CN111303232B - 一种通过乙酰化反应制备罗汉果苷v的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过乙酰化反应制备罗汉果苷V的方法，是通过对罗汉果提取物中的总甜苷乙酰化—结晶—脱乙酰基，融合了天然产物分离技术和有机半合成技术，打破了行业壁垒，能以更为便捷，成本更低的方式制备高经济价值的罗汉果苷V产品，为罗汉果资源的深度开发提供了新的途径。脱了以往制备高含量罗汉果甜苷V需要复杂工艺和设备的制约，开创了一种工艺简单，无需昂贵复杂的设备，乙酰化和脱乙酰化反应后只需要通过一次大孔吸附树脂，即可获得高品质罗汉果苷V的工艺，能够降低高经济价值罗汉果苷V的生产成本。

Description

一种通过乙酰化反应制备罗汉果苷V的方法

技术领域

本发明涉及罗汉果甜苷及其衍生物，具体涉及乙酰化罗汉果苷V及制备高含量罗汉果苷V的新方法。

背景技术

罗汉果中含有的天然高倍甜味剂——罗汉果甜苷，其甜度为蔗糖的300倍，热量仅为蔗糖的五十分之一，是一种十分理想的天然甜味剂，可作为糖尿病、肥胖等不宜吃糖者的理想替代糖源罗汉果苷V纯度的高低是衡量其甜度和口感的重要指标，高纯度的罗汉果苷V目前在国内外食品、饮料行业备受青睐。

具有清热润肺镇咳、润肠通便之功效，对肥胖、便秘、糖尿病等具有防治作用。罗汉果甜苷作为食品是安全无毒的，在国家强制标准《GB2760食品添加剂使用标准》中规定，罗汉果甜苷可不限量用于各类食品。我国罗汉果甜苷的生产已初具规模，但是目前市场上销售量最多的罗汉果甜苷产品中，罗汉果苷V的含量仅为50％。高含量的罗汉果苷V产品的销量及产量极少，很大程度上是由于生产技术的局限。传统的天然产物工业化分离纯化方法，得到的罗汉果甜苷产品中罗汉果苷V的含量普遍不高。

现有的公开文献显示，要得到罗汉果苷V含量＞90％的产品，往往需要特殊的设备、特殊的树脂、特殊的方法。

CN201910973928.0公开了一种高纯度罗汉果苷V的提取方法，是以罗汉果为原料，经冷冻高温预处理、常温超高压提取、ZTC-II型澄清剂澄清、10微米C18制备柱纯化、浓缩与干燥等步骤，得到高纯度的甜苷V产品。该方法设备昂贵，生产条件极端、苛刻，成本高，处理量小，不适合工业化生产。

CN201410522475.7公开了从罗汉果中提取罗汉果甜甙V的方法，是以罗汉果为原料，经乙醇回流提取、浓缩、大孔树脂吸附、酸液洗脱、调节PH值、上大孔吸附树脂与硅胶作填充物的层析柱、梯度洗脱等步骤，得到高纯度的罗汉果甜甙V。该方法采用的是大孔吸附树脂与硅胶作填充物的层析柱(大孔树脂在上、硅胶在下的形式)，由于两种树脂再生的原理和方式不同，实际生产中无法实现连续生产和再生，不适合工业化生产。

CN201410763087.8公开了一种罗汉果苷V的工业化制备方法，是以罗汉果为原料，经浸提、脱水、溶解、过滤、压缩柱制备色谱系统分离、流动相梯度洗脱等步骤，得到纯度大于95％的罗汉果苷V。该方法依托的是昂贵的制备色谱系统，且处理量极小，无法满足工业化生产需求。

本发明提供了一种高含量罗汉果苷V制备方法，融合天然产物分离技术和有机半合成技术，打破了行业壁垒，为罗汉果资源的深度开发提供了新的途径。生产工艺简单，不需要复杂大型的昂贵设备，不需要购买昂贵的专用树脂和层析柱，生产周期短，最终以高收率，高纯度获得了高品质的罗汉果苷V产品。现有文献尚无乙酰化罗汉果苷V的相关记载，更没有采用乙酰化罗汉果苷V的工艺制备高纯度罗汉果苷V工艺的相关记载。

发明内容

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种过乙酰化反应制备罗汉果苷V的方法，包括以下步骤：罗汉果提取物进行乙酰化反应后，加入乙酰化产物的不良溶剂，用低极性有机溶剂洗涤后，再加入乙酰化产物的良溶剂，在一定条件下使乙酰化罗汉果苷V析出，再进行脱乙酰化反应，纯化即得罗汉果苷V。

