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CN111295454A - 靶向染色体不稳定性和下游胞质dna信号传导以治疗癌症 - Google Patents

靶向染色体不稳定性和下游胞质dna信号传导以治疗癌症 Download PDF

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CN111295454A
CN111295454A CN201880058523.8A CN201880058523A CN111295454A CN 111295454 A CN111295454 A CN 111295454A CN 201880058523 A CN201880058523 A CN 201880058523A CN 111295454 A CN111295454 A CN 111295454A
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L·C·坎特利
B·恩格
S·F·巴库姆
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Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Original Assignee
Cornell University
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
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Abstract

如本文所述，染色体错误分离、染色体微核、胞质DNA以及其组合指示转移性癌症。本文描述了可用于检测和治疗具有染色体不稳定性如染色体错误分离、染色体微核、胞质DNA以及其组合的患者的方法和组合物。例如，一些方法和组合物包括使用驱动蛋白‑13蛋白(如Kif2b、MCAK/Kif2c或KIF13A)。所述方法和组合物还可包括STING、ENPP1、cGAS、NF‑κB转录因子p52、NF‑κB转录因子ReIB或其任何组合的抑制剂。还描述了鉴定有效治疗癌症(包括转移性癌症)的化合物的方法。

Description

靶向染色体不稳定性和下游胞质DNA信号传导以治疗癌症
本申请要求于2017年7月10日提交的美国临时申请序列第62/530,661号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
联邦资助
本发明是在美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助编号CA197588和ARMY/MRMC授予的资助编号W81XWH-16-1-0315的政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
癌症是人体各个部位异常细胞的不受控制的生长。目前，可通过手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法等方法治疗癌症，这些方法均取得了不同程度的成功。然而，外科手术疗法不能完全去除广泛转移的肿瘤细胞。在快速增殖的正常细胞的存在下，放射疗法和化学疗法没有足够的选择性来杀死癌细胞。免疫疗法在很大程度上受到细胞因子或治疗性癌症疫苗的使用的限制。细胞因子可导致严重的毒性，持续使用疫苗可导致免疫耐受。
发明内容
以前，有关胞质DNA的主要问题之一为其诱导免疫反应。然而，如本文所述，染色体不稳定性会产生胞质DNA，这增加了癌细胞转移的发生率和可能性。如本文进一步说明的，染色体不稳定性(如染色体错误分离(chromosomal missegregation))和微核也可增加癌细胞转移的发生率和可能性。
描述的方法组合物可用于治疗具有染色体不稳定性水平增加、胞质DNA水平增加、染色体错误分离或其组合的患者。所述组合物和方法还可以减少和/或抑制转移、癌症药物抗性或其组合。在一些情况下，所述组合物和方法可用于调节驱动蛋白-13(kinesin-13)表达，并且所述组合物和方法可降低染色体不稳定性。
例如，本文描述了可增加细胞中驱动蛋白-13蛋白(如Kif2b、MCAK/Kif2c或KIF13A)的表达和/或活性的方法和组合物。在一些情况下，所述方法和组合物可增加ABCC4、ABCG2的表达和/或活性。所述方法还可包括在哺乳动物细胞中抑制STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1或其任何组合。此类组合物和方法可用于治疗和抑制癌症的恶化，包括转移性癌症的发展和进程。
本文描述了其它方法，包括设计和开发用于治疗癌症(包括转移性癌症)的新化合物的试验。
附图说明
图1A-1M显示了染色体畸变在人类转移瘤(metastase)中普遍存在。图1A图示了匹配的原发性肿瘤(P)和脑转移瘤(M)的加权基因组不稳定性指数(wGII)，其中n＝61个原发性肿瘤-转移瘤匹配对，方框跨越第25至75百分位，柱跨越第10至90百分位，并使用Wilcoxon匹配对符号秩检验测试显著性。RCC，肾细胞癌。图1B-1图示了转移瘤和匹配的原发性乳腺肿瘤之间的wGII差异。图1B-2图示了转移瘤和匹配的原发性肺肿瘤之间的wGII差异。图1B-3图示了转移瘤和匹配的肾细胞癌原发性肿瘤之间wGII的差异。图1B-4图示了转移瘤和匹配的原发性肿瘤之间的wGII差异。图1C图示了在Mitelman数据库中发现的原发性(P)乳腺肿瘤(n＝637)或转移瘤(M，n＝131)中克隆数目(基于核型)图1D图示了在原发性乳腺肿瘤(n＝983个克隆)或转移瘤(n＝186个克隆)中发现的每个克隆的染色体数目的Log2。图1E图示了在原发性乳腺肿瘤(n＝983个克隆)或转移瘤(n＝186个克隆)中发现的每个克隆的染色体畸变数目。在图1C-1E中，方框跨越第25至75百分位，柱跨越第10至90百分位，使用双尾曼-惠特尼(Mann Whitney)检验进行显著性检验。图1F显示了福尔马林固定的石蜡包埋的头颈鳞状细胞癌细胞进入后期的图像。箭头指出染色体错误分离的实例，比例尺为5μm。图1G图示了后期细胞的百分比，其展示了具有(N+，n＝22个患者)或不具有(N-，n＝18个患者)临床上可检测的淋巴结转移瘤的患者的肿瘤中的染色体错误分离的证据。方框跨越第25至75百分位，柱跨越第10至90百分位，使用双尾曼-惠特尼检验进行显著性检验。图1H图示了作为匹配的原发性肿瘤的wGII的函数的脑转移瘤的加权基因组不稳定性指数(wGII)。红线表示线性回归。图1I图示了来源于原发性和转移性乳腺癌的样品中每个克隆的染色体畸变数目作为给定克隆中染色体总数的函数，并且如图1D-1E所示，数据点代表平均值±SD。图1J图示了N-或N+患者的百分比作为染色体错误分离频率的函数(对于CIN-低和CIN-高，n＝20个患者)，使用Fisher精确检验进行显著性检验。图1K图示了作为表达各种驱动蛋白-13蛋白的MDA-MB-231细胞的时间函数的细胞汇合度(cell confluence)。数据点代表平均±SD，n＝4个实验。图1L显示了表达各种GFP标记的驱动蛋白-13蛋白的细胞的免疫印迹，所述细胞使用抗GFP抗体染色，以β-肌动蛋白作为上样对照。图1M显示了表达MCAK和dnMCAK的细胞，这些细胞针对微管(DM1A)、中心体(中心粒周蛋白)和DNA(DAPI)染色，比例尺为5μm。
图2A-2J示出了染色体不稳定性(CIN)为转移的驱动因素。图2A示出了针对抗着丝粒蛋白(ACA)和DNA(DAPI)染色的后期细胞，比例尺为5μm。图2B-1图示了MDA-MB-231后期细胞的百分比，其展示了在对照细胞或表达驱动蛋白-13蛋白的细胞中的染色体错误分离的证据，柱代表平均值±SD，n＝150个细胞，3个实验，使用双尾t-检验进行显著性检验。图2B-2图示了后期H2030细胞的百分比，其展示了在对照细胞或表达驱动蛋白-13蛋白的细胞中的染色体错误分离的证据，柱代表平均值±SD，n＝150个细胞，3个实验，使用双尾t-检验进行显著性检验。图2C图示了心内注射表达不同驱动蛋白-13蛋白的MDA-MB-231细胞5周后成像的整个动物的光子通量(p/s)。使用双侧曼-惠特尼检验进行显著性检验，每组n＝7-14只小鼠，4个独立实验。图2D示出了心内注射表达不同驱动蛋白-13蛋白的MDA-MB-231细胞5周后成像的整个动物的光子通量(p/s)图像。图2E图示了用注射有MDA-MB-231细胞的具有不同水平的染色体不稳定性的小鼠的疾病特异性存活率：CIN-高(dnMCAK；最左侧的图显示了随着时间的推移存活率最低)，CIN-中(对照，Kif2a或微管蛋白；中间图显示了随着时间的推移存活率中等)，或CIN-低(MCAK或Kif2b；最右侧的图显示了随着时间的推移存活率最高)，n＝10只小鼠(CIN-高)，23只小鼠(CIN-中)，20只小鼠(CIN-低)，用对数秩检验进行成对显著性检验。图2F-1显示了亲代MDA-MB-231细胞#2的代表性核型(DAPI607条带)，其被允许分裂30天。图2F-2显示了亲代MDA-MB-231细胞#4的代表性核型(DAPI607条带)，其被允许分裂30天。图2G显示了来源于单个MCAK表达细胞的细胞代表性核型(DAPI607条带)，其被允许分裂30天。图2H显示了来源于单个Kif2a表达细胞的细胞代表性核型(DAPI607条带)，其被允许分裂30天。图2I图示了CIN-低(MCAK；每个染色体的左栏)或CIN-中/高(对照，Kif2a，dnMCAK；每个染色体的右栏)MDA-MB-231细胞中非克隆(存在于单个克隆中＜25％的细胞中)新染色体的数目。“Mar”表示结构异常的染色体，其无法通过常规条带明确鉴定，柱表示平均值±SD，来自7个克隆群体的n＝140个细胞，使用双向ANOVA检验进行显著性检验。图2J显示了来自属于同一克隆群体的6个不同细胞的染色体的实例，这些细胞来源于单个表达Kif2a的细胞，显示涉及22号染色体与其它不同染色体的趋同易位(convergenttranslocation)。
图3A至3M示出了染色体不稳定性(CIN)在原发性肿瘤和转移瘤中的相反作用。图3A为示出图3B至3E中所示的样品的采集方法的示意图，其中示意图中的细胞的颜色与图3B-3E中的柱的颜色相匹配。图3B-1图示了由属于ER乳腺癌亚型的转移能力患者来源的异种移植物(PDX)产生的后期细胞的百分比，以说明来源于原发性肿瘤和来源于肝转移瘤的第一代细胞中染色体错误分离的证据。图3B-2图示了由属于TNBC乳腺癌亚型的转移能力患者来源的异种移植物(PDX)产生的后期细胞的百分比，以说明来源于原发性肿瘤和来源于肝转移瘤的第一代细胞中染色体错误分离的证据。图3C图示了由CIN-低细胞产生的后期细胞的百分比，以说明在注射的细胞、来源于原发性肿瘤的第一代细胞、源自同一动物原发性肿瘤的自发转移瘤以及从直接心内植入获得的转移瘤中染色体错误分离的证据。图3D图示了由CIN-中(Kif2a)细胞产生的后期细胞的百分比，以说明注射的细胞、来源于原发性肿瘤的第一代细胞、源自同一动物中原发性肿瘤的自发转移瘤以及从直接心内植入获得的转移瘤中染色体错误分离的证据。图3E图示了由CIN-高(dnMCAK)细胞产生的后期细胞的百分比，以说明注射的细胞、来源于原发性肿瘤的第一代细胞、源自同一动物中原发性肿瘤的自发转移瘤以及从直接心内植入获得的转移瘤中染色体错误分离的证据。对于图2B-2E，柱代表平均值±SD，n＝150个细胞，3个独立实验，*p<0.05，表示错误分离率高于注射的细胞系的样品，#p<0.05，表示错误分离率低于注射的细胞系的样品，**p<0.05，表示来源于同一动物的转移瘤和匹配的原发性肿瘤之间的显著差异，双尾t检验。STmet，软组织转移瘤。图3F显示了火山图(Volcano plot)，其说明了CIN-低(MCAK和Kif2b)和CIN-中/高(对照，Kif2a和dnMCAK)MDA-MB-231细胞之间差异表达基因的变化。右上部区域中的数据点(Log2大于2.6)对应于随后用于确定染色体不稳定性(CIN)签名的基因。图3G为TAVAZOIE_转移基因组的富集图。图3H显示了在患者的元分析(meta-analysis)中具有高(CIN-高；下部图线)或低(CIN-低；上部图线)CIN签名基因表达的患者的无远处转移存活率(DMFS)的图。图3I显示了在171名患者的验证组中具有高(CIN-高；下部图线)或低(CIN-低；上部图线)CIN签名基因表达的患者的无远处转移存活率(DMFS)的图。如实例1所述，CIN签名基因包括PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24、FGF5、NTN4。图3J至3M示出了染色体不稳定性促进转移瘤的形成和维持。图3J-1图示了注射表达驱动蛋白-13蛋白的MDA-MB-231细胞的整个动物随时间的标准化光子通量图。柱代表平均值±s.e.m。n＝7-14只小鼠/每组。图3J-2显示了注射表达dnMCAK的MDA-MB-231细胞的小鼠的图像，其中使用生物发光追踪疾病负担。图3J-3显示了注射表达Kif2b的MDA-MB-231细胞的小鼠的图像，其中使用BLI追踪疾病负担。图3K示出了心内注射对照或表达MCAK的H2030细胞5周后成像的整个动物的光子通量(p/s)。使用双侧曼-惠特尼检验进行显著性检验，MCAK组中n＝10只小鼠，对照组中5只小鼠。图3L显示了在肿瘤切除之前(第33天)和之后(第90天)用MDA-MB-231细胞原位移植的小鼠的代表性BLI图像。在第90天，可以在移植有表达dnMCAK的细胞的小鼠中检测转移瘤。图3M显示了用具有不同水平染色体不稳定性的MDA-MB-231细胞原位移植的小鼠的无远处转移存活率(DMFS)。如图所示，接受CIN-低细胞的动物全部存活(顶部图线)，而接受CIN-中细胞的大多数动物存活(中间图线)，但接受CIN-高细胞的大多数动物没有存活(底部图线)，n＝5-9只小鼠组，用对数秩检验进行成对显著性检验。
图4A至4H示出了染色体不稳定性丰富了间充质细胞特性。图4A显示了6821个细胞(列)和参与上皮细胞向间充质细胞转化(EMT，行)的基因的基因表达热图。黑色矩形表示富含间充质性状的基因-细胞簇。图4B显示了使用无监督K近邻图理论鉴定的具有12个亚群的6821个表达MCAK、Kif2b和dnMCAK的细胞的t-随机近邻嵌入(tSNE)投影。热图显示了从每个亚群差异表达基因的基因组富集分析推断出的FDRq<0.05的基因组的标准化富集得分(NES)。图4C显示了针对β-肌动蛋白、波形蛋白和DNA染色的表达MCAK或dnMCAK的细胞的代表性图像，比例尺为50μm。图4D显示了在培养18小时内侵袭通过胶原膜的细胞的代表性图像。图4E图示了在培养18小时内侵袭通过胶原膜的细胞数量(参见图4D)。柱代表平均值±s.e.m，*p<0.05。**p<0.01，双侧曼-惠特尼检验，n＝10个高倍视野，2个独立实验。图4F显示了基于大量RNA表达数据表达不同驱动蛋白-13蛋白的MDA-MB-231细胞的主成分分析(PCA)图。图4G显示了与CIN-低细胞(MCAK和Kif2b)相比，CIN-中/高(对照，Kif2a和dnMCAK)中高度富集的HALLMARK基因集的基因集富集分析(GSEA)的结果。图4H显示了标准化富集分数对错误发现率(FDR)的图。
图5A至5I示出了染色体不稳定细胞胞质DNA的细胞内在炎症。图5A显示了基因-基因相关性热图，其显示表达模块和与模块2最显著相关的HALLMARKS基因集。NES，标准化富集分数。图5B显示了用其驱动蛋白-13表达状态或关键基因签名的表达水平标记的6821个表达MCAK、Kif2b和dnMCAK的细胞的tSNE投影(上方)。关键基因签名之间的单细胞相关图如下所示。图5C-1显示了用ACA和DAPI染色的细胞中原核附近的微核的代表性图像，比例尺为5μm。图5C-2图示了表达各种驱动蛋白-13蛋白的MDA-MB-231细胞中微核的百分比。图5C-3图示了表达各种驱动蛋白-13蛋白的H2030细胞中微核的百分比。图5C-2和5C-3中的方框跨越中位和四分位间范围，柱跨越第5至95百分位，n＝638-1127个细胞，10个高倍视野，3个独立实验，使用双侧曼-惠特尼检验进行显著性检验。图5D图示了先前在图3C至3E中描述的来源于原发性肿瘤和转移瘤的细胞中微核的百分比。柱代表中位和四分位间范围，n＝10个原发性肿瘤和28个转移瘤，500至1500个细胞/样品，使用双侧曼-惠特尼检验进行显著性检验。图5E图示了细胞百分比与微核百分比之间的相关性，其展示了在所有注射的细胞系以及来源于原发性肿瘤和转移瘤的细胞中的染色体错误分离的证据。图5F显示了针对DNA(DAPI)、胞质双链DNA(使用抗dsDNA抗体)或单链DNA(使用抗ssDNA抗体)染色的表达MCAK和dnMCAK的细胞，比例尺为20μm。图5G图示了CIN-中/高和CIN-低MDA-MB-231和H2030细胞中标准化的胞质与核DNA比率。柱代表平均值±SD，使用双侧曼-惠特尼检验进行显著性检验。图5H显示了针对DNA(DAPI)、胞质DNA(dsDNA)或DNA酶2(RFP报道子)染色的细胞，比例尺为10μm，箭头表示表达DNA酶2的细胞。图5I显示了针对DNA(DAPI)、胞质DNA(dsDNA)或mCherry-核纤层蛋白B2染色的细胞，比例尺为10μm，箭头表示表达mCherry-核纤层蛋白B2的细胞。
图6A至6J示出了对胞质DNA的细胞响应造成转移。图6A显示了使用DAPI(DNA)、胞质DNA(dsDNA)或抗-cGAS抗体染色的细胞，比例尺为5μm。图6B图示了在细胞内具有(cGAS+)或不具有(cGAS-)cGAS定位的微核百分比，所述细胞表达驱动蛋白-13蛋白(或核纤层蛋白B2和dnMCAK)，n＝400个细胞，4个实验，使用双侧曼-惠特尼检验进行显著性检验。图6C显示了细胞的裂解物的免疫印迹，所述细胞表达不同驱动蛋白-13蛋白或STING shRNA(dnMCAK)，以β-肌动蛋白作为上样对照。图6D示出了表达CIN-中/高细胞(对照，Kif2a和dnMCAK)、CIN-低细胞(Kif2b和MCAK)或STING耗尽的dnMCAK的细胞(STING shRNA)的磷酸化的p100与总p100(上)和p52与p100(下)的蛋白质水平的标准化比率。柱代表平均值±s.e.m.，*p<0.05，**p<0.01，双尾曼-惠特尼检验，n＝4个生物重复。图6E显示了针对ReIB和DNA(DAPI)染色的表达MCAK、dnMCAK的细胞和表达对照或STING shRNA的细胞，箭头指向ReIB阳性核，比例尺为20μm。图6F图示了在具有低(<第30百分位)或高(>第30百分位)染色体不稳定性基因表达签名的乳腺癌患者中CIN应答性非经典NF-κB靶基因的平均z-标准化表达，方框跨越四分位数间范围，柱跨越第10至90百分位，使用双侧曼-惠特尼检验进行显著性检验。图6G-1图示了心内注射表达对照shRNA或STING shRNA的细胞5周后成像的整个动物的光子通量(p/s)。使用双侧曼-惠特尼检验进行显著性检验，对照组n＝9只小鼠，STING shRNA组16只小鼠。图6G-2显示了心内注射表达对照shRNA或STING shRNA的细胞5周后成像的整个动物。图6H图示了在培养24小时内侵袭通过胶原膜的DNA传感或非经典NF-κB通路中表达shRNA靶向基因的细胞的数目。柱代表平均值±s.e.m，**p<0.0001，双侧曼-惠特尼检验，n＝10个高倍视野，2个实验。图6I-6J示出了单细胞测序和群体检测。图6I示出了图4B所示的每个亚群的细胞组成。图6J显示了小提琴图(violin plot)，其说明了与其它亚群相比，富含上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)和染色体不稳定基因(亚群“M”)的细胞亚群中关键转移瘤和侵袭基因的表达，亚群使用无监督K近邻图理论进行识别。
图7A至7F示出了染色体不稳定性促进病毒样免疫应答，所述病毒样免疫应答促进了转移，但是同时募集了大量免疫浸润。图7A显示了染色体不稳定性促进病毒样免疫应答，其促进大量免疫浸润。图7B为说明染色体不稳定性(CIN)与转移和肿瘤免疫浸润通过对胞质DNA的肿瘤细胞内在炎症反应浸润联系起来的示意图。图7C-1显示了创口面积中的细胞在创口后36小时的代表性相衬图像。图7C-2图示了表达不同驱动蛋白-13蛋白的细胞的长宽比。对于图7C-1和7C-2，柱跨越四分位数间的范围，n＝100个细胞，2个实验，**p<0.0001，曼-惠特尼检验。图7D-1显示了用β-连环蛋白或DNA(DAPI)染色的表达MCAK(CIN-低)的代表性细胞，比例尺为30μm。图7D-2显示了用β-连环蛋白或DNA(DAPI)染色的表达dnMCAK(CIN-高)的代表性细胞，比例尺为30μm。图7E-1显示了表达驱动蛋白-13蛋白的细胞的伤口愈合测定的相衬图像，比例尺为800μm。图7E-2图示了创口形成后24小时和45小时的创口面积(标准化为0小时的时间点)。*p<0.05，双尾t-检验。图7F-1显示了在培养18小时内侵袭通过含有8μm孔的聚碳酸酯膜的细胞的图像。图7F-2图示了从膜底部刮下的细胞的标准化光密度(O.D.)，柱代表平均值±s.e.m.，*p<0.05，双侧t检验，n＝3个实验。
图8A至8C示出了染色体不稳定性产生微核和胞质dsDNA。图8A图示了图3C所示的CIN-低样品中微核的百分比。图8B图示了图3D所示的CIN-低样品中微核的百分比。图8C图示了图3E所示的CIN-低样品中微核的百分比。对于图8A-8C：注射的细胞、来源于原发性肿瘤的第一代细胞或转移瘤(由原发性肿瘤产生的一些自发转移瘤、由直接心内植入获得的一些转移瘤)。柱代表平均值±s.e.m.，n＝10个高倍视野，包括500至1500个细胞/样品，3个实验，*p<0.05，表示具有比注射的细胞系更高的错误分离率的样品，#p<0.05，表示具有比注射的细胞系更低的错误分离率的样品，**p<0.05，表示来源于同一动物的转移瘤和匹配的原发性肿瘤之间的显著差异，双尾t检验。
图9A至9M示出了胞质DNA传感通路对预后的影响。图9A图示了注射有共表达对照shRNA或STING shRNA的表达dnMCAK的细胞的小鼠的疾病特异性存活率，对照组n＝9只小鼠，STING shRNA组16只小鼠，用对数秩检验进行显著性检验。如图所示，通过表达STINGshRNA减少STING表达增加了表达dnMCAK的细胞的存活率。图9B图示了表达高和低水平的非经典NF-κB调节剂的乳腺癌患者随时间的无远处转移存活率(DMFS)(其中NFKB2、ReIB、MAP3K14正调节NF-κB，而TRAF2、TRAF3、BIRC2，BIRC3负调节NF-κB)。如图所示，低水平的此类非经典NF-κB调节剂的表达改善了存活率。图9C图示了表达高和低水平的CIN响应性非经典NF-κB靶点的乳腺癌患者随时间的无远处转移存活率(DMFS)(其中PPARγ、DDIT3、NUPR1、RAB3B、IGFBP4、LRRC8C、TCP11L2、MAFK、NRG1、F2R、KRT19、CTGF、ZFC3H1正调节CIN响应性非经典NF-κB靶点，而MACROD1、GSTA4、SCN9A、BDNF、LACTB负调节CIN响应性非经典NF-κB靶点)。如图所示，这种CIN响应性非经典NF-κB靶点的下调改善了存活率。图9D图示了表达高和低水平的经典NF-κB调节剂(NFKB1、ReIA、TRAF1、TRAF4、TRAF5、TRAF6)的乳腺癌患者随时间的无远处转移存活率(DMFS)。如图所示，此类经典NF-κB调节剂的表达增加改善了存活率。图9E图示了表达高和低水平干扰素信号传导调节剂(IRF1、IRF3、IRF7、TBK1)的乳腺癌患者随时间的无远处转移存活率(DMFS)。如图所示，此类干扰素信号传导调节剂的表达增加改善了存活率。图9F图示了表达高和低水平非经典NF-κB调节剂的乳腺癌患者随时间的无复发存活率(RFS)。如图所示，低水平的非经典NF-κB调节剂的表达改善了存活率。图9G图示了表达高和低水平的CIN响应性非经典NF-κB靶点的乳腺癌患者随时间的无复发存活率(RFS)。如图所示，稍微更高水平的CIN响应性非经典NF-κB靶点的表达稍微改善了存活率。图9H图示了表达高和低水平的经典NF-κB调节剂的乳腺癌患者随时间的无复发存活率(RFS)。如图所示，经典NF-κB调节剂的表达增加改善了存活率。图9I图示了表达高和低水平干扰素信号传导调节剂的乳腺癌患者随时间的无复发存活率(RFS)。如图所示，干扰素信号传导调节剂的表达增加改善了存活率。图9J图示了表达高和低水平非经典NF-κB调节剂的肺癌患者随时间的无进展存活率(PFS)。如图所示，非经典NF-κB调节剂的表达降低改善了存活率。图9K图示了表达高和低水平的CIN响应性非经典NF-κB靶点的肺癌患者随时间的无进展存活率(PFS)。如图所示，CIN响应性非经典NF-κB靶点的表达降低改善了存活率。图9L图示了表达高和低水平的经典NF-κB调节剂的肺癌患者随时间的无进展存活率(PFS)。如图所示，经典NF-κB调节剂的表达增加改善了存活率。图9M图示了表达高和低水平干扰素信号传导调节剂的肺癌患者随时间的无进展存活率(PFS)。如图所示，干扰素信号传导调节剂的表达增加改善了存活率。
图10A至10B示出了cGAMP的定量。图10A示出了可由LC-MS检测的cGAMP转变。图10B图示了使用靶向LC-MS代谢组学对染色体不稳定的尿三阴性乳腺癌细胞(4T1)中cGAMP的定量。如图所示，在4T1细胞中敲除cGAS会降低cGAMP的丰度。
具体实施方式
如本文所述，与其原发性肿瘤对应物相比，人类转移瘤在染色体上明显更不稳定。更具体地，正在发生的染色体分离错误以及微核或胞质DNA的存在预示着转移，因为增加的染色体分离错误会富集引发转移的肿瘤细胞亚群。相反，即使在高度非整倍体但稳定的细胞中，染色体不稳定性的降低也可以持久抑制转移性爆发。本文所述的方法和组合物可用于检测、监测和治疗此类染色体不稳定性和转移性癌症。
癌症检测与监测
如本文所述，染色体不稳定性是指示受试者患有癌症的标记，并且染色体不稳定性尤其可用于预测、检测和监测转移性癌症。大部分(60至80％)人类实体瘤含有染色体不稳定性。因此，本文描述了诊断癌症(特别是转移性癌症)的方法。此类方法在预测、检测、监测和治疗癌症(包括转移性癌症)方面出人意料地有效。本文所述的治疗方法可以与用于预测、检测和监测转移性癌症的方法配对。
例如，一种用于预测、检测和监测癌症(包括转移性癌症)的方法可以包括从受试者获得样品；和检测和/或定量样品中的细胞是否表现出染色体不稳定性。当在受试者样品中检测到染色体不稳定性时，所述方法还可以包括对受试者进行治疗。
例如，一种方法包括对具有可检测水平的染色体不稳定性的细胞或组织的受试者开始治疗或改良治疗，其中所述治疗包括给予一种可降低转移性癌症的发生或进展的药剂。
如本文所用，“获得测试样品”涉及从患者取出组织或流体样品，接收患者的组织或流体样品，从医师接收患者的组织或流体样品，经由邮件递送接收患者的组织或流体样品和/或从储存装置(例如，冰箱或冷冻机)或设施取出患者的组织或流体样品。因此，获得测试样品可涉及直接从患者取出或接收测试样品，但是获得测试样品还可以包括间接从医务人员、从存储装置/设施、从医疗设施运输之后的邮件递送服务以及其任何组合接收测试样品。因此，测试样品可以起源于一个位置，并被运输至另一位置进行接收和测试。这些活动或活动的组合中的任一个均涉及“获得测试样品”。测试样品可以为体液或组织样品。例如，测试样品可以为疑似含有癌细胞的细胞样品。样品可以包括来源于一种或多种原发性肿瘤的细胞和/或组织、来源于原发性肿瘤的肿瘤细胞、从循环中纯化的肿瘤细胞、转移性细胞样品或来源于转移性肿瘤的细胞。样品可以包括来源于已形成的转移瘤的细胞，例如，由于增加的染色体不稳定性是更具侵袭性的疾病的标志。例如，样品可以为乳腺或肺组织(或本文提及的任何组织类型)的组织活检。在另一实例中，当检测一些癌症标志物(例如，cGAMP水平)以预测、检测或监测癌症(特别是转移性癌症)时，样品可以为体液，诸如血液、血清、血浆、尿液、腹水、淋巴液或其组合。
如本文所用，检测和/或定量样品中的细胞是否表现出染色体不稳定性可包括检测和/或定量样品细胞中的微核、染色体错误分离或胞质染色体DNA。检测和/或定量微核、染色体错误分离、胞质DNA或其组合可以例如通过显微镜检查细胞染色体并对微核、染色体错误分离、胞质DNA或其组合进行计数来进行。
在一些情况下，细胞样品可以被固定和/或裂解。可以选择后期细胞进行分析。在一些情况下，染色体可以用蛋白酶(例如，胰蛋白酶)处理，例如以改善可视化。在一些情况下，染色体可以用促进染色体或DNA的可视化的染料或标记抗体染色。可使用的染料的实例包括苏木精和曙红(H&E)染色剂、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色剂、喹吖因染色剂、吉姆沙染色剂、和其它染色体或DNA染色剂。
例如，当至少10％，或至少11％，或至少12％，或至少13％，或至少14％，或至少15％的染色体表现出错误分离时，癌症(特别是转移性癌症)可以被预测、检测到或经历进展。在一些情况下，当约15至20％的染色体表现出错误分离时，癌症(特别是转移性癌症)可以被预测、检测到或经历进展。
微核比染色体错误分离更容易鉴定。例如，当至少3％，至少4％或至少5％的细胞表现出微核时，癌症(特别是转移性癌症)可以被预测、检测到或经历进展。在一些情况下，当约5％至8％的细胞表现出微核时，癌症(特别是转移性癌症)可以被预测、检测到或经历进展。
在一些情况下，任何量的胞质DNA均指示癌症。可以通过在胞质中(而不是在细胞核中)的DNA(染色)检测胞质DNA。为了检测胞质DNA，可以使用任何方便的DNA染色剂。例如，双链DNA染色剂可用于检测和定量胞质DNA。例如，当观察到胞质内染色强度与正常非癌组织相比增加1倍至2倍时，癌症(特别是转移性癌症)可以被预测、检测到或经历进展。用于对比的正常非癌组织可以来自同一患者，或者其可以是源自正常组织样品的参比组织。
本文描述了一种用于检测和定量环状鸟苷一磷酸-腺苷一磷酸(cGAMP)的测定方法，其可用于鉴定患有癌症(包括转移性癌症)的患者。例如，通过将样品中的cGAMP水平与取自同一患者的参比正常组织或相邻正常组织进行对比，可以将样品中的总cGAMP浓度用作转移的标记。cGAMP增加10％，或20％，或30％，或50％，或70％，或80％，或90％可以鉴定患有或将要发展为癌症(包括转移性癌症)的患者。在一些情况下，cGAMP比正常增加1倍至2倍可以鉴定患有或将要发展为癌症(包括转移性癌症)的患者。治疗前和治疗后不久样品中cGAMP浓度增加为肿瘤反应的标记。cGAMP水平再增加1倍至2倍的变化为肿瘤反应的指征。
本文描述了一种使用cGAMP作为CIN驱动的癌症和转移性疾病的新代谢物生物标志物来诊断患者的转移性疾病的方法。cGAMP的测量可用作准确和特异性鉴定患有转移性疾病的患者的临床模式。患者样品(肿瘤、非癌组织、血液、血清、尿液和血浆)中cGAMP的测量以及其中cGAMP的相对存在与否，也可提供信息，使临床医生可以将其与癌症侵袭性或转移性疾病的可能诊断以及阴性诊断(例如，正常或疾病缺乏)相关联。
此外，本文描述了一种基于确定cGAMP随时间的水平并建立cGAMP分布图来监测患者对治疗的反应的方法。这种方法可以包括产生受试者中的cGAMP的分布图，包含从受试者获得样品；使用液相色谱法和/或质谱法测量cGAMP的水平；以及基于对比，得到指示所述受试者是否患有转移性疾病的分布图。参比分布图可以从无转移性疾病的健康对照受试者群体、患有局部癌症疾病的受试者群体和患有转移性疾病的受试者群体获得。
可以将样品中测得的cGAMP浓度或量与来自正常组织(不一定来自同一患者)的正常参比值进行对比，或者如果可以的话，将其与相邻正常组织中的cGAMP水平进行对比。例如，对于诊断患有乳腺癌后进行乳房切除术的患者，正常乳腺(未患癌症)样品中cGAMP水平的测量值可用作参比值或对照值。或者，对于无法获得正常组织的患者，可以使用例如来自非癌性乳房的参比库中的正常组织作为参比或对照。
一旦建立了分布图，cGAMP水平可用作参比点，以对比和表征未知样品和寻求进一步信息的样品。例如，相对于对照(例如，在较早的时间点取自受试者的样品或根据上述群体分布测定的平均cGAMP水平)，cGAMP水平降低(相对于基线至少降低10％或更多，或降低大于1倍，2倍或更多)可指示阳性治疗结果。然而，cGAMP水平的增加(至少增加10％或更多，或增加超过1倍)可指示转移性疾病的存在或可能性和治疗结果不佳。
转移性疾病的确定基于与参比对照水平或个性化纵向时间点相比测量的cGAMP水平。对照水平表示无转移性疾病的对照受试者中的水平，或治疗前后的水平。
在上述两个实施例中，测量作为生物标记的cGAMP水平可以包括使用液相色谱-质谱(LC-MS)。
简言之，从尿液、血液、血浆、血清和脑脊液中收集样品。在某些实施例中，样品还包含肿瘤细胞或邻近肿瘤的正常组织细胞。一旦收集，如本文所述处理样品。用于本发明实施例的非限制性示例性处理步骤包括有机酸的提取、柱纯化(例如，阴离子交换纯化)、色谱分析(例如，尺寸排阻色谱分析)、离心和醇处理(例如，甲醇或乙醇)。
例如，可以洗涤细胞样品的细胞，然后在液氮上冷冻以保存细胞的代谢状态。然后可以将细胞收集/刮到冷甲醇(-80℃)中。然后，甲醇代谢物提取物可以使用如Collins等人(《细胞宿主与微生物(Cell Host&Microbe)》17(6):820-828(2015))所述的HyperSep氨丙基固相柱通过固相提取(SPE)纯化。可以将流出物干燥并在70％乙腈的ddH2O溶液中重构。重构的流出物可以通过LC-MS/MS分析进行分析。
在一些情况下，可以评价血清或培养基的cGAMP的浓度或量。为了检测/定量培养基中分泌的cGAMP，可以收集条件培养基的等分试样，将其按照80:20与甲醇混合，并在4摄氏度下以3000rpm离心20分钟。所得上清液可以在LC-MS/MS之前在-80摄氏度下收集和储存以评估cGAMP水平。
为了测量全细胞相关代谢物，可以吸出培养基并且可以例如以非汇合密度收获细胞。
可以使用多种不同的液相色谱(LC)分离方法。
每种方法可以通过负电喷雾电离(ESI，-3.0kV)与以多反应监测(MRM)模式运行的三重四极质谱仪偶联，其中MS参数在输注代谢物标准溶液上优化。
本文还描述了鉴定正在进行的乳腺癌转移和/或将经历或存活乳腺癌转移的患者的方法。测试样品中一种或多种以下基因的表达降低可以识别正在进行的乳腺癌转移和/或将经历乳腺癌转移的患者：PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24、FGF5或NTN。
如本文所述，这些基因PREDICTS表达的提高增加了乳腺癌的无远处转移存活率。下列基因的表达升高被称为染色体不稳定性(CIN)签名：PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24、FGF5和NTN4。因此，本文还描述了识别可具有无转移存活的患者的方法，其中所述方法涉及定量患者样品中PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24或FGF5中的一种或多种基因的表达，以获得针对所述患者的这些基因中一个或多个的测定的定量表达水平。在一些情况下，这一方法可以涉及测量这些基因的表达水平，但不测量其它基因的表达水平。
