CN111296723A - 一种多菌种联合固态发酵菜籽粕的益生菌剂及其发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多菌种联合固态发酵菜籽粕的益生菌剂及其发酵方法，采用解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌组合固态发酵菜籽粕以降低其抗营养因子如硫甙等含量，包括如下步骤：菜籽粕原料的预处理与灭菌、发酵种子液的制备、益生菌进行固态发酵、发酵菜籽粕成品的制备。本发明首次使用解淀粉芽孢杆菌固态发酵菜籽粕，并与酿酒酵母、枯草芽孢杆菌进行组合加入菜籽粕中进行了联合发酵；与其他技术方案比，本发明可大幅度降低菜籽粕中抗营养因子硫甙含量，同时可降低菜籽粕抗营养因子单宁、植酸、粗纤维的含量并提高菜籽粕成品中肽含量，益生菌发酵过程中可产生各种生物活性物质，且本方法成本低，操作简单，耗时短，效率高。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，涉及一种多菌种联合固态发酵菜籽粕的益生菌剂及其发酵方法。
背景技术
菜籽粕是菜籽油生产过程中的副产物，一般粗蛋白含量35％～40％，氨基酸组成均衡且含有大量微量元素，是饲料行业中常用的植物蛋白饲料源。虽然菜籽粕营养丰富，但是由于其中含有较多抗营养因子限制了菜籽粕的使用，如硫甙、单宁、植酸、粗纤维等。硫甙不仅本身具有一定毒性，其主要分解产物异硫氰酸酯、噁唑烷硫酮等化合物也对畜禽有严重危害，会使禽畜甲状腺肿大、肠胃以及肝脾损坏；植酸会与饲料中金属离子结合，严重影响机体的发育；单宁不仅产生苦味还会阻碍自身蛋白质的消化吸收；非反刍动物体内缺乏能降解粗纤维的酶类，过量的纤维素无法被动物消化，降低了饲料效率，影响蛋白质和矿物质的吸收利用。
菜籽粕的应用需要脱毒处理，一般菜籽粕脱毒方法有遗传育种法、物理化学脱毒法和生物脱毒法。微生物发酵可以有效降解抗营养因子，同时改善饲料的适口性、提高饲料中营养物质消化率及利用率，还有益于动物肠道健康和增强免疫力等。因此筛选出具有较强脱毒能力的菌株对菜籽粕的生物技术处理具有重要意义。目前未见有同时具有较好脱除硫甙、单宁、植酸、粗纤维素能力以及提高肽含量的微生物组合固态发酵法报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种多菌种联合固态发酵菜籽粕的发酵方法，本发明的发酵方法可以具有较好的脱除菜籽粕中硫甙、单宁、植酸、粗纤维素以及提高肽含量。
本发明还公开了一种用于多菌种联合固态发酵菜籽粕的发酵方法的益生菌制剂以及本发明所述发酵法所发酵制备的发酵菜籽粕成品。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种多菌种联合固态发酵菜籽粕的发酵方法，采用解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌联合固态发酵菜籽粕，包括如步骤：
(1)菜籽粕原料的预处理与灭菌：将菜籽粕饼粉碎过筛，称取粉碎过筛的菜籽粕，灭菌处理，得到预处理灭菌后的菜籽粕发酵原料；
(2)发酵种子液的制备：采用摇瓶培养法分别培养解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌发酵种子液；
(3)固态发酵：无菌条件下，将步骤(2)制备的解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌发酵种子液接种至步骤(1)预处理灭菌后的菜籽粕发酵原料中，混合均匀进行发酵；
(4)发酵菜籽粕成品的制备：步骤(3)固态发酵结束后，将发酵菜籽粕低温烘干即制得发酵菜籽粕成品。
其中，步骤(1)所述将菜籽粕饼粉碎过40-60目筛，称取粉碎过筛的菜籽粕自然pH，121℃高压蒸汽灭菌20min。
作为优选，所述菜籽粕饼粉碎过60目筛后灭菌处理。
其中，步骤(2)所述解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌采用的培养基为肉汤培养基，酿酒酵母采用的培养基是马铃薯-葡萄糖培养基，均采用液态培养基，经121℃高压蒸汽灭菌20min后冷却备用；三种菌的发酵种子液的培养温度为28-37℃，摇床转速120-200rpm培养15-20h。
