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CN111304226A - 一种编码cyp1b1基因突变体的核酸及其应用 - Google Patents

一种编码cyp1b1基因突变体的核酸及其应用 Download PDF

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CN111304226A
CN111304226A CN201911146937.9A CN201911146937A CN111304226A CN 111304226 A CN111304226 A CN 111304226A CN 201911146937 A CN201911146937 A CN 201911146937A CN 111304226 A CN111304226 A CN 111304226A
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nucleic acid
congenital glaucoma
primary congenital
mutant
cyp1b1
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王开宇
赵烨
陈志伟
刘毅
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Fuzhou Furui Medical Laboratory Co ltd
Original Assignee
Fuzhou Furui Medical Laboratory Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种编码CYP1B1基因突变体的核酸及其应用，属于基因工程技术领域。该突变体与野生型相比，具有c.605C>T突变，其编码的多肽的氨基酸序列具有p.Ala202Val突变。通过检测该新突变体是否存在，可有效筛选出易患原发性先天性青光眼的生物样品；本发明的检测方法快速、准确、高效；本发明可用于原发性先天性青光眼患者的分子诊断和鉴别诊断，为原发性先天性青光眼患者的早期诊断、早期治疗提供科学依据；本发明可用于筛查原发性先天性青光眼携带者，可以为携带者提供遗传咨询建议和指导，降低后代患原发性先天性青光眼的几率。

Description

一种编码CYP1B1基因突变体的核酸及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码CYP1B1基因突变体的核酸及其应用。具体地，本发明涉及分离的编码CYP1B1突变体的核酸、分离的CYP1B1突变体多肽、筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品的方法。
背景技术
原发性先天性青光眼是严重的少见的婴幼儿致盲眼病，是儿童青光眼中最常见的类型。原发性先天性青光眼发病率存在明显的种族和地域差异，其中欧洲国家总发病率为1:10000，印第安人群为1:3300，中东沙特阿拉伯约为1:2500。我国原发性先天性青光眼的发病率尚无准确的统计数字，根据已有报道先天性青光眼占儿童青光眼住院患者的40％左右。原发性先天性青光眼严重危害患者的视力和视觉发育，如不能早期诊断、及早治疗和干预，致盲率可达到100％。
原发性先天性青光眼通常由CYP1B1、LTBP2、TEK基因突变引起，其中CYP1B1基因致病突变在原发性先天性青光眼患者中检出率最高。CYP1B1基因编码的蛋白酶是细胞色素P450酶家族成员之一，可参与人体的许多生物学过程，例如药物代谢、脂质产生等。CYP1B1酶在许多组织中都有活性，包括眼等。CYP1B1酶在眼部发育中的功能尚不清楚，但它可能在眼前节结构形成中发挥作用，也可能参与调节眼内液体分泌的过程。CYP1B1基因的常染色体隐性致病突变可导致原发性先天性青光眼。而携带一个CYP1B1基因杂合致病突变的个体虽然往往无明显临床症状，但可把致病变异遗传给后代。由于原发性先天性青光眼非常罕见，因此中国人原发性先天性青光眼的报道十分有限，具有诊断价值的致病位点较少。
因而，目前原发性先天性青光眼的致病基因的确定以及原发性先天性青光眼的检测方法仍有待深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CYP1B1基因突变体，并提出一种能够有效筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品的方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
根据原发性先天性青光眼医学研究领域的最新进展，利用第二代测序法分析原发性先天性青光眼相关基因已在原发性先天性青光眼患者分子诊断，发现新致病基因和致病变异研究中得到初步应用。第二代测序利用设计的DNA序列探针将目标基因区域捕获下来，然后针对每个外显子进行深度测序。利用该技术流程寻找原发性先天性青光眼致病基因的研究已成研究热点。Hadrami等(Hadrami M,Bonnet C,Zeitz C,et al.Mutation profileof glaucoma candidate genes in Mauritanian families with primary congenitalglaucoma.Mol Vis.2019Jul13；25:373-381.)利用第二代测序技术对4个原发性先天性青光眼家系进行基因包检测，发现1个家系携带CYP1B1基因的新致病突变。由此可见，第二代测序技术正在推动原发性先天性青光眼诊断及其机制研究的迅速发展。
