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CN111295447A - 玉米优良事件mzir098 - Google Patents

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CN111295447A CN201880039557.2A CN201880039557A CN111295447A CN 111295447 A CN111295447 A CN 111295447A CN 201880039557 A CN201880039557 A CN 201880039557A CN 111295447 A CN111295447 A CN 111295447A
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Abstract

披露了一种命名为MZIR098的新颖的转基因玉米优良事件。本发明涉及插入到玉米基因组中的重组构建体的DNA序列以及位于导致优良事件MZIR098的插入位点侧翼的基因组序列的DNA序列。本发明进一步涉及用于检测玉米优良事件MZIR098的DNA序列的存在的测定、涉及包含所述其基因型的玉米植物和玉米种子、以及涉及通过将包含所述优良事件MZIR098基因型的玉米植物与自身或另一种玉米品种进行杂交用于产生玉米植物的方法。

Description

玉米优良事件MZIR098
相关申请
本申请要求于2017年6月15日提交的美国临时申请号62/519,993的优先权，其披露通过引用以其全文并入本文。
关于序列表的电子提交的声明
提供ASCII文本格式的序列表作为纸质副本的替代，该序列表是根据37C.F.R.§1.821提交的，名称为“81336_ST25.txt”，大小为511千字节，于2018年3月30日生成并经由EFS-Web提交。这个序列表特此通过引用以其披露结合到本说明书中。
技术领域
本发明总体上涉及植物分子生物学、植物转化、以及植物育种的领域。更确切地说，本发明涉及包含新颖的转基因基因型的昆虫抗性转基因玉米植物并涉及检测样品及其组合物中玉米植物DNA的存在的方法。
背景技术
植物有害生物是在全世界重要作物损失中的主要因素。由于非哺乳动物有害生物(包括昆虫)的侵染，仅在美国每年就损失大约80亿美元。玉米根虫的多个物种被认为是最具破坏性的玉米有害生物。重要的根虫有害生物物种包括西方玉米根虫(Diabroticavirgifera virgifera，the western corn rootworm)、北方玉米根虫(D.longicornisbarberi，the northern corn rootworm)、南方玉米根虫(D.undecimpunctata howardi，the southern corn rootworm)、以及墨西哥玉米根虫(D.virgifera zeae，the Mexicancorn rootworm)。
玉米根虫主要是由密集施用化学杀有害生物剂来控制的。由此可以达到好的玉米根虫的控制，但这些化学品有时也能影响有益的生物。由化学杀有害生物剂的广泛使用产生的另一个问题是出现了抗性昆虫品种。通过各种抗性管理实践已部分地缓和了这一状况，但对可替代的有害生物控制策略仍有不断增加的需求。一种这样的替代方案包括在转基因植物中表达编码杀昆虫蛋白的外来基因。这种方法已经提供了保护以免受选择的昆虫有害生物侵袭的有效手段，并且表达杀昆虫毒素的转基因植物已经被商业化，这允许农业工作者减少化学杀昆虫剂的施用。
苏云金芽孢杆菌(Bt)Cry蛋白(还称为5-内毒素)是在芽孢杆菌属中形成结晶基质的蛋白质，当被某些昆虫摄取时已知该蛋白质拥有杀昆虫活性。已经分离了Cry蛋白编码基因并且它们在作物植物中的表达已经显示出提供了另一种用于控制经济上重要的昆虫有害生物的工具。这样的表达该Cry蛋白的转基因植物已经商品化，从而允许农场主减少或增加化学昆虫控制剂的施用。在转基因植物中有用的鞘翅目活性Cry蛋白包括例如Cry3A、Cry3B以及Cry34/Cry35复合物。
尽管表达Cry蛋白的转基因植物的使用是昆虫控制工具箱中的另一种工具，但它仍然易受抗性丧失的影响。现在具有对抗在某些转基因植物中表达的Cry蛋白的抗性的昆虫有害生物是已知的。减少抗性丧失的机会的一个策略是在单个植物中对相同的昆虫有害生物物种“堆叠”具有不同作用方式的转基因性状。目前，通过育种和随后的筛选，经常叠加转基因性状以使多种转基因性状融入单个商业种质。这些育种和筛选步骤对于需要引入这两种性状的各种种质是所希望的。对于许多农学上重要的作物，例如玉米，这两种性状需要作为数十种种质品种的杂种来维持。此外，例如不希望的性状或基因重组的遗传连锁的因素可以使来自两个不同基因座的两种性状进入单个种质品种的引入复杂化。因此，创建携带多种杀昆虫性状的核酸分子是有利的，并且可以在转基因植物的基因组中的单个基因座处引入。这种分子描述于公开WO 2016209360(通过引用并入本文)中。然而，创建用于转基因插入到作物植物中的这种分子不能预期地产生所希望的转基因事件。
植物中外来基因的表达可以被它们的染色体位置所影响，例如，这可能是由于染色质结构和/或转录调节元件的紧密地接近于整合位点(参见，例如，Weising等人,1988,"Foreign Genes in Plants[植物中的外来基因],"Ann.Rev.Genet.[遗传学年度评论]22:421-477)。高质量的转基因事件优选不在基因组的启动子或基因区域中。高质量的转基因事件也不得对转基因植物的农艺学性能产生负面影响。此外，高质量的转基因事件是单个、完整的转基因插入的结果，其中几乎没有转基因重排或没有转基因重排，并且没有受到外源异源DNA(例如来自转化过程中使用的载体主链的DNA)的污染。高质量的转基因事件还优选缺乏潜在可能在转基因植物中表达的所引入的ORF。
因此，通常的做法是产生几百种不同的事件(event)并且筛选这些事件得出单个的事件，该单个的事件具有对于商业目的所希望的分子质量和转基因表达水平和模式。满足可用于商业目的的高质量事件所需的所有标准的鉴定事件被认为是优良事件(eliteevent)。优良事件的特征在于其确切的基因组位置，而该位置决定事件的分子质量、转基因表达水平和农艺学性能。这种优良事件对于使用常规育种方法通过有性异型杂交将其转基因渗入其他遗传背景而言非常有用。这种杂交的子代保持原始转化体的转基因表达特征。该策略可用于产生包含优良事件的无数杂种和品种，并用于确保每种品种和杂种中可靠的转基因表达。
因为特定的优良事件的特征在于其基因组位置，所以能够检测该基因组位置的存在以便确定有性杂交的子代是否含有该优良事件将是有利的。另外，用于检测特定的优良事件的方法有助于遵循条例，这些条例要求例如上市前批准以及衍生于重组作物植物的食品标签。这有可能通过任何熟知的核酸检测方法检测出转基因的存在，该检测方法包括但不限于使用多核苷酸引物的热扩增(聚合酶链式反应(PCR))或者使用核酸探针的DNA杂交。典型地，为了用于检测特定的DNA构建体(该DNA构建体已被用于转化不同的植物品种)的试剂和方法学的简易性和均一性，这些检测方法一般集中于频繁使用的遗传元件上，例如，启动子、终止子以及标记基因，因为对于许多DNA构建体而言，该编码序列区域是可互换的。结果，此类方法对于仅在编码序列上不同的构建体之间进行区分可能是无用的。另外，此类方法对于区分不同事件、特别是使用相同DNA构建体产生的事件是无用的。为了解决这一问题，需要知道与插入的异源DNA邻近的基因组DNA的序列，即侧翼序列。特别地，需要知道侧翼基因组序列和插入的转基因之间的连接序列(junction sequence)。
发明内容
本发明包括昆虫抗性和除草剂耐受性转基因优良事件MZIR098玉米，其已经将包含杀昆虫性状mCry3A(披露于美国专利号7,030,295，其通过引用并入本文)、杀昆虫性状eCry3.1Ab(披露于美国专利号8,309,516，其通过引用并入本文)和除草剂耐受性性状膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)(美国专利号5,531,236、5,646,024、5,648,477和5,276,268，其通过引用并入本文)的转基因并入其基因组中。优良事件MZIR098玉米在其基因组中包含优良事件MZIR098连接序列。本发明进一步包括新颖的分离的核酸序列，即连接序列，其对于优良事件MZIR098是独特的，并且可用于鉴定包含优良事件MZIR098的转基因玉米和用于检测生物样品中来自转基因优良事件MZIR098玉米的核酸。本发明还包括试剂盒，这些试剂盒包含用于检测生物样品中这些核酸所必需的试剂。
本发明涉及命名为MZIR098的优良事件，该优良事件包含新颖的转基因基因型，该转基因基因型包含昆虫抗性基因mCry3A和eCry3.1Ab以及除草剂耐受基因PAT的编码序列。这些基因可用于控制昆虫有害生物，特别是根萤叶甲属(Diabotica)物种昆虫有害生物，并且还向包含此事件的植物及其子代赋予除草剂耐受性，特别是针对谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂除草剂的除草剂耐受性。本发明还提供了包含本发明的基因型的转基因MZIR098玉米植物，来自包含本发明的基因型的转基因玉米植物的种子、细胞和组织，以及通过将包含本发明的MZIR098基因型的玉米近交体与自身或不同基因型的另一种玉米系进行杂交用于产生包含本发明的基因型的转基因MZIR098玉米植物的方法。除了通过本发明的新颖的MZIR098基因型赋予这些玉米植物的特征之外，本发明的转基因MZIR098玉米植物可能基本上具有对应的同基因的非转基因玉米植物的所有形态学及生理学特征。本发明还提供了用于检测来自优良事件MZIR098的核酸的存在的组合物和方法，这是基于插入至该玉米基因组的产生该优良事件MZIR098的重组表达盒的DNA序列，以及位于插入点侧翼的基因组序列的DNA序列。优良事件MZIR098可以通过分析mCry3A、eCry3.1Ab和PAT的基因表达水平或蛋白水平，以及通过测试针对GS抑制剂除草剂(例如草铵膦或双丙氨磷)的功效，或通过测试玉米根虫抗性来进一步表征。
根据一个方面，本发明提供了任选地分离的核酸分子，该核酸分子包含被插入到优良事件MZIR098初始玉米转化体的玉米植物基因组中的异源DNA序列的至少10个连续核苷酸以及位于被插入到优良事件MZIR098初始玉米转化体的玉米植物基因组中的异源DNA序列的插入点侧翼的玉米植物基因组DNA的至少10个连续核苷酸。根据这个方面的任选地分离的核酸分子可以包含被插入到优良事件MZIR098初始玉米转化体的玉米植物基因组中的异源DNA序列的至少20个或至少50个连续核苷酸以及位于被插入到优良事件MZIR098初始玉米转化体的玉米植物基因组中的异源DNA序列的插入点侧翼的玉米植物基因组DNA的至少20个或至少50个连续核苷酸。
根据另一个方面，本发明提供了任选地分离的核酸分子，该核酸分子包含选自由以下组成的组的优良事件MZIR098的至少一个连接序列：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，及其互补序列。连接序列跨越包含被插入到该玉米基因组中的表达盒的异源DNA与来自位于插入点侧翼的玉米基因组的DNA之间的连接，并且对于优良事件MZIR098具有诊断性。
根据另一个方面，本发明提供了任选地分离的核酸，该核酸将异源DNA分子连接至玉米优良事件MZIR098中的玉米植物基因组中，该事件包含选自由以下组成的组的从约11至约20个连续核苷酸的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2，及其互补序列。
根据另一个方面，本发明提供了任选地分离的核酸分子，该核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4，及其互补序列。
根据本发明的另一个方面，提供了包括本发明的核酸分子的扩增子。
根据本发明的仍另一个方面，提供了用于检测优良事件MZIR098的侧翼序列引物。此类侧翼序列引物包含优选地分离的核酸序列，该核酸序列包含来自如SEQ ID NO:8或其互补序列中列出的核苷酸1-1076的至少10-15个连续核苷酸(本文命名为5'侧翼序列)。在这个方面的一个实施例中，侧翼序列引物选自由以下组成的组：SEQ ID NO:10、14、15、16、38、42、65，及其互补序列。
在本发明的另一个方面，侧翼序列引物包含优选地分离的核酸序列，该核酸序列包含来自如SEQ ID NO:9或其互补序列中列出的核苷酸1-1075的至少10-15个连续核苷酸(本文命名为3'侧翼序列)。在这个方面的一个实施例中，侧翼序列引物选自由以下组成的组：SEQ ID NO:19、20、21、36、41、45、67，及其互补序列。
根据本发明的另一个方面，提供了例如对于核酸扩增有用的引物对。此类引物对包含第一引物，该第一引物包含至少10-15个连续核苷酸长度的核苷酸序列，该核苷酸序列是上述基因组侧翼序列(SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9)或与其互补；以及第二引物，该第二引物包含被插入到优良事件MZIR098基因组中的异源DNA的至少10-15个连续核苷酸的核苷酸序列。该第二引物优选地包含核苷酸序列，该核苷酸序列是邻近于如SEQ ID NO:7中列出的植物基因组侧翼DNA序列的插入序列或与其互补。在这个方面的一个实施例中，插入序列引物选自由以下组成的组：SEQ ID NO:11、17、18、22、23、24、29、31、33、34、35、37、43、46、47、48、49、50，及其互补序列。
根据本发明的另一个方面，提供了检测生物样品中对应于优良事件MZIR098的DNA的存在的方法。此类方法包括：(a)将包含DNA的样品与一对引物接触，这对引物在与来自玉米原种事件MZIR098的基因组DNA一起进行核酸扩增反应时，产生对于玉米优良事件MZIR098具有诊断性的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生该扩增子；以及(c)检测该扩增子。在这个方面的一个实施例中，扩增子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，及其互补序列。
根据另一个方面，本发明提供了检测生物样品中对应于优良事件MZIR098的DNA的存在的方法。此类方法包括：(a)将包含DNA的样品与探针接触，该探针在高严格条件下与来自玉米优良事件MZIR098的基因组DNA杂交并且在高严格条件下不与对照玉米植物的DNA杂交；(b)使该样品和探针经受高严格杂交条件；以及(c)检测该探针与该DNA的杂交。所检测的杂交的DNA序列包括至少一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，及其互补序列。
根据本发明的另一个方面，提供了试剂盒用来检测生物样品中的优良事件MZIR098核酸。该试剂盒包括至少一个DNA序列，该DNA序列包含足够长的多核苷酸，该多核苷酸是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或与其互补，其中所述DNA序列作为与来自优良事件MZIR098的分离的DNA杂交的引物或探针是有用的，并且当扩增样品中的核酸序列或与其杂交随后对扩增子或与靶序列的杂交进行检测时，这些引物或探针对于样品中来自玉米优良事件MZIR098的核酸序列的存在具有诊断性。该试剂盒进一步包括使核酸杂交或者扩增方法能够完成所必需的其他材料。
在另一个方面，本发明提供了检测生物样品中玉米优良事件MZIR098蛋白的方法，该方法包括：(a)从玉米优良事件MZIR098组织的样品中提取蛋白质；(b)使用免疫学方法测定所提取的蛋白质，该蛋白质包含对由玉米优良事件MZIR098事件产生的mCry3A、eCry3.1Ab或PAT蛋白具有特异性的抗体；以及(c)检测所述抗体与mCry3A、eCry3.1Ab或PAT蛋白的结合。
在另一个方面，本发明提供了衍生于优良事件MZIR098玉米植物、组织、或种子的生物样品，其中该样品包含核酸，该核酸包含核苷酸序列，该序列是选自由以下组成的组的序列或与其互补：SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2，并且其中在该样品中使用核酸扩增或核酸杂交方法可检测到该序列。在这个方面的一个实施例中，该样品选自由以下组成的组：玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉、以及全部或部分地含有玉米副产物的制造的谷类食品。
在另一个方面，本发明提供了衍生于包含核苷酸序列的优良事件MZIR098玉米植物、组织、或种子的提取物，该序列是选自由以下组成的组的核苷酸序列或与其互补：SEQID NO:1和SEQ ID NO:2。在这个方面的一个实施例中，该序列在该提取物中使用核酸扩增或核酸杂交方法是可检测的。在这个方面的另一个实施例中，该样品选自由以下组成的组：玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉、以及全部或部分地含有玉米副产物的制造的谷类食品。
根据本发明的另一个方面，提供了包含本发明的核酸分子的玉米植物和种子。在本发明的一个实施例中，优良事件MZIR098玉米种子的保藏是根据2017年5月1日的布达佩斯条约(Budapest Treaty)存放到美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)。该种子于2017年5月12日经过测试并被认为是有活力的。所述种子的实例以ATCC登录号：PTA-124143保藏。
根据另一个方面，本发明提供了用于产生具有昆虫抗性和针对GS抑制剂除草剂的除草剂耐受性的玉米植物的方法，该方法包括：(a)将第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，其中该第一或第二亲本玉米植物包含玉米优良事件MZIR098 DNA，从而产生多个第一代子代植物；(b)选择至少对玉米根虫侵染具有抗性的第一代子代植物；(c)使第一代子代植物自交，从而产生多个第二代子代植物；(d)从这些第二代子代植物中选择具有昆虫抗性和针对GS抑制剂除草剂的除草剂耐受性的植物；其中这些第二代子代植物包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
然而根据又另一个方面，本发明提供了用于产生玉米种子的方法，该方法包括将第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物杂交，并且收集得到的第一代玉米种子，其中该第一或第二亲本玉米植物是本发明的近交玉米植物。
根据另一个方面，本发明提供了产生杂交玉米种子的方法，该方法包括以下步骤：(a)种植根据本发明的第一近交玉米系的种子和具有不同基因型的第二近交玉米系的种子；(b)培育从所述种植产生的玉米植物直到开花；(c)将玉米近交系中的一种的玉米植物的花去雄；(d)允许另一种近交系发生授粉，和(e)收获由此产生的杂交种子。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了选择染色体10上包含优良事件MZIR098的核酸分子的玉米植物和种子的方法。在本发明的一个实施例中，使用了多态性标记来选择或跟踪对于优良事件MZIR098具有特异性的序列。本发明提供了选择对于优良事件MZIR098具有特异性的序列的方法，该方法包括以下步骤：(a)检测多态性标记序列；(b)出于检测该标记的目的设计测定；(c)在来自多个玉米系的玉米核酸序列上运行该测定，以及(d)基于具有对优良事件MZIR098具有特异性的核苷酸的序列来选择玉米系。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了确定包含优良事件MZIR098的玉米植物的接合性的方法，该方法包括：(a)从所述玉米植物获得基因组DNA的DNA样品；(b)通过将所述DNA样品与以下进行接触来产生接触的样品：(i)第一事件引物和第二事件引物，其中所述第一事件引物与所述转基因构建体特异性结合，所述第二事件引物与所述5’玉米基因组侧翼DNA或所述3’玉米基因组侧翼DNA特异性结合，并且其中所述第一事件引物和所述第二事件引物在经受定量PCR条件时产生对于事件MZIR098独特的事件扩增子，(ii)至少一个天然插入位点第一引物和至少一个天然插入位点第二引物，其中该第一引物是正向引物，并且该第二引物是反向引物，其中第一引物和第二引物在经受定量PCR条件时共同起作用，以在该基因组中不存在优良事件MZIR098时从该天然MZIR098插入位点产生扩增子，(iii)与所述事件扩增子杂交的荧光事件探针，和(iv)与所述天然插入位点扩增子杂交的荧光天然插入位点探针；(c)使所述接触的样品经受基于荧光的终点定量PCR条件；(d)定量与所述事件扩增子杂交的所述荧光事件探针，并定量与所述天然插入位点扩增子杂交的所述荧光天然插入位点探针；(e)比较杂交的荧光事件探针与杂交的荧光天然插入位点探针的量；以及(f)通过比较杂交的荧光事件探针和杂交的荧光天然插入位点探针的荧光比，确定包含玉米优良事件MZIR098的所述玉米植物的接合性。可以将事件引物组和探针以及天然插入位点引物组和探针与相同的DNA样品混合，或者它们可以与衍生于相同玉米植物的不同DNA样品分开。可能存在不止一种正向天然插入位点引物和/或不止一种反向天然插入位点引物。来自事件探针的荧光和来自天然插入位点探针的荧光的定量可以顺序或同时进行。可以使用数据分析软件(例如，ABI 7900HT上的SDS软件)进行接合性确定，如实例9所述和图2所示。结果指示玉米植物对于优良事件MZIR098是否是纯合的(即，对于事件终点定量PCR具有阳性结果，但对于天然插入位点终点定量PCR不具有阳性结果)、玉米植物对于优良事件MZIR098是否是杂合的(即对于事件和对于天然插入位点终点定量PCR两者都具有阳性结果)、或玉米植物是否是野生型(即对于天然插入位点终点定量PCR具有阳性结果，但对于事件终点定量PCR不具有阳性结果)。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了染色体10上的位点用于靶向整合异源核酸。本发明提供了选择对于优良事件MZIR098具有特异性的序列用于靶向整合的方法，该方法包括以下步骤：(a)基于插入位点或载体序列设计同源序列；(b)在靶基因座处使用这些同源序列；(c)使用靶向的核酸内切酶(例如锌指核酸酶、大范围核酸酶、TALEN或Cas9核酸酶)在靶基因座中创建断裂；以及(d)将异源供体分子插入对优良事件MZIR098具有特异性的核苷酸中。这种技术的实例证明于Shukla等人(Nature[自然],2009,459:437-441，其通过引用并入本文)中。
序列表中序列的说明
SEQ ID NO:1是对于事件MZIR098独特的、5'基因组-插入连接的核酸序列。
SEQ ID NO:2是对于事件MZIR098独特的、3'基因组-插入连接的核酸序列。
SEQ ID NO:3是加上另外的5'侧翼基因组序列的、5'基因组-插入连接的核酸序列。
SEQ ID NO:4是加上另外的3'侧翼基因组序列的、3'基因组-插入连接的核酸序列。
SEQ ID NO:5是对于事件MZIR098独特的、加上5'和3'连接序列的转基因插入的核酸序列。
SEQ ID NO:6是加上另外的5'和3'侧翼基因组序列的、上对于事件MZIR098独特的、加5'和3'连接序列的转基因插入的核酸序列。
SEQ ID NO:7是事件MZIR098的全长转基因插入的核酸序列。
SEQ ID NO:8是MZIR098转基因插入的5’侧翼基因组序列的核酸序列。
SEQ ID NO:9是MZIR098转基因插入的3’侧翼基因组序列的核酸序列。
SEQ ID NO:10-12是可用于检测MZIR098事件的引物和探针序列
SEQ ID NO:13是使用由SEQ ID NO:10-11表示的引物产生的扩增子的核酸序列。
SEQ ID NO:14-52是用于优良事件MZIR098检测和转基因测序的引物和探针序列。
SEQ ID NO:53是MZIR098转基因内的eCry3.1Ab表达盒的eNOS-02增强子的核酸序列。
SEQ ID NO:54是MZIR098转基因内的eCry3.1Ab表达盒的prCMP-04启动子的核酸序列。
SEQ ID NO:55是MZIR098转基因内的eCry3.1Ab表达盒的eCry3.1Ab编码序列(其编码工程化的杀昆虫蛋白)的核酸序列。
SEQ ID NO:56是MZIR098转基因内的eCry3.1Ab表达盒的tNOS-05-01终止子的核酸序列。
SEQ ID NO:57是MZIR098转基因内的mCry3A表达盒的prUbi1-18启动子的核酸序列。
SEQ ID NO:58是MZIR098转基因内的mCry3A表达盒的mCry3A编码序列(其编码工程化的杀昆虫蛋白)的核酸序列。
SEQ ID NO:59是MZIR098转基因内的mCry3A表达盒的tNOS-20终止子的核酸序列。
SEQ ID NO:60是MZIR098转基因内的PAT表达盒的pr35S-04-01启动子的核酸序列。
SEQ ID NO:61是MZIR098转基因内的PAT表达盒的cPAT-08编码序列(其编码赋予针对GS抑制剂除草剂的耐受性的PAT蛋白)的核酸序列。
SEQ ID NO:62是MZIR098转基因内的eCry3.1Ab表达盒的核酸序列。
SEQ ID NO:63是MZIR098转基因内的mCry3A表达盒的核酸序列。
SEQ ID NO:64是MZIR098转基因内的PAT表达盒的核酸序列。
SEQ ID NO:65-69是当终点接合性测定中不存在MZIR098时可用于MZIR098插入位点(也称为天然插入位点)的检测的引物和探针序列。
SEQ ID NO:70是AC204437.3染色体10序列，其中N是任何碱基“A”、“T”、“G”或“C”。这个序列包括MZIR098插入位点的染色体位置。
SEQ ID NO:71是SEQ ID NO:70的反向互补序列：AC204437.3染色体10序列，其中N是任何碱基“A”、“T”、“G”或“C”。
附图说明
图1(Figure 1、Fig.1)是一个绘制的图谱，该图说明了元件的结构，这些元件包括被插入到玉米的基因组中以创建优良事件MZIR098的异源核酸序列，并且列出了相对位置，在这些位置处这些插入的核酸序列被连接到玉米基因组DNA序列上，这些玉米基因组DNA序列位于这些插入的异源DNA序列的末端的侧翼；并且还说明了包含转基因和侧翼基因组序列两者的核酸序列的连接序列的位置。数字指示序列根据其序列鉴定号(SEQ ID NO)的图形表示。因此，“1”是SEQ ID NO:1的图形表示，“2”表示SEQ ID NO:2，“3”表示SEQ ID NO:3，“4”表示SEQ ID NO:4，“5”表示SEQ ID NO:5，“6”表示SEQ ID NO:6，“7”表示SEQ ID NO:7，“8”表示SEQ ID NO:8，“9”表示SEQ ID NO:9，并且数字“53”至“64”分别表示SEQ ID NO:53至SEQ ID NO:64。“8”和“9”的灰色区域指示侧翼基因组序列。“53”-“61”的白色区域指示转基因插入。
图2(Figure 2、Fig.2)是来自FAM(Y轴)的信号(来自作为转基因插入的事件特异性等位基因(ESA)的信号)和来自TET(X轴)的信号(来自天然插入等位基因(WT等位基因；转基因的基因组位置，但不存在转基因)测定的信号)的强度的图。点或圆点来自PCR的40个循环后约90个样品的每个样品的最终读数。左上象限中的簇来自纯合植物(HOM)，因为不存在TET(WT等位基因)信号。右下方的簇来自无效植物(无效(NULL))，因为不存在FAM(ESA)信号。杂合子(HET)位于右上方之间，因为它们都具有来自两种测定的信号。象限位置以及组或簇之间的间隔，可根据其位置进行接合性调用。图2是实例9中产生的数据的表示。
具体实施方式
本发明上述以及其他方面将从以下详细说明中变得更清楚。
提供了以下定义和方法以更好地定义本发明并且指导本领域的普通技术人员实施本发明。除非另外说明，本文使用的术语应该根据相关领域的那些一般技术人员的常规用法来理解。分子生物学中的一般术语的定义也可在Rieger等人，Glossary of Genetics:Classical and Molecular[遗传学词汇表：标准和分子]，第5版，Springer-Verlag:NewYork[施普林格出版社：纽约]，1994中找到。
如本文使用的，术语“扩增的”意指使用至少一种核酸分子作为模板，构建核酸分子的多个拷贝或与该核酸分子互补的多个拷贝。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链式反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，安大略省密西索加的坎基尼公司(Cangene，Mississauga，Ontario))、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)、以及链置换扩增(SDA)。参见例如Diagnostic Molecular Microbiology:Principles andApplications[诊断分子微生物学：原理与应用]，D.H.Persing等人编著，AmericanSociety for Microbiology[美国微生物学会]，Washington,D.C.[华盛顿特区](1993)。扩增产物被称为扩增子。
“生物样品”是植物、植物材料或包含植物材料的产品。术语“植物”旨在涵盖玉米(玉蜀黍)植物组织(处于任何成熟阶段)，以及从任何一个这样的植物取得或衍生于其的细胞、组织、器官，包括但不限于任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。如本文使用的，“植物材料”是指从植物获得或衍生于植物的材料。包含植物材料的产品涉及食物、饲料或使用植物材料来产生的或可以被植物材料污染的(contaminated)其他产品。生物样品可能是压碎的、无活力的材料。生物样品可以衍生于商品产品，例如玉米商品产品。玉米，也称为玉蜀黍，被用作人类食品、牲畜饲料和工业原料。除人类食用玉蜀黍籽粒外，玉蜀黍的食物用途还包括干磨工业和湿磨工业两者的产品。玉蜀黍干磨的主要产品是糁、粉和面。玉蜀黍湿磨工业可提供玉蜀黍淀粉、玉蜀黍糖浆和用于食物用途的右旋糖。从玉蜀黍胚芽中回收玉蜀黍油，玉蜀黍胚芽是干磨工业和湿磨工业的副产物。
玉米商品产品典型地衍生于颗粒(衍生于玉米穗)。玉米商品产品也可能衍生于玉米植物的非颗粒部分。如本领域熟知的，可以采用许多不同的工业过程来提取或利用这些植物产品。玉米商品产品包括玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉、以及全部或部分地含有玉米副产物的制造的谷类食品。玉米商品产品可以是衍生于玉米种子的压碎的、无活力的材料(但不能再发芽)。玉米(包括植物的颗粒和非颗粒部分)也广泛用作牲畜饲料，主要用于肉牛、奶牛、猪和家禽。玉蜀黍的工业用途包括产生乙醇、湿磨工业中的玉蜀黍淀粉和干磨工业中的玉蜀黍粉。玉蜀黍淀粉和面粉的工业施用是基于功能特性，例如粘度、成膜性、粘合特性和悬浮颗粒的能力。玉蜀黍淀粉和面粉已在造纸和纺织工业中应用。其他工业用途包括在粘合剂、建筑材料、铸造黏结剂、洗衣淀粉、炸药，油井泥中的应用，以及其他采矿应用。除玉蜀黍粒以外的植物部分也用于工业：例如，将茎和外壳制成纸张和墙板，并将穗轴用作燃料和制作木炭。
生物提取物或“提取物”可衍生于生物样品或玉米商品产品。生物提取物来自压碎的生物材料，并且不再具有活力或不能再发芽。应当理解的是在本发明的上下文中，针对对于玉米优良事件MZIR098具有特异性的核酸的存在(暗示样品中核酸的存在)来测试此类生物样品或提取物。因此，本文提到的用来鉴定生物样品或提取物中的优良事件MZIR098的方法涉及鉴定生物样品或提取物中的核酸，这些核酸来自优良事件MZIR098玉米植物并且对于优良事件MZIR098具有诊断性。
“编码序列”是转录成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA)的核酸序列。优选地，RNA进而在生物中被翻译以产生蛋白质。
如本文使用的“检测试剂盒”是指用来检测样品中来自玉米优良事件MZIR098植物的DNA的存在或不存在的试剂盒，该试剂盒包含本发明的核酸探针和引物(它们在高严格条件下特异性地与靶DNA序列杂交)以及使核酸杂交或者扩增方法能够完成所必需的其他材料。
如本文使用的“表达盒”意指能够在适当的宿主细胞中指导特定核苷酸序列的表达的核酸分子，该表达盒包含可操作地连接到目的核苷酸序列(其可操作地连接到终止信号上)上的启动子。它还典型地包含适当翻译该核苷酸序列所需要的序列。表达盒还可以包含在指导目的核苷酸序列表达中不需要的序列，但是其因为用于将表达盒从表达载体移除的方便的限制性位点而存在。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着至少一个它的组分相对于至少一个它的其他组分是异源的。该表达盒还可以是天然存在的但已经是以对于异源表达有用的重组形式而获得的表达盒。然而，典型地，该表达盒相对于宿主来说是异源的，即表达盒的特定核酸序列在宿主细胞中不是天然存在的，并且必须已经通过本领域已知的转化方法引入至宿主细胞或宿主细胞的祖先中。在该表达盒中核苷酸序列的表达可以是在组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，该启动子只有当该宿主细胞暴露于一些特定的外界刺激时才引发转录。在多细胞生物(例如植物)的情况下，该启动子对于特定组织、或器官、或者发育阶段也可以是特异的。当被转化进植物中时，表达盒或其片段也可被称为“插入的序列”或者“插入序列”。
“基因”是位于基因组内的限定区域，并且除了前述的编码核酸序列之外，它还包括其他负责控制该编码部分的表达(也就是转录和翻译)的主要调节性核酸序列。基因还可以包含其他5'和3'未翻译序列和终止序列。另外的可能存在的元件是例如内含子。
“目的基因”是指当转移至植物时，在该植物上赋予所希望的特征(例如抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其他有害生物的抗性、除草剂耐受性、改进的营养价值、改进的工业过程的性能或者改变的繁育能力)的任何基因。“目的基因”还可以是被转移至植物用于在该植物中产生商业上有价值的酶或代谢物的基因。
如本文使用的“基因型”是由亲本玉米植物遗传的遗传材料，并不是所有这些遗传材料都必然地表达在后代玉米植物中。MZIR098基因型是指转化入植物基因组中的异源遗传材料以及位于插入序列侧翼的遗传材料。
“MZIR098-特异性”是指适合于在植物、植物材料或产品中(例如但不限于，包含植物材料或衍生于植物材料的食物或饲料产品(新鲜或加工的))区分地鉴定优良事件MZIR098的核苷酸序列。
“插入DNA”或“插入序列”是指表达盒内用于转化植物材料的异源DNA。插入DNA衍生于T-DNA，其包含于农杆菌介导的植物转化中使用的二元载体中。“侧翼DNA”或“侧翼序列”可以存在于生物(例如植物)中天然存在的基因组DNA中，或通过转化过程所引入的外来(异源)DNA(其对于例如与转化事件相关联的片段的原始插入DNA分子来说是外源的)中。如本文使用的，侧翼序列是指至少10bp、至少20bp、至少50bp、至少100bp、至少150bp、至少200bp、至少250bp、至少300bp、至少400bp、至少500bp、至少1000bp、至少2000bp、至少3000bp、至少4000bp、和至少5000bp的序列，该序列位于紧邻原始外来插入DNA分子的上游和邻接处、或紧邻原始外来的插入DNA分子的下游和邻接处。导致外来DNA的随机整合的转化程序将产生含有对于每个转化体特有的且可能独特的侧翼区域的转化体。当通过传统杂交将重组DNA引入植物时，其侧翼序列通常不会改变。转化体还将在一个异源插入DNA片段和基因组DNA片段之间、或两个基因组DNA片段之间、或两个异源DNA片段之间含有独特的连接。“连接”是两个特定DNA片段连接处的点。例如，在插入DNA连接侧翼DNA处存在连接。连接点还存在于转化的生物中，其中两个DNA片段以从天然生物中发现的方式修饰的方式而连接在一起。“连接DNA”或“连接序列”是指包含连接点的DNA。本披露中列出的两个连接序列是如SEQ ID NO:1中列出的玉蜀黍基因组DNA与插入物的5'末端之间的连接点，以及如SEQID NO:2中列出的插入物的3’末端与玉蜀黍基因组DNA之间的连接点。事件可以由其连接序列定义。这些连接序列可以通过传统杂交传递给子代并渗入其他种质。
术语“事件”是指包括所事件的异源DNA和/或子代的原始转化体。更普遍地，术语“事件”是指人工遗传基因座或基因型，该人工遗传基因座或基因型由于遗传工程化(例如转化)而携带外来插入的DNA或转基因(包含至少一个目的基因的至少一个拷贝)，并且还包含与插入的DNA紧邻的侧翼基因组序列，将期待插入的DNA转移到由于包含插入的DNA的一个亲本系(例如原始转化体和由自交产生的子代)与不含有该插入的DNA的亲本系的有性杂交而接收了包括目的转基因的插入的DNA的子代中。该事件包含连接序列和可以称为转基因或T-DNA插入的外来插入的DNA。细胞中事件的存在可以通过其连接序列进行基因型鉴定。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。
术语例如“事件MZIR098植物”、“MZIR098植物”、“优良事件MZIR098植物”或“事件MZIR098玉米”是指包含MZIR098事件的玉米植物。事件MZIR098植物可以指原始转化体的子代。术语“事件MZIR098植物”还是指由事件MZIR098植物与另一玉米系之间进行有性异型杂交而产生的子代。即使在与轮回亲本反复回交后，插入的DNA、基因组侧翼DNA和来自原始转化的植物的连接序列也存在于杂交子代中相同的染色体位置。类似地，“MZIR098种子”是指包含MZIR098事件的种子。
“优良事件”包括商业用途所需事件的所有所希望的特征。优良事件包含转基因的一个且只有一个完整的拷贝，而不含载体主链序列。将转基因插入基因组中所希望的位置，除其他特征外，这还易于渗入所希望的商业遗传背景中。优良事件的转基因的基因组位置也允许包含转基因的性状的正确表达。优良事件中转基因性状的表达在杂合(或半合)和纯合条件下都是正确、适当和空间和时间稳定的；在一系列环境条件下(其中携带该事件的植物很可能暴露于正常的农艺学用途中)处于商业上可接受的水平；并在多代子代中保持稳定。优良事件的转基因也显示出正常的孟德尔分离。优良事件具有所希望的农艺学特性(例如产率、活力、生育力等)，而不受事件在植物基因组中的存在的不利影响。优良事件具有出色的功效组合，包括在广泛的基因型背景下以及在多个环境位置中的除草剂耐受性和农艺学性能。通过将优良事件渗入不同的相关遗传背景并遵守上述标准，可以确认事件的状态为优良事件。“优良事件”可以是指包含外来DNA作为转基因的遗传基因座，其满足上述标准。植物、植物材料或子代(例如种子)可以在其基因组中包含一个或多个优良事件。在事件中具有所有这些特征的可能性很小，因此优良事件是非显而易见的且非典型的从转换过程中恢复的事件。优良事件只能通过广泛的选择程序发现。
携带优良事件MZIR098的植物的特征在于它们的昆虫抗性，特别是针对根萤叶甲属物种的抗性，以及针对GS抑制剂(例如草铵膦或双丙氨磷)的耐受性。包含优良事件MZIR098的玉米植物可用于控制鞘翅目昆虫有害生物，包括西方玉米根虫(Diabroticavirgifera virgifera，western corn rootworm)、墨西哥玉米根虫(D.virgifera zeae,Mexican corn rootworm)、以及北方玉米根虫(D.longicornis barberi,northern cornrootworm)。在没有施用除草剂或没有昆虫有害生物压力的情况下，携带优良事件MZIR098的植物的特征还在于具有与可商购的玉米品种相当的农艺特性。因此，与缺少事件MZIR098的同基因系相比，包含优良事件MZIR098的植物可以耐受GS抑制剂除草剂的施用而不会负面影响所述植物的产率。此外，与不含MZIR098事件的同基因玉米植物相比，包含优良事件MZIR098的玉米植物在疾病易感性或倒伏方面没有统计学上的显著差异。这些特征使优良事件MZIR098对于控制玉米的根萤叶甲属物种昆虫有害生物(特别是西方玉米根虫)以及控制玉米田中草甘膦抗性的杂草非常有用。因为mCry3A和eCry3.1Ab提供两种作用方式，所以优良事件MZIR098也可以用于IRM方法中，以预防或延迟昆虫有害生物对mCry3A或eCry3.1Ab的抗性发展。
“异源”核酸序列是天然地不与将该核酸序列引入其中的宿主细胞相关联的核酸序列，包括天然存在的核酸序列的非天然存在的多拷贝。
“同源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞天然相关联的核酸序列。
当涉及核酸使用时，术语“分离的”是指从至少一个污染物核酸中被鉴定并且分离出来的核酸序列，该污染物核酸通常是以其天然来源与该核酸序列相关联的。分离的核酸是以与其在自然界中发现的不同的形式或设置而存在的。相反，非分离的核酸(例如DNA和RNA)是在自然界中存在的状态下发现的。分离的核酸可以位于转基因植物或生物样品中，并且仍然被认为是“分离的”。
“可操作地连接”是指在单个核酸片段上多个核酸序列的关联，使得一个的功能影响另一个的功能。例如，当启动子能够影响编码序列或功能RNA的表达时(即，该编码序列或功能RNA处于该启动子的转录控制之下)，则该启动子与该编码序列或功能RNA是可操作地连接的。正义方向或者反义方向的编码序列能够与调节序列可操作地连接。
用于鉴定优良事件或包含优良事件的植物或植物材料、或含有包含优良事件的植物材料的产品的所开发的工具是基于优良事件的特定基因组特征，例如，包含插入的DNA、分子标记或插入的DNA的一个或多个侧翼区域的序列的基因组区域的特定限制性图谱。
