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CN111257264B - 一种生物组织包含的醛基含量的检测方法 - Google Patents

一种生物组织包含的醛基含量的检测方法 Download PDF

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CN111257264B CN202010197664.7A CN202010197664A CN111257264B CN 111257264 B CN111257264 B CN 111257264B CN 202010197664 A CN202010197664 A CN 202010197664A CN 111257264 B CN111257264 B CN 111257264B
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Abstract

本发明提供了一种生物组织包含的醛基含量的检测方法，包括以下步骤：配制多个具有不同浓度梯度的2,4‑二硝基苯肼标准溶液，测定所述多个标准溶液在特定波长处的吸光度值，绘制浓度和吸光度值呈函数关系的标准曲线；配制2,4‑二硝基苯肼反应溶液，并测定所述反应溶液在特定波长处的吸光度值A1；将所述2,4‑二硝基苯肼反应溶液与生物组织反应，测定反应后溶液在特定波长处的吸光度值A2；基于A1、A2以及所述标准曲线，计算所述生物组织包含的醛基的含量。本发明的检测方法，通过将生物组织浸泡在2,4‑二硝基苯肼溶液中，测定反应前后2,4‑二硝基苯肼紫外吸光度值的变化，间接测定生物组织醛基含量，从而具有操作简单、检测快速、检测准确度高等优点。

