CN111303233B - 一种海参硫酸甾醇的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于活性物质筛选技术领域，具体涉及一种海参硫酸甾醇的制备方法及其应用。将粉末状的干海参样品使用超临界CO₂流体萃取的方法进行提取；其中萃取过程分为静态与动态萃取，萃取的条件为取压强150bar，萃取温度为40℃，加入5％的乙醇夹带剂。本发明通过条件的优化或夹带剂的加入实现了硫酸甾醇从极性相近的其他脂质中分离；将海参样本经过研磨后以细粉的形式进入萃取装置，保证了样品与萃取溶剂的充分接触，因而可以通过静态与动态萃取相结合的方法，既提高萃取回收率也节省了萃取溶剂。以及所制备的硫酸甾醇用于制备改善胆固醇平衡，调控脂代谢的食品或药品的应用。

Description

一种海参硫酸甾醇的制备方法及其应用

技术领域：

本发明属于活性物质筛选技术领域，具体涉及一种海参硫酸甾醇的制备方法及其应用。

背景技术：

胆固醇(Cholesterol)自被发现以来，一直占据着科学家和临床医生的研究领域，其生理和病理意义不容否认。特别是胆固醇水平与动脉粥样硬化和心血管疾病的风险密切相关。高水平的低密度脂蛋白胆固醇和血清胆固醇含量以及低水平的高密度脂蛋白胆固醇含量被视为高脂血症，高胆固醇血症的主要诊断依据，由此可见胆固醇代谢稳态调控的重要意义。胆固醇在体内的合成代谢平衡受到自身以及其结构类似物水平的调节，通过外源物实现体内胆固醇稳态的调控是预防以及治疗胆固醇相关心脑血管疾病对的重要方向。

海参是一种棘皮动物。广泛分布于印度洋、西太平洋海区。我国海参分布在温带区和热带区，主要经济品种是刺参、梅花参等，也是我国最为知名的海参种类。海参具有多种中医特指的补益养生功能，海参体内不但富含氨基酸、维生素和化学元素等人体所需的营养成分，还含有多种生物活性脂质如缩醛磷脂以及神经节苷脂。海参活性物质的药理活性十分广泛。而硫酸甾醇类物质作为海参内的一种特殊脂质，其生物活性的研究还未见报道。

目前对于水产品中的脂质提取更多采用的是传统的溶剂萃取法，如Folch法或乙醇萃取法，类似的脂质提取方法需要使用大量的溶剂进行反复的多梯度萃取，不仅所需时间长，同时也存在着有机溶剂残留导致产品存在毒性的问题，对于有健康活性功能的食品甚至药品的开发不利。超临界流体萃取是一种新型萃取分离技术。它利用超临界流体，即处于温度高于临界温度、压力高于临界压力的热力学状态的流体作为萃取剂。从液体或固体中萃取出特定成分，以达到分离目的。具有高效、不易氧化、纯天然、无化学污染等特点。超临界流体萃取更多应用于食品原料中油料产品的萃取，对于其中特定某种脂质的靶向萃取尚未有所报道。

使用超临界流体萃取提取海参中的硫酸甾醇需要面对以下问题：首先是萃取条件是否符合硫酸甾醇的分离纯化，由于海参中还含有包括甘油酯在内的高丰度中性脂质，易溶于亲脂性的萃取流体中，不易从极性相近的其他脂质中分离。其次是如何提高萃取回收率、节省了萃取溶剂，保证萃取的安全性，也是需要解决的问题。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是在于使用超临界流体萃取提取海参中的硫酸甾醇时存在不易将硫酸甾醇从极性相近的其他脂质中分离，无法保证萃取安全性的问题。

为解决上述问题，本发明提供一种从海参中获得的硫酸甾醇的高效率、无有机试剂残留的提取方法，通过条件的优化或夹带剂的加入才能实现硫酸甾醇从极性相近的其他脂质中分离；将海参样本经过研磨后以细粉的形式进入萃取装置，保证了样品与萃取溶剂的充分接触，因而可以通过静态与动态萃取相结合的方法，既提高萃取回收率也节省了萃取溶剂。以及所制备的硫酸甾醇用于制备改善胆固醇平衡，调控脂代谢的食品或药品的应用。

为达到上述目的，本发明首先提供海参硫酸甾醇，其代表结构式如下，硫酸胆固醇与24-亚甲基硫酸胆固醇是海参硫酸甾醇中丰度最高，最为常见的两个分子种，其他分子种主要区别于其胆固醇结构骨架上不同位置取代的羟基个数与位置。