一旦对插入的DNA的一个或两个侧翼区域或转基因进行了测序，就可以开发引物和探针，这些引物和探针可以通过分子生物学技术的方式特异性识别样品的核酸(DNA或RNA)中的该(这些)序列。例如，可以开发PCR方法以鉴定生物样品(例如植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品)中的优良事件。这种PCR基于至少两个特异性“引物”，一个识别优良事件的5'或3'侧翼区域内的序列，而另一个识别外来DNA内的序列。引物优选具有15至35个核苷酸的序列，该序列在优化的PCR条件下分别“特异性识别”优良事件的5'或3'侧翼区域和优良事件的外来DNA内的序列，使得将特异性片段(“整合片段”或区分性扩增子)从包含该优良事件的核酸样品中扩增。这意味着在优化的PCR条件下仅扩增了靶向的整合片段，而没有扩增植物基因组或外来DNA中的其他序列。
如本文使用的“引物”是分离的核酸，它们通过核酸杂交被退火为互补靶DNA链，以在该引物与该靶DNA链之间形成杂交体，然后通过聚合酶(例如DNA聚合酶)沿着该靶DNA链延伸。引物对包含“正向”引物和“反向”引物。多对或多组引物可以用于核酸分子的扩增，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或者其他常规的核酸扩增方法。
适用于鉴定优良玉米事件MZIR098的PCR引物可能是以下：
a)长度在17bp至约200bp的范围内的寡核苷酸，其包含选自5'侧翼序列(SEQ IDNO:8)中的DNA的至少17个连续核苷酸(优选20个连续核苷酸)的核苷酸序列，使得该引物识别该5'侧翼序列；或
b)长度在17bp至约200bp的范围内的寡核苷酸，其包含选自3'侧翼序列(SEQ IDNO:9)中的DNA的至少17个连续核苷酸(优选20个连续核苷酸)的核苷酸序列，使得该引物识别该3'侧翼序列；或
c)长度在17bp至约200bp的范围内的寡核苷酸，其包含选自转基因(SEQ ID NO:7)中的DNA的至少17个连续核苷酸(优选20个连续核苷酸)的核苷酸序列，使得该引物识别该转基因。
引物当然可以比提到的17个连续核苷酸更长，并且可以例如20、21、22、23、24、25、30、35、50、75、100、150、200bp长或甚至更长。引物可以完全由选自侧翼序列和转基因DNA序列的提到的核苷酸序列组成。然而，引物在其5'末端(即在3'-定位的17个连续核苷酸之外)处的核苷酸序列不太关键。因此，引物的5'序列可以包含选自侧翼序列或外来DNA的核苷酸序列或由其组成，(适当时)但是可以含有若干个(例如1、2、5或10个)错配。引物的5'序列甚至可以完全是与侧翼序列或外来DNA无关的核苷酸序列，例如代表一个或多个限制性酶识别位点的核苷酸序列。此类具有错配的无关序列或侧翼DNA序列应优选不超过100个核苷酸，更优选不超过50或25个核苷酸。
此外，合适的引物可以包含跨越植物DNA衍生的序列和插入的DNA序列之间的连接区域的核苷酸序列(SEQ ID NO:1和2)、由其组成或基本上由其组成。本领域技术人员将立即清楚，适当选择的PCR引物对也不应包含彼此互补的序列。
用于检测或鉴定优良事件MZIR098的合适引物的实例包括SEQ ID NO:10、11、14至52及其互补序列。用于检测或鉴定优良事件MZIR098的合适的寡核苷酸引物的其他实例包括SEQ ID NO:7、8和9及其互补序列的至少10个连续核苷酸。本领域普通技术人员将理解，对于对玉米优良事件MZIR098具有诊断性的引物组，所得扩增子必须包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
“探针”是分离的核酸分子，其上附接常规的可检测的标记或报道分子，例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。这种探针与靶核酸的一条链互补，在本发明的情况下，与来自玉米优良事件MZIR098的基因组DNA的一条链互补。优良事件MZIR098的基因组DNA可以来自玉米植物或样品，该玉米植物或样品包括来自该事件的DNA。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括与靶DNA序列特异性结合并且可以用来检测靶DNA序列的存在的聚酰胺类以及其他探针材料。
探针和引物的长度通常为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、或500个或更多个多核苷酸。此类引物和探针在高严格杂交条件下与靶序列特异性杂交。根据本发明的引物和探针可能具有与该靶序列互补的完整序列，虽然与该靶序列不同并保留与该靶序列杂交的能力的探针可通过常规方法进行设计。
“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针与其靶序列杂交的程度比它与其他序列杂交的程度可检测地更高的条件。严格条件是靶序列依赖的，并将取决于多核苷酸的结构而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，能够鉴定与该探针(同源探测)100％互补的靶序列。可替代地，可调整严格条件以允许序列中的一些错配，使得检测到更低程度的相似性(异源探测)。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导见于以下文献中：Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes[生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交]第2章第I部分“Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid probe assays[杂交原理和核酸探针测定的策略综述]”Elsevier[爱思唯尔集团],纽约；和Current Protocols in Molecular Biology[现代分子生物学实验技术],第2章,Ausubel等人编,Greene Publishing and Wiley-Interscience:New York[格林出版公司和威利交叉科学公司：纽约](1995)，以及Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验手册](第5版ColsSpring Harbor Laboratory[冷泉港实验室出版社],Cold Spring Harbor[冷泉港],NY[纽约州])。
特异性典型地取决于杂交后的洗涤，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。通常，高严格杂交和洗涤条件在限定的离子强度和pH下被选定为比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针进行杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。典型地，在高严格调节下，探针将与其靶子序列杂交，而不与其他序列杂交。
针对互补核酸(它们在DNA或RNA印迹中在滤纸上具有超过100个互补的残基)的杂交的高严格杂交条件的实例是具有1mg肝素的50％甲酰胺、在42℃、将该杂交过夜进行。非常高严格洗涤条件的实例是0.15M NaCl，在72℃持续约15分钟。高严格洗涤条件的实例是在65℃以0.2x SSC洗涤持续15分钟(参见Sambrook，下文，针对SSC缓冲液的描述)。
本发明的示例性杂交条件包括在7％SDS、0.25M NaPO4(pH 7.2)、67℃条件下杂交过夜；然后在5％SDS、0.20M NaPO4(pH 7.2)、65℃条件下洗涤两次，每次30分钟；并在1％SDS、0.20M NaPO4(pH 7.2)、65℃条件下洗涤两次，每次30分钟。对于例如多于100个核苷酸的双链体的示例性中严格洗涤是在45℃以1x SSC持续15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双链体的低严格洗涤的实例是在40℃以4-6x SSC持续15分钟。
对于约10至50个核苷酸的探针，高严格条件典型地涉及在pH7.0至8.3下小于约1.0M Na离子的盐浓度，典型地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐类)，并且温度典型地是至少约30℃。高严格条件还可以通过添加去稳定剂(例如甲酰胺)来实现。一般而言，在特定的杂交测定中相比于不相关的探针观察到的高出2x(或更高)的信噪比表明检测到特异性杂交。如果它们编码的蛋白质基本相同，则在高严格条件下彼此不杂交的核酸仍然是基本上相同的。例如，当使用遗传密码允许的最大程度的密码子简并而创建核酸的拷贝时，则发生这种情况。
以下是可以用于杂交核苷酸序列的杂交/洗涤条件的示例性设置，这些杂交核苷酸序列与本发明的参考核苷酸序列是基本上相同的：参考核苷酸序列在以下条件下优选地与该参考核苷酸序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在2X SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在1X SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；仍更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在0.5X SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在0.1X SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；更优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA中在50℃，并且在0.1X SSC、0.1％SDS中在65℃洗涤。本发明的这些序列可以使用所有以上条件进行检测。出于定义本发明的目的，使用了高严格条件。
如本文使用的，“扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板的一部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定由有性杂交产生的玉米植物是否含有来自本发明的玉米植物的转基因事件基因组DNA，可以使用DNA引物对(其包括衍生于与插入的异源DNA的插入位点邻近的侧翼序列的第一引物，和衍生于插入的异源DNA的第二引物)对从玉米植物组织样品中提取的DNA进行核酸扩增方法，以产生对事件DNA的存在具有诊断性的扩增子。可替代地，第二引物可衍生于侧翼序列。扩增子具有一定长度，并具有也对该事件具有诊断性的序列。扩增子的长度范围可以在从引物对加上一个核苷酸碱基对的总长度到由DNA扩增方案产生的扩增子的任何长度，和/或引物对加上大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、或500、750、1000、1250、1500、1750、2000个或更多个多核苷酸的总长度，加上或减去任何上面列出的增量。可替代地，引物对可衍生于插入DNA两侧的侧翼序列，以产生包括转基因的整个插入核苷酸序列以及位于转基因插入物侧翼的序列的扩增子。衍生于侧翼序列的引物对的成员可以位于距插入的DNA序列一段距离，该距离的范围可以从一个核苷酸碱基对直至扩增反应的极限、或约20,000bp。术语“扩增子”的使用特别排除引物二聚体。
TaqMan(赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)被描述为检测和定量DNA序列的存在的方法，并且在制造商提供的说明中已得到充分理解。简而言之，设计FRET寡核苷酸探针，该探针与侧翼和插入DNA连接重叠。FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)在热稳定的聚合酶和dNTP的存在下循环。FRET探针的杂交(Flybridization)导致荧光部分的裂解和释放，使其远离FRET探针上的淬灭部分。荧光信号指示由于成功的扩增和杂交，侧翼/转基因插入序列的存在。该荧光信号可以被量化。
“转化”是用于将异源核酸引入到宿主细胞或生物的方法。特别地，“转化”意指DNA分子稳定地整合到目的生物的基因组中。
“转化的/转基因的/重组的”是指异源核酸分子已经引入其中的宿主生物例如细菌或植物。核酸分子能够被稳定地整合进入宿主的基因组中或者核酸分子也能作为染色体外的分子而存在。这种染色体外分子能够自主复制。转化的细胞、组织或植物应当理解为不仅涵盖转化过程的终产物，而且涵盖其转基因子代。“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指不含该异源的核酸分子的野生型生物，例如细菌或植物。如本文使用的，“转基因的”是指植物、植物细胞、或多个具有结构或没有结构的植物细胞，这些细胞通过熟知的基因操作和基因插入技术已将代表目的基因的核酸整合进植物基因组中，并典型地整合进细胞核的染色体中、线粒体或其他包含染色体的细胞器中(在与天然植物或植物细胞中正常存在的基因座不同的基因座处或以多于在天然植物或植物细胞中正常存在的拷贝数)。转基因植物来自此类核酸序列的操作和插入(与天然发生的突变相反)，以产生非天然发生的植物或具有非天然发生的基因型的植物。植物和植物细胞的转化技术在本领域中是熟知的，并可能包含例如电穿孔、显微注射、农杆菌介导的转化、以及基因枪转化(ballistictransformation)。
本文使用了如在37C.F.R.§1.822中对于DNA碱基和氨基酸给出的命名法。
本发明涉及遗传改进的玉米系，该玉米系提供了用于控制玉米根虫(根萤叶甲属物种)的双重作用模式，并耐受含有GS抑制剂(例如草铵膦)的除草剂。两种杀昆虫性状基因即mCry3A和eCry3.1Ab的存在提供了双重作用模式。除草剂耐受性性状基因PAT的存在提供了除草剂耐受性，该基因编码膦丝菌素乙酰转移酶并且衍生于绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)。本发明特别涉及被命名为优良事件MZIR098(包含新颖的基因型)的优良转基因玉米事件，以及用于检测在生物样品中的来自该事件的核酸的组合物和方法。本发明进一步涉及包含优良事件MZIR098基因型的玉米植物、来自这些玉米植物的转基因种子、以及用于通过将包含该优良事件MZIR098基因型的玉米近交体与其自身或与另一种玉米系进行杂交而产生包含该优良事件MZIR098基因型的玉米植物的方法。包含本发明的优良事件MZIR098基因型的玉米植物可用作昆虫有害生物管理的一部分和杂草控制程序的一部分，因为这些玉米植物具有针对GS抑制剂的除草剂耐受性。
本发明体现了玉米新颖基因型，其是通过农杆菌介导的转化将转基因随机插入玉米植物基因组中的结果。据本领域的认识，不能预测这种插入的基因组位置。本发明涵盖特定新颖基因型和新颖序列，即SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5或SEQ ID NO:6，及其互补序列，这些特定新颖基因型和新颖序列事是新颖的并且对于优良事件MZIR098具有诊断性。此外，本发明披露了包含优良事件MZIR098的玉米植物，该事件的实例以ATCC登录号PTA-124143保藏。包含优良事件MZIR098的玉米植物在其基因组内含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、以及SEQ ID NO:5。此外，本发明涵盖处于特定多核苷酸分子形式的特定工具，这些工具能够鉴定玉米基因组中其特定插入位点处的转基因插入。
本发明包含分子叠加，该分子叠加包含具有mCry3A，eCry3.1Ab和PAT编码序列的表达盒。本发明相比可以包含相同三个性状的育种叠加具有许多优点。包含育种叠加的植物将包含作为两个或可能单个事件存在的三个性状，使得该植物的基因组具有两个或可能三个分开的转基因插入。这种植物的创建在技术上可能会很复杂，因为需要将两个亲本进行杂交，其中每个亲本都含有事件的至少一个拷贝，并且需要针对每种性状的存在对子代进行筛选。此外，由于每个事件都存在于不同的基因组位置，因此需要评估得到的植物的农艺学和性状性能，以确保基因组中两个或可能三个插入的存在不会造成有害影响。此外，需要针对每个性状的存在对包含育种叠加的植物的子代进行筛选。最后，需要对希望进行育种叠加的每个玉米品种或种质进行这种程序。本发明通过将所有性状作为分子叠加，使得将它们一起直接地插入基因组中来解决这些问题。分子叠加还可以在多个种质中的性状表达提供更高的稳定性，因为这些性状在单个基因组基因座处一起插入，并且因此无论引入何种种质都具有相同的位置效应。
在一个实施例中，本发明涵盖优良事件MZIR098玉米植物的转基因玉米种子。所述种子的实例以ATCC登录号PTA-124143保藏。优良事件MZIR098的转基因种子、转基因植物、转基因细胞和转基因组织包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6及其互补序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸分子。这些序列定义了被插入到该玉米优良事件MZIR098的玉米植物基因组中的异源DNA序列的插入点。本发明进一步包含能够产生优良事件MZIR098诊断性扩增子的优良事件MZIR098的转基因玉米植物、转基因种子、转基因细胞和转基因组织，其中所述诊断性扩增子在严格条件下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、或SEQ ID NO:4杂交。本发明进一步包含转基因的昆虫抗性和除草剂耐受性植物、细胞、种子、组织或其子代，其包含：包含三个表达盒的DNA构建体，其中处于可操作地连接的所述第一表达盒包含：(i)由SEQ ID NO:53表示的NOS增强子；(ii)由SEQ ID NO:54表示的CMP启动子；(iv)由SEQ ID NO:55表示的工程化的杀昆虫蛋白eCry3.1Ab编码序列；以及(v)由SEQ ID NO:56表示的NOS转录终止子；并且其中处于可操作地连接的所述第二表达盒包含(i)由SEQ ID NO:57表示的玉蜀黍Ubi1启动子；(ii)由SEQ ID NO:58表示的工程化的杀昆虫蛋白mCry3A编码序列；以及(iii)由SEQ ID NO:59表示的转录终止子；并且其中处于可操作地连接的所述第三表达盒包含(i)由SEQ ID NO:60表示的CaMV 35S启动子；(ii)由SEQ ID NO:61表示的PAT编码序列；以及(iii)由SEQ ID NO:56表示的NOS转录终止子，其中与玉米基因组DNA和构建体的5'侧翼之间的连接重叠的序列包含SEQ ID NO:1，并且玉米基因组DNA和构建体的3'侧翼之间的重叠连接包含SEQ ID NO:2，并且其中该DNA构建体存在于美国典型培养物保藏中心(ATCC)以登录号PTA-124143保藏的玉米优良事件MZIR098中。
在另一个实施例中，本发明涵盖优选地分离的核酸分子，该核酸分子包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，及其互补序列。在另一个实施例中，本发明涵盖任选地分离的核酸分子，其中该核酸分子包含在以ATCC登录号PTA-124143保藏的玉米种子中。在另一个实施例中，本发明包括分离的核酸分子，该核酸分子包含：a)SEQ ID NO:1；b)在步骤(a)的所述序列的3'末端与包含SEQ ID NO:62的表达盒可操作地连接(eNOS-02:prCMP-04:eCry3.1Ab:tNOS-05-01)；c)在步骤(b)的所述盒的3'末端且以相同方向与包含SEQ ID NO:63的表达盒可操作地连接(prUbi1-18:mCry3A:tNOS-20)；d)在步骤(c)的所述盒的3'末端且以相同方向与包含SEQ ID NO:64的表达盒可操作地连接(pr35S-04-01:cPAT-08:tNOS-05-01)；以及e)在步骤(d)的所述盒的3'末端与SEQ ID NO:2可操作地连接。
在一个实施例中，本发明涵盖任选地分离的核酸分子，该核酸分子包含被插入到玉米优良事件MZIR098的玉米植物基因组中的异源DNA序列的至少10个或更多个(例如15、20、25、或50个)连续核苷酸以及位于被插入到玉米优良事件MZIR098的玉米植物基因组中的异源DNA序列的插入点的侧翼的玉米植物基因组DNA的至少10个或更多个(例如，15、20、25、或50个)连续核苷酸。还包括核苷酸序列，这些核苷酸系列包含来自优良事件MZIR098的连续插入序列的10个或更多个核苷酸以及来自邻近该插入序列的优良事件MZIR098的侧翼DNA的至少一个核苷酸。此类核苷酸序列对优良事件MZIR098具有诊断性。来自优良事件MZIR098的基因组DNA的核酸扩增可产生包含此类诊断性核苷酸序列(即SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及其互补序列)的扩增子。
在另一个实施例中，本发明涵盖优选地分离的核酸序列，该核酸序列含有包含选自由以下组成的组的优良事件MZIR098的至少一个连接序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及其互补序列，其中连接序列跨越被插入到该玉米基因组中的异源表达盒与来自位于该插入位点侧翼的玉米基因组的DNA之间的连接，并且对于该事件具有诊断性。在另一个实施例中，本发明包含与玉米优良事件MZIR098有关的核酸分子，其特征在于它由SEQ ID NO:1的序列组成。在另一个实施例中，本发明包含与玉米优良事件MZIR098有关的核酸分子，其特征在于它由SEQ ID NO:2的序列组成。在另一个实施例中，本发明包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2用于鉴定植物中的玉米优良事件MZIR098的用途。
在另一个实施例中，本发明涵盖将异源DNA分子与玉米优良事件MZIR098中的玉米植物基因组连接的核酸，该事件包含选自由以下组成的组的从约11至约20个连续核苷酸的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2，及其互补序列。
在另一个实施例中，本发明涵盖优选地分离的核酸分子，该核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4，及其互补序列。
在另一个实施例中，本发明涵盖核酸分子，该核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7，及其互补序列。在另一个实施例中，本发明涵盖上述核酸分子，其中该分子在转基因生物例如转基因玉蜀黍植物的基因组内。本发明还包括包含所述核酸分子的基因组。
在另一个实施例中，本发明涵盖用于检测优良事件MZIR098的侧翼序列引物。此类侧翼序列引物包含分离的核酸序列，该核酸序列包含来自SEQ ID NO:8(在本文中命名为5'侧翼序列)、SEQ ID NO:9(在本文中命名为3'侧翼序列)或其互补序列的至少10-15个连续核苷酸。在这个实施例的一个方面，侧翼序列引物选自由以下组成的组：SEQ ID NO:10、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:65、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQID NO:67，及其互补序列。侧翼序列可以被延伸以包括另外的染色体10序列，其中特别强调的是包含在SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:71中的核苷酸在检测与玉米优良事件MZIR098相关联的序列方面是有用的。在SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71的上下文中，“N”被定义为任何碱基“A”、“T”、“G”或“C”。SEQ ID NO:71是SEQ ID NO:70的反向互补序列。
在仍另一个实施例中，本发明涵盖一对多核苷酸引物，其包含第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物，该第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物在样品中存在玉米优良事件MZIR098 DNA模板的情况下共同起作用，以产生对玉米优良事件MZIR098具有诊断性的扩增子。在这个实施例的一些方面，该第一引物序列是位于插入到玉米优良事件MZIR098的玉米植物基因组中的异源DNA序列的插入点侧翼的玉米植物基因组序列或与其互补，并且第二多核苷酸引物序列是插入到玉米优良事件MZIR098的玉米植物基因组中的异源DNA序列或与其互补。本发明的另一个实施例是这些多核苷酸引物用于鉴定植物中玉米优良事件MZIR098的用途。
在这个实施例的一个方面，该第一多核苷酸引物包含来自SEQ ID NO:8的位置1-1076的至少10个连续核苷酸，或SEQ ID NO:9或其互补序列的位置1-1075的至少10个连续核苷酸。在这个实施例的另一个方面，该第一多核苷酸引物包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:65或其互补序列中列出的核苷酸序列。在这个实施例的又另一个方面，该第二多核苷酸引物包含SEQ IDNO:7的至少10个连续核苷酸，或其互补序列。在这个实施例的仍另一个方面，该第二多核苷酸引物包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:22至24、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46至49或其互补序列中列出的核苷酸序列。
在这个实施例的另一个方面，该第一多核苷酸引物包含SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:67或其互补序列的核苷酸序列，并且该第二多核苷酸引物包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:33至35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:50或其互补序列的核苷酸序列，使得这对在样品中存在玉米优良事件MZIR098DNA模板的情况下共同起作用，以产生对于玉米优良事件MZIR098具有诊断性的扩增子。在这个实施例的另一个方面，该第一多核苷酸引物包含SEQID NO:7或其互补序列的至少10个连续核苷酸，并且该第二多核苷酸引物包含SEQ ID NO:9或其互补序列的位置1-1075的至少10个连续核苷酸，使得这对在样品中存在玉米优良事件MZIR098 DNA模板的情况下共同起作用，以产生对于玉米优良事件MZIR098具有诊断性的扩增子。本发明的另一个实施例是这些多核苷酸引物用于鉴定植物中玉米优良事件MZIR098的用途。
在这个实施例的另一个方面，该第一多核苷酸引物包含SEQ ID NO:10，并且该第二多核苷酸引物包含SEQ ID NO:11，并且这对在样品中存在玉米优良事件MZIR098 DNA模板的情况下共同起作用，以产生对于玉米事件MZIR098具有诊断性的扩增子，如实例2所述通过包含SEQ ID NO:12的探针可以检测到该扩增子。
本领域的技术范围之内容易获得进一步向外进入位于插入的异源DNA序列的任何一端侧翼的基因组序列中的另外的序列，以此用作引物序列，该引物序列可用于此类引物对中以扩增对于玉米优良事件MZIR098具有诊断性的序列。出于本披露的目的，短语“进一步向外进入位于插入的异源DNA序列的任何一端侧翼的基因组序列中”具体指以下序列运动，该序列运动远离该插入的异源DNA序列的末端(插入的DNA序列邻近天然基因组DNA序列的点)并且向外进入特殊染色体的基因组DNA(该异源DNA序列被插入该特殊染色体)。优选地，对应于该插入序列的一部分的引物序列或与该插入序列的一部分互补的引物序列将DNA或RNA的一条新生链的转录延伸部分引(prime)向最近的侧翼序列连接。因此，对应于该基因组侧翼序列的一部分或与该基因组侧翼序列的一部分互补的引物序列将DNA或RNA的一条新生链的转录延伸引向最近的侧翼序列连接。引物序列可以是插入至该植物的染色体中的异源DNA序列或基因组侧翼序列，或者能够与其互补。本领域的一位普通技术人员将很容易认识到如下益处：引物序列是否需要是(或者是否需要是互补于)如该插入的异源DNA序列中给出的或如在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的序列取决于通过使用巢式引物组所希望获得的产品的性质，这些巢式引物组旨在用于扩增特定的侧翼序列，该侧翼序列含有在该基因组DNA序列与该插入的异源DNA序列之间的连接。此外，出于设计阳性对照的目的，本领域普通技术人员应该能够为多个天然玉米基因设计引物。一个这样的实例是玉米Adh1基因，其中通过核酸扩增产生扩增子的合适引物的实例是本领域熟知的(参见，例如，美国专利号8,466,346，其通过引用并入本文)。
在另一个实施例中，本发明涵盖检测包含玉米核酸的样品中对于事件MZIR098独特的核酸分子的存在的方法，该方法包括：a)从玉米中分离核酸分子；b)将该核酸分子与本发明的一对多核苷酸引物组合；c)进行核酸扩增反应，其产生对玉米优良事件MZIR098具有诊断性的扩增子；以及d)检测该扩增子。
在另一个实施例中，本发明涵盖确认包含玉米核酸的样品中对于事件MZIR098独特的核酸分子的不存在的方法，该方法包括：a)从玉米中分离基因组DNA；b)将该核酸分子与本发明的一对多核苷酸引物以及与作为阳性对照的玉米天然基因(例如玉米Adh1基因)的一对多核苷酸引物组合；c)进行核酸扩增反应，该核酸扩增反应不产生对优良事件MZIR098具有特异性的扩增子，并且产生对玉米天然基因阳性对照具有特异性的扩增子；以及d)检测对该玉米天然基因阳性对照具有特异性的扩增子。
在另一个实施例中，本发明涵盖检测包含玉米核酸的样品(例如，生物样品)中对于事件MZIR098独特的核酸分子的存在的方法，该方法包括：a)从玉米中分离核酸分子；b)将该核酸分子与本发明的一对多核苷酸引物以及包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:10至12、SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:52或其互补序列的核苷酸序列的多核苷酸探针组合；c)进行核酸扩增反应，所述核酸扩增反应产生可以被所述探针检测的扩增子；以及d)检测该探针。在另一个实施例中，本发明涵盖DNA分子，其包含通过本发明的方法产生的扩增子。在这个实施例的优选的方面，扩增子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4，及其互补序列。
在另一个实施例中，本发明涵盖检测生物样品中对应于玉米优良事件MZIR098的DNA的存在的方法，其中该方法包括：(a)将包含DNA的样品与探针接触，该探针在高严格条件下与来自玉米优良事件MZIR098的基因组DNA杂交并且在高严格条件下不与对照玉米植物的DNA杂交；(b)使该样品和探针经受高严格杂交条件；以及(c)检测该探针与该DNA的杂交。在这个实施例的一个方面，探针包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4，及其互补序列。
在另一个实施例中，本发明涵盖检测生物样品中对应于玉米优良事件MZIR098事件的DNA的存在的方法，其中该方法包括：(a)将包含DNA的样品与探针接触，该探针在高严格条件下与来自玉米事件玉米优良事件MZIR098的基因组DNA杂交并且在高严格条件下不与对照玉米植物的DNA杂交；(b)使该样品和探针经受高严格杂交条件；以及(c)检测该探针与该DNA的杂交。可以通过本领域熟知的任何方法进行检测，包括但不限于荧光方法、化学发光方法、放射线学方法、免疫学方法、或其他方法。在杂交旨在被用作扩增特殊序列的手段以产生对于玉米优良事件MZIR098玉米事件具有诊断性的扩增子的情况下，通过本领域熟知的任何方法进行的该扩增子的生产和检测旨在指示其中使用了一个探针或引物的靶序列、或其中使用了两个或更多个探针或引物的多个序列的预期杂交。术语“生物样品”旨在包括含有或被怀疑含有核酸的样品，该核酸包含在如下点的任一侧的五个和十个之间的核苷酸，在该点处插入的异源DNA序列的两个终止末端的一个或另一个接触在该染色体内的该基因组DNA序列(该异源DNA序列被插入该染色体中)，本文也被称为连接序列。另外，连接序列包含少至两个核苷酸：它们是在侧翼基因组DNA内的第一核苷酸，该第一核苷酸邻近并共价连接至在插入的异源DNA序列内的第一核苷酸。
在又另一个实施例中，本发明涵盖用于检测生物样品中玉米优良事件MZIR098核酸的存在的试剂盒，其中该试剂盒包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的核苷酸序列同源或互补的足够长度的连续核苷酸的至少一种核酸分子，该核苷酸序列作为DNA引物或对于玉米优良事件MZIR098具有特异性的探针起作用，以及使核酸杂交或扩增能够实现所必需的其他材料。能够使用多种检测方法，包括TaqMan(赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific))、热扩增、连接酶链式反应、Southern杂交、ELISA法，以及比色和荧光检测法。特别地，本发明提供了用于检测在含有来自事件玉米优良事件MZIR098的基因组核酸的样品中的靶序列(即玉米优良事件MZIR098中的插入DNA与玉米植物的基因组DNA的连接中的至少一个)的存在的试剂盒。该试剂盒包含至少一种多核苷酸，该多核苷酸能够结合至该靶位点上或基本上邻近该靶位点，以及至少一种手段，该手段用于检测该多核苷酸与该靶位点的结合。这些检测手段可为荧光手段、化学发光手段、比色手段或同位素手段，并且可以加上至少免疫学方法以检测该结合。还构思了一种试剂盒，该试剂盒能够检测样品中靶位点的存在，即，玉米优良事件MZIR098中插入DNA与玉米植物的基因组DNA的连接中至少一个，利用了两种或更多种多核苷酸序列，这些多核苷酸序列在一起能结合至邻近该靶序列核苷酸序列或在该靶序列的约100个碱基对之内、或在约200个碱基对之内、或在约500个碱基对之内或在约1000个碱基对之内，并且这些多核苷酸序列能向彼此延伸以形成包含至少该靶位点的扩增子。
在另一个实施例中，本发明涵盖用于检测生物样品中的玉米优良事件MZIR098蛋白的方法，该方法包括：(a)从玉米优良事件MZIR098组织的样品中提取蛋白质；(b)使用免疫学方法测定所提取的蛋白质，该蛋白质包含对由玉米优良事件MZIR098事件产生的mCry3A、eCry3.1Ab、和/或PAT蛋白具有特异性的抗体；以及(c)检测所述抗体与mCry3A、eCry3.1Ab、和/或PAT蛋白的结合。
本发明的另一个实施例涵盖包含转基因玉米优良事件MZIR098的基因型的玉米植物或其部分，其中该基因型包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或其互补序列中列出的核苷酸序列。所述基因型在玉米植物的基因组内。在这个实施例的一个方面，玉米植物来自以下近交玉米系：CG5NA58、CG5NA58A、CG3ND97、CG5NA01、CG5NF22、CG4NU15、CG00685、CG00526、CG00716、NP904、NP948、NP934、NP982、NP991、NP993、NP2010、NP2013、NP2015、NP2017、NP2029、NP2031、NP2034、NP2045、NP2052、NP2138、NP2151、NP2166、NP2161、NP2171、NP2174、NP2208、NP2213、NP2222、NP2275、NP2276、NP2316、BCTT609、AF031、H8431、894、BUTT201、R327H、2044BT、和2070BT。然而本领域的技术人员将认识到，玉米优良事件MZIR098基因型能够被渗入至任何能用玉米进行育种的植物品种(包括野生型玉蜀黍物种)中，因此这个实施例的优选的近交系并不意味着是限制性的。
在另一个实施例中，本发明涵盖玉米植物，该玉米植物至少包含第一DNA序列和第二DNA序列，它们连接在一起形成连续的核苷酸序列，其中该第一DNA序列在连接序列内并且包含选自由以下组成的组的的至少约10-15个连续核苷酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10，及其互补序列，其中该第二DNA序列在选自由以下组成的组的异源插入DNA序列之内：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:22至SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43、SEQID NO:44、SEQ ID NO:46至SEQ ID NO:52，及其互补序列。在另一个实施例中，该第一序列是连接序列上游的基因组侧翼序列，例如SEQ ID NO:10、14、15、16、19、20、21、38、41、42、45、65、67或其互补序列，并且该第二DNA序列在选自由以下组成的组的异源插入DNA序列内：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46至SEQID NO:52及其互补序列，并且其中该第一和第二DNA序列可用作核苷酸引物或探针，用于检测生物样品中玉米优良事件MZIR098核酸序列的存在。在这个实施例的一个方面，在DNA扩增方法中使用一对核苷酸引物(其中一个核苷酸引物包含上述第一核酸序列，另一个核苷酸引物包含上述第二核酸序列)以扩增来自从玉米植物中提取的模板DNA的靶DNA序列，并且该玉米植物通过对应于包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的DNA序列的扩增子的产生而可以从其他玉米植物中鉴定出来。
在一个实施例中，本发明提供了玉米植物，其中事件玉米优良事件MZIR098基因型赋予玉米植物昆虫抗性，特别是针对根萤叶甲属物种昆虫有害生物的抗性和针对GS抑制剂除草剂的耐受性。在这个实施例的一个方面，赋予玉米植物昆虫抗性的基因型包含mCry3A基因或eCry3.1Ab基因。在这个实施例的另一个方面，赋予玉米植物针对GS抑制剂除草剂耐受性的基因型包含PAT基因。
在一个实施例中，本发明提供了衍生于优良事件MZIR098玉米植物、组织、或种子的生物样品，其中该样品包含核酸序列，该序列是选自由以下组成的组的序列或与其互补：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，并且其中该序列在该样品中使用核酸扩增或核酸杂交方法是可检测的。因此，该基因序列作为检测手段而起作用。在这个实施例的一个方面，该样品选自玉米商品产品，例如但不限于玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉、以及全部或部分地含有玉米副产物的制造的谷类食品。本领域已知生物样品或提取物可包含具有生物活性的蛋白质。因此，在另一个实施例中，本发明提供了衍生于优良事件MZIR098玉米植物、组织或种子的生物样品，其中所述生物样品包含继续具有杀昆虫活性的杀昆虫蛋白mCry3A和/或eCry3.1Ab。
在另一个实施例中，本发明提供了衍生于包含如下核苷酸序列的优良事件MZIR098玉米植物、组织或种子的提取物，该核苷酸序列是选自由以下组成的组的核苷酸序列或与其互补：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:6。这样的种子的实例以登录号PTA-124143保藏于ATCC。在这个实施例的一个方面，使用核酸扩增或核酸杂交方法检测了在提取物中的序列。在这个实施例的另一个方面，该样品选自玉米商品产品，例如玉米粉，玉米糖浆，玉米油，玉米淀粉和全部或部分制造以包含玉米产品的谷类食品。
在另一个实施例中，本发明提供了产生玉米商品产品的方法，该方法包括以下步骤：a)获得转基因优良事件MZIR098玉米植物、其细胞或组织；和b)从所述转基因玉米植物、其细胞或组织产生玉米商品产品，其中该商品产品中包含来自其中的蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、淀粉、面、面粉或油。
在另一个实施例中，本发明提供了玉米商品产品，该玉米商品产品包含可检测量的对于玉米优良事件MZIR098独特的DNA分子，其中所述分子包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。在另一个实施例中，本发明提供了无生命植物材料，该无生命植物材料包含可检测量的包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的核酸分子，其中该核酸分子包含在以登录号PTA-124143保藏于ATCC的玉米种子中。