因而，发明人针对一个原发性先天性青光眼患者，采用26基因的原发性先天性青光眼基因包，通过目标区域捕获的高通量第二代测序技术，最终确定了原发性先天性青光眼的一个新的致病突变位点——CYP1B1基因的c.605C>T突变。
发明人一方面提出了一种分离的编码CYP1B1突变体的核酸。所述核酸的基因序列与SEQ ID NO:1相比，具有c.605C>T突变。该突变体与原发性先天性青光眼的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物体是否易患原发性先天性青光眼。
另一方面提出了一种所述CYP1B1基因突变体的检测试剂盒，及其在筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品中的应用。所述的检测试剂盒包括适于检测与SEQ ID NO:1相比具有c.605C>T突变的CYP1B1基因突变体的试剂。所述试剂包括具有如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示的核苷酸序列的特异性引物。
所述的试剂盒用于筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品的方法，该方法利用适于检测与SEQ ID NO:1相比具有c.605C>T突变的CYP1B1基因突变体的试剂，检测生物样品是否存在CYP1B1基因突变，从而筛选出易患原发性先天性青光眼的生物样品。具体包括以下步骤：
(1)从生物样品提取核酸样本，所述的生物样品是指来源于人体的各类样品，包括但不限于血液、唾液、组织、毛发或口腔黏膜。所述生物样品可用于分离获得所述编码CYP1B1基因突变体核酸，或者是通过反转录反应获得cDNA样本以构成所述核酸样本；
(2)利用CYP1B1基因的特异性的引物或探针，对核酸样本进行PCR扩增，针对所得的扩增产物构建核酸测序文库并进行测序；所述CYP1B1基因的特异性的引物或探针，具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
(3)将测序核苷酸图谱与人参考基因组序列比对，发现CYP1B1基因编码区的第605位碱基由C突变为T，该变异导致编码序列第202位密码子由丙氨酸变为缬氨酸，即发生p.Ala202Val改变。
发明人发现CYP1B1基因的SEQ ID NO:1所示序列中的1个新致病突变位点，即编码序列的第605位碱基由C突变为T，导致编码序列第202位密码子由丙氨酸变为缬氨酸。基于此，本发明提供了CYP1B1基因突变的检测方法。通过该方法能够筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品。
其中，所述的核酸包括DNA、RNA或cDNA。
第三方面提出了一种分离的CYP1B1突变体多肽，所述多肽是由编码CYP1B1突变体的核酸编码的，与SEQ ID NO:2相比，其氨基酸序列具有p.Ala202Val突变。
第四方面提出了一种利用分离的CYP1B1基因突变体多肽筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品的方法。通过检测生物样品中野生型CYP1B1基因编码的多肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)，可以作为生物体是否患原发性先天性青光眼的辅助判断方法。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
(1)本发明快速、准确、高效、简便，能够有效筛选出易患原发性先天性青光眼的生物样品。
(2)本发明可用于原发性先天性青光眼患者的分子诊断和鉴别诊断，为原发性先天性青光眼患者的早期诊断、早期治疗提供科学依据。
(3)本发明可用于筛查原发性先天性青光眼携带者，可以为携带者提供遗传咨询建议和指导，降低后代患原发性先天性青光眼的几率。
附图说明
图1为具体实施方式所述的原发性先天性青光眼患者的家系图谱，图中箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，半实心图标表示为携带者；
图2为具体实施方式所述的含突变位点的患者的正向引物测序图，图中箭头所示为基因突变位点。
具体实施方式
CYP1B1基因突变体
第一方面，本发明提出了一种分离的编码CYP1B1突变体的核酸。根据实施例，与SEQ ID NO:1相比，所述核酸具有c.605C>T突变。在本发明中所使用的表达方式“编码CYP1B1基因突变体的核酸”，是指与编码CYP1B1基因突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与CYP1B1基因突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据实施例，所述的编码CYP1B1基因突变体的核酸为DNA。
根据实施例，发明人确定了CYP1B1基因的新突变体，该突变体与原发性先天性青光眼的发病密切相关，从而通过检测上述突变体在生物样品中是否存在，可以达到有效地预测生物体是否易患原发性先天性青光眼的目的。