作为优选，酿酒酵母的培养温度为30℃，摇床转速200rpm培养15h；解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的培养温度为37℃，摇床转速150rpm培养15h。
其中，步骤(3)所述解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌发酵种子液接种至步骤(1)预处理灭菌后的菜籽粕发酵原料中，先接入酿酒酵母、枯草芽孢杆菌，28-37℃发酵24-48h后，继续接入解淀粉芽孢杆菌，28-37℃发酵24-48h，接种量按含有菌种的培养基(即发酵液)质量占菜籽粕质量(即原始菜籽粕的质量)的百分比计，接种量分别为5-20％。
作为优选，步骤(3)所述步骤(1)预处理灭菌后的菜籽粕发酵原料与无菌水混合均匀，料水质量比为1：0.8-1:1.4，再接入枯草芽孢杆菌、酿酒酵母发酵液。
作为优选，步骤(3)所述酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌接种量质量比为3：2：1，优选三种菌的接种的总量为30％。
本发明所述的用于多菌种联合固态发酵菜籽粕的发酵方法的益生菌剂，包括解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌。
本发明所述的多菌种联合固态发酵菜籽粕的发酵方法所发酵得到的发酵菜籽粕成品。
本发明中的解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌均由淮阴工学院提供，其他原料均市售可得。
本发明中的益生菌是指主要定殖在宿主肠道内，能够改变肠道菌群组成的一类且对宿主有益的活性微生物。它的特点是耐肠道酸性、安全无毒、生长代谢过程中会产生一些抑菌活性物质。益生菌主要有酵母菌、芽孢杆菌等。酿酒酵母及其代谢产物具有改善肠道菌群屏障、调节免疫反映应答、防毒及诱导细胞凋亡等功能。芽孢杆菌是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，具有耐高温、易培养、生命力强等特点，能产生多种营养物质和活性因子，具有调节肠道微生态、提高畜禽生长和生产性能、增强机体免疫力等益生功能，另外解淀粉芽孢杆菌还具有生防的功能。
本发明首次采用了解淀粉芽孢杆菌固态发酵菜籽粕，并与枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌进行分步混合使用，这种益生菌联合固态发酵法实现大幅度降解菜籽粕中硫甙和提高肽的含量，对单宁、植酸、粗纤维素也有较好的降解。本发明中当解淀粉芽孢杆菌和酿酒酵母、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢混合一步发酵时没有协同作用效果，分步发酵具有较好的协同作用效果，所以采用分步发酵的方式。
在本发明中，在发酵菜籽粕的过程中，解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母能够产生降解硫甙、单宁、植酸、粗纤维素的酶，还能够产生蛋白酶水解菜籽粕中的蛋白为肽。三株菌中解淀粉芽孢杆菌降解硫甙的能力和降解菜籽粕蛋白产肽的能力最突出，酿酒酵母的植酸降解能力和单宁降解能力比解淀粉芽孢杆菌突出，枯草芽孢杆菌对纤维素的降解能力比解淀粉芽孢杆菌突出，在饲料中加入酿酒酵母和枯草芽孢杆菌进行发酵可以弥补解淀粉芽孢杆菌降解植酸、单宁和粗纤维能力的不足，并且三株菌在两两组合和三菌组合后出现协同增效的作用，大幅度提高了对硫甙的降解能力和降解菜籽粕中蛋白产肽的能力。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明首次使用解淀粉芽孢杆菌固态发酵菜籽粕，并与酿酒酵母、枯草芽孢杆菌进行组合使用；与其他技术方案比，本发明可实现大幅度明显降低菜籽粕中抗营养因子硫甙、单宁、植酸、粗纤维素含量以及提高肽含量还可产生生理活性物质，而且成本低，操作简单，耗时短，效率高。