如本文所述评价储存在KM-Plotter数据库(参见网站www.kmplot.com)中的微阵列基因表达数据集。每个基因使用以下微阵列探针(请注意，一些基因具有多个名称，且其它名称可在下面列出)：219132_at(PELI2)、205289_at(BMP2)、207586_at(SHH)、230398_at(TNS4)、227123_at(RAB3B)、213194_at(ROBO1)、227911_at(ARHGAP28)、213385_at(CHN2)、206224_at(CST1)、203305_at(F13A1)、208146_s_at(CPVL)、226492_at(SEMA6D)、201431_s_at(DPYSL3)、228640_at(PCDH7)、209781_s_at(etoile)、210972_x_at(TRA@)、220169_at(TMEM156)、206994_at(CST4)、266_s_at(CD24)、210311_at(FGF5)、200948_at(MLF2)。使用36百分位的截止值，使得那些基因累积表达高于底部36百分位的基因的患者具有更高的无转移存活率。
在第二个数据集中，使用来自Next-Gen测序的公开保藏的基因表达数据，并且使用中位表达值作为截止值以鉴定存活改善的患者。表达值大于PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24、FGF5的中位表达值的那些患者具有改善的存活率。因此，可以在患者样品中定量这些基因中每一个的表达水平，并且可以将这些定量的表达水平与这些基因中每一个的中位参比表达水平进行对比。这些基因中的每一个的此类中位参比表达水平可以是来自一系列转移性癌症患者的样品中这些基因中的每一个的中位表达。
所测试的样品可以来自患有乳腺癌的患者，例如，无可检测的转移性乳腺癌的患者，或无显著转移性乳腺癌的患者。类似地，中位参比表达水平可以从一系列来自正在进行的转移性乳腺癌患者的样品获得。
在这一类型的分析中，根据患者群体和所使用的分析，通常使用25百分位至75百分位的截止值。
使用第一方法和第二方法获得相似的结果。
因此，本文描述了一种鉴定具有改善的存活率的患者的方法。所述方法可以包括从患有原发性癌症类型(例如，原发性乳腺癌)的患者收集样品；根据NextGen测序的标准方案进行RNA纯化和制备(参见，例如网站qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/total-rna/rneasy-mini-kit/#orderinginformation)；使用RT-PCR、NextGen测序或微阵列方法测定相对或绝对RNA表达水平；将23个基因的表达值相加；在这一组中确定预测无远处转移存活(DMFS)的最佳截止值；将其用作后续患者的绝对截止值。注意在一些情况下，正常组织参比对照可用于最佳校准(例如，乳腺癌的乳腺组织、胰腺癌的正常胰腺等)。
可以将如此获得的测量的定量表达水平与对照进行对比，例如，在一组正在进行乳腺癌转移的患者中一种或多种相应的PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24或FGF5基因的中位或平均表达水平。当测量的定量表达水平高于对照水平时，患者可以具有无转移存活。例如，当测量的定量表达水平高于对照水平时，这种无转移存活增加的患者可以比具有进行性乳腺癌转移的对照组患者多存活至少5个月，至少10个月，至少12个月，至少15个月，至少20个月，至少25个月，至少50个月，或至少100个月。
在一些情况下，降低或增加的表达可以是这些基因中的两种或更多种，或三种或更多种，或四种或更多种，或五种或更多种，或六种或更多种，或七种或更多种，或八种或更多种，或九种或更多种，十种或更多种，或十一种或这些基因中更多，或十二种或更多，或十三种或更多，或十四种或更多，或十五种或更多，或十六种或更多，或十七种或更多，或十八种或更多，或十九种或更多，或二十种或更多，或二十一种或更多，或二十二种或更多。如本文所用，与对照相比，这些基因表达的降低或增加可以是前述基因表达降低或增加至少10％，或20％，或30％，或40％，或50％，或60％，或75％，或100％。与对照相比，这些基因表达的这种降低或增加也可以增加至少1.2倍，或1.5倍，或2倍，或3倍，或5倍，或7倍，或10倍。这种对照可以为健康或非癌组织样品。在其它情况下，对照可以为癌性或转移性组织。
治疗方法
出人意料的是，由染色体不稳定性赋予的前转移表型是由对胞质双链DNA(dsDNA)的肿瘤细胞内在炎症反应驱动的。环状GMP-AMP合酶(cGAS)和其下游效应子STING对胞质DNA的传感，激活非经典NF-κB通路，并以肿瘤细胞自主的方式驱动侵袭和转移。染色体不稳定性和先天细胞炎症之间的这种意想不到的联系为基因组不稳定肿瘤的治疗干预提供了新途径。因此，本文所述的治疗方法可包括鉴定患者样品中的细胞是否表现出提高水平的胞质DNA、微核、染色体错误分离或其组合的方法。如本文所述，cGAMP水平的增加也指示癌症，特别是转移性癌症。然后可以如本文所述或通过多种其它治疗方法治疗具有提高水平的胞质DNA、微核、染色体错误分离或其组合的患者。
例如，一种方法可以包括将转移性化学治疗剂给予具有细胞样品或体液样品的患者：
a.所述细胞样品的一个或多个细胞内具有至少10％，或至少11％，或至少12％，或至少13％，或至少14％，或至少15％的可检测的染色体错误分离；
b.所述细胞样品的一个或多个细胞内具有至少3％，至少4％或至少5％的细胞可检测的微核；
c.所述细胞样品的一个或多个细胞内具有可检测的胞质双链DNA；或
d.所述细胞样品或体液样品中cGAMP的浓度或量高至少10％，或20％，或30％，或50％，或70％，或80％，或90％；
从而治疗患者的转移性癌症。
可以使用多种化学治疗剂。本文所述的方法可以例如包括给予驱动蛋白-13蛋白(如Kif2b、MCAK/Kif2c和/或KIF13A)，和任选地给予ABCC4和/或ABCG2蛋白。本文所述的方法可包括在转基因或载体中表达驱动蛋白-13蛋白(如Kif2b、MCAK/Kif2c和/或KIF13A)，和任选地在转基因或载体中表达ABCC4和/或ABCG2。所述方法还可以包括抑制STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1或其任何组合。
例如，本文描述了涉及细胞中驱动蛋白-13蛋白(如Kif2b、MCAK/Kif2c或KIF13A)的表达和/或活性增加的方法和组合物。此类方法和组合物可用于治疗癌症。所述方法和组合物可包括增加的ABCC4、ABCG2或其组合的表达和/或活性。此类驱动蛋白-13蛋白、ABCC4蛋白、ABCG2蛋白或其组合的激动剂可用于增加这些蛋白的活性。
本文所述的方法和组合物还可包括在哺乳动物细胞中抑制STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1或其任何组合。细胞可以是体外的(例如，在培养物中)或体内的(例如，在受试动物体内)。
本文所述的组合物和方法可包括使用驱动蛋白-13蛋白(如Kif2b、MCAK/Kif2c和/或KIF13A蛋白)。所述组合物和方法还可以包括使用编码驱动蛋白-13(如Kif2b、MCAK/Kif2c、KIF13A或其组合)的驱动蛋白-13核酸。所述组合物和方法还可以包括一种或STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1或其组合的抑制剂。此类抑制剂的实例包括抗体或抑制性核酸(例如，在载体中或从表达载体表达)。此类组合物和方法可用于治疗和抑制癌症(包括转移性癌症)的发展。
如本文所述，增加的驱动蛋白-13蛋白(如Kif2b、MCAK/Kif2c和/或KIF13A)的活性和/或水平，和增加的ABCC4和/或ABCG2的活性和/或水平可以降低癌症(包括转移性癌症)的发生率和/或进展。降低STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1或其任何组合的表达也可降低癌症(包括转移性癌症)的发生率和/或进展。
可从例如国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)(NCBI)数据维护的数据库(ncbi.nlm.nih.gov.)获得驱动蛋白-13蛋白和核酸(如Kif2b、MCAK/Kif2c和KIF13A以及ABCC4、ABCG2蛋白和核酸)的序列，和STING、cGAS、NF-κB转录因子p52和NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和MST1的序列。
例如，一种驱动蛋白-13蛋白为Kif2b蛋白，其可以具有以下人序列(SEQ ID NO:1；NCBI登录号NP_115948)。
Figure GDA0002476633540000221
Figure GDA0002476633540000231
编码SEQ ID NO:1人Kif2b蛋白的cDNA序列在下面显示为SEQ ID NO:2(NCBI登录号NM_032559)。
Figure GDA0002476633540000232
Figure GDA0002476633540000241
驱动蛋白-13蛋白为MCAK/Kif2c蛋白，其可以具有以下人序列(SEQ ID NO:3；NCBI登录号BAG50306.1)。
Figure GDA0002476633540000251
编码SEQ ID NO:3人MCAK/Kif2c蛋白的cDNA序列在下面显示为SEQ ID NO:4(NCBI登录号AB264115.1)。
Figure GDA0002476633540000252
Figure GDA0002476633540000261
Figure GDA0002476633540000271
另一种驱动蛋白-13蛋白为KIF13A蛋白，其可以具有以下人序列(SEQ ID NO:5；NCBI登录号NP_071396.4)。
Figure GDA0002476633540000281
Figure GDA0002476633540000291
编码SEQ ID NO:5人KIF13A蛋白的cDNA序列在下面显示为SEQ ID NO:6(NCBI登录号NM_022113.5)。
Figure GDA0002476633540000292
Figure GDA0002476633540000301
Figure GDA0002476633540000311
Figure GDA0002476633540000321
Figure GDA0002476633540000331
Figure GDA0002476633540000341
人MCAK蛋白的示例序列在下面显示为SEQ ID NO:7；NCBI登录号NP_006836.2)。
Figure GDA0002476633540000342
编码SEQ ID NO:7人MCAK蛋白的cDNA序列在下面显示为SEQ ID NO:8(NCBI登录号NM_006845.3)。
Figure GDA0002476633540000343
Figure GDA0002476633540000351
Figure GDA0002476633540000361
Figure GDA0002476633540000371
人ABCC4蛋白的示例序列在下面显示为SEQ ID NO:9；NCBI登录号AAH41560.1)。
Figure GDA0002476633540000372
编码SEQ ID NO:9人ABCC4蛋白的cDNA序列在下面显示为SEQ ID NO:10(NCBI登录号BC041560.1)。
Figure GDA0002476633540000373
Figure GDA0002476633540000381
Figure GDA0002476633540000391
Figure GDA0002476633540000401
人ABCG2蛋白的示例序列在下面显示为SEQ ID NO:11；NCBI登录号AAG52982.1)。
Figure GDA0002476633540000402
编码SEQ ID NO:11人ABCG2蛋白的cDNA序列在下面显示为SEQ ID NO:12(NCBI登录号AY017168.1)。
Figure GDA0002476633540000403
Figure GDA0002476633540000411
Figure GDA0002476633540000421
Kinsin-13、MCAK、ABCC4和/或ABCG2蛋白和核酸可以表现出序列变异。然而，与本文所示的氨基酸和核酸序列具有小于100％序列同一性的变体仍可具有相似的活性。例如，与SEQ ID NO:1-12中的任一个具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或至少99.5％序列同一性的kinsin-13、MCAK、ABCC4和/或ABCG2蛋白和核酸仍可用于本文所述的组合物和方法中。
Kinsin-13、MCAK、ABCC4和/或ABCG2蛋白可给予可能表现出染色体不稳定性的受试者或可能患有癌症或疑似发展为癌症的受试者。类似地，可以将编码kinsin-13、MCAK、ABCC4和/或ABCG2蛋白的表达盒和/或表达载体给予可能表现出染色体不稳定性的受试者或可能患有癌症或疑似患有癌症的受试者。
此外，可以给予kinsin-13、MCAK、ABCC4和/或ABCG2激动剂以增强驱动蛋白-13蛋白活性。例如，可以将驱动蛋白13激动剂UMK57(对Kif2c/MCAK具有特异性)给予可能表现出染色体不稳定性的受试者或患有癌症或疑似发展为癌症的受试者。UMK57的结构如下所示，其中X为甲基(CH3)。
Figure GDA0002476633540000431
在一些情况下，可以抑制各种内源核酸(mRNA)和蛋白质的表达。例如，可以抑制STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1或其任何组合的表达。
人STING蛋白序列(SEQ ID NO:13；NCBI登录号NP_938023XP_291127)的一个实例如下所示。
Figure GDA0002476633540000432
Figure GDA0002476633540000441
编码SEQ ID NO:13人STING蛋白的cDNA序列在下面显示为SEQ ID NO:14(NCBI登录号NM_198282XM_291127)。
Figure GDA0002476633540000442
Figure GDA0002476633540000451
cGAS(环状GMP-AMP合酶)蛋白可以包括以下人类序列(SEQ ID NO:15；NCBI登录号NP_612450)。
Figure GDA0002476633540000452
Figure GDA0002476633540000461
编码SEQ ID NO:15人cGAS蛋白的cDNA序列在下文显示为SEQ ID NO:16(NCBI登录号NM_138441)。
Figure GDA0002476633540000462
Figure GDA0002476633540000471
NF-κB转录因子p52蛋白可包括以下人序列(SEQ ID NO:17；NCBI登录号NP_001309863XP_005269917)。
Figure GDA0002476633540000472
Figure GDA0002476633540000481
编码SEQ ID NO:17人NF-κB转录因子p52蛋白的cDNA序列在下面显示为SEQ IDNO:18(NCBI登录号NM_001322934XM_005269860)。
Figure GDA0002476633540000482
Figure GDA0002476633540000491
Figure GDA0002476633540000501
Figure GDA0002476633540000511
NF-κB转录因子ReIB蛋白可包括以下人序列(SEQ ID NO:19；NCBI登录号NP_006500)。
Figure GDA0002476633540000512
编码SEQ ID NO:19人NF-κB转录因子ReIB蛋白的cDNA序列在下面显示为SEQ IDNO:20(NCBI登录号NM_006509)。
Figure GDA0002476633540000513
Figure GDA0002476633540000521
Figure GDA0002476633540000531
例如，ENPP1蛋白可以包括以下人序列(SEQ ID NO:21；NCBI登录号NP_006199.2)。
Figure GDA0002476633540000532
Figure GDA0002476633540000541
编码SEQ ID NO:21人ENPP1蛋白的cDNA序列在下面显示为SEQ ID NO:22(NCBI登录号NM_006208.2)。
Figure GDA0002476633540000542
Figure GDA0002476633540000551
Figure GDA0002476633540000561
Figure GDA0002476633540000571
Figure GDA0002476633540000581
Figure GDA0002476633540000591
Figure GDA0002476633540000601
例如，LTβR蛋白可包括以下人序列(SEQ ID NO:23；NCBI登录号P36941.1)。
Figure GDA0002476633540000602
编码SEQ ID NO:23人LTβR蛋白的cDNA序列在下面显示为SEQ ID NO:24(NCBI登录号NM_002342.2)。
Figure GDA0002476633540000603
Figure GDA0002476633540000611
Figure GDA0002476633540000621
STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和MST1蛋白和核酸可以表现出序列变异。然而，与本文所示的氨基酸和核酸序列具有小于100％序列同一性的变体仍可具有相似的活性。例如，与SEQ IDNO:13-24中的任一个具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或至少99.5％序列同一性的STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和MST1蛋白和核酸仍可用于本文所述的组合物和方法中。
表达系统
编码任何kinsin-13、MCAK、ABCC4和/或ABCG2蛋白的核酸片段，以及编码STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1的核酸片段，或包括任何STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1抑制性核酸的核酸片段可被插入任何合适的表达系统或与任何合适的表达系统一起使用。治疗有效量的kinsin-13、MCAK、ABCC4和/或ABCG2蛋白可由此类表达系统产生。治疗有效的STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1抑制性核酸也可以从此类表达系统产生。
核酸(或抑制性核酸)的重组表达可用载体(如质粒)有效地完成。载体可包括一种与编码kinsin-13、MCAK、ABCC4和/或ABCG2蛋白，或蛋白如STING、cGAS、NF-κB转录因子p52和/或NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1的核酸片段可操作连接的启动子。在另一实例中，载体可包括与编码STING、cGAS、NF-κB转录因子p52和/或NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1抑制性核酸的核酸片段可操作连接的启动子。
载体还可以包括转录和翻译所需的其它元件。如本文所用，载体是指含有外源DNA的任何载体。因此，载体是在不降解的情况下将外源核酸转运至细胞中并包括启动子的试剂，所述启动子在其被递送至的细胞中产生核酸表达。载体包括但不限于质粒、病毒核酸、病毒、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒和人工染色体。多种原核和真核表达载体适于携带、编码和/或表达kinsin-13、KIF13A、MCAK、ABCC4和/或ABCG2。多种原核和真核表达载体适于携带、编码和/或表达STING、cGAS、NF-κB转录因子p52和/或NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1抑制性核酸。此类表达载体包括例如pET、pET3d、pCR2.1、pBAD、pUC和酵母载体。载体可用于例如各种体内和体外情况。
表达盒、表达载体以及所述盒或载体中的序列可以是异源的。如本文所用，术语“异源的”当用于指表达盒、表达载体、调控序列、启动子或核酸时，是指已经以某种方式操纵的表达盒、表达载体、调控序列或核酸。例如，异源启动子可以为不与目的核酸天然连接的启动子，或已通过细胞转化方法导入细胞的启动子。异源核酸或启动子还包括生物天然的但已经以某种方式改变(例如，置于不同的染色体位置、突变、多拷贝添加、与非天然启动子或增强子序列连接等)的核酸或启动子。异源核酸可包含序列，所述序列包含cDNA形式；所述cDNA序列可以正义(产生mRNA)或反义方向(产生与mRNA转录物互补的反义RNA转录物)表达。异源编码区可与内源编码区区分开，例如，当异源编码区与包含调控元件的核苷酸序列连接时，所述调节元件如是未发现与编码区天然相关的启动子，或者当异源编码区与未发现于天然的染色体部分相关时(例如，在由编码区编码的蛋白未正常表达的基因座中表达的基因)。类似地，异源启动子可以为与其天然未连接的编码区连接的启动子。
可以使用的病毒载体包括涉及慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、神经元营养病毒、辛德毕斯(Sindbis)和其它病毒的那些。同样有用的是共享这些病毒特性的任何病毒家族，其使得它们适合用作载体。可以使用的逆转录病毒载体包括Verma,I.M.《用于基因转移的逆转录病毒载体(Retroviral vectors forgene transfer)》。《微生物学(Microbiology)》-1985，美国微生物学会(American Societyfor Microbiology)，第229-232页，华盛顿，(1985)中描述的那些。例如，此类逆转录病毒载体可包括鼠马罗尼白血病病毒MMLV和其它表达所需特性的逆转录病毒。通常，病毒载体含有非结构早期基因、结构晚期基因、RNA聚合酶III转录物、复制和衣壳化必需的反向末端重复以及控制病毒基因组转录和复制的启动子。当作为载体进行工程改造时，病毒通常去除一个或多个早期基因，并将基因或基因/启动子盒插入病毒基因组中代替去除的病毒核酸。
表达盒和/或表达载体中可包括多种调节元件，包括启动子、增强子、翻译起始序列、转录终止序列以及其它元件。“启动子”通常是当相对于转录起始位点位于相对固定的位置时发挥作用的DNA序列。例如，启动子可以位于编码kinsin-13、MCAK、ABCC4和/或ABCG2蛋白的核酸片段的上游。在另一实例中，启动子可以位于STING、cGAS、NF-κB转录因子p52和/或NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1抑制性核酸区段的上游。
“启动子”含有RNA聚合酶和转录因子基本相互作用所需的核心元件，并且可以含有上游元件和应答元件。“增强子”通常是指在离转录起始位点不固定距离处起作用并且可以在转录单位的5'或3'的DNA序列。此外，增强子可以在内含子内以及编码序列本身内。其长度通常在10和300之间，并且它们以顺式起作用。增强子的功能为增加附近启动子的转录。增强子，如启动子，也经常含有介导转录调节的应答元件。增强子通常决定表达的调节。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或有核细胞)的表达载体也可含有终止转录的序列，其可影响mRNA表达。这些区域在编码组织因子蛋白的mRNA的未翻译部分转录为聚腺苷酸化片段。3'非翻译区还包括转录终止位点。优选的是转录单元也含有聚腺苷酸化区域。这一区域的一个优点为增加了转录单元像mRNA一样被加工和转运的可能性。在表达构建体中鉴定和使用聚腺苷酸化信号是众所周知的。优选在转基因构建体中使用同源聚腺苷酸化信号。
kinsin-13、KIF13A、MCAK、ABCC4和/或ABCG2蛋白，或STING、cGAS、NF-κB转录因子p52和/或NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1抑制性核酸自表达盒或表达载体的表达可以由能够在原核细胞或真核细胞中表达的任何启动子控制。可以使用的原核启动子的实例包括但不限于SP6、T7、T5、tac、bla、trp、gal、lac或麦芽糖启动子。可使用的真核启动子的实例包括但不限于组成型启动子，例如病毒启动子(如CMV、SV40和RSV启动子)，以及可调节的启动子，例如诱导型或阻遏型启动子(如tet启动子、hsp70启动子和CRE调节的合成启动子)。用于细菌表达的载体包括pGEX-5X-3，用于真核表达的载体包括pCIneo-CMV。
表达盒或载体可包括编码标记产物的核酸序列。这一标记产物用于确定基因是否已经被递送至细胞，并且一旦被递送则所述标记产物被表达。标记基因可以包括编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌lacZ基因和绿色荧光蛋白。在一些实施例中，标记可以为选择标记。当此类选择标记成功地转移至宿主细胞中时，如果置于选择压力下，转化的宿主细胞可以存活。存在两种广泛使用的不同类别的选择方案。第一类基于细胞的新陈代谢和突变细胞系的使用，所述突变细胞系缺乏独立于补充培养基生长的能力。第二类为显性选择，其是指用于任何细胞类型且不需要使用突变细胞系的选择方案。这些方案通常使用药物来抑制宿主细胞的生长。具有新基因的那些细胞将表达传递抗药性的蛋白，并在选择中存活下来。这种显性选择的实例使用药物新霉素(Southern P.和Berg,P.，《分子应用遗传学杂志(J.Molec.Appl.Genet.)》1:327(1982))、霉酚酸(Mulligan,R.C和Berg,P.《科学(Science)》209:1422(1980))或潮霉素(Sugden,B等人，《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》5:410-413(1985))。
基因转移可以使用遗传物质的直接转移获得，所述遗传物质在但不限于质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒和人工染色体中，或者通过遗传物质在细胞或载体(如阳离子脂质体)中的转移获得。此类方法是本领域公知的，并且容易适用于本文所述的方法。转移载体可以是用于将基因递送到细胞中的任何核苷酸构建体(例如，质粒)，或作为递送基因的一般策略的一部分(例如，作为重组逆转录病毒或腺病毒的一部分)(Ram等人，《癌症研究(Cancer Res)》)53:83-88,(1993))。用于转染的合适手段，包括病毒载体、化学转染子或物理-机械方法，如电穿孔和DNA的直接扩散，描述于例如Wolff,J.A等人，《科学(Science)》247,1465-1468,(1990)；以及Wolff,J.A《自然(Nature)》352,815-818,(1991)。
例如，驱动蛋白-13相关(例如，kinsin-13、MCAK、ABCC4、ABCG2或KIF13A)核酸分子、表达盒和/或载体，和/或STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1抑制性核酸分子、表达盒和/或载体可通过任何方法引入细胞，所述方法包括但不限于钙介导的转化、电穿孔、显微注射、脂转染、粒子轰击等。细胞可以在培养物中扩增，然后给予受试者，例如哺乳动物(如人类)。所给予的细胞的量或数目可以变化，但是可以使用约106至约109个细胞的量。细胞通常在生理溶液如盐水或缓冲盐水中递送。细胞也可以在溶媒(如脂质体群、外泌体群或微泡群)中递送。
在一些情况下，转基因细胞可产生含有驱动蛋白-13相关(例如，kinsin-13、MCAK、ABCC4、ABCG2或KIF13A)核酸分子、表达盒和/或载体的外泌体或微泡，和/或产生STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1抑制性核酸。微泡可介导多种蛋白质、脂质、mRNA和微RNA的分泌，与相邻细胞相互作用，并由此可从细胞到细胞传递信号、蛋白质、脂质和核酸(参见例如Shen等人，《生物化学杂志(J Biol Chem)》286(16):14383–14395(2011)；Hu等人，《基因学前沿(Frontiers in Genetics)》3(2012年4月)；Pegtel等人，《美国国家科学协会公报(Proc.Nat'l Acad Sci)》107(14):6328–6333(2010)；WO/2013/084000；这些文献中的每一个均通过引用整体并入本文。产生此类微泡的细胞可用于表达STING、cGAS、NF-κB转录因子p52和/或NF-κB转录因子、驱动蛋白-13相关(例如，kinsin-13、MCAK、ABCC4、ABCG2或KIF13A)、ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1蛋白和/或抑制性核酸。
可以将具有表达驱动蛋白-13蛋白(例如，Kif2b、MCAK/Kif2c、kinsin-13、MCAK、ABCC4、ABCG2或KIF13A)，还可以任选地表达STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14和/或NIK(MAP3K14)和/或MST1抑制性核酸的异源表达盒或表达载体的转基因载体或细胞给予受试者。具有异源表达盒或表达载体的转基因载体或细胞也可以任选地表达ENPP1。由转基因细胞产生的外泌体可以用于将驱动蛋白-13/MCAK核酸或蛋白(例如，Kif2b、MCAK/Kif2c、ABCC4、ABCG2和/或KIF13A核酸或蛋白)递送至受试者的肿瘤和癌细胞。由转基因细胞产生的外泌体可用于将STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1抑制性核酸递送至受试者的肿瘤和癌细胞。
包括STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1或其任何组合的抑制剂的方法和组合物可涉及使用针对STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1或其任何组合的抗体或抑制性核酸。
抑制性核酸
例如通过使用抑制性核酸，下列的表达可以被抑制：STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1或其任何组合，所述抑制性核酸特异性识别编码STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1的核酸。
抑制性核酸可以具有至少一个在细胞内或严格条件下与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1核酸杂交的片段。抑制性核酸可以降低编码STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1的核酸的表达。核酸可以与基因组DNA、信使RNA或其组合杂交。抑制性核酸可被掺入质粒载体或病毒DNA中。其可为单链或双链的、环状或线性的。
抑制性核酸为长度超过13个核苷酸的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物。抑制性核酸可包括天然存在的核苷酸；合成的、修饰的或假核苷酸，如硫代磷酸酯；以及具有可检测标记(如P32、生物素或地高辛)的核苷酸。抑制性核酸可以降低STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1核酸的表达和/或活性。这种抑制性核酸可以与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1核酸的片段完全互补。或者，相对于STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1序列，在抑制性核酸序列中允许某些可变性。抑制性核酸可以在细胞内条件下或在严格杂交条件下与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1核酸杂交，并且充分互补以抑制STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1核酸的表达。细胞内条件是指通常在细胞(例如，动物或哺乳动物细胞)内发现的条件，例如温度、pH和盐浓度。这种动物或哺乳动物细胞的一个实例为髓系祖细胞。这种动物或哺乳动物细胞的另一实例为来源于髓系祖细胞的更分化的细胞。通常，严格杂交条件选择为比特定序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约5℃。然而，严格条件包含比选定序列的热熔点低约1℃至约20℃的温度，这取决于所需的严格程度，如本文另外限定。包含例如与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1编码序列精确互补的2个、3个、4个或5个或更多个连续核苷酸段的抑制性寡核苷酸可以抑制STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1核酸的功能，其中每个核苷酸段均由与相邻编码序列不互补的一段连续核苷酸段隔开。通常，连续核苷酸的每一段长度为至少4个、5个、6个、7个或8个或更多个核苷酸。非互补插入序列的长度可以为1个、2个、3个或4个核苷酸。本领域技术人员可以容易地使用计算出的与正义核酸杂交的抑制性核酸的熔点来估计抑制特定靶核酸表达所容许的错配程度。本发明的抑制性核酸包括，例如，短发夹RNA、小干扰RNA、核糖酶或反义核酸分子。
本文显示了编码STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1的核酸的实例。实例1提供了抑制性核酸序列的实例，包括SEQ ID NO:25-36。还参见图6和9。
抑制性核酸分子可为单链或双链的(例如，小干扰RNA(siRNA))，并且可以以酶依赖性方式或通过空间阻断起作用。以酶依赖性方式起作用的抑制性核酸分子包括依赖于RNase H活性降解靶mRNA的形式。这些抑制性核酸分子包括单链DNA、RNA和硫代磷酸酯分子，以及双链RNAi/siRNA系统，其涉及通过正义-反义链配对识别靶mRNA，然后通过RNA诱导的沉默复合物降解靶mRNA。不依赖于RNase H的空间阻断抑制性核酸通过与靶mRNA结合并通过其它过程的方式干扰基因表达或其它mRNA依赖性细胞过程。空间阻断抑制性核酸包括2'-O烷基(通常在具有RNase H依赖性反义物的嵌合体中)、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)和吗啉代反义物。