Description

一种生物组织包含的醛基含量的检测方法
技术领域
本发明属于检测领域，具体地，本发明涉及一种生物组织包含的醛基含量的检测方法。
背景技术
人工心脏瓣膜分为机械瓣膜和生物瓣膜，生物瓣膜主要由合金支架和瓣叶构成，瓣叶承载着人工心脏瓣膜的开合功能，实现血流的单向运动。瓣叶通常采用牛心包、猪心包等生物组织构成，目前限制生物瓣膜耐久性的一个主要原因是瓣叶的钙化，钙化后的瓣叶开合功能会减弱甚至丧失。生物组织主要由胶原纤维、弹性纤维以及结缔组织构成，这些组织中含有氨基、羧基、羟基、巯基等官能团。为增强生物组织的力学性能同时避免变质，现取的新鲜生物组织通常会用戊二醛进行交联固定，其原理是戊二醛的醛基与生物组织中的氨基反应。由于在反应过程中会存在戊二醛的一端醛基未反应，残留在生物组织上，未反应的醛基在一定条件下被氧化为羧基，进而与钙离子反应形成钙化位点，引起瓣叶的钙化，因此确认生物组织中醛基的含量，对于评估瓣叶的防钙化能力至关重要。
但是，由于醛基是通过化学键与生物组织连接，反应物与醛基反应后同样是通过化学键连接于生物组织，由于产物无法溶解在溶液中，所以不能对产物进行直接的检测，而通过化学消解的方法，由于通常使用强酸，可能造成组织中已反应的醛基释放，进而影响实际游离醛基含量。因此一直没有有效的方法对生物组织中的醛基含量进行检测。2006年Edwards Lifesciences在发表的文章(Carpentier-Edwards ThermaFix Process AMethod for Extracting Calcium Binding Sites from Pericardial Tissue)中提到将醛基在轻度酸性溶液中氧化为羧基，进而通过测定羧基含量间接反映醛基含量，由于生物组织本身含有一定量的羧基，因此此法无法真实反映醛基含量。2016年EdwardsLifesciences在发表的文章(The association of bound aldehyde content withbioprosthetic tissue calcification)中提供一种新的测定生物组织醛基方法：先在一定条件下用胱胺二盐酸盐与醛基反应形成第一中间产物，然后第一中间产物与5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸酸)反应形成第二中间产物，最后加入三(2-羧乙基)膦分解第二中间产物释放被测物质5-硫代-2-硝基苯甲酸，此法反应步骤较多，因此检测准确度有限。
发明内容
针对现有技术存在的生物组织包含的醛基含量检测的不足，本发明提供一种生物组织包含的醛基含量的检测方法。
具体来说，本发明涉及如下方面：
1一种生物组织包含的醛基含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
配制多个具有不同浓度梯度的2,4-二硝基苯肼标准溶液，测定所述多个标准溶液在特定波长处的吸光度值，绘制浓度和吸光度值呈函数关系的标准曲线；
配制2,4-二硝基苯肼反应溶液，并测定所述反应溶液在特定波长处的吸光度值A1；
将所述2,4-二硝基苯肼反应溶液与生物组织反应，测定反应后溶液在特定波长处的吸光度值A2；
基于A1、A2以及所述标准曲线，计算所述生物组织包含的醛基的含量。
2根据项1所述的方法，其特征在于，所述特定波长为218、264或323nm中的一种。
3根据项1所述的方法，其特征在于，所述标准溶液的浓度为选自0.01-1.0mmol/L范围中的任意浓度。
4根据项1所述的方法，其特征在于，所述反应溶液的浓度为选自0.01-1.0mmol/L范围中的任意浓度。
5根据项4所述的方法，其特征在于，所述生物组织与所述反应溶液反应时，所述生物组织与所述反应溶液的质量体积比为0.1-50mg/mL。
6根据项5所述的方法，其特征在于，所述反应条件为，20-60℃振荡反应0.5-5h。
7根据根据要求1所述的方法，其特征在于，将所述2,4-二硝基苯肼反应溶液与生物组织反应之前清洗所述生物组织。
8根据根据要求1所述的方法，其特征在于，所述生物组织与所述2,4-二硝基苯肼反应时的厚度为0.2-0.4mm。
9根据项1所述的方法，其特征在于，根据A1、A2和所述标准曲线计算所述反应中2,4-二硝基苯肼的减少，进而计算所述生物组织中醛基的含量。
10根据项1所述的方法，其特征在于，所述生物组织选自心包、心脏瓣膜、韧带、胸膜、皮肤中的至少一种。
本发明涉及的检测方法，采取2,4-二硝基苯肼间接法测定生物组织中醛基含量，通过将生物组织浸泡在2,4-二硝基苯肼溶液中，测定反应前后2,4-二硝基苯肼紫外吸光度值的变化，间接测定生物组织醛基含量，从而具有操作简单、检测快速、检测准确度高等优点。
附图说明
图1为本发明实施例1中的DNPH标准曲线；
图2为本发明实施例2中的DNPH标准曲线；
图3为本发明实施例2中的DNPH标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
本发明利用醛基与2,4-二硝基苯肼(DNPH)能够发生反应，以及2,4-二硝基苯肼在特定波长具有紫外吸收，进而通过测定底物2,4-二硝基苯肼在反应前后的减少，间接的检测生物组织含有的醛基含量。其中，醛基与2,4-二硝基苯肼的反应式如下：
Figure BDA0002418200250000041
具体的，本发明涉及一种生物组织包含的醛基含量的检测方法，该方法包括以下步骤：
配制多个具有不同浓度梯度的2,4-二硝基苯肼标准溶液，测定所述多个标准溶液在特定波长处的吸光度值，绘制浓度和吸光度值呈函数关系的标准曲线；
配制2,4-二硝基苯肼反应溶液，并测定所述反应溶液在特定波长处的吸光度值A1；
将所述2,4-二硝基苯肼反应溶液与生物组织反应，测定反应后反应溶液在特定波长处的吸光度值A2；
基于A1、A2以及所述标准曲线，计算所述生物组织包含的醛基的含量。
在一个具体的实施方式中，所述特定波长为218nm、264nm或323nm。
在一个具体的实施方式中，2,4-二硝基苯肼标准溶液和反应溶液的pH为2.0-6.0。
在一个具体的实施方式中，2,4-二硝基苯肼标准溶液的浓度可以在0.01-1.0mmol/L范围内任意选取，例如，可以是0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1.0mmol/L。
在一个具体的实施方式中，反应2,4-二硝基苯肼反应溶液的浓度可以在0.01-1.0mmol/L范围内任意选取，例如，可以是0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1.0mmol/L。
在一个具体的实施方式中，所述生物组织与所述2,4-二硝基苯肼反应溶液反应时，所述生物组织与所述反应溶液的质量体积比为0.1-50mg/mL，其中，生物组织的重量为干重，例如可以是0.1mg/mL、1.0mg/mL、5.0mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL。
在一个具体的实施方式中，2,4-二硝基苯肼反应溶液与生物组织反应的条件为20-60℃振荡反应0.5-5h。其中，20-60℃可以是20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃等。0.5-5h可以是0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h，3h，3.5h，4h，4.5，5h。振荡反应是为了使生物组织与2,4-二硝基苯肼反应溶液反应更完全，可以采用已知的各种振荡或摇晃操作。