本发明发酵法生产的产品，不仅抗营养因子硫甙含量大幅度下降，并且肽含量很大程度的提高，抗营养因子单宁、植酸、粗纤维素含量也大幅度下降。与菜籽粕原材料(普通菜籽粕)相比，按本发明工艺生产的产品硫甙完全去除，含量降低了100％，单宁含量降低了33.88％，植酸含量降37.87％，纤维素含量降低38.00％，肽含量提高297.78％。因此本发明可大幅度降低菜籽粕中硫甙含量，同时可降低单宁、植酸、粗纤维素含量，降低其毒性，大幅度提高肽含量，较大程度上改善提高菜籽粕的品质。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)菜籽粕原料的预处理与灭菌：将菜籽饼粕烘箱45℃烘4h并将其粉碎过60目筛，经121℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)发酵种子液的制备：采用摇瓶培养法分别发酵培养解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌，其中解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌采用的发酵培养基为肉汤培养基，酿酒酵母采用的发酵培养基是马铃薯-葡萄糖培养基，均采用液态培养基；经121℃高压蒸汽灭菌20min后冷却至室温备用；在分别含三种培养基的试管中将三种菌培养到对数期，将试管液按体积比1％的接种量分别接种到三种菌株的发酵培养基中，酿酒酵母的培养温度为30℃，摇床转速200rpm培养15h；解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的培养温度为37℃，摇床转速150rpm培养15h；得到三种菌株的发酵种子液。
(3)三菌联合固态发酵：无菌条件下，将步骤(1)预处理灭菌后的菜籽粕发酵原料中与无菌水混合均匀，料水质量比为1:1.1，接着加入酿酒酵母、枯草芽孢杆菌发酵种子液；37℃发酵48h后，接入解淀粉芽孢杆菌发酵液，37℃发酵48h，接种量按含有菌种的培养基质量占菜籽粕质量的百分比计，三种菌酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌接种量分别为15％、10％和5％。
(4)发酵菜籽粕成品的制备：步骤(3)固态发酵结束后，将发酵菜籽粕低温烘干即制得发酵菜籽粕成品。
对比例1
(1)菜籽粕原料的预处理与灭菌：将菜籽饼粕烘箱45℃烘4h并将其粉碎过60目筛，经121℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)发酵种子液的制备：采用摇瓶培养法分别发酵培养解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌，其中解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌采用的发酵培养基为肉汤培养基，酿酒酵母采用的发酵培养基是马铃薯-葡萄糖培养基，均采用液态培养基；经121℃高压蒸汽灭菌20min后冷却至室温备用；在分别含三种培养基的试管中将三种菌培养到对数期，将试管液按体积比1％的接种量分别接种到三种的发酵培养基中，酿酒酵母的培养温度为30℃，摇床转速200rpm培养15h；解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的培养温度为37℃，摇床转速150rpm培养15h；得到三种菌株的发酵种子液。
(3)单菌固态发酵：无菌条件下，将步骤(1)预处理灭菌后的菜籽粕发酵原料中与无菌水混合均匀，料水质量比为1:1.1；继续分别接种三种菌株的发酵种子液至菜籽粕发酵原料中，接种量按含有菌种的培养基质量占菜籽粕质量的百分比计，接种量均为30％，37℃进行单菌发酵96h。
(4)发酵菜籽粕成品的制备：步骤(3)固态发酵结束后，将发酵菜籽粕低温烘干即制得发酵菜籽粕成品。
对比例2
(1)菜籽粕原料的预处理与灭菌：将菜籽饼粕烘箱45℃烘4h并将其粉碎过60目筛，经121℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)发酵种子液的制备：采用摇瓶培养法分别发酵培养解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌，其中解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌采用的发酵培养基为肉汤培养基，酿酒酵母采用的发酵培养基是马铃薯-葡萄糖培养基，均采用液态培养基；经121℃高压蒸汽灭菌20min后冷却至室温备用；在分别含三种培养基的试管中将三种菌培养到对数期，将试管液按体积比1％的接种量分别接种到三种菌株的发酵培养基中，酿酒酵母的培养温度为30℃，摇床转速200rpm培养15h；解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的培养温度为37℃，摇床转速150rpm培养15h；得到三种菌株的发酵种子液。