小干扰RNA，例如，可用于特异性减少STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1翻译，从而减少所编码多肽的翻译。siRNA以序列特异性方式介导转录后基因沉默。参见，例如，网站invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/rnai.html。一旦掺入到RNA诱导沉默复合物中，siRNA通过将复合物导向同源mRNA转录物而介导同源内源mRNA转录物的切割，然后通过复合物切割同源mRNA转录物。siRNA可以与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1mRNA转录物的任何区域同源。同源区的长度可以为30个核苷酸或更少，优选少于25个核苷酸，更优选约21至23个核苷酸。siRNA通常为双链，并可具有两个核苷酸的3'突出端，例如3'突出UU二核苷酸。设计siRNA的方法是本领域技术人员已知的。参见，例如，Elbashir等人，《自然(Nature)》411:494-498(2001)；Harborth等人，《反义核酸药物开发(AntisenseNucleic Acid Drug Dev)》13:83-106(2003)。
可从IMGENEX(San Diego，California)商购获得的用于表达发夹siRNA的pSuppressorNeo载体可用于产生抑制STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1表达的siRNA。siRNA表达质粒的构建涉及mRNA靶区域的选择，其可以为一个反复试验的过程。但是，Elbashir等人提供的指南似乎在大约80％的时间内有效。Elbashir,S.M.等人，《使用小干扰RNA分析哺乳动物体细胞中的基因功能(Analysis of gene function in somatic mammalian cellsusing small interfering RNAs.)》《方法(Methods)》2002.26(2):p.199-213。因此，为了合成siRNA，可以优选选择起始密码子下游50至100个核苷酸的靶区域。应避免5'和3'非翻译区和靠近起始密码子的区域，因为它们可能更富含调控蛋白结合位点。因为siRNA可以以AA开始，所以正义siRNA链和反义siRNA链均具有3'UU突出端，并具有大约50％G/C含量。合成siRNA的序列的实例为5'-AA(N19)UU，其中N为mRNA序列中的任何核苷酸，且其G-C含量应约为50％。可以将所选择的序列与人类基因组数据库中的其它序列进行对比，以使与其它已知编码序列的同源性(例如，在NCBI网站，例如通过Blast检索)最小化。
SiRNA可以化学合成、通过体外转录产生或通过siRNA表达载体或PCR表达盒表达。参见，例如，网站invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/rnai.html。当siRNA通过表达载体或PCR表达盒表达时，编码siRNA的插入物可以表达为折叠成siRNA发夹的RNA转录物。因此，RNA转录物可包括正义siRNA序列，所述序列通过间隔序列与其反向互补的反义siRNA序列相连，所述间隔序列形成发夹环以及3'端的U's链。所述发夹的环可具有任何合适的长度，例如长度为3至30个核苷酸，优选长度为3至23个核苷酸，并且可具有各种核苷酸序列，包括AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC和UUCAAGAGA(SEQ ID NO:60)。SiRNA也可以通过切割直接或通过转基因或病毒引入的双链RNA在体内产生。RNA依赖性RNA聚合酶的扩增可发生在一些生物体中。
抑制性核酸如短发夹RNA siRNA或反义寡核苷酸可使用如从包括抑制性核酸序列的表达载体或表达盒表达的方法来制备。或者，其可通过使用天然存在的核苷酸、修饰的核苷酸或其任何组合的化学合成来制备。在一些实施例中，抑制性核酸由修饰的核苷酸或非磷酸二酯键制成，例如，其被设计为增加抑制性核酸的生物稳定性或增加抑制性核酸与靶标STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1核酸之间形成的双链体的细胞内稳定性。
抑制性核酸可采用可用的方法制备，例如，通过从编码STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1核酸或其互补序列的表达载体表达来制备。或者，其可通过使用天然存在的核苷酸、修饰的核苷酸或其任何组合的化学合成来制备。在一些实施例中，STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1核酸由修饰的核苷酸或非磷酸二酯键制成，例如，其被设计为增加STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1核酸的生物稳定性或增加抑制性核酸与其它(例如，内源)核酸之间形成的双链体的细胞内稳定性。
例如，STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1核酸可以为具有肽键而非磷酸二酯键的肽核酸。
可用于STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1核酸的天然存在的核苷酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸、腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。可用于STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸、Wybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。
因此，STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子，ReIB核酸以及ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1抑制性核酸可包括修饰的核苷酸，以及天然核苷酸(如核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合)。抑制性核酸可具有与野生型(例如，SEQ ID NO:14、16、18、20、22或24)相同的长度。STING、cGAS、NF-κB转录因子p52和NF-κB转录因子ReIB核酸以及ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1抑制性核酸也可以更长，并包括其它可用序列。在一些实施例中，STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1核酸稍短。例如，STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1抑制性核酸可包括具有以下核酸序列(例如，SEQ IDNO:14、16、18、20、22或24)的片段，所述核酸序列可从5'或3'端缺失最多5个核苷酸，或缺失最多10个核苷酸，或缺失最多20个核苷酸，或缺失最多30个核苷酸，或缺失最多50个核苷酸，或缺失最多100个核苷酸。
抗体
抗体可用作STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14和NIK(MAP3K14)、MST1的抑制剂。可以产生针对STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14和NIK(MAP3K14)、MST1蛋白的各种表位的抗体。STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14和NIK(MAP3K14)、MST1蛋白的一些抗体也可商购获得。然而，根据本文所述的方法和组合物预期用于治疗的抗体优选为人抗体或人源化抗体，并且对其靶点具有高度特异性。
一方面，本公开涉及与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1特异性结合的分离抗体的用途。此类抗体可以为单克隆抗体。此类抗体也可以为人源化单克隆抗体或全人源单克隆抗体。抗体可表现出一种或多种所需的功能特性，诸如与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1结合的高亲和力，或抑制与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1受体结合的能力。
本文所述的方法和组合物可包括STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1抗体，或STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1抗体的组合。
本文所指的术语“抗体”包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原(例如，STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1的结构域)的能力。已经表明抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实现。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含两个通过铰链区的二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)《自然(Nature)》341:544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由单独的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接起来，从而使它们能够被制成单个蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见例如，Bird等人(1988)《科学(Science)》242:423-426；以及Huston等人(1988)《美国国家科学协会公报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:5879-5883)。此类单链抗体也意在包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
如本文所用，“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1特异性结合的分离的抗体基本上不含与除STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1之外的抗原特异性结合的抗体)。然而，与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1特异性结合的分离抗体可与其它抗原(诸如来自其它物种的STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1家族分子)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学物质。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，所述恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”并不意图包括其中来源于另一哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的CDR序列已被移植到人构架序列上的抗体。
术语“人单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性的抗体，其具有可变区，其中框架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。在一个实施例中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括获自转基因非人动物(例如，转基因小鼠)的B细胞，所述B细胞具有包含与重生细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如，小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体(下文进一步描述)，(b)从被转化以表达人抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组的组合人抗体文库分离的抗体，以及(d)通过将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中框架区和CDR区来源于人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施例中，可以对此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VL和VH区的氨基酸序列是尽管来源于人种系VL和VH序列并与之相关的序列，但可能并不天然存在于体内人抗体种系库中。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类(例如，IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
术语“人抗体衍生物”指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一种试剂或抗体的缀合物。
术语“人源化抗体”是指其中来源于另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。可在人框架序列内进行其它框架区修饰。
术语“嵌合抗体”是指其中可变区序列来源于一种物种而恒定区序列来源于另一物种的抗体，诸如其中可变区序列来源于小鼠抗体而恒定区序列来源于人抗体的抗体。
如本文所用，“与人STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1特异性结合”的抗体是指以1×10-7M或更小，更优选5×10-8M或更小，更优选1×10-8M或更小，更优选5×10-9M或更小，甚至更优选1×10-8M至1×10-10M或更小的KD与人STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1结合的抗体。
如本文所用，术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“KD”是指解离常数，其由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域公知的方法测定。测定抗体KD的优选方法为通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统(如BiacoreTM系统)。
本发明的抗体的特征在于所述抗体的特定功能特征或性质。例如，抗体与人STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1特异性结合。优选地，本发明的抗体以高亲和力(例如，以1×10- 7M或更小的KD)与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1结合。抗体可表现出一种或多种以下特征：
(a)以1×10-7M或更小的KD与人STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1结合；
(b)抑制STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1的功能或活性；
(c)抑制癌症(例如，转移性癌症)；或
(d)其组合。
可以使用评价抗体对STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1的结合能力的测定法，包括例如ELISA、免疫印迹(Western blot)和RIA。抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法(诸如通过BiacoreTM分析)来评估。
假定每种受试抗体可与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1结合，VL和VH序列可“混合并匹配”以产生与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1结合的其它结合分子。此类“混合并匹配的”抗体的结合特性可以使用上述结合试验进行测试，并在实例描述的试验中进行评估。当VL链和VH链混合并匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列可被结构相似的VH序列替代。同样，优选地，来自特定VH/VL配对的VL序列被结构相似的VL序列替代。
因此，一方面，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)包含氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含氨基酸序列的轻链可变区；
其中所述抗体与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1特异性结合。
在一些情况下，CDR3结构域独立于CDR1和/或CDR2结构域，可单独决定抗体对同源抗原的结合特异性，并且基于共同的CDR3序列可以预测地产生具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如，Klimka等人，《英国癌症杂志(British J.of Cancer)》83(2):252-260(2000)(其描述了仅使用鼠抗CD30抗体Ki-4的重链可变区CDR3产生人源化抗CD30抗体)；Beiboer等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》296:833-849(2000)(其描述了仅使用亲代鼠MOC-31抗EGP-2抗体的重链CDR3序列的重组上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader等人，《美国国家科学协会公报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》95:8910-8915(1998)(其描述了一组使用重链和轻链可变CDR3结构域的人源化抗整联蛋白αvβ3抗体)。因此，在一些情况下，混合并匹配的抗体或人源化抗体含有对STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1具有特异性的CDR3抗原结合结构域。
小分子
STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB蛋白、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)和/或MST1的小分子调节剂也是可用的。例如，SK4A化合物为ENNP1的特异性抑制剂(Arad等人，SAT0037，一种ENPP1特异性抑制剂可减轻人骨关节炎软骨中的细胞外焦磷酸酶活性(SAT0037 An ENPP1-Specific Inhibitor AttenuatesExtracellular Ecto-Pyrophosphatase Activity in Human OsteoarthriticCartilage)，参见网站ard.bmj.com/content/74/Suppl_2/662.1(2015))。
此外，下列化合物(L524-0366)为FN14拮抗剂。
Figure GDA0002476633540000821
药物开发试验
本文还描述了用于筛选对候选化合物治疗敏感的转移性肿瘤样品的方法。具体地，所述方法可以包括用于鉴定候选化合物的测定步骤，所述候选化合物选择性干扰表现出增加的染色体不稳定性的细胞(例如，CIN突变细胞)或具有升高的cGAMP水平的转移性细胞的增殖或活力。
如果与正常对照细胞相比，在测试化合物存在下表现出增加的染色体不稳定性的细胞(例如，CIN突变细胞)的增殖或活力降低，则所述测试化合物可用于减少表现出这种增加的染色体不稳定性的细胞的生长和/或转移。
类似地，如果细胞或细胞群具有升高的cGAMP水平，则所述细胞或细胞群是癌性的或将发展成癌症。当与先前cGAMP分泌细胞的水平相比，这种细胞或细胞群的cGAMP水平表现出cGAMP水平降低时，所述测试化合物可用于降低cGAMP水平升高的细胞的生长和/或转移。
测定可包括确定化合物是否可特异性引起来自转移性或CIN癌细胞或细胞系的cGAMP水平降低。如果所述化合物确实引起水平降低，则可以选择/鉴定所述化合物用于进一步研究，诸如其作为治疗癌症的治疗剂的适用性。例如，可以通过例如将本发明特征的选择方法鉴定的候选化合物给予动物模型，进一步检查其靶向肿瘤或治疗癌症的能力。
被评估的细胞可包括来自癌症患者(包括转移性癌症患者)的细胞，或来自已知癌症类型或癌细胞系的细胞，或表现出cGAMP过量产生的细胞。可以将可减少任何这些细胞类型产生cGAMP的化合物给予患者。
例如，一种方法可以包括：(a)从患者获得细胞或组织样品；(b)测量由样品中已知数量或重量的细胞或组织产生的cGAMP的量或浓度，以产生参比cGAMP值；(c)将样品中已知数量或重量相同的细胞或组织与测试化合物混合以得到测试分析物；(d)在所述测试分析物(在细胞培养基中或在细胞或组织中)中测量cGAMP的量或浓度，以得到测试分析物cGAMP值；(e)任选地重复步骤(c)和(d)；以及选择测试分析物cGAMP值低于参比cGAMP值的测试化合物。所述方法可以进一步包括向动物模型给予测试化合物，例如以进一步评估测试化合物的毒性和/或功效。在一些情况下，所述方法可以进一步包括将测试化合物给予从中获得细胞或组织样品的患者。
例如，另一种方法可以包括用于鉴定KIF2B和KIF2C/MCAK激动剂或激活剂的测定。KIF2B和KIF2C/MCAK是相关的分子驱动蛋白运动蛋白，其利用ATP水解的能量来调节微管动力学和染色体-动粒附着。KIF2B和MCAK过表达或过度活化的核心作用为抑制染色体不稳定性(CIN)，这使得其成为癌症治疗的有吸引力的靶点。下文描述了一种体外测定和成像方法，其可用于鉴定和评估KIF2B和MCAK的有效激活剂。
测量ATP水解的动力学可用于筛选激活KIF2B和MCAK并抑制CIN的化合物。这一测定基于当2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核苷(MESG)在无机磷酸盐存在下转化为2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤时发生的吸光度偏移(330至360nm)。所述反应由嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)催化。一分子无机磷酸盐(Pi)将在不可逆反应中产生一分子2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤。因此，360nm处的吸光度与ATP酶反应中产生的Pi的量成正比，并且可以用作MCAK活性的指标。
或者，还可以使用来自BellBrock实验室的Transcreener ADP测定监测ADP产生，作为MCAK活性的读数。这一测定基于ADP置换与特异性识别ADP的抗体结合的荧光示踪剂(633nm)的能力。示踪剂的置换引起通过633nm激光激发测量的荧光降低。因此，MCAK的活性可以通过绘制所用药物的浓度和产生/降低荧光强度的ADP的量来计算。
下面是鉴定和评估MCAK激活剂效力的方法的另一实例。通过结合微管尖端并促进微管解聚，MCAK负调节微管长度。因此，可以测量γ-微管蛋白标记的中心体之间的距离，作为细胞中MCAK活性的间接读数。纺锤体长度与MCAK活性成反比，并且可以作为评估促进MCAK活性的潜在化合物的指标。这一方法可适用于通过使用高通量成像显微镜筛选化合物。
化合物(例如，通过本文所述的任何方法鉴定的热门物质)可用于基于细胞的测定中，所述测定使用落后染色体、微核或染色体错误分离与荧光原位杂交(FISH)来作为其功效的读数。可以使用具有标记γ-微管蛋白着丝粒的染色体的细胞。或者，与中心体中的γ-微管蛋白结合的标记抗体可用于测定。
本文还描述了用于鉴定和评估NF-κB诱导激酶(NIK)抑制剂的效力的测定方法。NF-kB诱导激酶(NIK)介导非经典NF-kB信号传导，并与转移相关。因此，NIK的抑制可抑制CIN诱导的炎症反应和转移。NIK激酶功能的特异性抑制提供了一种评估各种化合物效力的方法。下面描述鉴定和评估NIK抑制的两种方法。
可以使用BellBrook实验室的Transcreener ADP测定监测ADP生产，以作为MCAK活性的读数。这一测定基于ADP置换与特异性识别ADP的抗体结合的荧光示踪剂(633nm)的能力。示踪剂的竞争性置换导致荧光(如通过633nm的激光激发测量的)降低。因此，MCAK的活性可以通过绘制所用药物的浓度和产生/降低荧光强度的ADP的量来计算。
NIK的抑制提供了直接抑制非经典NF-κB通路的方法。这一测定依赖于使用高含量细胞成像对p52的核易位(REIB；非经典NF-kB信号传导)进行定量。对于REIB核易位测定，用不同浓度的化合物处理细胞，并用100ng/mL拮抗性抗淋巴毒素β受体(LT-βR)抗体(一种非经典NF-kB信号传导的有效激活剂)刺激。通过细胞核与细胞质信号强度的比率来定量REIB向细胞核的转移。发现了选择性抑制REIB的核易位的有效化合物。
如此鉴定的化合物可用于选择性靶向肿瘤或治疗以CIN为特征的癌症。例如，所述化合物可用于治疗表现出cGAMP过量产生的肿瘤或癌症类型。
“治疗(treatment或treating)”是指治疗性治疗和预防或预防性措施。需要治疗的人包括已经患有病症的人以及易于患有病症的人，或其中要对病症进行预防的人。
出于治疗目的，“受试者”是指被分类为哺乳动物或鸟类的任何动物，包括人类、家畜和农场动物，以及动物园动物、竞技动物或宠物动物，诸如狗、马、猫、牛等。优选地，受试者为人类。
如本文所用，术语“癌症”包括实体动物肿瘤以及血液恶性肿瘤。术语“肿瘤细胞”和“癌细胞”在本文中可互换使用。
“实体动物肿瘤”包括头颈癌、肺癌、间皮瘤、纵隔癌、肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆系统癌、小肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、妇科器官癌症、卵巢癌、乳腺癌、内分泌系统癌症、皮肤中枢神经系统癌症；软组织和骨肉瘤；以及皮肤和眼内源的黑色素瘤。此外，可以治疗任何进展阶段的转移性癌症，诸如微转移性肿瘤、大转移性肿瘤和复发性癌症。
术语“血液恶性肿瘤”包括成人或儿童白血病和淋巴瘤、何杰金氏病、淋巴细胞和皮肤来源的淋巴瘤、急性和慢性白血病、浆细胞瘤和与AIDS有关的癌症。
本发明的方法和组合物还可以用于治疗乳腺癌、肺癌、肾上腺皮质癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、头颈癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胸腺癌、类癌肿瘤、慢性淋巴细胞白血病、尤因氏肉瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、肝母细胞瘤、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤或卵巢肿瘤。可以治疗或检测任何进展阶段的癌症，诸如原发性、转移性和复发性癌症。在一些情况下，转移性癌症被治疗，但原发性癌症未被治疗。关于多种类型癌症的信息可以从例如美国癌症协会(American Cancer Society)(cancer.org)或从例如Wilson等人(1991)《哈里森内科学(Harrison's Principles of Internal Medicine)》，第12版，McGraw-Hill公司找到。
在一些实施例中，待治疗的癌症和/或肿瘤是起源于乳腺癌或肺癌的那些。
转移性癌症的治疗可以包括减少癌细胞迁移或减少至少一种转移性肿瘤的形成。所述治疗还包括缓解或减轻转移性癌症的多于一种的症状，诸如咳嗽、呼吸短促、咯血、淋巴结病、肝脏增大、恶心、黄疸、骨痛、骨折、头痛、癫痫发作、全身性疼痛以及其组合。所述治疗可以治愈癌症，例如，其可以预防转移性癌症，其可以基本上消除转移性肿瘤的形成和生长，和/或其可以阻止或抑制转移性癌细胞的迁移。
使用本领域技术人员可用的方法，抗癌活性可减少多种癌症(例如，乳腺癌、肺癌或前列腺癌)的进展。抗癌活性例如可以通过鉴定本发明的防止癌细胞迁移的药剂的致死剂量(LD100)或50％有效剂量(ED50)或抑制50％生长的剂量(GI50)来确定。在一方面，抗癌活性是例如当通过检测原发性肿瘤部位近端或远端部位的癌细胞标志物的表达来测量时，或者当使用用于检测转移的可用方法来评估时，降低50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的癌细胞迁移的药剂量。
在另一实例中，可以给予促进染色体不稳定性的药剂以使肿瘤细胞对免疫疗法敏感。染色体不稳定性促进与免疫检查点阻断协同的病毒样应答。因此，通过给予促进染色体不稳定性的药剂，肿瘤细胞可以对免疫系统和各种免疫疗法变得更加敏感。
组合物
本发明还涉及含有化学治疗剂的组合物。这种化学治疗剂可以为多肽、编码多肽的核酸(例如，在表达盒或表达载体内)、小分子、通过本文描述的方法鉴定的化合物或其组合。所述组合物可以为药物组合物。在一些实施例中，所述组合物可以包括药学上可接受的载体。“药学上可接受的”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或盐与制剂的其它成分相容，并且对其接受者无害。
所述组合物可以配制成任何方便的形式。在一些实施例中，所述组合物可以包括与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11具有至少90％氨基酸序列同一性的Kinsin-13、MCAK、ABCC4和/或ABCG2蛋白或多肽，或这些Kinsin-13、MCAK、ABCC4和/或ABCG2蛋白或多肽的组合。在其它实施例中，所述组合物可以包括Kinsin-13、MCAK、ABCC4和/或ABCG2核酸或表达盒，其包括编码Kinsin-13、MCAK、ABCC4和/或ABCG2蛋白的核酸片段。例如，所述核酸或表达盒可以具有与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12中的任一个具有至少90％序列同一性的核酸序列。
在一些实施例中，本发明的化学治疗剂(例如，多肽、编码多肽的核酸(例如，在表达盒或表达载体内)、小分子、通过本文所述方法鉴定的化合物或其组合)以“治疗有效量”给予。这种治疗有效量是足以获得所需生理效果(如减少癌症的至少一种症状)的量。例如，化学治疗剂可以将细胞转移减少5％，或10％，或15％，或20％，或25％，或30％，或35％，或40％，或45％，或50％，或55％，或60％，或65％，或70％，或80％，或90％，095％，或97％，或99％，或5％至100％之间的任何数值百分比。癌症的症状还可以包括肿瘤恶病质、肿瘤引起的疼痛症、肿瘤引起的疲劳、肿瘤生长和转移扩散。因此，化学治疗剂还可以将肿瘤恶病质、肿瘤引起的疼痛症、肿瘤引起的疲劳、肿瘤生长或其组合减少5％，或10％，或15％，或20％，或25％，或30％，或35％，或40％，或45％，或50％，或55％，或60％，或65％，或70％，或80％，或90％，095％，或97％，或99％，或5％至100％之间的任何数值百分比。
为了达到所需的效果，化学治疗剂可以以单剂量或分开的剂量给予。例如，化学治疗剂可以以至少约0.01mg/kg体重至约500至750mg/kg体重，至少约0.01mg/kg体重至约300至500mg/kg体重，至少约0.1mg/kg体重至约100至300mg/kg体重或至少约1mg/kg体重至约50至100mg/kg体重的剂量给予，尽管其它剂量可提供有益的结果。给药量将根据各种因素而变化，这些因素包括但不限于选择用于给药的小分子、化合物、肽或核酸的类型、哺乳动物的疾病、体重、身体状况、健康和年龄。临床医生使用动物模型或本领域可用的其它测试系统可以容易地确定此类因素。
本发明的化学治疗剂的给药可以连续或间歇地以单剂量、多剂量进行，这取决于例如接受者的生理状况、给药目的为治疗性的还是预防性的，以及本领域技术人员已知的其它因素。本发明的化学治疗剂和组合物的给药可以在预选的时间段内基本上连续，或者可以是一系列间隔的剂量。可以考虑局部给药和全身给药。
为了制备所述组合物，合成或以其它方式获得小分子、化合物、多肽、核酸、表达盒和其它药剂，根据需要或期望将其纯化。这些小分子、化合物、多肽、核酸、表达盒和其它药剂可以悬浮于药学上可接受的载体中和/或冻干或以其它方式稳定化。可以将小分子、化合物、多肽、核酸、表达盒、其它药剂以及其组合调节至合适的浓度，并且任选地与其它药剂组合。单位剂量中包括的给定小分子、化合物、多肽、核酸和/或其它药剂的绝对重量可以有很大的差异。例如，可以给予约0.01至约2g，或约0.1至约500mg的至少一种分子、化合物、多肽、核酸和/或其它药剂，或多种分子、化合物、多肽、核酸和/或其它药剂。或者，单位剂量可以为约0.01g至约50g，约0.01g至约35g，约0.1g至约25g，约0.5g至约12g，约0.5g至约8g，约0.5g至约4g，或约0.5g至约2g。
本发明的化学治疗剂的日剂量也可以变化。此类日剂量可以在例如约0.1g/天至约50g/天，约0.1g/天至约25g/天，约0.1g/天至约12g/天，约0.5g/天至约8g/天，约0.5g/天至约4g/天，和约0.5g/天至约2g/天的范围内。
应当理解，用于治疗的化学治疗剂的量不仅随着所选择的具体载体而变化，而且随着给药途径、所治疗的癌症病状的性质以及患者的年龄和状况而变化。最终，护理人员可以确定适当的剂量。此外，药物组合物可以配制成单一单位剂型。
因此，包含化学治疗剂的一种或多种合适的单位剂型可以通过多种途径给予，所述途径包括肠胃外(包括皮下、静脉内、肌内和腹膜内)、口服、直肠、皮肤、透皮、胸内、肺内和鼻内(呼吸)途径。还可以将化学治疗剂配制成持续释放的形式(例如，使用微囊化，参见WO94/07529和美国专利第4,962,091号)。如果合适，制剂可以方便地以离散的单位剂型存在，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法来制备。此类方法可以包括以下步骤：将化学治疗剂与液体载体、固体基质、半固体载体、细分的固体载体或其组合混合，然后，如果需要，将产物引入或成形为所需的递送系统。例如，化学治疗剂可以与方便的载体(如纳米颗粒、白蛋白、聚亚烷基二醇)连接，或者以前药形式提供。化学治疗剂和其组合可以与载体组合和/或包封在囊泡(如脂质体)中。
本发明的组合物可制备成许多形式，包括水溶液、悬浮液、片剂、硬或软明胶胶囊，以及脂质体和其它缓释制剂(诸如成型聚合物凝胶)。抑制剂的给药还可以涉及在水溶液或缓释载体中的肠胃外或局部给药。
因此，虽然化学治疗剂和/或其它药剂有时可以以口服剂型给予，但是所述口服剂型可以配制成保护小分子、化合物、多肽、核酸、表达盒以及其组合在小分子、化合物、多肽、编码此类多肽的核酸以及其组合提供治疗效用之前免于降解或分解。例如，在一些情况下，小分子、化合物、多肽、编码这种多肽的核酸和/或其它药剂可以配制成在通过胃后释放到肠中。此类制剂描述于例如美国专利第6,306,434号以及其中所包含的参考文献。