其制备方法为将粉末状的干海参样品使用超临界CO₂流体萃取的方法进行提取；其中萃取过程分为静态与动态萃取，动态萃取的条件为取压强150bar，萃取温度为40℃，加入5％的乙醇夹带剂。

将海参样本经过研磨后以细粉的形式进入萃取装置，保证了样品与萃取溶剂的充分接触，因而可以通过静态与动态萃取相结合的方法，既提高萃取回收率也节省了萃取溶剂。

相较其他中性脂，海参硫酸甾醇的结构特点在于其胆固醇骨架上可连接有若干羟基，这一特点使其极性比主要的中性脂如三酰基甘油，二酰基甘油大。在超临界流体萃取条件下，萃取溶剂更倾向于溶解极性更小的物质，导致硫酸甾醇提取效率下降也降低了产物的纯度。所以，我们通过萃取条件的优化和采用了5％的乙醇夹带剂，极大的提高了硫酸甾醇提取效率和产物纯度。

进一步的，所述超临界流体CO₂纯度＞95％，夹带剂乙醇纯度＞98％。使用较高纯度的提取溶剂，一方面确保了萃取效率，避免了溶剂不纯导致的成本提高以及污染产物；另一方面保证安全高效的进行萃取。

具体包括以下步骤：

(1)海参样品前处理：称取适量干制海参样品，采用粉碎研磨仪打碎后获得粉末状样品，过筛后取滤过物得到海参细粉；

(2)CO₂超临界流体萃取：将海参细粉样品装入密闭萃取釜内进行超临界CO2流体萃取，萃取条件为萃取压强150bar，萃取温度为40℃，加入5％的乙醇夹带剂。

(3)首先进行15min的静态萃取，然后将CO₂流速调整为8L/h，动态萃取3h后，以硫酸甾醇为主的海参中性脂提取物随CO₂进入50-70℃的分离釜中。由于分离釜内超临界状态的CO2汽化为气态排出，所携带的海参硫酸甾醇提取物在分离釜内收集。

进一步的，步骤(1)中所述的干制海参样品包括冰岛刺参、仿刺参、美国红参、梅花参、海地瓜。

一种海参硫酸甾醇的应用，用于制备调控脂代谢与胆固醇稳态的制品，可以实现治疗高脂血症，调控脂质代谢的效果。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明通过萃取条件的优化和夹带剂的加入解决了所得产物中甘油酯等其他中性脂共萃取导致硫酸甾醇纯度和萃取得率较低的问题。结合静态与动态萃取，提高了萃取的回收率的同时节省了萃取溶剂。

(2)本发明硫酸甾醇的提取方法制备方法效率高、无有机试剂残留，具有高效、不易氧化、纯天然、无化学污染等特点。适用于提取的活性物质作为食品或药品原料的应用途径。

(3)本发明所得活性物质经动物实验证实可明显降低血清胆固醇，低密度脂蛋白胆固醇含量，即具有良好的调控脂代谢、胆固醇稳态的效果，可用于开发安全、有效改善，预防高脂血症、高胆固醇血症的食品或药品，因而可将海参硫酸甾醇作为组分或配料之一用于产品制备。

附图说明：

图1说明海参硫酸甾醇对高胆固醇饮食诱导的高脂血症小鼠体内胆固醇分布以及血脂水平的改善。高胆固醇饮食组相较正常饮食组，其血清甘油三酯、血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量显著上升，阳性药(辛伐他汀)受试组可显著降低上述三个指标，同时上调高密度脂蛋白胆固醇水平。而就硫酸甾醇受试组而言，低剂量灌胃硫酸甾醇组其血脂调控效果不及阳性药组显著，而高剂量受试组其效果则略优于阳性药组。

图中，A：血清总甘油三酯含量；B：血清总胆固醇含量；C：血清高密度脂蛋白胆固醇含量；D：血清低密度脂蛋白胆固醇含量。

具体实施方式：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

首先给出制备海参硫酸甾醇的基础步骤，用于后续的萃取条件优化：

1)海参样品前处理：干制海参采用粉碎研磨仪打碎后的得到海参细粉样品。由于干制海参样本一般硬度较大，需要反复研磨，在打碎过程中注意避免粉碎研磨仪过热导致的仪器损坏以及样品氧化损失。研磨至粉末样品颗粒均一、细腻即可。

2)CO₂超临界流体萃取：将海参细粉样品装入密闭萃取釜内进行超临界CO₂流体萃取，萃取条件为萃取压强150bar，萃取温度为40。萃取温度过低，会降低超临界流体的溶解能力；而萃取温度过高会导致萃取脂质的受热变形，降低萃取得率，浪费物料。首先进行5-45min的静态萃取，将CO₂流速调整为8L/h，动态萃取1.5-4h，以硫酸甾醇为主的海参中性脂提取物随CO₂进入50-70℃的分离釜中。由于分离釜内超临界状态的CO₂汽化为气态排出，所携带的海参硫酸甾醇提取物在分离釜内收集。