对于本发明中提及的核酸，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本发明中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。本领域技术人员可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
编码CYP1B1基因突变体的核酸，是发明人通过外显子组测序分析联合Sanger测序验证的方法确定的原发性先天性青光眼致病基因上的新致病突变。该致病突变位点为新的，在现有技术中并未被提到。
其中，野生型CYP1B1基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列：
ATGGGCACCAGCCTCAGCCCGAACGACCCTTGGCCGCTAAACCCGCTGTCCATCCAGCAGACCACGCTCCTGCTACTCCTGTCGGTGCTGGCCACTGTGCATGTGGGCCAGCGGCTGCTGAGGCAACGGAGGCGGCAGCTCCGGTCCGCGCCCCCGGGCCCGTTTGCGTGGCCACTGATCGGAAACGCGGCGGCGGTGGGCCAGGCGGCTCACCTCTCGTTCGCTCGCCTGGCGCGGCGCTACGGCGACGTTTTCCAGATCCGCCTGGGCAGCTGCCCCATAGTGGTGCTGAATGGCGAGCGCGCCATCCACCAGGCCCTGGTGCAGCAGGGCTCGGCCTTCGCCGACCGGCCGGCCTTCGCCTCCTTCCGTGTGGTGTCCGGCGGCCGCAGCATGGCTTTCGGCCACTACTCGGAGCACTGGAAGGTGCAGCGGCGCGCAGCCCACAGCATGATGCGCAACTTCTTCACGCGCCAGCCGCGCAGCCGCCAAGTCCTCGAGGGCCACGTGCTGAGCGAGGCGCGCGAGCTGGTGGCGCTGCTGGTGCGCGGCAGCGCGGACGGCGCCTTCCTCGACCCGAGGCCGCTGACCGTCGTGGCCGTGGCCAACGTCATGAGTGCCGTGTGTTTCGGCTGCCGCTACAGCCACGACGACCCCGAGTTCCGTGAGCTGCTCAGCCACAACGAAGAGTTCGGGCGCACGGTGGGCGCGGGCAGCCTGGTGGACGTGATGCCCTGGCTGCAGTACTTCCCCAACCCGGTGCGCACCGTTTTCCGCGAATTCGAGCAGCTCAACCGCAACTTCAGCAACTTCATCCTGGACAAGTTCTTGAGGCACTGCGAAAGCCTTCGGCCCGGGGCCGCCCCCCGCGACATGATGGACGCCTTTATCCTCTCTGCGGAAAAGAAGGCGGCCGGGGACTCGCACGGTGGTGGCGCGCGGCTGGATTTGGAGAACGTACCGGCCACTATCACTGACATCTTCGGCGCCAGCCAGGACACCCTGTCCACCGCGCTGCAGTGGCTGCTCCTCCTCTTCACCAGGTATCCTGATGTGCAGACTCGAGTGCAGGCAGAATTGGATCAGGTCGTGGGGAGGGACCGTCTGCCTTGTATGGGTGACCAGCCCAACCTGCCCTATGTCCTGGCCTTCCTTTATGAAGCCATGCGCTTCTCCAGCTTTGTGCCTGTCACTATTCCTCATGCCACCACTGCCAACACCTCTGTCTTGGGCTACCACATTCCCAAGGACACTGTGGTTTTTGTCAACCAGTGGTCTGTGAATCATGACCCACTGAAGTGGCCTAACCCGGAGAACTTTGATCCAGCTCGATTCTTGGACAAGGATGGCCTCATCAACAAGGACCTGACCAGCAGAGTGATGATTTTTTCAGTGGGCAAAAGGCGGTGCATTGGCGAAGAACTTTCTAAGATGCAGCTTTTTCTCTTCATCTCCATCCTGGCTCACCAGTGCGATTTCAGGGCCAACCCAAATGAGCCTGCGAAAATGAATTTCAGTTATGGTCTAACCATTAAACCCAAGTCATTTAAAGTCAATGTCACTCTCAGAGAGTCCATGGAGCTCCTTGATAGTGCTGTCCAAAATTTACAAGCCAAGGAAACTTGCCAATAA(SEQ ID NO:1)。
其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：
MGTSLSPNDPWPLNPLSIQQTTLLLLLSVLATVHVGQRLLRQRRRQLRSAPPGPFAWPLIGNAAAVGQAAHLSFARLARRYGDVFQIRLGSCPIVVLNGERAIHQALVQQGSAFADRPAFASFRVVSGGRSMAFGHYSEHWKVQRRAAHSMMRNFFTRQPRSRQVLEGHVLSEARELVALLVRGSADGAFLDPRPLTVVAVANVMSAVCFGCRYSHDDPEFRELLSHNEEFGRTVGAGSLVDVMPWLQYFPNPVRTVFREFEQLNRNFSNFILDKFLRHCESLRPGAAPRDMMDAFILSAEKKAAGDSHGGGARLDLENVPATITDIFGASQDTLSTALQWLLLLFTRYPDVQTRVQAELDQVVGRDRLPCMGDQPNLPYVLAFLYEAMRFSSFVPVTIPHATTANTSVLGYHIPKDTVVFVNQWSVNHDPLKWPNPENFDPARFLDKDGLINKDLTSRVMIFSVGKRRCIGEELSKMQLFLFISILAHQCDFRANPNEPAKMNFSYGLTIKPKSFKVNVTLRESMELLDSAVQNLQAKETCQ(SEQ ID NO:2)。
