CN111278894A - 肾脏靶向药物递送载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有具有多个末端基团的大分子载体的化合物，其中丝氨酸的羰基直接通过肽键或酯键或者经由连接基团连接至末端基团；由该化合物组成的药物递送载体；以及用于预防或治疗肾脏疾病的药剂，其包含药物递送载体和药物，该药物直接或经由连接基团与载体连接或封装在载体中。根据本发明，可以提供选择性地在体内肾脏中累积的药物递送载体。

Description

肾脏靶向药物递送载体

技术领域

本发明涉及用于递送肾脏靶向药物的载体，该肾脏靶向药物选择性地累积在体内的肾脏中，特别是在近端肾小管中，以及涉及一种肾脏靶向药剂(medicament)，其含有与该载体连接或封装在该载体中的药物(drug)。

背景技术

近年来，通过控制药物的药代动力学来最有效且安全地给药的剂型(即药物递送系统)的开发在药物开发中引起了关注。然而，几乎没有开发出用于递送选择性地累积在肾脏中的药物的载体。

例如，已知用丁二酸或乌头酸修饰的药物在肾脏中相对容易累积，但同时也在肝脏中积聚(非专利文献1)。

此外，聚乙烯吡咯烷酮类化合物作为选择性在肾脏中累积的靶向要素引起了人们的注意。但是，由于它们是人造聚合物，因此在分布到肾脏后难以分解，因此引起对累积性和安全性的担忧。因此，将其作为肾脏靶向要素的临床应用困难并且尚未投入实际使用(非专利文献2)。

肾脏疾病包括各种疾病，例如肾小球肾炎，IgA肾病，糖尿病性肾病，膜性肾病，积水性肾病，造影剂肾病，肾盂肾炎，肾衰竭，急性肾炎，慢性肾炎，尿毒症，间质性肾炎，肾脏疾病，肾病综合征，高血压性肾硬化，糖尿病肾小球硬化症，肾结石，淀粉样肾，肾静脉血栓形成，Alport综合征，肾肿瘤等。因此，开发用于递送选择性积聚在肾脏中的药物的载体在治疗这些疾病中极为重要。

[文献清单]

[非专利文献]

非专利文献1：Yamasaki，Y.et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，2002May；301(2)：467-477

非专利文献2：Kamada，H.et al.，Nat Biotechnol.，21(4)：399-404(2003).

发明内容

[本发明要解决的问题]

在这种情况下，对安全性和生物相容性优异、肾脏靶向效率高的药物递送用载体的开发需求日益增加。

本发明旨在提供一种具有高生物相容性并通过使用生物成分即丝氨酸作为肾脏靶向要素而选择性地在肾脏中蓄积的实用的药物递送载体。

[解决问题的手段]

在这种情况下，本发明人进行了深入研究，并首次发现了：含有具有多个末端基团的大分子载体的化合物(下文有时称为“本发明的化合物”)，其选自树状分子(dendrimer)、树突状分子(dendron)、葡聚糖和壳聚糖，其中丝氨酸的羰基直接通过肽键或酯键或经由连接基团与末端基团总数的至少50％连接；以及，含有该化合物的药剂，该化合物直接或经由连接基团连接药物，或药物被包封在该化合物中，可实现高度选择性的肾脏分布和高的肾脏靶向效率，从而完成了本发明。

因此，本发明提供以下内容。

[1]一种含有大分子载体的化合物，所述大分子载体具有多个末端基团，所述大分子载体选自树状分子、树突状分子、葡聚糖和壳聚糖，其中丝氨酸的羰基直接通过肽键或酯键或经由连接基团与末端基团总数的至少50％连接。

[2]前述[1]的化合物，其中前述大分子载体是树状分子或树突状分子。

[3]前述[2]的化合物，其中前述树状分子或树突状分子由化合物组成，该化合物选自聚酰胺-胺(polyamidoamine)、聚赖氨酸、由聚乙二醇和2，2-双(羟甲基)丙酸构成的树突状分子，以及由2，2-双(羟甲基)丙酸构成的树突状分子。

[4]一种药物递送载体，其由前述[1]至[3]中任一项的化合物组成，并选择性地将药物递送至体内靶组织。

[5]前述[4]的药物递送载体，其中前述靶组织是肾脏。

[6]一种药剂，其包含前述[4]或[5]的药物递送载体和直接或经由连接基团连接到载体或封装在载体中的药物。

[7]前述[6]的药剂，其中前述药物选自血管紧张素转化酶抑制剂、抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂、抗纤维化剂、免疫抑制剂、抗氧化剂、核酸药物、放射性药物和显像剂中的至少一种。

[8]前述[6]的药剂，其中前述药物是卡托普利(captopril)，并且卡托普利经由连接基团连接到前述药物递送载体的丝氨酸修饰位点的丝氨酸衍生的末端氨基。

[9]前述[6]的药剂，其中前述药物是半胱氨酸，并且该半胱氨酸的羰基直接通过肽键或酯键或者经由连接基团连接到前述药物递送载体的非丝氨酸修饰的末端基团。

[10]前述[6]至[9]中任一项的药剂，其中所述药剂是用于肾脏疾病的预防剂或治疗剂。

[发明的效果]

本发明的化合物以及药剂(其中药物共价或非共价地掺入到该化合物中)显示出高的肾脏选择性和特别高的肾脏分布率以及向其他器官的稀少分布，并且作为各种肾脏疾病的预防剂(测试药物)或治疗剂是非常有用的。另外，本发明的化合物以及药剂(其中药物连接到或封装在该化合物中)(以下有时称为“本发明的药剂”或“本发明的药物组合物”)使用生物来源的丝氨酸作为肾脏靶向要素。因此，它们在生物相容性和安全性方面是优异的，并且在可以容易地合成等方面是有益的。因此，预期它们可广泛用作药效高、副作用少的实用性药物递送载体。

附图说明

图1(a)显示了比较例1的化合物的药代动力学，(b)显示了化合物1a的药代动力学，(c)显示了比较例2的化合物的药代动力学，(d)显示了比较例3的化合物的药代动力学。

图2显示静脉注射Dye800标记的化合物1a后器官分布的弱光成像图像。在图2中，A示出了小鼠的全身图像，并且B示出了切除的器官的图像。

图3显示了静脉注射FITC标记的化合物1a后60分钟的小鼠肾脏切片的显微图像。在图3中，(a)示出了肾皮质的图像，(b)示出了肾皮质的放大图像，并且(c)示出了髓质的图像。

图4A和4B分别显示了化合物1a和比较例1在LLC-PK1细胞单层膜的吸收方向和分泌方向上的膜通透性。图4C显示了各种抑制剂对LLC-PK1细胞中¹¹¹In标记的化合物1a的细胞摄取的影响。

图5显示了在给小鼠施用卡托普利化合物1a后卡托普利的药代动力学。在图5中，(a)显示血浆中卡托普利浓度的变化，(b)显示肾脏中卡托普利浓度的变化，并且卡托普利浓度是通过HPLC测定的结果。

图6显示了单独给药卡托普利和给药卡托普利-化合物1a后，肾脏中血管紧张素转化酶(ACE)活性的变化。

图7显示了半胱氨酸-化合物1a的药代动力学。

图8显示了在局部缺血-再灌注小鼠中施用半胱氨酸-化合物1a后的肾脏切片的图像。

图9显示了静脉注射¹¹¹In标记的化合物1a后器官分布的SPECT/CT成像图像。

图10A和10B分别显示未经处理的血浆以及施用PBS、化合物1a或阳性对照HgCl₂后的血浆中的肌酸酐水平和尿素氮(BUN)水平。图10C显示未经处理的以及施用PBS、化合物1a或阳性对照HgCl₂后的肾脏切片图像。

具体实施方式

下面描述本发明的具体实施方式。

[定义]

在本说明书中，“具有多个末端基团的大分子载体”的大分子载体选自树状分子、树突状分子、葡聚糖和壳聚糖，并且末端基团是指存在于大分子载体的末端(在树状分子或树突状分子的情况下，是指每个分支的末端)的官能团，可以是亲核基团(例如氨基、羟基、巯基等)或吸电子基团(例如甲酰基、羰基等)。

