CN111254219A

CN111254219A - 一种用于进行病毒包装效率检测的方法

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Publication number: CN111254219A
Application number: CN201911374412.0A
Authority: CN
Inventors: 宋凯; 张庆华; 王世东; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Shanghai Wayen Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Wayen Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: CN111254219B

Abstract

本发明提供了一种检测病毒包装效率的方法，该方法基于病毒成功包装核酸后表面电荷会发生变化，通过检测病毒表面带电荷的相对情况，判断成功包装核酸的病毒颗粒数量，进而计算病毒颗粒包装效率。

Description

一种用于进行病毒包装效率检测的方法

技术领域

本发明涉及一种新型的病毒包装效率检测方法，特别是在转基因与基因治疗领域中，用于判断病毒包装外源基因的包装效率。

背景技术

基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。也包括转基因等方面的技术应用。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。相比传统医疗手段，以基因技术为基础的基因治疗手段更具针对性，能够获得较为理想的治疗效果，并能大大减轻患者痛苦，其应用被业内普遍看好。自2012年开始，全球新增基因治疗临床试验754例。其中最引人注目的领域当属利用CAR-T细胞靶向肿瘤相关细胞表面抗原的肿瘤的免疫治疗(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫治疗)。2013年CAR-T治疗被《科学》(Science)杂志评选为“十大科技进展”之首。CAR-T技术现阶段主要用于血液肿瘤的治疗，主要代表是FDA于2017年批准的Kymriah(诺华)和Yescarta(Kite)两款产品。

基因治疗的流程一般是利用基因工程的方法将正常基因插入到病毒载体的 DNA上；(2)将重组后的病毒DNA体外包装产生具有感染能力的完整工程病毒；(3)把重组后的病毒直接注入病人体内，病毒感染病变细胞并将正常基因带到靶细胞中，实现疾病的治疗；或者(1)将正常基因插入到病毒载体的DNA 上；(2)将重组后的病毒DNA体外包装产生具有感染能力的完整工程病毒；(3) 获取病人的体细胞，如造血干细胞等，体外培养扩增；(4)用重组后的病毒感染获取的病人细胞，病毒把正常基因导入靶细胞中；(5)对携带正常基因的重组细胞体外培养扩增；(6)将携带正常基因的重组细胞回输到病人体内，实现疾病的治疗。

以上无论哪种方法都会用到载体，目前使用的主要载体包括真核载体和病毒载体等，其中病毒载体的研究更加热门，较常用的病毒载体包括腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等。慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可装载DNA片段容量高达5kb，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，形成稳定遗传物质，使得目的基因在细胞中可稳定长期表达。腺病毒(adenovirus)颗粒没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈二十面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链 DNA分子，约含35000bp，两端各有长约100bp的反向重复序列。腺病毒的结构蛋白在细胞核内聚集形成病毒衣壳，病毒的基因组被包装进去，形成有感染能力的病毒颗粒，并最终裂解宿主细胞被释放出去，完成腺病毒的生活周期。逆转录病毒，球形，有包膜，80～120nm，含有逆转录酶的单链正链RNA病毒。慢病毒是逆转录病毒科中的亚科，逆转录病毒侵入宿主细胞后以自身RNA为模板，靠逆转录酶形成DNA环化后整合到宿主细胞的染色体中，以原病毒形式在宿主细胞中复制。

在使用病毒包装核酸的时候，并不是所有的病毒都正确完成了包装，往往存在损伤的、无感染能力的病毒，这些“无效”病毒会影响后续的应用，因此病毒包装效率的测定非常重要。在现有的检测体系中，传统的包装效率检测的方法有空斑检测法、稀释荧光计数法、定量PCR法、ELISA法(检测P24蛋白含量)等，其中空斑检测法为金标准，但是这些方法或者费时费力，或者成本高，无法实时反应病毒包装过程中的情况，严重影响了病毒的生产制造工艺的效率。因此，亟需一种可以简单精确的用于病毒包装效率检测的方法。

ZETA电位(Zeta potential)又叫电动电位或电动电势(ζ-电位或ζ-电势)。Zeta电位的主要用途之一就是检测颗粒表面的电荷数量。例如病毒颗粒表面是带电荷的，其在一定的溶液体系中会形成一定的ZETA电位，当病毒表面的电荷发生变化后，其ZETA电位会发生改变。而病毒包装的核酸是带有负电荷的，因此当病毒完整的包装了核酸后，其表面电荷受其影响发生改变，导致ZETA电位的变化，因此测定病毒颗粒表面ZETA电位的变化可有效分辨病毒包装的完整性。