(3)两菌联合固态发酵：无菌条件下，将步骤(1)预处理灭菌后的菜籽粕发酵原料中与无菌水混合均匀，料水质量比为1:1.1。将酿酒酵母和解淀粉芽孢杆菌联合发酵，先在菜籽粕中接入酿酒酵母发酵种子液，37℃发酵48h后再接入解淀粉芽孢杆菌发酵种子液，继续37℃发酵48h，接种量按含有菌种的培养基质量占菜籽粕质量的百分比计，接种量酿酒酵母和解淀粉芽孢杆菌分别为22.5％和7.5％。将枯草芽孢杆和解淀粉芽孢杆菌菌联合发酵，先在菜籽粕中接入枯草芽孢杆菌发酵种子液，37℃发酵48h后再接入解淀粉芽孢杆菌发酵种子液，继续37℃发酵48h，接种量按含有菌种的培养基质量占菜籽粕质量的百分比计，接种量枯草芽孢杆和解淀粉芽孢杆菌分别为20％和10％。将酿酒酵母和枯草芽孢杆菌联合发酵，两者采用一步发酵，37℃发酵96h，接种量酿酒酵母和枯草芽孢杆菌分别为18％和12％。
(4)发酵菜籽粕成品的制备：步骤(3)固态发酵结束后，将发酵菜籽粕低温烘干即制得发酵菜籽粕成品。
测试实施例1和对比例1-2中发酵菜籽粕抗营养因子降解率和肽含量变化，结果如表1所示。
表1实施例1中的发酵菜籽粕抗营养因子降解率和肽含量增加率
注：J：解淀粉芽孢杆菌，N：酿酒酵母，K：枯草芽孢杆菌，/代表未测。
由表1可知，本发明工艺生产的产品，不仅抗营养因子硫甙含量大幅度下降，并且肽含量很大程度的提高，抗营养因子单宁、植酸、粗纤维素含量也大幅度下降。与菜籽粕原材料(普通菜籽粕)相比，按本发明发酵生产的产品硫甙完全去除，其含量降低了100％，单宁含量降低了33.88％，植酸含量降37.78％，纤维素含量降低38.00％，肽含量提高297.78％。因此本发明利用高效发酵菜籽粕益生菌解淀粉芽孢杆菌联合酿酒酵母和枯草芽孢杆菌复合发酵有效脱毒并且显著提高肽的含量，提高菜籽粕的品质。
实施例2
(1)菜籽粕原料的预处理与灭菌：将菜籽饼粕烘箱45℃烘4h并将其粉碎过40目筛，经121℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)发酵种子液的制备：采用摇瓶培养法分别发酵培养解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌，其中解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌采用的发酵培养基为肉汤培养基，酿酒酵母采用的发酵培养基是马铃薯-葡萄糖培养基，均采用液态培养基；经121℃高压蒸汽灭菌20min后冷却至室温备用；在分别含三种培养基的试管中将三种菌培养到对数期，将试管液按体积比1％的接种量分别接种到三种菌株的发酵培养基中，酿酒酵母的培养温度为28℃，摇床转速200rpm培养20h；解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的培养温度为33℃，摇床转速200rpm培养20h；得到三种菌株的发酵种子液。
(3)三菌联合固态发酵：无菌条件下，将步骤(1)预处理灭菌后的菜籽粕发酵原料中与无菌水混合均匀，料水质量比为1:0.8，接着加入枯草芽孢杆菌、酿酒酵母发酵种子液；28℃发酵24h后，接入解淀粉芽孢杆菌，33℃发酵24h，接种量按含有菌种的培养基质量占菜籽粕质量的百分比计，三种菌酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌接种量分别为20％、5％、5％。
(4)发酵菜籽粕成品的制备：步骤(3)固态发酵结束后，将发酵菜籽粕低温烘干即制得发酵菜籽粕成品。
实施例3