液体药物组合物可以为例如水性或油性混悬剂、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂、在使用前用水或其它合适赋形剂配制的干粉形式。此类液体药物组合物可含有常规添加剂，诸如悬浮剂、乳化剂、非水赋形剂(其可包括食用油)或防腐剂。药物组合物可以采取如在油性或水性赋形剂中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。合适的载体包括盐水溶液、包封剂(例如，脂质体)和其它材料。化学治疗剂和/或其它药剂可以在存在或不存在赋形剂的情况下配制成干燥形式(例如，冻干形式)。如果需要载体，所述载体可以包括在药物制剂中，或者可以单独包装在单独的容器中，以添加至抑制剂中，所述抑制剂以干燥形式、悬浮液或可溶浓缩形式包装在方便的液体中。
化学治疗剂和/或其它药剂可以配制用于肠胃外给药(例如，通过注射，例如团注或连续输注)，并且可以以单位剂型存在于安瓿、预填充注射器、小体积输注容器或添加有防腐剂的多剂量容器中。
组合物还可以含有其它成分，诸如化学治疗剂、抗病毒剂、抗菌剂、抗微生物剂和/或防腐剂。可使用的其它治疗剂的实例包括但不限于：烷化剂，诸如氮芥、磺酸烷基酯、亚硝基脲、乙烯亚胺和三氮烯；抗代谢物，诸如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物和嘧啶类似物；抗生素，诸如蒽环类抗生素、博来霉素、丝裂霉素、更生霉素和普卡霉素；酶，诸如L-天冬酰胺酶；法呢基-蛋白转移酶抑制剂；激素剂，诸如糖皮质激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、孕激素和促黄体激素释放激素拮抗剂、醋酸奥曲肽；微管破坏剂，诸如海鞘素或其类似物和衍生物；微管稳定剂，诸如紫杉醇
Figure GDA0002476633540000911
多西他赛
Figure GDA0002476633540000912
和埃坡霉素A-F或其类似物或衍生物；植物来源的产品，诸如长春花生物碱、表鬼臼毒素、紫杉烷；和拓扑异构酶抑制剂；异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂；以及杂类药剂，诸如羟基脲、丙卡巴肼、米托坦、六甲基三聚氰胺、铂配位络合物诸如顺铂和卡铂；以及其它用作抗癌和细胞毒性剂的药剂，诸如生物反应调节剂、生长因子；免疫调节剂和单克隆抗体。组合物还可以与放射疗法联合使用。
通过以下实例进一步说明本发明，这些实例不应以任何方式被解释为限制性的。所有引用的参考文献(包括本申请中引用的参考文献、授权专利、公开的专利申请)的内容通过引用明确地并入本文。
实例1：材料和方法
这一实例描述了用于开发本发明的若干材料和方法。
原发性-转移配对的基因组分析
从基因型和表型(dbGAP)数据库中下载了61例具有匹配原发性肿瘤的脑转移瘤和正常的完整外显子组DNA序列数据(Brastianos等人，《癌症发现(Cancer Discovery)》5,1164–1177(2015))并按描述的方法(McGranahan等人，《科学(Science)》351,1463–1469(2016))进行了处理，以得出每个样品的等位基因特异性分段DNA拷贝数数据。如描述(Burrell等人，《自然(Nature)》494,492–496(2013))的那样测定加权基因组不稳定性指数(wGII)，其描述了被分类为相对于肿瘤倍性的异常基因组的比例。
Mitelman数据库分析
分析了Mitelman数据库(Mitelman等人，“癌症中的染色体畸变和基因融合数据库(Database of Chromosome Aberrations and Gene Fusions in Cancer)”cgap.nci.nih.gov可在以下网址找到：cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman)中所有可用的乳腺癌病例。回顾了主要文献以确定样品的来源(原发性肿瘤或转移)。当克隆核型报告为范围时，将平均值用于这一克隆。核型畸变包括结构畸变以及与克隆的总核型的数值偏差。
HNSCC中染色体分离的分析
分析了60例头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者的原发性肿瘤样本(Chung等人，《癌细胞(Cancer Cell)》5,489–500(2004))。40名患者具有苏木精和曙红染色(H&E)的原发性肿瘤样品，其质量足以用于高分辨率显微镜分析。如前所述，分析仅限于在经历后期时固定的细胞(Bakhoun等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》17,7704–7711(2011)；Zaki等人，《癌症(Cancer)》120,1733–1742(2014))。通过在后期的其余分离染色体之间存在苏木精染色来定义染色体错误分离，并将其报告为经历后期的细胞的百分比，并具有染色体错误分离的证据。临床淋巴结状态通过临床检查或淋巴结肿瘤受累的放射影像证据来定义(Chung等人，《癌细胞(Cancer Cell)》5,489–500(2004))。
单细胞核型分析
将培养物用终浓度为0.1μg ml-1的秋水仙胺处理。在37℃下孵育45分钟后，将培养物进行胰蛋白酶消化，重悬于预热的0.075M KCl中，在37℃下再孵育10分钟，并固定在甲醇-乙酸(3:1)中。然后将固定的细胞悬浮液滴到载玻片上，在2×SSC中的0.08μg/ml DAPI中染色5分钟，并固定在抗荧光衰减封片剂(antifade solution)(Vectashield，Vector实验室)中。使用配有GenAsi细胞遗传学套件(实用光谱影象诊断法，Carlsbad)的NikonEclipse E800落射荧光显微镜捕获中期染色体涂片(metaphase spreads)。对于每个样品，对最少20个反向DAPI染色的中期进行完全核型分析，并根据国际人类细胞遗传命名系统(International System of Human Cytogenetic Nomenclature)(ISCN)2013进行了分析。
细胞培养
细胞系购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)。在青霉素(50Uml-1)和链霉抗生物素蛋白(50μgml-1)存在下，在补充有10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中培养肿瘤(MDA-MB-231和H2030)和293T细胞。所有细胞均检测为支原体阴性。使用IncuCyte活细胞分析系统(Essen Bioscience)测量细胞汇合度。
免疫荧光显微术
如(Bakhoun等人，《自然通讯(Nat Commun)》6,5990(2015))所述进行细胞固定和抗体染色。简言之，将细胞用冰冷的(-30℃)甲醇固定15分钟——当用于对着丝粒、中心体、cGAS、波形蛋白、β-肌动蛋白或α-微管蛋白染色时，或用4％多聚甲醛固定——当用于对ReIB、p65、IRF3、ssDNA、dsDNA、CoxIV或β-连环蛋白染色时。随后，使用1％Triton渗透细胞4分钟。抗体信息见表1。
表1：用于免疫荧光的抗体
抗体靶向 来源 分类编码
α-微管蛋白 Sigma Aldrich T9026
β-肌动蛋白 Abcam ab8227
β-连环蛋白 Abcam ab16051
cGAS Sigma Aldrich HPA031700
Cox IV Abcam ab16056
dsDNA Abcam AB27156
dsDNA(图5f) Thermo Fisher Scientific MAB1293MI
人着丝粒蛋白 Antibodies Incorporated 15-234-0001
IRF3 Abcam ab68481
p65 Abcam ab16502
中心粒周蛋白 Abcam ab4448
ReIB Cell Signaling Technology 4922
ssDNA Thermo Fisher Scientific MAB3299MI
波形蛋白 Abcam ab201637
对于用于胞质dsDNA和ssDNA染色的选择性质膜透化，细胞在固定后用0.02％皂苷处理5分钟。对于单链(Thermo Fisher FEREN0321)和双链(Life Technologies-EN0771)-特异性核酸酶处理，细胞同样用0.02％皂苷透化2分钟并用任一种核酸酶处理10分钟，然后用4％多聚甲醛固定。TBS-BSA在抗体染色过程中用作封闭剂。DAPI与第二抗体一起加入。细胞用Prolong Diamond抗淬灭封片剂(Life Technologies–P36961)固定。
免疫印迹
将细胞沉淀并用RIPA缓冲液裂解。使用BCA蛋白测定法测定蛋白浓度，并将20至30mg总蛋白上样到每个泳道中。通过梯度SDS-PAGE分离蛋白质并转移至PVDF膜上。抗体信息见表2。
表2：用于免疫印迹的抗体
抗体靶向 公司 分类编码
β-肌动蛋白 Abcam ab8227
cGAS Sigma Aldrich HPA031700
GFP Life Technologies A11122
IRF3 Abcam ab68481
p100/p52 Cell Signaling Technology 4882
p65 Abcam ab16502
Phospho-IRF3 Cell Signaling Technology 4947
Phospho-p100 Abcam 194919
Phospho-p65 Cell Signaling Technology 3033
Phospho-TBK1 Cell Signaling Technology 5483
ReIB Cell Signaling Technology 4922
STING Cell Signaling Technology 13647
TBK1 Cell Signaling Technology 3013
TRAF2 Cell Signaling Technology 4712
TRAF3 Cell Signaling Technology 4729
对于图6D所示的定量对比，使用来自三个生物学重复的免疫印迹。使用ImageJ(参见网站imagej.nih.gov/ij)获得条带强度，将其标准化为β-肌动蛋白(上样对照)，并减去背景。将比例相对于对照细胞标准化。
敲除和过表达构建体
使用pLVX质粒(表达tdTomato)实现荧光素酶表达，并筛选稳定表达荧光素酶的细胞用于tdTomato表达。使用质粒(pEGFP)转染或慢病毒(pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro)表达实现驱动蛋白-13表达，其中分别使用G418(0.5mgml-1)或嘌呤霉素(5μgml-1)选择细胞。使用pLenti-GIII-CMV-RFP-2A-Puro质粒和嘌呤霉素进行选择，实现DNA酶2的过表达。含有驱动蛋白-13或核纤层蛋白B2(pQCXIB-mCherry-Imnb2)构建体的质粒分别由Compton和Hetzer实验室提供。杀稻瘟菌素(Blasticidin)用于选择10μgml-1的lmnb2表达细胞。所有其它质粒均购自Applied Biological Materials公司(www.abmgood.com)。使用pRRL(SGEP或SGEN)质粒中的shRNA实现STING、NFKB2、ReIB和cGAS的稳定敲除，并且从MSKCC RNA干扰核心(Interference Core)获得。每个靶点筛选二至四个不同的shRNA发夹。靶向shRNA序列列于表3。
表3：反义shRNA序列
Figure GDA0002476633540000961
动物研究
根据由威尔·康奈尔医学研究所动物护理和使用委员会(Weill CornellMedicine Institutional Animal Care and Use Committee)批准的方案进行动物实验。对于疾病特异性存活率，功效分析表明，每组10只小鼠足以检测相对危险比率<0.2或>5的差异，具有80％的功效和95％的置信度，假定对照组中特定疾病的中位存活期为3个月，总随访时间为250天。无需将动物随机化。研究人员未采取盲法进行小组分配。如前所述(Chen等人，《自然(Nature)》533,493–498(2016))进行心内注射。简言之，将细胞进行胰蛋白酶消化并用PBS洗涤，并将1×105个细胞(在100μl PBS中)注射到雌性无胸腺6至7周龄无胸腺裸(nu/nu)小鼠(Jackson实验室株002019)的左心室中。然后立即给小鼠注射D-荧光素(150mgkg-1)，并使用Tan IVIS Spectrum Xenogen仪(Caliper Life Sciences)进行生物发光成像(BLI)，以确保肿瘤细胞的全身性播散。在注射后第5周使用BLI测量转移负荷，在MDA-MB-231小鼠的情况下，每1至2周拍摄BLI图像，持续长达17周。使用Living ImageSoftware版本2.50分析BLI图像。当小鼠死亡或符合IACUC协会规定下的安乐死标准并具有转移性疾病的放射影像证据时，达到疾病特异性存活终点。对于原位肿瘤植入，将50μl PBS中的2.5×105个细胞与Matrigel(BD Biosciences)以1:1混合，并注入第四乳腺脂肪垫中。每只动物仅植入一个肿瘤。当原发性肿瘤达到最大尺寸约1.5cm时，通过手术将其激发，并使用BLI成像以1周至3周的间隔评估转移性播散，持续长达30周。当在原发性肿瘤移植部位以外观察到BLI信号时，达到无远处转移的存活终点。为了从原发性肿瘤和转移瘤中获得短期培养物，对麻醉的动物(异氟烷)进行成像，然后处死。随后对采集的器官进行离体BLI以确定转移性病灶的精确位置。随后将原发性肿瘤和转移瘤机械分离，并在含有选择培养基的DMEM中培养以选择肿瘤细胞。所有随后的测定均在一次传代后进行。
患者来源的异种移植物(PDX)测定
通过将新获得的手术切除的肿瘤样本移植到雌性NOD-scidIL2Rgammanull(NSG)(Jackson实验室菌株005557)中，成功地制备了人转移性乳腺癌的PDX模型，所述肿瘤样本来自根据IRB批准的方案(MSKCC IRB#97-094)同意的患者。雌激素受体阳性PDX来源于转移至骨的乳腺癌。根据患有炎性乳腺癌的患者的腋窝淋巴结转移建立三阴性PDX。PDX维持最多3次连续传代。简言之，将新获得的肿瘤组织样本直接移植至小鼠的乳腺脂肪垫中，或在含有非必需氨基酸(Cat#41500018，Thermosfier)的无血清MEM培养基中切成1至2mm的碎片，用表达GFP-荧光素酶或pUltra-Chili-Luc质粒(Addgene质粒：48688)的慢病毒载体转导，然后移植到小鼠中。通常，PDX肿瘤生长在移植后最初的1至3周变得明显，且肿瘤又继续生长4至8周。使用BLI或光谱CT成像追踪原发性肿瘤的生长和转移。在收集原发性肿瘤和转移瘤时，直接从原发性肿瘤以及肺和肝转移瘤获得原代细胞培养物。简言之，将500mg新鲜的大块肿瘤组织切成1至2mm3大小的碎片，并在Accutase(AT104；InnovativeCellTechnologies)中孵育，以在1至2小时内进行细胞脱附和分离。通过100μm细胞过滤网筛选解离的组织，并通过在1200RPM离心使细胞沉淀。将沉淀物洗涤并重悬于含有3％FBS的上述MEM缓冲液中。在一次传代后分析细胞的染色体错误分离。
RNA测序和分析使用QIAShredder(Qiagen-79654)和RNA提取试剂盒(Qiagen-74106)从细胞中提取大量RNA，并使用HiSeq2500或HiSeq4000(Illumina公司)进行测序。用FastQC检查原始FASTQ文件的质量(参见网站bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)，然后使用STAR(版本2.4.1d，2-pass模式)映射到人类参比GRCh38(Dobin等人，《生物信息学(Bioinformatics)》29,15–21(2013))。使用cufflinks(版本2.2.1，默认参数)和HTSeq(版本0.6.1)(Trapnell等人，《国家生物科技(Nat Biotechnol)》28,511–515(2010)；Anders等人，《生物信息学(Bioinformatics)》31,166–169(2015))评估基因表达。使用DESeq2(版本1.14.1)(Love等人，《基因组生物学(Genome Biol)》15,550(2014))进行差异表达分析。在进行任何无监督分析之前，使用DESeq2R软件包，进行方差稳定变换来转换表达计数。所有自定义代码、统计分析和可视化都在Python或R中执行。使用NextFlow来管理一些计算流程(参见网站nextflow.io)。
单细胞RNA测序
细胞进行胰蛋白酶消化并重悬于PBS中。将21μl细胞悬浮液(400个细胞/μl，>95％活力)上样到10XGenomics Chromium平台上以产生条形码单细胞GEM。根据10×Genomics说明书(《单细胞3'试剂试剂盒用户指南PN-120233(Single Cell 3′Reagent Kits UserGuide PN-120233)》，10×Genomics，美国，加利福尼亚州，普莱森顿)制备单细胞RNA测序(scRNA-seq)文库。GEM-逆转录(RT)(55℃下进行2小时，85℃下进行5分钟；保持在4℃)在具有96深孔反应模块(Bio-Rad，Hercules)的C1000Touch热循环仪中进行。RT后，GEM破碎，并用DynaBeads MyOne Silane珠(Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，沃尔瑟姆市)和SPRIselect试剂盒(0.6×SPRI；Beckman Coulter)清除单链cDNA。使用带有96深孔反应模块的C1000 Touch热循环仪将cDNA扩增14个循环(98℃下进行3分钟；98℃下进行15秒，67℃下进行20秒，以及72℃下进行1分钟×14个循环；72℃下进行1分钟；保持在4℃)。使用Agilent Bioanalyzer2100(加利福尼亚州，圣克拉拉)分析cDNA的质量。使用Covaris S220仪(Covaris，马萨诸塞州，沃本)将所得cDNA剪切至约200bp，并用0.6×SPRI珠进行清洗。对产物进行末端修复、加A尾并与试剂盒中提供的接头(adaptor)连接。使用试剂盒提供的指数，通过10个PCR扩增循环，为每个文库引入独特的样品指数(98℃下进行45秒；98℃下进行20秒，60℃下进行30秒，以及72℃下进行20秒×14个循环；72℃下进行1分钟；保持在4℃)。两次SPRI清洗后，使用Qubit荧光定量(Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，沃尔瑟姆市)对文库进行定量，并在Agilent Bioanalyzer 2100上评估质量。收集4个文库，并在HiSeq2500快速模式下以10pM在双端测序流式细胞上聚集，并测序98个循环R1，随后是14bpI7 Index(10X Barcode)、8bp I5 Index(Sample Index)和R2上的10bp(UMI)。使用Illumina的实时分析软件(RTA)进行测序图像的初步处理。根据制造商的建议，使用10XGenomics Cell Ranger管道进行拆分(Demultiplexing)和后处理。使用Cell Ranger管道将单细胞RNA测序数据(scRNA-seq)从原始读数处理为分子计数阵列(Zheng等人，《自然通讯(Nat Commun)》8,14049(2017))。另外，为了将实验假象对分析的影响最小化，对数据进行预处理以滤出具有低总分子计数(文库大小)、低复杂性和高线粒体含量的细胞(通过双峰拟合鉴定)。通过将细胞中每种基因的表达水平除以其总文库大小，然后按照所有细胞的中值文库大小进行缩放，将剩余细胞进行标准化。将文库大小标准化后；进行主成分分析(PCA)以在计算扩散特征值以估算出Dropout噪声时提高构建的马尔可夫矩阵(MarkovMatrix)的鲁棒性(van Dijk等人，《BioRxiv》(2017))。选择主成分的数量以保留数据中大约80％的方差，并排除与文库大小高度相关的第一主成分。使用提高到3的幂(幂对应于加权最近邻的近似数目)的马尔可夫矩阵并根据所述的21个最近邻小区计算的基因表达分布来进行标准化和非标准化计数矩阵的推断(van Dijk等人，《BioRxiv》(2017))。使用Phenograph(Levine等人，《细胞(Cell)》162,184–197(2015))鉴定亚群，使用自举方法，通过Kruskal-Wallis秩统计量鉴定至少一种亚群中差异表达的基因，以随机降低样本中每个亚群的匹配分子和细胞计数。采用t-分布随机近邻嵌入(t-SNE)方法，基于输入计数矩阵的前20个主成分(以前5150个差异表达基因为子集)(Kruskal Wallis秩统计的假发现率(FDR)q<0.05)，将亚群结构进行可视化。群M中关键基因签名相对于其它亚群的平均表达进行z-标准化，并通过小提琴图可视化。所有基因签名在实例1末尾附近注释。根据每个细胞每个签名的所有基因的平均表达，使用Spearman秩相关系数计算基因签名之间的相关性。Ward的最小方差方法通过将差异表达的上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)基因的标准化表达应用于分层簇细胞(hierarchically cluster cells)。
患者存活率分析
用于存活率分析的基因包括PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24、FGF5(任选地NTN4)(见表5)。
使用两个独立的数据集来评估存活率标记。第一种为元分析(meta-analysis)(
Figure GDA0002476633540001011
等人，《乳腺癌研究和治疗(Breast Cancer Res.Treat.)》123,725–731(2010))和验证组(validation cohort)(Hatzis等人，《美国医学会杂志(J.Am.Med.Assoc.)》。305,1873–1881(2011))对于元分析，使用存储在KM-Plotter数据库(www.kmplot.com)中的可公开获得的微阵列基因表达数据集，其中每个基因具有以下微阵列探针(注意，一些基因具有多个名称并且替代名称可以在下面列出)：219132_at(PELI2)、205289_at(BMP2)、207586_at(SHH)、230398_at(TNS4)、227123_at(RAB3B)、213194_at(ROBO1)、227911_at(ARHGAP28)、213385_at(CHN2)、206224_at(CST1)、203305_at(F13A1)、208146_s_at(CPVL)、226492_at、(SEMA6D)、201431_s_at(DPYSL3)、228640_at(PCDH7)、209781_s_at(etoile)、210972_x_at(TRA@)、220169_at(TMEM156)、206994_at(CST4)、266_s_at(CD24)、210311_at(FGF5)、200948_at(MLF2)。对于元分析组，使用JetSet最佳探针组，并将自动选择用于第25和第75个百分位之间的最佳截止。对于其中DMFS数据可用的验证组(Hatzis等人，《美国医学会杂志(JAMA)》305,1873–1881(2011))，将数据集的z标准化表达数据和中值用作截止值。使用对数秩检验对比DMFS曲线。对于第一个数据集，最佳截止值被确定为第36个百分位，然后使用这种截止值，使得那些基因累积表达高于底部36百分位的基因的患者具有更高的无转移存活率。在第二个数据集中，使用来源于下一代测序的公开保藏的基因表达数据，并且使用中位表达值作为截止，并获得相似的结果。在这一类型的分析中，通常根据患者人群和所用试验，使用从25百分位到75百分位的截止值，因此应将其包括在内。
体外侵袭和迁移试验
对于侵袭和迁移/趋化性试验，分别使用CytoSelect细胞侵袭(CBA-110)和细胞迁移(CBA-100)试剂盒。简言之，将3×105个细胞悬浮于无血清培养基中，并置于膜的顶部。将含有血清的培养基置于底部，将侵袭到胶原膜下表面的细胞染色并在18至24小时后计数。对于趋化性试验，使用比色方法(OD560nm)进行定量。对于划痕试验(scratch assay)，当细胞达到>90％汇合度时，将细胞用丝裂霉素C(10μgml-1)处理1小时，然后置于含有1％FBS的DMEM中。使用p200移液管尖端涂抹创口，并随后立即以规则间隔拍摄创口的图像。使用ImageJ定量创口表面积。
胞质DNA的定量
裂解约1×107个细胞，并使用线粒体分离试剂盒(Thermo Fisher-89874)获得核、胞质和线粒体部分。蛋白酶抑制剂未用于随后的DNA纯化。以12000xg纯化线粒体，以使其在胞质部分中的污染最小化。随后使用Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen-69506)从核、胞质、线粒体部分中分离DNA，并通过Quibit2.0(Invitrogen)使用Quibit dsDNA HS试剂对dsDNA进行定量。
数据可用性
所有RNA测序数据保存在序列读取档案(Sequence Read Archive)(SRA，www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)中。单细胞RNAseq数据以下列登记号保存：SRP104750。大量RNAseq数据以下列登记号保存：SRP104476。网址访问链接ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/review/SRP104476_20170424_100917_3d522deaf85577451c01974654b36ad3
用于评估存活率的CIN基因表达签名：PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24、FGF5(任选地NTN4)。表5列出了蛋白质和编码这些蛋白质的核酸的序列示例。
表5：CIN基因表达签名基因
Figure GDA0002476633540001031
Figure GDA0002476633540001041
Figure GDA0002476633540001051
Figure GDA0002476633540001061
Figure GDA0002476633540001071
Figure GDA0002476633540001081
Figure GDA0002476633540001091
Figure GDA0002476633540001101
CIN响应性非经典NF-kB签名：
PPARG、DDIT3、NUPR1、RAB3B、IGFBP4、LRRC8C、TCP11L2、MAFK、NRG1、F2R、KRT19、CTGF、ZFC3H1、MACROD1、GSTA4、SCN9A、BDNF、LACTB
*粗体基因被抑制(在存活率和TCGA分析中使用负值)
非经典NF-kB调控基因：
NFKB2、ReIB、MAP3K14、TRAF2、TRAF3、BIRC2、BIRC3
*粗体基因被抑制(在存活率分析中使用负值)
经典NF-kB调控基因：
NFKB1、ReIA、TRAF1、TRAF4、TRAF5、TRAF6
干扰素调控基因
IRF1、IRF3、IRF7、TBK1
上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)的调节剂：VIM、ZEB2、SNAI2、ZEB1
炎症基因：
RGS16、DENND5A、BTG2、STAT3、IFITM3、CD47、SLAMF7、REL、BCL6、IL18BP、NAMPT、PDE4B、
IL8、PSME2、P2RX4、IFI44、CCR7、KLF10、ADRM1、KLF9、NFIL3、CNP、LDLR、HES1、HLA-A、PARP9、NUB1、STAT2、VIP、TGIF1、PVR、MOV10、PSMA2、EIF4E3、IER3、PLA2G4A、TRAFD1、MYD88、VAMP5、TRIM14、TUBB2A、BPGM、B2M、HRH1、PSMB9、LATS2、PTPN6、DCBLD2、PSMB8、IL1R1、PSMB2、SQSTM1、PTX3、ITGA5、EDN1、SLC31A1、SAMHD1、PNPT1、CSF1、TNFRSF9、SOCS1、REIB、VEGFA、ARL4A、DUSP5、CMKLR1、CD38、SLC4A4、SP110、PLAU、DDX58、PSME1、TRAF1、SPSB1、TDRD7、F2RL1、EPSTI1、SAMD9L、NINJ1、RNF19B、LIF、RIPK1、SLC2A6、IRF7、PTAFR、IRAK2、CD14、ITGB8、SCARF1、KIF1B、FOSL2、SOCS3、DUSP1、IRF1、SLC2A3、HBEGF、CXCL3、TNIP1、AHR、SGMS2、FZD5、GCH1、SLC25A28、OSMR、RSAD2、APOL6、ICOSLG、JAG1、G0S2、GEM、KLF4、NFKB1、STAT1、HLA-C、IFIH1、LY6E、EFNA1、SLC16A6、BHLHE40、TRIM26、CD82、CYBB、IL15RA、GABBR1、REIA、PHLDA2、MAP3K8、NUP93、IL7R、PTPRE、IFI27、SNN、NR4A2、SPPL2A、RHOG、SAT1、SLC7A1、IL6、IL15、RAF1、CCL20、ACVR1B、BIRC2、RBCK1、LAP3、ID2、TNFSF10、SIK1、BST2、PANX1、GADD45A、PML、CD40、TRIM21、SECTM1、SSPN、TXNIP、BTG1、AREG、KYNU、PTGS2、IRS2、C3AR1、STAT4、ATP2A2、BIRC3、MAP2K3、CXCL1、NFKBIA、IFNAR1、MET、NR4A1、CXCL2、EBI3、CD83、DNAJB4、CASP7、PHLDA1、NLRC5、IL1B、TRIM25、IER5、RNF213、IL10、NFAT5、ADAR、PNP、MMP14、ICAM4、PPAP2B、SDC4、ABCA1、DUSP2、EIF2AK2、IER2、HERC6、BMP2、IL7、ISG20、GMPR、PSEN1、XAF1、SERPINB8、MTHFD2、EREG、TNFAIP3、TMEM140、KDM6B、CXCL11、CASP1、CYR61、IRF9、GBP2、ADM、TRIP10、PTGER2、METTL7B、SOD2、OAS2、CSF3、SERPINE1、MXD1、ICAM1、ZC3H12A、BCL3、PFKFB3、OGFR、SRI、IFNAR2、FUT4、IL6ST、TNIP2、DUSP4、PROCR、TLR2、OASL、JAK2、C1S、NMI、UBE2L6、LAMP3、TRIB1、TIPARP、IFIT3、GFPT2、IFI30、PPP1R15A、FAM46A、ELF1、UPP1、NOD1、CCL5、FOS、VAMP8、RTP4、TPBG、IL23A、BEST1、CEBPB、TNFSF15、SCN1B、P2RY2、STAT5A、CHST2、HIF1A、ZFP36、KLF2、LPAR1、EHD1、PLSCR1、PDLIM5、OAS1、CXCL10、JUNB、PFKP、CD274、CD55、TNFSF9、ADORA2B、ETS2、OAS3、CASP8、ISG15、WARS、SLC7A2、TNFRSF1B、PARP14、FAS、SAMD9、EIF1、CD74、TOR1B、PTPN2、MARCKS、ST8SIA4、SEMA4D、LYSMD2、ATF3、FOSB、PSMB10、ISOC1、PSMA3、IFNGR2、SMAD3、RIPK2、MARCH1、DHX58、IL4R、TRIM5、LITAF、B4GALT5、NLRP3、ITGB3、CIITA、IFITM1、PIM1、BTG3、CD44、PLK2、DRAM1、FPR1、RHOB、EGR1、GNAI3、C1R、NCOA3、PARP12、ABI1、RCAN1、EMP3、IRF2、HLA-DMA、LAMB3、MYC、ATP2B1、YRDC、HLA-DRB1、NDP、MCL1、F3、MT2A、IFI44L、SERPINB2、MAFF、FJX1、LGALS3BP、IL18、GADD45B、TLR1、CEBPD、GNA15、CSF2、SPHK1、IFI35、LYN、PNRC1、IRF5、IFITM2、BANK1、AXL、KLF6、PTGER4、CASP3、PMEPA1、TNC、ZBTB10、PCDH7、CCRL2、CDKN1A、CCNL1、PER1、TLR3、B4GALT1、CLCF1、MVP、CFB、NFKBIE、PTPN1、USP18、NFKB2、CASP4、TNFAIP2、ACVR2A、CX3CL1、IFIT1、EMR1、CFLAR、DDX60、IDO1、CFH、IFIT2、NCOA7、INHBA、TIMP1、RNF144B、MX1、ATP2C1、TSC22D1、PELI1、TAPBP、GBP4、CCND1、SLC31A2、SGK1、ZNFX1、RAPGEF6、CCL2、HLA-B、NFE2L2、UBA7、HAS2、JUN、SLC11A2、FOSL1、SELL、PLAUR、BATF2、TNFAIP8、ST3GAL5、TANK、ARID5B、MX2、TAP1。
迁移和运动基因：
CALD1、CAV2、EGFR、FN1、ITGB1、JAG1、MSN、MST1R、NODAL、PDGFRB、RAC1、STAT3、TGFB1、VIM。
实例2：人转移瘤中染色体不稳定性增加
这一实例描述了说明染色体不稳定性与人转移瘤有关的实验。
为了研究染色体不稳定性是否与人转移瘤有关，将来自61个原发性肿瘤(包含13种肿瘤类型)的全外显子序列数据进行对比，并使用来自最近发表的组(Brastianos等人，《癌症发现(Cancer Discovery)》5,1164–1177(2015))与脑转移瘤进行匹配。使用加权基因组完整性指数(wGII)作为染色体不稳定性的基因组指标重新分析这些数据。wGII通过测量偏离平均肿瘤倍性的基因组的百分比来评估拷贝数异质性(Burrell等人，《自然(Nature)》494,492–496(2013))。存在显著的偏差，由此转移瘤与其匹配的原发性肿瘤相比，更可能获得更高的wGII分数(图1A-1B-1至1B-4、1H)。
使用第二种方法，分析了Mitelman染色体易位数据库中存档的637种原发性乳腺肿瘤和131种乳腺癌转移瘤的核型信息(Mitelman等人，网址cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman)。如单细胞核型分析所定义的，原发性乳腺肿瘤含有更多克隆，但它们表现出对正常的近二倍体(2n)核型的强烈倾向。另一方面，来源于乳腺癌转移瘤的样品显示出近三倍体(3n)核型的显著富集，并且每个克隆的染色体畸变平均为原发肿瘤的两倍(图1C至1E)。已经假定近三倍体核型代表趋同优化进化状态，其中染色体不稳定性最大化(Carter等人，《国家生物科技(Nat Biotechnol)》30,413–421(2012)；Laughney等人，《细胞报告(Cell Rep)》12,809–820(2015)；Storchova等人，《细胞学杂志(J Cell Sci)》121,3859–3866(2008))。因此，染色体畸变的数目在具有二倍体和四倍体(4n)范围之间的核型的肿瘤样品中最高(图1I)。
