CN111257072B - 一种通过牛血清原料预混合降低补体水平和蛋白析出的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及牛血清技术领域，本发明通过提前将牛血清低温充分混合，提升了牛血清产品的品质。本发明创新的采用了牛血清原料低温充分预混合工艺，解决了牛血清补体系统消除需要用56℃，30分钟处理对牛血清有效成份破坏太剧烈的问题。用牛血清预混合工艺，将不同血型的牛血清充分混合时，会有蛋白析出，如果只是在最后过滤前混合，反应时间不够充分，最终产品的蛋白析出现象比较常见，采用本工艺制备的牛血清能够有效避免这类的蛋白析出。本发明还有一个优势，原料充分预混合后再进行检测项目的初步筛选，跟最终产品的检测项目对应性更好。

Description

一种通过牛血清原料预混合降低补体水平和蛋白析出的方法

技术领域

本发明涉及血清技术领域，具体地，涉及一种牛血清原料低温充分预混合的方法。本发明通过提前将牛血清低温充分混合，降低血清中补体系统的负面影响；解决了牛血清最终产品中容易出现的蛋白析出问题；同时，预混合工艺还能将原料预混合后再进行检测项目的初步筛选，这种原料跟最终产品的检测项目对应性更好。

背景技术

血液中包含血浆和血细胞，血液去除血细胞和纤维蛋白后即为血清，血清的主要作用是运载血细胞，运输维持人体生命活动所需的物质和体内产生的废物等，血清相当于结缔组织的细胞间质，血清是血液的重要组成部分，呈淡黄色液体(因含有胆红素)，血清的化学成分中，水分占90％至92％，其他10％以溶质血浆蛋白为主，新生牛血清约有3.5-5％的蛋白。血清中还有离子、营养素、酶类、激素类、胆固醇和其他重要组成部分。

牛血清是生物医药生产、生命科学细胞研究和诊断试剂中一个重要的原材料。牛血清的稳定生产、供应涉及到生物医药生产的安全、稳定；支持了生命科学细胞研究、诊断试剂结果的重现性。

细胞培养体系包括细胞、牛血清、培养基、培养方式，牛血清是细胞培养体系中的重要组成部分。生物医药生产及生命科学中培养的细胞大部分是人源、鼠源细胞，这些细胞用带牛血清的培养基培养，牛血清中的补体成份会对这些外源细胞造成损伤，降低牛血清中的补体作用就是牛血清工艺中重要的一步。降低血清中补体常用的做法是用56℃，30分钟热处理，该处理方式剧烈，会导致血清中贴壁成份和细胞培养维持成份的丧失，影响细胞贴壁。同时血清中的维持因子也会大大降低，对细胞后期维持造成影响。这样热处理去补体生生产的血清通不过要求严格的细胞培养检测，常常被判定为不合格产品。因此，本领域迫切需要一种降低牛血清中的补体作用同时不导致血清中贴壁成份和细胞培养维持成份的丧失的解决方案。

此外，牛血清在使用过程中，经常会有蛋白析出。牛的血型通常分类有9个血型系，49种抗原，在不同来源的牛血清混合时，肉眼可见蛋白析出的现象。这个现象中，不同牛血清中不同类型的补体、抗体系统相互反应起了重要作用。因此，本领域也迫切需要一种解决后期过滤、分装和冻存解冻使用时出现蛋白析出问题的方案。

本发明人惊喜的发现，通过牛血清原料低温充分预混合可以同时有效的解决上述问题，这是本领域未曾发现及实施的。

发明内容

本发明旨在设计一种牛血清新的低温充分预混合工艺。

本发明的目的在于通过牛血清的充分预混合，降低牛血清中补体成份，同时减少成品蛋白析出。本发明的工艺还旨在能够增加血清生产过程中，原料和成品血清的对应性。

在第一个方面，本发明提供了一种降低牛血清中补体水平的方法，其特征在于：该方法包括充分预混合牛血清原料。

在一个优选实施方案中，所述牛血清原料预混合为在10-15℃的低温充分混合2-3小时，及在10-15℃的低温放置12-16小时。

在一个更优选实施方案中，所述牛血清原料预混合为在12℃的低温充分混合2.5小时，及在12℃的低温放置14小时。

在一个实施方案中，牛血清原料通过如下获得：刚出生的新生小牛通过六联袋封闭动脉采血，血液进入六联袋后，凝血，4000rpm离心30分钟，通过虹吸取上清，得到牛血清原料。