所述一定条件是指浓缩至固形物为含量为15％-25％，冷却至0-8℃析晶。

所述低极性有机溶剂为石油醚、乙醚、6#溶剂油、120#溶剂油中的一种或几种，低极性有机溶剂的用量为罗汉果提取物重量的10-20倍(ml/g)。将沉淀物用低极性有机溶剂搅拌分散的目的，一是除去酰化反应中生成的极性较小的杂质，二是除去沉淀物中黏附或包埋的极少量的含氮碱性有机溶剂(因含氮碱性有机溶剂沸点高、难挥发、难干燥，其存在将影响后续低碳醇精制)。

所述乙酰化产物的不良溶剂为冷的弱碱性水溶液；所述乙酰化产物的良溶剂为低碳醇类，酮类，醚类，酯类，卤代烷类溶剂。

进一步的，本发明提供了一种过乙酰化反应制备罗汉果苷V的方法，包括以下步骤：

(1)酰化反应：将罗汉果提取物用含氮碱性有机溶剂溶解，加入乙酰化试剂，保温反应；

(2)酰化反应后处理：将反应液缓慢加入冷的弱碱性水溶液中，析出沉淀，过滤，水洗，沥干，用低极性有机溶剂搅拌分散，过滤，干燥，得到乙酰化罗汉果甜苷的混合物；

(3)乙酰化物精制：将乙酰化罗汉果甜苷的混合物用低碳醇加热溶解，加入吸附剂保温搅拌，趁热过滤，减压浓缩，将浓缩液冷却，搅拌析晶，抽滤，干燥，得乙酰化罗汉果苷V；

(4)脱乙酰基：将乙酰化罗汉果苷V进行脱乙酰基反应；

(5)罗汉果苷V的纯化：将脱乙酰基反应液减压浓缩至无溶剂，用水将浓缩物溶解，过滤，再将滤液通过大孔吸附树脂柱，乙醇解吸，浓缩乙醇解吸液，干燥，得高含量罗汉果苷V。

优选地，步骤(1)中，所述的罗汉果提取物，是以天然罗汉果果实为原料，通过提取、大孔树脂层析、浓缩、干燥步骤，得到的干燥粉末。所述的罗汉果提取物中，其中，罗汉果苷V的质量百分比含量为20-70％，优选为30-60％，各种罗汉果甜苷的质量百分比总含量为25-90％,优选为30-80％。

优选地，步骤(1)中，所述的含氮碱性有机溶剂为吡啶、哌啶、咪唑、甲基咪唑、二甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺、乙二胺、丙二胺、环己胺中的一种或几种。使用含氮碱性有机溶剂溶解罗汉果提取物的目的，一是做为酰化反应的溶剂，二是用做缚酸剂。这样做可以减少使用溶剂的种类，方便回收利用，进一步降低了溶剂循环利用的难度和成本。

所述含氮碱性有机溶剂的体积用量为罗汉果提取物重量的3-10倍(ml/g)，若含氮碱性有机溶剂的用量过少，将无法充分的达到上述目的；若含氮碱性有机溶剂的用量过多，将造成能源和物料的浪费。

优选地，步骤(1)中，所述的乙酰化试剂没有特别的限定，为本领域所熟知，本发明选择乙酸酐，乙酰化试剂的用量为罗汉果提取物重量的2-8倍，优选为3-5倍。

乙酰化的反应时间和温度是本领域技术人员根据乙酰化反应程度筛选出合适的反应时间和温度。具体地，步骤(1)中，所述保温反应的温度为30-80℃，所述反应的时间为2-12小时。

优选地，步骤(2)中，所述冷的弱碱性水溶液的温度为0-5℃，所述弱碱性水溶液可选自饱和碳酸钠，饱和碳酸氢钠，饱和碳酸钾，饱和碳酸氢钾中的至少一种，弱碱性水溶液用量为罗汉果提取物重量的40-100倍(ml/g)。

优选地，步骤(2)中，所述低极性有机溶剂为石油醚、乙醚、6#溶剂油、120#溶剂油中的一种或几种，低极性有机溶剂的用量为罗汉果提取物重量的10-20倍(ml/g)。将沉淀物用低极性有机溶剂搅拌分散的目的，一是除去酰化反应中生成的极性较小的杂质，二是除去沉淀物中黏附或包埋的极少量的含氮碱性有机溶剂(因含氮碱性有机溶剂沸点高、难挥发、难干燥，其存在将影响后续低碳醇精制)。