在另一个实施例中，本发明提供了用于确定包含本发明的玉米优良事件MZIR098的玉米植物的接合性的方法，所述方法包括：(a)从所述玉米植物获得基因组DNA的DNA样品；(b)通过将所述DNA样品与以下进行接触来产生接触的样品：(i)第一事件引物和第二事件引物，其中所述第一事件引物与所述转基因构建体特异性结合，所述第二事件引物与所述5’玉米基因组侧翼DNA或所述3’玉米基因组侧翼DNA特异性结合，并且其中所述第一事件引物和所述第二事件引物在定量PCR条件下产生对于事件MZIR098独特的事件扩增子，(ii)至少一个天然插入位点第一引物和至少一个天然插入位点第二引物，其中所述第一引物是正向引物，并且所述第二引物是反向引物，其中第一引物和第二引物在定量PCR条件下共同起作用，以在所述基因组中不存在优良事件MZIR098时从所述天然MZIR098插入位点产生扩增子，(iii)与所述事件扩增子杂交的荧光事件探针，和(iv)与所述天然插入位点扩增子杂交的荧光天然插入位点探针；(c)使所述接触的样品经受基于荧光的终点定量PCR条件；(d)定量与所述事件扩增子杂交的所述荧光事件探针，并定量与所述天然插入位点扩增子杂交的所述荧光天然插入位点探针；(e)比较杂交的荧光事件探针与杂交的荧光天然插入位点探针的量；以及(f)通过比较杂交的荧光事件探针和杂交的荧光天然插入位点探针的荧光比，确定包含玉米优良事件MZIR098的所述玉米植物的接合性。可以将事件引物组和探针以及天然插入位点引物组和探针与相同的DNA样品混合，或者它们可以与衍生于相同玉米植物的不同DNA样品分开。天然插入引物组可包含不止一种正向天然插入位点引物和/或不止一种反向天然插入位点引物。来自事件探针的荧光和来自天然插入位点探针的荧光的定量可以顺序或同时进行。可以使用数据分析软件(例如，ABI 7900HT上的SDS软件)进行接合性确定，如实例9所述和图2所示。结果指示玉米植物对于优良事件MZIR098是否是纯合的(即，对于事件终点定量PCR具有阳性结果，但对于天然插入位点终点定量PCR不具有阳性结果)、玉米植物对于优良事件MZIR098是否是杂合的(即对于事件和对于天然插入位点终点定量PCR两者都具有阳性结果)、或玉米植物是否是野生型(即对于天然插入位点终点定量PCR具有阳性结果，但对于事件终点定量PCR不具有阳性结果)。
将认识到，基于引入了优良事件MZIR098的各种玉米种质的遗传多样性，将发现天然插入位点的一些序列多样性。因此，为了在新颖的玉米种质中成功确定接合性，可能需要鉴定天然插入位点引物组，使得在经受定量PCF条件时当基因组中不存在优良事件MZIR098时产生扩增子。可能需要多个天然插入位点引物组和探针，以正确确定各种玉米种质中事件MZIR098的接合性。单个反应中可包括多个天然插入位点引物组和/或探针，以产生与天然插入位点探针杂交的天然插入位点扩增子。类似地，可能需要鉴定与MZIR098的5'或3'侧翼序列特异性结合的事件引物以在新颖的玉米种质中的成功确定接合性，因为5'和/或3'侧翼序列可能在各种种质中有所不同。同样，多个事件引物组可包括在单个反应中，以产生对于事件MZIR098独特的事件扩增子。
在上述确定接合性的方法的另一个实施例中，事件和/或天然插入位点扩增子可以由50-200个核苷酸长度组成。在一个优选的实施例中，该事件和天然插入位点的扩增子的长度为50-150个核苷酸。在另一个实施例中，该第一事件引物包含来自如SEQ ID NO:7或其互补序列中列出的位置1-8476的至少10个连续核苷酸，并且该第二事件引物包含来自如SEQ ID NO:8中列出的位置1-1076或如SEQ ID NO:9或其互补序列中列出的位置1-1075的至少10个连续核苷酸。在另一个实施例中，该第一事件引物选自SEQ ID NO:11、17、18、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、37、39、40、43、44、46、47、48、49、50、51、52，或其互补序列。在另一个实施例中，该第二事件引物选自SEQ ID NO:10、14、15、16、19、20、21、36、38、41、42、45、65、67，或其互补序列。在另一个实施例中，该第一天然插入位点引物包含来自如SEQ ID NO:8或其互补序列中列出的位置1-1076的至少10个连续核苷酸，并且该第二天然插入位点引物包含来自如SEQ ID NO:9或其互补序列中列出的位置1-1075的至少10个连续核苷酸。在另一个实施例中，该第一天然插入位点引物选自SEQ ID NO:10、14、15、16、38、42、65，或其互补序列。在另一个实施例中，该第二天然插入位点引物选自SEQ IDNO:19、20、21、36、41、45、67，或其互补序列。在另一个实施例中，该荧光天然插入位点探针包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:69。认识到，天然插入位点引物可以有不止一个第一引物或第二引物。
在另一个实施例中，上述用于确定接合性的方法的结果直接在酶标仪(platereader)中读取。本发明还涵盖用于进行上述确定接合性的方法的试剂盒。该试剂盒包含对DNA样品进行接合性测定所需的所有引物和探针，包括第一事件引物、第二事件引物、至少一个天然插入位点引物、至少一个天然插入位点反向引物、事件探针、和天然插入位点探针。该试剂盒可包括用于事件、天然插入位点或两者的不止一个引物组/探针。该试剂盒还可包括不止一对的引物，例如，如实例9所述的两个正向引物和单个反向引物。
在另一个实施例中，本发明涵盖对包含抗除草剂耐受性玉米优良事件MZIR098的玉米植物进行育种的方法，其中通过上述方法确定包含玉米优良事件MZIR098的玉米植物的接合性。接合性确定方法可以在育种程序中用于确定分离的子代群体中事件MZIR098的接合性。然后可以基于上述接合性确定方法的结果，选择对于事件MZIR098是纯合的玉米植物。如果基于接合性确定方法的结果发现玉米植物对于事件MZIR098是杂合的，也可以将这些玉米植物弃去。
在又另一个实施例中，本发明提供了用于产生玉米植物的方法，该玉米植物可用于控制昆虫并且还对除草剂具有耐受性，该方法包括：(a)将第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，其中所述第一或第二亲本玉米植物包含玉米优良事件MZIR098，从而产生多个第一代子代植物；(b)选择针对GS抑制剂具有除草剂耐受性和/或针对根萤叶甲属物种(例如西方玉米根虫)具有昆虫抗性的第一代子代植物；(c)使第一代子代植物自交，从而产生多个第二代子代植物；以及(d)从这些第二代子代植物中选择针对GS抑制剂具有除草剂耐受性和/或针对玉米根虫具有昆虫抗性的植物；其中这些第二代子代植物包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5和SEQ ID NO:6。
在又另一个实施例中，本发明提供了使用玉米优良事件MZIR098对缺乏所述事件的植物赋予昆虫抗性和/或除草剂耐受性。该用法可包括例如将包含事件MZIR098的亲本玉米植物与不包含事件MZIR098的第二亲本玉米植物进行有性杂交，并选择包含事件MZIR098的子代。该子代可以进一步与第二亲本回交(任选地多次回交)，或与另外的玉米植物杂交，作为育种程序的一部分，以产生包含优良事件MZIR098的至少一种玉米品种，该玉米品种先前不包含所述事件。
在另一个实施例中，本发明提供了无性繁殖玉米优良事件MZIR098的方法。玉米植物的无性繁殖可以使用本领域熟知的方法进行，例如通过花药培养或通过小孢子衍生的植物组织培养。体外植物再生可以通过微繁殖(其涉及抑制顶端优势，从而导致腋芽的活化和繁殖)或者通过体细胞胚发生(其中例如从体细胞形成含子叶的胚)来进行。无性繁育需要无性繁殖和体外植物再生。在另一个实施例中，本发明提供了通过无性繁殖产生的玉米优良事件MZIR098。本发明还提供了玉米优良事件MZIR098植物、细胞或组织产生玉米优良事件MZIR098植物的用途。该植物可以通过无性繁殖产生。
在另一个实施例中，本发明提供了产生杂交玉米种子的方法，该方法包括：(a)种植第一近交玉米系的种子，所述种子的实例作为ATCC登录号PTA-124143保藏，其中所述种子包含由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，和具有与该第一近交玉米植物不同基因型的第二近交系的种子；(b)培育从所述种植产生的玉米植物直到开花和产生花；(c)将该第一或第二个玉米近交系的植物的所述花去雄；(d)通过用去雄植物的花粉对未去雄的植物进行授粉来使两个不同的近交系有性杂交；和(e)允许产生杂交种子并收获由此产生的杂交种子。在这个实施例的一个方面，该第一近交玉米系提供了母本。在这个实施例的另一个方面，该第一近交玉米系提供了父本。本发明还涵盖通过实施的方法产生的种子以及由该种子长成的杂交植物。
在另一个实施例中，本发明提供了选择与玉米优良事件MZIR098相关联的标记的方法，该方法包括：(a)筛选玉米优良事件MZIR098染色体10序列，(b)将这些序列与非转基因NP2222序列进行比较，(c)出于检测序列变异的目的来比较这些序列，(d)将这些序列变异用作开发与玉米优良事件MZIR098相关联的标记，(e)使用这些标记来筛选系，以及(f)检测标记以确认染色体10上存在玉米优良事件MZIR098序列。在另一个实施例中，本发明提供了对玉米植物进行育种的方法，该玉米植物包含遗传连接至或核酸标记的互补序列的除草剂耐受性玉米优良事件MZIR098，其中使用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10至SEQID NO:12、SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或其互补序列鉴定所述标记。在另一个实施例中，本发明提供了针对除草剂耐受性玉米优良事件MZIR098的标记辅助选择的方法，该方法包括：(a)从玉米分离一个或多个核酸分子或制备核酸样品；(b)将该一个或多个核酸分子与一对多核苷酸引物和探针结合，这些多核苷酸引物和探针选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67，或其互补序列；(c)进行核酸扩增反应，这产生扩增子；(d)检测该扩增子；和(e)出于对包含玉米优良事件MZIR098的除草剂耐受性玉米进行育种的目的选择植物。
在另一个实施例中，本发明含有包含优良事件MZIR098的转基因玉米植物、细胞或组织，其特征在于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，其中这些转基因玉米植物、细胞或组织进一步被定义为包含优良事件MZIR098的玉米植物的任何一代的子代或衍生于该子代。在另一个实施例中，这些转基因玉米植物、细胞或组织是包含优良事件MZIR098的至少一个亲本的杂交种或衍生于该杂交种。
本领域的一个普通技术人员将认识到本发明的转基因基因型能通过育种而渗入至包含不同转基因基因型的其他玉米系中。例如，可以将包含本发明的转基因基因型的玉米近交体与包含鳞翅目抗性Bt11事件的转基因基因型的玉米近交体进行杂交，这是本领域已知的，从而产生了包含本发明的转基因基因型和Bt11转基因基因型两者的玉米种子。可以与本发明的近交体杂交的其他转基因事件的实例包括：Enogen事件3272、草甘膦耐受性/鳞翅目昆虫抗性MON802事件、鳞翅目昆虫抗性事件DBT418、鳞翅目昆虫抗性事件DAS-06275-8、鳞翅目昆虫抗性事件MIR162、雄性不育事件MS3、鳞翅目昆虫抗性事件MON 80100、鳞翅目昆虫抗性事件176和鞘翅目昆虫抗性事件MON863，所有这些在本领域中都是已知的。将进一步认识到可以用本发明的转基因的基因型进行其他组合，并因此这些实例不应被视为是限制性的。
在另一个实施例中，本发明涵盖用于产生玉米优良事件MZIR098种子的方法。该方法包括将本发明的玉米优良事件MZIR098与第二玉米植物杂交。该第二个玉米植物可包含也可不包含MZIR098事件。在优选的实施例中，该第二玉米植物不包含MZIR098事件。杂交或授粉事件后，使种子生长并结在母本植物上。本发明进一步包含通过上述方法产生的玉米优良事件MZIR098种子，以及通过使种子发芽而产生的玉米优良事件MZIR098植物。
在另一个实施例中，本发明提供了将另外性状引入玉米优良事件MZIR098植物的方法，该方法包括：(a)将从玉米优良事件MZIR098种子生长的玉米优良事件MZIR098植物与包含另外性状的另一种玉蜀黍植物杂交以产生杂交子代植物，所述玉米优良事件MZIR098种子的代表性种子保藏在ATCC登录号PTA-124143下；(b)选择具有所述另外性状的杂交子代植物以产生选择的杂交子代植物；(c)使所述选择的子代植物与玉米优良事件MZIR098亲本植物杂交以产生回交子代植物；(d)选择具有另外性状的回交子代植物以产生选择的回交子代植物；以及(e)重复步骤(c)和(d)至少三次或更多次，以产生包含所述另外性状和玉米优良事件MZIR098的回交子代植物。本发明进一步包括通过上述方法产生的植物。
在另一个实施例中，本发明提供了用于在玉米植物育种程序中开发玉米优良事件MZIR098植物种质的方法，所述方法包括施用植物育种技术，其中所述技术包含轮回选择、回交、谱系育种、标记增强选择、单倍体/双单倍体产生、或玉米优良事件MZIR098植物或其部分的转化，其中所述技术的施用导致包含优良事件MZIR098的第二玉米种质的开发。
在另一个实施例中，本发明提供了产生具有双单倍体染色体的玉米优良事件MZIR098植物的方法，该方法包括：(a)将根据权利要求2所述的植物与诱导玉蜀黍植物杂交以产生具有单倍体染色体的子代；和(b)将该子代中的单倍体染色体加倍以产生具有双单倍体染色体的玉米优良事件MZIR098植物。
育种
对植物或种子或其部分的操作(例如突变、进一步转染和进一步育种)可能导致创建所谓的“本质上衍生(essentially derived)”品种。国际植物新品种保护联盟(International Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV)提供了以下指南，用于确定品种是否本质上衍生于受保护品种：
在以下情况下，品种应被视为本质上衍生于另一个品种(“初始品种”)：
(i)主要衍生于初始品种，或者衍生于其本身主要衍生于初始品种的品种，同时保留了由初始品种的基因型或基因型组合产生的基本特征的表达；
(ii)与初始品种有明显区别；以及
(iii)除了由衍生行为产生的差异外，它在表达由初始品种的基因型或基因型组合导致的基本特征方面与该初始品种相符。
UPOV，与国际组织的第六次会议，日内瓦，1992年10月30日；由联合办公室(Officeof the Union)准备的文件。
如本文使用的，“系”是针对至少一个性状在个体之间显示很少或不显示遗传变异的一组植物。可以通过若干代自花授粉和选择，或者使用组织或细胞培养技术从单亲本进行无性繁殖来创建此类系。
如本文使用的，术语“栽培种”和“品种”是同义词，并且是指用于商业生产的系。
“稳定性”或“稳定的”意指相对于给定的组分，该组分每代保持基本上相同的水平，并且优选至少三代保持基本相同的水平，例如优选±15％、更优选±10％、最优选±5％。稳定性可能受温度、位置、胁迫和种植时间的影响。在田地条件下对后代的比较应该以类似的方式产生组分。
将“商业用途”定义为具有良好的植物活力和高生育力，使得农民可以使用常规耕作设备生产作物。
本发明的转基因基因型能够采用本领域公认的育种技术而渗入至任何玉米近交体或杂种中。植物育种的目标是将不同的所希望的性状结合在单一品种或杂交种中。对于大田作物而言，这些性状可能包括对昆虫和疾病的抗性、对除草剂的耐受性、对热和旱的耐受性、减少作物成熟的时间、更高的产率、以及更好的农艺学质量。随着许多作物的机械收获，植物特征(例如发芽和植物丛建立、生长速率、成熟，以及植物和穗的高度)的均一性是很重要的。
大田作物是通过利用了植物授粉方法的技术进行育种的。如果来自一朵花的花粉被转移至同一植物的同一朵花或另一朵花，则该植物是自花受粉的。如果花粉来自一个不同植物的一朵花，则该植物是异花授粉的。
已经自花授粉及对于许多代的类型进行了选择的植物在几乎所有基因基因座变得纯合，并产生纯种子代(true breeding progeny)的均一群体。在两种不同纯合系之间的杂交产生杂交植物(对于许多基因基因座可以是杂合的)的均一群体。两种植物(每种在很多基因基因座上是杂合的)的杂交将产生遗传上不同的并且将是不均一的杂交植物的群体。
玉米能通过自花受粉和异花授粉两种技术培育。玉米在同一个植物上具有分开的雄花和雌花，分别位于雄花穗和穗上。当风将花粉从雄花穗吹到从穗顶突出的花丝时，则在玉米中发生自然授粉。
在植物中控制雄性生育力的一个可靠方法为改进植物育种提供了机会。这对于开发依赖于某些雄性不育系统的玉米杂种尤其是成立的。对育种者而言有若干个可用的控制雄性生育力的选择，例如，手工或机械去雄(或去雄花穗)、细胞质雄性不育性、遗传雄性不育性、杀配子药等等。
杂交玉米种子典型地通过雄性不育系统结合手工或机械去雄花穗而典型地产生。两个玉米近交体以交错条带的方式种植在一块田地上，并且从近交体(雌性)中的一个去除带花粉的雄花穗。假如能足够隔离外来玉米花粉源，则该去雄花穗近交体的穗将只从另一个近交体(雄性)受精，因此得到的种子是杂种并且将形成杂交植物。
通过使用本领域中赋予遗传的雄性不育性的许多方法(每种方法都有其自身的优点和缺点)中的方法能够避免这种费力的且有时不可靠的去雄花穗的方法。这些方法采用多种途径，例如将编码细胞毒性物质的基因递送到植物中，该细胞毒性物质与雄性组织特异性启动子或反义系统相关联，其中对生育力至关重要的基因被鉴定出来，并且该基因的反义引物被插入至该植物中(参见：Fabinjanski等人EPO89/3010153.8公开号329,308，以及作为WO 90/08828公开的PCT申请PCT/CA 90/00037)。
玉米近交系的开发
使用雄性不育近交体只是玉米杂种产生中的一个因素。本领域已知的且在一个玉米植物育种程序中使用的植物育种技术包括但不限于，轮回选择、回交、谱系育种、限制长度多态性增强选择、标记辅助选择和转化。在一个玉米植物育种程序中玉米杂种的开发通常需要纯合近交系的开发、这些系的杂交、以及这些杂交的评估。谱系育种和轮回选择育种方法被用来开发来自育种群体的近交系。玉米植物育种程序将来自两个或更多个近交系或各种其他种质源的遗传背景结合进入育种库(breeding pool)中，从该育种库中通过自交和选择所希望的表型而开发新的近交系。这些新的近交体与其他近交系杂交，并且评估来自这些杂交的杂种以确定它们当中哪些具有商业潜力。如在一个玉米植物育种程序中所实践的，植物育种和杂种开发是昂贵且耗时的过程。
谱系育种开始于两个基因型的杂交，其中每个基因型可能具有一个或多个所希望的特征，这些特征在另一个中缺乏或补充另一个。如果这两种原始的亲本不能提供所有的所希望的特征，则可将其他源包括在该育种群体中。在该谱系方法中，将优异(superior)植物自交并在连续后代中进行选择。在这些继代中，作为自体授粉和选择的结果，杂合条件为同质系提供途径。典型地，在自交及选择的育种五代或更多代的谱系方法中，实行如下：F1→F2；F2→F3；F3→F4；F4→F.5等。
轮回选择育种(例如回交)可以用来改进近交系及使用这些近交体产生的杂种。回交可被用来将特异的所希望的性状从近交体或来源转移至缺乏该性状的近交体中。这可以通过例如将优异近交体(轮回亲本)与携带对于所讨论的性状适当的一个或多个基因的供体近交体(非轮回亲本)进行杂交来完成。然后将这种杂交的子代配对回至该优异的轮回亲本，然后在得到的子代中对于从该非轮回亲本转移的所希望的性状进行选择。选择了所希望的性状的五代或更多代回交代之后，该子代对于控制被转移的特性的位点将是纯合的，但对于基本上所有其他基因将与该优异的亲本相像。然后，最后回交的子代进行自交以便对于被转移的一个或多个基因给出纯种子代。从包含被转移的一个或多个基因的近交体中发育的杂种与从没有被转移该一个或多个基因的同样的近交体发育的杂种基本上是一样的。
还可以通过将双单倍体方法施用于包含优良事件MZIR098的玉米植物与不同植物杂交的子代来产生近交植物。双单倍体方法无需重复的回交步骤即可产生基本上纯合的植物。近交系发育的单倍体/双单倍体过程始于单倍体的诱导，例如通过使用KWS诱导系、Krasnador诱导系、stock 6诱导系(Coe,1959,Am.Nat.[美国自然学家]93:381-382)。然后将单倍体细胞加倍，并且并产生双单倍体植物。在一些实施例中，本发明是产生具有衍生于玉米优良事件MZIR098的双单倍体染色体的玉米植物的方法，该方法包括：(a)将植物(其中所述植物包含优良事件MZIR098)与诱导玉蜀黍植物杂交，以产生具有单倍体染色体的子代；和(b)将该子代中的单倍体染色体加倍以产生具有双单倍体染色体的玉蜀黍植物。在一些实施例中，子代可以是例如细胞、种子、胚或植物。在另外的实施例中，通过上述步骤(b)产生的具有双单倍体染色体的玉蜀黍植物是具有玉米优良事件MZIR098的特征的玉蜀黍近交植物。在其他实施例中，在步骤(a)中与诱导物杂交的植物是通过将包含优良事件MZIR098的玉米植物与不同植物杂交而产生的杂交玉蜀黍植物。
有关使用双杂交方法的实例，参见Prasanna等人(编)Doubled HaploidTechnology in Maize Breeding:Theory and Practice Mexico[玉蜀黍育种中双单倍体技术：墨西哥的理论与实践],D.F.:CIMMYT,Barnabus等人“Colchicine,an efficientgenome doubling agent for maize microsporescultured in anthero[秋水仙碱，一种有效的用于在花药中玉蜀黍小孢子培养的基因组倍增剂]”,Plant Cell Reports[植物细胞报告],1999,18:858-862或美国专利公开2003/0005479。有时，这种双单倍体可用作近交体，但有时其会进一步自我授粉以完成近交体发育。另一个育种过程是谱系选择，其使用从两种基因型(通常是优良近交系)杂交产生的F2群体中的选择，或合成品种(开放授粉的、复合的或回交的群体)的子代的选择。谱系选择对于高度遗传的性状(例如转基因事件)有效，但其他性状(例如产率)则需要在多个阶段进行重复测试杂交以进行准确选择。
优良近交系，即，纯种繁育的纯合近交系，还可作为起始材料被用于育种或作为由此开发其他近交系的源群体(source population)。衍生于优良近交系的这些近交系可以用以上所述的谱系育种和轮回选择育种方法来开发。作为一个实例，当在玉米植物育种程序中使用回交育种来创建这些衍生系(derived line)时，优良近交体可以被用作亲本系或起始材料或源群体，并且可以作为供体或轮回亲本。
玉米杂交体的开发
一个单交玉米杂种来自两个近交系的杂交，这两个近交系中的每一个具有与另一个基因型互补的基因型。将第一代的杂交子代命名为F1。在玉米植物育种程序中的商品杂种的开发中，仅仅搜索F1杂交植物。优选的F1杂种比其近交亲本更有活力。这种杂种活力或杂种优势可以在许多的多基因性状中表现出来，包括增加的植物生长及增加的产率。
在玉米植物育种程序中开发玉米杂种涉及三个步骤：(1)选择来自各种种质库的植物进行初始育种杂交；(2)将从该育种杂交选择的植物进行若干代自交，以产生一系列近交系，尽管这些近交系彼此不同，但它们是纯育且高度均一的；和(3)将选择的近交系与不同的近交系杂交以产生杂交子代(F1)。在玉米的近交过程中，这些系的活力下降。当两种不同的近交系杂交以产生杂交子代(F1)时活力被恢复。这些近交系的纯合性和均一性的一个重要结果是在已确定的一对近交体之间的杂种将总是一样的。一旦给出优异杂种的近交体被鉴定出来，只要保持这些近交亲本的均一性，就能无限地复制该杂交种子。通过F1杂种展示的许多杂种活力在下一代(F2)中消失。因此，来自杂种的种子不用于种植储备。
杂交种子的产生需要将通过母本产生的花粉消除或失活。花粉的不完全去除或失活为自花授粉提供了可能性。这个不注意地自花授粉的种子可能无意中与杂交种子一起收获并包装。
一旦该种子被种植，有可能鉴定并选择这些自花授粉的植物。这些自花授粉的植物将与用来产生该杂种的雌性近交系在遗传上是等同的。
如对本领域的一位普通技术人员很清楚的是，前述只是不同方式中的一些方式，通过这些方式那些寻求将本发明的转基因的基因型渗入至其他玉米系的人们可获得本发明的近交体。还有其他可供使用的手段，并且上述实例仅仅是说明性的。
本领域的普通技术人员也将认识到包含本发明的转基因基因型的转基因玉米种子能用不同的种子处理化学品(包括杀昆虫剂)进行处理。在一个实施例中，本发明包含用于保护玉米优良事件MZIR098植物免受一种或多种有害生物的摄食损伤的方法，该方法包括(a)提供玉米优良事件MZIR098植物的MZIR098种子；和(b)用杀昆虫剂处理MZIR098植物。在优选的实施例中，杀昆虫剂可包含选自由以下组成的组的活性成分：噻虫嗪、λ-三氯氟氰菊酯和七氟菊酯(tefluthrin)。例如，可以用化学杀昆虫剂
Figure BDA0002316750130000541
来处理本发明的转基因玉米种子。本发明还涵盖用杀昆虫剂处理的玉米优良事件MZIR098种子。在另一个实施例中，本发明包含用杀昆虫剂处理的玉米优良事件MZIR098种子，该杀昆虫剂包含选自由以下组成的组的活性成分：噻虫嗪、λ-三氯氟氰菊酯和七氟菊酯。在另一个实施例中，本发明涵盖用杀昆虫剂处理的玉米优良事件MZIR098植物。在一个优选的实施例中，本发明涵盖用杀昆虫剂处理的玉米优良事件MZIR098植物，该杀昆虫剂包含选自由以下组成的组的活性成分：噻虫嗪、λ-三氯氟氰菊酯和七氟菊酯。
在另一个实施例中，本发明提供了控制杂草的方法，其中将除草剂施用到包含玉米优良事件MZIR098植物的田地上。在优选的实施例中，除草剂是GS抑制剂，例如草铵膦或双丙氨磷。包含GS抑制剂的可商购的除草剂的实例包括Herbiace、Meiji Herbiace、
Figure BDA0002316750130000542
Figure BDA0002316750130000543
和
Figure BDA0002316750130000544
在另一个实施例中，本发明提供了在至少包含玉米优良事件MZIR098植物的区域中控制草甘膦抗性杂草的方法，其中所述方法包括将GS抑制剂除草剂(例如草铵膦或双丙氨膦)施用至所述区域的至少一部分。草甘膦抗性杂草可以是不需要的自生物(volunteer)芸苔属物种、粟、柳枝稷、玉蜀黍、高粱、小麦、燕麦、草皮草、牧场草、木瓜、亚麻、辣椒、马铃薯、向日葵、番茄、十字花科植物、大豆、菜豆、莲花、葡萄、桃子、可可、棉花、大米、大豆、甘蔗、甜菜、烟草、大麦、木薯、黄瓜、西瓜、蜜瓜、橙、克莱门氏小柑橘、蓖麻子或葡萄藤。在另一个实施例中，本发明提供了在培育区域中控制杂草的方法，所述区域包括多个玉米优良事件MZIR098植物，所述方法包括在植物的顶部施用GS抑制剂除草剂，例如草铵膦或双丙氨磷。
在另一个实施例中，本发明提供了玉米植物，该玉米植物包含优良事件MZIR098，其中该玉米植物可用于控制根萤叶甲属物种昆虫有害生物。在另外的实施例中，玉米植物可用于控制玉米根虫。玉米根虫的实例包括西方玉米根虫和北方玉米根虫。本发明的另一个实施例是控制昆虫有害生物的方法，该方法包括在田地种植包含优良事件MZIR098的玉米植物。该田地可包括至少一种MZIR098玉米植物，至少50％MZIR098玉米植物，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％MZIR098玉米植物。本发明还提供了包含优良事件MZIR098的玉米植物在田地用于控制昆虫有害生物的用途。昆虫有害生物可以是根萤叶甲属物种。昆虫有害生物还可以是玉米根虫，例如西方玉米根虫和北方玉米根虫。
本发明的另一个实施例是重组序列，该重组序列包含位于染色体10上在SNP标记SYN23814和PZE-110102022之间的玉蜀黍染色体靶位点和异源核酸。染色体10上的玉蜀黍染色体靶位点还位于SNP标记PZE-110101785、PZE-110101800和SYN23814(全部在5'侧翼序列)与SNP标记PZE-110102022、PZA02167.2、SYNGENTA16568和SYN8530(全部在3'侧翼序列)之间。可通过靶向插入将异源核酸引入玉蜀黍染色体靶位点。另一个实施例是染色体10的重组核酸分子，该重组核酸分子包含插入到列为SEQ ID NO:70的核苷酸1至核苷酸172,841的染色体10上的异源核酸序列。优选的实施例是重组核酸分子，该重组核酸分子包含插入到列为SEQ ID NO:70的核苷酸18,206至18,246的染色体10上的异源核酸序列。另一个实施例是包含异源核酸的重组核酸分子，该异源核酸在其5'末端邻近SEQ ID NO:70的核苷酸16,206至18,206，并且在其3'末端邻近SEQ ID NO:70的核苷酸18,246至20,246。在另一个实施例中，本发明提供了具有插入到列为SEQ ID NO:70的核苷酸18,206至18,246的染色体10上的异源核酸的玉米基因组，其中该异源核酸包含SEQ ID NO:7。在另一个实施例中，本发明提供了具有插入到列为SEQ ID NO:70的核苷酸18,206至18,246的染色体10上的异源核酸的玉米基因组，其中该异源核酸包含SEQ ID NO:62、63、和/或SEQ ID NO:64。
本发明的另一个实施例是制备转基因玉蜀黍植物的方法，该方法包括在列为SEQID NO:70的核苷酸1至核苷酸172,841的染色体10上的位置插入异源核酸。一个优选的实施例是制备转基因玉蜀黍植物的方法，其中将异源核酸插入到列为SEQ ID NO:70的核苷酸18,206至18,246之间的染色体10上。另一个实施例是制备转基因玉蜀黍植物的方法，该方法包括在染色体10上的位置处插入异源核酸，其中该异源核酸在其5'末端邻近SEQ ID NO:70的核苷酸16,206至18,206，并且在其3'末端邻近SEQ ID NO:70的核苷酸18,246至20,246。
实例
通过参考以下具体的实例可以进一步描述本发明。这些实例仅仅是作为说明性的目的而提供的，并且不旨在进行限制，除非另外说明。本文使用的标准的重组DNA以及分子克隆技术是本领域已知的，并且描述于：Ausubel(编),Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学实验指南],John Wiley and Sons,Inc.[约翰威立父子公司](1994)；J.Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第3版,Cold Spring Harbor[冷泉港],NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press[纽约州：冷泉港实验室出版社](2001)；以及T.J.Silhavy,M.L.Berman,和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions[基因融合实验],Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],Cold Spring Harbor,NY[纽约州：冷泉港](1984)。
实例1.优良事件MZIR098的转化与选择
MZIR098事件是由农杆菌介导的近交玉米(玉蜀黍(Zea mays))系NP2222转化产生的。使用来自二元载体17629(PCT申请号PCT/US16/29424，其通过引用并入本文)的T-DNA片段，基本上如Negrotto等人(Plant Cell Reports[植物细胞报告]19:798-803,2000，其通过引用并入本文)所述的转化未成熟胚。载体17629含有核苷酸序列，该核苷酸序列包含eCry3.1Ab、mCry3A和PAT串联表达盒作为其T-DNA序列的一部分。第一表达盒包含NOS基因增强子区域，该区域衍生于根癌农杆菌的胭脂碱合酶(NOS)基因(eNOS-02；SEQ ID NO:38)，所述基因可操作地连接到夜香树黄化曲叶病毒启动子prCMP-04(SEQ ID NO:39；美国专利公开US 20040086447)，可操作地连接至工程化Cry毒素eCry3.1Ab(SEQ ID NO:40；于2008年10月9日公开的国际公开号WO 08/121633，其通过引用并入本文)，在3'末端可操作地连接至衍生于根癌农杆菌的胭脂碱合酶(NOS)基因的终止子序列(tNOS-05-01；SEQ ID NO:41)。第二表达盒包含基于泛素基因的组成型玉米启动子(prUbi1-18；SEQ ID NO:42；Christensen等人,1992,PMB[植物分子生物学]18:675-689)，所述启动子可操作地连接到修饰的Cry毒素mCry3A(SEQ ID NO:43；美国专利号7,030,295)，在其3'末端可操作地连接到衍生于NOS基因的终止子序列(tNOS-20；SEQ ID NO:44)。第三表达盒包含CaMV 35S启动子(pr35S-04-01；SEQ ID NO:45)，所述启动子可操作地连接到PAT编码序列(cPAT-08；SEQID NO:46)，在其3'末端可操作地连接到衍生于NOS基因的终止子序列(NOS-05-01；SEQ IDNO:41)。包含这三个表达盒的T-DNA序列为SEQ ID NO:7。
从8至12天的穗上切下未成熟胚并用新鲜的培养基冲洗以为转化作准备。将胚与携带二元载体17629的农杆菌细胞的悬浮液混合，涡旋30秒，并且允许另外孵育5分钟。抽吸过量的农杆菌溶液，然后将胚移至包含非选择性培养基的平板上。将胚在22℃、黑暗中与其余农杆菌共培养2-3天。在该转化过程中使用PAT基因作为选择性标记(Negrotto等人，2000)。将产生胚发生的愈伤组织的胚转移到一系列包含双丙氨磷作为选择剂的细胞培养物选择培养基中总共培养10-11周。该选择培养基含有200mg/ml的特美汀和/或10ml/l PPM(植物防腐剂混合物)，以确保从转化组织中清除农杆菌。
通过TaqMan PCR分析(参见实例2)测试再生的小植株中eCry3.1Ab、mCry3A和PAT基因的存在，以及载体17629主链上抗生素抗性大观霉素(spec)基因的不存在。将对所有转基因阳性并且对spec基因阴性的植物转移至温室中用于进一步繁殖。然后第二次使用TaqMan PCR分析来对事件进行分析，这次确定转基因的拷贝数。然后使用ELISA对单拷贝事件的转基因蛋白进行分析(参见实例7)。然后，使鉴定出具有良好蛋白水平的事件生长至成熟。验证了这些转基因事件中转基因的编码序列，以鉴定转基因蛋白序列中具有突变的事件。最后，使用Fluidigm BioMark系统(富鲁达公司(Fluidigm Corporation)，旧金山，加利福尼亚州，美国)分析了其余事件的T-DNA插入物的完整性，以确定是否将全长单拷贝的T-DNA插入基因组事件中。最终鉴定了具有良好结实率的事件，这些事件是自交的产物，又是来自异交的产物。
表1：T0事件选择
Figure BDA0002316750130000591
如表1所示，进行了大规模的玉米转化工作，其中将超过42,000个胚进行转化以产生2,043个推定的任何拷贝事件。任何拷贝事件都可能在基因组的多个位置处含有多个T-DNA插入和/或在给定插入位点处含有全部或部分重复和/或T-DNA重排。通过主要的TaqMan分析推定地确定这些中的610个具有单个插入，同时没有主链污染。在ELISA表达分析后，确定196个事件具有所有性状基因的所希望的表达水平，并选择用于另外的广泛分子表征。该分子表征包括验证编码序列以消除具有改变的蛋白质编码序列的事件。该分子表征数据与温室种子产率一起用于选择总共109个事件。通过DNA印迹对这些事件中的每一个进行分子分析。为了继续，需不含17629个载体主链的事件仅包含一个完整的T-DNA插入的拷贝，并且没有遗传重排。mCry3A和eCry3.1Ab编码序列含有100％同一性的长序列(1400bp)，因此在转基因内或插入基因组期间发生重排的可能性很高。这些事件均通过Southern分析进行评估。基于那些结果，选择了92个无主链、完整(无基因重排)的单拷贝事件用于田地试验。
田地试验典型地包含来自每个测试事件的杂种系，其中每个样地的每个杂种至少有6株植物，每个位置三个重复，并且至少评估了两个位置。对于田地试验，使用ISU(爱荷华州立大学(Iowa State University))0-3量表评估西方玉米根虫的损伤。所有田地试验均包括转基因事件MIR604(包含mCry3A，但不包含eCry3.1Ab)、转基因事件5323(包含eCry3.1Ab，但不包含mCry3A)以及由MIR604与5323杂交产生的转基因杂种的阳性对照。所有田地试验还包括阴性对照，即非转基因玉米。还评估了事件对除草剂的耐受性；在V4玉蜀黍发育阶段以
Figure BDA0002316750130000601
的最大标记率的2x或4x对它们进行喷洒。还评估了事件的农艺学性能，包括产率。选择与阳性对照和阴性对照相比表现最好的事件以继续。
在两年的田地试验数据之后，使用与上述那些相似的测定方法，基于性状和农艺学性能选择了35个事件。在另外两次田地试验之后，选择了18个事件进行进一步评估，并且最后在广泛的事件选择试验中评估了12个事件(参见实例8)。这些田地试验包括对在V6和V8发育阶段收获的田地生长根样品进行性状表达研究。这些样品是从植物的根(来自这12个事件中的每个)中获得的，这是CRW田地功效试验的一部分。简而言之，获得根，评估CRW损伤，冻干，研磨，并将100mg冻干的根组织用于mCry3A和eCry3.1Ab ELISA测定，测定与实例7所述的相似。还通过ELISA分析了来自转基因MIR604植物(表达mCry3A)和来自转基因5323(表达eCry3.1Ab)的根样品作为阳性对照。
还对12个事件进行侧翼序列恢复，使得鉴定并表征了转基因插入的基因组位置。高质量基因组插入有许多标准。首先，转基因插入不能在基因组的基因区域中。基因区域被理解为包括5'非翻译区(UTR)、外显子、内含子和3'-UTR。此外，转基因插入不能在启动子区域。估计启动子区域在基因上游2千碱基(kb)处。此外，高质量的连接序列不包含“连接ORF”，它是跨越T-DNA和基因组DNA连接的推定开放阅读框(ORF)。连接ORF由“ATG”核酸序列启动，该连接可能是由于T-DNA随机插入基因组而创建的，其中基因组序列断裂并且可能发生核酸序列的小的插入、缺失和/或重排。连接ORF可以包含序列，如果表达，则该序列可含有与已知过敏原的氨基酸序列相似的氨基酸序列。因此，连接ORF是非常不希望的，并且不能在高质量的基因组插入或优良转基因事件中发生。
在选择用于进一步研究的12个事件中，有7个在基因区域或启动子区域具有T-DNA插入。对于另一方面，无法测序RB，这提示插入时发生T-DNA重排。在其余四个候选事件(MZIR098、MZIR08G、MZIR0AN和MZIR0BC)中，事件08G在V8生长阶段的根中的mCry3A表达与MIR604阳性对照相比较低，并且对于在V4和V8生长阶段两者，根中的eCry3.1Ab表达低于事件5323阳性对照。其余三个事件至少在阳性对照水平上表达了mCry3A和eCry3.1Ab。然而，只有事件MZIR098令人惊讶地且意外地表达了mCry3A，其表达水平明显高于MIR604。事件MIR604是一个优良事件，选择该事件的原因在于它在其姊妹事件中具有最佳mCry3A表达，此外还具有高质量的基因组插入和连接序列以及出色的农艺学性能。事件MZIR098具有更高水平的mCry3A蛋白(尤其是在CRW昆虫有害生物摄食玉米植物的根中)的这一发现是无法预料和意外的。
基于所有性状功效试验、农艺学试验、分子和基因组表征以及根中mCry3A和eCry3.1Ab的蛋白水平的组合，只有一个事件被明确鉴定为有可能成为优良事件。该事件是MZIR098。在许多不同的杂交遗传背景下，对事件MZIR098植物的CRW功效、CRW高压农艺学等效性测试和农艺学性能进行了进一步评估。试验在40个地点进行了三年。评估的农艺学性状包括产率、倒伏、开花、植物高度和病害压力。试验表明，事件MIZ098在不同环境压力和多种遗传背景下，在多个生长季节、多个地点均具有出色的农艺学性能。
包含MZIR098事件的植物的优异性能是由于转基因本身的完整性和转基因插入到玉米基因组中特定位置，该转基因插入支持转基因上编码的性状基因的高表达并因此具有很高的功效，并且进一步不会对植物性能产生任何负面影响。此外，从多种遗传背景产生的所有MZIR098杂种的而没有负面影响的高农艺学性能和性状功效进一步展示了MZIR098事件的新颖性。同样，这是由于转基因的确切基因组位置和转基因插入的特征，这由连接序列的核酸序列(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)描述。因此，事件MZIR098被认为是优良事件，并且其被选作商业发布的主要事件。图1说明了插入玉米基因组中的MZIR098的转基因。
实例2.通过TaqMan PCR的优良事件MZIR098检测
开发了实时的MZIR098-特异性聚合酶链式反应(PCR)方法，以检测和定量从种子、颗粒和其他植物材料样品中提取的MZIR098脱氧核糖核酸(DNA)。该方法由作为参考的玉蜀黍特异性PCR方法和用于检测和定量MZIR098玉蜀黍DNA的事件特异性PCR方法组成。该方法可用于确定事件MZIR098玉蜀黍DNA相对于样品中总玉蜀黍DNA的相对含量。
为了特异性检测MZIR098玉蜀黍基因组DNA，使用了两个特异性引物(SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11)，以扩增跨越5'插入物-至-植物基因组连接(SEQ ID NO:13)的区域的73-bp片段。对照引物组和探针(例如内源玉蜀黍基因)可以用作阳性对照。通过测量由MZIR098-特异性寡核苷酸探针(SEQ ID NO:12)产生的荧光实时确定每个循环中PCR产物的量，该特异性寡核苷酸探针在其5'末端标记有作为报道染料的6-FAMTM并且在其3'末端标记有作为淬灭剂的
Figure BDA0002316750130000621
-1plus。引物和探针如表2所示。