在一个实施方案中，所得到的牛血清原料进行病毒、抗体指标的筛选。优先地，所述病毒为BVDV、噬菌体等；所述抗体为口蹄疫抗体、IgG等。

在第二个方面，本发明提供了一种防止牛血清后期血清出现蛋白析出或聚合沉淀的方法，其特征在于：所述方法包括充分预混合牛血清原料。

在一个优选实施方案中，所述牛血清原料预混合为在10-15℃的低温充分混合2-3小时，及在10-15℃的低温放置12-16小时。

在一个更优选实施方案中，所述牛血清原料预混合为在12℃的低温充分混合2.5小时，及在12℃的低温放置14小时。

在一个实施方案中，牛血清原料通过如下获得：刚出生的新生小牛通过六联袋封闭动脉采血，血液进入六联袋后，凝血，4000rpm离心30分钟，通过虹吸取上清，得到牛血清原料。

在一个实施方案中，所得到的牛血清原料进行病毒、抗体指标的筛选。优先地，所述病毒为BVDV、噬菌体等；所述抗体为口蹄疫抗体、IgG等。

在第三个方面，本发明提供了一种降低牛血清中补体水平及防止牛血清后期血清出现蛋白析出或聚合沉淀的方法，其特征在于：所述方法包括充分预混合牛血清原料。

在一个优选实施方案中，所述牛血清原料预混合为在10-15℃的低温充分混合2-3小时，及在10-15℃的低温放置12-16小时。

在一个更优选实施方案中，所述牛血清原料预混合为在12℃的低温充分混合2.5小时，及在12℃的低温放置14小时。

在一个实施方案中，牛血清原料通过如下获得：刚出生的新生小牛通过六联袋封闭动脉采血，血液进入六联袋后，凝血，4000rpm离心30分钟，通过虹吸取上清，得到牛血清原料。

在一个实施方案中，所得到的牛血清原料进行病毒、抗体指标的筛选。优先地，所述病毒为BVDV、噬菌体等；所述抗体为口蹄疫抗体、IgG等。

优选地，牛血清生产原料预混合后进行检测跟后期产品对应性更好。

具体的，新生小牛通过六联袋封闭采血，凝血后离心，上清为牛血清。每袋牛血清标记好来源、采血时间和操作人员。送到生产工厂后，取出采血管(已申请实用新型专利)中牛血清进行质检，先进行病毒、抗体等多个指标的筛选。筛选合格的原料，通常用100头新生牛的原料血清进行预混合，低温充分混合后，原料低温(10-15℃)放置过夜。预混合后的血清，取部分血清过滤质检。

本发明的有益效果：

(1)牛血清低温充分预混合工艺，能够使不同血型的牛血清充分反应，有效的降低血清中补体活性。最终牛血清低温充分预混合工艺的成品比没有经过该工艺预混合的成品补体活性大大降低；本发明工艺生产的牛血清中补体系统(后期还有辐照进一步降低补体系统)对外源的细胞培养没有影响。

(2)牛血清预混合工艺使不同牛血清中不同类型的补体、抗体系统相互反应的作用和时间更充分，在后期过滤、分装和冻存解冻使用时没有蛋白析出现象。牛血清没有蛋白析出，利于细胞培养的观察。没有蛋白析出的牛血清用做诊断中试剂盒里的保护剂或封闭液，对反应或结果读取影响小。

(3)牛血清经过充分预混合后还有一个优点，质检时，预混合原料跟成品的对应性更好。经过原料和预混合原料初筛后能更好的保障客户血清的使用。

附图说明

图1为蛋白析出情况，其中，A图为混合后的蛋白析出情况；B图为混合挡掉沉淀后的蛋白析出情况。

图2为过滤后成品解冻后的情况，其中，左边是低温充分预混合后过滤的成品，右边是快速混合后过滤的成品。

图3为CHO细胞培养至第三代48小时：A图为小样，细胞数量：116×10⁴个/ml，细胞活率：99.58％。B图为成品，细胞数量：118×10⁴个/ml，细胞活率：99.5％。

图4为293T细胞培养至第三代48小时：A图为小样，细胞数量：132×10⁴个/ml，细胞活率：99.18％；B图为成品，细胞数量：128×10⁴个/ml，细胞活率：99.46％。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例中所用原料、试剂、仪器和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或合成。

实施例1：充分预混合过程

刚出生的新生小牛通过六联袋封闭动脉采血。血液进入六联袋后，凝血，4000rpm离心30分钟，通过虹吸取上清，即为牛血清原料。每袋牛血清标记好来源、采血时间和操作人员。通过冷链运输到生产工厂后，取出采血管(已申请实用新型专利)中牛血清进行质检，先进行病毒(具体的，BVDV、噬菌体等)、抗体(具体的，口蹄疫抗体、IgG)等多个指标的筛选。