将所述2,4-二硝基苯肼反应溶液与生物组织反应之前清洗所述生物组织。具体的，可以使用去纯化水清洗3遍以上，清洗完毕后使用无尘布将表面水分吸干。
通常，心包是完整无褶皱的，为了使生物组织与2,4-二硝基苯肼能够更充分的反应，在反应时，生物组织不宜过大。在一个具体的实施方式中，所述生物组织与所述2,4-二硝基苯肼反应时的厚度为0.2-0.4mm。例如，可以是0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.35mm、0.4mm。
具体的，生物组织中醛基含量是通过间接计算反应前后反应溶液中2,4-二硝基苯肼的减少来计算的。即根据反应前2,4-二硝基苯肼反应溶液在特定波长处的吸光度值A1、反应后溶液在特定波长处的吸光度值A2、以及建立的2,4-二硝基苯肼的吸光度和浓度的标准曲线，计算2,4-二硝基苯肼的减少量，即为生物组织中的醛基含量。
在一个具体的实施方式中，生物组织选自心包、心脏瓣膜、韧带、胸膜、皮肤中的至少一种。
本实施例中所用的试剂和仪器如下：紫外可见分光光度计(UNICO公司，型号3802S)，2,4-二硝基苯肼(阿拉丁生化科技股份有限公司)，纯化水(公司自制)，牛心包生物组织(市售)，不同的牛心包分别用牛心包1、牛心包2、牛心包3表示。
实施例1
(1)建立标准曲线
精准配制0.1mmol/L的DNPH溶液，其中，使用醋酸调节DNPH溶液的pH为6.0。
分别选取浓度为0.1mmol/L的DNPH溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml，用纯化水稀释至10ml，使用紫外分光光度计，测定其在218nm处的吸光度值，以DNPH溶液的浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。得到的标准曲线如图1所示，曲线的回归方程为：y＝10.248x+0.0273，R2＝0.9991，其中x代表DNPH溶液的浓度，单位为mmol/L，y代表吸光度值。
(2)生物组织包含的醛基含量的检测
取5ml 0.1mmol/L的DNPH溶液使用紫外分光光度计测试其在218nm处的吸光度值A1为1.03。
取100ml 0.1mmol/L的DNPH溶液作为反应溶液，放入容器中。取干重为100mg的牛心包生物组织1#，(其中，牛心包生物组织1#单面的的面积大约为18cm2，厚度约为0.3mm)用纯化水清洗3遍，清洗完毕后使用无尘布将表面水分吸干。随后将清洗后的牛心包生物组织加入到DNPH溶液中，20℃振荡反应5h。反应结束后，去除生物组织，取10ml反应后的DNPH溶液，使用紫外分光光度计测试其在218nm处的吸光度值A2为0.85。
根据A1、A2以及建立的标准曲线，计算单位生物组织包含的醛基含量。
计算得到反应前后DNPH溶液浓度分别为0.0978mmol/L，0.0803mmol/L，DNPH的消耗量为1750nmol，故生物组织中醛基的含量为17.5nmol/mg。
实施例2
(1)建立标准曲线
精准配制0.3mmol/L的DNPH溶液，其中，使用磷酸调节DNPH溶液的pH为2.0。
分别选取浓度为0.1mmol/L的DNPH溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml，用纯化水稀释至10ml，使用紫外分光光度计，测定其在264nm处的吸光度值，以DNPH溶液的浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。得到的标准曲线如图1所示，曲线的回归方程为：y＝10.293x+0.0227，R2＝0.9998，其中x代表DNPH溶液的浓度，单位为mmol/L，y代表吸光度值。
(2)生物组织包含的醛基含量的检测
取10ml 0.3mmol/L的DNPH溶液稀释至20ml，作为DNPH反应溶液，使用紫外分光光度计测试其在264nm处的吸光度值A1为1.57。
取40ml 0.3mmol/L的DNPH溶液作为反应溶液，放入容器中。取干重为100mg的牛心包生物组织2#(其中，牛心包生物组织2#单面的的面积大约为18cm2，厚度约为0.3mm)，用纯化水清洗3遍，清洗完毕后使用无尘布将表面水分吸干。随后将清洗后的牛心包生物组织加入到DNPH溶液中60℃振荡反应0.5h。反应结束后，去除生物组织，取10ml反应后的DNPH溶液稀释至20ml，使用紫外分光光度计测试其在264nm处的吸光度值A2为1.27。
作为对比将3.008mmol/L的戊二醛溶液1mL加入40mL 0.3mmol/L的DNPH溶液中，60℃振荡反应0.5h，反应结束后对溶液进行过滤，测滤液的DNPH在264nm吸光度A3为1.52。
根据A1、A2、A3以及建立的标准曲线，计算单位生物组织包含的醛基含量和戊二醛浓度。
根据A1、A2以及建立的标准曲线，计算单位生物组织包含的醛基含量。
计算得到牛心包反应体系中反应前后DNPH衍生液浓度分别为0.301mmol/L，0.242mmol/L，DNPH消耗量为2360nmol，故生物组织醛基含量为23.6nmol/mg。计算得到戊二醛溶液体系反应后DNPH浓度为0.145mmol/L，戊二醛浓度值为3.048mmol/L，与戊二醛实际的浓度误差为1.3％，说明使用此方法测定醛基含量的准确度较高。
实施例3
(1)建立标准曲线
精准配制1.0mmol/L的DNPH溶液，其中，使用高氯酸调节DNPH溶液的pH为4.0。
分别选取浓度为1.0mmol/L的DNPH溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml，用纯化水稀释至10ml，使用紫外分光光度计，测定其在323nm处的吸光度值，以DNPH溶液的浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。得到的标准曲线如图1所示，曲线的回归方程为：y＝10.329x+0.034，R2＝0.9998，其中x代表DNPH溶液的浓度，单位为mmol/L，y代表吸光度值。
(2)生物组织包含的醛基含量的检测
取1ml 1.0mmol/L的DNPH溶液稀释至10ml，使用紫外分光光度计测试其在323nm处的吸光度值A1为1.06。
取10ml 1.0mmol/L的DNPH溶液作为反应溶液，放入容器中，取干重为100mg的牛心包生物组织3#(其中，牛心包生物组织3#单面的的面积大约为18cm2，厚度约为0.3mm)，用纯化水清洗3遍，清洗完毕后使用无尘布将表面水分吸干。随后将清洗后的牛心包生物组织加入到DNPH溶液中，40℃振荡反应2h。反应结束后，去除生物组织，取1ml反应后的DNPH溶液稀释至10ml，使用紫外分光光度计测试其在323nm处的吸光度值A2为0.83。
根据A1、A2以及建立的标准曲线，计算单位生物组织包含的醛基含量。
计算得到反应前后DNPH衍生液浓度分别为0.993mmol/L，0.771mmol/L，DNPH消耗量为2220nmol，故生物组织醛基含量为22.2nmol/mg。
需要说明的是，由于生物组织的特异性，在实践过程中生物组织的来源、生物组织的厚度，生物组织的固定工艺及处理工艺等差异，都可能带来的醛基含量变化，所以本文中实施例测得的不同的牛心包生物组织中的醛基含量略有差异。
由上述三个实施例对不同的牛心包生物组织醛基含量的检测结果可以看出，与现有技术相比，本发明涉及的方法操作简单，仅仅需要紫外分光光度计等常用仪器；检测方法仅涉及醛基和DNPH的一个反应步骤，避免了多个反应步骤带来的检测准确度问题；最低在0.5h左右即可完成检测反应，因此检测快速。