(1)菜籽粕原料的预处理与灭菌：将菜籽饼粕烘箱45℃烘4h并将其粉碎过60目筛，经121℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)发酵种子液的制备：采用摇瓶培养法分别发酵培养解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌，其中解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌采用的发酵培养基为肉汤培养基，酿酒酵母采用的发酵培养基是马铃薯-葡萄糖培养基，均采用液态培养基；经121℃高压蒸汽灭菌20min后冷却至室温备用；在分别含三种培养基的试管中将三种菌培养到对数期，将试管液按体积比1％的接种量分别接种到三种菌株的发酵培养基中，酿酒酵母的培养温度为37℃，摇床转速120rpm培养20h；解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的培养温度为30℃，摇床转速200rpm培养20h；得到三种菌株的发酵种子液。
(3)三菌联合固态发酵：无菌条件下，将步骤(1)预处理灭菌后的菜籽粕发酵原料中与无菌水混合均匀，料水质量比为1:1.4，接着加入枯草芽孢杆菌、酿酒酵母发酵种子液；30℃发酵36h后，接入解淀粉芽孢杆菌，30℃发酵36h，接种量按含有菌种的培养基质量占菜籽粕质量的百分比计，三种菌酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌接种量均为10％。
(4)发酵菜籽粕成品的制备：步骤(3)固态发酵结束后，将发酵菜籽粕低温烘干即制得发酵菜籽粕成品。
Claims (8)
1.一种多菌种联合固态发酵菜籽粕的发酵方法，采用解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌组合固态发酵菜籽粕，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菜籽粕原料的预处理与灭菌：将菜籽粕饼粉碎过筛，称取粉碎过筛的菜籽粕，灭菌处理，得到预处理灭菌后的菜籽粕发酵原料；
(2)发酵种子液的制备：采用摇瓶培养法分别培养解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌发酵种子液；
(3)固态发酵：无菌条件下，将步骤(2)制备的解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌发酵种子液接种至步骤(1)预处理灭菌后的菜籽粕发酵原料中进行发酵；
(4)发酵菜籽粕成品的制备：步骤(3)固态发酵结束后，将发酵菜籽粕低温烘干即制得发酵菜籽粕成品。
2.根据权利要求1所述的多菌种联合固态发酵菜籽粕的发酵方法，其特征在于，步骤(1)所述将菜籽粕饼优选粉碎过40-60目筛，称取粉碎过筛的菜籽粕自然pH，121℃高压蒸汽灭菌20min。
3.根据权利要求1所述的多菌种联合固态发酵菜籽粕的发酵方法，其特征在于，步骤(2)所述解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌采用的培养基为肉汤培养基，酿酒酵母采用的培养基是马铃薯-葡萄糖培养基，均采用液态培养基,121℃高压蒸汽灭菌20min后冷却备用；三种菌的发酵种子液的培养温度为28-37℃，摇床转速120-200rpm培养15-20h。
4.根据权利要求1所述的多菌种联合固态发酵菜籽粕的发酵方法，其特征在于，步骤(3)所述解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌发酵种子液接种至步骤(1)预处理灭菌后的菜籽粕发酵原料中具体为，先接入枯草芽孢杆菌、酿酒酵母，28-37℃发酵24-48h后，继续接入解淀粉芽孢杆菌，28-37℃发酵24-48h，接种量按含有菌种的培养基质量占菜籽粕质量的百分比计，接种量分别为5-20％
5.根据权利要求4所述的多菌种联合固态发酵菜籽粕的发酵方法，其特征在于，步骤(3)所述步骤(1)预处理灭菌后的菜籽粕发酵原料与无菌水混合均匀，料水质量比为1：0.8-1:1.4，再接入枯草芽孢杆菌、酿酒酵母发酵液。
6.根据权利要求4所述的多菌种联合固态发酵菜籽粕的发酵方法，其特征在于，步骤(3)所述酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌接种量质量比为3：2：1。
7.一种用于多菌种联合固态发酵菜籽粕的发酵方法的益生菌剂，其特征在于，包括解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌。
8.一种多菌种联合固态发酵菜籽粕的发酵方法所发酵得到的发酵菜籽粕成品。
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