筛选合格的原料，用100头新生牛的血清原料进行预混合，低温(10-15℃，具体的，12℃)充分混合2-3小时(具体的，2.5小时)后(混合罐已申请实用新型专利)，分装到500ml的血清瓶中，该原料低温(10-15℃，具体的，12℃)放置过夜(12-16小时，具体的，14小时)。充分混合的血清原料，取出部分进行补体活性检测，补体活性下降比率批次稳定方可放行进入下一步过滤环节。在血清过滤前用滤布(100目)，进行初步过滤，可以防止后面蛋白析出物堵塞后面的滤器。大批次过滤，一般包括1000头新生牛血清的混合，取出10个充分预混合的新生牛原料，进行大批次混合(10-15℃，具体的，12℃)，在混合罐中充分混合2-3小时(具体的，2.5小时)。混合后再次用滤布过滤掉蛋白析出，过滤前和过滤后分别留样，就行质控和质检项目的检测。

实施例2：

原料血清充分预混合后，过滤的成品血清和没有充分预混合的血清补体活性的测定比较。

1.制备山羊抗血清并稀释使达到最好的致敏状态。

(1)将兔红细胞(1×10⁹细胞/mL)皮下注射成年山羊体内，每次3ml，每周一次，共注射6周。

(2)停止注射后间隔四天对山羊进行颈静脉采血，分离血清。

(3)56℃加热30min灭活抗血清中的内源补体。

(4)用GVB2+(明胶弗洛拿缓冲液，gelatin veronal buffer；pH＝7.4)溶液将抗血清从1：100到1：1600做二倍系列稀释。

(5)再分别取稀释液0.1mL与兔红细胞悬浮液做1：1混合，将混合液在37℃水浴30min。加10倍稀释的待测大牛血清1.3mL，在37℃轻摇2h。

(6)最后，5000rpm离心5min，取上清液于414nm处测OD值。最后通过溶血率达到平衡的点确定山羊抗血清的最佳稀释倍数为1:200。抗血清用Protein G初步纯化，得到溶血抗体，用溶血抗体做实验效果更好。

2.制备致敏兔红细胞。

(1)用EDTA-GVB2+(pH＝7.4)缓冲液替换阿氏液制备5％的兔红细胞悬浮液。

(2)5％的兔红细胞悬浮液进行不同程度的稀释，并用蒸馏水做空白对照于414nm处测OD值。通过如下公式：OD＝0.740×稀释倍数，把兔红细胞悬浮液的密度调到10⁹细胞/mL。

(3)将稀释好的山羊抗血清与相同体积的兔红细胞悬浮液(1×10⁹细胞/mL)做1：1混合，并将混合液在37℃轻摇30min，以使兔红细胞达到敏化状态。

(4)然后用GGVB2+(葡萄糖-明胶弗洛拿缓冲液，glucose gelatin veronalbuffer；pH＝7.8)缓冲液换液2-3次，用相同的方法在GGVB2+中把兔红细胞悬浮液调整到5×10⁸细胞/mL。4℃贮存，一周内使用。

3.测试

(1)1.5mL的EP管中加1.3ml 10倍稀释的牛血清(预混合血清和快速混合血清通过过滤去除蛋白析出成份)，并各管中加入0.2ml致敏兔红细胞，以上过程均冰上操作。

(2)混合液混合均匀后放于37℃轻摇2h。

(3)观察红细胞裂解情况并记录。

补体活性检测试结果如下：

表1

注：“+++++”为完全溶血现象；“++++”为强溶血现象；“++”为少量溶血；“+”为微量溶血，“-”为不溶血。

从实验结果显示，充分预混合的血清补体作用大大降低，原料或成品还有辐照等工艺进一步降低补体的作用，最终产品的补体在细胞培养过程中的负面作用可以忽略不计。

实施例3：

原料血清预混合一段时间后，出现蛋白析出的现象。这些蛋白析出在过滤前用滤布挡掉后，再进行过滤。

参见图1，该图反映了蛋白析出情况，其中，A图为混合后的蛋白析出情况；B图为混合挡掉沉淀后的蛋白析出情况。

参见图2，该图显示了过滤后成品解冻后的情况。其中，左图是低温充分预混合后过滤的成品，右图是快速混合后过滤的成品。

实施例4：

原料血清低温预混合后，低温放置过夜。把血清中析出蛋白用滤布挡掉后，取2000ml样品血清过滤，过滤血清进行质检。

血清样品质检跟成品血清质检比较。血清样品和成品生化指标检测结果基本一致，CHO细胞和293T细胞培养差别不大。BVDV抗原和抗体检测结果能相互对应。测试3批次牛血清原料和成品生化指标、细胞测试和BVDV抗原/抗体结果均能得到很好的对应。

表格2.样品和成品生化指标检测

细胞培养方面：

CHO或293T细胞连续传代3次，每24小时拍照记录数据，第三代48小时用细胞计数仪计算细胞数量，测试细胞活率。

图3为CHO细胞培养至第三代48小时：A图为小样，细胞数量：116×10⁴个/ml，细胞活率：99.58％。B图为成品，细胞数量：118×10⁴个/ml，细胞活率：99.5％。