与野生型CYP1B1基因的SEQ ID NO:1所示序列相比，发明人发现的CYP1B1基因新突变体具有c.605C>T突变，即CYP1B1基因突变体的cDNA中第605位碱基由C突变为T，由此，其所编码的产物与野生型CYP1B1(SEQ ID NO:2)相比，具有p.Ala202Val突变，即编码序列第202位密码子由丙氨酸变为缬氨酸。
发明人首次提出CYP1B1基因的c.605C>T杂合突变导致患者出现原发性先天性青光眼的症状，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可达到有效地预测生物体是否易感原发性先天性青光眼的目的。
第二方面，发明人根据获得的突变基因提出了一种分离的多肽。根据实施例，与野生型CYP1B1相比，所述分离的多肽具有p.Ala202Val突变。该多肽是由前述分离的编码CYP1B1基因突变体的核酸编码的。
筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品的方法
第三方面，本发明提供了检测编码CYP1B1基因突变体的核酸的试剂盒，以及筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品的方法。所述的试剂盒包括适用于检测CYP1B1基因突变体的试剂，所述CYP1B1基因突变体为与SEQ ID NO:1所示序列相比，具有c.605C>T突变。所述的试剂包括特异性引物，引物具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。通过筛选具有所述CYP1B1突变体的生物样品，能够有效地筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品。
根据实施例，该筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品的方法包括以下实施步骤：
第一，从所述生物样品提取核酸样本。生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品CYP1B1基因是否存在突变的核酸样本即可。所述的生物样品包括但不限于血液、唾液、组织、毛发或口腔黏膜。所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中CYP1B1基因是否存在突变的样本，包括但不限于从生物样品中提取的基因组DNA、总RNA和mRNA。根据实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品的效率。
第二，确定所述核酸样本的核酸序列。确定所述核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。可采用但不限于核酸测序的方法确定核酸样本的核酸序列，并且核酸测序的方法和设备并不受特别限制。可采用第二代测序技术，也可以采用第一代、第三代等各种性能的测序技术。根据实施例，采用第二代测序技术确定核酸样本的核酸序列的步骤还包括：针对核酸样本，构建测序文库，利用测序设备对测序文库进行测序，达到获得包含CYP1B1基因信息的测序结果。所述测序设备包括但不限于Novaseq系列、Hiseq系列、Nexeseq系列、BGIseq系列第二代核酸测序仪。所述的构建测序文库的试剂和方法包括但不限于Nextera、TruSeq、Yeasen，具体流程可参见厂家说明书，本领域技术人员可以根据不同的测序平台进行适当选择。根据实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集CYP1B1基因外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据实施例，设计并合成特异性扩增CYP1B1基因外显子区域的引物，利用所述引物扩增基因组DNA样本，利用扩增产物构建核酸测序文库。所述利用CYP1B1基因外显子特异性引物进行PCR扩增的方法，可有效提高筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品的效率。
根据实施例，CYP1B1基因外显子特异性引物不受特别限制，针对c.605C>T突变，发明人进行了优选设计，所述CYP1B1基因特异性引物具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：
上游引物F：ATTTCTCCAGAGAGTCAGCTCCG(SEQ ID NO:3)
下游引物R：GCCTCAAGAACTTGTCCAGGATG(SEQ ID NO:4)
需要说明的是，这里所使用的术语“核酸序列”泛指所有包含CYP1B1基因编码信息的核酸序列和信息数据，包括但不限于测序直接获得的核酸序列信息、测序数据进行组装后得到的完整的核酸序列信息、测序设备产生的原始测序数据(reads)、测序数据经计算机处理后的数据信息(Bam文件等)。