使用第三种方法，分析了取自局部晚期头颈部鳞状细胞癌(SCC)患者的原发性肿瘤样品的数据，其中诊断时淋巴结转移的临床数据是可获得的(Chung等人，《癌细胞(Cancer Cell)》5,489–500(2004))。作为染色体不稳定性的动态性质的量度，直接评估了在处于后期的固定细胞中的染色体分离完整性(Bakhoun等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》17,7704–7711(2011))。正常分离的染色体之间染色质的存在被认为是染色体错误分离的证据(图1F)。与无淋巴结扩散的肿瘤相比，伴有相关淋巴结转移的原发性肿瘤具有更高的染色体错误分离率。类似地，其肿瘤表现出高染色体错误分离率的患者更可能出现临床上涉及的淋巴结转移(图1F、1J)。使用这三种正交方法，推断染色体不稳定性在人转移瘤中富集，并且当存在于原发性肿瘤中时，其与更高的扩散倾向有关。
实例3：染色体不稳定性驱动转移
为了确定染色体不稳定性是否与转移相关，设计了一种遗传方法(Bakhoun等人，《自然细胞生物学(Nat.Cell Biol)》11,27–35(2009)；Bakhoun等人，《自然通讯(NatCommun)》6,5990(2015))来改变人TNBC(MDA-MB-231)和肺腺癌(H2030)的可移植肿瘤模型中的染色体错误分离率。来自这些高度转移性肿瘤模型的细胞表现出升高的染色体不稳定性基础率，其中47％和67％的后期细胞分别显示出后期期间染色体分离错误的证据(图2A、2B-1至2B-2)。这些具有未干扰的染色体分离率的细胞称为CIN-中细胞。Kif2b或MCAK/Kif2c在这些细胞中的过表达导致显著抑制染色体分离错误(称为CIN低细胞)。相反，MCAK24(dnMCAK)显性阴性形式的过表达导致MDA-MB-231细胞中的染色体分离错误进一步增加——被称为CIN高(图2B-1至2B-2、图1L)。驱动蛋白-13蛋白的过表达不会改变培养物中的细胞增殖速率或每个细胞的中心体数目(图1K、1M)。作为重要对照，将Kif2a过表达，Kif2a为微管解聚驱动蛋白-13蛋白的第三成员，其缺乏任何动粒或着丝粒定位结构域(Ems-McClung等人，《细胞与发育生物学研讨会(Semin.Cell Dev.Biol.)》21,276–282(2010))。Kif2a过表达对染色体不稳定性没有影响，尽管对间期微管表现出类似于Kif2b和MCAK的微管解聚活性(图2B-1和2B-2)。
亲代MDA-MB-231细胞系的核型分析显示了广泛的非整倍体(近三倍体)染色体含量，并显示了显著的核型异质性以及染色体异常，正如从染色体不稳定细胞系所预期的(图2F-1至2F-2)。抑制这些细胞中的染色体不稳定性导致单细胞来源克隆中的核型异质性降低，如与CIN-中或CIN-高相比在CIN-低细胞中存在较少的新染色体(展示非克隆结构异常的染色体)所证明的(图2G-2I)。例如，染色体22与其它染色体融合，在同一表达Kif2a的克隆群体内的不同细胞中产生独特的染色体组合(图2J)，表明由染色体不稳定性赋予的趋同核型进化。相反，此类事件在CIN低克隆中是不常见的。然而，CIN-低细胞维持高度非整倍体的核型，但它们以稳定的方式忠实地繁殖这些异常核型(图2G、2I)。通过将染色体稳定的非整倍体细胞与其染色体不稳定的非整倍体对应物进行对比，可以通过实验检测染色体不稳定性(独立于非整倍体)在转移中的作用。
将MDA-MB-231细胞直接注射到无胸腺小鼠的左心室中，以实现全身性播散(图3J-1和3J-2，第0天)。然后使用生物发光报告试验追踪转移性定植。通过实验改变染色体错误分离率对转移性定植具有显著的影响，由此携带CIN-高细胞的小鼠在注射60天内迅速死于广泛的疾病，脑、骨、肺、肾上腺和软组织中均存在转移瘤。相反地，注射CIN-低细胞的小鼠表现出显著更低的转移性肿瘤负荷，并且中值存活时间为207天，一些小鼠存活超过290天(图2C-2E、3J)。在一些动物中，CIN-低转移瘤起伏不定时重时轻，并且有时是自发消退的，而CIN-高转移瘤涉及多个器官并且迅速进展导致死亡(图3J-1和3J-2)，表明染色体不稳定性在转移的起始和维持中有着潜在作用。在心室内注射肺腺癌H2030细胞后获得相似的结果(图3K)。
为了评估染色体不稳定性在自原发性肿瘤开始的转移中的作用，在乳腺脂肪垫中原位注射MDA-MB-231，然后手术切除原发性肿瘤以允许有时间进行转移性播散(图3L，参见实例1中描述的方法)。染色体不稳定性状态并未显著改变原发性肿瘤植入效率，因为CIN-低、CIN-中和CIN-高肿瘤均能够以相似的速率形成可触知的肿瘤(未示出)，然而与注射CIN-低肿瘤细胞的动物相比，原位注射CIN-高细胞的小鼠表现出显著更短的无远处转移存活率(DMFS)(图3M)。总之，这些结果显示染色体不稳定性是肿瘤转移的关键因素，抑制染色体不稳定性降低了转移潜能，即使在高度异常和非整倍体细胞中也是如此。
为了评价肿瘤播散过程中相对于染色体不稳定性的选择动力学，评估了注射的细胞以及来源于原发性肿瘤或转移性集落的细胞(传代1)中的染色体错误分离(图3J-1和3J-2)。这一分析首先在属于两种乳腺癌亚型的两种具有转移能力的患者来源的异种移植物(PDX)中进行：ER+和TNBC(参见实例1)。在两种PDX肿瘤模型中，与来源于同一动物的匹配转移瘤相比，来源于原位移植的原发性肿瘤的细胞具有较低的染色体错误分离率(图3B)。然后使用MDA-MB-231细胞重复这一分析，发现无论注射的细胞的染色体不稳定性状态如何，大部分转移富集了与注射的细胞相比具有显著更高的染色体错误分离率的细胞(图3C至3E)。相反，与注射的细胞相比，来源于大多数原发性肿瘤的细胞具有显著更低的染色体错误分离率(图3D至3E)。当在乳腺脂肪垫中注射CIN-高细胞(图3E，最左边的柱)时，在同一动物中自发发生的转移瘤(图3E，标记为‘met’的相应柱)中再一次增加之前，原发性肿瘤(图3E，标记为‘原发性肿瘤’的柱)中的染色体错误分离率显著降低。这些结果揭示了由染色体不稳定性引起的快速基因组可塑性的潜力，并且证明了在转移进化过程中对于高速率染色体错误分离的强选择压力。
实例4：染色体不稳定性丰富了间充质性状
为了检测响应染色体不稳定性的细胞变化，对CIN-低、CIN-中和CIN-高MDA-MB-231细胞进行了大量RNA测序(RNA-seq)，并在对比CIN-低和CIN-中/高时发现1584个差异表达的基因(图3F)。对基因表达的主成分分析(PCA)根据其染色体不稳定性状态精确地分离样品(图4F)。基因集富集分析(GSEA)揭示了，与CIN-低相比，转移相关基因集是CIN-中/高细胞中最高度富集的基因集(图3G)，表明染色体错误分离诱导类似于在转移中观察到的转录变化。实际上，与CIN-低相比，CIN-中/高的前23个差异表达的基因在人乳腺癌患者中是高度预后的，因为它们在元分析中预测了无远处转移存活率(DMFS)(
Figure GDA0002476633540001171
等人，《乳腺癌研究和治疗》123,725–731(2010))以及验证组(Hatzis等人，《美国医学会杂志(JAMA)》305,1873–1881(2011))(图3H至3I)。
这一23个基因(其表达升高预示乳腺癌中的无远处转移存活率提高)的列表被称为染色体不稳定性(CIN)签名，并且包括以下基因的表达提高：PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24、FGF5和NTN4。这样的预测能力在肿瘤亚型、等级和淋巴结状态中得到很大程度的保持。例如，23-基因染色体不稳定性(CIN)签名准确地鉴定出与患有多种乳腺癌的CIN-高患者相比，CIN-低患者具有增加的无远处转移存活率，所述乳腺癌包括淋巴结阴性、淋巴结阳性、2级、3级、1/2级、3级、ER+、ER-和Her2+乳腺癌。
上皮细胞向间充质细胞(EMT)转录程序在CIN-中/高细胞中也高度富集(图4G)。为了进一步了解染色体不稳定性如何影响细胞异质性，使用基于微珠的分子条形码技术(Klein等人，《细胞(Cell)》161,1187–1201(2015))对两种CIN-低MDA-MB-231细胞系(Kif2b和MCAK)和一种CIN-高细胞系(dnMCAK)进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)，总共包含6821个细胞。样品中的单细胞文库大小是一致的。使用关键EMT基因的单细胞聚集成功地基于它们的CIN-状态将大多数细胞分类，并且其揭示了高度富集间充质标记物的细胞部分，所述间充质标记物包括关键EMT调节剂如波形蛋白和ZEB1。这一部分主要由表达dnMCAK的CIN-高细胞构成(图4A)。相反，CIN-低细胞高度富集上皮标志物。
然后，基于所有基因的无监督的基于图的聚类(Levine等人，《细胞(Cell)》162,184–197(2015))以无偏方式鉴定内在亚群。鉴定出一个亚群(称为亚群‘M’)，其表现出参与上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)和转移的基因的表达增加，并且伴随地其富集染色体不稳定性(CIN)基因签名。与仅6％的CIN-低细胞相比，亚群M包括45％的总的表达dnMCAK的细胞(图4B、图6I至6J)。
使用高分辨率荧光显微镜实验来验证这些结果，由此发现表达dnMCAK的细胞具有展示出肌动蛋白细胞骨架重组的更加伸长的特征(由长宽比定义)。它们还展示出间充质特征，诸如弥散波形蛋白染色和β-连环蛋白定位的变化：从表达MCAK的细胞中的细胞-细胞连接到表达dnMCAK的细胞的细胞质和细胞核(图4C、图7C至7D)。因此，具有高水平染色体不稳定性的细胞展现出增加的迁移能力，并且在体外通过胶原蛋白基底膜明显更具侵袭性(图4D、图7E至7F)。总而言之，这些结果证明了染色体不稳定性促进了有利于转移过程的细胞自主侵袭程序。
实例5：染色体不稳定性诱导的细胞内在炎症
这一实例说明了染色体不稳定性诱导内在炎症。
为了进一步确定染色体不稳定性反应通路，使用scRNA-seq数据进行基因-基因Pearson相关分析，并鉴定两个大的基因模块。模块2含有参与上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)以及大量炎症途径的基因(图5A)。
如实例1所述，EMT基因包括VIM、ZEB2、SNAI2和ZEB1。炎症通路基因包括RGS16、DENND5A、BTG2、STAT3、IFITM3、CD47、SLAMF7、REL、BCL6、IL18BP、NAMPT、PDE4B、IL8、PSME2、P2RX4、IFI44、CCR7、KLF10、ADRM1、KLF9、NFIL3、CNP、LDLR、HES1、HLA-A、PARP9、NUB1、STAT2、VIP、TGIF1、PVR、MOV10、PSMA2、EIF4E3、IER3、PLA2G4A、TRAFD1、MYD88、VAMP5、TRIM14、TUBB2A、BPGM、B2M、HRH1、PSMB9、LATS2、PTPN6、DCBLD2、PSMB8、IL1R1、PSMB2、SQSTM1、PTX3、ITGA5、EDN1、SLC31A1、SAMHD1、PNPT1、CSF1、TNFRSF9、SOCS1、REIB、VEGFA、ARL4A、DUSP5、CMKLR1、CD38、SLC4A4、SP110、PLAU、DDX58、PSME1、TRAF1、SPSB1、TDRD7、F2RL1、EPSTI1、SAMD9L、NINJ1、RNF19B、LIF、RIPK1、SLC2A6、IRF7、PTAFR、IRAK2、CD14、ITGB8、SCARF1、KIF1B、FOSL2、SOCS3、DUSP1、IRF1、SLC2A3、HBEGF、CXCL3、TNIP1、AHR、SGMS2、FZD5、GCH1、SLC25A28、OSMR、RSAD2、APOL6、ICOSLG、JAG1、G0S2、GEM、KLF4、NFKB1、STAT1、HLA-C、IFIH1、LY6E、EFNA1、SLC16A6、BHLHE40、TRIM26、CD82、CYBB、IL15RA、GABBR1、REIA、PHLDA2、MAP3K8、NUP93、IL7R、PTPRE、IFI27、SNN、NR4A2、SPPL2A、RHOG、SAT1、SLC7A1、IL6、IL15、RAF1、CCL20、ACVR1B、BIRC2、RBCK1、LAP3、ID2、TNFSF10、SIK1、BST2、PANX1、GADD45A、PML、CD40、TRIM21、SECTM1、SSPN、TXNIP、BTG1、AREG、KYNU、PTGS2、IRS2、C3AR1、STAT4、ATP2A2、BIRC3、MAP2K3、CXCL1、NFKBIA、IFNAR1、MET、NR4A1、CXCL2、EBI3、CD83、DNAJB4、CASP7、PHLDA1、NLRC5、IL1B、TRIM25、IER5、RNF213、IL10、NFAT5、ADAR、PNP、MMP14、ICAM4、PPAP2B、SDC4、ABCA1、DUSP2、EIF2AK2、IER2、HERC6、BMP2、IL7、ISG20、GMPR、PSEN1、XAF1、SERPINB8、MTHFD2、EREG、TNFAIP3、TMEM140、KDM6B、CXCL11、CASP1、CYR61、IRF9、GBP2、ADM、TRIP10、PTGER2、METTL7B、SOD2、OAS2、CSF3、SERPINE1、MXD1、ICAM1、ZC3H12A、BCL3、PFKFB3、OGFR、SRI、IFNAR2、FUT4、IL6ST、TNIP2、DUSP4、PROCR、TLR2、OASL、JAK2、C1 S、NMI、UBE2L6、LAMP3、TRIB1、TIPARP、IFIT3、GFPT2、IFI30、PPP1R15A、FAM46A、ELF1、UPP1、NOD1、CCL5、FOS、VAMP8、RTP4、TPBG、IL23A、BEST1、CEBPB、TNFSF15、SCN1B、P2RY2、STAT5A、CHST2、HIF1A、ZFP36、KLF2、LPAR1、EHD1、PLSCR1、PDLIM5、OAS1、CXCL10、JUNB、PFKP、CD274、CD55、TNFSF9、ADORA2B、ETS2、OAS3、CASP8、ISG15、WARS、SLC7A2、TNFRSF1B、PARP14、FAS、SAMD9、EIF1、CD74、TOR1B、PTPN2、MARCKS、ST8SIA4、SEMA4D、LYSMD2、ATF3、FOSB、PSMB10、ISOC1、PSMA3、IFNGR2、SMAD3、RIPK2、MARCH1、DHX58、IL4R、TRIM5、LITAF、B4GALT5、NLRP3、ITGB3、CIITA、IFITM1、PIM1、BTG3、CD44、PLK2、DRAM1、FPR1、RHOB、EGR1、GNAI3、C1R、NCOA3、PARP12、ABI1、RCAN1、EMP3、IRF2、HLA-DMA、LAMB3、MYC、ATP2B1、YRDC、HLA-DRB1、NDP、MCL1、F3、MT2A、IFI44L、SERPINB2、MAFF、FJX1、LGALS3BP、IL18、GADD45B、TLR1、CEBPD、GNA15、CSF2、SPHK1、IFI35、LYN、PNRC1、IRF5、IFITM2、BANK1、AXL、KLF6、PTGER4、CASP3、PMEPA1、TNC、ZBTB10、PCDH7、CCRL2、CDKN1A、CCNL1、PER1、TLR3、B4GALT1、CLCF1、MVP、CFB、NFKBIE、PTPN1、USP18、NFKB2、CASP4、TNFAIP2、ACVR2A、CX3CL1、IFIT1、EMR1、CFLAR、DDX60、IDO1、CFH、IFIT2、NCOA7、INHBA、TIMP1、RNF144B、MX1、ATP2C1、TSC22D1、PELI1、TAPBP、GBP4、CCND1、SLC31A2、SGK1、ZNFX1、RAPGEF6、CCL2、HLA-B、NFE2L2、UBA7、HAS2、JUN、SLC11A2、FOSL1、SELL、PLAUR、BATF2、TNFAIP8、ST3GAL5、TANK、ARID5B、MX2和TAP1。
染色体不稳定性签名基因包括PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24、FGF5和NTN4。当检测到这些基因的表达水平升高时，这一23个基因(其表达升高预示乳腺癌中的无远处转移存活率提高)的列表被称为染色体不稳定性(CIN)签名。
炎症相关基因、染色体不稳定性签名基因和EMT基因之间存在显著的相关性，所有这些基因都高度富集于亚群M中(图4B，黑框；图5b)。大量RNA-seq数据也揭示了染色体不稳定性-中/高细胞中参与炎症反应和TNF-α/NF-κB通路的基因的显著富集(图4H)。这些数据表明染色体不稳定性和肿瘤细胞内在炎症之间可能存在关系。
甚至在体内移植之前，由于染色体不稳定性而引起的细胞内炎症的诱导也是出乎意料的，并且使人联想到病毒感染。然后通过将基因组DNA导入胞质溶胶来询问染色体不稳定性是否可能诱导细胞炎症，从而引起通常保留用于抗病毒免疫的内在细胞炎症。
染色体不稳定性-中/高表现出较高的微核优势，如与原发性肿瘤相比，当对比来源于转移性损伤的细胞时所看到的。染色体错误分离率和微核频率之间存在总体显著的相关性(图5C至5E、图8A至8C)。
为了确定易破裂微核的存在是否有助于胞质DNA的产生，在选择性质膜透化之后，使用两种不同的抗dsDNA抗体对细胞进行染色。在每种情况下，与表现出低水平染色体不稳定性的细胞相比，表达dnMCAK的细胞显示出显著增加的胞质dsDNA和单链DNA(ssDNA)水平(图5G)。与线粒体染色不同的dsDNA信号在用双链特异性但非单链特异性核酸酶处理后和DNA酶2过表达后消失，证实了这些抗体的特异性(图5H)。
亚细胞分级分离后dsDNA水平的直接定量显示，与表现出中到高水平染色体不稳定性的细胞(CIN-中/高细胞；图5G)相比，表现出低水平染色体不稳定性的细胞中胞质DNA减少4倍。最后，亚细胞部分覆盖30x的全基因组测序证实了胞质DNA的基因组来源(未示出)。为了进一步确定胞质dsDNA起因于微核破裂，过表达mCherry-核纤层蛋白B2作为稳定微核包膜的手段(Hatch等人，《细胞(Cell)》154,47–60(2013))，并观察细胞以确定在过表达核纤层蛋白B2的细胞中是否存在胞质dsDNA染色的选择性降低(图5I)。总之，这些结果证明了染色体不稳定性通过微核破裂诱导基因组来源的胞质DNA。
实例6：来自胞质DNA应答的转移
这一实例说明DNA暴露于胞质溶胶可导致癌细胞转移。
胞质dsDNA引发独特的信号传导通路，导致诱导用于对抗病毒感染的I型干扰素信号传导。为了探讨染色体不稳定细胞中胞质dsDNA的下游结果，对细胞进行了环状GMP-AMP合酶(cGAS)(胞质DNA的关键传感器)染色(Sun等人，《科学(Science)》339,786–791(2013))。cGAS表现出对存在的所有微核的大约一半的显著定位，而与染色体不稳定性的水平无关(图6A至6B)。
在选择性质膜透化之后，用抗dsDNA抗体对cGAS阳性微核进行阳性染色，而cGAS阴性微核不染色(图6A)此外，通过核纤层蛋白B2过表达来稳定微核膜(Hatch等人，《细胞(Cell)》154,47–60(2013))，用cGAS染色显著减少微核的相对分数(图6B)。总而言之，这些结果证明，cGAS检测胞质DNA需要微核破裂。而且，尽管染色体不稳定性本身不影响微核完整性，但其增加了每个细胞的微核总数，并因此增加了cGAS活化的可能性(图5C至5E、图6A至6B)。
cGAS催化2'3'-环GMP-AMP(cGAMP)的形成，其依次激活干扰素基因的刺激物(STING，也称为TMEM173)以诱导I型干扰素产生。在CIN-高细胞中观察到STING蛋白水平增加(图6C)。然而，没有证据表明下游干扰素调节因子或经典NF-κB通路的激活，如p65或IRF磷酸化没有显著变化以及其没有核易位所证明的(图6C)。这与癌细胞抑制胞质DNA传感下游的干扰素产生的观察结果一致(Stetson等人，《细胞(Cell)》134,587–598(2008)；Lau等人，《科学(Science)》350,568–571(2015))。然而，胞质DNA能够以STING-依赖性和TBK1-非依赖性的方式激活非经典NF-κB通路(Abe等人，《病毒学杂志(J.Virol.)》88,5328–5341(2014))。
在表现出中等至高水平染色体不稳定性的细胞(CIN-中/高细胞)中观察到非经典NF-κB通路激活的证据。相对于总p100库，这些细胞具有较低水平的非经典NF-κB前体蛋白p100，以及增加量的磷酸化p100和其裂解产物p52，符合非经典通路的激活(图6C至6D)。非经典NF-κB通路抑制剂TRAF2的水平也显著降低(图6C)。在表现出中等至高水平染色体不稳定性的CIN-中/高细胞中，观察到ReIB(p52的结合伴侣)的核易位(图6E)。
有趣的是，STING耗尽(depletion)消除了非经典NF-κB激活和ReIB核易位，并且它与TNF-α/NF-κB以及其它炎症和EMT通路的负富集相关(图6D至6E)。
大量RNA-seq数据揭示了许多非经典NF-κB靶基因，其响应于染色体不稳定性而上调(因此称为CIN响应性NC-NF-κB基因，其包括PPARG、DDIT3、NUPR1、RAB3B、IGFBP4、LRRC8C、TCP11L2、MAFK、NRG1、F2R、KRT19、CTGF、ZFC3H1、MACROD1、GSTA4、SCN9A、BDNF、LACTB)。类似地，单细胞分析显示，染色体不稳定性签名基因和CIN应答性NC-NF-κB基因之间存在显著相关性(图4B和图5B)。
为了验证染色体不稳定性签名基因与CIN响应性NC-NF-κB基因在独立数据集中的关系，从TCGA乳腺癌数据库中分析了RNA-seq数据。在CIN-签名基因水平更高的肿瘤中观察到CIN响应性NC-NF-κB基因的显著上调(图6F)。此外，在乳腺癌和肺癌中，非经典NF-κB通路的关键调节子或其CIN响应性靶基因的更高表达与更短的DMFS和无病存活率相关。相反，经典NF-κB通路(NFKB1、ReIA、TRAF1、TRAF4、TRAF5、TRAF6)或干扰素调节因子(IRF1、IRF3、IRF7、TBK1)的上调与改善的预后相关(图9)。
总而言之，这些数据表明，染色体不稳定性诱导胞质dsDNA应答，其表现为非经典NF-κB通路的选择性激活，并且这些特征与不良预后相关。
为了测试STING活性对于肿瘤细胞自主方式的转移而言是否重要，进行表现出高水平染色体不稳定性的STING耗尽细胞的心内注射与注射STING-完全对应物的小鼠相比，注射STING耗尽细胞的小鼠中转移性播散和寿命延长显著降低(图6G-1和6G-2、图9A)。
类似地，STING、cGAS或非经典NF-κB转录因子p52和ReIB的耗尽导致表现出高水平染色体不稳定性的细胞(CIN高细胞；图6H)的侵袭潜力显著降低。
另一方面，添加cGAMP增加了MCAK(CIN-低)细胞迁移和侵袭胶原膜的能力(图6H)。
因此，响应于胞质DNA的肿瘤细胞自主STING激活部分地通过非经典NF-κB通路促进侵袭和转移。
实例7：染色体不稳定性也与免疫浸润有关
本文提供的数据显示存在一种新途径，其通过对胞质DNA的肿瘤细胞内在炎症反应将染色体不稳定性(CIN)与肿瘤免疫浸润的转移和形成联系起来。本发明人鉴定的通路总结于图7B中。简言之，发明人发现CIN促进含染色体的微核的形成，所述微核经常破裂，使它们的DNA含量暴露于细胞质(或胞质)。这种不寻常的情况(在正常细胞中不发生)让人联想到病毒感染。在通过cGAS检测胞质DNA后，癌细胞促进cGAMP(小分子)的形成，cGAMP进而激活STING。癌细胞激活非经典NF-kB通路(NIK和ReIB/p52)而不是上调经典通路，这导致前转移程序的上调。同时，cGAMP可通过直接与STING蛋白结合而退出肿瘤细胞并激活邻近的基质，特别是抗原呈递细胞。
目前正在进行临床前的努力，探索肿瘤内cGAMP注射在激活免疫系统以攻击肿瘤细胞中的用途。本发明人认为这一努力可能并非没有风险，因为他们已经发现肿瘤细胞中的cGAMP自身促进转移，而不是其在激活免疫细胞中的抗肿瘤作用。
染色体不稳定性促进促进病毒样免疫应答并促进转移，同时募集大量的免疫浸润物(图7A)，这一发现意义重大，这显示了染色体不稳定的细胞在这一免疫激活的存在下能够存活、增殖和转移。
表现出染色体不稳定性的细胞似乎足以在它们自己的细胞质内尽可能多地保留胞质DNA信号(和其副产物)。换句话说，它们下调推定的cGAMP转运蛋白ABCG2和ABCC4。此外，这些细胞产生显著更大量的ENPP1，ENPP1是一种有效分解cGAMP且仅存在于质膜的细胞外小叶上的水解酶。因此，这些染色体不稳定的肿瘤细胞在细胞内环境中保存cGAMP，减少其输出，并且必要时，在其泄漏时将其降解此外，这些肿瘤细胞还产生大量M-CSF，M-CSF是促进肿瘤前M2巨噬细胞产生的细胞因子。
这种免疫激活可被调动以促进与染色体浸润相关的癌症的治疗。
例如，代替直接用cGAMP注射肿瘤(并冒着在肿瘤细胞中激活转移的风险)，由染色体不稳定的肿瘤细胞产生的cGAMP可与之抗衡：通过抑制ENPP1，这基于其当cGAMP一旦存在于细胞就将cGAMP破坏的能力。另一种方法为使用ABC转运蛋白的激动剂来增加cGAMP向细胞外空间的输出并激活邻近的免疫细胞。
实例8：cGAMP检测和定量
使用液相色谱-质谱(LC-MS)
这一实例说明，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)由于其特异性、再现性和灵敏度而成为测定cGAMP的可行技术。LC-MS/MS是高度特异性的，因此使来自其它核苷酸的干扰最小化。LC-MS/MS的更高特异性来源于分析物特异性前体对产物离子的质荷比(m/z)值和/或分析物特异性保留时间。
材料和方法：
cGAMP溶液用作标准。cGAMP标准溶液在70％乙腈的ddH2O溶液中制备，用于LC-MS/MS分析。
对于细胞培养，细胞在10cm平板中生长。
采集和样品制备：
将细胞用PBS洗涤两次，用LC/MS级水洗涤一次(以除去盐)。然后将平板在液氮上快速冷冻以保存细胞的代谢状态。然后将细胞收集/刮到2ml冷的80％LC-MS级甲醇(-80C)中。然后如Collins,A.C.等人2015先前所述，使用HyperSep氨基丙基固相柱通过固相提取(SPE)纯化甲醇代谢物提取物。将流出物在真空离心机中干燥至完全，并且以100μg蛋白质/μL的浓度在70％乙腈的ddH2O溶液中重构。对15μL进行LC-MS/MS分析。
血清/培养基样品制备：
为了检测培养基中分泌的cGAMP，可以收集500μl等分试样的条件培养基，与甲醇以80:20混合，并在4℃下以3000rpm离心20分钟。所得上清液可以在LC-MS/MS之前在-80摄氏度下收集并储存以评估cGAMP水平。为了测量全细胞相关代谢物，可以吸出培养基并且可以例如以非汇合密度收获细胞。可以使用多种不同的液相色谱(LC)分离方法。每种方法可以通过负电喷雾电离(ESI，-3.0kV)与以多反应监测(MRM)模式运行的三重四极质谱仪偶联，其中MS参数在输注代谢物标准溶液上优化。
cGAMP分析
固相提取(SPE)后，使用真空离心机(Eppendorf Vacufuge，Eppendorf，德国)干燥样品并在70％乙腈的ddH2O溶液中重构。为了除去未溶解的颗粒，将21130g样品在4℃离心10分钟。将上清液注入由Agilent 1260HPLC和Agilent6460三重四极质谱仪(AgilentTechnologies，美国加利福尼亚州，圣克拉拉)构成的LC/MS系统中，所述Agilent 6460三重四极质谱仪配备有射流电喷雾电离源，在动态多重反应监测(dMRM)中使用正离子监测。在水性中性相柱(CogentTMDiamond Hydride，4μm粒径，150mm×2.1mm；Microsolv Technology公司，新泽西州)的干扰信号中分离出分析物cGAMP，柱室温度为40℃。将样品保持在4℃，且进样量为15μL。Chen等人(《公共科学图书馆期刊(PLoS One)》7(6):p.e37149(2012))先前描述的梯度色谱经过了优化，以实现从干扰峰的色谱分离。水性流动相(A)为含有0.025％乙酸的50％异丙醇，有机流动相(B)为含有5mM乙酸铵的90％乙腈。为了消除金属离子对色谱峰完整性和ESI离子化的干扰，将EDTA以6μM的终浓度加入到流动相中。所施加的最终梯度为：0至1.0分钟99％B，1.0至10.0分钟至60％B，10.1至20分钟0％B以及20.1分钟99％B，持续10分钟以再生所述柱。流速为0.4mL/分钟。使用Agilent MassHunter工作站采集软件(B.06.00Build 6.0.6025.4SP4)以质心模式保存数据。获得的原始数据文件用AgilentMassHunter定性分析软(B.07.00Build7.0.7024.0，Agilent Technologies)和定量分析软件(B.07.01Build 7.1.524.0)处理。MS-分析的操作源参数为：气体温度280℃；气体流量11L/分钟；喷雾器压力35psi；鞘气温度350℃；鞘气流量11L/分钟；毛细管电压4000V；喷嘴电压300V；裂解电压(fragmentor voltage)145V；电池加速器电压2V。当LC-流导向MS时，运行4分钟时开始采集dMRM数据。
使用Agilent Optimizer软件(对于6400系列三重四极版本B.06.00Build6.0.6025.4SP4)优化化合物的特定参数。
优化的dMRM跃迁导致去糖基化的碱基离子：对于cGAMP，跃迁675.1→136.1*(CE65eV)代表腺嘌呤的形成，675.1→152.1**(CE65eV)代表鸟嘌呤的形成。另外，记录了675.1→312.0(CE61eV)和675.1→524.1(CE35eV)的dMRM跃迁。*表示quantifier跃迁，**表示qualifier跃迁(见图10A)。由于所有cGAMP跃迁均来源于相同的母离子，所以所有四个跃迁都被求和为最终TIC(总离子流)，以增加信号丰度和信噪比。
结果
图10B图示了使用靶向LC-MS代谢组学对染色体不稳定的尿三阴性乳腺癌细胞(4T1)中cGAMP的定量。如图所示，4T1细胞中cGAS的敲除降低了cGAMP的丰度。这些结果表明，cGAMP可以在多种样品中进行定量，并且cGAMP可以作为检测和监测患者中转移性疾病的标志物。
实例9：鉴定/评价KIF2B和MCAK激动剂的ATP酶试验
KIF2B和KIF2C/MCAK是相关的分子驱动蛋白运动蛋白，其利用ATP水解的能量来调节微管动力学和染色体-动粒附着。KIF2B和MCAK过表达或过度活化的中心作用为抑制染色体不稳定性(CIN)，这使其成为癌症治疗的有吸引力的靶点。这里，在本实例中概述了两种鉴定和评估KIF2B和MCAK的有效活化剂的方法(体外测定和成像方法)。
方法1体外测定KIF2B或MCAK活性：
测定ATP水解的动力学是一种筛选活化KIF2B和MCAK并抑制CIN的化合物的策略。所述测定基于当2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核苷(MESG)在无机磷酸盐(Pi)存在下转化为2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤时发生的吸光度偏移(330-360nm)(参见例如Webb,M.R.1992.“一种用于无机磷酸盐和用于测量生物系统中磷酸盐释放动力学的连续分光光度测定法(A continuous spectrophotometric assay for inorganic phosphate andfor measuring phosphate release kinetics in biological systems)”《美国国家科学协会公报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》89：4884-4887)。所述反应由嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)催化。一分子无机磷酸盐将在不可逆反应中产生一分子2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤。因此，360nm处的吸光度与ATP酶反应中产生的Pi的量成正比，并且可以用作MCAK活性的指标。
或者，还可以使用来自BellBrock实验室的Transcreener ADP测定监测ADP产生，作为MCAK活性的读数。这一测定基于ADP置换与特异性识别ADP的抗体结合的荧光示踪剂(633nm)的能力。示踪剂的置换引起通过633nm激光激发测量的荧光降低。因此，MCAK的活性可以通过绘制所用药物的浓度和产生/降低荧光强度的ADP的量来计算。
方法2基于细胞的KIF2B或MCAK活性测定：
通过结合微管尖端并促进微管解聚，MCAK负调节微管长度。因此，可以测量γ-微管蛋白标记的中心体之间的距离，作为细胞中MCAK活性的间接读数。纺锤体长度与MCAK活性成反比，并可作为评估促进MCAK活性的潜在化合物的代表(参见，例如，Lockhart,A&Cross,R.A.1996.“Eg5微管运动的动力学和运动(Kinetics and Motility of the Eg5Microtubule Motor)”《生物化学(Biochemistry)》35:2365–2373)。这一方法可适用于通过使用高通量成像显微镜筛选化合物。
随后可以将化合物(例如，通过本文所述的任何方法鉴定的热门(top hits))用于落后染色体、微核或染色体错误分离的基于细胞的测定，使用FISH读取其功效。荧光原位杂交(FISH)是一种使用荧光探针的分子细胞遗传学技术，所述荧光探针仅结合具有高度序列互补性的染色体的那些部分。探针可包括本文所述的任何染色体或基因的序列的一部分。
实例10：用于鉴定/评估NF-kB诱导激酶
(NIK)抑制剂的ATP酶试验
NF-kB诱导激酶(NIK)介导非经典NF-kB信号传导，并与转移相关。因此，NIK的抑制可以抑制CIN诱导的炎症反应和转移。这一实例概述了两种可用于鉴定和评估NIK抑制的方法。
方法1：
NIK激酶功能的特异性抑制提供了一种评估各种化合物效力的方法。因此，可以使用来自BellBrock实验室的Transcreener ADP测定法监测ADP产生，作为NIK活性的读数。这一测定基于ADP置换与特异性识别ADP的抗体结合的荧光示踪剂(633nm)的能力。示踪剂的竞争性置换导致荧光(如通过633nm的激光激发测量的)降低。因此，NIK的活性可以通过绘制所用药物的浓度和产生/降低荧光强度的ADP的量来计算。
方法2：
NIK的抑制提供了直接抑制非经典NF-κB通路的方法。这一测定依赖于使用高含量细胞成像对p52的核易位(REIB；非经典NF-kB信号传导)进行定量。人REIB序列的实例如SEQID NO:59所示。
Figure GDA0002476633540001301
Figure GDA0002476633540001311
对于REIB核易位测定，用不同浓度的化合物处理细胞并用100ng/mL拮抗性抗淋巴毒素β受体(LT-βR)抗体(例如，来自Sigma Aldrich)刺激，后者是非经典NF-kB信号传导的有效激活剂。通过细胞核与细胞质信号强度的比率定量REIB易位到细胞核中的程度。发现了选择性抑制REIB的核易位的有效化合物。
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60.