超临界流体萃取的具体操作流程为：海参预处理后装入萃取器→萃取釜调整萃取参数→加入超临界流体以及夹带剂→静态萃取→调整参数后进行动态萃取→超临界流体经减压、调温作用在分离釜内与萃取物分离→收集所需硫酸甾醇。

所述的干制海参样品包括冰岛刺参、仿刺参、美国红参、梅花参、海地瓜。

实施例2：

利用夹带剂的加入解决初始萃取条件所得产物纯度低，含量少的问题：

相较其他中性脂，海参硫酸甾醇的结构特点在于其胆固醇骨架上可连接有若干羟基，这一特点使其极性比主要的中性脂如三酰基甘油，二酰基甘油大。在超临界流体萃取条件下，萃取溶剂更倾向于溶解极性更小的物质，导致硫酸甾醇提取效率下降也降低了产物的纯度。选定三个不同水平的夹带剂(2％、5％、10％乙醇)，与不加入夹带剂的萃取条件(静态萃取15min，动态萃取3h)进行产物纯度以及得率的比较。乙醇是一种常见的脂质提取溶剂，更为适用于极性脂的提取，可以有效排除甘油酯等中性脂对产物纯度的干扰。同时，控制其添加量可以有效防止其他更高极性脂质的共萃取，有效提高萃取效率。

利用液质联用仪极性萃取脂质纯度、得率检测：

根据实施例1中的萃取条件，将10g海参细粉加入萃取釜中进行萃取，分离结束后对分离釜内所得物进行称重。后取所得物10mg，复溶于1mL异丙醇/甲醇(1:1,v/v)溶液中，超声波振荡使其完全溶解。利用Q-ToF液质联用仪进行脂质的质谱检测，依据硫酸甾醇含量所占分离釜中所得萃取产物的质量比例，计算得到硫酸甾醇在所得样品中的纯度以及分子种组成。依据硫酸甾醇含量所占海参细粉加入朗的质量比例，计算得到硫酸甾醇甾萃取得率。

液相条件如下：

流动相A：正己烷；流动相B：异丙醇

表1液相梯度条件

在负离子模式下进行质谱检测。质谱采集参数为：喷雾电压-4500V，雾化气压力50psi，吹扫气压力35psi，加热气温度500℃。依据二级质谱中，正离子模式下的m/z96.0096作为特征离子进行定性，同时依据其母离子丰度作为定量指标，得到硫酸甾醇的分子种组成，样品纯度，萃取得率。

条件优化以冰岛刺参样本为例，每组实验进行4次重复，作为平行组。

表2不同夹带剂加入量提高萃取产物得率，纯度的效果

由表2可知，采用5％的夹带剂加入萃取过程可以有效提高硫酸甾醇得率以及纯度，避免其他中性脂的干扰。而过多夹带剂的加入可能会引入非中性脂降低产物纯度。

实施例3：

调整静态与动态萃取时间提高萃取效率与产物纯度：

在静态萃取达到平衡，即硫酸甾醇在当前溶剂环境下达到平衡即可及时进行动态提取从而提高提取效率，也避免了溶剂的浪费。选定了四组静态/动态萃取时间的组合(15min/3h、30min/2h、45min/1.5h)，其他条件同实施例1。每组实验进行4次重复，作为平行组。提取结束后，使用液质联用仪检测萃取得率与产物纯度，结果见表3。

表3不同静态/动态萃取时间提高萃取产物得率，纯度的效果

可见5min的静态萃取时间无法使海参样本中硫酸甾醇在初始溶剂中得到平衡，而较长的动态萃取时间使部分极性较高的脂质也共萃取出来导致产物纯度降低。静态15min/动态3h是最优的萃取条件，产物纯度高，萃取得率可观。

实施例4：

使用最优萃取条件提取多种海参中硫酸甾醇并检测分子种与含量：

选定5％夹带剂，15min静态萃取，3h静态萃取的实验条件，其他参数同实施例1，每种海参各称取10g细粉进行提取，而后称取萃取产物进行液质检测，操作流程同实施例2，每组实验进行4次重复，作为平行组。