优选地，步骤(3)中，所述低碳醇为碳原子1-4的醇类，具体选自甲醇、乙醇和异丙醇中的至少一种；所述低碳醇的用量为乙酰化罗汉果甜苷混合物重量的10-20倍(ml/g)。

优选地，步骤(3)中，所述吸附剂为活性炭。

优选地，步骤(3)中，所述的浓缩液中的固形物含量为15％-25％，所述冷却的温度为0-8℃；可选地，所述搅拌的速度为10-20r/min，所述析晶的时间为12-24小时。

发明人通过大量的实践，发现将步骤(3)中的浓缩，析晶的条件控制在上述范围内，特别是浓缩的固形物含量以及冷却析晶的温度，能够极大降低其他乙酰化罗汉果甜苷的含量，同时最大限度保证了乙酰化罗汉果甜苷V的收率和纯度，从而同时保证了最终罗汉果甜苷V的收率和纯度。

优选地，步骤(4)中，所述脱乙酰化反应是在醇溶剂中加入脱乙酰化催化剂，进行保温反应。所述醇溶剂为无水甲醇或无水乙醇，醇溶剂用量为乙酰化罗汉果苷V精品重量的10-20倍(ml/g)；所述催化剂为甲醇钠或甲醇钡，催化剂的用量为乙酰化罗汉果苷V精品重量的0.01-0.1倍；所述保温反应的温度为20-60℃，所述反应的时间为0.5-4小时。

优选地，步骤(5)中，所述大孔树脂为D101、AB-8、LX-11、LX-60、LX-28、LX-38。使用大孔树脂吸附的目的是利用大孔树脂只吸附罗汉果苷V、不吸附盐的特性，除去脱乙酰基反应产物中的盐，最终得到高含量的罗汉果苷V。

本发明的有益效果：

1、本发明提供了一种全新的罗汉果甜苷V的制备方法，是通过对罗汉果提取物中的总甜苷乙酰化—结晶—脱乙酰基，融合了天然产物分离技术和有机半合成技术，打破了行业壁垒，能以更为便捷，成本更低的方式制备高经济价值的罗汉果苷V产品，为罗汉果资源的深度开发提供了新的途径。

2、本发明提供的罗汉果甜苷V的制备方法摆脱了以往制备高含量罗汉果甜苷V需要复杂工艺和设备的制约，开创了一种工艺简单，无需昂贵复杂的设备，乙酰化和脱乙酰化反应后只需要通过一次大孔吸附树脂，即可获得高品质罗汉果苷V的工艺，能够降低高经济价值罗汉果苷V的生产成本。

3、本发明方法得到的罗汉果苷V含量可高达98％以上，优选实施例可以达到99.5％以上；在出口欧美日韩的高端市场占有优势；此外，本发明方法制备罗汉果苷V收率在90％以上，优选实施例高达93％以上，生产单位质量纯度95％以上的高品质罗汉果苷V的生产成本大约可以降低50％，在生产成本上也具有同样的优势。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的罗汉果提取物购于湖南华诚生物资源股份有限公司，罗汉果提取物中罗汉果苷V的含量为51.65％，罗汉果甜苷总含量为75.20％；本发明实施例所使用的辅料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

本发明实施例中，采用高效液相色谱(HPLC)外标法检测罗汉果甜苷和罗汉果苷V的含量。

实施例1

(1)酰化反应：取罗汉果提取物50g，用250ml吡啶室温搅拌溶解，缓慢加入200g乙酸酐，在温度为35℃条件下保温反应10小时至反应结束，得到乙酰化反应液；

(2)酰化反应后处理：将乙酰化反应液缓慢加入5000ml温度为5℃冷的饱和碳酸氢钠水溶液中，析出大量沉淀物，将沉淀物滤出，先用水洗至中性，沥干水分，再用600ml石油醚搅拌分散，过滤，干燥，得到乙酰化罗汉果甜苷的混合物69.2g。

(3)乙酰化物精制：将乙酰化罗汉果甜苷的混合物用700ml甲醇加热溶解，加入活性炭保温搅拌，趁热过滤，将滤液减压浓缩至固形物含量为15％，得到浓缩液。将浓缩液冷却至温度8℃，以15r/min的搅拌速度，析晶20小时，抽滤，干燥，得乙酰化罗汉果苷V精品64.3g。