大分子载体没有特别限制，只要其具有多个末端基团即可。优选的是，例如，树状分子和树突状分子(例如，可从Sigma-Aldrich公司等商购的2，2-双(羟甲基)丙酸树状分子)，它们由聚酰胺-胺、聚赖氨酸、由聚乙二醇和2，2-双(羟甲基)丙酸构成的树枝状分子，或由2，2-双(羟甲基)丙酸构成的树突状分子，和具有氨基、羟基等作为多个末端基团的分子构成。更优选的大分子载体包括：由具有烷基二胺(例如乙二胺、1，4-二氨基丁烷、1，6-二氨基己烷、1，12-二氨基十二烷等)作为核心的聚酰胺-胺构成的树状分子(PAMAM)、由具有烷基二胺(例如1，6-二氨基己烷等)作为核心的聚赖氨酸构成的树状分子(例如，M.Ohsaki等人在Bioconjugate Chem，2002，13，510-517中描述的聚赖氨酸树状分子)，以及由聚赖氨酸构成的树突状分子(例如，KL Chang等人在J.Control.Release，2011，156，195-202中描述的聚赖氨酸树突状分子)，以及具有氨基或羟基作为多个末端基团的分子。这些之中，特别优选具有氨基作为末端基团的PAMAM-NH₂树状分子(例如，可从Sigma-Aldrich公司等商购的第一代至第五代PAMAM-NH₂树状分子等)。另外，只要不对本发明的目的造成不利影响(例如，在不与药物等发生反应的范围内)，构成前述大分子载体的各构成单元(树状分子或树突状分子的核心部分或分支部分或单体单元)可选地被C_1-12烷基、卤素原子(例如氟原子)等取代基取代。

这种大分子载体的分子量没有特别限制，只要它不阻止向生物体的给药即可。分子量约为1000-30000Da，优选约为3000-15000Da，更优选约为3000-7000Da。

在本说明书中，“末端基团总数的至少50％”是指末端基团的数量至少为前述大分子载体的末端基团(即，末端上存在的官能团)总数的50％(不少于50％)。

在本说明书中，“连接基团”是指包含原子链的双功能(同双功能或异双功能)或多功能化学部分，该原子链将丝氨酸的羧基与具有多个末端基团的大分子载体的末端基团(通过肽键或酯键)共价连接(在下文中有时称为“第一连接基团”)，或该原子链包合位点(inclusion site)或螯合位点(chelating site)，该位点将药物与来自丝氨酸修饰的大分子载体的末端基团的丝氨酸衍生的末端氨基(或丝氨酸修饰的大分子载体的非丝氨酸修饰部分的末端基团)共价或非共价连接(以下有时称为“第二连接基团”)。

双功能连接基团优选由具有下式的连接试剂形成：

X-R-Y

其中X是第一反应性部分，R是间隔基，Y是第二反应性部分。X和Y可以是合适的反应性部分，其可以相同(即，同双功能连接基团)或不同(即，异双功能连接基团)。合适的反应性部分包括但不限于醛(甲酰基)、氨基、卤素、羟基、羧基、二烯、酰肼、马来酰亚胺、NHS酯、磷酰基、巯基或其他反应性部分。优选地，X或Y是卤素、甲酰基、羧基、酰肼、马来酰亚胺或巯基。间隔基(R)可以是合适的未取代或取代的脂族或芳族有机部分。合适的有机部分可以是选自羰基、烷基、环烷基、环烷基烷基、芳基烷基、芳基、杂芳基、烷氧基烷基、卤代芳基、羟烷基、羧基、羧基烷基、烷酰基、烯基和炔基的二价基团，但不限于此。间隔基优选包含1-20个碳原子，更优选2-12个碳原子。

在本发明中，将丝氨酸或药物的羰基与末端基团共价连接的第一连接基团或第二连接基团可以由一个或多个双功能连接基团组成。作为形成这样的双功能性连接基团的连接试剂，可列举出可从各种试剂供应商商购的连接试剂(例如，参见Pierce公司、Sigma-Aldrich公司等试剂供应商目录)。使用这些试剂并根据本身已知的方法，本领域普通技术人员可以容易地引入这些连接基团。

双功能连接基团的实例包括但不限于由以下一种或多种市售的连接试剂形成的连接基团：6-马来酰亚胺基己酰基(MC)，马来酰亚胺基丙酰基(MP)，对氨基苄氧羰基(PAB)，乙烯氧基(-CH₂CH₂O-；EO或PEG)作为一个或多个重复单元，N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫基)丙酸酯(SPDP)，聚乙二醇化长链SPDP交联剂，N-琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺)-n乙二醇]酯(SM(PEG)n)(其中n为2、4、6、8、12、24等)，N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-6-酰胺基己酸酯(LC-SMCC)，2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut试剂)，磺基琥珀酰亚胺基6-(3′-(2-吡啶硫基)丙酰胺)己酸酯(磺基-LC-SPDP)，N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫基)戊酸酯(SPP)，N-琥珀酰亚胺基-(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)，双马来酰亚胺基三氧乙二醇(BMPEO)，N-β-马来酰亚胺基丙基-氧代琥珀酰亚胺酯(BMPS)，N-ε-马来酰亚胺基己酰基-氧代琥珀酰亚胺酯(EMCS)，N-γ-马来酰亚胺基丁酰基-氧代琥珀酰亚胺酯(GMBS)，1，6-己烷-双乙烯基砜(HBVS)，间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)，琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺)丙酸酯(SBAP)，琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)，琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)，琥珀酰亚胺基6-((β-马来酰亚胺基丙酰胺基))(己酸酯)(SMPH)，N-ε-马来酰亚胺基己酰基-氧代琥珀酰亚胺酯(磺基-EMCS)，N-γ-马来酰亚胺基丁酰基-氧代琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS)，N-[κ-马来酰亚胺基亚乙基癸氧基氧基]-磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-KMUS)，间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基MBS)，磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基SIAB)，磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-甲酸酯(磺基SMCC)，磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)，琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯(SVSB)，二硫代双马来酰亚胺基乙烷(DTME)，1，4-双马来酰亚胺基丁烷(BMB)，1，4-双-双马来酰亚胺基-2，3-二羟基丁烷(BMDB)，双(马来酰亚胺基)己烷(BMH)，双(马来酰亚胺基)乙烷(BMOE)，1，8-双马来酰亚胺-二甘醇(BM(PEG)₂)，1，11-双马来酰亚胺-三甘醇(BM(PEG)₃)，二亚乙基三胺-N，N，N′，N”，N”-五乙酸二酐(DTPA酸酐)等。其中，特别优选由以下一种或多种连接试剂形成的连接基团：N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫基)丙酸酯(SPDP)、聚乙二醇化长链SPDP交联剂、N-琥珀酰亚胺基-[[N-马来酰亚胺基丙酰胺)-n乙二醇]酯(SM(PEG)n)(其中n为2、4、6、8、12、24等)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-6-酰胺基己酸酯(LC-SMCC)、2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut′s试剂)和磺基琥珀酰亚胺基6-(3′-(2-吡啶硫基)丙酰胺)己酸酯(磺基-LC-SPDP)。

在本发明中，通过非共价地包含在末端基团中或与末端基团螯合而保留药物的第二连接基团的实例包括具有分子识别部分(包合部分或螯合部分)的连接基团，该分子识别部分可以与丝氨酸修饰的大分子载体的丝氨酸衍生的末端氨基(或丝氨酸修饰的大分子载体的非丝氨酸修饰的部分的末端基团)键合，并且可以在末端包封药物。在这样的连接基团中，能够包封药物的包合部分或螯合部分直接或经由前述一个或多个双功能连接基团与丝氨酸修饰的或非丝氨酸修饰的末端基团键合。这样的包合部分或螯合部分不通过共价键与药物连接，但是，由于其可以通过非共价相互作用与药物连接，因此被定义为本说明书中的双功能连接基团之一。这样的包合部分或螯合部分的实例包括但不限于：包合部分，例如3A-氨基-3A-脱氧-(2AS，3AS)-γ-环糊精水合物、胆固醇、胆酸、C₆₀富勒烯等；螯合部分，例如二亚乙基三胺-N，N，N′，N”，N”-五乙酸(DTPA)等。