第三，所述核酸序列与基因组参考序列的比对。具体地，基于核酸样本的核酸序列或其互补序列与SEQ ID NO:1相比，如具有c.605C>T突变，则提示生物体易患原发性先天性青光眼。核酸序列与SEQ ID NO:1进行比对的方法并不受特别限制，可以采用人工比对，也可以给予任意计算机软件，根据实施例，可以采用Novocraft公司的NovoAlign软件比对。
需要说明的是，本发明采用第二代测序技术，针对一个原发性先天性青光眼患者进行26个与原发性先天性青光眼相关基因的外显子测序分析，并联合Sanger测序对患者本人及其父母进行验证，最终发现了原发性先天性青光眼的一个新突变位点——CYP1B1基因的c.605C>T突变。与第一代测序技术、经典的连锁分析策略相比，高通量的第二代测序技术具有通量高、速度快、检测成本低等优点，可以快速、准确的定位原发性先天性青光眼的致病突变位点，进而为阐明原发性先天性青光眼的分子发病机制，为疾病筛查、早期诊断、治疗、预后判断、遗传咨询提供科学的依据。
第四方面，作为本发明的衍生应用，还可建立筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品的方法，即通过检测生物样品中野生型CYP1B1基因编码的多肽(氨基酸序列如SEQID NO:2所示)，可以作为生物体是否患原发性先天性青光眼的辅助判断方法。
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案进行详细说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1确定原发性先天性青光眼致病突变
1、样本来源
来自中国福建省的一名2岁原发性先天性青光眼女性患儿(先证者)，其家族中三代内仅先证者一人患病，发明人挑选患者及其父母进行青光眼基因包检测。先证者于7月龄时发现视力发育异常，经专科检查发现角膜雾浊，双眼眼压增高，对光反射稍迟钝，临床拟诊断为原发性先天性青光眼。该原发性先天性青光眼患者的家系谱如图1所示，箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，半实心图标表示为携带者。获得所有参与者的知情同意书，并进行静脉血采集。
2、基因组DNA提取
取上述家系所有成员的外周血，分别采用HiPure Blood&Tissue DNA Kit(Magen)全血DNA提取方法从外周血样品中提取基因组DNA，用Nanodrop one测量DNA的纯度，所得各基因组DNA的OD260nm/OD280nm均位于1.7-2.0之间，用Nanodrop one测量DNA的浓度，所得各基因组DNA的浓度为50-100ng/μL，总量为5-10μg。
3、目标外显子捕获测序
发明人利用Illumina公司的Nextera DNA Exome试剂盒结合Illumina第二代测序技术，对上述原发性先天性青光眼患者的临床外显子组序列进行了测序。
具体如下：
1)利用Illumina公司的Nextera DNA Exome试剂盒将基因组DNA样本随机打断成200-1000bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库。
2)文库经纯化后，用Nanodrop one检测文库，并等量混合，混合后浓度>100ng/μL，用经过Nextera Rapid Capture Enrichment捕获试剂，结合Illumina公司的Nextera DNAExome试剂盒进行杂交富集，再经过扩增，文库检测合格后即可上机测序，获得原始测序数据。其中，测序平台为Illumina Hiseq X Ten，PE150，各样本的20X平均测序覆盖度≥96％。
3)变异检测、注释及数据库比较
使用Novocraft NovoAlign将NGS测序结果和人类参考基因组UCSC NCBI37/hg19进行比对，获得比对到基因组上的唯一比对序列。利用VarScan mpileup2snp和VarScanmpileup2indel检测确定靶区域的变异。利用Remove Run Common Variants和RemoveGlobal Common Variants软件用来去除dbSNP和ExAC数据库中的常见变异。然后利用Interactive Biosoftware Alamut Batch对变异进行注释。注释用到的数据库包括：dbSNP、ExAC、1000g、ClinVar、OMIM等。利用filterAlamut.py将注释后的变异按照High，Medium，Low排序。在High和Medium分组中，给予变异一个优先级值和分级理由。所有的变异最初都在Low组别中，当一个变异符合某些标准时，则可以被划分为更高级别的变异。并利用FATHMM、FATHMMMKL、METALR、METASVM、MUTATIONASSESSOR、MUTATIONTASTERAGVGD、AGVGD、LRT,PROVEAN、SIFT软件进行SNP功能预测。
上述流程中分析的目标基因共26个，主要为原发性青光眼相关基因，目标基因包括：
ACVR1,BEST1,CA4,CANT1,COL18A1,COL4A1,CYP1B1,FOXC1,ISPD,LMX1B,LOXL1,LTBP2,MFRP,MYOC,NTF4,OPA1,OPTN,PAX6,PITX2,PITX3,SBF2,SH3PXD2B,SLC4A4,TBK1,TTR,WDR36