图4为293T细胞培养至第三代48小时：A图为小样，细胞数量：132×10⁴个/ml，细胞活率：99.18％；B图为成品，细胞数量：128×10⁴个/ml，细胞活率：99.46％。

BVDV抗原、抗体检测

抗体、抗原ELISA检测试剂盒购自美国IDEXX

操作步骤：

1.BVDV抗体检测

(1)取出包被板，并在操作记录表上标记样品的位置。

(2)每孔用12道的移液器加入100μl样品。

(3)振荡器振荡，将反应板中的溶液混匀。

(4)室温(18-25℃)孵育1.5小时，或2-8℃冰箱中过夜孵育。

(5)吸出反应孔中的液体弃入废液缸中。

(6)用300μl的洗涤液洗涤每个孔板5次。每次洗涤后，甩去孔中的液体，在最后一次甩掉后，在吸水纸上用力扣板，甩去剩余的液体，加入下一个试剂前，避免孔壁变干。

(7)每个反应孔中加入100μl酶标抗体。

(8)室温下孵育30分钟。

(9)重复步骤(5)和(6)

(10)在每个反应孔加入100μl TMB底物

(11)在室温(暗处)孵育10分钟。在第一个孔加入TMB底物后开始计时。

(12)按照(10)加入TMB底物的顺序在每个反应孔中加入100μl终止液终止反应。

(13)酶标仪调零

(14)在450nm波长(或双波长450nm和650nm)测定和记录样品及对照的吸光值。

(15)计算结果并记录。

表3

注：S-N值＝样品-阴性对照；结果小于等于0.3为阴性，结果大于0.3为阳性。

2.BVDV抗原检测：

(1)取出被抗体包被的微量反应板，并在记录表上标记好每个样品的位置。

(2)每个反应孔中用12道移液器加入50μl的检测抗体。

(3)阴性对照双孔中各加50μl阴性对照。

(4)阳性对照双孔中各加50μl阳性对照。

(5)剩余的反应孔中分别加入50μl对照样品。不同的被检样更换吸头。

(6)用振荡器振荡，将反应板中的溶液混匀。

(7)37℃孵育2小时，孵育过程中将反应板塑封防止反应孔中液体挥发。

(8)吸出反应孔中的液体弃入废液缸中。

(9)每个反应孔加入约300μl的洗涤液进行5次洗涤。每次洗涤后吸出所有孔中的液体。在洗涤时及加入辣根氧化物酶标记物之前要防止反应板出现干燥现象。最后一次洗涤结束后，将反应板在吸水纸上拍干。注意：洗涤时避免血清等污渍遗留在孔壁或孔边上，如果有遗留需要清洗干净。

(10)每个反应孔加入100μl辣根过氧化物酶标记物。

(11)室温孵育30分钟。

(12)重复步骤(8)和(9)

(13)每个反应孔中加入100μl TMB底物。

(14)室温条件下黑暗处孵育10分钟。

(15)每个反应孔中加入100μl的终止液终止反应。在加终止液时要按第13步的顺序进行滴加。

(16)酶标仪调零

(17)在450nm波长(或双波长450nm和650nm)测定和记录样品及对照的吸光值。

(18)计算结果并记录。

表4.结果：

样品	OD值	S/P值	结果判定
				低温充分预混合原料	0.163±0.006	0.022	阴性
过滤后成品	0.159±0.011	0.009	阴性
				阴性对照	0.153±0.011	0	阴性
阳性对照	0.802±0.025	1	阳性

注：S/P值＝(样品-阴性对照)/(阳性对照-阴性对照)；S/P值<0.2为阴性，0.2-0.3之间为疑似阴性,>0.3为阳性。

最后有必要在此指出的是：以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种降低牛血清中补体水平的方法，其特征在于：所述方法包括充分预混合牛血清原料；

所述牛血清原料充分预混合为在 10-15℃的低温充分混合 2-3 小时，及在 10-15℃的低温放置 12-16 小时。

2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：所述牛血清原料充分预混合为在 12℃的低温充分混合 2.5 小时，及在 12℃的低温放置 14 小时。

3.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：牛血清原料通过如下获得：刚出生的新生小牛通过六联袋封闭动脉采血，血液进入六联袋后，凝血，4000rpm 离心 30 分钟，通过虹吸取上清，得到牛血清原料。

4.根据权利要求 3 所述的方法，其特征在于：所得到的牛血清原料进行 BVDV、噬菌体、口蹄疫抗体、IgG 指标的筛选。

5.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：所述方法防止牛血清后期出现蛋白析出或聚合沉淀。

6.根据权利要求 1-5 任一项所述的方法，其特征在于，牛血清生产原料预混合后进行检测跟后期产品对应性更好。

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