在本说明书中，“丝氨酸的羰基直接通过肽键或酯键或经由连接基团连接”至大分子载体的末端基团是指这样的状态：大分子载体中存在多个的各末端基团和通过前述第一连接基团与每个末端基团结合形成的新末端基团都是氨基或羟基，丝氨酸的羧基通过肽键或酯键与该氨基或羟基连接并引入其中。

在本说明书中，“丝氨酸修饰的”和“非丝氨酸修饰的”分别是指这样的状态：大分子载体的末端基团与丝氨酸的d-羧基直接通过肽键或酯键连接或经由连接基团连接，以及丝氨酸不与大分子载体的末端基团连接。

在本发明的化合物或本发明的药剂中，大分子载体的末端基团的丝氨酸修饰部分(特别是丝氨酸衍生的羟基)作为肾脏靶向要素。“肾脏靶向要素”是指具有生物识别功能并且能够通过与肾脏特异性结合而与本发明的化合物或药剂形成生物结合对的位点。

为了使本发明的化合物或本发明的药剂表现出高的肾脏分布和高的肾脏选择性，需要向大分子载体末端基团中引入丝氨酸的引入率(丝氨酸修饰度)为末端基团总数的至少50％，优选不小于60％，更优选不小于70％，特别优选不小于80％。

在本说明书中，“药物”的实例包括血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、抗癌剂、抗炎剂，抗感染剂、抗纤维化剂、免疫抑制剂、抗氧化剂、核酸药物、放射性药物、显像剂等。药物的种类没有特别限制。药物的具体实例如下所示，尽管该药物不限于以下具体实例。

血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂的实例包括卡托普利、咪达普利、依那普利、赖诺普利、贝那普利、培哚普利、地拉普利、群多普利、西拉普利等。

抗癌剂的实例包括BCG、放线菌素D、天冬酰胺酶、醋葡醛内酯、阿那曲唑、别嘌醇、蒽环类、比卡鲁胺、抗雄激素、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、伊立替康、干扰素、α-干扰素、白介素-2、乌苯美司(ubenimex)、依西美坦、雌莫司汀、雌激素、依托泊苷、依诺他滨、表柔比星、奥沙利铂、奥曲肽、卡培他滨、卡巴醌、卡铂、卡莫氟、克拉屈滨、克拉霉素、云芝多糖、酮康唑、吉非替尼、吉西他滨、吉妥单抗、戈舍瑞林、环磷酰胺、顺铂、裂裥菌素、阿糖胞苷、赛庚啶、净司他丁斯酯(Zinostatin stimalamer)、西妥昔单抗、索布佐生、他莫昔芬、柔红霉素、达卡巴嗪、放线菌素、噻替帕、替加氟、替加氟尿嘧啶、替加氟吉美拉西奥托拉西尔钾(tegafur gimeracil oteracil potassium)、地塞米松、拓扑替康、曲妥珠单抗、曲普瑞林、维甲酸、托瑞米芬、多西氟啶、阿霉素、多西他赛、尼莫斯汀、新卡他汀、奈达铂、紫杉醇、羟基脲、羟基脲、比卡鲁胺、长春瑞滨、长春新碱、长春地辛、长春碱、沙培林(picibanil)、吡柔比星、法得唑、氟尿嘧啶、氟他胺、氟达拉滨、白消安、博来霉素、泼尼松、甲苄肼、孕激素、佩洛霉素、喷司他丁、卟吩姆钠、丝裂霉素、米托蒽醌、米线托、美司钠、甲氨蝶呤、甲羟孕酮、巯基嘌呤、美法仑、雷莫司汀、利妥昔单抗、亮丙瑞林、视黄酸、香菇多糖、亚叶酸等。所述抗癌剂可以单独使用，或者也可以组合使用两种以上。

抗炎剂的实例包括甾体抗炎剂和非甾体抗炎剂。

甾体类抗炎药的实例包括肾上腺皮质类固醇抗炎药，例如地塞米松、醋曲米松酮、倍氯米松、氢可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安西松、可的松、氢化可的松、帕拉米松、氟羟氢化泼尼松、二氟泼尼酯、双氟可乐定、氟美他松、氟西农尼、氟轻松丙酮、阿氯米松、氟氢可的松等及它们的盐。更具体地，可以提及例如，地塞米松、曲安西松酮、丙酸倍氯米松、琥珀酸氢化可的松、琥珀酸甲泼尼龙、乙酸地塞米松、乙酸地雷松龙、地塞米松偏磺酸苯甲酸酯、曲安西龙双醋酸酯、丙酮酸地松烯酮、丙酮酸己内酯、泼尼松龙琥珀酸酯、乙酸可的松、乙酸对甲米松、乙酸甲基泼尼松龙、曲安西龙、氢化可的松、泼尼松龙、倍他米松、泼尼松龙戊酸酯、地氟可松酮戊酸酯、地塞米松戊酸酯、倍他米松戊酸戊酸酯、二氟泼尼酯乙酸二氟戊酸酯、二氟哌啶酮乙酸酯、二氟哌啶酮乙酸二氟戊酸酯丙酮化物、丙酸倍氯米松、倍氯米松、丙酸氯倍松、丁酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、丁酸氟可的松、地塞米松棕榈酯、甲基强的松龙等。

非甾体抗炎剂的实例包括NSAID，COX-2抑制剂等。更具体地，例如，乙酰水杨酸、阿氯芬酸、阿米洛芬、苯恶洛芬、布比芬、丁氯芬酸、卡洛芬、塞来昔布、克林达那、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、芬布芬、非诺洛芬、芬太尼、氟芬那酸、氟比洛芬、氟苯丙酸、氟丁酸、氟苯丙酸、氟比洛芬、呋罗芬酸、吲哚美辛、吲哚洛芬、异西帕克、异昔康、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、米洛洛芬、萘普生、奥沙普嗪、羟苯丁酮、氧哌酸、派瑞昔布、苯基丁酮、吡拉昔布、普罗昔可、十氯芬酸、噻吩芬酸、甲苯磺那酸、托美汀、曲马多、伐地考昔、唑吡克拉等以及它们的盐等。

抗感染剂的实例包括左氧氟沙星、头孢曲松、米诺环素、磺胺甲恶唑、新诺明等。

抗纤维化剂的实例包括吡啶酮衍生物、吡非尼酮、泛硫因、半胱氨酸、组氨酸、S-烯丙基半胱氨酸、生长因子、HGF(肝细胞生长因子)、珀-贝珀米诺近、骨激活素(osteoactivin)、醛固酮拮抗剂、ACE抑制剂、盐酸吡虫啉、硫酸角质素寡糖等。

免疫抑制剂的实例包括雷帕霉素、他克莫司、环孢霉素、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、咪唑立宾等。

抗氧化剂的实例包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、一氧化氮供体、硫化氢供体、姜黄素、辅酶Q10、虾青素、α-生育酚、β-生育酚衍生物等。

核酸药物的实例包括siRNA、质粒DNA、mRNA等。

放射性药物和显像剂的实例包括钇Y-90、钆Ga-67、钆Ga-68、镏Lu-177、铜Cu-64、锝Tc-99、铼Re-186、铼Re-188、放射性碘-131等。

在本说明书中，“肾脏疾病”的例子包括肾小球肾炎、IgA肾病、糖尿病肾病、膜性肾病、肾积水、造影剂肾病、肾盂肾炎、肾衰竭、急性肾炎、慢性肾炎、尿毒症、间质性肾炎、肾脏疾病、肾病综合征、高血压肾硬化、糖尿病肾小球硬化症、肾结石、淀粉样肾、肾静脉血栓形成、Alport综合征、肾肿瘤等。