(4)脱乙酰基：将乙酰化罗汉果苷V精品用650ml无水甲醇溶解，加入1g甲醇钠，在温度为30℃条件下保温反应2小时至反应结束，得到脱乙酰基反应液；

(5)罗汉果苷V的纯化：将脱乙酰基反应液减压浓缩至无溶剂，用水将浓缩物溶解，过滤，再将滤液通过D101大孔吸附树脂柱，乙醇解吸，浓缩乙醇解吸液，干燥，得高含量罗汉果苷V 24.09g。

经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得高含量罗汉果苷V的含量为99.70％，罗汉果苷V的收率为93.0％。

实施例2

(1)酰化反应：取罗汉果提取物50g，用300ml哌啶室温搅拌溶解，缓慢加入180g乙酸酐，在温度为60℃条件下保温反应6小时至反应结束，得到乙酰化反应液；

(2)酰化反应后处理：将乙酰化反应液缓慢加入4500ml温度为0℃冷的饱和碳酸氢钠水溶液中，析出大量沉淀物，将沉淀物滤出，先用水洗至中性，沥干水分，再用500ml乙醚搅拌分散，过滤，干燥，得到乙酰化罗汉果甜苷的混合物72.5g。

(3)乙酰化物精制：将乙酰化罗汉果甜苷的混合物用1000ml乙醇加热溶解，加入活性炭保温搅拌，趁热过滤，将滤液减压浓缩至固形物含量为25％，得到浓缩液。将浓缩液冷却至温度0℃，以20r/min的搅拌速度，析晶16小时，抽滤，干燥，得乙酰化罗汉果苷V精品65.5g。

(4)脱乙酰基：将乙酰化罗汉果苷V精品用700ml无水甲醇溶解，加入1.2g甲醇钠，在温度为40℃条件下保温反应1.5小时至反应结束，得到脱乙酰基反应液；

(5)罗汉果苷V的纯化：将脱乙酰基反应液减压浓缩至无溶剂，用水将浓缩物溶解，过滤，再将滤液通过LX-28大孔吸附树脂柱，乙醇解吸，浓缩乙醇解吸液，干燥，得高含量罗汉果苷V 24.34g。

经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得高含量罗汉果苷V的含量为99.52％，罗汉果苷V的收率为93.8％。

实施例3

(1)酰化反应：取罗汉果提取物50g，用300ml咪唑室温搅拌溶解，缓慢加入220g乙酸酐，在温度为50℃条件下保温反应4小时至反应结束，得到乙酰化反应液；

(2)酰化反应后处理：将乙酰化反应液缓慢加入4000ml温度为0℃冷的饱和碳酸氢钠水溶液中，析出大量沉淀物，将沉淀物滤出，先用水洗至中性，沥干水分，再用750ml6#溶剂油搅拌分散，过滤，干燥，得到乙酰化罗汉果甜苷的混合物71.7g。

(3)乙酰化物精制：将乙酰化罗汉果甜苷的混合物用800ml甲醇加热溶解，加入活性炭保温搅拌，趁热过滤，将滤液减压浓缩至固形物含量为20％，得到浓缩液。将浓缩液冷却至温度3℃，以10r/min的搅拌速度，析晶20小时，抽滤，干燥，得乙酰化罗汉果苷V精品63.8g。

(4)脱乙酰基：将乙酰化罗汉果苷V精品用700ml无水甲醇溶解，加入1.5g甲醇钡，在温度为50℃条件下保温反应2小时至反应结束，得到脱乙酰基反应液；

(5)罗汉果苷V的纯化：将脱乙酰基反应液减压浓缩至无溶剂，用水将浓缩物溶解，过滤，再将滤液通过AB-8大孔吸附树脂柱，乙醇解吸，浓缩乙醇解吸液，干燥，得高含量罗汉果苷V 24.60g。

经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得高含量罗汉果苷V的含量为98.83％，罗汉果苷V的收率为94.1％。

实施例4

其他步骤和条件和实施例3相同，区别在于步骤(3)中，将滤液减压浓缩至固形物含量改为10％，最终获得24.01g罗汉果苷V产品，经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，产品中罗汉果苷V含量为98.75％，罗汉果苷V的收率为91.8％。

实施例5

其他步骤和条件和实施例3相同，区别在于步骤(3)中，将滤液减压浓缩至固形物含量改为30％，最终获得25.06g罗汉果苷V产品，经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，产品中罗汉果苷V的含量为94.91％，罗汉果苷V的收率为92.1％。