公认的是，其他引物组合可用于检测MZIR098连接序列。例如，为了检测5'连接序列(SEQ ID NO:1)，第一引物可以选自SEQ ID NO:10、14、15、16、38、42、65或其互补序列，并且第二引物可以选自SEQ ID NO:11、17、22、23、24、25、29、43、46、47、48、49或其互补序列。本领域技术人员将认识到，包含来自5'侧翼序列的序列(SEQ ID NO:8，或其互补序列)的第一引物和包含来自转基因内部的序列(SEQ ID NO:7，或其互补序列)的第二引物可以在PCR反应中成对起作用，以产生包含5'连接序列(SEQ ID NO:1)的扩增子，并且该扩增子可以通过例如探针检测。类似地，为了检测3'连接序列(SEQ ID NO:2)，第一引物可以选自SEQ IDNO:19、20、21、36、41、45、67或其互补序列，并且第二引物可以选自SEQ ID NO:18、31、33、34、35、37、50、52或其互补序列。本领域技术人员将认识到，包含来自3'侧翼序列的序列(SEQ ID NO:9，或其互补序列)的第一引物和包含来自转基因内部的序列(SEQ ID NO:7，或其互补序列)的第二引物可以在PCR反应中成对起作用，以产生包含3'连接序列(SEQ IDNO:2)的扩增子，并且该扩增子可以通过例如探针检测。重要的是要注意这些连接序列对于本文所述的发明是新颖的。因此，仅借助本披露，技术人员将知道新颖的且对于事件MZIR098独特的连接序列，并且也有对它们进行检测的动机。
基本如Ingham等人所述的(Biotechniques[生物技术],31:132-140,2001，将其通过引用并入本文)来进行TaqMan分析。简而言之，基本上根据生产者的说明(除了所有步骤在1.2ml的96孔板中进行以外)使用
Figure BDA0002316750130000631
(基因组DNA提取试剂盒)(根特拉体系股份有限公司(Gentra Systems)，明尼苏达州(Minneapolis,MN))将基因组DNA从转基因和非转基因玉米植物的叶中分离出来。将干燥的DNA沉淀再次悬浮在TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA)中。
TaqMan PCR反应在96孔板中进行。对于内源玉米基因对照，设计了对玉蜀黍醇脱氢酶(Adh)基因具有特异性的引物和探针(Genbank登录号AF044295)。普通技术人员会认识到其他玉米基因可用作内源对照。
表2：通过TaqMan PCR的优良事件MZIR098检测
Figure BDA0002316750130000641
下表显示了事件MZIR098-特异性TaqMan PCR的主混合物：
表3：通过TaqMan PCR的MZIR098检测
Figure BDA0002316750130000642
*补充有磺基罗丹明101和11mM MgCl2
使用以下扩增参数在ABI Prism 7700仪器中进行PCR：在95℃进行10分钟，接着在95℃进行15秒的40个循环，并在60℃进行1分钟。PCR可以在ABI 7900HT，GeneAmp PCR系统9700或任何其他适当的系统上运行。使用ABI 7900HT上的SDS软件分析数据。结果验证了上述方法学，验证了该方法学已成功鉴定了衍生于玉米组织(包括种子、颗粒和其他植物材料样品)的生物样品中的MZIR098事件。
实例3.通过DNA印迹的优良事件MZIR098检测
通过DNA印迹分析和核苷酸测序的手段对优良事件MZIR098的T-DNA插入物进行了广泛的遗传表征。通过DNA印迹分析和通过检查至少三代MZIR098玉蜀黍的转基因的遗传模式来评估插入物的遗传稳定性。测序结果证实了T-DNA中每个功能性元件的预期拷贝数。另外，对位于MZIR098插入物侧翼的玉米基因组序列进行鉴定和表征。还确定了MZIR098插入物没有破坏任何已知玉米基因的功能。这些数据共同证明，由于T-DNA插入没有使MZIR098基因组中发生有害变化，这进一步证明了MZIR098是优良事件。
通过确定载体17629T-DNA整合位点的数目、载体17629主链序列的存在或不存在、以及T-DNA的外源片段的添加，进行DNA印迹分析以表征MZIR098玉蜀黍的转基因插入物。DNA印迹分析中使用的MZIR098玉米代包括T2(来自穗4和穗35的两个样品)、T3、T4、T5和F1。T2至T5代处于遗传背景NP2222中。F1代位于背景NP2391/NP2222中，并且代表了商业玉米杂种。包括了五代MZIR098玉米，以证明T-DNA插入物在多代中的稳定性。对照物质是非转基因的、近等基因的NP2222、NP2391和NP2222/NP2391玉米。所有材料均在温室中生长。对来自七种植物的叶组织进行采样、合并、并进行DNA提取。通过Murray和Thompson(1980,NucleicAcids Research[核酸研究],8:4321-4325)所述的方法修饰的方法，将用于DNA印迹分析的基因组DNA从叶组织中分离。
将不同细菌宿主中其重复和选择所必需的载体元件归类为“载体主链”(T-DNA以外的区域)。在DNA印迹分析中，通过使用两个主链特异性探针确定载体主链的存在或不存在，这些探针一起覆盖了T-DNA以外的载体17629的每个碱基对。预期这些元素在T-DNA转移期间不会转移到植物细胞或整合到植物基因组中。
每个DNA印迹分析均用从MZIR098玉米和非转基因的近等基因玉米中提取的基因组DNA进行，将其用作阴性对照，以鉴定与探针杂交的任何内源玉米DNA序列。为了证明分析的敏感性，每个分析还包括两个阳性测定对照，分别代表玉米基因组中已知大小的DNA片段的每个基因组的1个拷贝和1/7个拷贝。阳性测定对照是PCR扩增的片段，这些片段对应于两个主链特异性探针或对应于在MZIR098玉米插入物表征中使用的T-DNA特异性探针。
将T-DNA特异性探针和主链特异性探针1和2的阳性测定对照与7.5μg来自非转基因的近等基因的NP2222/NP2391玉米的消化DNA一起加载到孔中，以便更准确地反映它们玉米基因组矩阵中的迁移速度。在不存在非转基因玉米基因组DNA的情况下，对T-DNA特异性探针的阳性测定对照进行了分析，使得内源带不会混淆阳性测定对照。
通过两种限制性酶消化策略分析了玉米基因组DNA。在第一种策略中，用在MZIR098插入物内和位于MZIR098插入物侧翼的玉米基因组中切割的酶来消化基因组DNA。该第一种策略用两种不同的酶进行两次，以确定MZIR098玉米基因组中载体17629T-DNA插入物的数量以及MZIR098玉米基因组其他区域中插入物的外源DNA片段的存在或不存在。使用的酶是HindIII和XcmI。在第二种策略中，用限制性酶来消化基因组DNA，这些限制性酶在插入物内切割，以释放可预测大小的DNA片段。该策略用于确定MZIR098玉米基因组内每个位置的T-DNA拷贝数、插入物的完整性、以及任何紧密连接的外源T-DNA片段的存在或不存在。使用的酶是BmtI、HindIII、和XcmI。BmtI在T-DNA插入物以外切割侧翼序列。用于检测T-DNA插入物的探针包含全长T-DNA(SEQ ID NO:7)。
用限制性酶切下约7.5μg/泳道的基因组DNA样品，并在约32伏特的1X TBE缓冲液中的琼脂糖凝胶上电泳过夜。将凝胶照相、洗涤、并用10X SSC作为转移溶液印迹到尼龙膜上。将它们用紫外线连接到膜上，并在65℃与小牛胸腺DNA预杂交。将探针用放射性磷32标记。添加探针并在65℃杂交3小时至过夜。将印迹洗涤若干次并在磷光成像盒(phosphorimager cassette)中曝光。将图像被显影并评分。
使用这两种策略之一进行的印迹均未检测到意外的带，这进一步支持了MZIR098玉蜀黍事件是优良事件，包含完好无损的单拷贝T-DNA(没有检测到来自载体17629主链或来自部分二级T-DNA插入的载体的外源DNA片段)。此外，DNA印迹分析证明，在所有包含从T2(耳穗4)、T2(耳穗35)、T3、T4、T5或F1代的MZIR098玉米植物中提取的基因组DNA的泳道中，对MZIR098插入物具有特异性的杂交带均相同。这些结果支持如下结论，MZIR098插入物可以稳定地从一代遗传到下一代，并且MZIR098玉米含有单个T-DNA插入物。
实例4：优良事件MZIR098的T-DNA插入物的孟德尔遗传
这项研究的目的是通过确定与玉蜀黍近交物回交(BC)的三代MZIR098玉蜀黍的分离率来确定eCry3.1Ab、mCry3A和PAT-08的孟德尔遗传率。在这项研究之前，将F2代半合子MZIR098玉蜀黍植物与非转基因玉蜀黍系NP2391杂交。将产生的F1代与非转基因轮回亲本(NP2391)回交，以产生BC1F1代。将来自BC1F1代的MZIR098玉蜀黍植物再与非转基因轮回亲本(NP2391)回交三次，以产生BC2F1、BC3F1和BC4F1代。在每次回交中均使用如通过草铵膦除草剂抗性和实时PCR分析所确定的阳性半合子分离物。通过实时聚合酶链式反应(PCR)分析，测试来自与玉蜀黍近交物回交(BC)的三代MZIR098玉蜀黍(BC2F1、BC3F1、和BC4F1代)的单个植物中eCry3.1Ab、mCry3A和PAT-08的存在。将实时PCR分析的结果用于确定eCry3.1Ab、mCry3A、和PAT-08的分离率。每个基因的预期分离率在每代中为1:1(即，预期每代中有50％的植物携带该基因)。对分离数据进行卡方分析以测试以下假设：MZIR098事件是根据孟德尔原理遗传的，这与插入玉蜀黍核基因组内的染色体一致。
预期和观察到的分离率示于表4中。基因eCry3.1Ab、mCry3A和PAT-09共分离(即，当一个基因存在时，另外两个基因也存在)。根据孟德尔遗传在α＝0.05时不符合分离假设的临界值为3.84。对于测试的每一代，所有卡方值均小于3.84，这表明根据孟德尔原理，eCry3.1Ab、mCry3A、和PAT-08以可预测的方式遗传。这些结果支持了以下结论，MZIR098 T-DNA插入物整合到玉米核基因组内的染色体。
表4：事件MZIR098的转基因的孟德尔遗传
Figure BDA0002316750130000681
a eCry3.1Ab、mCry3A、和PAT-08的观察到的频率相同；这三个基因分离为一个基因座。
*P<0.05(χ2<3.84)。
实例5：侧翼DNA序列的分析
使用衔接子PCR进行侧翼序列回收，其中使用与载体17629的靶TDNA边界序列(如下所示例的)具有同源性的基因特异性引物，结合与衔接子具有同源性的另一种引物，该衔接子连接于自包含事件MZIR098的玉米植物的消化的基因组DNA。一级衔接子PCR之后是二级衔接子PCR(巢式PCR)，其中使用与载体17629的靶TDNA边界序列具有同源性的巢式基因特异性引物，结合与相同衔接子具有同源性的另一巢式引物。
将GenomeWalkerTM通用试剂盒(克罗泰克公司(Clontech)，目录号638904)用于回收位于事件MZIR098的转基因插入物侧翼的基因组序列。通过将8μl基因组DNA(20至100ng/μl)、1μl钝性限制性酶(在分开反应中的PvuII、EcoRV或StuI)和对于选择的酶具有特异性的1μl消化缓冲液组合，然后在37℃孵育过夜，完成限制性酶消化。通过将限制性酶切产物与0.475ul GenomeWalker衔接子、1.1ul 10X T4 DNA连接酶缓冲液和0.125ul T4 DNA连接酶组合，然后在16℃孵育过夜，将消化的基因组DNA连接到GenomeWalker衔接子上。对连接的产物进行热处理以使酶失活，并用于一级衔接子PCR和二级衔接子PCR中以回收侧翼序列。使用GenomeWalkerTM通用试剂盒的制造商推荐的PCR参数，用西格玛公司(Sigma)高保真酶(西格玛公司，目录号D1313)进行一级PCR和二级(巢式)PCR。
使用标准PCR程序来证实5’和3'侧翼序列和连接序列。使用SEQ ID NO:14至SEQID NO:16中列出的第一多核苷酸引物与SEQ ID NO:17中列出的第二多核苷酸引物组合来证实该5'侧翼序列和连接序列(参见下表6)。使用SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21中列出的第一多核苷酸引物与SEQ ID NO:18的第二多核苷酸引物组合来证实该3'侧翼序列和连接序列(参见下表)。普通技术人员应认识到其他引物序列也可用于证实该侧翼序列和连接序列。
表5：用于确认侧翼序列和连接序列的引物
Figure BDA0002316750130000691
事件MZIR098的5'侧翼序列和3'侧翼序列均用于搜索玉蜀黍基因组数据库。在染色体10(MAIZE_REF_3_GENOME)和BAC克隆(NCBI登录号AC204437.3)上发现了与两个侧翼序列相同的匹配。使用这个信息，可以确定的是被插入到事件MZIR098中的异源DNA替换了玉蜀黍基因组DNA的39个核苷酸，它位于5'侧翼序列(缺失的序列的上游)与3'侧翼序列(缺失的序列的下游)之间。
发现事件MZIR098插入物的右侧边缘(5'侧翼序列)上是示于SEQ ID NO:8中的玉米基因组序列侧翼，并且其左侧边缘(3'侧翼序列)上是示于SEQ ID NO:9中的玉米基因组序列侧翼。5'连接序列在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3中列出。3'连接序列在SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中列出。事件MZIR098中的17629载体转基因的基因组整合位点包含在SEQ IDNO:70及其互补序列SEQ ID NO:71中。更具体地说，事件MZIR098的基因组整合位点位于NCBI登录号AC204437.3(SEQ ID NO:70)的18,206-18,246之间。
实例6：T-DNA插入物测序
存在于事件MZIR098中的整个转基因DNA插入物的核苷酸序列被确定用来证明该插入物的总完整性、功能性元件的连续性以及用来检测任何单独的碱基对改变。从衍生于单个植物的基因组DNA中以重叠片段来PCR扩增事件MZIR098插入物，以覆盖整个TDNA插入物，该插入物在两侧均与其5'侧翼序列和3'侧翼序列连接。
表6：用于重叠PCR的引物序列组合
Figure BDA0002316750130000701
Figure BDA0002316750130000711
使用高保真酶(西格玛公司，目录号D1313)进行PCR扩增，其中针对不同的靶区域调整PCR参数。在一个实例中，使用以下参数进行PCR：在96℃下30秒持续1个循环，随后在94℃下30秒持续35个循环，在60℃下30秒，并在68℃下3分钟，随后在68℃下7分钟持续1个循环。在另一个实例中，使用以下参数进行PCR：在95℃下5分钟持续1个循环，随后在94℃下30秒持续35个循环，在59℃下30秒，并在68℃下1至7分钟，随后在68℃下10分钟持续1个循环。
对从重叠PCR扩增获得的PCR产物进行测序之前，使用以下方案，用EXO-SAP处理：通过将核酸外切酶I(USB，目录号72073)、虾碱性磷酸酶(USB，目录号70092Z)和EX-SAP缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgCl2)以1:1:2组合制备EXO-SAP主混合物。向每种PCR产物中添加1/10体积的EXO-SAP主混合物。将反应在37℃持续30分钟，随后在80℃持续20分钟，以使酶失活。
使用具有ABI
Figure BDA0002316750130000721
化学的ABI3730XL DNA分析仪进行测序。通过组合来自不同PCR扩增子的序列数据来确定最终的共有序列，以生成事件MZIR098插入物(SEQ IDNO:7)的共有序列，该序列在每一侧都与其5'基因组序列和3'基因组序列连接(SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9)。SEQ ID NO:6包含具有100bp的5’和3’侧翼基因组序列的全长T-DNA插入。c
事件MZIR098插入物的共有序列数据证明，该插入物的总完整性以及该插入物中功能性元件的连续性已经如pSYN17629中所预期的那样被保持了。因此，核苷酸序列分析证明MZIR098插入物含有每个功能元件(eCry3.1Ab、mCry3A、PAT-08、eNOS-02增强子、prCMP-04启动子、prUbi1-18启动子、pr35S-04启动子，以及tNOS-05-01和tNOS-20终止子)的单个拷贝。
实例7：通过ELISA检测优良事件MZIR098eCry3.1Ab、mCry3A、和PAT蛋白
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)对各种MZIR098玉米组织中eCry3.1Ab、mCry3A和PAT的浓度进行定量，以建立如MZIR098玉米中产生的这些蛋白的表达谱。所分析的组织是处于四个生长阶段(V6、R1、R6和衰老)的叶和根，处于三个阶段(V6、R1和R6)的完整植物，处于两个阶段(R6和衰老)的籽粒，以及花粉(阶段R1)。这些组织是从MZIR098玉米和非转基因的近等基因的对照玉米中收集的，这些玉米是根据当地农艺学惯例在2013年在美国四个地点同时种植的。这些研究中使用的植物的基因型为NP2391×NP2222(MZIR098)和NP2391×NP2222。
在每个地点，一个样地种植MZIR098玉米，并且一个样地种植非转基因玉米。针对MZIR908，从每个样地收集了每种组织类型的五份重复样品；针对非转基因对照，收集两个重复样品。针对叶，每个样品收集一株植物的所有真叶。针对根，每个样品收集不包括支柱根的整个根团。针对花粉，每个样地从10到15个雄穗收集合并的样品。针对完整植物，每个样品收集包括根团在内的整个植物。针对籽粒，每个样品收集来自一株植物的初生穗的所有籽粒。将除花粉以外的所有组织样品研磨成粉末，并且将所有样品冻干。由冻干之前的样品新鲜重量和冻干之后的样品干燥重量确定每个样品的干燥重量百分比(DW)。
从冻干的组织样品的代表性等分试样中，以3ml蛋白质提取缓冲液(PBST缓冲液)比约30mg冻干的组织的比例来提取蛋白质。将样品均质化、离心，并收集上清液。对于花粉样品，使用KLECO均质器均质约25mg冻干的花粉。然后添加硼酸盐提取缓冲液，并将样品在冰上孵育至少20分钟、离心，并收集上清液。将样品在ELISA稀释剂(含1％BSA、0.05％Tween-20的PBS)中稀释。
按照标准技术，使用兔抗G6-Cry1Ab和偶联碱性磷酸酶的驴抗兔免疫球蛋白G来定量eCry3.1Ab。使用标准方法，使用针对修饰的Cry3A的QualiPlateTMELISA试剂盒，对mCry3A进行定量。使用针对
Figure BDA0002316750130000731
PAT/pat的QualiPlateTMELISA试剂盒对PAT进行定量。对样品提取物的每种特性蛋白一式两份或一式三份进行分析，并用已知量的相应参考蛋白为每个ELISA板生成标准曲线。对来自非转基因玉米的组织的同时分析证实了植物基质对分析方法没有影响。针对提取率调整所有蛋白质浓度。
对于草铵膦处理的MZIR098玉蜀黍，eCry3.1Ab蛋白的浓度范围从花粉检测限以下到叶(V6阶段)中45.94μg/g新鲜重量。籽粒(衰老)中eCry3.1Ab蛋白的算术平均表达值为1.42±0.56μg/g新鲜重量。mCry3A蛋白的浓度范围从根(衰老)中0.72μg/g的新鲜重量到花粉中236.71μg/g的新鲜重量。籽粒(衰老)中mCry3A蛋白的算术平均表达值为7.55±1.58μg/g新鲜重量。PAT蛋白的浓度范围从花粉、根和籽粒(R6和衰老)，叶(衰老)和完整植物(R6)的检测限以下到叶(V6)中1.75μg/g的新鲜重量。
对于未处理的MZIR098玉蜀黍，eCry3.1Ab蛋白的浓度范围从花粉检测限以下到叶(V6阶段)中46.68μg/g新鲜重量。籽粒(衰老)中eCry3.1Ab蛋白的算术平均表达值为1.50±0.79μg/g新鲜重量。mCry3A蛋白的浓度范围从根(衰老)中0.53μg/g的新鲜重量到花粉中246.96μg/g的新鲜重量。籽粒(衰老)中mCry3A蛋白的算术平均表达值为8.30±2.02μg/g新鲜重量。PAT蛋白的浓度范围从花粉、叶、根和籽粒(R6和衰老)以及完整植物(R6)的检测限以下到叶(V6)中1.85μg/g的新鲜重量。
实例8：优良事件MZIR098的昆虫控制田地功效
在三个地点种植12个具有阳性和阴性对照的不同转基因事件的田地试验株。每个地点的每个事件有三个重复，并且每个重复被种植在三个20英尺长的行中，其中收获中心行用于根表达研究和根损伤等级。对于每个重复，取样10株植物。田地试验依赖于玉米根虫的天然群体。当样地中80％的幼虫达到蛹化时，将根在V10阶段挖出、洗涤以去除土壤、并使用0-3的节点损伤量表进行评级(Oleson等人,2005,J.Econ.Entomol.[经济昆虫学期刊]98:1-8)。分析之后，将每个根团的约50％切成大块、冷冻、研磨并冻干，并将100mg冻干的根组织用于ELISA测定。如实例7所述，通过ELISA确定来自12个事件中每一个的V6和V8植物的根样品中存在的mCry3A和eCry3.1Ab蛋白的量。还通过ELISA分析了来自转基因MIR604植物(表达mCry3A)和来自转基因5323(表达eCry3.1Ab)的根样品作为阳性对照。
使用SAS JMP统计软件包(JMP SAS机构(JMP SAS Institute)2010)，通过单向方差分析(ANOVA)对表达数据和根损伤等级(RDR)进行分析。将Student的成对t检验用于平均值分离以区分处理差异。在P<0.05的下，所有测试的结果均被认为具有统计学显著性。V6和V8根中的mCry3A和eCry3.1Ab蛋白水平以及CRW RDR的结果示于下表7中。
表7：田地试验的平均根蛋白水平和RDR
Figure BDA0002316750130000751
*平均根损伤等级(RDR)
事件之间在同一列中后跟相同字母的平均值在统计上没有差异(P<0.05)。使用Student的t检验来分离平均值
实例9：通过终点TaqMan PCR的优良事件MZIR098的接合性确定
该方案描述了用于确定包含优良事件MZIR098的单个植物中存在的事件MZIR098的接合性状态的程序。该方法使用双重终点TaqMan PCR，其中一个反应对事件MZIR098插入具有特异性，而另一反应对其中事件MZIR098转基因DNA整合到的相应野生型等位基因序列具有特异性。该野生型等位基因序列可以称为天然插入位点。由于事件MZIR098已渗入大量玉米种质中，因此需要确定适合天然插入位点的引物/探针，该引物/探针适合于尽可能多的品种。
使用本领域已知的方法制备来自生物样品的DNA样品。引物/探针主混合物按50x原液制备，其中引物浓度为15μM，并且探针浓度为5μM。下表(表8)列出了10μL反应的每种试剂和量：
表8：通过终点TaqMan PCR的接合性确定
组分 体积/反应
DNA样品(10-20ng DNA/μL) 3.0μL
JumpStart<sup>TM</sup>ReadyMix<sup>TM</sup>(2x)<sup>1</sup> 5.0μL
MZIR098的50x引物/探针主混合物<sup>2</sup> 0.2μL
野生型等位基因的50x引物/探针主混合物<sup>2</sup> 0.2μL
无核酸酶的水 1.6μL
总体积 10.0μL
1添加MgCl2和磺胺多巴胺101
2最终浓度300nM(每个引物)和100nM(每个探针)
对于表8，用于检测事件MZIR098的引物的序列为5’-ATCTCAGACACCAAACCGAGATC-3’(SEQ ID NO:10)和5’-ACACCGTTAGGCTAGTGCCAGT-3’(SEQ ID NO:11)。MZIR098探针的序列为5’-CAAGTGACAGCGAACGGAGCTGGTTT-3’(SEQ ID NO:12)。对于天然插入位点，针对位于T-DNA插入物侧翼的基因组序列来设计引物/探针组。可替代地，用于天然插入位点的引物/探针组可包括多个引物和多个探针。由于不同玉米品种之间的序列差异，该设计比单一引物-探针测定涵盖更多品种。在这个实例中，使用了两个正向引物(5’-ACCAAACCGAGATCCAAGTGA-3’；SEQ ID NO:65和5’-GCGCGTCGACCTGCAC-3’，SEQ ID NO:66)，一个反向引物(5’-GCATGGTTCCTTGTCGGC-3’；SEQ ID NO:67)和两个天然插入位点探针(5’CTAGTTGTACCTGCCCCCGCCTG-3’；SEQ ID NO:68和5’AACGGAGCTGCCCCCGCC-3’；SEQ ID NO:69)。
使用以下扩增参数在ABI 7900HT仪器中进行PCR：在95℃进行10分钟，接着在95℃进行15秒的40个循环，并在60℃进行1分钟。PCR可以在ABI Prism 7700、GeneAmp PCR系统9700或任何其他适当的系统上运行。使用ABI 7900HT上的SDS软件分析数据。数据分析包括基于簇位置进行调用(Hom、Het、无效(Null))，如图2所示。结果指示该生物样品是否：来自“纯合”玉米植物，或在每个染色体10上均包含MZIR098事件的一个拷贝(总共有MZIR098事件的两个拷贝)；“杂合的”，其中植物在一个染色体10中包含事件MZIR098，但第二个染色体10中不包含该事件；或“无效”，其中事件MZIR098在所评估的玉米植物的染色体10二者之一上均不存在。确定玉蜀黍植物中存在事件MZIR098的多少拷贝对于育种目的是有用的，使得可以确定事件MZIR908在所得杂种子代中的分离。
实例10：优良事件MZIR098插入位点在玉蜀黍中进行靶向整合的用途。
优良事件MZIR098侧翼序列披露于SEQ ID NO:8(5'侧翼序列)和SEQ ID NO:9(3'侧翼序列)中，并用于搜索玉蜀黍基因组数据库。在染色体10上的BAC克隆CH201-411G1(NCBI登录号AC204437.3；SEQ ID NO:70)上发现了与两个侧翼序列的匹配。使用这个信息，可以确定的是优良事件MZIR098插入是在染色体10上在NCBI登录号AC204437.3(SEQ IDNO:70)的核苷酸18,206-18,246之间的玉米基因组中。此外，使用玉蜀黍B73参考RefGen_v4(AGPv4，2016年8月)，将侧翼序列用于确定MZIR098插入位点在玉蜀黍B73的可公开获得的玉蜀黍参考集合(assembly)上的物理位置。该参考集合由亚利桑那基因组学研究所(Arizona Genomics Institute)创建。该集合针对Chado中的corn_v4，并且组分BAC克隆的染色体假集合由物理图谱(也称为玉蜀黍附加黄金路径(maize accessioned goldenpath，AGP))引导。SEQ ID NO:8(5'侧翼)与染色体10上的物理位置145,988,054-145,988,634对齐，并且SEQ ID NO:9(3'侧翼)与染色体10上145,988,674-145,988,730和145,989,526-145,990,048对齐。SEQ ID NO:9的片段化可能是由于玉米品种的基因组差异(原始事件MZIR098已进入NP2222，并且该比对与品种B73相比)，或者是由于基因组测序或B73基因组当前集合中的集合的错误。无论如何，MZIR098插入物位于B73染色体10的大约145,988,634-145,988,674上，这是任何玉米品种基因组的相关参考点。可使用玉蜀黍B73RefGen_v4(AGPv4，2016年8月)数据源，在玉蜀黍遗传学和基因组学数据库(Maize Genetics andGenomics Database(maizegdb.org))上在线找到此位置。
使用50k SNP Illumina Infinium芯片(亿明达公司(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚)生成的可公开获得的数据，鉴定了位于MZIR098插入位点侧翼的分子标记。50k SNPIllumina Infinium芯片是一个56,110个玉蜀黍SNP的Illumina BeadChip阵列，其从B73基因开发，并最初在多种种质上进行了验证(美国、欧洲和野生近缘种；Ganal等人2011,PlosOne[公共科学图书馆·综合]6(12):e28334.doi:10.1371)。这些SNP标记中约有50％(28,156)已被映射到非常高分辨率的IBM和LHRF绘制板上(Ganal等人2011)。使用公开的Illumina Infinium玉蜀黍50k SNP芯片标记名称，MZIR098插入位点位于标记SYN23814和PZE110102022之间。更广泛地说，MZIR098插入位于标记组之间。关于玉米B73品种(RefGen_v4，AGPv4，2016年8月)的基因组中的标记基因座的位置描述于玉蜀黍遗传学和基因组学数据库互联网资源(maizegdb.org)中。
玉米优良事件MZIR098在田地条件下经过若干代的一致农艺学性能说明这些在玉米优良事件MZIR098插入位点周围的被鉴定的基因组区域为其他目的转基因基因的靶向整合提供了良好的基因组位置。此类靶向的整合克服了所谓的“位置效应”的问题，其中转基因可以插入基因组的转录沉默区域，或者可以通过插入或紧密接近于天然基因来破坏天然基因的功能或表达模式。这种靶向的整合的其他优点包括但不限于：减少了在获得转基因植物(该植物展示所希望水平的转基因表达而不同样展示由该转基因的不经意的插入至宿主基因组中的重要基因座导致的异常)之前，筛选和测试数千个随机插入的转基因事件所需的非常大量的资源。此外，这种靶向整合允许将转基因叠加在单个基因组位置，从而使叠加性状渗入所希望的种质的效率显著更高。
使用以上披露的教导，技术人员能够使用本领域熟知的方法来将转基因靶向到与玉米优良事件MZIR098中相同的基因组插入位点或靶向到紧密接近于玉米优良事件MZIR098中的插入位点的位点。位点特异性核酸酶(包括例如锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALENS)和簇状规则间隔的短回文重复序列/CRISPR相关联的核酸酶(CRISPR/Cas))，与工程化的crRNA/tracr RNA(例如，作为单指导RNA、或形成双分子指导的修饰的crRNA和tracrRNA分子)，以及使用这种核酸酶靶向已知基因组位置(例如优良事件MZIR098的基因组插入位点)的方法是本领域熟知的(参见Bortesi和Fischer的综述,2015,Biotechnology Advances[生物技术进展]33:41-52；以及Chen和Gao,2014,Plant Cell Rep[植物细胞报道]33:575-583，及其中的参考文献)。专利公开WO2016106121(通过引用以其全文特此并入)举例说明了使用玉米事件MIR604的插入位点进行靶向插入。该申请以其全文并入本文。对于一些实例，将未转化的玉米中的MIR604插入位点用作靶向插入的位点。MIR604事件还用作靶向插入的位点，以添加另外的转基因。本申请的披露以及本领域已知的并且例如在WO 2016106121公开中所教的教导为本领域普通技术人员提供了足够的位置披露，以在优良事件MZIR098的基因组插入位点处(该事件不存在时的基因组位置，或在靶向整合到MZIR098转基因或或靠近MZIR098转基因的部分情况下，该事件本身的基因组位置)进行靶向插入。
在本说明书中提到的所有公开物以及专利申请对于本发明相关领域的普通技术人员的技术水平是指示性的。所有这些公开物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开物或专利申请被明确地并单独地指示通过引用而被并入。
虽然为了清楚理解的目的已经通过说明和举例的方式在一定详细程度上描述了以上发明，显然的是在本发明的范围内可以进行某些改变和修饰。
保藏
申请人已经在2017年5月1日将以上披露的优良事件MZIR098的玉米种子，根据布达佩斯条约，保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801大学大道，弗吉尼亚州马纳萨斯，VA 20110-2209)，ATCC登录号为PTA-124143。该种子于2017年5月12日经过测试并被认为是有活力的。此保藏将在该保藏机构保存30年，或在最后一次要求之后的5年，或本专利的有效期内，以更长的为准，且此时期内如果必须将被替换。诸位申请人对从ATCC获得所保藏的材料没有限制；然而，诸位申请人无权免除法律在转移生物材料或其在商业上的运输方面所施加的任何限制。
在本说明书中所引用的所有公开物和已公开的专利文件均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开物或专利文件被明确地并单独地指示通过引用而并入。
序列表
<110> Syngenta Participations, AG
Noe, Andrew
Conville, Jared
Gu, Weining
Jiang, Yaping
Carlin, Ryan William
Yu, Wenjin
Mittendorf, Volker
<120> 玉米优良事件MZIR098
<130> 81336-US-L-ORG-NAT-1
<150> 62/519993
<151> 2017-06-15
<160> 71
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 玉蜀黍，根癌农根菌
<400> 1
aacggagctg gtttaaactg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 玉蜀黍，根癌农根菌
<400> 2
caccacaata ccaggcccag 20
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 玉蜀黍，根癌农根菌
<400> 3
gcaacaaaat atacgtgtgt gcgtcgagct gcatattcta gttgtaccgg cacggcagtc 60
gaacgatctc agacaccaaa ccgagatcca agtgacagcg aacggagctg gtttaaactg 120
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 玉蜀黍，根癌农根菌
<400> 4
caccacaata ccaggcccag gcgcgaccgg ccgcagcgcg ccgacaagga accatgccgg 60
ttgcctaact aacggctgac tcgctcgatc gagcggagca tgcggacact gcagcaggtt 120
<210> 5
<211> 8487
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于玉蜀黍、根癌农根菌、夜香树黄化曲叶病毒、苏云金芽胞杆菌、花椰菜花叶病毒、和绿色产色链霉菌
<400> 5
aacggagctg gtttaaactg gcactagcct aacggtgttg actaagtagg ccgcttccct 60
aattagctaa gggacccggg tcattgagcg gagaattaag ggagtcacgt tatgaccccc 120
gccgatgacg cgggacaagc cgttttacgt ttggaactga cagaaccgca acgaatattg 180
gcagacaaag tggcagacat actgtcccac aaatgaagat ggaatctgta aaagaaaacg 240
cgtgaaataa tgcgtctgac aaaggttagg tcggctgcct ttaatcaata ccaaagtggt 300
ccctaccacg atggaaaaac tgtgcagtcg gtttggcttt ttctgacgaa caaataagat 360
tcgtggccga caggtggggg tccaccatgt gaaggcatct tcagactcca ataatggagc 420
aatgacgtaa gggcttacga aataagtaag ggtagtttgg gaaatgtcca ctcacccgtc 480
agtctataaa tacttagccc ctccctcatt gttaagggag caaaatctca gagagatagt 540
cctagagaga gaaagagagc aagtagccta gaagtggatc caccatgact agtaacggcc 600
gccagtgtgc tggtattcgc ccttatgacg gccgacaaca acaccgaggc ctggacagca 660
gcaccaccaa ggacgtgatc cagaagggca tcagcgtggt gggcgacctg ctgggcgtgg 720
tgggcttccc cttcggcggc gccctggtga gcttctacac caacttcctg aacaccatct 780
ggcccagcga ggacccctgg aaggccttca tggagcaggt ggaggccctg atggaccaga 840
agatcgccga ctacgccaag aacaaggcac tggccgagct acagggcctc cagaacaacg 900
tggaggacta tgtgagcgcc ctgagcagct ggcagaagaa ccccgctgca ccgttccgca 960
acccccacag ccagggccgc atccgcgagc tgttcagcca ggccgagagc cacttccgca 1020
acagcatgcc cagcttcgcc atcagcggct acgaggtgct gttcctgacc acctacgccc 1080
aggccgccaa cacccacctg ttcctgctga aggacgccca aatctacgga gaggagtggg 1140
gctacgagaa ggaggacatc gccgagttct acaagcgcca gctgaagctg acccaggagt 1200
acaccgacca ctgcgtgaag tggtacaacg tgggtctaga caagctccgc ggcagcagct 1260
acgagagctg ggtgaacttc aaccgctacc gccgcgagat gaccctgacc gtgctggacc 1320
tgatcgccct gttccccctg tacgacgtgc gcctgtaccc caaggaggtg aagaccgagc 1380
tgacccgcga cgtgctgacc gaccccatcg tgggcgtgaa caacctgcgc ggctacggca 1440
ccaccttcag caacatcgag aactacatcc gcaagcccca cctgttcgac tacctgcacc 1500
gcatccagtt ccacacgcgt ttccagcccg gctactacgg caacgacagc ttcaactact 1560
ggagcggcaa ctacgtgagc acccgcccca gcatcggcag caacgacatc atcaccagcc 1620
ccttctacgg caacaagagc agcgagcccg tgcagaacct tgagttcaac ggcgagaagg 1680
tgtaccgcgc cgtggctaac accaacctgg ccgtgtggcc ctctgcagtg tacagcggcg 1740
tgaccaaggt ggagttcagc cagtacaacg accagaccga cgaggccagc acccagacct 1800
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tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat 3000
aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac 3060
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gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt 3180
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catctatttt attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt 3300
tttatttaat aatttagata taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat 3360
accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc 3420
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acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa 3780
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ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 4080
ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 4140
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ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 4320
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ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 4740
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cccctggtga aggcctacaa gctccagagc ggcgccagcg tggtggcagg cccccgcttc 6300
accggcggcg acatcatcca gtgcaccgag aacggcagcg ccgccaccat ctacgtgacc 6360