此外，在本说明书中，“预防或治疗”可以是任何预防或治疗，只要其可以抑制与肾功能不全、肾脏发炎等相关的症状的发展或维持或抑制其进展，预防和治疗可能没有明确区分。

在本说明书中，“药物直接或经由连接基团连接”是指这样的状态：药物通过共价键直接或通过前述一个或多个双功能连接基团(第二连接基团)连接至本发明化合物的丝氨酸修饰的末端上的丝氨酸衍生的氨基或非丝氨酸修饰的末端上的氨基或羟基。

在本说明书中，“药物被包封”是指这样的状态：在末端具有分子识别部分(例如，包合部分、螯合部分等)的前述第二连接基团与本发明化合物末端的丝氨酸衍生的氨基直接或经由连接基团(前述第二连接基团)连接，并且药物通过疏水相互作用或螯合键非共价地结合到本发明化合物的分子识别部分中(即，包合状态或螯合状态)。

可以根据药物的种类，适当地改变本发明的药剂中药物的负载率(loading rate)或包合率(inclusion rate)。通常占本发明化合物的末端基团总数的约1-20％，优选约5-15％。

本发明的化合物优选为以下化合物。

[化合物(A)]

本发明的化合物含有具有多个末端基团的大分子载体，其选自树状分子和树突状分子，其中丝氨酸的羰基直接通过肽键或酯键或经由连接基团与末端基团总数的至少50％连接。

[化合物(B)]

本发明的化合物含有具有多个末端基团的大分子载体，其选自聚酰胺-胺、聚赖氨酸、由聚乙二醇和2，2-双(羟甲基)丙酸构成的树突状分子，以及由2，2-双(羟甲基)丙酸构成的树突状分子，其中丝氨酸的羰基直接通过肽键或酯键与末端基团总数的至少50％(优选不少于60％、更优选不少于70％、特别优选不少于80％)连接。

[化合物(C)]

本发明的化合物含有具有多个末端氨基的大分子载体，其选自聚酰胺-胺和聚赖氨酸，其中丝氨酸的羰基直接通过肽键与末端氨基总数的至少50％(优选不低于60％，更优选不低于70％，特别优选不低于80％)连接。

本发明的化合物的平均分子量不小于1000，优选不小于3000。尽管其没有特别的上限，但是为了易于处理，期望不大于40000。

本发明的化合物还包括盐形式。本发明化合物的盐的实例包括与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与无机碱形成的盐、与有机碱形成的盐、与氨基酸形成的盐等。

与无机酸形成的盐的实例包括与盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、氢氟酸、氢碘酸、高氯酸等形成的盐。

与有机酸形成的盐的实例包括与乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、丙酸、草酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸、葡糖酸、抗坏血酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等的盐。

与无机碱形成的盐的实例包括与钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐等形成的盐。

与有机碱形成的盐的实例包括与甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、三(羟甲基)甲胺、二环己胺、N，N′-二苄基乙二胺、胍、吡啶、甲基吡啶、胆碱、辛可宁、葡甲胺等形成的盐。

与氨基酸形成的盐的实例包括与赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等形成的盐。

本发明的化合物还包括溶剂化物形式。本发明化合物的溶剂化物还包括以溶剂化物形式存在的那些。本发明化合物的溶剂化物是其中溶剂的分子与本发明的化合物配位的溶剂化物，并且包括水合物。例如，可以提及本发明化合物的水合物、乙醇溶剂化物、二甲亚砜溶剂化物或其盐。

本发明的化合物可以用放射性药物、显像剂或同位素(例如³H、²H(D)、¹⁴C、³⁵S、⁹⁰Y、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、¹⁷⁷Lu、⁶⁴Cu、⁹⁹Tc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹³¹I、¹⁸F等)标记。作为具体实例，例如，通过将螯合基团(例如，二亚乙基三胺-N，N，N′，N”，N”-五乙酸(DTPA)基团等)引入本发明化合物的端基中被¹¹¹In螯合标记的部分而获得的化合物，通过用异硫氰酸荧光素(FITC)标记本发明化合物的一部分末端基团而获得的化合物，通过用近红外探针(例如，近红外荧光染料，VivoTag 800(Dye 800))标记本发明化合物的一部分末端基团而获得的化合物等也包括在本发明的化合物中。

[本发明化合物的合成]

对本发明化合物的生产方法没有特别限制，例如，该化合物可以通过以下反应合成。

除非另有说明，否则起始化合物可以作为市售产品容易地获得，或者可以根据本身已知的方法来生产(例如，Ohsaki，M.等人，Bioconjugate Chem，2002，13，510-517；Tomalia，DA等人，Polymer Journal，1985，17，117-132；Chang，KL等人，J.Control.Release，2011，156，195-202等)或与其类似的方法。

在以下每个步骤中，官能团的保护或脱保护反应根据本身已知的方法进行，例如，《有机合成中的保护基》，第四版，Theodora W.Greene，Peter GM Wuts，Wiley-Interscience(2007)等，或本说明书的实施例中描述的方法。

在以下反应式中的每个步骤中获得的化合物可以作为反应溶液或粗产物用于随后的反应。或者，化合物也可以按照常规方法从反应混合物中分离，并且可以通过常规分离手段如重结晶、蒸馏、色谱法等容易地纯化。

本发明的化合物可以通过以下步骤制备，例如：

其中L¹是连接基团(第一连接基团)，R^a是氨基或羟基，P和P′相同或不同，并且各自独立地是保护基，Z是NH或氧原子，m1是0或1，nl为8以上的整数，n2为4以上的整数。

步骤1

在该步骤中，将大分子载体(1)的末端氨基或羟基与具有受保护的氨基和受保护的羟基的丝氨酸(化合物2)的α-羧基在大分子载体(1)的末端基团上直接或通过第一连接基团进行脱水缩合。

该反应在不影响反应的溶剂中进行，并且在本身已知的脱水缩合反应条件下进行。

相对于大分子载体(1)的末端基团的总数(1mol)，化合物2的用量通常为0.5-3mol，优选1-1.5mol。

用于脱水缩合反应的缩合剂的实例包括1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(WSC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、N-乙基-N′-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺及其盐酸盐(EDC·HCl)、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBop)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、1-[双(二甲氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)、O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐(HBTU)等。

在缩合步骤中，必要时可以添加缩合添加剂(例如1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、1-羟基-1H-1，2，3-三唑-5-羧酸乙酯(HOCt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)等)和碱(例如有机碱，如三乙胺、吡啶、N，N-二异丙基乙胺等)。

相对于大分子载体(1)的末端基团的总数(1摩尔)，缩合剂的用量通常为0.5-3摩尔，优选为1-1.5摩尔。

溶剂的实例包括芳族烃，例如甲苯、二甲苯等；酰胺溶剂，例如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺等；醚，例如乙醚、四氢呋喃、二恶烷等；卤代烃，例如氯仿、二氯甲烷等，以及它们的混合物。这些之中，优选N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷等。

反应温度通常为-10至30℃，优选0℃至20℃，反应时间通常为1至30小时。

步骤2

在该步骤中，除去在前述步骤1中获得的脱水缩合产物的保护基P和P′，以合成化合物3。

该反应在不影响反应的溶剂中和本身已知的脱保护条件下进行。

脱保护的反应条件(反应试剂、反应溶剂、反应温度、反应时间等)根据保护基(P和P′)的种类而变化。例如，可以根据《有机合成中的保护基》，第4版，Theodora W.Greene，Peter GM Wuts，Wiley-Interscience(2007)等或本说明书的实施例中记载的方法或与其类似的方法进行。

[本发明的药剂及其生产方法]

由本发明的化合物构成并选择性地将药物递送至活体中的靶组织(肾脏)的药物递送载体直接通过共价键或经由连接基团连接至药物，以形成本发明的药剂(化合物)，或通过引入到药物递送载体中的连接基团与药物的非共价相互作用封装药物，以形成本发明的药剂(组合物)。