发明人发现了CYP1B1基因突变体c.605C>T(p.Ala202Val)。该变异在总人口中的等位基因频率尚未在gonmAD数据库中报道。该变异导致基因编码序列第202位密码子由丙氨酸变为缬氨酸，可能对基因功能造成影响。该变异在先证者为纯合，先证者父母分别为杂合，CYP1B1基因是原发性先天性青光眼的致病基因，与患者本身病情相符，依据ACMG指南，发明人认为该变异是致病变异。根据该检测结果表明患者由于CYP1B1基因发生致病突变，罹患原发性先天性青光眼的诊断明确，建议定期随访，根据病情可能需要多次手术治疗，及时进行降眼压，营养神经治疗。对于患者父母，由于均为携带者，发明人对其进行遗传咨询，指出其后代患原发性先天性青光眼的再发风险为1/4，成为该病携带者的风险为1/2，如有生育需求可根据个人意愿进行产前诊断、PGD、接受赠卵、赠精等，降低后代患原发性先天性青光眼风险。
实施例2Sanger法测序
分别对实施例1中所述的原发性先天性青光眼患者的CYP1B1基因进行检测：针对CYP1B1基因的c.605C>T突变设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得突变位点有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证CYP1B1基因的c.605C>T突变与原发性先天性青光眼之间的相关性。
具体步骤如下：
1、DNA提取
参照实施例1中所述的提取DNA的方法。
2、引物设计及PCR反应
首先，参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，设计得到针对CYP1B1基因的c.605C>T突变的外显子特异性引物，具体序列如下：
上游引物F：ATTTCTCCAGAGAGTCAGCTCCG(SEQ ID NO:3)
下游引物R：GCCTCAAGAACTTGTCCAGGATG(SEQ ID NO:4)
接着，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应，50μL反应体系包括：10×buffer 5μL、基因组DNA 1μL、上游引物F(SEQ ID NO:3)2μL、下游引物R(SEQ ID NO:4)2μL、10mM dNTP 5μL、Taq酶1μL、ddH2O 34μL。PCR反应条件：95℃5min，30个循环(95℃15s，60℃30s，72℃45s)，72℃5min，4℃保温。最终获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。
3、测序
将步骤2中获得的各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物直接进行DNA测序。测序采用ABI3730型测序仪进行正反向测序。将测序结果与CYP1B1基因如SEQ ID NO:1所示核酸序列进行比对。基于比对结果，可以排查原发性先天性青光眼家系成员中是否存在CYP1B1基因的c.605C>T突变位点。比对发现，该家系中患者(先证者)携带了c.605C>T纯合突变，结果见图2；该突变体编码的多肽与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列比较，具有p.Ala202Val变异。由此，进一步证明CYP1B1基因的c.605C>T(p.Ala202Val)是原发性先天性青光眼的新的致病位点，CYP1B1基因的c.605C>T的杂合突变能够导致该病。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中，且不做特定指代。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
序列表
<110> 福州福瑞医学检验实验室有限公司
<120> 一种编码CYP1B1基因突变体的核酸及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1632
<212> DNA
<213> 人(human)
<400> 1
atgggcacca gcctcagccc gaacgaccct tggccgctaa acccgctgtc catccagcag 60
accacgctcc tgctactcct gtcggtgctg gccactgtgc atgtgggcca gcggctgctg 120
aggcaacgga ggcggcagct ccggtccgcg cccccgggcc cgtttgcgtg gccactgatc 180
ggaaacgcgg cggcggtggg ccaggcggct cacctctcgt tcgctcgcct ggcgcggcgc 240
tacggcgacg ttttccagat ccgcctgggc agctgcccca tagtggtgct gaatggcgag 300
cgcgccatcc accaggccct ggtgcagcag ggctcggcct tcgccgaccg gccggccttc 360
gcctccttcc gtgtggtgtc cggcggccgc agcatggctt tcggccacta ctcggagcac 420
tggaaggtgc agcggcgcgc agcccacagc atgatgcgca acttcttcac gcgccagccg 480
cgcagccgcc aagtcctcga gggccacgtg ctgagcgagg cgcgcgagct ggtggcgctg 540