Claims (6)

1.一种生物组织包含的醛基含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
配制多个具有不同浓度梯度的2,4-二硝基苯肼标准溶液，测定所述多个标准溶液在特定波长处的吸光度值，绘制浓度和吸光度值呈函数关系的标准曲线，所述特定波长为218nm、264nm或323nm中的一种；
配制2,4-二硝基苯肼反应溶液，并测定所述反应溶液在特定波长处的吸光度值A1；
将所述2,4-二硝基苯肼反应溶液与生物组织反应，测定反应后溶液在特定波长处的吸光度值A2；
根据A1、A2和所述标准曲线计算所述反应中2,4-二硝基苯肼的减少，计算所述生物组织包含的醛基的含量；
所述生物组织与所述反应溶液反应时，所述生物组织与所述反应溶液的质量体积比为0.1-50mg/mL，所述生物组织的厚度为0.2-0.4mm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准溶液的浓度为选自0.01-1.0mmol/L范围中的任意浓度。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应溶液的浓度为选自0.01-1.0mmol/L范围中的任意浓度。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应条件为，20-60℃振荡反应0.5-5h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述2,4-二硝基苯肼反应溶液与生物组织反应之前清洗所述生物组织。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物组织选自心包、心脏瓣膜、韧带、胸膜、皮肤中的至少一种。
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