作为本发明的药剂，优选以下药剂。

[药剂(A)]

本发明的药剂包含与本发明化合物的丝氨酸修饰部分的丝氨酸衍生的末端氨基的一部分(基于丝氨酸衍生的氨基的总数，优选1-20％，更优选5-15％)直接连接的药物。

[药剂(B)]

本发明的药剂包含与本发明化合物的非丝氨酸修饰的大分子载体部分的末端氨基或羟基的一部分(基于末端氨基或羟基的总数，优选1-20％，更优选5-15％)直接连接的药物。

[药剂(C)]

本发明的药剂包含经由一个或多个双功能连接基团(前述第二连接基团)连接至本发明化合物的丝氨酸修饰部分的丝氨酸衍生的末端氨基的一部分(基于丝氨酸衍生的氨基的总数，优选为1-20％，更优选5-15％)的药物。

[药剂(D)]

本发明的药剂包含经由一个或多个双功能连接基团(前述第二连接基团)连接至本发明化合物的非丝氨酸修饰的大分子载体部分的末端氨基或羟基的一部分(基于末端氨基或羟基的总数，优选1-20％，更优选5-15％)的药物。

[药剂(E)]

本发明的药剂包含通过非共价相互作用封装在分子识别部分中的药物，所述非共价相互作用是由于分子识别部分(例如，包合部分、螯合部分等)直接连接至本发明化合物的丝氨酸修饰部分的丝氨酸衍生的末端氨基的一部分(基于丝氨酸衍生的氨基的总数，优选1-20％，更优选5-15％)而产生的。

[药剂(F)]

本发明的药剂包含通过非共价相互作用封装在分子识别部分中的药物，所述非共价相互作用是由于分子识别部分(例如，包合部分、螯合部分等)经由连接基团(例如，一个或多个双功能连接基团(前述第二连接基团))连接至本发明化合物的丝氨酸修饰部分的丝氨酸衍生的末端氨基的一部分(基于丝氨酸衍生的氨基的总数，优选为1-20％，更优选为5-15％)而产生的。

如上所述，当通过本发明的化合物与药物的共价键形成来产生本发明的药剂时，其是通过将药物直接或经由前述一个或多个双功能连接基团(第二连接基团)连接到本发明化合物的丝氨酸修饰部分的丝氨酸衍生的末端氨基而产生的，或者是通过将药物直接或经由前述一个或多个双功能连接基团(第二连接基团)连接到非丝氨酸修饰的大分子载体部分的末端氨基或羟基而产生的。这种药剂的生产方法没有特别限制。在一个具体的实施方案中，例如，如下式所示：

其中Cap是卡托普利，SPDP是N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫基)丙酸酯，n3是1以上的整数，其他符号如上定义，n1＞n3，根据本身已知的方法，将由SPDP(前述第二连接基团的形成试剂)形成的连接基团连接至大分子载体(化合物4)的丝氨酸修饰的末端上的丝氨酸衍生的氨基，得到在末端具有2-吡啶二硫基的化合物(化合物5)。化合物5与在末端具有巯基的药物(例如卡托普利(Cap))进行已知的二硫键形成反应，从而可以生产包含通过S-S键连接到药物递送载体上的药物的本发明药剂(化合物6)。另外，化合物6也可以通过以下另一种方法制备。即，通过本身已知的二硫键形成反应，将前述第二连接基团的形成试剂即SPDP与在末端具有巯基的药物(例如卡托普利(Cap))连接，来制备SPDP-Cap，然后，将SPDP-Cap通过本身已知的方法连接到具有丝氨酸修饰的末端基团的大分子载体(化合物4)的丝氨酸衍生的末端氨基上，由此生产本发明的药剂(化合物6)，其包含通过S-S键连接到药物递送载体上的药物。

在另一个具体实施方案中，例如，如下式所示：

其中P”和P”’是相同或不同的，各自独立地代表保护基，n4为不小于4的整数，n5为1以上的整数，其它符号如上定义(n1≥n4+n5)，将大分子载体(1)的末端氨基或羟基、具有受保护的氨基和受保护的羟基的丝氨酸的α-羧基(化合物2)、和具有受保护的氨基和受保护的巯基的半胱氨酸的α-羧基(化合物2′)作为药物，在本身已知的前述脱水缩合反应的条件下，进行脱水缩合，然后脱保护，从而可以制备本发明的药剂(化合物7)。

如上所述，当通过引入到药物递送载体中的连接基团与药物的非共价相互作用来封装药物，来制备本发明的药剂时，该药剂是通过如下方式制备的：将分子识别部分直接或经由前述一种或多种双功能连接基团(第二连接基团)连接至本发明化合物的丝氨酸修饰部分的丝氨酸衍生的末端氨基，引起分子识别部分与药物之间的非共价相互作用如疏水相互作用、螯合结合等，其结果是药物被掺入到药物递送载体中，产生本发明的药剂。这种药剂的生产方法没有特别限制。在一个具体实施方式中，例如，如下式所示：

其中CD-NH₂是在末端具有氨基的环糊精衍生物，CD是从CD-NH₂去除了末端氨基的环糊精衍生物残基，n6是1以上的整数，其他符号如以上定义(n1＞n6)，由SPDP(前述第二连接基团的形成试剂)形成的连接基团通过肽键与丝氨酸修饰的大分子载体(化合物4)的末端的丝氨酸衍生的氨基连接，得到在末端具有2-吡啶二硫基的化合物(化合物8)。另外，用Traut’s试剂处理具有一个氨基侧链的环糊精衍生物(化合物9)，得到在末端具有巯基的化合物(化合物10)。使化合物8和化合物10进行本身已知的二硫键形成反应，得到在末端具有环糊精部分(包合部分)的化合物(化合物11)，并加入可以包合在环糊精部分中的药物，从而可以制备本发明的药剂(化合物12)。在另一个具体实施方式中，例如，如下式所示，但不受特别限制：

其中M是可螯合药物，n7是1以上的整数，其他符号如上定义(n1＞n7)，由DTPA酸酐(化合物13)(前述第二连接基团的形成试剂)形成的连接基团通过肽键连接至丝氨酸修饰的大分子载体(化合物4)末端的丝氨酸衍生的氨基，以制备化合物14，并且放射性药物(M)(例如钇Y-90等)或其他通过螯合结合掺入，从而可以制备本发明的药剂(化合物15)。在下述实验实施例1、4中，追踪了¹¹¹In与化合物14螯合的本发明化合物(¹¹¹In标记的化合物1a)的药代动力学。

本发明的药剂显示出高的肾脏分布并且可以在肾脏中选择性地积聚药物。因此，本发明的药剂作为预防或治疗剂可以对各种肾病如肾功能不全、肾脏发炎等显示出优异的效果。此类肾脏疾病的具体例子包括肾小球肾炎、IgA肾病、糖尿病性肾病、膜性肾病、积水性肾病、造影剂肾病、肾盂肾炎、肾衰竭、急性肾炎、慢性肾炎、尿毒症、间质性肾炎、肾脏疾病、肾病综合征、高血压性肾硬化、糖尿病肾小球硬化症、肾结石、淀粉样肾、肾静脉血栓形成、Alport综合征、肾肿瘤等。

本发明药剂的给药途径主要分为口服给药和肠胃外给药。本发明药剂的剂量根据药物的种类、给药途径、给药频率、年龄、体重、给药对象的病理和严重程度等而变化。通常为0.005-150mg/kg/天，优选0.05-20mg/kg/天，并且可以一次性或分批给药。

本发明的药剂通常以通过与药物载体混合制备的药物组合物的形式给药。优选的具体实例包括外用制剂如微针、吸入剂、滴鼻剂等，以及包括腔内注射剂的注射剂如静脉内注射剂、皮内注射剂、皮下注射剂、腹膜内注射剂等。这些药物组合物是根据常规方法制备的。