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ttcgagctga gcggcaacaa cctccagatc ggcgtgaccg gcctgagcgc cggcgacaag 6600
gtgtacatcg acaagatcga gttcatcccc gtgaactaga tctgaggggt accagctctt 6660
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tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc 6900
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tttgagttgc cagctcctcc aaggccagtt aggccagtta cccagatctg aatagtgata 8100
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tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt 8280
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tgcccgggcg gccagcatgg ccgtatccgc aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat 8460
ttgtttacac cacaatacca ggcccag 8487
<210> 6
<211> 8687
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于玉蜀黍、根癌农根菌、夜香树黄化曲叶病毒、苏云金芽胞杆菌、花椰菜花叶病毒、和绿色产色链霉菌
<400> 6
gcaacaaaat atacgtgtgt gcgtcgagct gcatattcta gttgtaccgg cacggcagtc 60
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tggcgaacag ttcatacaga gtctcttacg actcaatgac aagaagaaaa tcttcgtcaa 7200
catggtggag cacgacacgc ttgtctactc caaaaatatc aaagatacag tctcagaaga 7260
ccaaagggca attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcc ggaaacctcc tcggattcca 7320
ttgcccagct atctgtcact ttattgtgaa gatagtggaa aaggaaggtg gctcctacaa 7380
atgccatcat tgcgataaag gaaaggccat cgttgaagat gcctctgccg acagtggtcc 7440
caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc 7500
ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg cacaatccca 7560
ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg agaggacacg 7620
ctgaaatcac tagtccacca tgtctccgga gaggagacca gttgagatta ggccagctac 7680
agcagctgat atggccgcgg tttgtgatat cgttaaccat tacattgaga cgtctacagt 7740
gaactttagg acagagccac aaacaccaca agagtggatt gatgatctag agaggttgca 7800
agatagatac ccttggttgg ttgctgaggt tgagggtgtt gtggctggta ttgcttacgc 7860
tgggccctgg aaggctagga acgcttacga ttggacagtt gagagtactg tttacgtgtc 7920
acataggcat caaaggttgg gcctaggatc cacattgtac acacatttgc ttaagtctat 7980
ggaggcgcaa ggttttaagt ctgtggttgc tgttataggc cttccaaacg atccatctgt 8040
taggttgcat gaggctttgg gatacacagc gcggggtaca ttgcgcgcag ctggatacaa 8100
gcatggtgga tggcatgatg ttggtttttg gcaaagggat tttgagttgc cagctcctcc 8160
aaggccagtt aggccagtta cccagatctg aatagtgata tcggcgcctg ggtcgacctg 8220
cagatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 8280
cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 8340
gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 8400
acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 8460
ctatgttact agatccgtag ccctgcagga aatttaccgg tgcccgggcg gccagcatgg 8520
ccgtatccgc aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttgtttacac cacaatacca 8580
ggcccaggcg cgaccggccg cagcgcgccg acaaggaacc atgccggttg cctaactaac 8640
ggctgactcg ctcgatcgag cggagcatgc ggacactgca gcaggtt 8687
<210> 7
<211> 8467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于玉蜀黍、根癌农根菌、夜香树黄化曲叶病毒、苏云金芽胞杆菌、花椰菜花叶病毒、绿色产色链霉菌
<400> 7
gtttaaactg gcactagcct aacggtgttg actaagtagg ccgcttccct aattagctaa 60
gggacccggg tcattgagcg gagaattaag ggagtcacgt tatgaccccc gccgatgacg 120
cgggacaagc cgttttacgt ttggaactga cagaaccgca acgaatattg gcagacaaag 180
tggcagacat actgtcccac aaatgaagat ggaatctgta aaagaaaacg cgtgaaataa 240
tgcgtctgac aaaggttagg tcggctgcct ttaatcaata ccaaagtggt ccctaccacg 300
atggaaaaac tgtgcagtcg gtttggcttt ttctgacgaa caaataagat tcgtggccga 360
caggtggggg tccaccatgt gaaggcatct tcagactcca ataatggagc aatgacgtaa 420
gggcttacga aataagtaag ggtagtttgg gaaatgtcca ctcacccgtc agtctataaa 480
tacttagccc ctccctcatt gttaagggag caaaatctca gagagatagt cctagagaga 540
gaaagagagc aagtagccta gaagtggatc caccatgact agtaacggcc gccagtgtgc 600
tggtattcgc ccttatgacg gccgacaaca acaccgaggc ctggacagca gcaccaccaa 660
ggacgtgatc cagaagggca tcagcgtggt gggcgacctg ctgggcgtgg tgggcttccc 720
cttcggcggc gccctggtga gcttctacac caacttcctg aacaccatct ggcccagcga 780
ggacccctgg aaggccttca tggagcaggt ggaggccctg atggaccaga agatcgccga 840
ctacgccaag aacaaggcac tggccgagct acagggcctc cagaacaacg tggaggacta 900
tgtgagcgcc ctgagcagct ggcagaagaa ccccgctgca ccgttccgca acccccacag 960
ccagggccgc atccgcgagc tgttcagcca ggccgagagc cacttccgca acagcatgcc 1020
cagcttcgcc atcagcggct acgaggtgct gttcctgacc acctacgccc aggccgccaa 1080
cacccacctg ttcctgctga aggacgccca aatctacgga gaggagtggg gctacgagaa 1140
ggaggacatc gccgagttct acaagcgcca gctgaagctg acccaggagt acaccgacca 1200
ctgcgtgaag tggtacaacg tgggtctaga caagctccgc ggcagcagct acgagagctg 1260
ggtgaacttc aaccgctacc gccgcgagat gaccctgacc gtgctggacc tgatcgccct 1320
gttccccctg tacgacgtgc gcctgtaccc caaggaggtg aagaccgagc tgacccgcga 1380
cgtgctgacc gaccccatcg tgggcgtgaa caacctgcgc ggctacggca ccaccttcag 1440
caacatcgag aactacatcc gcaagcccca cctgttcgac tacctgcacc gcatccagtt 1500
ccacacgcgt ttccagcccg gctactacgg caacgacagc ttcaactact ggagcggcaa 1560
ctacgtgagc acccgcccca gcatcggcag caacgacatc atcaccagcc ccttctacgg 1620
caacaagagc agcgagcccg tgcagaacct tgagttcaac ggcgagaagg tgtaccgcgc 1680
cgtggctaac accaacctgg ccgtgtggcc ctctgcagtg tacagcggcg tgaccaaggt 1740
ggagttcagc cagtacaacg accagaccga cgaggccagc acccagacct acgacagcaa 1800
gcgcaacgtg ggcgccgtga gctgggacag catcgaccag ctgccccccg agaccaccga 1860
cgagcccctg gagaagggct acagccacca gctgaactac gtgatgtgct tcctgatgca 1920
gggcagccgc ggcaccatcc ccgtgctgac ctggacccac aagagcgtcg acttcttcaa 1980
catgatcgac agcaagaaga tcacccagct gcccctgacc aagagcacca acctgggcag 2040
cggcaccagc gtggtgaagg gccccggctt caccggcggc gacatcctgc gccgcaccag 2100
ccccggccag atcagcaccc tgcgcgtgaa catcaccgcc cccctgagcc agcgctaccg 2160
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ccccatcaac cagggcaact tcagcgccac catgagcagc ggcagcaacc tgcagagcgg 2280
cagcttccgc accgtgggct tcaccacccc cttcaacttc agcaacggca gcagcgtgtt 2340
caccctgagc gcccacgtgt tcaacagcgg caacgaggtg tacatcgacc gcatcgagtt 2400
cgtgcccgcc gaggtgacct tcgaggccga gtacgacctg gagagggctc agaaggccgt 2460
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catcgatcag gtgtaggagc tgagctcttc atatgacgat cgttcaaaca tttggcaata 2580
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gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt 2700
ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg 2760
cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc gcggacccaa 2820
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tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc 2940
agtttatcta tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt 3000
actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa 3060
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tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca 3180
tccatttagg gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt 3240
attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat 3300
aatttagata taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag 3360
aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa 3420
acgccgccga cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa 3480
gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct 3540
ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt 3600
gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc 3660
ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc 3720
cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc 3780
cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc 3840
cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatagtt agggcccggt agttctactt 3900
ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgttag cgttcgtaca 3960
cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg 4020
ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt 4080
ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt 4140
ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg 4200
gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt 4260
tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa 4320
atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat 4380
gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta 4440
gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg 4500
tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat 4560
aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct 4620
attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt 4680
attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta 4740
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gttgtttggt gttacttctg cagggatcca ccatgacggc cgacaacaac accgaggccc 4860
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tgggcgtggt gggcttcccc ttcggcggcg ccctggtgag cttctacacc aacttcctga 4980
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gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggccat cgttgaagat gcctctgccg 7320
acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc 7380
caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg 7440
cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg 7500
agaggacacg ctgaaatcac tagtccacca tgtctccgga gaggagacca gttgagatta 7560
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ttgcttacgc tgggccctgg aaggctagga acgcttacga ttggacagtt gagagtactg 7800
tttacgtgtc acataggcat caaaggttgg gcctaggatc cacattgtac acacatttgc 7860
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atccatctgt taggttgcat gaggctttgg gatacacagc gcggggtaca ttgcgcgcag 7980
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<212> DNA
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ccaggcccag gcgcgaccgg ccgcagcgcg ccgacaagga accatgccgg ttgcctaact 60
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aggagcaata gctgagctag ccaagcctag ctgtacgatg tgttgacacc catgcatgtc 180
catgtccatg gggccggcct gtactgcgag tgcgcgacga tgctcctcag ctgcttgccc 240
gccctcaggg gcacgacgtt atcagtagcc tcggtccgtg aagcagggaa acgcgagccc 300
ttccacggct acgacctcaa ctccgatccg aataccacac accgatcgca acaacacatg 360
ttttccgttg atcgctagac gatgccaccg cccaggttat cttcagcttc gattccatgt 420
gtctgcgctg catgatgaaa aggttggggg gcctgcccgc ctggatccgt ttccgtgcat 480
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aggcacaggc ggccggccgg ccgcagtccg cttgtcgcct tgcccagcag agatgccacg 600
ggctgaccgg cgcggggatg gggaaggggc cggacggggg aacgggcccc cgatgacaag 660
cctcctgcag tcctgtcgat atgatgtgga gcaaaccagg acaggcgcca gcagatgagc 720
gcagagtggg cactctcttt gtgtgtgtgt gtgtggtcgt ggcatcttgc cgtcttgcat 780
ggatccatca tggtcggtgg ctggaccgtc ggagggcacc gcaccataga tagaggagca 840
ttgcattcac ggtatcacag aagaggctgc ccaggccggt ggtaaagcta ggtgacgagg 900
aaaatgttgc atggacaagt gctgcagaca tagagtcgtc ctcttacact cggcactttc 960
ggtgcaggtg ctgaggtgtt gacccggcga gaacgagcga gcgagggccc tcccccgacg 1020
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 衍生于玉蜀黍、根癌农根菌
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<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于玉蜀黍、根癌农根菌
<400> 13
atctcagaca ccaaaccgag atccaagtga cagcgaacgg agctggttta aactggcact 60
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<400> 14
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<213> 玉蜀黍
<400> 15
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<211> 21
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<220>
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<400> 19
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<213> 玉蜀黍
<400> 20
ccacacacac acacacaaag agagt 25
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<212> DNA
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<400> 21
gtggcatcgt ctagcgatca ac 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 22
gtaggccgct tccctaatta gc 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于苏云金芽胞杆菌
<400> 23
cgctgatgcc cttctggatc ac 22
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于夜香树黄化曲叶病毒
<400> 24
gtagtttggg aaatgtccac tcacccgt 28
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 25
accggcaaca ggattcaatc ttaag 25
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于苏云金芽胞杆菌
<400> 26
accagatcgg cctgaagacc 20
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于玉蜀黍
<400> 27
cagaagtaga actaccgggc cctaac 26
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于玉蜀黍
<400> 28
ggattccttt cccaccgct 19
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于苏云金芽胞杆菌
<400> 29
gctgggccag atggtgttca g 21
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于玉蜀黍
<400> 30
gccctgcctt catacgctat ttatt 25
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 31
accggcaaca ggattcaatc ttaag 25
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于苏云金芽胞杆菌
<400> 32
cagcaccagc cagatcacct tca 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于绿色产色链霉菌
<400> 33
ccacaacacc ctcaacctca gca 23
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于绿色产色链霉菌
<400> 34
acagtgaact ttaggacaga gccacaa 27
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 35
cacattgcgg atacggcc 18
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 36
gacatggaca tgcatgggt 19
<210> 37
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于花椰菜花叶病毒
<400> 37
gacgtaaggg atgacgcaca atccca 26
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 38
ctggcgtggc agtggcactg 20
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于苏云金芽胞杆菌
<400> 39
tgtcggccgt catggtggat c 21
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于玉蜀黍
<400> 40
tctttgggga atcctgggat ggc 23
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 41
catggttcct tgtcggcgcg 20
<210> 42
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 42
gtacgtttgg tgcacgtacc gatttggcc 29
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 43
cgtgactccc ttaattctcc gctcaatg 28
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 44
tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc 30
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 45
cgaccagcag caccaaccgt t 21
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 46
gggggtcata acgtgactc 19
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 47
gggggtcata acgtgactcc ctta 24
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 48
ctcccttaat tctccgctca 20
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 49
aattctccgc tcaatgacc 19
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于绿色产色链霉菌
<400> 50
acccagatct gaatagtgat atcgg 25
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 51
ccgcaattat acatttaata cg 22
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 52
gccctgcagg aaatttaccg 20
<210> 53
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 53
tcattgagcg gagaattaag ggagtcacgt tatgaccccc gccgatgacg cgggacaagc 60
cgttttacgt ttggaactga cagaaccgca acg 93
<210> 54
<211> 397
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于夜香树黄化曲叶病毒
<400> 54
tggcagacaa agtggcagac atactgtccc acaaatgaag atggaatctg taaaagaaaa 60
cgcgtgaaat aatgcgtctg acaaaggtta ggtcggctgc ctttaatcaa taccaaagtg 120
gtccctacca cgatggaaaa actgtgcagt cggtttggct ttttctgacg aacaaataag 180
attcgtggcc gacaggtggg ggtccaccat gtgaaggcat cttcagactc caataatgga 240
gcaatgacgt aagggcttac gaaataagta agggtagttt gggaaatgtc cactcacccg 300
tcagtctata aatacttagc ccctccctca ttgttaaggg agcaaaatct cagagagata 360
gtcctagaga gagaaagaga gcaagtagcc tagaagt 397
<210> 55
<211> 1962
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于苏云金芽胞杆菌
<400> 55
atgactagta acggccgcca gtgtgctggt attcgccctt atgacggccg acaacaacac 60
cgaggcctgg acagcagcac caccaaggac gtgatccaga agggcatcag cgtggtgggc 120
gacctgctgg gcgtggtggg cttccccttc ggcggcgccc tggtgagctt ctacaccaac 180
ttcctgaaca ccatctggcc cagcgaggac ccctggaagg ccttcatgga gcaggtggag 240
gccctgatgg accagaagat cgccgactac gccaagaaca aggcactggc cgagctacag 300
ggcctccaga acaacgtgga ggactatgtg agcgccctga gcagctggca gaagaacccc 360
gctgcaccgt tccgcaaccc ccacagccag ggccgcatcc gcgagctgtt cagccaggcc 420
gagagccact tccgcaacag catgcccagc ttcgccatca gcggctacga ggtgctgttc 480
ctgaccacct acgcccaggc cgccaacacc cacctgttcc tgctgaagga cgcccaaatc 540
tacggagagg agtggggcta cgagaaggag gacatcgccg agttctacaa gcgccagctg 600
aagctgaccc aggagtacac cgaccactgc gtgaagtggt acaacgtggg tctagacaag 660
ctccgcggca gcagctacga gagctgggtg aacttcaacc gctaccgccg cgagatgacc 720
ctgaccgtgc tggacctgat cgccctgttc cccctgtacg acgtgcgcct gtaccccaag 780
gaggtgaaga ccgagctgac ccgcgacgtg ctgaccgacc ccatcgtggg cgtgaacaac 840
ctgcgcggct acggcaccac cttcagcaac atcgagaact acatccgcaa gccccacctg 900
ttcgactacc tgcaccgcat ccagttccac acgcgtttcc agcccggcta ctacggcaac 960
gacagcttca actactggag cggcaactac gtgagcaccc gccccagcat cggcagcaac 1020
gacatcatca ccagcccctt ctacggcaac aagagcagcg agcccgtgca gaaccttgag 1080
ttcaacggcg agaaggtgta ccgcgccgtg gctaacacca acctggccgt gtggccctct 1140
gcagtgtaca gcggcgtgac caaggtggag ttcagccagt acaacgacca gaccgacgag 1200
gccagcaccc agacctacga cagcaagcgc aacgtgggcg ccgtgagctg ggacagcatc 1260
gaccagctgc cccccgagac caccgacgag cccctggaga agggctacag ccaccagctg 1320
aactacgtga tgtgcttcct gatgcagggc agccgcggca ccatccccgt gctgacctgg 1380
acccacaaga gcgtcgactt cttcaacatg atcgacagca agaagatcac ccagctgccc 1440
ctgaccaaga gcaccaacct gggcagcggc accagcgtgg tgaagggccc cggcttcacc 1500
ggcggcgaca tcctgcgccg caccagcccc ggccagatca gcaccctgcg cgtgaacatc 1560
accgcccccc tgagccagcg ctaccgcgtc cgcatccgct acgccagcac caccaacctg 1620
cagttccaca ccagcatcga cggccgcccc atcaaccagg gcaacttcag cgccaccatg 1680
agcagcggca gcaacctgca gagcggcagc ttccgcaccg tgggcttcac cacccccttc 1740
aacttcagca acggcagcag cgtgttcacc ctgagcgccc acgtgttcaa cagcggcaac 1800
gaggtgtaca tcgaccgcat cgagttcgtg cccgccgagg tgaccttcga ggccgagtac 1860
gacctggaga gggctcagaa ggccgtgaac gagctgttca ccagcagcaa ccagatcggc 1920
ctgaagaccg acgtgaccga ctaccacatc gatcaggtgt ag 1962
<210> 56
<211> 253
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 56
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240
atgttactag atc 253
<210> 57
<211> 1993
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于玉蜀黍
<400> 57
ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60
agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120
tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180
tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240
gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300
ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360
gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420
agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480
taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540
aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgccga 600
cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660
cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720
acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780
ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840
gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900
ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960
cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 1020
ttctctagat cggcgttccg gtccatagtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 1080
ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgttag cgttcgtaca cggatgcgac 1140
ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 1200
gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 1260
agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 1320
atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 1380
tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 1440
tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 1500
aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 1560
cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 1620
gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 1680
acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 1740
gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 1800
tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 1860
tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 1920
catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 1980
gttacttctg cag 1993
<210> 58
<211> 1797
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于苏云金芽胞杆菌
<400> 58
atgacggccg acaacaacac cgaggccctg gacagcagca ccaccaagga cgtgatccag 60
aagggcatca gcgtggtggg cgacctgctg ggcgtggtgg gcttcccctt cggcggcgcc 120
ctggtgagct tctacaccaa cttcctgaac accatctggc ccagcgagga cccctggaag 180
gccttcatgg agcaggtgga ggccctgatg gaccagaaga tcgccgacta cgccaagaac 240
aaggcactgg ccgagctaca gggcctccag aacaacgtgg aggactatgt gagcgccctg 300
agcagctggc agaagaaccc cgctgcaccg ttccgcaacc cccacagcca gggccgcatc 360
cgcgagctgt tcagccaggc cgagagccac ttccgcaaca gcatgcccag cttcgccatc 420
agcggctacg aggtgctgtt cctgaccacc tacgcccagg ccgccaacac ccacctgttc 480
ctgctgaagg acgcccaaat ctacggagag gagtggggct acgagaagga ggacatcgcc 540
gagttctaca agcgccagct gaagctgacc caggagtaca ccgaccactg cgtgaagtgg 600
tacaacgtgg gtctagacaa gctccgcggc agcagctacg agagctgggt gaacttcaac 660
cgctaccgcc gcgagatgac cctgaccgtg ctggacctga tcgccctgtt ccccctgtac 720
gacgtgcgcc tgtaccccaa ggaggtgaag accgagctga cccgcgacgt gctgaccgac 780
cccatcgtgg gcgtgaacaa cctgcgcggc tacggcacca ccttcagcaa catcgagaac 840
tacatccgca agccccacct gttcgactac ctgcaccgca tccagttcca cacgcgtttc 900
cagcccggct actacggcaa cgacagcttc aactactgga gcggcaacta cgtgagcacc 960
cgccccagca tcggcagcaa cgacatcatc accagcccct tctacggcaa caagagcagc 1020
gagcccgtgc agaaccttga gttcaacggc gagaaggtgt accgcgccgt ggctaacacc 1080
aacctggccg tgtggccctc tgcagtgtac agcggcgtga ccaaggtgga gttcagccag 1140
tacaacgacc agaccgacga ggccagcacc cagacctacg acagcaagcg caacgtgggc 1200
gccgtgagct gggacagcat cgaccagctg ccccccgaga ccaccgacga gcccctggag 1260
aagggctaca gccaccagct gaactacgtg atgtgcttcc tgatgcaggg cagccgcggc 1320
accatccccg tgctgacctg gacccacaag agcgtcgact tcttcaacat gatcgacagc 1380
aagaagatca cccagctgcc cctggtgaag gcctacaagc tccagagcgg cgccagcgtg 1440
gtggcaggcc cccgcttcac cggcggcgac atcatccagt gcaccgagaa cggcagcgcc 1500
gccaccatct acgtgacccc cgacgtgagc tacagccaga agtaccgcgc ccgcatccac 1560
tacgccagca ccagccagat caccttcacc ctgagcctgg acggggcccc cttcaaccaa 1620
tactacttcg acaagaccat caacaagggc gacaccctga cctacaacag cttcaacctg 1680
gccagcttca gcaccccttt cgagctgagc ggcaacaacc tccagatcgg cgtgaccggc 1740
ctgagcgccg gcgacaaggt gtacatcgac aagatcgagt tcatccccgt gaactag 1797
<210> 59
<211> 277
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于根癌农根菌
<400> 59
ttgacgacct gctaagatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct 60
gttgccggtc ttgcgatgat tatcaatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat 120
aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca 180
attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc 240
gcgcgcggtg tcatctattg ttactagatc taattga 277
<210> 60
<211> 521
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于花椰菜花叶病毒
<400> 60
agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt aaagactggc gaacagttca 60
tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt cgtcaacatg gtggagcacg 120
acacgcttgt ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggcaattg 180
agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 240
gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 300
ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 360
cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 420
attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 480
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag g 521
<210> 61
<211> 552
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于绿色产色链霉菌
<400> 61
atgtctccgg agaggagacc agttgagatt aggccagcta cagcagctga tatggccgcg 60
gtttgtgata tcgttaacca ttacattgag acgtctacag tgaactttag gacagagcca 120
caaacaccac aagagtggat tgatgatcta gagaggttgc aagatagata cccttggttg 180
gttgctgagg ttgagggtgt tgtggctggt attgcttacg ctgggccctg gaaggctagg 240
aacgcttacg attggacagt tgagagtact gtttacgtgt cacataggca tcaaaggttg 300
ggcctaggat ccacattgta cacacatttg cttaagtcta tggaggcgca aggttttaag 360
tctgtggttg ctgttatagg ccttccaaac gatccatctg ttaggttgca tgaggctttg 420
ggatacacag cgcggggtac attgcgcgca gctggataca agcatggtgg atggcatgat 480
gttggttttt ggcaaaggga ttttgagttg ccagctcctc caaggccagt taggccagtt 540
acccagatct ga 552
<210> 62
<211> 2740
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于夜香树黄化曲叶病毒、苏云金芽孢杆菌、和根癌农根菌
<400> 62
tcattgagcg gagaattaag ggagtcacgt tatgaccccc gccgatgacg cgggacaagc 60
cgttttacgt ttggaactga cagaaccgca acgaatattg gcagacaaag tggcagacat 120
actgtcccac aaatgaagat ggaatctgta aaagaaaacg cgtgaaataa tgcgtctgac 180
aaaggttagg tcggctgcct ttaatcaata ccaaagtggt ccctaccacg atggaaaaac 240
tgtgcagtcg gtttggcttt ttctgacgaa caaataagat tcgtggccga caggtggggg 300
tccaccatgt gaaggcatct tcagactcca ataatggagc aatgacgtaa gggcttacga 360
aataagtaag ggtagtttgg gaaatgtcca ctcacccgtc agtctataaa tacttagccc 420
ctccctcatt gttaagggag caaaatctca gagagatagt cctagagaga gaaagagagc 480
aagtagccta gaagtggatc caccatgact agtaacggcc gccagtgtgc tggtattcgc 540
ccttatgacg gccgacaaca acaccgaggc ctggacagca gcaccaccaa ggacgtgatc 600
cagaagggca tcagcgtggt gggcgacctg ctgggcgtgg tgggcttccc cttcggcggc 660
gccctggtga gcttctacac caacttcctg aacaccatct ggcccagcga ggacccctgg 720
aaggccttca tggagcaggt ggaggccctg atggaccaga agatcgccga ctacgccaag 780
aacaaggcac tggccgagct acagggcctc cagaacaacg tggaggacta tgtgagcgcc 840
ctgagcagct ggcagaagaa ccccgctgca ccgttccgca acccccacag ccagggccgc 900
atccgcgagc tgttcagcca ggccgagagc cacttccgca acagcatgcc cagcttcgcc 960
atcagcggct acgaggtgct gttcctgacc acctacgccc aggccgccaa cacccacctg 1020
ttcctgctga aggacgccca aatctacgga gaggagtggg gctacgagaa ggaggacatc 1080
gccgagttct acaagcgcca gctgaagctg acccaggagt acaccgacca ctgcgtgaag 1140
tggtacaacg tgggtctaga caagctccgc ggcagcagct acgagagctg ggtgaacttc 1200
aaccgctacc gccgcgagat gaccctgacc gtgctggacc tgatcgccct gttccccctg 1260
tacgacgtgc gcctgtaccc caaggaggtg aagaccgagc tgacccgcga cgtgctgacc 1320
gaccccatcg tgggcgtgaa caacctgcgc ggctacggca ccaccttcag caacatcgag 1380
aactacatcc gcaagcccca cctgttcgac tacctgcacc gcatccagtt ccacacgcgt 1440
ttccagcccg gctactacgg caacgacagc ttcaactact ggagcggcaa ctacgtgagc 1500
acccgcccca gcatcggcag caacgacatc atcaccagcc ccttctacgg caacaagagc 1560
agcgagcccg tgcagaacct tgagttcaac ggcgagaagg tgtaccgcgc cgtggctaac 1620
accaacctgg ccgtgtggcc ctctgcagtg tacagcggcg tgaccaaggt ggagttcagc 1680
cagtacaacg accagaccga cgaggccagc acccagacct acgacagcaa gcgcaacgtg 1740
ggcgccgtga gctgggacag catcgaccag ctgccccccg agaccaccga cgagcccctg 1800
gagaagggct acagccacca gctgaactac gtgatgtgct tcctgatgca gggcagccgc 1860
ggcaccatcc ccgtgctgac ctggacccac aagagcgtcg acttcttcaa catgatcgac 1920
agcaagaaga tcacccagct gcccctgacc aagagcacca acctgggcag cggcaccagc 1980
gtggtgaagg gccccggctt caccggcggc gacatcctgc gccgcaccag ccccggccag 2040
atcagcaccc tgcgcgtgaa catcaccgcc cccctgagcc agcgctaccg cgtccgcatc 2100
cgctacgcca gcaccaccaa cctgcagttc cacaccagca tcgacggccg ccccatcaac 2160
cagggcaact tcagcgccac catgagcagc ggcagcaacc tgcagagcgg cagcttccgc 2220
accgtgggct tcaccacccc cttcaacttc agcaacggca gcagcgtgtt caccctgagc 2280
gcccacgtgt tcaacagcgg caacgaggtg tacatcgacc gcatcgagtt cgtgcccgcc 2340
gaggtgacct tcgaggccga gtacgacctg gagagggctc agaaggccgt gaacgagctg 2400
ttcaccagca gcaaccagat cggcctgaag accgacgtga ccgactacca catcgatcag 2460
gtgtaggagc tgagctcttc atatgacgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta 2520
agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt 2580
aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt 2640
agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag 2700
gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc 2740
<210> 63
<211> 4095
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于玉蜀黍、苏云金芽胞杆菌、和根癌农根菌
<400> 63
ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60
agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120
tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180
tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240
gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300
ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360
gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420
agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480
taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540
aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgccga 600
cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660
cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720
acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780
ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840
gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900
ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960
cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 1020
ttctctagat cggcgttccg gtccatagtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 1080
ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgttag cgttcgtaca cggatgcgac 1140
ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 1200
gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 1260
agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 1320
atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 1380
tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 1440
tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 1500
aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 1560
cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 1620
gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 1680
acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 1740
gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 1800
tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 1860
tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 1920
catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 1980
gttacttctg cagggatcca ccatgacggc cgacaacaac accgaggccc tggacagcag 2040
caccaccaag gacgtgatcc agaagggcat cagcgtggtg ggcgacctgc tgggcgtggt 2100
gggcttcccc ttcggcggcg ccctggtgag cttctacacc aacttcctga acaccatctg 2160
gcccagcgag gacccctgga aggccttcat ggagcaggtg gaggccctga tggaccagaa 2220
gatcgccgac tacgccaaga acaaggcact ggccgagcta cagggcctcc agaacaacgt 2280
ggaggactat gtgagcgccc tgagcagctg gcagaagaac cccgctgcac cgttccgcaa 2340
cccccacagc cagggccgca tccgcgagct gttcagccag gccgagagcc acttccgcaa 2400
cagcatgccc agcttcgcca tcagcggcta cgaggtgctg ttcctgacca cctacgccca 2460
ggccgccaac acccacctgt tcctgctgaa ggacgcccaa atctacggag aggagtgggg 2520
ctacgagaag gaggacatcg ccgagttcta caagcgccag ctgaagctga cccaggagta 2580
caccgaccac tgcgtgaagt ggtacaacgt gggtctagac aagctccgcg gcagcagcta 2640
cgagagctgg gtgaacttca accgctaccg ccgcgagatg accctgaccg tgctggacct 2700
gatcgccctg ttccccctgt acgacgtgcg cctgtacccc aaggaggtga agaccgagct 2760
gacccgcgac gtgctgaccg accccatcgt gggcgtgaac aacctgcgcg gctacggcac 2820
caccttcagc aacatcgaga actacatccg caagccccac ctgttcgact acctgcaccg 2880
catccagttc cacacgcgtt tccagcccgg ctactacggc aacgacagct tcaactactg 2940
gagcggcaac tacgtgagca cccgccccag catcggcagc aacgacatca tcaccagccc 3000
cttctacggc aacaagagca gcgagcccgt gcagaacctt gagttcaacg gcgagaaggt 3060
gtaccgcgcc gtggctaaca ccaacctggc cgtgtggccc tctgcagtgt acagcggcgt 3120
gaccaaggtg gagttcagcc agtacaacga ccagaccgac gaggccagca cccagaccta 3180
cgacagcaag cgcaacgtgg gcgccgtgag ctgggacagc atcgaccagc tgccccccga 3240
gaccaccgac gagcccctgg agaagggcta cagccaccag ctgaactacg tgatgtgctt 3300
cctgatgcag ggcagccgcg gcaccatccc cgtgctgacc tggacccaca agagcgtcga 3360
cttcttcaac atgatcgaca gcaagaagat cacccagctg cccctggtga aggcctacaa 3420
gctccagagc ggcgccagcg tggtggcagg cccccgcttc accggcggcg acatcatcca 3480
gtgcaccgag aacggcagcg ccgccaccat ctacgtgacc cccgacgtga gctacagcca 3540
gaagtaccgc gcccgcatcc actacgccag caccagccag atcaccttca ccctgagcct 3600
ggacggggcc cccttcaacc aatactactt cgacaagacc atcaacaagg gcgacaccct 3660
gacctacaac agcttcaacc tggccagctt cagcacccct ttcgagctga gcggcaacaa 3720
cctccagatc ggcgtgaccg gcctgagcgc cggcgacaag gtgtacatcg acaagatcga 3780
gttcatcccc gtgaactaga tctgaggggt accagctctt gacgacctgc taagatcgtt 3840
caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 3900
tcaatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg 3960
ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata 4020
gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctattgtt 4080
actagatcta attga 4095
<210> 64
<211> 1381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生于花椰菜花叶病毒、绿色产色链霉菌、和根癌农根菌
<400> 64
agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt aaagactggc gaacagttca 60
tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt cgtcaacatg gtggagcacg 120
acacgcttgt ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggcaattg 180
agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 240
gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 300
ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 360
cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 420
attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 480
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcactagt 540
ccaccatgtc tccggagagg agaccagttg agattaggcc agctacagca gctgatatgg 600
ccgcggtttg tgatatcgtt aaccattaca ttgagacgtc tacagtgaac tttaggacag 660
agccacaaac accacaagag tggattgatg atctagagag gttgcaagat agataccctt 720
ggttggttgc tgaggttgag ggtgttgtgg ctggtattgc ttacgctggg ccctggaagg 780
ctaggaacgc ttacgattgg acagttgaga gtactgttta cgtgtcacat aggcatcaaa 840
ggttgggcct aggatccaca ttgtacacac atttgcttaa gtctatggag gcgcaaggtt 900
ttaagtctgt ggttgctgtt ataggccttc caaacgatcc atctgttagg ttgcatgagg 960
ctttgggata cacagcgcgg ggtacattgc gcgcagctgg atacaagcat ggtggatggc 1020
atgatgttgg tttttggcaa agggattttg agttgccagc tcctccaagg ccagttaggc 1080
cagttaccca gatctgaata gtgatatcgg cgcctgggtc gacctgcaga tcgttcaaac 1140
atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata 1200
taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt 1260
atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac 1320
aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat 1380
c 1381
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 65
accaaaccga gatccaagtg a 21
<210> 66
<211> 16
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 66
gcgcgtcgac ctgcac 16
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 67
gcatggttcc ttgtcggc 18
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 68
ctagttgtac ctgcccccgc ctg 23
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 69
aacggagctg cccccgcc 18
<210> 70
<211> 172841
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1424)..(1523)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (8718)..(8817)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (9815)..(9914)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (11286)..(11385)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (35128)..(35227)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (89878)..(89977)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (105187)..(105286)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (108813)..(108912)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (119229)..(119328)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (132486)..(132585)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (134025)..(134124)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (144520)..(144619)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (147090)..(147189)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (151745)..(151844)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (169545)..(169644)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (170871)..(170970)
<223> n是a、c、g、或t
<400> 70
ctctcatgct atggaattgg caggccgttg ggcatgcgct taaagatatg gagactttat 60
atcatgggga acaagtgcca agtataacgg atcataagag tttatattca ctcaggaagg 120
atctcaacct taggcacgcc gttggttgga gcttattaag ggataatgat ttggagattc 180
actatcactg ggcaaggcaa atttggttgc agaagccttt gagtcgaaag gagcatgttc 240
attcagctat tgttgcccag ctacccgatg agattgttga ggatttcagg agacttaacc 300
tggggataga tgctcacgct taaggagtca ttattgatgt ggaacctacc ttggagcaag 360
aaaatccaca gaacgacaga ttggtgatgc caagatacaa gagatcaagg atcttattac 420
gaaaggtaga ggtccggaat ttacggaaga tgaacaagac acaatatggt tcaagggcag 480
gatatgtgtt cctggtattg aaagccttcg taagactatt ctaaaggaag cccataactt 540
ggattattct attcatcctg gtagtaccaa gatgtatcag gaattgaagc agaaatactg 600
gtggtatgga ttgaagagag atgtggctgc acatgtggct atgtgcgatg ggtgtcaaag 660
agttaaggcc taacaccaaa gaccagctgg actattacat ccactgaaga tacccaagtg 720
gaaggggaag aaattggtaa ggacttcatt actggattgc ctcgcacccc gtgtcacacc 780
cggctttaag gaacaaagcc aggtgcatct catacatgcg ccaagaagac aacatatata 840
ataacagagt gtatagagat aaatgtcgta aaacatcaga gtatttatta catagcggaa 900
gacttattaa aaaaataaaa gataaaagta aaacgaacta aggatcgtcg gcgccaatgt 960
caactgagaa acgccaccta gatcagatca tactcctcgc cttgtggctc ctcctgaacc 1020
acctgctctt ctcctgtggg gggggtgtga gacagcaagg gtgagctcac acatgatcat 1080
cgctcaacaa gttgtgggga ataatgtgac atgaactcac caaaggtgag agctcatgga 1140
gtgtaaggct tatcaaagag aatggttaaa gctgagcatt gcttttaagt agttggtcaa 1200
aattttatta gcagttacta agtgtaagta aataccaaac cttaaataaa gtaatagaac 1260
aaaattaata ataaacccat gcatatgcaa atgacaaaat tgaatttaag ttccataatt 1320
taaacatcag agagtcctga gctgctcatg accgtgagct cggctagtat accagtttta 1380
cactaatgca gaggttgtac ccttagacga atctctagat tcgnnnnnnn nnnnnnnnnn 1440
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1500
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtttggt tacattaatg cacatacaag taaagccaac 1560