Figure GDA0002476633540001391
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声明(Statement)：
2)一种方法，其包含将转移性化学治疗剂给予具有细胞样品或体液样品的患者：
a.所述细胞样品的一个或多个细胞内具有至少10％，或至少11％，或至少12％，或至少13％，或至少14％，或至少15％的可检测的染色体错误分离；
b.所述细胞样品的一个或多个细胞内具有至少3％，至少4％或至少5％的细胞可检测的微核；
c.所述细胞样品的一个或多个细胞内具有可检测的胞质双链DNA；或
d.所述细胞样品或体液样品中cGAMP的浓度或量高至少10％，或20％，或30％，或50％，或70％，或80％，或90％；
从而治疗患者的转移性癌症。
3)根据声明1所述的方法，其包含将转移性化学治疗剂给予患者，所述患者的细胞样品的后期细胞中15至20％的染色体表现出错误分离。
4)根据声明1或2所述的方法，其包含将转移性化学治疗剂给予患者，所述患者的细胞样品中5至8％的细胞表现出微核。
5)根据声明1、2或3所述的方法，其包含将转移性化学治疗剂给予患者，所述患者的胞质内的染色强度与正常非癌组织相比增加1倍至2倍。
6)根据声明1、2、3或4所述的方法，其包含将转移性化学治疗剂给予患者，所述患者的体液样品中cGAMP的浓度或量比非癌性体液样品高1倍至2倍。
7)根据声明1至4或5所述的方法，其进一步包含随时间监测患者的样品以定量所述患者的细胞或体液内的染色体错误分离、微核、胞质双链DNA或cGAMP。
8)根据声明1至5或6所述的方法，其中所述转移性化学治疗剂为包含驱动蛋白-13蛋白的组合物，所述驱动蛋白-13蛋白与SEQ ID NO:1、3或5中的任一个具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性。
9)根据声明1至6或7所述的方法，其中所述转移性化学治疗剂为包含驱动蛋白-13核酸的组合物，所述驱动蛋白-13核酸包含与SEQ ID NO:2、4或6中任一个具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性的序列。
10)根据声明1至7或8所述的方法，其中所述转移性化学治疗剂为包含MCAK蛋白或MCAK核酸的组合物，所述MCAK蛋白与SEQ ID NO:7具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性，所述MCAK核酸与SEQ ID NO:8具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性。
11)根据声明1至8或9所述的方法，其中转移性化学治疗剂为包含至少一种STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1抑制性核酸的组合物。
12)根据声明1至9或10所述的方法，其中所述转移性化学治疗剂为包含至少一种抑制性核酸的组合物，所述抑制性核酸与SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36中任一个具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性。
13)根据声明1至10或11所述的方法，其中所述转移性化学治疗剂为包含至少一种抗体的组合物，所述抗体与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1蛋白亲和力结合。
14)根据声明1至11或12所述的方法，其中所述转移性化学治疗剂为包含表达载体的组合物，所述表达载体具有与编码驱动蛋白-13或MCAK蛋白的核酸片段可操作地连接的启动子，所述驱动蛋白-13或MCAK蛋白与SEQ ID NO:1、3、5或7中任一个具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性。
15)根据声明1至12或13所述的方法，其中转移性化学治疗剂为包含具有以下结构的驱动蛋白-13激动剂的组合物，其中X为甲基：
Figure GDA0002476633540001421
16)根据声明1至13或14所述的方法，其中所述体液样品或细胞样品中cGAMP的浓度或量通过包含液相色谱法(LC)和质谱法(MS)的方法定量。
17)根据声明1至14或15所述的方法，其中所述体液样品或细胞样品中的cGAMP被提取和/或溶解在醇中以产生醇提取物，可以对所述醇提取物进行色谱分析，且在测量cGAMP的浓度或量之前，可以将色谱分析的流出物悬浮于乙腈、水或其组合中。
18)一种方法，其包含将至少一种驱动蛋白-13蛋白、至少一种MACK蛋白、至少一种驱动蛋白-13激动剂、至少一种MACK激动剂或其组合给予受试者。
19)根据声明17所述的方法，其中所述至少一种驱动蛋白-13蛋白或MCAK与SEQ IDNO:1、3、5或7中任一个具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性。
20)根据声明17或18所述的方法，其中驱动蛋白-13的至少一种激动剂如下，其中X为甲基：
Figure GDA0002476633540001431
21)根据声明17、18或19所述的方法，其进一步包含将STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1或其任何组合的抑制剂给予受试者。
22)一种方法，其包含在哺乳动物细胞中抑制STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1或其任何组合。
23)一种方法，其包含将表达载体给予受试者，所述表达载体包含启动子，所述启动子与编码驱动蛋白-13或MACK蛋白的核酸片段可操作地连接。
24)根据声明22所述的方法，其中所述至少一种驱动蛋白-13蛋白或MACK蛋白与SEQ ID NO:1、3、5或7中任一个具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性。
25)根据声明17至23或23所述的方法，其包含给予表达载体，所述表达载体包含启动子，所述启动子与抑制性核酸片段可操作地连接，所述抑制性核酸片段与SEQ ID NO:9、11、13或15中的任一个具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性或互补性。
26)根据声明1至23或24所述的方法，其进一步包含将STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)、MST1或其任何组合的抑制剂给予受试者。
27)根据声明1至24或25所述的方法，其进一步包含给予ABCC4、ABCG2或其组合的激动剂；给予表达盒或载体，所述表达盒或载体包含与编码ABCC4或ABCG2的核酸片段可操作地连接的启动子；或其组合。
28)根据声明1至25或26所述的方法，其中所述患者中的细胞在给药前表现出染色体不稳定性。
29)根据声明1至26或27所述的方法，其中所述患者疑似患有癌症。
30)根据声明1至27或28所述的方法，其中所述患者疑似发展为癌症。
31)根据声明1至28或29所述的方法，其中所述患者患有癌症。
32)根据声明1至29或30所述的方法，其中所述患者患有转移性癌症。
33)根据声明1至30或31所述的方法，其中所述方法抑制所述受试者中癌症的转移。
34)根据声明1至31或32所述的方法，其中与未接受所述蛋白或所述表达载体的对照受试者相比，所述方法抑制所述受试者中癌症的转移。
35)根据声明1至32或33所述的方法，其中所述方法抑制染色体不稳定性。
36)一种方法，其包含对患者的测试样品中至少一种以下基因的表达水平进行定量：PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24或FGF5，以得到测试样品中至少一种以下基因的至少一种定量表达水平：PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24或FGF5。
37)根据声明35所述的方法，其进一步包含确定与健康或非癌性样品中至少一种相应基因的对照表达水平相比，所述测试样品中至少一种以下基因的至少一种定量表达水平的至少一种差异：PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24或FGF5。
38)根据声明35或36所述的方法，其中所述健康或非癌性样品未表现出染色体不稳定性。
39)根据声明35、36或37所述的方法，其进一步包含确定与转移性癌症患者的样品(或样品组)中至少一种相应基因的对照表达水平相比，所述测试样品中至少一个以下基因的至少一个定量表达水平中的至少一个差异：PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24或FGF5。
40)根据声明35至37或38所述的方法，其包含定量所述测试样品中以下基因：PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24或FGF5中的两种或更多种，或三种或更多种，或四种或更多种，或五种或更多种，或六种或更多种，或七种或更多种，或八种或更多种，或九种或更多种，十种或更多种，或十一种或更多种，或十二种或更多种，或十三种或更多种，或十四种或更多种，或十五种或更多种，或十六种或更多种，或十七种或更多种，或十八种或更多种，或十九种或更多种，或二十种或更多种，或二十一种或更多种，或二十二种或更多种的表达水平。
41)根据声明35至38或39所述的方法，其中与健康或非癌性样品中至少一种相应基因的对照表达水平相比，所述测试样品中至少一种以下基因：PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24或FGF5的至少一种定量表达水平的差异为表达增加至少10％，或20％或30％，或40％，或50％，或60％，或75％，或100％。
42)根据声明35至39或40所述的方法，其中与样品(或来自一个或多个转移性癌症患者的样品组)中至少一种相应基因的平均对照表达水平相比，所述测试样品中至少一种以下基因：PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24或FGF5的至少一种定量表达水平的差异为表达增加至少10％，或20％或30％，或40％，或50％，或60％，或75％，或100％
43)根据声明35至40或41所述的方法，其中与对照表达水平相比，所述测试样品中至少一种以下基因：PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24或FGF5的至少一种定量表达水平的差异为这些相应基因的表达增加至少1.2倍，或1.5倍，或2倍，或3倍，或5倍，或7倍，或10倍。
44)一种方法，其包含将STING蛋白或在受试者中表达来自表达盒或表达载体的STING蛋白给予受试者，以恢复和/或激活胞质DNA传感下游的经典通路，作为对抗染色体不稳定肿瘤细胞的治疗工具并诱导细胞内在细胞毒性通路。
45)一种方法，其包含向将一种或多种STING激动剂给予受试者以恢复和/或激活胞质DNA传感下游的经典通路，作为对抗染色体不稳定肿瘤细胞的治疗工具并诱导细胞内在细胞毒性通路。
46)根据声明43或44所述的方法，其使肿瘤细胞对免疫疗法敏感。
47)一种组合物，其包含载体和驱动蛋白-13蛋白，所述驱动蛋白-13蛋白与SEQ IDNO:1、3或5中任一个具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性。
48)一种组合物，其包含载体和驱动蛋白-13蛋白，所述驱动蛋白-13核酸包含与SEQ ID NO:2、4或6中任一个具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％序列同一性的序列。
49)根据声明46或47所述的组合物，其进一步包含MCAK蛋白或MCAK核酸，所述MCAK蛋白与SEQ ID NO:7具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性，所述MCAK核酸与SEQ ID NO:8具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性。
50)根据声明46、47或48所述的组合物，其包含至少一种STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1抑制性核酸。
51)根据声明46至48或49所述的组合物，其包含至少一种抑制性核酸，所述抑制性核酸与SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36中任一个具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性。
52)根据声明46至49或50所述的组合物，其包含至少一种抗体，所述抗体与STING、cGAS、NF-κB转录因子p52、NF-κB转录因子ReIB、ENPP1、LTβR、BAFFR、CD40、RANK、FN14、NIK(MAP3K14)或MST1蛋白亲和结合。
53)根据声明46至50或51所述的组合物，其包含至少一种抗体，所述抗体与同SEQID NO:9、11、13、15、17、19、21或23中的任一个具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％序列同一性的蛋白质亲和结合。
54)一种表达载体，其包含一种与编码驱动蛋白-13或MCAK蛋白的核酸片段可操作地连接的启动子，所述驱动蛋白-13或MCAK蛋白与SEQ ID NO:1、3、5或7中任一个具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性。
55)一种表达载体，其包含一种与抑制性核酸片段可操作地连接的启动子，所述抑制性核酸片段与SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36中任一个具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性或互补性。
56)一种方法，其包含：(a)将测试化合物与癌(或转移性癌)细胞在培养基中混合以产生测试分析物(test assay)；(b)在足以使所述测试化合物与所述细胞结合或穿透所述细胞的条件下将所述测试分析物温育一段时间；(c)测量所述培养基中、所述细胞中或其组合中cGAMP的量或浓度以产生测试分析物cGAMP值；以及(d)选择测试分析cGAMP值比参比cGAMP值低的测试化合物，从而产生有效的测试化合物。
57)根据声明55所述的方法，其中所述参比cGAMP值为不含测试化合物的分析混合物在所述培养基中、所述细胞中或其组合中cGAMP的量或浓度。
58)一种方法，其包含：(a)从患者获得细胞或组织样品；(b)测量由样品中已知数量或重量的细胞或组织产生的cGAMP的量或浓度，以得到参比cGAMP值；(c)将样品中相同已知数量或重量的细胞或组织与测试化合物混合以得到测试分析物；(d)测量所述测试分析物(在所述细胞培养基中或在所述细胞或组织中)中cGAMP的量或浓度以得到测试分析物cGAMP值；(e)任选地重复步骤(c)和(d)；以及选择测试分析物cGAMP值比参比cGAMP值低的测试化合物，从而鉴定有效的测试化合物。
59)根据声明55、56或57所述的方法，其中所述转移癌细胞或转移组织在培养基中混合以得到测试分析物。
60)根据声明55至57或58所述的方法，其在测量cGAMP之前进一步包含用醇(例如，甲醇、乙醇或异丙醇)提取细胞或组织样品以产生醇提取物。
61)根据声明59所述的方法，其进一步包含使用一个或多个HyperSep氨基丙基固相柱通过固相提取(SPE)纯化所述醇提取物以产生半纯测试样品，然后测量所述半纯测试样品的cGAMP。
62)根据声明59或60所述的方法，其在测量cGAMP之前还包含将cGAMp悬浮于乙腈、水或其组合中。
63)根据声明55至60或61所述的方法，其中测量cGAMP的量或浓度包含液相色谱分析和/或质谱分析以测量cGAMP的水平。
64)根据声明55至61或62所述的方法，其进一步包含将所受有效测试化合物给予动物模型，例如以进一步评估所述有效测试化合物的毒性和/或功效。
65)根据声明55至62或63所述的方法，其进一步包含将所述有效测试化合物给予患者或者从中获得所述细胞或组织样品的患者。
66)一种通过一种方法制备的有效测试化合物，所述方法包含：(a)将测试化合物与癌(或转移性癌)细胞在培养基中混合以产生测试分析物；(b)在足以使所述测试化合物影响所述细胞中cGAMP产生的条件下将所述测试分析物温育一段时间；(c)测量所述培养基中、所述细胞中或其组合中cGAMP的量或浓度以产生测试分析物cGAMP值；以及(d)选择测试分析物cGAMP值比参比cGAMP值低的测试化合物，从而产生有效的测试化合物。
67)根据声明65所产生的有效测试化合物，其中所述转移癌细胞或转移组织在所述培养基中混合以产生测试分析物。
68)根据声明65或66所产生的有效测试化合物，其中所述方法在测量cGAMP之前进一步包含用醇(例如，甲醇、乙醇或异丙醇)提取细胞以产生醇提取物。
69)根据声明65、66或67所产生的有效测试化合物，其中所述方法进一步包含用甲醇提取所述细胞或组织样品以产生甲醇提取物，并测量所述甲醇提取物中的cGAMP。
70)根据声明67或68所产生的有效测试化合物，其中所述方法进一步包含使用一个或多个HyperSep氨基丙基固相柱通过固相提取(SPE)纯化所述醇提取物或甲醇提取物以产生半纯测试样品，然后测量所述半纯测试样品的cGAMP。
71)根据声明65至68或69所产生的有效测试化合物，其中测量cGAMP的量或浓度包含液相色谱分析和/或质谱分析以测量cGAMP的水平。
72)根据声明65至69或70所产生的有效测试化合物，其中所述方法进一步包含将所述有效测试化合物给予动物模型，例如以进一步评估所述有效测试化合物的毒性和/或功效。
73)根据声明65至70或71所产生的有效测试化合物，其中所述方法还包含将所述有效测试化合物给予患者或从中获得所述细胞或组织样品的患者。
74)一种方法，其包含：(a)将测试化合物与KIF2B或MCAK在含有2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核苷(MESG)的测试分析物混合物中混合；(b)将所述测试分析物混合物温育以产生温育的测试分析物；(c)测量无机磷酸盐的量以提供无机磷酸盐测试结果；以及(d)将所述无机磷酸盐测试结果与对照或参比进行对比。
75)根据声明74所述的方法，其中所述对照为含有KIF2B或MCAK和2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核苷(MESG)但不含所述测试化合物的对照分析物(control assay)中存在的无机磷酸盐(Pi)的量。
76)根据声明74所述的方法，其中所述参比为含有KIF2B或MCAK和2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核苷(MESG)但不含所述测试化合物的两种或更多种对照分析物中存在的无机磷酸盐(Pi)的平均量。
77)根据声明74、75或76所述的方法，其进一步包含选择无机磷酸盐测试结果高于对照或参比的测试化合物。
78)根据声明74至76或77所述的方法，其进一步包含选择无机磷酸盐测试结果高于对照或参比的测试化合物，并在第二测定中评估所述测试化合物以评估作为KIF2B或MCAK活化剂的测试化合物。
79)一种方法，其包含：(a)将测试化合物与具有γ-微管蛋白标记的中心体的癌细胞混合以产生测试分析物；(b)在足以使所述测试化合物穿透所述癌细胞的条件下将所述测试分析物温育一段时间以产生温育的测试癌细胞；(c)测量一系列温育的测试癌细胞内γ-微管蛋白标记的中心体之间的距离以产生平均距离结果；以及(d)将所述平均距离结果与对照或参比进行对比。
80)根据声明79所述的方法，其中所述距离通过荧光原位杂交(FISH)测量。
81)根据声明79或80所述的方法，其中所述对照为不含所述测试化合物的对照分析物的癌细胞中γ-微管蛋白标记的中心体之间的距离。
82)根据声明79或80所述的方法，其中所述参比为不含所述测试化合物的对照分析物中一系列γ-微管蛋白标记的癌细胞内的γ-微管蛋白标记的中心体之间的平均距离。
83)根据声明79、80或81所述的方法，其进一步包含选择平均距离结果比对照或参比低的测试化合物。
84)根据声明74至76或77所述的方法，其进一步包含选择平均距离结果比对照或参比低的测试化合物，并在第二测定中评估所述测试化合物以评估作为MCAK活化剂的测试化合物。
85)一种方法，其包含(a)将NF-kB诱导激酶与测试化合物、ATP和抗体以及与所述抗体结合的荧光示踪剂(633nm)混合，其中所述抗体特异性识别ADP；(b)将所述测试分析物混合物温育以产生温育的测试分析物；(c)测量所述温育的测试分析物中的荧光量；以及(d)将所述温育的测试分析物中的荧光量与对照或参比进行对比。
86)根据声明85所述的方法，其中所述对照为不含所述测试化合物的对照分析物中的荧光量。
87)根据声明85所述的方法，其中所述参比为一系列不含测试化合物的对照分析物中的平均荧光量。
88)根据声明85、86或87的方法，其进一步包含选择在一个或多个温育的测试分析物中具有比对照或参比更高荧光量的测试化合物。
89)根据声明85至87或88所述的方法，其进一步包含选择在一个或多个温育的测试分析物中具有比对照或参比更高荧光量的测试化合物，并在第二测定中评估所述测试化合物以评估作为NF-kB诱导激酶抑制剂的所述测试化合物。
90)一种方法，其包含：(a)将癌细胞与测试化合物和抗淋巴毒素β受体(LT-βR)抗体混合；(b)在足以使所述测试化合物穿透所述癌细胞的条件下将所述测试分析物温育一段时间以产生温育的测试癌细胞；(c)测量REIB易位到所述温育的测试癌细胞的细胞核中的量；以及(d)将REIB易位到所述温育的测试癌细胞的细胞核中的所述量与对照或参比进行对比。
91)根据声明90所述的方法，其中测量REIB易位到所述温育的测试癌细胞的细胞核中的量进一步包含获得细胞核与细胞质信号强度的比率。
92)根据声明90或91所述的方法，其中所述对照为不含所述测试化合物的对照分析物中REIB易位到细胞核中的量。
93)根据声明90或91所述的方法，其中所述参比为不含所述测试化合物的一系列对照分析物中REIB易位到细胞核中的平均量。
94)根据声明90至92或93所述的方法，其进一步包含所述温育的测试癌细胞中REIB易位到细胞核中的量比对照或参比低的测试化合物。
95)根据声明85至87或88所述的方法，其进一步包含选择REIB易位到所述温育的测试癌细胞的细胞核中的量比对照或参比低的测试化合物，并在第二测定中评估所述测试化合物以评估作为NF-kB诱导激酶抑制剂的所述测试化合物。
96)一种通过声明74至94或95所述的方法产生的有效测试化合物。
97)根据声明96所述的有效测试化合物，其中所述方法还包含将所述有效测试化合物给予动物模型，例如以进一步评估所述有效测试化合物的毒性和/或功效。
98)根据声明96或97所述的有效测试化合物，其中所述方法还包含将所述有效测试化合物给予患者或从中获得所述癌细胞的患者。
本文所述的具体方法和组合物是优选实施例的代表，并且是示例性的，并不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员在考虑本说明书后将想到其它目的、方面和实施例，并且这些目的、方面和实施例包括在由权利要求书的范围所限定的本发明的精神内。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的本发明进行各种替换和修改。
本文示例性描述的本发明可适当地在不存在本文未具体公开为必要的任何一个或多个要素，或一个或多个限定的情况下实施。本文说明性描述的方法和过程可适当地以不同的步骤顺序来实践，并且方法和过程不必限于本文或权利要求书中指示的步骤顺序。
如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一种”和“所述”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“核酸”或“表达盒”或“细胞”包括多个这样的核酸、表达载体或细胞(例如，核酸或表达盒的溶液或干燥制剂，或细胞群)，依此类推。在本文中，除非另有说明，术语“或”用于指非排他性的或使得“A或B”包括“A但不包括B”，“B但不包括A”和“A和B”。
在任何情况下，本专利都不能解释为限于本文具体公开的具体实例或实施例或方法。在任何情况下，本专利都不应被解释为受到任何审查员或专利商标局的任何其他官员或雇员作出的任何声明的限制，除非所述声明是明确的，并且没有条件或保留被申请人明确采用在答复性书面文件中。
已经使用的术语和表达被用作描述性术语而非限制性术语，并且在使用这些术语和表达时无意排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施例和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的概念进行修改和变化，并且这些修改和变化被认为在由所附权利要求和本发明的声明所限定的本发明的范围内。
本发明在此已被广泛地和一般性地描述。落入一般公开内容内的每个较窄种类和亚类分组也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述，附带条件或否定限制为从所述属中除去任何主题，无论所除去的材料是否在本文中具体列举。此外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此也根据马库什组的任何单个成员或成员子组描述本发明。
序列表
<110> L·C·坎特利
B·恩格
S·F·巴库姆
康奈尔大学
<120> 靶向染色体不稳定性和下游胞质DNA信号传导以治疗癌症
<130> 1676.125WO1
<150> US 62/530,661
<151> 2017-07-10
<160> 61
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
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1490 1495 1500
Ile Val Pro Ser Gly Ser Asn Gly Ser Ser Met Pro Val Glu His Asn
1505 1510 1515 1520
Ser Lys Arg Glu Lys Lys Ile Asp Ser Glu Glu Glu Glu Asn Glu Leu
1525 1530 1535
Glu Ala Ile Asn Arg Lys Leu Ile Ser Ser Gln Pro Tyr Val Pro Val
1540 1545 1550
Glu Phe Ala Asp Phe Ser Val Tyr Asn Ala Ser Leu Glu Asn Arg Glu
1555 1560 1565
Trp Phe Ser Ser Lys Val Asp Leu Ser Asn Ser Arg Val Leu Glu Lys
1570 1575 1580
Glu Val Ser Arg Ser Pro Thr Thr Ser Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Phe
1585 1590 1595 1600
Ser His Ser Ala Ser Asn Ala Thr Leu Ser Asp Met Val Val Pro Ser
1605 1610 1615
Ser Asp Ser Ser Asp Gln Leu Ala Ile Gln Thr Lys Asp Ala Asp Ser
1620 1625 1630
Thr Glu His Ser Thr Pro Ser Leu Val His Asp Phe Arg Pro Ser Ser
1635 1640 1645
Asn Lys Glu Leu Thr Glu Val Glu Lys Gly Leu Val Lys Asp Lys Ile
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Ile Val Val Pro Leu Lys Glu Asn Ser Ala Leu Ala Lys Gly Ser Pro
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Ser Ser Gln Ser Ile Pro Glu Lys Asn Ser Lys Ser Leu Cys Arg Thr
1685 1690 1695
Gly Ser Cys Ser Glu Leu Asp Ala Cys Pro Ser Lys Ile Ser Gln Pro
1700 1705 1710
Ala Arg Gly Phe Cys Pro Arg Glu Val Thr Val Glu His Thr Thr Asn
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Ile Leu Glu Asp His Ser Phe Thr Glu Phe Met Gly Val Ser Glu Gly
1730 1735 1740
Lys Asp Phe Asp Gly Leu Thr Asp Ser Ser Ala Gly Glu Leu Ser Ser
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Arg Arg Ser Leu Pro Asn Lys Thr Gly Gly Lys Thr Val Ser Asp Gly
1765 1770 1775
Leu His His Pro Ser Gln Leu His Ser Lys Leu Glu Asn Asp Gln Val
1780 1785 1790
Ile Ile Pro Glu Ala Ala Phe Trp Val Leu Cys Cys Gln
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<210> 6
<211> 6005
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
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gcgctcgagg ggcgcgcggc tgcagcggcg gcggcgccgc gcgtgagggg ccgcctaagg 120
ccgagcgggc gcggcgagcg gccgggcgag cgcagccaac atgtcggata ccaaggtaaa 180
agttgccgtc cgggtccggc ccatgaaccg acgagaactg gaactgaaca ccaagtgcgt 240
ggtggagatg gaagggaatc aaacggtcct gcaccctcct ccttctaaca ccaaacaggg 300
agaaaggaaa cctcccaagg tatttgcctt tgattattgc ttttggtcca tggatgaatc 360
taacactaca aaatacgctg gtcaagaagt ggttttcaag tgccttgggg aaggaattct 420
tgaaaaagcc tttcaggggt ataatgcgtg tatttttgca tatggacaga caggttcggg 480
aaaatccttt tccatgatgg gccatgctga gcagctgggc cttattccaa ggctctgctg 540
tgctttattt aaaaggatct ctttggagca aaatgagtca cagaccttta aagttgaagt 600
gtcctatatg gaaatttata atgagaaagt tcgggatctt ttagacccca aagggagtag 660
acagtctctt aaagttcgag aacataaagt tttgggacca tatgtagatg gtttatctca 720
actagctgtc actagttttg aggatattga gtcattgatg tctgagggaa ataagtctcg 780
aacggtagct gctaccaaca tgaacgaaga aagcagccgc tcccatgctg tgttcaacat 840
cataatcaca cagacacttt atgacctgca gtctgggaat tccggggaga aagtcagtaa 900
ggtcagcttg gtagacctgg cgggtagcga aagagtatct aaaacaggag ctgcaggaga 960
gcgactgaaa gaaggcagca acattaacaa atcgcttaca accttggggt tggttatatc 1020
atcactggct gaccaggcag ctggcaaggg taaaagcaaa tttgtgcctt atcgagattc 1080
agtcctcact tggctgctta aggacaactt ggggggcaac agccaaacct ctatgatagc 1140
cacaatcagc ccagccgcag acaactatga agagaccctc tccacattaa gatatgcaga 1200
ccgagccaaa aggattgtga accatgctgt tgtgaatgag gaccccaacg caaaagtgat 1260
ccgagaactg cgggaggaag tcgagaaact gagagagcag ctctctcagg cagaggccat 1320
gaaggcccct gaactgaagg agaagctcga agagtctgaa aagctgataa aagaactaac 1380
agtgacttgg gaagagaagc tgagaaaaac agaagagata gcacaggaaa gacaacgaca 1440
acttgaaagc atggggattt ccctggagat gtccggtatc aaggtggggg atgacaaatg 1500
ctacttagtc aatctgaatg cagaccctgc tcttaacgaa cttctggttt attatttaaa 1560
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tcagcctcag cactgtgaga ttgacattgc atctgatgga gacgtcactc tcactccaaa 1680
agaaaatgca aggtcctgtg tgaacggcac ccttgtgtgc agtaccaccc agctgtggca 1740
tggtgaccga atcctatggg gaaataatca cttttttaga ataaacttac ctaagaggaa 1800
acgtcgagat tggttgaaag actttgaaaa agaaacgggc ccgccagagc atgacctgga 1860
tgcagccagt gaggcttcct ctgaaccaga ctataactat gaatttgcac agatggaagt 1920
tatcatgaaa accctgaata gtaatgaccc agttcaaaat gtggttcagg tcctggagaa 1980
acaataccta gaagaaaaga gaagtgccct agaggagcag cggctcatgt atgagcggga 2040
actggagcaa ctccgccagc agctctcccc cgacaggcag ccacagagta gcggccctga 2100
ccgcctggcc tacagcagcc agacagcgca gcagaaggtg acccagtggg cagaagagag 2160
ggatgaactc ttccgacaaa gcctggcaaa actgcgagag cagctggtta aagctaatac 2220
cttggtgagg gaagcaaact tcctggctga ggaaatgagc aaactcaccg attaccaagt 2280
gactcttcag atccctgctg caaacctcag tgccaatagg aagagaggtg caatagtgag 2340
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gctggagaat aaattaattg acatgagaga cctttaccaa gaatggaagg aaaaagttcc 2460
tgaggcaaag agactctacg gaaaacgagg tgaccctttc tatgaagccc aagaaaatca 2520
caacctcatc ggggtggcga atgtattctt ggaatgcctc ttctgtgatg tgaaacttca 2580
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gatgcgtgtt acaggagctg ttccagagcg tgtggtggag gatgactctt cggagaattc 2700
cagtgaaagt gggagccttg aagtcgtaga cagcagcggg gaaatcattc accgagtcaa 2760
aaagctgaca tgtcgggtaa aaattaaaga agcaacgggg ctgcccttaa acctctcaaa 2820
ttttgtcttc tgtcaataca cattctggga ccagtgtgag tctacggtgg ctgccccggt 2880
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ggaacttcat caggcaaaag atgtcaacac aggaggcatc tttcaactta gacagggtca 3240
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<213> 智人
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Met Ala Met Asp Ser Ser Leu Gln Ala Arg Leu Phe Pro Gly Leu Ala
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Gly Ala Thr Lys Gly Lys Glu Ile Asp Phe Asp Asp Val Ala Ala Ile
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Pro Leu Gln Glu Asn Val Thr Ile Gln Lys Gln Lys Arg Arg Ser Val
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Asn Ser Lys Ile Pro Ala Pro Lys Glu Ser Leu Arg Ser Arg Ser Thr
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Arg Met Ser Thr Val Ser Glu Leu Arg Ile Thr Ala Gln Glu Asn Asp
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Met Glu Val Glu Leu Pro Ala Ala Ala Asn Ser Arg Lys Gln Phe Ser
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Val Pro Pro Ala Pro Thr Arg Pro Ser Cys Pro Ala Val Ala Glu Ile
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Pro Leu Arg Met Val Ser Glu Glu Met Glu Glu Gln Val His Ser Ile
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Arg Gly Ser Ser Ser Ala Asn Pro Val Asn Ser Val Arg Arg Lys Ser
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Cys Leu Val Lys Glu Val Glu Lys Met Lys Asn Lys Arg Glu Glu Lys
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His Arg Ile Cys Val Cys Val Arg Lys Arg Pro Leu Asn Lys Gln Glu
260 265 270
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Gly Lys Thr His Thr Met Gly Gly Asp Leu Ser Gly Lys Ala Gln Asn
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Phe Phe Glu Ile Tyr Asn Gly Lys Leu Phe Asp Leu Leu Asn Lys Lys
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Ala Lys Leu Arg Val Leu Glu Asp Gly Lys Gln Gln Val Gln Val Val
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Lys Gly Arg Met His Gly Lys Phe Ser Leu Val Asp Leu Ala Gly Asn
485 490 495
Glu Arg Gly Ala Asp Thr Ser Ser Ala Asp Arg Gln Thr Arg Met Glu
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<213> 智人
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Arg Ile Gln Thr Phe Leu Leu Leu Asp Glu Ile Ser Gln Arg Asn Arg
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Gln Leu Pro Ser Asp Gly Lys Lys Met Val His Val Gln Asp Phe Thr
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Ala Phe Trp Asp Lys Ala Ser Glu Thr Pro Thr Leu Gln Gly Leu Ser
420 425 430
Phe Thr Val Arg Pro Gly Glu Leu Leu Ala Val Val Gly Pro Val Gly
435 440 445
Ala Gly Lys Ser Ser Leu Leu Ser Ala Val Leu Gly Glu Leu Ala Pro
450 455 460
Ser His Gly Leu Val Ser Val His Gly Arg Ile Ala Tyr Val Ser Gln
465 470 475 480
Gln Pro Trp Val Phe Ser Gly Thr Leu Arg Ser Asn Ile Leu Phe Gly
485 490 495
Lys Lys Tyr Glu Lys Glu Arg Tyr Glu Lys Val Ile Lys Ala Cys Ala
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Leu Lys Lys Asp Leu Gln Leu Leu Glu Asp Gly Asp Leu Thr Val Ile
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Gly Asp Arg Gly Thr Thr Leu Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Val Asn
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Leu Ala Arg Ala Val Tyr Gln Asp Ala Asp Ile Tyr Leu Leu Asp Asp
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Pro Leu Ser Ala Val Asp Ala Glu Val Ser Arg His Leu Phe Glu Leu
565 570 575
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Ile Asp Phe Gly Ser Leu Leu Lys Lys Asp Asn Glu Glu Ser Glu Gln
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Leu Val Phe Tyr Val Leu Val Asn Ser Ser Gln Thr Leu His Asn Lys
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Val Val Glu Lys Lys Leu Phe Ile His Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Tyr
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Met Arg Met Leu Pro Ser Ile Ile Phe Thr Cys Ile Val Tyr Phe Met
485 490 495
Leu Gly Leu Lys Ala Lys Ala Asp Ala Phe Phe Val Met Met Phe Thr
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Leu Met Met Val Ala Tyr Ser Ala Ser Ser Met Ala Leu Ala Ile Ala
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325 330 335
Gly Leu Arg Ile Gln Asn Trp Leu Ser Ala Lys Val Arg Lys Gln Leu
340 345 350
Arg Leu Lys Pro Phe Tyr Leu Val Pro Lys His Ala Lys Glu Gly Asn
355 360 365
Gly Phe Gln Glu Glu Thr Trp Arg Leu Ser Phe Ser His Ile Glu Lys
370 375 380
Glu Ile Leu Asn Asn His Gly Lys Ser Lys Thr Cys Cys Glu Asn Lys
385 390 395 400
Glu Glu Lys Cys Cys Arg Lys Asp Cys Leu Lys Leu Met Lys Tyr Leu
405 410 415
Leu Glu Gln Leu Lys Glu Arg Phe Lys Asp Lys Lys His Leu Asp Lys
420 425 430
Phe Ser Ser Tyr His Val Lys Thr Ala Phe Phe His Val Cys Thr Gln
435 440 445
Asn Pro Gln Asp Ser Gln Trp Asp Arg Lys Asp Leu Gly Leu Cys Phe
450 455 460
Asp Asn Cys Val Thr Tyr Phe Leu Gln Cys Leu Arg Thr Glu Lys Leu
465 470 475 480
Glu Asn Tyr Phe Ile Pro Glu Phe Asn Leu Phe Ser Ser Asn Leu Ile
485 490 495
Asp Lys Arg Ser Lys Glu Phe Leu Thr Lys Gln Ile Glu Tyr Glu Arg
500 505 510
Asn Asn Glu Phe Pro Val Phe Asp Glu Phe
515 520
<210> 16
<211> 1802
<212> DNA
<213> 智人
<400> 16
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caacagctgc tgctggctct tcctcttgcg gccttttcct gaaacggatt cttctttcgg 120
ggaacagaaa gcgccagcca tgcagccttg gcacggaaag gccatgcaga gagcttccga 180
ggccggagcc actgccccca aggcttccgc acggaatgcc aggggcgccc cgatggatcc 240
caccgagtct ccggctgccc ccgaggccgc cctgcctaag gcgggaaagt tcggccccgc 300
caggaagtcg ggatcccggc agaaaaagag cgccccggac acccaggaga ggccgcccgt 360
ccgcgcaact ggggcccgcg ccaaaaaggc ccctcagcgc gcccaggaca cgcagccgtc 420
tgacgccacc agcgcccctg gggcagaggg gctggagcct cctgcggctc gggagccggc 480
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tccgcccggg ccctgggacg tgcccagccc cggcctgccg gtctcggccc ccattctcgt 600
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gctcagactg aagtgcgact ccgcgttcag aggcgtcggg ctgctgaaca ccgggagcta 780
ctatgagcac gtgaagattt ctgcacctaa tgaatttgat gtcatgttta aactggaagt 840
ccccagaatt caactagaag aatattccaa cactcgtgca tattactttg tgaaatttaa 900
aagaaatccg aaagaaaatc ctctgagtca gtttttagaa ggtgaaatat tatcagcttc 960
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aaaaatatct gtggatataa ccctggcttt ggaatcaaaa agtagctggc ctgctagcac 1140
ccaagaaggc ctgcgcattc aaaactggct ttcagcaaaa gttaggaagc aactacgact 1200
aaagccattt taccttgtac ccaagcatgc aaaggaagga aatggtttcc aagaagaaac 1260
atggcggcta tccttctctc acatcgaaaa ggaaattttg aacaatcatg gaaaatctaa 1320
aacgtgctgt gaaaacaaag aagagaaatg ttgcaggaaa gattgtttaa aactaatgaa 1380
atacctttta gaacagctga aagaaaggtt taaagacaaa aaacatctgg ataaattctc 1440
ttcttatcat gtgaaaactg ccttctttca cgtatgtacc cagaaccctc aagacagtca 1500
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cctcaggaca gaaaaacttg agaattattt tattcctgaa ttcaatctat tctctagcaa 1620
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ac 1802
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Met Glu Ser Cys Tyr Asn Pro Gly Leu Asp Gly Ile Ile Glu Tyr Asp
1 5 10 15
Asp Phe Lys Leu Asn Ser Ser Ile Val Glu Pro Lys Glu Pro Ala Pro
20 25 30
Glu Thr Ala Asp Gly Pro Tyr Leu Val Ile Val Glu Gln Pro Lys Gln
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Arg Gly Phe Arg Phe Arg Tyr Gly Cys Glu Gly Pro Ser His Gly Gly
50 55 60
Leu Pro Gly Ala Ser Ser Glu Lys Gly Arg Lys Thr Tyr Pro Thr Val
65 70 75 80
Lys Ile Cys Asn Tyr Glu Gly Pro Ala Lys Ile Glu Val Asp Leu Val
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Thr His Ser Asp Pro Pro Arg Ala His Ala His Ser Leu Val Gly Lys
100 105 110
Gln Cys Ser Glu Leu Gly Ile Cys Ala Val Ser Val Gly Pro Lys Asp
115 120 125
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Asn Met Met Gly Thr Met Ile Gln Lys Leu Gln Arg Gln Arg Leu Arg
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Ser Arg Pro Gln Gly Leu Thr Glu Ala Glu Gln Arg Glu Leu Glu Gln
165 170 175
Glu Ala Lys Glu Leu Lys Lys Val Met Asp Leu Ser Ile Val Arg Leu
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Arg Phe Ser Ala Phe Leu Arg Ala Ser Asp Gly Ser Phe Ser Leu Pro
195 200 205
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210 215 220
Ala Ser Asn Leu Lys Ile Ser Arg Met Asp Lys Thr Ala Gly Ser Val
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Arg Gly Gly Asp Glu Val Tyr Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Asp
245 250 255
Asp Ile Glu Val Arg Phe Tyr Glu Asp Asp Glu Asn Gly Trp Gln Ala
260 265 270
Phe Gly Asp Phe Ser Pro Thr Asp Val His Lys Gln Tyr Ala Ile Val
275 280 285
Phe Arg Thr Pro Pro Tyr His Lys Met Lys Ile Glu Arg Pro Val Thr
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Val Phe Leu Gln Leu Lys Arg Lys Arg Gly Gly Asp Val Ser Asp Ser
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Lys Gln Phe Thr Tyr Tyr Pro Leu Val Glu Asp Lys Glu Glu Val Gln
325 330 335
Arg Lys Arg Arg Lys Ala Leu Pro Thr Phe Ser Gln Pro Phe Gly Gly
340 345 350
Gly Ser His Met Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ala Gly Gly Tyr Gly
355 360 365
Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gly Phe Phe Pro Ser Ser Leu Ala
370 375 380
Tyr Ser Pro Tyr Gln Ser Gly Ala Gly Pro Met Gly Cys Tyr Pro Gly
385 390 395 400
Gly Gly Gly Gly Ala Gln Met Ala Ala Thr Val Pro Ser Arg Asp Ser
405 410 415
Gly Glu Glu Ala Ala Glu Pro Ser Ala Pro Ser Arg Thr Pro Gln Cys
420 425 430
Glu Pro Gln Ala Pro Glu Met Leu Gln Arg Ala Arg Glu Tyr Asn Ala
435 440 445
Arg Leu Phe Gly Leu Ala Gln Arg Ser Ala Arg Ala Leu Leu Asp Tyr
450 455 460
Gly Val Thr Ala Asp Ala Arg Ala Leu Leu Ala Gly Gln Arg His Leu
465 470 475 480
Leu Thr Ala Gln Asp Glu Asn Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ile
485 490 495
Ile His Gly Gln Thr Ser Val Ile Glu Gln Ile Val Tyr Val Ile His
500 505 510
His Ala Gln Asp Leu Gly Val Val Asn Leu Thr Asn His Leu His Gln
515 520 525
Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Gly Gln Thr Ser Val Val Ser
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Phe Leu Leu Arg Val Gly Ala Asp Pro Ala Leu Leu Asp Arg His Gly
545 550 555 560
Asp Ser Ala Met His Leu Ala Leu Arg Ala Gly Ala Gly Ala Pro Glu
565 570 575
Leu Leu Arg Ala Leu Leu Gln Ser Gly Ala Pro Ala Val Pro Gln Leu
580 585 590
Leu His Met Pro Asp Phe Glu Gly Leu Tyr Pro Val His Leu Ala Val
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Arg Ala Arg Ser Pro Glu Cys Leu Asp Leu Leu Val Asp Ser Gly Ala
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900
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 18
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tccggccccg cctccccttg gtattttcgg gactttccta agctgctcta actttcctgc 120
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ggcttccgat ttcgatatgg ctgtgaaggc ccctcccatg gaggactgcc cggtgcctcc 480
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atgatacaaa aacttcagag gcagcggctc cgctctaggc cccagggcct tacggaggcc 780
gagcagcggg agctggagca agaggccaaa gaactgaaga aggtgatgga tctgagtata 840
gtgcggctgc gcttctctgc cttccttaga gccagtgatg gctccttctc cctgcccctg 900
aagccagtca tctcccagcc catccatgac agcaaatctc cgggggcatc aaacctgaag 960
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tgtgacaagg tgcagaaaga tgacattgag gttcggttct atgaggatga tgagaatgga 1080
tggcaggcct ttggggactt ctctcccaca gatgtgcata aacagtatgc cattgtgttc 1140
cggacacccc cctatcacaa gatgaagatt gagcggcctg taacagtgtt tctgcaactg 1200
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gaagacaagg aagaggtgca gcggaagcgg aggaaggcct tgcccacctt ctcccagccc 1320
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gctggtgctg acatccatgc tgaaaacgag gagcccctgt gcccactgcc ttcaccccct 2400
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cttatggca 3129
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
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Gly Ala Leu Gly Ser Pro Asp Leu Ser Ser Leu Ser Leu Ala Val Ser
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Arg Leu Val Ser Arg Gly Ala Ala Ser Leu Ser Thr Val Thr Leu Gly
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Pro Val Ala Pro Pro Ala Thr Pro Pro Pro Trp Gly Cys Pro Leu Gly
100 105 110
Arg Leu Val Ser Pro Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro His Leu Val
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Ile Thr Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Met Arg Phe Arg Tyr Glu Cys
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Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Leu Gly Glu Ser Ser Thr Glu Ala
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Ser Lys Thr Leu Pro Ala Ile Glu Leu Arg Asp Cys Gly Gly Leu Arg
165 170 175
Glu Val Glu Val Thr Ala Cys Leu Val Trp Lys Asp Trp Pro His Arg
180 185 190
Val His Pro His Ser Leu Val Gly Lys Asp Cys Thr Asp Gly Ile Cys
195 200 205
Arg Val Arg Leu Arg Pro His Val Ser Pro Arg His Ser Phe Asn Asn
210 215 220
Leu Gly Ile Gln Cys Val Arg Lys Lys Glu Ile Glu Ala Ala Ile Glu
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Arg Lys Ile Gln Leu Gly Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Gly Ser Leu Lys
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Asn His Gln Glu Val Asp Met Asn Val Val Arg Ile Cys Phe Gln Ala
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Ser Tyr Arg Asp Gln Gln Gly Gln Met Arg Arg Met Asp Pro Val Leu
275 280 285
Ser Glu Pro Val Tyr Asp Lys Lys Ser Thr Asn Thr Ser Glu Leu Arg
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Ile Cys Arg Ile Asn Lys Glu Ser Gly Pro Cys Thr Gly Gly Glu Glu
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Leu Tyr Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Glu Asp Ile Ser Val Val
325 330 335
Phe Ser Arg Ala Ser Trp Glu Gly Arg Ala Asp Phe Ser Gln Ala Asp
340 345 350
Val His Arg Gln Ile Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Pro Tyr Glu Asp
355 360 365
Leu Glu Ile Val Glu Pro Val Thr Val Asn Val Phe Leu Gln Arg Leu
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385 390 395 400
Asp His Asp Ser Tyr Gly Val Asp Lys Lys Arg Lys Arg Gly Met Pro
405 410 415
Asp Val Leu Gly Glu Leu Asn Ser Ser Asp Pro His Gly Ile Glu Ser
420 425 430
Lys Arg Arg Lys Lys Lys Pro Ala Ile Leu Asp His Phe Leu Pro Asn
435 440 445
His Gly Ser Gly Pro Phe Leu Pro Pro Ser Ala Leu Leu Pro Asp Pro
450 455 460
Asp Phe Phe Ser Gly Thr Val Ser Leu Pro Gly Leu Glu Pro Pro Gly
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Gly Pro Asp Leu Leu Asp Asp Gly Phe Ala Tyr Asp Pro Thr Ala Pro
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Thr Leu Phe Thr Met Leu Asp Leu Leu Pro Pro Ala Pro Pro His Ala
500 505 510
Ser Ala Val Val Cys Ser Gly Gly Ala Gly Ala Val Val Gly Glu Thr
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Gly Asp Gly Gly Thr Ala Ser Leu Val Gly Ser Asn Met Phe Pro Asn
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Glu Ala Thr
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<212> DNA
<213> 智人
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aaaaaaaaaa aaaaaaa 2297
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Glu Arg Asp Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly Glu Gly
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Gly Arg Ala Pro Arg Glu Gly Pro Ala Gly Asn Gly Arg Asp Arg Gly
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100 105 110
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165 170 175
Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu
180 185 190
Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu
195 200 205
Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr
210 215 220
Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys
225 230 235 240
Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr
245 250 255
Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His
260 265 270
Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe
275 280 285
Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu
290 295 300
Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe
305 310 315 320
Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile
325 330 335
Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala
340 345 350
Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr
355 360 365
Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro
370 375 380
Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val
385 390 395 400
Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu
405 410 415
Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys
420 425 430
Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys
435 440 445
Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp
450 455 460
Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys
465 470 475 480
Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro
485 490 495
Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe
500 505 510
Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys
515 520 525
Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met
530 535 540
Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu
545 550 555 560
Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu
565 570 575
Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn
580 585 590
His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val
595 600 605
His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu
610 615 620
Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr
625 630 635 640
Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr
645 650 655
Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys
660 665 670
Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu
675 680 685
Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser
690 695 700
Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu
705 710 715 720
Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser
725 730 735
Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile
740 745 750
Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser
755 760 765
Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr
770 775 780
Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp
785 790 795 800
Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys
805 810 815
Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe
820 825 830
Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys
835 840 845
Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn
850 855 860
Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu
865 870 875 880
Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr
885 890 895
Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu
900 905 910
Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp
915 920 925
<210> 22
<211> 7442
<212> DNA
<213> 智人
<400> 22
ccggagcggc cggggccacg atggagcgcg acggctgcgc ggggggcggg agccgcggcg 60
gcgagggcgg gcgcgctccc cgggagggcc cggcggggaa cggccgcgat cggggccgca 120
gccacgctgc cgaggcgccc ggggacccgc aggcggccgc gtccttgctg gcccctatgg 180
acgtggggga ggagccgctg gagaaggcgg cgcgcgcccg cactgccaag gaccccaaca 240
cctataaagt actctcgctg gtattgtcag tatgtgtgtt aacaacaata cttggttgta 300
tatttgggtt gaaaccaagc tgtgccaaag aagttaaaag ttgcaaaggt cgctgtttcg 360
agagaacatt tgggaactgt cgctgtgatg ctgcctgtgt tgagcttgga aactgctgtt 420
tagattacca ggagacgtgc atagaaccag aacatatatg gacttgcaac aaattcaggt 480
gtggtgagaa aaggttgacc agaagcctct gtgcctgttc agatgactgc aaggacaagg 540
gcgactgctg catcaactac agttctgtgt gtcaaggtga gaaaagttgg gtagaagaac 600
catgtgagag cattaatgag ccacagtgcc cagcagggtt tgaaacgcct cctaccctct 660
tattttcttt ggatggattc agggcagaat atttacacac ttggggtgga cttcttcctg 720
ttattagcaa actaaaaaaa tgtggaacat atactaaaaa catgagaccg gtatatccaa 780
caaaaacttt ccccaatcac tacagcattg tcaccggatt gtatccagaa tctcatggca 840
taatcgacaa taaaatgtat gatcccaaaa tgaatgcttc cttttcactt aaaagtaaag 900
agaaatttaa tcctgagtgg tacaaaggag aaccaatttg ggtcacagct aagtatcaag 960
gcctcaagtc tggcacattt ttctggccag gatcagatgt ggaaattaac ggaattttcc 1020
cagacatcta taaaatgtat aatggttcag taccatttga agaaaggatt ttagctgttc 1080
ttcagtggct acagcttcct aaagatgaaa gaccacactt ttacactctg tatttagaag 1140
aaccagattc ttcaggtcat tcatatggac cagtcagcag tgaagtcatc aaagccttgc 1200
agagggttga tggtatggtt ggtatgctga tggatggtct gaaagagctg aacttgcaca 1260
gatgcctgaa cctcatcctt atttcagatc atggcatgga acaaggcagt tgtaagaaat 1320
acatatatct gaataaatat ttgggggatg ttaaaaatat taaagttatc tatggacctg 1380
cagctcgatt gagaccctct gatgtcccag ataaatacta ttcatttaac tatgaaggca 1440
ttgcccgaaa tctttcttgc cgggaaccaa accagcactt caaaccttac ctgaaacatt 1500
tcttacctaa gcgtttgcac tttgctaaga gtgatagaat tgagcccttg acattctatt 1560
tggaccctca gtggcaactt gcattgaatc cctcagaaag gaaatattgt ggaagtggat 1620
ttcatggctc tgacaatgta ttttcaaata tgcaagccct ctttgttggc tatggacctg 1680
gattcaagca tggcattgag gctgacacct ttgaaaacat tgaagtctat aacttaatgt 1740
gtgatttact gaatttgaca ccggctccta ataacggaac tcatggaagt cttaaccacc 1800
ttctaaagaa tcctgtttat acgccaaagc atcccaaaga agtgcacccc ctggtacagt 1860
gccccttcac aagaaacccc agagataacc ttggctgctc atgtaaccct tcgattttgc 1920
cgattgagga ttttcaaaca cagttcaatc tgactgtggc agaagagaag attattaagc 1980
atgaaacttt accctatgga agacctagag ttctccagaa ggaaaacacc atctgtcttc 2040
tttcccagca ccagtttatg agtggataca gccaagacat cttaatgccc ctttggacat 2100
cctataccgt ggacagaaat gacagtttct ctacggaaga cttctccaac tgtctgtacc 2160
aggactttag aattcctctt agtcctgtcc ataaatgttc attttataaa aataacacca 2220
aagtgagtta cgggttcctc tccccaccac aactaaataa aaattcaagt ggaatatatt 2280
ctgaagcttt gcttactaca aatatagtgc caatgtacca gagttttcaa gttatatggc 2340
gctactttca tgacacccta ctgcgaaagt atgctgaaga aagaaatggt gtcaatgtcg 2400
tcagtggtcc tgtgtttgac tttgattatg atggacgttg tgattcctta gagaatctga 2460
ggcaaaaaag aagagtcatc cgtaaccaag aaattttgat tccaactcac ttctttattg 2520
tgctaacaag ctgtaaagat acatctcaga cgcctttgca ctgtgaaaac ctagacacct 2580
tagctttcat tttgcctcac aggactgata acagcgagag ctgtgtgcat gggaagcatg 2640
actcctcatg ggttgaagaa ttgttaatgt tacacagagc acggatcaca gatgttgagc 2700
acatcactgg actcagcttc tatcaacaaa gaaaagagcc agtttcagac attttaaagt 2760
tgaaaacaca tttgccaacc tttagccaag aagactgata tgttttttat ccccaaacac 2820
catgaatctt tttgagagaa ccttatattt tatatagtcc tctagctaca ctattgcatt 2880
gttcagaaac tgtcgaccag agttagaacg gagccctcgg tgatgcggac atctcaggga 2940
aacttgcgta ctcagcacag cagtggagag tgttcctgtt gaatcttgca catatttgaa 3000
tgtgtaagca ttgtatacat tgatcaagtt cgggggaata aagacagacc acacctaaaa 3060
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ttgaatcttt cttactattg gtaataaacc ttgatggcat tgggcaaaca gtagacttat 3180
agtagggttg gggtagccca tgttatgtga ctatctttat gagaatttta aagtggttct 3240
ggatatcttt taacttggag tttcatttct tttcattgta atcaaaaaaa aaattaacag 3300
aagccaaaat acttctgaga ccttgtttca atctttgctg tatatcccct caaaatccaa 3360
gttattaatc ttatgtgttt tctttttaat tttttgattg gatttcttta gatttaatgg 3420
ttcaaatgag ttcaactttg agggacgatc tttgaatata cttacctatt ataaaatctt 3480
actttgtatt tgtatttaaa aaagaaaaat attcctatcc tgctcactgg taattaacat 3540
aggtttaaaa tggcttcaaa tgtggcccta tagacggtta aaattgtacc ttatcttggc 3600
aaaacttcag agcaccagtc agtgcatgca aggtgccatt ttttattgag atgcttagaa 3660
tgtttctttc tgtgcacaag acttacccta ccagcagcag agccattctc tgttgagtgg 3720
ttcattttga agttccacag attgaagaga acatgccacc aatcacctca catcttcttg 3780
gtggacatga taaatgacac aatgaacttg atttctttac taccttgact gtagcttttt 3840
atccctacct gtgaaccttc aaagactgca ttaactttta ggctacatag gtccaattga 3900
ggtataatat cagtacacca aagattttta tatgtccttc gtgtgaccat tcttcaacgg 3960
cctaagggcc agctgcaaag acttttggaa aatacaattt acaactcaaa attatttaat 4020
aatttaggaa gttgcttttt tttttttttt ttttcagtcc tgcagtttcc tgaagctctg 4080
tatatgatat ttttttcagc ctgcttctct ctgttgttca gattaggtaa ttttattctt 4140
ctgtctcgaa gctcactgat tctttattct gtctaatctg ttctgctgtt gagcccattt 4200
attcctgatt tttatatttt agttattgta tgttttattt ctaaaatttc cattcagttt 4260
ttctttatat cttctatttg ctgagaattt ctgtctcttt gctgagactt tctacgtttt 4320
catttgtttc aagtgcattt atacttgctt gttgaagaat ttttatgatg gctgctgtaa 4380
aatccttatc agataattcc aacatctgtc acctcattgt ttgcatctac tgatggtctt 4440
ttttccattc ggaaacattt tcctgtttct tggtgtgtgg aatgattttt tattgaaacc 4500
tggatatttt taggtattat gttatgagac tatgggtctt atttaaacct tctgctttag 4560
ccaactttct cagataccac cacagcaggg gaattgggag cactgcttca ttattaccag 4620
gtgtggctag gagtccaggt tccccagtca gcctcccttt atactgagta acagggtccc 4680
ctcattacta ctgggcaagg tgagaattca gtttcccatt aggtctttat tgattcttcc 4740
ctggctggaa tgtgcagcgg caccttttgg tgcaccctgg gaatctccac taatgctatg 4800
ggacagagtg accaggaaga gcttcattac accaggtggg aatgaaattc ccagtagcct 4860
acacagcctt ctccgacacc actctggagt tgtattcttc cagcacacaa acatacacaa 4920
tttaactcaa agcatcttag cagagcttaa ttaaatggat agatgcctgt tccctttgct 4980
ggataccaag aatacaaaag tcagggagtt ggggcacctc tttacagctt ggtgagagtg 5040
taagtctgga ctccccactc agcatttgct ggtatgggtg gggccatggt gtttttccat 5100
ggtgtttggt tggagtacag ccttttttac ccttgcttgg ctaccctttt ctggtccttt 5160
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aggttgctga ctttttcagc tccaagttgg aaatatatga gctgaaaaga aaatgtaggg 5280
aactcatcac agtgttgtta cttgggcccc aatgttccta gcctattttc tgtctactat 5340
tcagagtctt gctgtgtttt aatataatat ccaggatttt tatatgcatt tagcagaagg 5400
atgtctactc tgcctttgta gaagtgtctc actgattttt acatattttt ccagcacaca 5460
aacatacaca atttaactca aagcatctta gcagagctta attaaatgga tagatgtctg 5520
ttccctttgc tggacgccaa gaatacaaaa aagaacaagt gacaattttc tctgtcttag 5580
ggagaagaga cagcagaagt gtaaatgatc cctaaagagt gatagatgtt atcatgaagc 5640
cacaggaggg gtgccaggct gcacaaaaga gacactggat gcttcttggt agtagaggca 5700
gtggcttccc agccttgggg ctaaggcttg tagggtgaat tggaactttt cagatgagca 5760
aggcaaagaa gggaccttct aacattcctt ggatggaaca tttttgacat tttcccattt 5820
acagctactt atattttcta caagtgtcac tgtgaccaac ttatgtacac atactttttc 5880
ttgcttagtt ataataatct gttcttaaag aaaatgtcag tctctacatt ctatgctgac 5940
tgttaaggaa agagcaccca catctgctcc tacttagctt tttttctgtg gttcttacac 6000
agtattcctt tttttctttt cttgaaagag actcctcctt tcttttcttt tcttgaaaga 6060
gttttaaaca gataagatgg caaaagtgac tgatctctac tcccccagtt tgaatggtaa 6120
atttgaatgg taaattccca tgaacatata tggaaatgtc tttatcctac tttctccaat 6180
aaaggctgtt cttagctttt caaatgcaaa gtgaaacctt tatttatctt gatttctttt 6240
tttttttttt tttttttttt ttttttgaga tgctctgtca cccaggctgg agtgcagtgg 6300
caagatcttg gctcactgca agctccgcct cccaggttca cgccattctc ctggctcagc 6360
ctcccgagta actgggacta caggcacctg ccgtcacgcc tggctaattt tttgtatttt 6420
tagtagagaa tggagtttca ccgtgttagc caggatggtc tcgatctcct gaccttgtga 6480
tctgcccgcc tcggcctccc aaagtgctgg gattacaggc tcgagccact gcctccagcc 6540
tatcctgatt tctactgtca tgcctcacat cagtcctttt tttttttttt gagacagagt 6600
ctcgctctgt ggcccaggct agactgcagt ggcatgatct cggctcactg caacctccac 6660
ctccggggtt ctagcaattc tcctgcctca gcctcctgag tagctgggat tataggcgca 6720
tgccacacct ggctttttgt attttagtgg agatggggtt tcactgtgtt gctcaggctg 6780
gtcttgatct cctgagctca gacaatcccc ccgccttggc ctcccaaagt gctaggatta 6840
taggcgagag ctgctgtgtg cttcttaagt gaggtaagta acttccatag aaaatttcca 6900
tcagttcatt catgaaagaa caaagaacct ggcaaaactt aaaaaaacgt ttccaagaat 6960
cagataaaag aggacaaacc ttagggagaa gaaggcagct gctcatttcc agcaggggaa 7020
gtagctgcat agagtacaag gactggtagg cctgttggct gttcctgttt aaggagacaa 7080
gatgggcatg gaacagggac caccccctcc tctgggagaa gctgttaccc ccttcacttt 7140
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gcttttcaca tgagtgcttt cataagcatt aagtaaaatt ttataatgac tgcagtccaa 7320
ggacattttc cctggttttt ggccagtcta aatattgtaa gagagagaga agaaaagtgt 7380
acggaatata attgtctcta agctaagaaa tgtggatgtt caaataaaac atacgtacag 7440
aa 7442
<210> 23
<211> 435
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Met Leu Leu Pro Trp Ala Thr Ser Ala Pro Gly Leu Ala Trp Gly Pro
1 5 10 15
Leu Val Leu Gly Leu Phe Gly Leu Leu Ala Ala Ser Gln Pro Gln Ala
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Val Pro Pro Tyr Ala Ser Glu Asn Gln Thr Cys Arg Asp Gln Glu Lys
35 40 45
Glu Tyr Tyr Glu Pro Gln His Arg Ile Cys Cys Ser Arg Cys Pro Pro
50 55 60
Gly Thr Tyr Val Ser Ala Lys Cys Ser Arg Ile Arg Asp Thr Val Cys
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Ala Thr Cys Ala Glu Asn Ser Tyr Asn Glu His Trp Asn Tyr Leu Thr
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Ile Cys Gln Leu Cys Arg Pro Cys Asp Pro Val Met Gly Leu Glu Glu
100 105 110
Ile Ala Pro Cys Thr Ser Lys Arg Lys Thr Gln Cys Arg Cys Gln Pro
115 120 125
Gly Met Phe Cys Ala Ala Trp Ala Leu Glu Cys Thr His Cys Glu Leu
130 135 140
Leu Ser Asp Cys Pro Pro Gly Thr Glu Ala Glu Leu Lys Asp Glu Val
145 150 155 160
Gly Lys Gly Asn Asn His Cys Val Pro Cys Lys Ala Gly His Phe Gln
165 170 175
Asn Thr Ser Ser Pro Ser Ala Arg Cys Gln Pro His Thr Arg Cys Glu
180 185 190
Asn Gln Gly Leu Val Glu Ala Ala Pro Gly Thr Ala Gln Ser Asp Thr
195 200 205
Thr Cys Lys Asn Pro Leu Glu Pro Leu Pro Pro Glu Met Ser Gly Thr
210 215 220
Met Leu Met Leu Ala Val Leu Leu Pro Leu Ala Phe Phe Leu Leu Leu
225 230 235 240
Ala Thr Val Phe Ser Cys Ile Trp Lys Ser His Pro Ser Leu Cys Arg
245 250 255
Lys Leu Gly Ser Leu Leu Lys Arg Arg Pro Gln Gly Glu Gly Pro Asn
260 265 270
Pro Val Ala Gly Ser Trp Glu Pro Pro Lys Ala His Pro Tyr Phe Pro
275 280 285
Asp Leu Val Gln Pro Leu Leu Pro Ile Ser Gly Asp Val Ser Pro Val
290 295 300
Ser Thr Gly Leu Pro Ala Ala Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Pro Gln
305 310 315 320
Gln Gln Ser Pro Leu Asp Leu Thr Arg Glu Pro Gln Leu Glu Pro Gly
325 330 335
Glu Gln Ser Gln Val Ala His Gly Thr Asn Gly Ile His Val Thr Gly
340 345 350
Gly Ser Met Thr Ile Thr Gly Asn Ile Tyr Ile Tyr Asn Gly Pro Val
355 360 365
Leu Gly Gly Pro Pro Gly Pro Gly Asp Leu Pro Ala Thr Pro Glu Pro
370 375 380
Pro Tyr Pro Ile Pro Glu Glu Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Leu Ser
385 390 395 400
Thr Pro His Gln Glu Asp Gly Lys Ala Trp His Leu Ala Glu Thr Glu
405 410 415
His Cys Gly Ala Thr Pro Ser Asn Arg Gly Pro Arg Asn Gln Phe Ile
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Thr His Asp
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 24
gctttcccgg ccgcccctcc cgccccgcat cgaggcagac aagcctgttc ctcttccctg 60
ggctgcgatt gcgacaggcc ggcctggctc ccagcgctcc ctgtccccgc cccgcggcca 120
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gccgccgcca ccgctgccca ggacgtcggg cctcctgcct tcctcccagg cccccacgtt 300
gctggccgcc tggccgagtg gccgccatgc tcctgccttg ggccacctct gcccccggcc 360
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agccccagca ccgcatctgc tgctcccgct gcccgccagg cacctatgtc tcagctaaat 540
gtagccgcat ccgggacaca gtttgtgcca catgtgccga gaattcctac aacgagcact 600
ggaactacct gaccatctgc cagctgtgcc gcccctgtga cccagtgatg ggcctcgagg 660
agattgcccc ctgcacaagc aaacggaaga cccagtgccg ctgccagccg ggaatgttct 720
gtgctgcctg ggccctcgag tgtacacact gcgagctact ttctgactgc ccgcctggca 780
ctgaagccga gctcaaagat gaagttggga agggtaacaa ccactgcgtc ccctgcaagg 840
ccgggcactt ccagaatacc tcctccccca gcgcccgctg ccagccccac accaggtgtg 900
agaaccaagg tctggtggag gcagctccag gcactgccca gtccgacaca acctgcaaaa 960
atccattaga gccactgccc ccagagatgt caggaaccat gctgatgctg gccgttctgc 1020
tgccactggc cttctttctg ctccttgcca ccgtcttctc ctgcatctgg aagagccacc 1080
cttctctctg caggaaactg ggatcgctgc tcaagaggcg tccgcaggga gagggaccca 1140
atcctgtagc tggaagctgg gagcctccga aggcccatcc atacttccct gacttggtac 1200
agccactgct acccatttct ggagatgttt ccccagtatc cactgggctc cccgcagccc 1260
cagttttgga ggcaggggtg ccgcaacagc agagtcctct ggacctgacc agggagccgc 1320
agttggaacc cggggagcag agccaggtgg cccacggtac caatggcatt catgtcaccg 1380
gcgggtctat gactatcact ggcaacatct acatctacaa tggaccagta ctggggggac 1440
caccgggtcc tggagacctc ccagctaccc ccgaacctcc ataccccatt cccgaagagg 1500
gggaccctgg ccctcccggg ctctctacac cccaccagga agatggcaag gcttggcacc 1560
tagcggagac agagcactgt ggtgccacac cctctaacag gggcccaagg aaccaattta 1620
tcacccatga ctgactgagt ctgagaaaag gcagaagaag gggggcacaa gggcaccttc 1680
tcccttgagg ctgccctgcc cacgtgggat tcacaggggc ctgagtaggg cccggggaag 1740
cagagcccta agggattaag gctcagacac ctctgagagc aggtgggcac tggctgggta 1800
cggtgccctc cacaggactc tccctactgc ctgagcaaac ctgaggcctc ccggcagacc 1860
cacccacccc ctggggctgc tcagcctcag gcacggacag ggcacatgat accaactgct 1920
gcccactacg gcacgccgca ccggagcacg gcaccgaggg agccgccaca cggtcacctg 1980
caaggacgtc acgggcccct ctaaaggatt cgtggtgctc atccccaagc ttcagagacc 2040
ctttggggtt ccacacttca cgtggactga ggtagaccct gcatgaagat gaaattatag 2100
ggaggacgct ccttccctcc cctcctagag gagaggaaag ggagtcatta acaactaggg 2160
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aaa 2283
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸序列
<400> 26
ttagttttaa acaatctttc ct 22
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<212> DNA
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ttctaaaaac tgactcagag ga 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸序列
<400> 28
ttcagttgca gaaacactgt ta 22
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<212> DNA
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tcatcatatt caataatacc at 22
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ttcctcatct gtaaaatggg ct 22
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taatgattgg ggaacatgtt gc 22
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tcaaaaactc atctttattg gg 22
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ttatgatccc atttcacagg tt 22
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tctcaagaga aatccgtgcg ga 22
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Met Phe Ser Pro Gly Gln Glu Glu His Cys Ala Pro Asn Lys Glu Pro
1 5 10 15
Val Lys Tyr Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Tyr Asn Gly Ala Leu Pro
20 25 30
Asn Gly Asp Arg Gly Arg Arg Lys Ser Arg Phe Ala Leu Tyr Lys Arg
35 40 45
Pro Lys Ala Asn Gly Val Lys Pro Ser Thr Val His Val Ile Ser Thr
50 55 60
Pro Gln Ala Ser Lys Ala Ile Ser Cys Lys Gly Gln His Ser Ile Ser
65 70 75 80
Tyr Thr Leu Ser Arg Asn Gln Thr Val Val Val Glu Tyr Thr His Asp
85 90 95
Lys Asp Thr Asp Met Phe Gln Val Gly Arg Ser Thr Glu Ser Pro Ile
100 105 110
Asp Phe Val Val Thr Asp Thr Ile Ser Gly Ser Gln Asn Thr Asp Glu
115 120 125
Ala Gln Ile Thr Gln Ser Thr Ile Ser Arg Phe Ala Cys Arg Ile Val
130 135 140
Cys Asp Arg Asn Glu Pro Tyr Thr Ala Arg Ile Phe Ala Ala Gly Phe
145 150 155 160
Asp Ser Ser Lys Asn Ile Phe Leu Gly Glu Lys Ala Ala Lys Trp Lys
165 170 175
Asn Pro Asp Gly His Met Asp Gly Leu Thr Thr Asn Gly Val Leu Val
180 185 190
Met His Pro Arg Gly Gly Phe Thr Glu Glu Ser Gln Pro Gly Val Trp
195 200 205
Arg Glu Ile Ser Val Cys Gly Asp Val Tyr Thr Leu Arg Glu Thr Arg
210 215 220
Ser Ala Gln Gln Arg Gly Lys Leu Val Glu Ser Glu Thr Asn Val Leu
225 230 235 240
Gln Asp Gly Ser Leu Ile Asp Leu Cys Gly Ala Thr Leu Leu Trp Arg
245 250 255
Thr Ala Asp Gly Leu Phe His Thr Pro Thr Gln Lys His Ile Glu Ala
260 265 270
Leu Arg Gln Glu Ile Asn Ala Ala Arg Pro Gln Cys Pro Val Gly Leu
275 280 285
Asn Thr Leu Ala Phe Pro Ser Ile Asn Arg Lys Glu Val Val Glu Glu
290 295 300
Lys Gln Pro Trp Ala Tyr Leu Ser Cys Gly His Val His Gly Tyr His
305 310 315 320
Asn Trp Gly His Arg Ser Asp Thr Glu Ala Asn Glu Arg Glu Cys Pro
325 330 335
Met Cys Arg Thr Val Gly Pro Tyr Val Pro Leu Trp Leu Gly Cys Glu
340 345 350
Ala Gly Phe Tyr Val Asp Ala Gly Pro Pro Thr His Ala Phe Thr Pro
355 360 365
Cys Gly His Val Cys Ser Glu Lys Ser Ala Lys Tyr Trp Ser Gln Ile
370 375 380
Pro Leu Pro His Gly Thr His Ala Phe His Ala Ala Cys Pro Phe Cys
385 390 395 400
Ala Thr Gln Leu Val Gly Glu Gln Asn Cys Ile Lys Leu Ile Phe Gln
405 410 415
Gly Pro Ile Asp
420
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Met Val Ala Gly Thr Arg Cys Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Gln Val
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys
20 25 30
Phe Ala Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gln Pro Ser Asp Glu
35 40 45
Val Leu Ser Glu Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser Met Phe Gly Leu Lys
50 55 60
Gln Arg Pro Thr Pro Ser Arg Asp Ala Val Val Pro Pro Tyr Met Leu
65 70 75 80
Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly Gln Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp
85 90 95
His Arg Leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe
100 105 110
His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Thr Ser Gly Lys Thr
115 120 125
Thr Arg Arg Phe Phe Phe Asn Leu Ser Ser Ile Pro Thr Glu Glu Phe
130 135 140
Ile Thr Ser Ala Glu Leu Gln Val Phe Arg Glu Gln Met Gln Asp Ala
145 150 155 160
Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Ile
165 170 175
Ile Lys Pro Ala Thr Ala Asn Ser Lys Phe Pro Val Thr Arg Leu Leu
180 185 190
Asp Thr Arg Leu Val Asn Gln Asn Ala Ser Arg Trp Glu Ser Phe Asp
195 200 205