微针基质的具体实例包括：聚合物基质，如聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸、聚乙醇酸、硫酸软骨素、羧甲基纤维素、麦芽糖、葡聚糖、聚乳酸和聚(乳酸-共-乙醇酸)；金属，如不锈钢等；硅；钛等。可以通过将其应用到微针的表面或放在内部来生产。

吸入剂可以通过将本发明的化合物粉化或液化，将其混入到可吸入的喷雾剂或载体中，并将混合物填充在例如定量雾化吸入器、干粉吸入器等吸入剂容器中来生产。它可以是推进剂(propellant)、气雾剂或喷雾剂。作为吸入推进剂，可以广泛使用以往公知的物质，实例包括：氟利昂气，如氟利昂-11、氟利昂-12、氟利昂-21、氟利昂-22、氟利昂-113、氟利昂-114、氟利昂-123、氟利昂-142c、氟利昂-134a、氟利昂-227，氟利昂-C318、1，1，1，2-四氟乙烷等；氟利昂气替代物，如HFA-227，HFA-134a等；烃类气体，如丙烷、异丁烷、丁烷等；乙醚；氮气；二氧化碳气体等。作为载体，可以广泛使用常规已知的那些，实例包括糖类、糖醇类、氨基酸类等。

对于用于吸入剂的液体，可通过根据需要适当选择防腐剂(苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯等)，着色剂，缓冲剂(磷酸钠、乙酸钠等)，等渗剂(氯化钠、浓缩甘油等)，增稠剂(羧乙烯基聚合物等)，防腐剂(苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯等)，吸收促进剂等来制备。

对于用于吸入剂的粉剂，可通过根据需要适当选择润滑剂(硬脂酸及其盐等)，粘合剂(淀粉、葡聚糖等)，赋形剂(乳糖、纤维素等)，着色剂，吸收促进剂等来制备。

鼻滴剂可以采取各种形式，例如滴剂型、施用型、喷雾型等。在喷雾型的情况下，具有通过手动移动连接到容器的泵来喷射液体的机构的手动泵型滴鼻剂，具有通过向容器中填充推进剂并移动附接至容器的阀来自动喷射液体剂的机构的气溶胶型滴鼻剂等。

注射剂是通过将本发明的药剂溶解在注射用蒸馏水中而制成的，该溶液必要时还包含增溶剂、缓冲剂、pH调节剂、等渗剂、舒缓剂、防腐剂等；或通过将化合物悬浮在注射用水或植物油中而制成的。在这种情况下，可以根据需要添加碱、悬浮剂、增稠剂等。另外，当使用时其可以为用于溶解粉末或冻干物的形式，可以根据需要添加赋形剂(甘露醇、山梨糖醇、乳酸、海藻糖、蔗糖等)等。

药物组合物中本发明药剂的含量根据其剂型而变化。通常为整个组合物的0.0025-30重量％。这样的药物组合物还可包含对治疗有效的其他药物。并用时，本发明的化合物与并用药物的给药时间没有特别限定，本发明的药剂和并用药物的混合比例可以根据给药对象、给药方法、疾病、组合等适当确定。例如，虽然本发明的组合药物中并用药物的含量根据剂型而变化，但通常为整个组合物的0.0025-30wt％。

尽管在以下本发明的优选实施例和实验实施例中更详细地描述了本发明，但是以下实施例仅用于示例性地确认本发明的效果，而不是将本发明限制于此。另外，可以在不脱离本发明的范围的情况下修改本发明。

[实施例]

下面通过实施例、制剂实施例和实验实施例更详细地解释本发明，所述实施例、制剂实施例和实验实施例不限制本发明。另外，可以在不脱离本发明的范围的情况下修改本发明。

除非另有说明，否则实施例中使用的装置、试剂等可以根据本领域通常采用的方法容易地获得或制备，或者可以商购获得。

以下实施例中的“室温”通常为约10℃至约25℃。

实施例1：肾脏靶向药物递送载体(丝氨酸修饰的树状分子)(本发明的化合物(化 合物1a))的合成

相对于第三代聚酰胺-胺树状分子(PAMAM)(由Sigma-Aldrich制造)的表面氨基的总数，1.1当量的Boc-Ser(tBt)-OH(由渡边化学工业株式会社生产)、1.1当量的1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HBTU)(由默克密理博公司生产)、1.1当量的无水1-羟基-1H-苯并三唑(HOBt)(由渡边化学工业株式会社生产)和2.2当量的N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)在DMF/DMSO(1∶1)中混合。然后，通过在室温下搅拌使反应混合物反应直到茚三酮测试在TLC分析上产生阴性结果。偶联完成后，将该溶液通过用乙醚沉淀3次而纯化。将其沉淀物溶解在三氟乙酸(TFA)混合物中(95％TFA、2.5％硫代苯甲醚(TIS)和2.5％纯水)，以脱保护Boc和OBt基团。然后，将反应混合物在室温温育90分钟。脱保护完成后，将反应混合物通过用乙醚沉淀3次而纯化。将粗沉淀物溶解在超纯水中，并通过PD-10柱，通过尺寸排阻色谱法分离得到的产物，然后冻干，获得丝氨酸修饰的PAMAM(以下称为“化合物1a”)。为了分析粒度和Zeta电位，将化合物1a溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)中，浓度为1mg/mL。然后，通过Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments，伍斯特郡，英国)测量化合物1a的粒径和Zeta电位的这些性质。

所得化合物1a的粒径为约4nm(4.03±0.09nm)，Zeta电位为约4.8mV(4.76±0.70mV)。

比较例1：聚酰胺-胺树状分子(PAMAM G4)

将第四代聚酰胺-胺树状分子(PAMAM G4)(由Sigma-Aldrich制造)用作比较例1的化合物。

比较例1的化合物的粒径为约4.2nm(4.20±0.09nm)，Zeta电位为约4.6mV(4.56±0.81mV)。

比较例2：苏氨酸修饰的树状分子的合成

除了将实施例1中使用的Boc-Ser(tBt)-OH换为Boc-Thr(tBu)-OH(由渡边化学工业株式会社制造)以外，通过与实施例1相同的方法，制备了比较例2的化合物。

比较例2的化合物的粒径为约4.2nm(4.15±0.35nm)，Zeta电位为约2.6mV(2.58±1.36mV)。

比较例3：酪氨酸修饰的树状分子的合成

除了将实施例1中使用的Boc-Ser(tBt)-OH换为Boc-Tyr(tBu)-OH(由渡边化学工业株式会社制造)以外，通过与实施例1相同的方法，制备了比较例3的化合物。

比较例3的化合物的粒径为约3.2nm(3.17±0.35nm)，Zeta电位为约5.3mV(5.26±3.00mV)。

实施例2：与卡托普利键合的化合物1a(卡托普利-化合物1a)的合成

相对于化合物1a的6当量的N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫基)丙酸酯(SPDP)(由东京化学工业有限公司制造)和6.6当量的卡托普利(由东京化学工业有限公司制造)加入DMSO中，并将混合物在室温下搅拌10分钟，以使SPDP和卡托普利反应。之后，将反应混合物与溶解在DMSO中的化合物1a混合，并将混合物在室温下搅拌12小时，使卡托普利通过SPDP连接至化合物1a末端的氨基，合成与卡托普利键合的化合物1a(卡托普利-化合物1a)。

实施例3：与半胱氨酸键合的化合物1a(半胱氨酸-化合物1a)的合成

相对于第三代聚酰胺-胺树状分子(PAMAM)(由Sigma-Aldrich制造)的表面氨基的总数，0.88当量的Boc-Ser(tBt)-OH、0.22当量的Boc-Cys(Trt)-OH(渡边化学工业株式会社制造)、1.1当量的1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HBTU)、1.1当量的无水1-羟基-1H-苯并三唑(HOBt)和2.2当量的N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)在DMF/DMSO(1∶1)中混合。此后的合成步骤通过类似于实施例1的方法进行。

实验实施例1：化合物1a的药代动力学评估

[测试方法]