ctggtgcgcg gcagcgcgga cggcgccttc ctcgacccga ggccgctgac cgtcgtggcc 600
gtggccaacg tcatgagtgc cgtgtgtttc ggctgccgct acagccacga cgaccccgag 660
ttccgtgagc tgctcagcca caacgaagag ttcgggcgca cggtgggcgc gggcagcctg 720
gtggacgtga tgccctggct gcagtacttc cccaacccgg tgcgcaccgt tttccgcgaa 780
ttcgagcagc tcaaccgcaa cttcagcaac ttcatcctgg acaagttctt gaggcactgc 840
gaaagccttc ggcccggggc cgccccccgc gacatgatgg acgcctttat cctctctgcg 900
gaaaagaagg cggccgggga ctcgcacggt ggtggcgcgc ggctggattt ggagaacgta 960
ccggccacta tcactgacat cttcggcgcc agccaggaca ccctgtccac cgcgctgcag 1020
tggctgctcc tcctcttcac caggtatcct gatgtgcaga ctcgagtgca ggcagaattg 1080
gatcaggtcg tggggaggga ccgtctgcct tgtatgggtg accagcccaa cctgccctat 1140
gtcctggcct tcctttatga agccatgcgc ttctccagct ttgtgcctgt cactattcct 1200
catgccacca ctgccaacac ctctgtcttg ggctaccaca ttcccaagga cactgtggtt 1260
tttgtcaacc agtggtctgt gaatcatgac ccactgaagt ggcctaaccc ggagaacttt 1320
gatccagctc gattcttgga caaggatggc ctcatcaaca aggacctgac cagcagagtg 1380
atgatttttt cagtgggcaa aaggcggtgc attggcgaag aactttctaa gatgcagctt 1440
tttctcttca tctccatcct ggctcaccag tgcgatttca gggccaaccc aaatgagcct 1500
gcgaaaatga atttcagtta tggtctaacc attaaaccca agtcatttaa agtcaatgtc 1560
actctcagag agtccatgga gctccttgat agtgctgtcc aaaatttaca agccaaggaa 1620
acttgccaat aa 1632
<210> 2
<211> 543
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 2
Met Gly Thr Ser Leu Ser Pro Asn Asp Pro Trp Pro Leu Asn Pro Leu
1 5 10 15
Ser Ile Gln Gln Thr Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Thr
20 25 30
Val His Val Gly Gln Arg Leu Leu Arg Gln Arg Arg Arg Gln Leu Arg
35 40 45
Ser Ala Pro Pro Gly Pro Phe Ala Trp Pro Leu Ile Gly Asn Ala Ala
50 55 60
Ala Val Gly Gln Ala Ala His Leu Ser Phe Ala Arg Leu Ala Arg Arg
65 70 75 80
Tyr Gly Asp Val Phe Gln Ile Arg Leu Gly Ser Cys Pro Ile Val Val
85 90 95
Leu Asn Gly Glu Arg Ala Ile His Gln Ala Leu Val Gln Gln Gly Ser
100 105 110
Ala Phe Ala Asp Arg Pro Ala Phe Ala Ser Phe Arg Val Val Ser Gly
115 120 125
Gly Arg Ser Met Ala Phe Gly His Tyr Ser Glu His Trp Lys Val Gln
130 135 140
Arg Arg Ala Ala His Ser Met Met Arg Asn Phe Phe Thr Arg Gln Pro
145 150 155 160
Arg Ser Arg Gln Val Leu Glu Gly His Val Leu Ser Glu Ala Arg Glu
165 170 175
Leu Val Ala Leu Leu Val Arg Gly Ser Ala Asp Gly Ala Phe Leu Asp
180 185 190
Pro Arg Pro Leu Thr Val Val Ala Val Ala Asn Val Met Ser Ala Val
195 200 205
Cys Phe Gly Cys Arg Tyr Ser His Asp Asp Pro Glu Phe Arg Glu Leu