atgatgcact taggttattt aggtgtcttt tgttaattat ttatttgttt aggtgagatg 1620
tccacatgaa atgctacata gggatgacac ccatatatgc gaaggaatat aatctttact 1680
cttaggtttt atttttacaa agtgggtgtt acaaatccta ccccccttaa aaataatctc 1740
gtcctcgaga tttaggaaga acgagggaaa aggtgaggaa aatctatgcg aagctcttct 1800
tctctttccc aagttgcttc atcttcaccg tggtgactcc attggacttt gcacatcttt 1860
accaccttat ttcttgtaac tcgagtcaaa gtatcctaaa tcttgatcgg gtattccgtg 1920
taagttaaat caccctgaac actaagctct tccattggta actgttcctc agggacacgg 1980
agccacttct tgagttgaga tacgtgaaac acattatgca catccgatag actagcaggt 2040
aactcaagtt ggtatgccat ctctccaact ctcctaaaga tcaagaatgg tccaatatag 2100
cgaggggaca atttgccctt aactttgaat ctcctcattc cacgcagtgg tgacaccttg 2160
agatacacat aatctccttc ttcaaattac agtggcctcc ttctattatc agcataactc 2220
ttttgcctgg tttgagccac tctcaaattc tctcgaatta tacggacttg ttcttctgct 2280
tcttgaatca attcaggccc aaagaactgt ctctctccag tctgatccca atacaaagga 2340
gtcctgcact tcctcccatg ctgaagggca catgctctca acatatcttc caaaacttga 2400
ttagtccttt cagtctgttc atcagtctga gggtgataag ccgtactaaa attcaacttc 2460
gtgctcatgt tctcatgaaa gcttctccaa aatcttgagg taaactgcga acctcgatca 2520
gacacgatct tctttggtac tccatgtaaa cacacaagcc gagccatata caactctgct 2580
agctgagaac ctttataagt agtcttgaca ggaataaagt gagccacttt agtcaatcta 2640
tccacaatca cccatatagc atcatatcct ttctgggtgc gaggcaatcc agtaatgaaa 2700
tccataccaa tctcttccca cttccactcg ggtatcttca gtgggtgcaa tagtccaact 2760
ggcctctggt gttcagcctt aactctttga catacatcac acatagccac atgtgcagcc 2820
acatctcttt tcaatccata ccaccaatac ttccgcttca aatcctgata catcttagta 2880
ctaccaggat gaatagaata atttgagtca tgggcctcct tcaatatagt ctcacgaagg 2940
ctttcaatat caggaacaca catcttgtcc ttgaaccata cagtgccttg ctcatcttcc 3000
gtaaattcca gaactcgacc ttcagtaatc agatccttaa tctctcgtat tttagcatca 3060
ccaatttgtc ctttacggat ttcttgctcc aaggtaggtt ccacatcaat agtaactcct 3120
tcagtgtgag caactatccc caggttaagt ctcctgaaat cctcaacaat ctcatcgggt 3180
agctgggcaa caacagctga atgaacatgc tcctttcgac tcaaggcatc tgcaaccaaa 3240
tttgccttgc tcgggtgata gtgaatctcc aaatcataat ccttaataag ctccaaccaa 3300
cggcgttgcc taaggttgag atccttctga gtgaatatat acttcagact cttatgatct 3360
gtgtatactt gacacttgat tcccataatg taatgtctcc aaatcttaag tgcatgcaca 3420
acggctgcca attccaagtc atgagtgggg tagttcaatt catgtctccg taattgtcga 3480
gaagcataag caatcacatg tccttcctgc atgaccacac atcctaagcc ttggccacat 3540
gcatcgcaat agatatcaaa tcctttctgt aggtccggca taaccaatac tggtggcgac 3600
attaacctct tcttcaatag atcaaagctg tcttgacact tctcgtccca cttaaattct 3660
tttcctttct ccaaaagcga agtcataggc ttggcaatct tagagaaccc ttcaataaat 3720
ctccgataat agcctgctaa tcccaagaaa ctccgaatct cagtcactgt agtgggtact 3780
ctccactcca ttatctcctt aactttagca ggatccactg atattcctcc atcagaaatg 3840
atatgtccaa gaaatggcac ctcgccaatc caaaactcgc atttggtaaa cttggtgtag 3900
agttgattat ctcttagctt ttgtagcacc aatctcagat gttcctcatg atcactatca 3960
ctcttggaat aaataagaat atcgtcgatg aatactacga cgagtctgtc caaatactcc 4020
ataaacacct tattcatcaa gttcataaaa taagctggtg cattggttaa tccaaacgac 4080
ataacagtaa actcatataa tccatatcga gtcgagaaag ccgtcttggg aatatccgat 4140
ggtctaatcc tcatctgatg gtaacccgat cggagatcaa tcttcgagaa tactctagca 4200
cctctcatct gattaaataa atccttaatg cggggtaatg gacacttgtc cttcacagtg 4260
acatcgttaa gggtcctata atccacgcac atcccttgcg atccatcttt cttctgtaca 4320
aaatagaact ggtgctccac aaggtgaaga actcggacga atgtacccat cctcttgtaa 4380
ttccgttaat tgcttcttaa gttcctttta gttcttctac ggacatcttg tatggccatt 4440
tagaaatagg ggcggttcca ggtaagagat caataacaaa ctcaacttct ctatcgggtg 4500
gcatccctgg taactcctct ggaaagacat ccggaaaatc tctaaccaca cggatgttgt 4560
cacccacaac ttctcatcta ctaagaacgc cactagtctg atggtggtag ttactgcaac 4620
ttcaacttca aatctttgtc ctttggaact ggtgagtgct acggttccct tagcacaatg 4680
tacaaagtgc ctttgccttt cttaaccatg acataccaag gatcaagcct atactgctct 4740
cttctaacag tataggggta gcccatttgg gtcaggaaca cagggtaaga aagaaaggat 4800
tatagacaag gcatgtaatt acgagtaatg ttactacggg ggatttatta gctaagtaga 4860
ttagtgtgtc acccactaaa gctaatacat taccttatgg tggtacatgc taagatgccc 4920
gtctatacta tttcaatcaa tcaaagaagc aaatcaggca ttgatcatca gaacaatcaa 4980
ccaacatttt taataaagaa aatagtttta attttgtctt aggcttccta cctcttaaaa 5040
atgtcatagg ggtagggact ccaaggtgtg aaatccatct tgtctaggag tagaaaaggt 5100
aagaatgata agagtagaac aatagaaggt gagacaagat caagatgaga tgagtataga 5160
atgagtcaga gtaaggtaag taggaaaggg tctgtccatt tctatctagg tttcgtccta 5220
cagtcaacat ttcctctgat accacttctg tcacacccgg ctttaaggaa caaagccagg 5280
tgcatctcat acatgcgcca agaagacaac atatataata acagagtgta tagagataaa 5340
tgtcgtaaaa catcagagta tttattacat agcggaagac ttattaaaaa aataaaagat 5400
aaaagtaaaa cgaactaagg atcgtcggcg ccaatgtcaa ctgagaaacg ccacctagat 5460
cagatcatac tcctcgcctt gtggctcctc ctgaaccacc tgctcttctc ctgtgggggg 5520
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gtgtaagtaa ataccaaacc ttaaataaag taatagaaca aaattaataa taaacccatg 5760
catatgcaaa tgacaaaatt gaatttaagt tccataattt aaacatcaga gagtcctgag 5820
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tttacccaca agtcatgcta cccatctgcc aaggggtcgc gaatcccata cacctctacc 5940
taggaagcgc ggcagggcaa cactacgagg cctttacaaa gttccactag cttccgaaaa 6000
cccgctacag tttataggaa gttccaatgc agggttcctg gctgaccgcc atcgcagcaa 6060
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accatgtaaa gcaatagcaa actacccaag tgattcaggg gtaaacaagg taatgagata 6360
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agctattccg aacgcggtga tgagcaatcg gtagtggaga ttacgacgaa ctcaatgggg 7380
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ggcctccgtc gagcaattat ggaggtccag gggcccttct cgtccagcga tgtgatgagc 7500
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agggagagga aaggaggggg tcggtccgca gatatagaag gtgaggatca cgacgcgcag 7680
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ctcgacctga tcctccgatc aacgcggcgg ctgttacaac tacgcgcgcg attcatcggc 7920
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tttttttctt tttttttatt ttccttttct tttatctttt aaatctctat ttgaattcaa 8220
atttttttgt tgtgaatttg tactcagaca aaagttgtaa cttaagagta ccaatttgaa 8280
aagttatatt tatttttata tagttttctt tacaaggtga tccctttctt ttccttgttc 8340
ttttatgtta tttccatttt tttaaattgt aaatgaggtc tttgaatccc aatttgggac 8400
acctttgtat ttctattgat atgattattg ttatcattaa atgcacatac aagtaaaagc 8460
caacatgatg cacttaggtt atttaggtgt cttttgttaa ttatttattt gtttaggtga 8520
gatgtccaca tgaaatgcta catagggatg acacccatat atgcgaagga atataatctt 8580
tactcttagg ttttattttt acaaagtggg tgttacaaat cctacccccc ttaaaaataa 8640
tctcgtcctc gagatttagg aagaacgagg gaaaaggtga ggaaaatcta tgcgaagctc 8700
ctccttctct tcccatgnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 8760
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnact 8820
aatctagaga ttcgttacct tacccgaaag gggcaagggc agtaggggag tggtcagtgt 8880
agggaggtcc ttggttgatt ttgctgcgat ggcggtcaga ccaagaaccc tgcattggaa 8940
cttcttataa actgtagcgg gttttcggaa gctagtggaa ctttgtaaag gcctcgtagt 9000
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ttgtgagttt atgtccaccg gttccccaca acttgttgag ctatgatcat gtgtgagctc 9420
acccttgctg tctcacaccc ccccacagga gaagagcagg tggttcagga ggagccgcct 9480
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tccttagttc gttttacttt tatcttttat tttgtaataa gtcttccgct atgtaataaa 9600
tactctgatg ttttatgaca tttatctcta tacactctgt tattatatat gttgtcttct 9660
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acccttctgg cccaactcct aatcctgtgt ccccttcccc atttctcctt ccacctccta 9780
agtctgagta taaggtacga atctctagat tcatnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9840
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9900
nnnnnnnnnn nnnnagatct aggagattcg tcgtggagat acgacgaact caatgggggc 9960
aatcttaccg gggagccatg taagagccga cgacggggtt tggcggcaga agcggcctcc 10020
gtcgagcaat tatggaggtc caggggccct tctcgtccag cgatgtgatg agcggctcca 10080
gtggtgtcag gcgaaactcc ctgcactcca attcggccac gggtggcgcg gtggtctggg 10140
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caacacgggt ccacttgtct gcgactggtg cgcacgcgcg aagtcttcct ggccagtagg 10620
cccaccaggc aaatgcgcac agcccaaaag aacggattag accgtgtgcc gaccggtggg 10680
ccgttggtgc cagcctcttc cctctgcgcc gatggtgggg gccacattcc agatgcgcgt 10740
gctgtggcga cttgcaggcg ggcccaggtt gtcagttcct tccccttcgc cgtaacagaa 10800
ctcgcgttct ctacgccgcg tgactatcac ttccgccgag cccaggaccg ctctggattc 10860
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ttgggcaccg cacccgtgcc ttccgtcccc gcctgcttgc agtgaccccg cgcatttttt 11220
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attctnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11340
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnntccga ttctgatgaa 11400
tcagcttgat tcgtacacgt gccaccacaa gggtttaatg ggacgccctt ggaagacaaa 11460
ttaggaaagc tagtggaaga ctaccttacc cgaaaggggc aagggcagta ggggagtggt 11520
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gatgggtagc atgacttgtg ggtaaagggt acaacctctg cagagtgtaa aactagtata 11760
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tctaaggttt ggtattcact tatacttagt aactgctaat aaaattttga ccaactactt 11940
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tcgtgcatat aatttccgac catttgttct aaaaataaac tcactcaatc aattaccaac 13320
ggaagactat gtgttttctt tatctagtac agtatgtgtt tttatattaa acaatacaga 13380
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tagtttctag tttttagtct catttagtcc tttttttgcc aaacactagg attaaatata 13500
aactaaaatg atttagtctt tagtagggac taaaccatat taattccaca tttatcactc 13560
atttagttca attgtactaa tagtagtaga atgttaaagg tcattttagt tttcttataa 13620
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caactaccac atattatatt actttttccc acttctcaac taccggttgt ccgcacccat 14040
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ctaaaataaa aaaatcgaga agttcagttt cgatttctta ctttggtttt ggtttttggt 14460
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gcaggaggct tgtcatgggg ggcccgttcc cccgtccggc ccctcccctc cccgcgccgg 16920
ccagcccgtg gcatggcatc tctgcgcaag gcgaccagcg gactgcggcc ggccggccgc 16980
ctgtgcctgt gacgatttgt cagaagaaaa cagcaatttt cagggcctgc actgcatcta 17040
atcatgcacg gaaacggatc caggcgggcg ggggcccaac cttttcatca tgcagaagac 17100
acatggaatc gaagctgaag atagcctggg cgagtgggcg gtggcttcta gcgatcaacg 17160
gaaaacatgt gttgggatca gtgtggtatt cggatcggag ttcaggtcgt aggtcgtagc 17220
cgtggaaggg ctcgcgctcc ctgcttcacg gaccgaggct actgataacg tcgtgcccct 17280
gagggcaagc agcgagacag cagctgagga gcatcgtcgc gcagtacagg ccccatggac 17340
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cgacgaataa ttgggccgtg cccggctggc ccgcgtgccg cggcccaggc acggcacgcc 17520
ggcctggtag tcgtgctgag ccggcccgtt aactggtcac gttctcccat taaattaagg 17580
aaaatagcaa aaaactgtgt gtgtgtctag ctcagctatt gctccttgaa actatcaacc 17640
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tagtatacta gttttacact ctgcagaggt tgtacccttt acccacaagt catgctaccc 168540
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tacgaggcct ttacaaagtt ccactagctt ccgaaaaccc gctacagttt ataagaagtt 168660
ccaatgcagg gttcttgtct gaccgccatc gcagcaaaat caaccaagga cctccctaca 168720
ctgaccactc ccctactgcc cttgcccctt tcgggtaagg tagtcttcca ctagctttcc 168780
taattagtca gccaagggcg tcccattaaa cccttgtggt ggcacgtgtt tctcaagtta 168840
agctctatgt tccaattaac attaatgaac ttgacatgaa cataaataga ataacaagaa 168900
taattggaac atagatataa taattgatta tcccaaaacc atgtaaagca atagcaaact 168960
acccaagtga ttcaggggta aacaaggtaa tgagataaac aaatctaggg tgtcctattg 169020
ggtcccatca aaattaacct atgcacgagt gaatgataat tagagaacat tattgggtaa 169080
aaagtggtca agggcacaac ttgcctggca ctagagattc cagttaccag ggtgattctt 169140
caaatcctcg tgacctcact gctagtcgta gcaatacaaa caaacatggt atagacaaaa 169200
ttaacatcac accaaacata agaatatact gcgtaataat gatatacgcg ttgctacgag 169260
actaacgcaa cttgaacgga tcaaattgaa gttaaaacgg aggatatatg aatttcctaa 169320
ggttttatgt atttgatacg aggttaatta agaaataaat tttaatacca ttttcatgtt 169380
aaaacagaga cacagggtga taaacaacat tattacaaaa ttatagaaac taaaatggat 169440
taatttggac tacacatgaa tttttttttt ttttaaccaa ttctagcatt tatttctaca 169500
ttaaaaatcc aacgaatcaa gctgattcat caaaggtacc aaatnnnnnn nnnnnnnnnn 169560
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 169620
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnntaactt aatgaacttg acatgaacat aaaaaagaat 169680
accaagaata attgaaacat agatataata attgattatc ccaaaaccat gtaaagcaat 169740
agcaaactac ccaagtgatt caggggtaaa caaaggtaat gagataaaca aatctagggt 169800
gtcctattgg tcccatcaaa attaacctat gcacgagtga atgataatta gagaacatta 169860
ttgggtaaaa aagtggtcaa gggcacaact tgcctggcac ttgagattcc agttaccagg 169920
gtgattcttc aaatcctcgt gacctcactg ctagtcgtag caatacaaac aaacatggta 169980
tagacaaaat taacatcaca ccaaacataa gaatatactg cgtaataatg atatacgcgt 170040
tgctacgaga ctaacgcaac ttgaacggat caaattgaag ttaaaacgga ggatatatga 170100
atttcctaag gttttatgta tttgatacga ggttaattaa gaaataaatt ttaataccat 170160
tttcatgtta aaacagagac acagggtgat aaacaacatt attacaaaat tatagaaact 170220
gaaatggatt aatttggact acacatgaat tttctatgaa ttaaaccaat tctagcattt 170280
atttctacat taaaaatcca attctatatt tgttttctga tttttctggc tctctggact 170340
gggcacacta atacagagaa gttcaggggt ctcggtgtaa gttttcctaa gactcagagc 170400
ccaactacgt ggactgcggg ttatttatta acgacattag ggctcttttg taagatgggt 170460
cggcagcagt atgcgcatgc accctgagcc gttagatttt catcccacgg ccgcaactta 170520
acacaacgaa ggggtacgcc atgtggagcc tcggatccag atccaacggc aaccaaaaag 170580
gcatgagctg gcaactaatc acgcgtgttg gatcacgatc taacggccca cgactaagga 170640
atgaaggggt aatctaggcc gcccgtcatc aatctgacag ccacaacccc ctcttctacc 170700
ttatgccgct accttctcct ggaatacgca agactccacc aacagcaagc gactcggccc 170760
tgttgactcg gaggagggga attctcaccg ttgaagagca gggatgccga cgacgaagcg 170820
cgggtcacgg tgctgtgaag ccctagcgca gaatgaagtt ccttcgggct nnnnnnnnnn 170880
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 170940
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tccacataag gtcggctcca agaggtaacg 171000
accatacgat aacccgcggc gggaacggcg agatctttag caaatagaat tccaggagcg 171060
gatcctggga tcaaagacgt gagcttgatt cgttctcggc ggaagtgata gtcatgcggc 171120
gtagagaacg cgagttctgt tacggcgaag gggaaggaac tgacaacctg ggcccgcctg 171180
caagtcgcca cagcacgcgc atctggaatg tggcccccac catcggcgca gagggaagag 171240
gctggcacca acggcccacc ggtcggcaca cggtctaatc cgttcttttg ggctgtgcgc 171300
atttgcctga tgggccgatc acagaagaaa ttcggcccag agcgcaggta gtccccctct 171360
cctttctttt attttctatc ctcttattca taaatatttt gaattcaaat ttggatttga 171420
atctgctttt gagctctacc cctgagtcag gtgtcacatt aaagcactag tatagcaata 171480
atattttatt tatttatttt acattttttt atcacataaa attttctttc cttccctttc 171540
taggatttct tttagattct aaattccctt tttggacttt aatatttttc ttgtcacatt 171600
tttattttat tttgtcacaa tatgcacaca aaagaaaatc ctagcatgat gcatgattta 171660
tttgagtgtt tttatttaat tatttatttg tggaagtgag gtgttcacat gaaatgatag 171720
atatagatga cacacatgta tataaaggaa tataatctct ccttttagat ttttattaca 171780
aagtgggtat tacaaatcct acccccctta acaagaatct cgtcctcgag atttaggaag 171840
gactaggaaa aagatgggga aaaatctatg tgaaactctt cttctctttc ccatgatgct 171900
tcatcttctc catggtgact ccattgcact ttgcacattt ttatcacctt attccttgta 171960
agtcgagtaa aagtgtcaag aatcttgatc ggataccccg tgtaagtcaa atcatcctga 172020
acactgagct cttccattgg taactgttcc tcaaggacac ggagacactt cttaagttga 172080
gacacgtaaa ttacattata cacatcagat atattatcag gtagctcgag ttgataggcc 172140
atctctccaa ctcgcctaaa aactcataat ggtccaataa agtgagggaa caatttgccc 172200
ttaactttaa atctcctcat tccacgaagt ggtgacactt tgaggtacac atgatcacct 172260
tcctcaaact ccagtggtct tcttctatta tcagcgtagc tcttttgcct ggtctgagct 172320
accctcaaat tctcccgaat tatacggact tgttcctctg cttcttgaat aagttcaggc 172380
ccaaagaaat gtcttcctct agtctggtcc aaaaatagag gtgtcctgca tttcctgcca 172440
tacagagcct cgtacggtga catcttcaga ctagcctgat agctattatt atatgaaaac 172500
tcagcataag gtagactctt gtcacaacta ctaccatgct gaagggcgca agctctcaac 172560
atgtcttcca atacttgatt agccctttta gtttgtccat cagtctgagg ttggtaagcc 172620
aaaactagaa ttcaacttcg catccatatt ctcatgaaaa ctttttccaa aatctggagg 172680
taaactgtga ttcctctatc caaaatgatc ttcttcgggt acatcgtgtg ggagacacaa 172740
tccgagccat atattaactc taccaatttg agatacttta tagtagtctt gaccagaaat 172800
ggaatgaagt cactttggta attttatcca taataaccca a 172841
<210> 71
<211> 172841
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1872)..(1971)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3198)..(3297)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (20998)..(21097)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (25653)..(25752)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28223)..(28322)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (38718)..(38817)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40257)..(40356)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (53514)..(53613)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (63930)..(64029)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (67556)..(67655)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (82865)..(82964)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (137615)..(137714)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (161457)..(161556)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (162928)..(163027)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (164025)..(164124)
<223> n是a、c、g、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (171319)..(171418)
<223> n是a、c、g、或t
<400> 71
ttgggttatt atggataaaa ttaccaaagt gacttcattc catttctggt caagactact 60
ataaagtatc tcaaattggt agagttaata tatggctcgg attgtgtctc ccacacgatg 120
tacccgaaga agatcatttt ggatagagga atcacagttt acctccagat tttggaaaaa 180
gttttcatga gaatatggat gcgaagttga attctagttt tggcttacca acctcagact 240
gatggacaaa ctaaaagggc taatcaagta ttggaagaca tgttgagagc ttgcgccctt 300
cagcatggta gtagttgtga caagagtcta ccttatgctg agttttcata taataatagc 360
tatcaggcta gtctgaagat gtcaccgtac gaggctctgt atggcaggaa atgcaggaca 420
cctctatttt tggaccagac tagaggaaga catttctttg ggcctgaact tattcaagaa 480
gcagaggaac aagtccgtat aattcgggag aatttgaggg tagctcagac caggcaaaag 540
agctacgctg ataatagaag aagaccactg gagtttgagg aaggtgatca tgtgtacctc 600
aaagtgtcac cacttcgtgg aatgaggaga tttaaagtta agggcaaatt gttccctcac 660
tttattggac cattatgagt ttttaggcga gttggagaga tggcctatca actcgagcta 720
cctgataata tatctgatgt gtataatgta atttacgtgt ctcaacttaa gaagtgtctc 780
cgtgtccttg aggaacagtt accaatggaa gagctcagtg ttcaggatga tttgacttac 840
acggggtatc cgatcaagat tcttgacact tttactcgac ttacaaggaa taaggtgata 900
aaaatgtgca aagtgcaatg gagtcaccat ggagaagatg aagcatcatg ggaaagagaa 960
gaagagtttc acatagattt ttccccatct ttttcctagt ccttcctaaa tctcgaggac 1020
gagattcttg ttaagggggg taggatttgt aatacccact ttgtaataaa aatctaaaag 1080