向ddY小鼠静脉内施用¹¹¹In标记的化合物1a(以下也称为“¹¹¹In标记的化合物1a”)，并评价化合物1a的药代动力学。具体而言，根据Hnatowich等(Int.J.Appl.Radiat.Isot，12，327-332(1982))中描述的方法，通过使用双官能螯合剂即二亚乙基三胺-N，N，N′，N”，N”，N”-五乙酸(DTPA)酸酐(DOJINDO LABORATORIES制造)，用¹¹¹In对化合物1a进行放射性标记。通过尾静脉将所得的¹¹¹In标记的化合物1a静脉内给药ddY小鼠。在静脉注射后的适当时间点，在异氟烷麻醉下从腹部腔静脉收集血液。切下肝脏、肾脏、脾脏、心脏和肺组织，用盐水冲洗、吸干，然后测量器官的湿重。将采集的血液以2000×g离心5分钟，获得血浆。将收集到的器官样本和100μL血浆转移到计数管中，并使用伽玛计数器(1480WizardTM 3′，Perkin-Elmer，波士顿，马萨诸塞州，美国)测量每个样品的放射性。

图1显示了静脉内注射¹¹¹In标记的化合物1a后血浆、肝脏、肾脏、脾脏、心脏和肺的浓度-时间曲线(即化合物1a的药代动力学)。

根据图1(b)，静脉内给药后，化合物1a剂量的约80％累积在肾脏中。几乎没有发现在其他器官中积累，该化合物显示出肾脏选择性优异的药代动力学。相反，非丝氨酸修饰的PAMAM(比较例1的化合物)(图1(a))和比较例2的化合物(图1(c))和比较例3的化合物(图1(d))的每一个都修饰有与丝氨酸结构类似的苏氨酸(Thr)或酪氨酸(Tyr)，但没有显示出与化合物1a相同的肾脏分布或肾脏选择性。具体而言，比较例1的化合物主要分布在肝脏和肾脏中，并且肾脏分布率低；比较例2的化合物主要分布在肾脏中，并且肾脏分布率低；比较例的化合物3主要分布在肝脏和肾脏中，并且肾脏分布率低。

从图1的结果证实，化合物1a在肾脏分布和肾脏选择性方面特别优越。

实验实施例2：通过弱光成像系统的化合物1a的器官分布

[测试方法]

比较例1的化合物和化合物1a用近红外荧光染料即Vivo Tag 800(Dye800)(由PerkinElmer Co.，Ltd制造)标记。即，将化合物1a溶解在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH8.5)中，并将DMSO中的Dye800以2∶3的摩尔比添加至化合物1a。在室温下混合1小时后，将反应混合物通过超滤纯化。然后，以1mg/kg的剂量向HR-l小鼠静脉内施用Dye800标记的化合物1a的溶液(Dye800标记的化合物1a)。静脉内给药后60分钟，在异氟烷麻醉下，使用IVISLumina XRMS系列III多物种光学和X射线成像系统进行小鼠全身成像。之后，在异氟烷麻醉下，从腹部腔静脉收集血液。通过心脏左心室向小鼠灌注10ml盐水，洗去血液中的化合物1a，并与小腿骨一起切除肝脏、肾脏、脾脏、心脏和肺组织，并用盐水清洗。接着，使用IVISLumina XRMS系列III多物种光学和X射线成像系统进行成像。

图2显示静脉注射Dye800标记的化合物1a后器官分布的弱光成像图像。图2A示出了小鼠整个身体的图像，图2B示出了切除的器官的图像。根据图2，静脉内给药后，Dye800标记的化合物1a主要在肾脏中蓄积，并且证实了有效的肾脏靶向。

实验实施例3：化合物1a在肾脏中的分布

[测试方法]

用异硫氰酸荧光素(FITC)(由Sigma-Aldrich制造)标记化合物1a(FITC标记的化合物1a)。将FITC标记的化合物1a从尾静脉施用于ddY小鼠。静脉内给药后60分钟，在异氟烷麻醉下切除肾脏，用OCT固定并冷冻。用100μg/mL的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(和光纯药工业株式会社制造)处理冷冻的肾脏切片，并在荧光显微镜(Biozero，KEYENCE，日本大阪)下观察染色的肾脏切片。

[结果]

图3显示了静脉内注射FITC标记的化合物1a后60分钟的小鼠肾脏切片的显微图像。根据图3(a)，证实了FITC标记的化合物1a的荧光在肾髓质的肾皮质中显著高。肾皮质的放大显微图像如图3(b)所示。在近端小管中观察到源自FITC标记的化合物1a的强荧光。另一方面，在髓质中几乎没有确认到来源于FITC标记的化合物1a的荧光。由上可知，化合物1a主要分布在肾脏的近端小管中。由于近端小管是诸如肾脏癌、慢性肾功能衰竭等肾脏疾病的发作部位，发现化合物1a在肾脏中显示出分布有利于肾脏疾病的治疗和图像诊断。

实验实施例4：利用猪肾上皮细胞分析化合物1a的膜通透性和肾脏摄取机制

[测试方法]

为了评估化合物1a的肾上皮细胞膜通透性(在吸收方向或分泌方向上的通透性)，评估了化合物1a通过LLC-PK1细胞(猪肾上皮细胞)的单层膜的通透性。即，将LLC-PK1细胞以2.5×10⁵个细胞/插入(insert)接种到Transwells(Corning Inc，Coming，纽约)上，并培养1周。将绒毛面侧(apical side)和基底侧(basolateral side)用Hank的平衡盐溶液(HBSS；pH7.4)预孵育1小时。然后，将HBSS中0.1mg/mL的FITC标记的化合物1a添加至绒毛面侧(0.5mL)或基底侧(1.5mL)。随着时间回收100μL的受体溶液(当将FITC标记的化合物1a添加到基底侧时为绒毛面侧，当将FITC标记的化合物1a添加到绒毛面侧时为基侧)，将等量的HBSS添加到受体侧(receptor side)。使用荧光分光光度计(PowerScan HT，BioTekInstruments)测量FITC-化合物1a的量。所使用的激发波长为485nm，所使用的荧光波长为528nm。

另外，评价了化合物1a在肾上皮细胞中的细胞摄取机制。即，将LLC-PK1细胞以2.5×105个细胞/插入接种在胶原包被的24孔板上，并培养1周。将细胞在HBSS(pH 7.4)中预孵育1小时，然后加入5μg/mL的¹¹¹In标记的化合物1a，并以细胞内放射性为指标评价化合物1a的细胞内摄取量。同时添加各种抑制剂(过量的未标记化合物1a，氯丙嗪100μM，染料木黄酮370μM，5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利100μM和溶菌酶1mM)，并通过化合物1a的摄取量的降低来评估摄取机理。

结果在图4中示出。

图4A和图4B分别示出了化合物1a和比较例1在LLC-PK1细胞单层膜的吸收方向和分泌方向上的膜通透性。比较例1的膜通透性在吸收方向和分泌方向上相等，未发现差异。与此相对，化合物1a在吸收方向上的膜通透性高于分泌方向，并且发现在吸收方向上具有优异的通透性。由此认为，化合物1a从肾小管腔侧向血管侧掺入。

图4C显示了各种抑制剂对LLC-PK1细胞中^IIIIn标记的化合物1a的细胞内摄取的影响。发现在添加过量的未标记化合物1a的组、添加细胞膜穴样凹陷(caveolae)依赖性内吞作用抑制剂染料木黄酮的组、添加巨胞饮(macropinocytosis)抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利的组、以及添加巨蛋白(megalin)底物溶菌酶的组中，化合物1a的细胞内摄取显著降低。因此，暗示化合物1a可通过细胞膜穴样凹陷依赖性内吞作用、巨胞饮作用或巨蛋白介导的转胞吞作用而掺入。

实验实施例5：卡托普利-化合物1a的药代动力学

[测试方法]

卡托普利-化合物1a的药代动力学通过分别以2mg卡托普利/kg的剂量向ddY小鼠静脉内施用单独的卡托普利或卡托普利-化合物1a来评估。在静脉内给药后的合适时间点，在异氟烷麻醉下从腹部腔静脉收集血液并切除肾脏。此后，使用HPLC测量血浆和肾脏匀浆中的卡托普利浓度。