210 215 220
Leu Ser His Asn Glu Glu Phe Gly Arg Thr Val Gly Ala Gly Ser Leu
225 230 235 240
Val Asp Val Met Pro Trp Leu Gln Tyr Phe Pro Asn Pro Val Arg Thr
245 250 255
Val Phe Arg Glu Phe Glu Gln Leu Asn Arg Asn Phe Ser Asn Phe Ile
260 265 270
Leu Asp Lys Phe Leu Arg His Cys Glu Ser Leu Arg Pro Gly Ala Ala
275 280 285
Pro Arg Asp Met Met Asp Ala Phe Ile Leu Ser Ala Glu Lys Lys Ala
290 295 300
Ala Gly Asp Ser His Gly Gly Gly Ala Arg Leu Asp Leu Glu Asn Val
305 310 315 320
Pro Ala Thr Ile Thr Asp Ile Phe Gly Ala Ser Gln Asp Thr Leu Ser
325 330 335
Thr Ala Leu Gln Trp Leu Leu Leu Leu Phe Thr Arg Tyr Pro Asp Val
340 345 350
Gln Thr Arg Val Gln Ala Glu Leu Asp Gln Val Val Gly Arg Asp Arg
355 360 365
Leu Pro Cys Met Gly Asp Gln Pro Asn Leu Pro Tyr Val Leu Ala Phe
370 375 380
Leu Tyr Glu Ala Met Arg Phe Ser Ser Phe Val Pro Val Thr Ile Pro
385 390 395 400
His Ala Thr Thr Ala Asn Thr Ser Val Leu Gly Tyr His Ile Pro Lys
405 410 415
Asp Thr Val Val Phe Val Asn Gln Trp Ser Val Asn His Asp Pro Leu
420 425 430
Lys Trp Pro Asn Pro Glu Asn Phe Asp Pro Ala Arg Phe Leu Asp Lys
435 440 445
Asp Gly Leu Ile Asn Lys Asp Leu Thr Ser Arg Val Met Ile Phe Ser
450 455 460
Val Gly Lys Arg Arg Cys Ile Gly Glu Glu Leu Ser Lys Met Gln Leu
465 470 475 480
Phe Leu Phe Ile Ser Ile Leu Ala His Gln Cys Asp Phe Arg Ala Asn
485 490 495
Pro Asn Glu Pro Ala Lys Met Asn Phe Ser Tyr Gly Leu Thr Ile Lys
500 505 510
Pro Lys Ser Phe Lys Val Asn Val Thr Leu Arg Glu Ser Met Glu Leu
515 520 525
Leu Asp Ser Ala Val Gln Asn Leu Gln Ala Lys Glu Thr Cys Gln
530 535 540
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
atttctccag agagtcagct ccg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gcctcaagaa cttgtccagg atg 23

Claims (7)

1.一种编码CYP1B1基因突变体的核酸，其特征在于：与SEQ ID NO:1相比，所述核酸的基因序列具有c.605C>T突变。
2.一种用于检测编码CYP1B1基因突变体的核酸的引物，其特征在于：所述的引物序列如下：
上游引物F：ATTTCTCCAGAGAGTCAGCTCCG(SEQ ID NO:3)；
下游引物R：GCCTCAAGAACTTGTCCAGGATG(SEQ ID NO:4)。
3.一种编码CYP1B1基因突变体的核酸的检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求2所述的引物。
4.一种如权利要求1所述的编码CYP1B1基因突变体的核酸在制备筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品的试剂中的应用。
5.一种如权利要求2所述的用于检测编码CYP1B1基因突变体的核酸的引物在制备检测易患原发性先天性青光眼的生物样品的试剂中的应用。
6.一种分离的多肽，其特征在于：所述的多肽由权利要求1所述的编码CYP1B1基因突变体的核酸编码，与SEQ ID NO:2相比，所述的多肽的氨基酸序列具有p.Ala202Val突变。
7.一种如权利要求6所述的分离的多肽在制备筛选易患原发性先天性青光眼的生物样品的检测试剂中的应用。
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