gagagattat attcctttat atacatgtgt gtcatctata tctatcattt catgtgaaca 1140
cctcacttcc acaaataaat aattaaataa aaacactcaa ataaatcatg catcatgcta 1200
ggattttctt ttgtgtgcat attgtgacaa aataaaataa aaatgtgaca agaaaaatat 1260
taaagtccaa aaagggaatt tagaatctaa aagaaatcct agaaagggaa ggaaagaaaa 1320
ttttatgtga taaaaaaatg taaaataaat aaataaaata ttattgctat actagtgctt 1380
taatgtgaca cctgactcag gggtagagct caaaagcaga ttcaaatcca aatttgaatt 1440
caaaatattt atgaataaga ggatagaaaa taaaagaaag gagaggggga ctacctgcgc 1500
tctgggccga atttcttctg tgatcggccc atcaggcaaa tgcgcacagc ccaaaagaac 1560
ggattagacc gtgtgccgac cggtgggccg ttggtgccag cctcttccct ctgcgccgat 1620
ggtgggggcc acattccaga tgcgcgtgct gtggcgactt gcaggcgggc ccaggttgtc 1680
agttccttcc ccttcgccgt aacagaactc gcgttctcta cgccgcatga ctatcacttc 1740
cgccgagaac gaatcaagct cacgtctttg atcccaggat ccgctcctgg aattctattt 1800
gctaaagatc tcgccgttcc cgccgcgggt tatcgtatgg tcgttacctc ttggagccga 1860
ccttatgtgg annnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1920
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nagcccgaag 1980
gaacttcatt ctgcgctagg gcttcacagc accgtgaccc gcgcttcgtc gtcggcatcc 2040
ctgctcttca acggtgagaa ttcccctcct ccgagtcaac agggccgagt cgcttgctgt 2100
tggtggagtc ttgcgtattc caggagaagg tagcggcata aggtagaaga gggggttgtg 2160
gctgtcagat tgatgacggg cggcctagat taccccttca ttccttagtc gtgggccgtt 2220
agatcgtgat ccaacacgcg tgattagttg ccagctcatg cctttttggt tgccgttgga 2280
tctggatccg aggctccaca tggcgtaccc cttcgttgtg ttaagttgcg gccgtgggat 2340
gaaaatctaa cggctcaggg tgcatgcgca tactgctgcc gacccatctt acaaaagagc 2400
cctaatgtcg ttaataaata acccgcagtc cacgtagttg ggctctgagt cttaggaaaa 2460
cttacaccga gacccctgaa cttctctgta ttagtgtgcc cagtccagag agccagaaaa 2520
atcagaaaac aaatatagaa ttggattttt aatgtagaaa taaatgctag aattggttta 2580
attcatagaa aattcatgtg tagtccaaat taatccattt cagtttctat aattttgtaa 2640
taatgttgtt tatcaccctg tgtctctgtt ttaacatgaa aatggtatta aaatttattt 2700
cttaattaac ctcgtatcaa atacataaaa ccttaggaaa ttcatatatc ctccgtttta 2760
acttcaattt gatccgttca agttgcgtta gtctcgtagc aacgcgtata tcattattac 2820
gcagtatatt cttatgtttg gtgtgatgtt aattttgtct ataccatgtt tgtttgtatt 2880
gctacgacta gcagtgaggt cacgaggatt tgaagaatca ccctggtaac tggaatctca 2940
agtgccaggc aagttgtgcc cttgaccact tttttaccca ataatgttct ctaattatca 3000
ttcactcgtg cataggttaa ttttgatggg accaatagga caccctagat ttgtttatct 3060
cattaccttt gtttacccct gaatcacttg ggtagtttgc tattgcttta catggttttg 3120
ggataatcaa ttattatatc tatgtttcaa ttattcttgg tattcttttt tatgttcatg 3180
tcaagttcat taagttannn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3240
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnatt 3300
tggtaccttt gatgaatcag cttgattcgt tggattttta atgtagaaat aaatgctaga 3360
attggttaaa aaaaaaaaaa attcatgtgt agtccaaatt aatccatttt agtttctata 3420
attttgtaat aatgttgttt atcaccctgt gtctctgttt taacatgaaa atggtattaa 3480
aatttatttc ttaattaacc tcgtatcaaa tacataaaac cttaggaaat tcatatatcc 3540
tccgttttaa cttcaatttg atccgttcaa gttgcgttag tctcgtagca acgcgtatat 3600
cattattacg cagtatattc ttatgtttgg tgtgatgtta attttgtcta taccatgttt 3660
gtttgtattg ctacgactag cagtgaggtc acgaggattt gaagaatcac cctggtaact 3720
ggaatctcta gtgccaggca agttgtgccc ttgaccactt tttacccaat aatgttctct 3780
aattatcatt cactcgtgca taggttaatt ttgatgggac ccaataggac accctagatt 3840
tgtttatctc attaccttgt ttacccctga atcacttggg tagtttgcta ttgctttaca 3900
tggttttggg ataatcaatt attatatcta tgttccaatt attcttgtta ttctatttat 3960
gttcatgtca agttcattaa tgttaattgg aacatagagc ttaacttgag aaacacgtgc 4020
caccacaagg gtttaatggg acgcccttgg ctgactaatt aggaaagcta gtggaagact 4080
accttacccg aaaggggcaa gggcagtagg ggagtggtca gtgtagggag gtccttggtt 4140
gattttgctg cgatggcggt cagacaagaa ccctgcattg gaacttctta taaactgtag 4200
cgggttttcg gaagctagtg gaactttgta aaggcctcgt agtgttgccc tgccgcgctt 4260
cctaggtaga ggtgtatggg attcgtgacc ccttggcaga tgggtagcat gacttgtggg 4320
taaagggtac aacctctgca gagtgtaaaa ctagtatact agccgtgctc gcggtcatga 4380
gcggctcagg actctctgat gttttaaatt atggaactta aattcaattt tgtcatttgc 4440
attgcatggg gtctattatt aatttttgtt caattacttt atctaaggtt ttggtattca 4500
cttatacttt agtaactgct aaataaaatt ttgaccaact acttaaaagc aatgctcagc 4560
tttaacccct atcattgatt agccttacac atcacatgac ctcacacctt tgtgagttta 4620
tgtccaccgg ttccccacaa cttgttgagc tatgatcatg tgtgagctca cccttgctgt 4680
ctcacacccc cccacaggag aagagcaggt ggttcaggag gagccgccta acactgagga 4740
gttcgatctg atctaggtgg catttcccag tcgacattgg cgccgacgat ccttagttcg 4800
ttttactttt atcttttatt ttgtaataag tcttccgcta tgtaataaat actctgatgt 4860
tttatgacat ttatctctat acactctgtt attatatatg ttgtcttctt ggcgcatgta 4920
tgagatgcac ccggctttgt tccttaaagc cgggtgtgac agaagtggta tcagaggaaa 4980
tgttgactgt aggacgaaac ctagatagaa atggacaaaa cccttcacta cttaccttac 5040
tctgattctt tctacactta tcttgattct gtctcacctt ctactgttct actctgatca 5100
ttcttacctt ttctactctt agtcaagatg gatttcacac cttggaatcc ctacctgtgg 5160
gggatagata tcccccgggt ccactaaaga agtaaaaggc ctcacgaaag gcccaagggc 5220
ccaataattc gtaaggtcat tctttcgtgg gcctagggaa agacagccgt taaaataaag 5280
aagacgtggg actgattagt gcaaacacag gcggcccaca acgtcgaacg aatgaatcac 5340
aaacagagac ccgactttcc cgcgctgaag cccccatgca acggagccat gcgaggataa 5400
gtcggcggag gttacgtaag gataagctca agaagttcac tatctttcag ctacttgttg 5460
ttatcgtatc acatgtaatg ctccacggcc gagtatataa ggcctagggg gcaccccttc 5520
agatggatcg actctgctcc acttagccac ccacaaaaac tctctgcgcc ctctatccag 5580
agaatccttt tgtaaccacg ctcatatact caccaggacg tagggtgtta cgcgtttcta 5640
agcggcccga acctgtaaat cttgtccatt gtccctcgtg cgatcggcac gaaccatttt 5700
gctacagtcg tcgacaccgt cctactccta aaaacacctt gaggggcaac cccgggtgtg 5760
cggtcggacc caaaacaccg atagctggcg cgccaggtag ggggtgtgtc gacgatccaa 5820
gctagctcaa tggccgtcac cttccacagc aagatcacca tgcgtcccgg atccacattc 5880
tgcttcggga caatctcctc cgtggcggat gaagaaggaa ttctacaccg cctcgcggat 5940
ctgccggaac agaagtctcc accaacaaac tccgaaaatg ctggaaagac gctacttccg 6000
gttcttcggg aaaagatcgt ctccggggag gctggagcga gaagctcgct gacccggaag 6060
actccgctgt ctacttcccc gacgaaagaa tggacacaga tcatgagaag gaaggagatc 6120
agggagaggc cggtcgttct tcccgttcct ccgacttcaa aggagaatgg aaagaaagtc 6180
gccgcggcag caataccgtt ctaccccgac atcctcttca tcgggagagc agaatcaccc 6240
gccgtctccg acgatgaacc gaccgcgcct ggagaagaac cgcctcagcg agaatcccgc 6300
cgacgaagga atcggcgcag gaacgttcga cgacatcacg cagctggaga acaggatccg 6360
gagcaacctg tctcgcgaga cgaggtctca gagataggag aaactccgga agaacgcgtc 6420
ttcagggaac gaaggaactc ccgacgacga gatcgccgtc gaactcagga gcaagccgag 6480
caagatgcaa ggcaacgacg cgagaatccg ctcttcgggc gcaacctgaa ccccgacttc 6540
gcccgagcca tgaatacgcc gagcgaagtc ggaggcgttc tggcccggat agctgacgga 6600
cttcctcgga cccccgacgc cgagggatac cggcgcctgt tcactcaggc agccaaccat 6660
cttctaccgc tcgctcatcc gccgaacgat ctgcgacacg ccatcaacag tcgccgagac 6720
gcgcgaagct ctatcaatgc ttcgcgcgaa cggcggcacg agaacgaaat tcgccgtcga 6780
gaggagtatg atcgagatca tggcttcccg acccaaagcc aggccacccg aactgagtcg 6840
gcaacagctt caactggtgg aaccacccgg ggacggtcga ggagccacca ccgccactcc 6900
cctccccggg acagacgaca tcctcgacga caggaagaca cgtgcggagt atccgccctt 6960
actccgcgcc ttagggccat ccaatggcct cccaacttca aggtatccaa tgtcgacaaa 7020
tatgaaccta agcaggatcc ggggggctgg ttagccgtct acaccaccgc tgctcgggcc 7080
gctggggcat ccgaggacgt catgactgcg tatctgccca tcgtcctcgg gcaagacgcg 7140
ctgcagtggc tacgacatct accccgacac tgcatcgacg actggggaga cttcagtcga 7200
cgtttcaccg ccaacttcca gtctctctcc gacaagccag cgcaaccatg ggacctcaaa 7260
tccatcaagc gccgggggga tgagactctc aggtcatacc ttaaaaggtt ccagaccatg 7320
agaaaccgca tccccgaggt cacggaggcg gccgtaatcg aggacttcta cagaggatct 7380
aacgactcag ctttcgtccg agccatactg caaaaggcgc cgactacctc cgaggagctg 7440
ttccgggaag ccgacctcta catcaccgct gacgagcggg cccaggacct catcggagga 7500
gcaaagcccg caccggcggt accacgacgc gacgcgaacc agccgcccga caagcgctgg 7560
gagaagaggc ctcgcgaaga ggtacacgcc gtcggaccac ccgcctctcg cgcccgagga 7620
ggacctcgtg gaggcgaacg cacgctggac gacatcctcg acgcccagtg cccgtaccac 7680
aaggatatgc gccacactct ccgcaactgc cgggacttca agcactccgt cgggcatggc 7740
cgacccttcc aacctctacc acctcctccg ccgagaggag gaccagatga accacgacag 7800
ccccatcagc cggaggaggg gggaggagga gctttcccgc gcgttgacag ggaggtcaac 7860
gtcatcttcg gcggacatgg gtcgcaggag aacaagagac aacaaaagct caacgaccgc 7920
cagatactgg tggcgaccac cggccctccc gccccgtacc ggtggtcgga gcacccaatc 7980
acattcactc gggaggatca atggctcaac ttcgaccacc caggcaaata cccgctcctc 8040
gtcgatccgg tgatccgaga gagccgagtg aagaaggtgc tagtggacgg ggggagcagc 8100
atcaacgtca ccttcccccg tacgcttcaa ggcttgggag ttcacctcaa agagctccac 8160
gagtcagaca ctcctttctt cggcatcgtg ccgacggaag gggagtatcc gctgggccac 8220
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gaggtggcga acttcgactg cgggtacaac gccatcatcg ggaggccagg gctggccaag 8340
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ggcaatccag taatgaagtc cttaccaatt tcttcccctt ccacttgggt atcttcagtg 172140
gatgtaatag tccagctggt ctttggtgtt aggccttaac tctttgacac ccatcgcaca 172200
tagccacatg tgcagccaca tctctcttca atccatacca ccagtatttc tgcttcaatt 172260
cctgatacat cttggtacta ccaggatgaa tagaataatc caagttatgg gcttccttta 172320
gaatagtctt acgaaggctt tcaataccag gaacacatat cctgcccttg aaccatattg 172380
tgtcttgttc atcttccgta aattccggac ctctaccttt cgtaataaga tccttgatct 172440
cttgtatctt ggcatcacca atctgtcgtt ctgtggattt tcttgctcca aggtaggttc 172500
cacatcaata atgactcctt aagcgtgagc atctatcccc aggttaagtc tcctgaaatc 172560
ctcaacaatc tcatcgggta gctgggcaac aatagctgaa tgaacatgct cctttcgact 172620
caaaggcttc tgcaaccaaa tttgccttgc ccagtgatag tgaatctcca aatcattatc 172680
ccttaataag ctccaaccaa cggcgtgcct aaggttgaga tccttcctga gtgaatataa 172740
actcttatga tccgttatac ttggcacttg ttccccatga tataaagtct ccatatcttt 172800
aagcgcatgc ccaacggcct gccaattcca tagcatgaga g 172841

Claims (83)

1.一种转基因玉米植物的种子，所述种子包含优良事件MZIR098，所述种子的实例以ATCC登录号PTA-124143保藏。
2.一种转基因玉米植物、其细胞及组织，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
3.一种玉米植物，其包含以ATCC登录号PTA-124143保藏的玉米优良事件MZIR098的基因型，其中所述基因型包含与SEQ ID NO:1-6中任一个具有至少95％的核酸序列。
4.一种核酸分子，其含有包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核酸序列。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含在玉米种子中，所述种子的实例以登录号PTA-124143保藏于ATCC。
6.一种扩增子，其包含根据权利要求4所述的核酸分子。
7.一对多核苷酸引物，其包含第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物，所述第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物在样品中存在玉米优良事件MZIR098 DNA模板的情况下共同起作用，以产生对所述玉米优良事件MZIR098具有诊断性的扩增子。
8.根据权利要求7所述的一对多核苷酸引物，其中所述第一多核苷酸引物包含来自如SEQ ID NO:8中列出的位置1-1076的至少10个连续核苷酸，或其互补序列。
9.根据权利要求8所述的一对多核苷酸引物，其中所述第一多核苷酸引物包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:65，或其互补序列。
10.根据权利要求7所述的一对多核苷酸引物，其中所述第一多核苷酸引物包含来自如SEQ ID NO:9中列出的位置1-1075的至少10个连续核苷酸，或其互补序列。
11.根据权利要求10所述的一对多核苷酸引物，其中所述第一多核苷酸引物包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:67，或其互补序列。
12.根据权利要求7至11所述的一对多核苷酸引物，其中所述第二多核苷酸引物包含来自如SEQ ID NO:7中列出的位置1-8467的至少10个连续核苷酸，或其互补序列。
13.根据权利要求7至11所述的一对多核苷酸引物，其中所述第二多核苷酸引物包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:22至SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43、SEQID NO:44、SEQ ID NO:46至SEQ ID NO:52，及其互补序列。
14.一种在包含玉米核酸的样品中检测对于事件MZIR098独特的核酸分子的存在的方法，所述方法包括：
a)从所述玉米植物获得基因组DNA的DNA样品；
b)将所述核酸分子与根据权利要求7-13所述的一对多核苷酸引物组合；
c)进行核酸扩增反应，所述核酸扩增反应产生对玉米优良事件MZIR098具有诊断性的扩增子，其中所述扩增子含有包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列；以及
d)检测所述扩增子。
15.一种在包含玉米核酸的样品中检测对于事件MZIR098独特的核酸分子的存在的方法，所述方法包括：
a)从所述玉米植物获得基因组DNA的DNA样品；
b)将所述核酸分子与根据权利要求7-13所述的一对多核苷酸引物以及与包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或其互补序列的核苷酸序列的多核苷酸探针组合；
c)进行核酸扩增反应，所述核酸扩增反应产生可以被所述探针检测的扩增子；以及
d)检测所述探针。
16.一种DNA分子，其包含由根据权利要求14所述的方法产生的扩增子。
17.一种证实包含玉米核酸的样品中不存在对于事件MZIR098独特的核酸分子的方法，所述方法包括：
a)从玉米中分离基因组DNA；
b)将所述核酸分子与根据权利要求7-13所述的一对多核苷酸引物以及与作为阳性对照的玉米天然基因的一对多核苷酸引物组合；
c)进行核酸扩增反应，所述核酸扩增反应不产生对事件MZIR098具有特异性的扩增子，并且产生对所述玉米天然基因阳性对照具有特异性的扩增子；以及
d)检测对所述玉米天然基因阳性对照具有特异性的扩增子。
18.一种生物样品，其衍生于玉米优良事件MZIR098玉米植物、组织、种子或细胞，其中所述样品包含核苷酸序列，所述核苷酸序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2互补。
19.根据权利要求18所述的生物样品，其中所述序列在所述样品中使用核酸扩增或核酸杂交方法是可检测的。
20.根据权利要求18所述的生物样品，其中所述样品衍生于玉米商品产品。
21.根据权利要求20所述的生物样品，其中所述样品选自由以下组成的组：玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉、以及全部或部分地含有玉米副产物的制造的谷类食品。
22.一种提取物，其衍生于玉米优良事件MZIR098玉米植物、种子、组织、或细胞的生物样品，所述提取物包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2互补的核苷酸序列。
23.根据权利要求22所述的提取物，其中所述序列在所述提取物中使用核酸扩增或核酸杂交方法是可检测的。
24.根据权利要求22所述的提取物，其中所述提取物衍生于玉米商品产品。
25.根据权利要求24所述的提取物，其中所述样品选自由以下组成的组：玉米粉、玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉、以及全部或部分地含有玉米副产物的制造的谷类食品。
26.一种产生玉米商品产品的方法，所述方法包括以下步骤：
a)获得根据权利要求2所述的转基因玉米植物、其细胞或组织；以及
b)从所述转基因玉米植物、其细胞或组织产生玉米商品产品。
27.一种玉米商品产品，其包含可检测量的对于优良事件MZIR098独特的DNA分子，其中所述分子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
28.一种非生命植物材料，其包含可检测量的根据权利要求4所述的核酸分子。
29.一种用于确定包含玉米优良事件MZIR098的玉米植物的接合性的方法，所述方法包括：
(a)从所述玉米植物获得基因组DNA的DNA样品；
(b)通过将所述DNA样品与以下进行接触来产生接触的样品：
(i)第一事件引物和第二事件引物，其中所述第一事件引物与事件MZIR098的转基因的至少一个片段特异性结合，并且所述第二事件引物与事件MZIR098的5'玉米基因组侧翼DNA或3’玉米基因组侧翼DNA的至少一个片段特异性结合，并且其中所述第一事件引物和所述第二事件引物在经受定量PCR条件时产生对于事件MZIR098独特的事件扩增子，
(ii)至少一个天然插入位点第一引物和至少一个天然插入位点第二引物，其中所述第一引物是正向引物，并且所述第二引物是反向引物，其中第一引物和第二引物在经受定量PCR条件时共同起作用，以在所述基因组中不存在优良事件MZIR098时从所述天然MZIR098插入位点产生扩增子，
(iii)能够与所述事件扩增子杂交的荧光事件探针，以及
(iv)能够与所述天然插入位点扩增子杂交的荧光天然插入位点探针；
(c)使所述接触的样品经受基于荧光的终点定量PCR条件；
(d)定量与所述事件扩增子杂交的所述荧光事件探针，并定量与所述天然插入位点扩增子杂交的所述荧光天然插入位点探针；
(e)比较杂交的荧光事件探针与杂交的荧光天然插入位点探针的量；以及
(f)通过比较杂交的荧光事件探针和杂交的荧光天然插入位点探针的荧光比，确定包含玉米优良事件MZIR098的所述玉米植物的接合性。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述事件或天然插入位点扩增子由50-200个核苷酸组成。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一事件引物包含来自如SEQ ID NO:7或其互补序列中列出的位置1-8467的至少10个连续核苷酸，并且其中所述第二事件引物包含来自如SEQ ID NO:8中列出的位置1-1076、或来自如SEQ ID NO:9或其互补序列中列出的位置1-1075的至少10个连续核苷酸。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一事件引物选自SEQ ID NO:11、17、18、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、37、39、40、43、44、46、47、48、49、50、51、52，或其互补序列。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述第二事件引物选自SEQ ID NO:10、14、15、16、19、20、21、36、38、41、42、45、65、67，或其互补序列。
34.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一天然插入位点引物包含来自如SEQ IDNO:8或其互补序列中列出的位置1-1076的至少10个连续核苷酸，并且其中所述第二天然插入位点引物包含来自如SEQ ID NO:9或其互补序列中列出的位置1-1075的至少10个连续核苷酸。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一天然插入位点引物选自SEQ ID NO:10、14、15、16、38、42、45，或其互补序列。
36.根据权利要求29所述的方法，其中所述第二天然插入位点引物选自SEQ ID NO:19、20、21、36、41、45、67，或其互补序列。
37.根据权利要求29所述的方法，其中所述荧光天然插入位点探针包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:69。
38.根据权利要求29所述的方法，其中所述方法的结果在酶标仪中直接读取。
39.一种用于进行根据权利要求29所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含所述第一事件引物、所述第二事件引物、至少一个所述天然插入位点第一引物、至少一个所述天然插入位点第二引物、所述事件探针和所述天然插入位点探针。
40.一种对玉米植物进行育种的方法，所述玉米植物包含昆虫抗性和除草剂耐受性玉米优良事件MZIR098，其中通过根据权利要求29所述的方法确定包含玉米优良事件MZIR098的玉米植物的接合性。
41.一种对玉米植物进行育种的方法，所述玉米植物包含遗传连接至或核酸标记的互补序列的昆虫抗性和除草剂耐受性玉米优良事件MZIR098，其中使用SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:65、SEQID NO:67或其互补序列鉴定所述标记。
42.一种用于昆虫抗性和除草剂耐受性玉米优良事件MZIR098的标记辅助选择的方法，所述方法包括：
a)从玉米中分离核酸分子；
b)将所述核酸分子与一对多核苷酸引物和探针结合，所述多核苷酸引物和探针选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67，或其互补序列；
c)进行核酸扩增反应，所述核酸扩增反应产生扩增子；
d)检测所述扩增子；以及
e)出于对包含玉米优良事件MZIR098的昆虫抗性和除草剂耐受性玉米进行育种的目的选择所述植物。
43.一种产生包含玉米优良事件MZIR098的杂交玉米种子的方法，所述方法包括以下步骤：
a)种植第一近交玉米植物的种子，所述第一近交玉米植物的种子的实例以ATCC登录号PTA-124143保藏，以及第二近交玉米植物的种子，所述第二近交玉米植物的种子具有与所述第一近交玉米植物不同的基因型；
b)培育所述第一和第二玉米植物直至产生花；
c)将在所述第一或第二近交玉米系流动时产生的所述花去雄；
d)用去雄的近交植物的花粉对未去雄的植物进行授粉，产生杂交玉米；以及
e)收获所产生的杂交玉米种子。
44.由根据权利要求43所述的方法产生的杂交玉米种子。
45.通过使根据权利要求44所述的杂交玉米种子生长而产生的杂交玉米植物。
46.根据权利要求2所述的转基因玉米植物、其细胞或组织，其中将所述玉米植物进一步定义为包含所述优良事件MZIR098的玉米植物的任一代的子代植物。
47.根据权利要求46所述的转基因玉米植物、其细胞或组织，其中所述玉米植物是由包含优良事件MZIR098的至少一个亲本育种的杂种。
48.一种检测样品中对应于玉米优良事件MZIR098的核酸分子的存在的方法，所述方法包括：
a)将所述样品与探针接触，所述探针在高严格条件下与来自玉米优良事件MZIR098的基因组DNA杂交并且在高严格条件下不与对照玉米植物的DNA杂交；
b)使所述样品和所述探针经受高严格杂交条件；以及
c)检测所述探针与所述DNA的杂交。
49.一种用于检测生物样品中玉米优良事件MZIR098核酸的存在的试剂盒，所述试剂盒含有包含足够长度的连续核苷酸的至少一种DNA分子，所述DNA分子是SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或与其互补，所述DNA分子作为对于玉米优良事件MZIR098具有特异性的DNA引物或探针而起作用。
50.一种用于通过无性繁育产生玉米优良事件MZIR098植物的方法。
51.根据权利要求2所述的转基因玉米植物、细胞或组织在产生玉米优良事件MZIR098植物中的用途。
52.一种用于保护玉米优良事件MZIR098植物免受一种或多种有害生物摄食损伤的方法，所述方法包括：
(a)提供玉米优良事件MZIR098植物的MZIR098种子；以及
(b)用杀昆虫剂处理所述MZIR098种子。
53.一种用杀昆虫剂处理的玉米优良事件MZIR098种子。
54.一种用杀昆虫剂处理的玉米优良事件MZIR098植物。
55.一种控制杂草的方法，所述方法包括将除草剂施用于田地，所述田地包含根据权利要求2所述的植物。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述除草剂是GS抑制剂，例如草铵膦或双丙氨磷。
57.一种控制包含至少一种根据权利要求2所述的植物的区域中的草甘膦抗性杂草的方法，其中所述方法包括将GS抑制剂除草剂施用于所述区域的至少一部分。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述除草剂是草铵膦。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述杂草中的至少一种是不同于包含优良事件MZIR098的植物的物种的草甘膦抗性自生物。
60.一种控制培育区域中杂草的方法，所述区域包含根据权利要求2所述的多种植物，所述方法包括在所述植物的顶部施用GS抑制剂除草剂。
61.根据权利要求3所述的玉米植物，其中所述玉米植物可用于控制根萤叶甲属物种昆虫有害生物并具有除草剂耐受性。
62.一种控制昆虫有害生物的方法，所述方法包括在田地种植包含优良事件MZIR098的玉米。
63.包含优良事件MZIR098的玉米植物用于在田地控制昆虫有害生物中的用途。
64.一种用于产生玉米优良事件MZIR098种子的方法，所述方法包括将根据权利要求3所述的玉米植物与第二玉米植物杂交。
65.一种由根据权利要求64所述的方法产生的玉米优良事件MZIR098种子。
66.一种通过使根据权利要求65所述的种子发芽而产生的玉米优良事件MZIR098植物。
67.一种将另外性状引入玉米优良事件MZIR098植物的方法，所述方法包括：(a)将从玉米优良事件MZIR098种子生长的玉米优良事件MZIR098植物与包含另外性状的另一种玉蜀黍植物杂交以产生杂交子代植物，所述玉米优良事件MZIR098种子的代表性种子保藏在ATCC登录号PTA-124143下；(b)选择具有所述另外性状的杂交子代植物以产生选择的杂交子代植物；(c)使所述选择的子代植物与玉米优良事件MZIR098亲本植物杂交以产生回交子代植物；(d)选择具有另外性状的回交子代植物以产生选择的回交子代植物；以及(e)重复步骤(c)和(d)至少三次或更多次，以产生包含所述另外性状和玉米优良事件MZIR098的回交子代植物。
68.一种由根据权利要求67所述的方法产生的植物。
69.一种用于在玉米植物育种程序中开发玉米优良事件MZIR098植物种质的方法，所述方法包括施用植物育种技术，其中所述技术包含轮回选择、回交、谱系育种、标记增强选择、单倍体/双单倍体产生、或玉米优良事件MZIR098植物或其部分的转化，其中所述技术的施用导致包含优良事件MZHG0J的第二玉米种质的开发。
70.一种产生具有双单倍体染色体的玉米优良事件MZIR098植物的方法，所述方法包括：(a)将根据权利要求2所述的植物与诱导玉蜀黍植物杂交以产生具有单倍体染色体的子代；和(b)将所述子代中的单倍体染色体加倍以产生具有双单倍体染色体的玉米优良事件MZIR098植物。
71.一种重组序列，所述重组序列包含位于染色体10上在SNP标记SYN23814和PZE110102022之间的玉蜀黍染色体靶位点，其中所述靶位点包含异源核酸。
72.一种染色体10的重组核酸分子，所述重组分子包含插入到列为SEQ ID NO:70的核苷酸1至核苷酸172,841的染色体9上的异源核酸序列。
73.根据权利要求71或72所述的重组核酸分子，其中将所述异源核酸序列插入到列为SEQ ID NO:70的核苷酸18,206至18,246的染色体10上。
74.根据权利要求71或72所述的重组核酸分子，其中所述异源核酸在其5'末端邻近SEQID NO:70的核苷酸16,206至18,206，并且在其3'末端邻近SEQ ID NO:54的核苷酸18,246至20,246。
75.一种制备转基因玉蜀黍植物的方法，所述方法包括在染色体10上在SNP标记SYN23814和PZE110102022之间的位置处插入异源核酸。
76.根据权利要求75所述的方法，其中将所述异源核酸插入列为SEQ ID NO:70的核苷酸1至核苷酸172,841的染色体10上的位置处。
77.根据权利要求75所述的方法，其中将所述异源核酸插入到列为SEQ ID NO:54的核苷酸18,206至18,246的染色体10上。
78.根据权利要求75所述的方法，其中所述异源核酸在其5'末端邻近SEQ ID NO:70的核苷酸16,206至18,206，并且在其3'末端邻近SEQ ID NO:70的核苷酸18,246至20,246。
79.一种与所述玉米优良事件MZIR098有关的核酸分子，其特征在于所述核酸分子由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列组成。
80.根据权利要求4、5或79中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子在转基因生物的基因组内。
81.根据权利要求4、5或79中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子在转基因玉蜀黍植物的基因组内。
82.SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2在鉴定优良事件MZIR098中的用途。
83.一种来自根据权利要求3所述的玉米植物的生物样品，其中所述生物样品包含持续具有杀昆虫活性的杀昆虫蛋白mCry3A和/或eCry3.1Ab。
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