其包括，使用有效剂量的依托红霉素直接抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黄热病病毒感染或在组织或者细胞水平上实施抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黄热病病毒感染；

所述的有效剂量是依托红霉素能有效地抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黄热病病毒感染的量。

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