表4多种海参中硫酸甾醇分子种组成及含量

采用超临界流体萃取所得的海参硫酸甾醇提取物，不同中海参其分子种组成丰富。在五种海参样品中，冰岛刺参的分子种最多，且含量也最高。

实施例5：

海参硫酸甾醇调控脂代谢以及胆固醇稳态的生物活性作用：

一、材料与方法

1)小鼠的实验分组以及模型的建立

40只雄性C57BL6/J小鼠，SPF级，每只20g±10g，饲养于SPF环境中，室温20±2℃，相对湿度50-60％。适应性饲养一周后，随机分组(每组8只)，分为正常饮食组，高脂模型组，低剂量硫酸甾醇受试组，高剂量硫酸甾醇受试组和阳性对照组。配制正常饲料与高脂高胆固醇饲料，其中正常饮食组喂食正常饲料，而其他组均喂食高脂高胆固醇饲料(1.2％胆固醇、20％猪油与80％基础饲料)，连续喂养8周，建立高脂血症模型组，每周称量体重。

2)受试物的灌胃

小鼠高质高胆固醇喂食造模4周开始，低剂量硫酸甾醇受试组，高剂量硫酸甾醇受试组和阳性对照组分别灌胃20mg/kg/d硫酸甾醇，100mg/kg/d硫酸甾醇和15mg/kg/d辛伐他汀阳性对照药物，连续喂养4周。采用副主动脉采集血液2mL取出血清，放于-80℃贮存。

3)高脂血症小鼠模型生化指标检测

取每组小鼠血清，参照南京建成A110/111/112/113/-1-1血清总甘油三酯/总胆固醇/高密度脂蛋白胆固醇/低密度脂蛋白胆固醇试剂盒说明书要求，应用酶标仪检测小鼠各项血清生化指标。

二、实验结果

如图1所示，四项指标中，正常饮食组均与高脂饮食组有显著性差异证明了小鼠模型建立成功。海参硫酸甾醇对高脂高胆固醇饮食诱导的高脂血症小鼠体内胆固醇分布以及血脂水平具有改善作用，在高低两个计量的硫酸甾醇受试组中，其血清总甘油三酯，总胆固醇相较模型组均有显著性下调。阳性药(辛伐他汀)受试组也可显著降低上述三个指标，同时上调高密度脂蛋白胆固醇水平。尽管低剂量灌胃硫酸甾醇组其血脂调控效果不及阳性药组显著，但高剂量受试组其效果则略优于阳性药组。这是由于海参硫酸甾醇可有效降低血清胆固醇、甘油三酯水平，并且提高高密度脂蛋白胆固醇含量，从而降低小鼠胆固醇排出能力，对体内胆固醇以及脂质代谢具有显著的调控效果。

本发明采用超临界流体CO₂萃取法就制备得到海参硫酸甾醇，解决了常规萃取条件下产物混有其他中性脂的问题。通过调整静态/动态萃取时间，实现了在不过度萃取其他高极性脂的情况下，节省溶剂使用，提高了萃取效率。本发明制备的海参硫酸甾醇分子种丰富，纯度高，经动物实验验证具有调控体内脂质代谢以及胆固醇稳态的作用。本发明制备的海参硫酸甾醇可以作为改善健康作用的食品或药品原料，应用于相关行业。

最后需要说明，以上实施例虽然描述了本发明的具体实施方式，但是并非限制本发明；本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书所限定的。而一切进行修改或等同替换，其均应包含在本发明的保护范围中。

Claims (5)

1.一种海参硫酸甾醇的制备方法，其特征在于：将粉末状的干海参样品使用超临界CO₂流体萃取的方法进行提取；其中萃取过程分为静态与动态萃取，萃取的条件为萃 取压强150bar，萃取温度为40℃，加入5%的乙醇夹带剂；

首先进行15min的静态萃取，然后将CO₂流速调整为8L/h，动态萃取3h后，以硫酸甾醇为主的海参中性脂提取物随CO₂进入50-70℃的分离釜中，在分离釜中得到的产物即海参硫酸甾醇。

2.如权利要求1所述的海参硫酸甾醇的制备方法，其特征在于：所述超临界流体CO2纯度＞95%，夹带剂乙醇纯度＞98%。

3.如权利要求1所述的海参硫酸甾醇的制备方法，其特征在于：将粉末状的干海参样品装入密闭萃取釜内进行超临界CO2流体萃取，萃取条件设为萃取压强150bar，萃取温度为40℃，加入5%的乙醇夹带剂。

4.如权利要求1所述的海参硫酸甾醇的制备方法，其特征在于：粉末状的样品制备步骤为：称取适量干制海参样品，研磨后获得粉末状样品，过筛后取滤过物得到海参细粉备用。

5.如权利要求1所述的海参硫酸甾醇的制备方法，其特征在于：干制海参样品包括冰岛刺参、仿刺参、美国红参、梅花参、海地瓜中的一种或一种以上的混合物。

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