Val Thr Pro Ala Val Met Arg Trp Thr Ala Gln Gly His Ala Asn His
210 215 220
Gly Phe Val Val Glu Val Ala His Leu Glu Glu Lys Gln Gly Val Ser
225 230 235 240
Lys Arg His Val Arg Ile Ser Arg Ser Leu His Gln Asp Glu His Ser
245 250 255
Trp Ser Gln Ile Arg Pro Leu Leu Val Thr Phe Gly His Asp Gly Lys
260 265 270
Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gln Ala Lys His Lys Gln
275 280 285
Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp
290 295 300
Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr
305 310 315 320
His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His
325 330 335
Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
340 345 350
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
355 360 365
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
370 375 380
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
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<213> 智人
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Met Leu Leu Leu Ala Arg Cys Leu Leu Leu Val Leu Val Ser Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Cys Ser Gly Leu Ala Cys Gly Pro Gly Arg Gly Phe Gly Lys
20 25 30
Arg Arg His Pro Lys Lys Leu Thr Pro Leu Ala Tyr Lys Gln Phe Ile
35 40 45
Pro Asn Val Ala Glu Lys Thr Leu Gly Ala Ser Gly Arg Tyr Glu Gly
50 55 60
Lys Ile Ser Arg Asn Ser Glu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Pro Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Asp Ile Ile Phe Lys Asp Glu Glu Asn Thr Gly Ala Asp Arg
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Leu Met Thr Gln Arg Cys Lys Asp Lys Leu Asn Ala Leu Ala Ile Ser
100 105 110
Val Met Asn Gln Trp Pro Gly Val Lys Leu Arg Val Thr Glu Gly Trp
115 120 125
Asp Glu Asp Gly His His Ser Glu Glu Ser Leu His Tyr Glu Gly Arg
130 135 140
Ala Val Asp Ile Thr Thr Ser Asp Arg Asp Arg Ser Lys Tyr Gly Met
145 150 155 160
Leu Ala Arg Leu Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val Tyr Tyr Glu
165 170 175
Ser Lys Ala His Ile His Cys Ser Val Lys Ala Glu Asn Ser Val Ala
180 185 190
Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe Pro Gly Ser Ala Thr Val His Leu Glu
195 200 205
Gln Gly Gly Thr Lys Leu Val Lys Asp Leu Ser Pro Gly Asp Arg Val
210 215 220
Leu Ala Ala Asp Asp Gln Gly Arg Leu Leu Tyr Ser Asp Phe Leu Thr
225 230 235 240
Phe Leu Asp Arg Asp Asp Gly Ala Lys Lys Val Phe Tyr Val Ile Glu
245 250 255
Thr Arg Glu Pro Arg Glu Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ala His Leu Leu
260 265 270
Phe Val Ala Pro His Asn Asp Ser Ala Thr Gly Glu Pro Glu Ala Ser
275 280 285
Ser Gly Ser Gly Pro Pro Ser Gly Gly Ala Leu Gly Pro Arg Ala Leu
290 295 300
Phe Ala Ser Arg Val Arg Pro Gly Gln Arg Val Tyr Val Val Ala Glu
305 310 315 320
Arg Asp Gly Asp Arg Arg Leu Leu Pro Ala Ala Val His Ser Val Thr
325 330 335
Leu Ser Glu Glu Ala Ala Gly Ala Tyr Ala Pro Leu Thr Ala Gln Gly
340 345 350
Thr Ile Leu Ile Asn Arg Val Leu Ala Ser Cys Tyr Ala Val Ile Glu
355 360 365
Glu His Ser Trp Ala His Arg Ala Phe Ala Pro Phe Arg Leu Ala His
370 375 380
Ala Leu Leu Ala Ala Leu Ala Pro Ala Arg Thr Asp Arg Gly Gly Asp
385 390 395 400
Ser Gly Gly Gly Asp Arg Gly Gly Gly Gly Gly Arg Val Ala Leu Thr
405 410 415
Ala Pro Gly Ala Ala Asp Ala Pro Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Ile
420 425 430
His Trp Tyr Ser Gln Leu Leu Tyr Gln Ile Gly Thr Trp Leu Leu Asp
435 440 445
Ser Glu Ala Leu His Pro Leu Gly Met Ala Val Lys Ser Ser
450 455 460
<210> 40
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Met Gly Ser Lys Ala Ser Ser Pro His Gly Leu Gly Ser Pro Leu Val
1 5 10 15
Ala Ser Pro Arg Leu Glu Lys Arg Leu Gly Gly Leu Ala Pro Gln Arg
20 25 30
Gly Ser Arg Ile Ser Val Leu Ser Ala Ser Pro Val Ser Asp Val Ser
35 40 45
Tyr Met Phe Gly Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Ser Asn Ser Ser
50 55 60
His Gln Ser Ser Ser Arg Ser Leu Glu Ser Pro Ala Asn Ser Ser Ser
65 70 75 80
Ser Leu His Ser Leu Gly Ser Val Ser Leu Cys Thr Arg Pro Ser Asp
85 90 95
Phe Gln Ala Pro Arg Asn Pro Thr Leu Thr Met Gly Gln Pro Arg Thr
100 105 110
Pro His Ser Pro Pro Leu Ala Lys Glu His Ala Ser Ser Cys Pro Pro
115 120 125
Ser Ile Thr Asn Ser Met Val Asp Ile Pro Ile Val Leu Ile Asn Gly
130 135 140
Cys Pro Glu Pro Gly Ser Ser Pro Pro Gln Arg Thr Pro Gly His Gln
145 150 155 160
Asn Ser Val Gln Pro Gly Ala Ala Ser Pro Ser Asn Pro Cys Pro Ala
165 170 175
Thr Arg Ser Asn Ser Gln Thr Leu Ser Asp Ala Pro Phe Thr Thr Cys
180 185 190
Pro Glu Gly Pro Ala Arg Asp Met Gln Pro Thr Met Lys Phe Val Met
195 200 205
Asp Thr Ser Lys Tyr Trp Phe Lys Pro Asn Ile Thr Arg Glu Gln Ala
210 215 220
Ile Glu Leu Leu Arg Lys Glu Glu Pro Gly Ala Phe Val Ile Arg Asp
225 230 235 240
Ser Ser Ser Tyr Arg Gly Ser Phe Gly Leu Ala Leu Lys Val Gln Glu
245 250 255
Val Pro Ala Ser Ala Gln Ser Arg Pro Gly Glu Asp Ser Asn Asp Leu
260 265 270
Ile Arg His Phe Leu Ile Glu Ser Ser Ala Lys Gly Val His Leu Lys
275 280 285
Gly Ala Asp Glu Glu Pro Tyr Phe Gly Ser Leu Ser Ala Phe Val Cys
290 295 300
Gln His Ser Ile Met Ala Leu Ala Leu Pro Cys Lys Leu Thr Ile Pro
305 310 315 320
Gln Arg Glu Leu Gly Gly Ala Asp Gly Ala Ser Asp Ser Thr Asp Ser
325 330 335
Pro Ala Ser Cys Gln Lys Lys Ser Ala Gly Cys His Thr Leu Tyr Leu
340 345 350
Ser Ser Val Ser Val Glu Thr Leu Thr Gly Ala Leu Ala Val Gln Lys
355 360 365
Ala Ile Ser Thr Thr Phe Glu Arg Asp Ile Leu Pro Thr Pro Thr Val
370 375 380
Val His Phe Lys Val Thr Glu Gln Gly Ile Thr Leu Thr Asp Val Gln
385 390 395 400
Arg Lys Val Phe Phe Arg Arg His Tyr Pro Leu Thr Thr Leu Arg Phe
405 410 415
Cys Gly Met Asp Pro Glu Gln Arg Lys Trp Gln Lys Tyr Cys Lys Pro
420 425 430
Ser Trp Ile Phe Gly Phe Val Ala Lys Ser Gln Thr Glu Pro Gln Glu
435 440 445
Asn Val Cys His Leu Phe Ala Glu Tyr Asp Met Val Gln Pro Ala Ser
450 455 460
Gln Val Ile Gly Leu Val Thr Ala Leu Leu Gln Asp Ala Glu Arg Met
465 470 475 480
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<211> 219
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Met Ala Ser Val Thr Asp Gly Lys Thr Gly Val Lys Asp Ala Ser Asp
1 5 10 15
Gln Asn Phe Asp Tyr Met Phe Lys Leu Leu Ile Ile Gly Asn Ser Ser
20 25 30
Val Gly Lys Thr Ser Phe Leu Phe Arg Tyr Ala Asp Asp Thr Phe Thr
35 40 45
Pro Ala Phe Val Ser Thr Val Gly Ile Asp Phe Lys Val Lys Thr Val
50 55 60
Tyr Arg His Glu Lys Arg Val Lys Leu Gln Ile Trp Asp Thr Ala Gly
65 70 75 80
Gln Glu Arg Tyr Arg Thr Ile Thr Thr Ala Tyr Tyr Arg Gly Ala Met
85 90 95
Gly Phe Ile Leu Met Tyr Asp Ile Thr Asn Glu Glu Ser Phe Asn Ala
100 105 110
Val Gln Asp Trp Ala Thr Gln Ile Lys Thr Tyr Ser Trp Asp Asn Ala
115 120 125
Gln Val Ile Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Met Glu Glu Glu Arg Val
130 135 140
Val Pro Thr Glu Lys Gly Gln Leu Leu Ala Glu Gln Leu Gly Phe Asp
145 150 155 160
Phe Phe Glu Ala Ser Ala Lys Glu Asn Ile Ser Val Arg Gln Ala Phe
165 170 175
Glu Arg Leu Val Asp Ala Ile Cys Asp Lys Met Ser Asp Ser Leu Asp
180 185 190
Thr Asp Pro Ser Met Leu Gly Ser Ser Lys Asn Thr Arg Leu Ser Asp
195 200 205
Thr Pro Pro Leu Leu Gln Gln Asn Cys Ser Cys
210 215
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Met Ile Ala Glu Pro Ala His Phe Tyr Leu Phe Gly Leu Ile Cys Leu
1 5 10 15
Cys Ser Gly Ser Arg Leu Arg Gln Glu Asp Phe Pro Pro Arg Ile Val
20 25 30
Glu His Pro Ser Asp Leu Ile Val Ser Lys Gly Glu Pro Ala Thr Leu
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Asn Cys Lys Ala Glu Gly Arg Pro Thr Pro Thr Ile Glu Trp Tyr Lys
50 55 60
Gly Gly Glu Arg Val Glu Thr Asp Lys Asp Asp Pro Arg Ser His Arg
65 70 75 80
Met Leu Leu Pro Ser Gly Ser Leu Phe Phe Leu Arg Ile Val His Gly
85 90 95
Arg Lys Ser Arg Pro Asp Glu Gly Val Tyr Val Cys Val Ala Arg Asn
100 105 110
Tyr Leu Gly Glu Ala Val Ser His Asn Ala Ser Leu Glu Val Ala Ile
115 120 125
Leu Arg Asp Asp Phe Arg Gln Asn Pro Ser Asp Val Met Val Ala Val
130 135 140
Gly Glu Pro Ala Val Met Glu Cys Gln Pro Pro Arg Gly His Pro Glu
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Pro Thr Ile Ser Trp Lys Lys Asp Gly Ser Pro Leu Asp Asp Lys Asp
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Glu Arg Ile Thr Ile Arg Gly Gly Lys Leu Met Ile Thr Tyr Thr Arg
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Lys Ser Asp Ala Gly Lys Tyr Val Cys Val Gly Thr Asn Met Val Gly
195 200 205
Glu Arg Glu Ser Glu Val Ala Glu Leu Thr Val Leu Glu Arg Pro Ser
210 215 220
Phe Val Lys Arg Pro Ser Asn Leu Ala Val Thr Val Asp Asp Ser Ala
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Glu Phe Lys Cys Glu Ala Arg Gly Asp Pro Val Pro Thr Val Arg Trp
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Arg Lys Asp Asp Gly Glu Leu Pro Lys Ser Arg Tyr Glu Ile Arg Asp
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Asp His Thr Leu Lys Ile Arg Lys Val Thr Ala Gly Asp Met Gly Ser
275 280 285
Tyr Thr Cys Val Ala Glu Asn Met Val Gly Lys Ala Glu Ala Ser Ala
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Thr Leu Thr Val Gln Val Gly Ser Glu Pro Pro His Phe Val Val Lys
305 310 315 320
Pro Arg Asp Gln Val Val Ala Leu Gly Arg Thr Val Thr Phe Gln Cys
325 330 335
Glu Ala Thr Gly Asn Pro Gln Pro Ala Ile Phe Trp Arg Arg Glu Gly
340 345 350
Ser Gln Asn Leu Leu Phe Ser Tyr Gln Pro Pro Gln Ser Ser Ser Arg
355 360 365
Phe Ser Val Ser Gln Thr Gly Asp Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Arg
370 375 380
Ser Asp Val Gly Tyr Tyr Ile Cys Gln Thr Leu Asn Val Ala Gly Ser
385 390 395 400
Ile Ile Thr Lys Ala Tyr Leu Glu Val Thr Asp Val Ile Ala Asp Arg
405 410 415
Pro Pro Pro Val Ile Arg Gln Gly Pro Val Asn Gln Thr Val Ala Val
420 425 430
Asp Gly Thr Phe Val Leu Ser Cys Val Ala Thr Gly Ser Pro Val Pro
435 440 445
Thr Ile Leu Trp Arg Lys Asp Gly Val Leu Val Ser Thr Gln Asp Ser
450 455 460
Arg Ile Lys Gln Leu Glu Asn Gly Val Leu Gln Ile Arg Tyr Ala Lys
465 470 475 480
Leu Gly Asp Thr Gly Arg Tyr Thr Cys Ile Ala Ser Thr Pro Ser Gly
485 490 495
Glu Ala Thr Trp Ser Ala Tyr Ile Glu Val Gln Glu Phe Gly Val Pro
500 505 510
Val Gln Pro Pro Arg Pro Thr Asp Pro Asn Leu Ile Pro Ser Ala Pro
515 520 525
Ser Lys Pro Glu Val Thr Asp Val Ser Arg Asn Thr Val Thr Leu Ser
530 535 540
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545 550 555 560
Glu Ala Phe Ser His Ala Ser Gly Ser Ser Trp Gln Thr Val Ala Glu
565 570 575
Asn Val Lys Thr Glu Thr Ser Ala Ile Lys Gly Leu Lys Pro Asn Ala
580 585 590
Ile Tyr Leu Phe Leu Val Arg Ala Ala Asn Ala Tyr Gly Ile Ser Asp
595 600 605
Pro Ser Gln Ile Ser Asp Pro Val Lys Thr Gln Asp Val Leu Pro Thr
610 615 620
Ser Gln Gly Val Asp His Lys Gln Val Gln Arg Glu Leu Gly Asn Ala
625 630 635 640
Val Leu His Leu His Asn Pro Thr Val Leu Ser Ser Ser Ser Ile Glu
645 650 655
Val His Trp Thr Val Asp Gln Gln Ser Gln Tyr Ile Gln Gly Tyr Lys
660 665 670
Ile Leu Tyr Arg Pro Ser Gly Ala Asn His Gly Glu Ser Asp Trp Leu
675 680 685
Val Phe Glu Val Arg Thr Pro Ala Lys Asn Ser Val Val Ile Pro Asp
690 695 700
Leu Arg Lys Gly Val Asn Tyr Glu Ile Lys Ala Arg Pro Phe Phe Asn
705 710 715 720
Glu Phe Gln Gly Ala Asp Ser Glu Ile Lys Phe Ala Lys Thr Leu Glu
725 730 735
Glu Ala Pro Ser Ala Pro Pro Gln Gly Val Thr Val Ser Lys Asn Asp
740 745 750
Gly Asn Gly Thr Ala Ile Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Pro Glu Asp
755 760 765
Thr Gln Asn Gly Met Val Gln Glu Tyr Lys Val Trp Cys Leu Gly Asn
770 775 780
Glu Thr Arg Tyr His Ile Asn Lys Thr Val Asp Gly Ser Thr Phe Ser
785 790 795 800
Val Val Ile Pro Phe Leu Val Pro Gly Ile Arg Tyr Ser Val Glu Val
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Ala Ala Ser Thr Gly Ala Gly Ser Gly Val Lys Ser Glu Pro Gln Phe
820 825 830
Ile Gln Leu Asp Ala His Gly Asn Pro Val Ser Pro Glu Asp Gln Val
835 840 845
Ser Leu Ala Gln Gln Ile Ser Asp Val Val Lys Gln Pro Ala Phe Ile
850 855 860
Ala Gly Ile Gly Ala Ala Cys Trp Ile Ile Leu Met Val Phe Ser Ile
865 870 875 880
Trp Leu Tyr Arg His Arg Lys Lys Arg Asn Gly Leu Thr Ser Thr Tyr
885 890 895
Ala Gly Ile Arg Lys Val Thr Tyr Gln Arg Gly Gly Glu Ala Val Ser
900 905 910
Ser Gly Gly Arg Pro Gly Leu Leu Asn Ile Ser Glu Pro Ala Ala Gln
915 920 925
Pro Trp Leu Ala Asp Thr Trp Pro Asn Thr Gly Asn Asn His Asn Asp
930 935 940
Cys Ser Ile Ser Cys Cys Thr Ala Gly Asn Gly Asn Ser Asp Ser Asn
945 950 955 960
Leu Thr Thr Tyr Ser Arg Pro Ala Asp Cys Ile Ala Asn Tyr Asn Asn
965 970 975
Gln Leu Asp Asn Lys Gln Thr Asn Leu Met Leu Pro Glu Ser Thr Val
980 985 990
Tyr Gly Asp Val Asp Leu Ser Asn Lys Ile Asn Glu Met Lys Thr Phe
995 1000 1005
Asn Ser Pro Asn Leu Lys Asp Gly Arg Phe Val Asn Pro Ser Gly Gln
1010 1015 1020
Pro Thr Pro Tyr Ala Thr Thr Gln Leu Ile Gln Ser Asn Leu Ser Asn
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Asn Met Asn Asn Gly Ser Gly Asp Ser Gly Glu Lys His Trp Lys Pro
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Leu Gly Gln Gln Lys Gln Glu Val Ala Pro Val Gln Tyr Asn Ile Val
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Asp Cys Pro Glu Glu Thr Gly His Met Gln His Gln Pro Asp Arg Arg
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Gln Ala Val Ala Ala Ala Ala Glu Tyr Ala Gly Leu Lys Val Ala Arg
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Arg Gln Met Gln Asp Ala Ala Gly Arg Arg His Phe His Ala Ser Gln
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Val Pro Pro Pro Ala Ile Lys Ser Pro Thr Ala Gln Ser Lys Thr Gln
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Leu Glu Val Arg Pro Val Val Val Pro Lys Leu Pro Ser Met Asp Ala
1460 1465 1470
Arg Thr Asp Arg Ser Ser Asp Arg Lys Gly Ser Ser Tyr Lys Gly Arg
1475 1480 1485
Glu Val Leu Asp Gly Arg Gln Val Val Asp Met Arg Thr Asn Pro Gly
1490 1495 1500
Asp Pro Arg Glu Ala Gln Glu Gln Gln Asn Asp Gly Lys Gly Arg Gly
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Asn Lys Ala Ala Lys Arg Asp Leu Pro Pro Ala Lys Thr His Leu Ile
1525 1530 1535
Gln Glu Asp Ile Leu Pro Tyr Cys Arg Pro Thr Phe Pro Thr Ser Asn
1540 1545 1550
Asn Pro Arg Asp Pro Ser Ser Ser Ser Ser Met Ser Ser Arg Gly Ser
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Gly Ser Arg Gln Arg Glu Gln Ala Asn Val Gly Arg Arg Asn Ile Ala
1570 1575 1580
Glu Met Gln Val Leu Gly Gly Tyr Glu Arg Gly Glu Asp Asn Asn Glu
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1605
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Met Asn Glu Leu Pro Arg Asp Thr Cys Gly Asn His Thr Asn Gln Leu
1 5 10 15
Asp Gly Thr Lys Glu Glu Arg Glu Leu Pro Arg Val Ile Lys Thr Ser
20 25 30
Gly Ser Met Pro Asp Asp Ala Ser Leu Asn Ser Thr Thr Leu Ser Asp
35 40 45
Ala Ser Gln Asp Lys Glu Gly Ser Phe Ala Val Pro Arg Ser Asp Ser
50 55 60
Val Ala Ile Leu Glu Thr Ile Pro Val Leu Pro Val His Ser Asn Gly
65 70 75 80
Ser Pro Glu Pro Gly Gln Pro Val Gln Asn Ala Ile Ser Asp Asp Asp
85 90 95
Phe Leu Glu Lys Asn Ile Pro Pro Glu Ala Glu Glu Leu Ser Phe Glu
100 105 110
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Lys Lys Ser Glu Ile Lys Lys Glu Asp Tyr Val Leu Thr Lys Phe Asn
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Val Gln Lys Thr Arg Phe Gly Leu Thr Glu Ala Gly Asp Leu Ser Ala
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Glu Asp Met Lys Lys Ile Arg His Leu Ser Leu Ile Glu Leu Thr Ala
165 170 175
Phe Phe Asp Ala Phe Gly Ile Gln Leu Lys Arg Asn Lys Thr Glu Lys
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Leu Gln Lys Phe Phe Glu Lys Val Glu Glu Ser Gly Leu Glu Ser Glu
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Gly Ile Phe Arg Leu Ser Gly Cys Thr Ala Lys Val Lys Gln Tyr Arg
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Glu Glu Leu Asp Ala Lys Phe Asn Ala Asp Lys Phe Lys Trp Asp Lys
260 265 270
Met Cys His Arg Glu Ala Ala Val Met Leu Lys Ala Phe Phe Arg Glu
275 280 285
Leu Pro Thr Ser Leu Phe Pro Val Glu Tyr Ile Pro Ala Phe Ile Ser
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Leu Met Val Met Ala Leu Pro Asp Ala Asn Arg Asp Ala Ala Gln Ala
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370 375 380
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530 535 540
Thr
545
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<213> 智人
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50 55 60
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Leu Leu Arg Glu Lys Val Ser Arg Arg Leu Ser Arg Ser Lys Asn Glu
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Gly Leu Lys Ser Glu Gly Leu Tyr Arg Val Ser Gly Phe Thr Glu His
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<213> 智人
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<213> 智人
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325 330 335
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435 440 445
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<213> 智人
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Ser Gly Thr Ser Arg Leu Glu Thr Gly Pro Gly Gly Ala Ser Arg Phe
115 120 125
Arg Glu Arg Ser Leu Ser Val Pro Thr Asp Ser Gly Thr Thr Asp Val
130 135 140
Asp Tyr Asp Glu Glu Gln Lys Ala Asn Glu Ala Cys Ala Leu Pro Phe
145 150 155 160
Ala Ser Thr Ser Ser Glu Gly Ser Asn Ser Ala Asp Asn Ile Ala Ser
165 170 175
Leu Ser Ala Gln Gln Glu Ala Gln His Arg Arg Gln Arg Ser Lys Ser
180 185 190
Ile Ser Leu Arg Lys Ala Lys Lys Lys Pro Ser Pro Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Val Ser Leu Val Lys Asp Glu Pro Gly Leu Leu Pro Glu Gly Gly Ser
210 215 220
Ala Leu Pro Lys Asp Gln Arg Pro Lys Ser Leu Cys Leu Ser Leu Glu
225 230 235 240
His Gln Gly His His Ser Ser His Pro Asp Ala Gln Gly His Pro Ala
245 250 255
Ile Pro Asn His Lys Asp Pro Glu Ser Thr Gln Phe Ser His His Trp
260 265 270
Tyr Leu Thr Asp Trp Lys Ser Gly Asp Thr Tyr Gln Ser Leu Ser Ser
275 280 285
Ser Ser Thr Ala Thr Gly Thr Thr Val Ile Glu Cys Thr Gln Val Gln
290 295 300
Gly Ser Ser Glu Ser Leu Ala Ser Pro Ser Thr Ser Arg Ala Thr Thr
305 310 315 320
Pro Ser Gln Leu Ser Ile Glu Val Glu Ala Arg Glu Ile Ser Ser Pro
325 330 335
Gly Arg Pro Pro Gly Leu Met Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Ser Gln
340 345 350
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355 360 365
Leu Pro Pro Pro Ser Ser Ser Val Arg Val Arg Pro Val Val Pro Glu
370 375 380
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385 390 395 400
Ser Arg Leu Ser Phe Asp Leu Pro Leu Thr Ser Ser Pro Asn Leu Asp
405 410 415
Leu Ser Gly Met Ser Ile Ser Ile Arg Ser Lys Thr Lys Val Ser Arg
420 425 430
His His Ser Glu Thr Asn Phe Gly Val Lys Leu Ala Gln Lys Thr Asn
435 440 445
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450 455 460
Val Arg Leu Arg Ser Val Ser Lys Ser Glu Pro Glu Asp Asp Ile Glu
465 470 475 480
Ser Pro Glu Tyr Ala Glu Glu Pro Arg Ala Glu Glu Val Phe Thr Leu
485 490 495
Pro Glu Arg Lys Thr Lys Pro Pro Val Ala Glu Lys Pro Pro Val Ala
500 505 510
Arg Arg Pro Pro Ser Leu Val His Lys Pro Pro Ser Val Pro Glu Glu
515 520 525
Tyr Ala Leu Thr Ser Pro Thr Leu Ala Met Pro Pro Arg Ser Ser Ile
530 535 540
Gln His Ala Arg Pro Leu Pro Gln Asp Ser Tyr Thr Val Val Arg Lys
545 550 555 560
Pro Lys Pro Ser Ser Phe Pro Asp Gly Arg Ser Pro Gly Glu Ser Thr
565 570 575
Ala Pro Ser Ser Leu Val Phe Thr Pro Phe Ala Ser Ser Ser Asp Ala
580 585 590
Phe Phe Ser Gly Thr Gln Gln Pro Pro Gln Gly Ser Val Glu Asp Glu
595 600 605
Gly Pro Lys Val Arg Val Leu Pro Glu Arg Ile Ser Leu Gln Ser Gln
610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
Glu Ala Tyr Val Ala Glu Pro Arg Leu Pro Leu Ser Pro Ile Ile Thr
660 665 670
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675 680 685
Leu Gly Gln Arg Val Thr Ser Thr Pro Gln Ala Asp Ser Glu Arg Glu
690 695 700
Ala Ser Pro Leu Gly
705
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<211> 684
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Met Ala Ser Gly Arg Arg Gly Trp Asp Ser Ser His Glu Asp Asp Leu
1 5 10 15
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65 70 75 80
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210 215 220
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Ala Asp Gly Lys Ser Cys Cys Asp Tyr Ala Leu His Val Asp Ile Thr
245 250 255
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275 280 285
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325 330 335
His Val Leu Ser Arg Pro Glu Glu Leu Glu Ala Glu Ala Val Phe Arg
340 345 350
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355 360 365
Val Met Ser Lys Ser Ala Ala Asp Leu Ile Ser Gln Ala Arg Lys Lys
370 375 380
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<213> 智人
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Met Leu Arg Met Arg Thr Ala Gly Trp Ala Arg Gly Trp Cys Leu Gly
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<400> 58
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20 25 30
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165 170 175
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195 200 205
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245 250 255
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<213> 智人
<400> 59
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195 200 205
Arg Val Arg Leu Arg Pro His Val Ser Pro Arg His Ser Phe Asn Asn
210 215 220
Leu Gly Ile Gln Cys Val Arg Lys Lys Glu Ile Glu Ala Ala Ile Glu
225 230 235 240
Arg Lys Ile Gln Leu Gly Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Gly Ser Leu Lys
245 250 255
Asn His Gln Glu Val Asp Met Asn Val Val Arg Ile Cys Phe Gln Ala
260 265 270
Ser Tyr Arg Asp Gln Gln Gly Gln Met Arg Arg Met Asp Pro Val Leu
275 280 285
Ser Glu Pro Val Tyr Asp Lys Lys Ser Thr Asn Thr Ser Glu Leu Arg
290 295 300
Ile Cys Arg Ile Asn Lys Glu Ser Gly Pro Cys Thr Gly Gly Glu Glu
305 310 315 320
Leu Tyr Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Glu Asp Ile Ser Val Val
325 330 335
Phe Ser Arg Ala Ser Trp Glu Gly Arg Ala Asp Phe Ser Gln Ala Asp
340 345 350
Val His Arg Gln Ile Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Pro Tyr Glu Asp
355 360 365
Leu Glu Ile Val Glu Pro Val Thr Val Asn Val Phe Leu Gln Arg Leu
370 375 380
Thr Asp Gly Val Cys Ser Glu Pro Leu Pro Phe Thr Tyr Leu Pro Arg
385 390 395 400
Asp His Asp Ser Tyr Gly Val Asp Lys Lys Arg Lys Arg Gly Met Pro
405 410 415
Asp Val Leu Gly Glu Leu Asn Ser Ser Asp Pro His Gly Ile Glu Ser
420 425 430
Lys Arg Arg Lys Lys Lys Pro Ala Ile Leu Asp His Phe Leu Pro Asn
435 440 445
His Gly Ser Gly Pro Phe Leu Pro Pro Ser Ala Leu Leu Pro Asp Pro
450 455 460
Asp Phe Phe Ser Gly Thr Val Ser Leu Pro Gly Leu Glu Pro Pro Gly
465 470 475 480
Gly Pro Asp Leu Leu Asp Asp Gly Phe Ala Tyr Asp Pro Thr Ala Pro
485 490 495
Thr Leu Phe Thr Met Leu Asp Leu Leu Pro Pro Ala Pro Pro His Ala
500 505 510
Ser Ala Val Val Cys Ser Gly Gly Ala Gly Ala Val Val Gly Glu Thr
515 520 525
Pro Gly Pro Glu Pro Leu Thr Leu Asp Ser Tyr Gln Ala Pro Gly Pro
530 535 540
Gly Asp Gly Gly Thr Ala Ser Leu Val Gly Ser Asn Met Phe Pro Asn
545 550 555 560
His Tyr Arg Glu Ala Ala Phe Gly Gly Gly Leu Leu Ser Pro Gly Pro
565 570 575
Glu Ala Thr
<210> 60
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸序列
<400> 60
uucaagaga 9
<210> 61
<211> 750
<212> DNA
<213> 智人
<400> 61
tgcctccaga aagggttgag aagataatgg atcagattga aaagtacatc atgactcatc 60
tctgtaaata tgcgttctgt ccagaacccc agtgagcctg gaagactggg tgctatggga 120
aatgtcatca atccaatgct agtgaaagat gtgactgggg aatgctgaaa aatgcgcacc 180
cctgggagga atgaggaaag atgacatcca ctgacttgtt atttttttga gaaggagtct 240
tgctctgttg cccaggctgg agtgtggtgg cacgatctcg gctcactgat gatgagaaga 300
aagatcttgc cattcaaaag aggatcagag tggaagcttc tctgtggtgt cagaaagacg 360
aggaatgtgg tgacctcacc tatccatctc cctcaaggca gcttttgacc tgaactggtt 420
atttcctact tgcctcctgg agttgctaat aaaataaaca ctaaagcttc gcagtttcta 480
aaaagaccat gaagccctga gagtaatgaa aaggttcctg aaattgaggt cactgtggaa 540
ggagaatcta atgcctgatg atctgtcact atctcccatc acccccagat gggaccatct 600
agttgcagga aaagaaggtc aagactccca gtcattctac attatgcctc agccaagatg 660
tctcacccca ctctctctga tgcaacaaga agcccctgga gaacgtttca gtcccatttt 720
gtacttctgt catgtgctca tcacagtctg 750

Claims (25)

1.一种方法，其包含：(a)将测试化合物与转移性癌细胞样品在培养基中混合以产生测试分析物；(b)在足以使所述测试化合物与所述细胞结合或穿透所述细胞的条件下将所述测试分析物温育一段时间；(c)测量：
所述培养基中、所述细胞中或其组合中cGAMP的量或浓度以产生测试分析物值；
一系列所述细胞内中心体之间的距离以产生平均距离结果；
RELB易位到所述细胞的细胞核中的量；以及
(d)选择测试化合物，其：
测试分析物cGAMP值比参比cGAMP值低；
平均距离结果比参比距离低；
RELB易位到所述细胞的核的量比参比量低；
从而产生有效治疗染色体不稳定性的测试化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述参比为
a.不含测试化合物的分析混合物中cGAMP的量或浓度；
b.不含测试化合物的分析混合物中转移性癌细胞中的着丝粒之间的距离；或
c.不含测试化合物的分析混合物中RELB易位到转移性癌细胞的细胞核中的量。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包含在测量所述cGAMP之前用醇提取所述样品或培养基以产生醇提取物。
4.根据权利要求3所述的方法，其进一步包含使用一个或多个HyperSep氨基丙基固相柱通过固相提取(SPE)纯化所述醇提取物以产生半纯测试样品，然后测量所述半纯测试样品的所述cGAMP。
5.根据权利要求1至3或4所述的方法，其中测量cGAMP的量或浓度包含液相色谱分析和/或质谱分析以测量cGAMP的水平。
6.根据权利要求1至4或5所述的方法，其进一步包含将所述测试化合物给予动物模型以鉴定治疗剂。
7.根据权利要求1至5或6所述的方法，其进一步包含将所述治疗剂给予患者。
8.一种方法，其包含：(a)从患者获得细胞或组织样品；(b)测量：由所述样品中已知数量或重量的细胞或组织产生的cGAMP的量或浓度，以得到参比cGAMP值；(c)将所述样品中相同已知数量或重量的细胞或组织与测试化合物混合以得到测试分析物；(d)测量所述测试分析物中cGAMP的量或浓度以得到测试分析物cGAMP值；(e)任选地重复步骤(c)和(d)；以及选择任何测试分析cGAMP值比参比cGAMP值低的测试化合物，从而鉴定至少一种有效的测试化合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述样品包含转移性癌细胞或转移性组织。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其进一步包含在测量所述cGAMP之前用醇提取所述细胞或组织样品以产生醇提取物。
11.根据权利要求8、9或10所述的方法，其进一步包含用甲醇提取所述细胞或组织样品以产生甲醇提取物，并测量所述甲醇提取物中的所述cGAMP。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其进一步包含使用一个或多个HyperSep氨基丙基固相柱通过固相提取(SPE)纯化所述醇提取物或所述甲醇提取物以产生半纯测试样品，然后测量所述半纯测试样品的所述cGAMP。
13.根据权利要求8至11或12所述的方法，其中测量cGAMP的量或浓度包含液相色谱分析和/或质谱分析。
14.根据权利要求8至12或13所述的方法，其进一步包含将所述有效测试化合物给予动物癌症模型。
15.根据权利要求8至13或14所述的方法，其进一步包含将所述有效测试化合物给予患者或者从中获得所述细胞或组织样品的所述患者。
16.一种通过根据权利要求1至14或15所述的方法产生的有效测试化合物。
17.一种方法，其包含将转移性化学治疗剂给予具有细胞样品或体液样品的患者：
a.所述细胞样品的一个或多个细胞内具有至少10％的可检测的染色体错误分离；
b.所述细胞样品的一个或多个细胞内具有至少3％的可检测的微核；
c.所述细胞样品的一个或多个细胞内具有可检测的胞质双链DNA；或
d.所述细胞样品或体液样品中cGAMP的浓度或量高至少10％。
18.根据权利要求17所述的方法，其包含将转移性化学治疗剂给予患者，所述患者中：
a.所述细胞样品的后期细胞中15至20％的染色体表现出错误分离；
b.所述细胞样品中5至8％的细胞表现出微核；
c.与正常非癌组织相比，胞质溶胶内染色强度增加1倍至2倍；或
d.所述体液样品中cGAMP的浓度或量比非癌性体液样品高1倍至2倍。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其进一步包含随时间监测所述患者的样品以定量所述患者细胞或体液中的染色体错误分离、微核、胞质双链DNA或cGAMP。
20.根据权利要求17、18或19所述的方法，其中所述转移性化学治疗剂为一种组合物，所述组合物包含一种或多种驱动蛋白-13蛋白、一种或多种MCAK蛋白或其组合。
21.根据权利要求17至19或20所述的方法，其中所述转移性化学治疗剂为一种包含驱动蛋白-13核酸或表达盒的组合物，所述表达盒具有与编码驱动蛋白-13蛋白的核酸片段可操作连接的启动子。
22.一种方法，其包含(a)对患者的测试样品中以下基因的表达水平进行定量：PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24或FGF5，以得到所述测试样品中以下基因中的每一个的定量表达水平：PELI2、BMP2、SHH、TNS4、RAB3B、ROBO1、ARHGAP28、CHN2、CST1、F13A1、CPVL、SEMA6D、C9orf152、NHSL2、GTF2IP7、DPYSL3、PCDH7、KHDRBS3、TRAC、TMEM156、CST4、CD24或FGF5；和(b)当每个定量的表达水平大于这些基因中的每一个的中位参比表达水平时，报告患者具有更长的无转移存活期。
23.根据权利要求22所述的方法，其中这些基因中每一个的所述中位参比表达水平为一系列转移性癌症患者的样品中这些基因中每一个的中位表达。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述患者患有乳腺癌。
25.一种化学治疗剂的用途，其用于向具有细胞样品或体液样品的患者给药的组合物中：
a.所述细胞样品的一个或多个细胞内具有至少10％的可检测的染色体错误分离；
b.所述细胞样品的一个或多个细胞内具有至少3％的可检测的微核；
c.所述细胞样品的一个或多个细胞内具有可检测的胞质双链DNA；或
d.所述细胞样品或体液样品中cGAMP的浓度或量高至少10％。
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