实施例6

其他步骤和条件和实施例3相同，区别在于步骤(3)中，将浓缩液冷却至温度改为10℃，最终获得24.73g罗汉果苷V产品，经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，产品中罗汉果苷V的含量为97.74％，罗汉果苷V的收率为93.6％。

实施例7

其他步骤和条件和实施例3相同，区别在于步骤(3)中，将搅拌速度改为5r/min，最终获得24.13g罗汉果苷V产品，经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，产品中罗汉果苷V的含量为98.25％，罗汉果苷V的收率为91.8％。

实施例8

其他步骤和条件和实施例3相同，区别在于步骤(3)中，将搅拌速度改为30r/min，最终获得25.16g罗汉果苷V产品，经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，产品中罗汉果苷V的含量为94.85％，罗汉果苷V的收率为92.4％。

Claims (7)

1.一种过乙酰化反应制备罗汉果苷V的方法，包括以下步骤：

（1）酰化反应：将罗汉果提取物用含氮碱性有机溶剂溶解，加入乙酰化试剂，保温反应；

（2）酰化反应后处理：将反应液缓慢加入冷的弱碱性水溶液中，析出沉淀，过滤，水洗，沥干，用低极性有机溶剂搅拌分散，所述低极性有机溶剂为石油醚、乙醚、6#溶剂油、120#溶剂油中的一种或几种，低极性有机溶剂的用量为罗汉果提取物重量的10-20倍，ml/g 过滤，干燥，得到乙酰化罗汉果甜苷的混合物，所述冷的弱碱性水溶液的温度为0-5℃，所述弱碱性水溶液选自饱和碳酸钠，饱和碳酸氢钠，饱和碳酸钾，饱和碳酸氢钾中的至少一种，弱碱性水溶液用量为罗汉果提取物重量的40-100倍，ml/g；所述低极性有机溶剂为石油醚、乙醚、6#溶剂油、120#溶剂油中的一种或几种，低极性有机溶剂的用量为罗汉果提取物重量的10-20倍，ml/g ；

（3）乙酰化物精制：将乙酰化罗汉果甜苷的混合物用低碳醇加热溶解，加入吸附剂保温搅拌，趁热过滤，减压浓缩，将浓缩液冷却，搅拌析晶，抽滤，干燥，得乙酰化罗汉果苷V，所述低碳醇为碳原子1-4的醇类，所述浓缩液中的固形物的含量为15%-25%，所述冷却的温度是0-8℃；

（4）脱乙酰基：将乙酰化罗汉果苷V进行脱乙酰基反应；所述脱乙酰化反应是在醇溶剂加入脱乙酰化催化剂，进行保温反应，所述醇溶剂为无水甲醇或无水乙醇，醇溶剂用量为乙酰化罗汉果苷V精品重量的10-20倍，单位ml/g，所述催化剂为甲醇钠或甲醇钡，催化剂用量为乙酰化罗汉果苷V精品重量的0.01-0.1倍，所述保温反应温度为20-60℃，所述反应的时间为0.5-4小时；

（5）罗汉果苷V的纯化：将脱乙酰基反应液减压浓缩至无溶剂，用水将浓缩物溶解，过滤，再将滤液通过大孔吸附树脂柱，乙醇解吸，浓缩乙醇解吸液，干燥，得高含量罗汉果苷V。

2.如权利要求1所述的制备罗汉果苷V的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的罗汉果提取物中，罗汉果苷V的质量百分比含量为20-70%，各种罗汉果甜苷的质量百分比总含量为25-90%。

3.如权利要求2所述的制备罗汉果苷V的方法，其特征在于，所述的罗汉果提取物中，罗汉果苷V的质量百分比含量为30-60%；各种罗汉果甜苷的质量百分比总含量为30-80%。

4.如权利要求1所述的制备罗汉果苷V的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的含氮碱性有机溶剂为吡啶、哌啶、咪唑、甲基咪唑、二甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺、乙二胺、丙二胺、环己胺中的一种或几种。

5.如权利要求4所述的制备罗汉果苷V的方法，其特征在于，步骤（1）中,所述含氮碱性有机溶剂的体积用量为罗汉果提取物重量的3-10倍，ml/g;所述的乙酰化试剂为乙酸酐，乙酰化试剂的用量为罗汉果提取物重量的2-8倍。

6.如权利要求5所述的制备罗汉果苷V的方法，其特征在于，乙酰化试剂的用量为罗汉果提取物重量的3-5倍。

7.如权利要求1所述的制备罗汉果苷V的方法，其特征在于，所述脱乙酰化反应是在醇溶剂中加入脱乙酰化催化剂，进行保温反应。