结果示于图5。根据图5(b)，与单独施用卡托普利的组相比，施用卡托普利-化合物1a后肾脏中卡托普利的浓度显著更高。由此证实，通过使用化合物1a，卡托普利有效地在肾脏中积累。

实验实施例6：卡托普利-化合物1a的药理作用

[测试方法]

以0.5mg卡托普利/kg的剂量向ddY雄性小鼠静脉内注射卡托普利或卡托普利-化合物1a。给药后30分钟和120分钟，在异氟烷麻醉下切下肾脏，在2mL的50mM KHPO₄缓冲液(pH7.5)中进行匀浆处理，并将匀浆离心。混合上清液(100μL)、超纯水(100μL)和50mM N-马尿酰-L-组氨酸-L-亮氨酸(50μL)并在37℃下反应15分钟，用1N HCl(250μL)终止酶反应。用乙酸乙酯萃取马尿酸(400μL×2次)，并蒸发乙酸乙酯。通过HPLC测量获得的马尿酸的水平，并且以马尿酸水平为指标评估血管紧张素转化酶(ACE)活性。

结果显示在图6中。根据图6，发现与单独给药卡托普利相比，给药卡托普利-化合物la以持续的方式抑制了肾脏中ACE的活性。

实验实施例7：半胱氨酸-化合物1a的药代动力学评估

[测试方法]

向ddY小鼠静脉内施用¹¹¹In标记的半胱氨酸化合物1a，并评估半胱氨酸-化合物1a的药代动力学。通过与实验实施例1相同的方法，用¹¹¹In标记半胱氨酸-化合物la。

结果显示在图7中。根据图7，与化合物1a同样，半胱氨酸化合物1a也未在其他器官中积累，并显示出肾脏选择性的药代动力学。

实验实施例8：半胱氨酸-化合物1a针对肾脏缺血再灌注疾病的肾脏保护作用

[测试方法]

在异氟烷麻醉下，从ddY小鼠切下右肾，用手术钳(klemme)阻断左肾的肾动脉血流，在30分钟后恢复血流，建立肾脏缺血-再灌注损伤模型。在恢复血流之前即刻静脉内施用半胱氨酸-化合物1a，并从恢复血流6小时后的肾脏切片图像评估肾损伤程度。

结果示于图8。根据图8，通过肾脏缺血-再灌注观察到肾脏的形态变化。然而，证实了半胱氨酸-化合物1a的施用显著抑制了形态变化。

实验实施例9：通过单光子发射计算机断层摄影/计算机断层摄影(SPECT/CT)成像 观察化合物1a的器官分布

[测试方法]

使用NanoSPECT/CT(Bioscan Inc.，华盛顿特区，美国)进行SPECT/CT。将¹¹¹In标记的化合物1a(8.7MBq/小鼠)静脉内注射到小鼠中。静脉内施用¹¹¹In标记的化合物1a 3小时后，在异氟烷麻醉下，获得了小鼠的45分钟SPECT扫描。在SPECT扫描之前，在异氟烷吸入麻醉下，对小鼠进行CT扫描，作为解剖参考。使用HiSPECT软件(Scivis，哥廷根，德国)重建SPECT图像。此外，使用Amira 3D数据分析和可视化软件包(5.1版；FEI Company，美国俄勒冈州希尔斯伯勒)进行了图像分析。

结果显示在图9中。图9显示了静脉内注射¹¹¹In标记的化合物1a后器官分布的SPECT/CT成像图像。根据图9，¹¹¹In标记的化合物1a部分分布在膀胱中(在尿液中排泄)，但特别在肾脏中蓄积。在肾脏中，¹¹¹In标记的化合物1a主要蓄积在存在近端小管等的皮质部分。由于近端小管是肾脏疾病(例如肾脏细胞癌、慢性肾衰竭等)的发作部位，这些研究结果表明化合物1a可适用于肾脏疾病的图像诊断。

实验实施例10：化合物1a对小鼠的毒性评估

[测试方法]

每天一次向ddY小鼠静脉内施用化合物1a(1mg/kg)或PBS，持续5天。第一次静脉注射后六天，在异氟烷麻醉下，从腔静脉收集血液，处死小鼠。分别使用肌酐检测试剂盒(LabAssay，Wako)和BUN检测试剂盒(DIUR-100，BioAssay System)测量血浆肌酐和尿素氮(BUN)水平。此后，切除肾脏，用4％多聚甲醛固定，并包埋在石蜡块中。然后，制备了5μm厚的切片。肾脏切片用苏木精和曙红染色，并使用光学显微镜(Biozero，KEYENCE)评估肾脏损伤。此外，当将HgCl₂用作阳性对照时，也通过前述方法评估了血浆肌酐、BUN水平和肾脏切片。

结果显示在图10中。通过皮下注射HgCl₂作为阳性对照，肌酐和BUN的血浆浓度显著增加(图10A和10B)。此外，在源自施用了HgCl₂的ddY小鼠的肾脏组织的组织学切片中，观察到炎性细胞和受损细胞的浸润和坏死(图10C)。与此相对，化合物1a的施用几乎不影响肌酐和BUN的血浆浓度。施用化合物1a后，肾脏组织的组织学切片与未经处理和施用PBS的小鼠的组织学切片相似(图10C)。上述结果表明，化合物1a是具有较高安全性的药物载体。

制剂实施例(冻干制剂的生产)

将1)、2)和3)混合，用膜滤器过滤灭菌，装入容器中并冻干，得到冻干制剂。

[工业适用性]

与现有技术相比，本发明的化合物以及其中将药物共价或非共价地掺入到该化合物中的药剂显示出高的肾脏选择性和特别高的肾脏分布率，并且几乎没有分布到其他器官，并且非常适用于作为各种肾脏疾病的预防剂(测试药物)或治疗剂。另外，本发明的化合物和药剂使用生物来源的丝氨酸作为肾脏靶向要素。因此，它们具有优异的生物相容性和安全性，并且可以容易地合成。因此，预期它们可以广泛用作药效良好、副作用少的实用的药物递送载体。

本申请是基于在日本提交的专利申请号为2017-132806的专利申请，其全部内容通过引用合并于此。

Claims (10)

1.一种含有大分子载体的化合物，其中，所述大分子载体具有多个末端基团，所述大分子载体选自树状分子、树突状分子、葡聚糖和壳聚糖，其中丝氨酸的羰基直接通过肽键或酯键或者经由连接基团与末端基团总数的至少50％连接。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述大分子载体是树状分子或树突状分子。

3.根据权利要求2所述的化合物，其中，所述树状分子或树突状分子由化合物组成，所述化合物选自聚酰胺-胺、聚赖氨酸、由聚乙二醇和2，2-双(羟甲基)丙酸构成的树突状分子，以及由2，2-双(羟甲基)丙酸构成的树突状分子。

4.一种药物递送载体，其由权利要求1至3中任一项所述的化合物组成，并选择性地将药物递送至体内靶组织。

5.根据权利要求4所述的药物递送载体，其中，所述靶组织是肾脏。

6.一种药剂，其包含权利要求4或5所述的药物递送载体和直接或经由连接基团连接到载体或封装在载体中的药物。

7.根据权利要求6所述的药剂，其中，所述药物选自血管紧张素转化酶抑制剂、抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂、抗纤维化剂、免疫抑制剂、抗氧化剂、核酸药物、放射性药物和显像剂中的至少一种。

8.根据权利要求6所述的药剂，其中，所述药物是卡托普利，所述卡托普利经由连接基团连接到所述药物递送载体的丝氨酸修饰位点的丝氨酸衍生的末端氨基。

9.根据权利要求6所述的药剂，其中，所述药物是半胱氨酸，所述半胱氨酸的羰基直接通过肽键或酯键或者经由连接基团连接到所述药物递送载体的非丝氨酸修饰的末端基团。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的药剂，其中，所述药剂是用于肾脏疾病的预防剂或治疗剂。

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