ZETA电位的测定可以基于TRPS技术(Tunable resistive pulse sensing，可调电阻脉冲传感技术)，悬浮在电解液中的颗粒随电解液通过小孔管时，取代相同体积的电解液，在恒电流设计的电路中导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化，产生电位脉冲。脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比。当病毒颗粒通过电解液体系时，由于病毒表面带有电荷，当通过改变电压调节电场的强度时，病毒颗粒通过电场的速率会发生变化，将这种变化与已知ZETA 电位与大小的粒子进行比较时，即可测定病毒颗粒的ZETA电位和大小。TRPS 检测的结果可以使用散点图的形式进行展示，其中横坐标为颗粒大小(nm级别)，纵坐标为ZETA电位。完整包装的病毒颗粒与未包装核酸的病毒颗粒其大小基本一致，对应在横坐标的大致相同区域；而带电荷的差异导致两种病毒颗粒 ZETA电势的不同，对应在纵坐标的不同区域。而这种基于TRPS技术的检测需要的样本体积大约为30ul，检测时间为2min，相较于传统病毒包装效率检测技术效率大大提高。因此，TRPS技术是一种可用于进行病毒核酸包装效率检测的方法。

发明内容

为实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：

采用常规方法进行细胞培养，当细胞生长至70-80％饱和度时，将组成慢病毒载体的3个质粒进行转染，转染6-8小时后换完全培养液，再培养约48-60小时后，收集病毒培养上清液，经离心后，病毒沉淀加入提前过滤的PBS重悬。将病毒重悬液使用表面电荷测定仪器进行检测，对检测到的病毒携带的电荷进行分析，根据电荷差异判断成功包装核酸的病毒颗粒数量，进而计算得到病毒颗粒包装效率。

附图说明

图1是通过qNano仪器检测的500个病毒颗粒分布图。

图2是500个病毒颗粒表面电荷情况图。

具体实施方式

实施例1病毒制备

按照常规方法培养293T细胞，当细胞长至70-80％饱和度时，将组成慢病毒载体的3个质粒(含eGFP基因)进行转染，转染6-8小时后换完全培养液，再培养约48-60小时后，收集病毒培养上清液，经离心后，病毒沉淀加入提前过滤的 PBS重悬。

实施例2Real-time PCR检测病毒颗粒数量

取2μL病毒悬液进行DNase处理，处理后的混合液，加入蛋白酶K等处理，酚、氯仿抽提，无水乙醇沉淀，DEPC水溶解。应用实时定量PCR测定病毒LTR拷贝数，软件分析荧光检测数据。

表1.PCR引物与探针

引物和探针	序列
		LTR-F	5′-ACAGCCGCCTAGCATTTCAT-3′
LTR-R	5′-GAGAGCTCCCAGGCTCAGATC-3′
		LTR-Probe	5′-ACATGGCCCGAGAGCTGCATCC-3′

表2.PCR反应条件

反应体系
		引物与探针	1μL
PCR Mix	5μL
		样本	2μL
H2O	2μL
		总反应体系	10μL
反应条件
		95℃	变性5min
95℃30s，59℃30s，	40个循环
		59℃	520nm处检测荧光值

实时定量PCR测定结果显示，病毒颗粒数为5.78×10¹¹/ml。

实施例3病毒感染细胞

使用不同剂量病毒感染293T细胞，按10倍稀释法，取0.1、0.01μL病毒悬液(慢病毒颗粒数为：5.78×10⁷、5.78×10⁶)，用

培养液稀释后，感染293T细胞(1.5×10⁶/孔)，细胞经2d天培养后，用胰酶将细胞消化，收集细胞沉淀。

实施例4Real-time PCR检测感染细胞效率

收集的293T细胞，加入蛋白酶K等处理后，酚、氯仿抽提，无水乙醇沉淀， DEPC水溶解。应用实时定量PCR测定病毒LTR拷贝数，反应条件同实施例2，软件分析荧光检测数据。

根据一个病毒感染细胞并将外源基因整合入基因组后，每条DNA单链上含有两个完整的LTR，因此，在被整合的细胞基因组，一个慢病毒颗粒＝LTR拷贝数/4。5.78*10⁷、5.78*10⁶病毒颗粒感染后，细胞中外源基因整合的拷贝数分别为1.15×10⁶、1.96×10⁵。

根据公式：感染效率＝有效感染病毒数/感染细胞总病毒颗粒数，

本次病毒感染效率＝(1.45×10⁶/5.78×10⁷+2.16×10⁵/5.78×10⁶)/2× 100％＝3.12％.。

由于只有包装完整的病毒颗粒才可以感染细胞并发挥功能，因此本次病毒的包装效率＝病毒感染效率＝3.12％。

实施例5表面电荷检测病毒颗粒和病毒表面电荷

取实施例1制备的病毒悬液，1000倍稀释后，使用新西兰IZON公司生产的qNano表面电荷测定仪进行ZETA电势测定。使用CPC200作为标准颗粒，该颗粒已知直径、浓度、以及表面电荷。通过一次检测，即可获得病毒颗粒的数量以及表面电荷分布(表3)。本次检测，共统计500个病毒颗粒的数据，具体500个病毒颗粒粒子大小分布情况和病毒表面电荷情况，见图1和图2。其中病毒颗粒的大小分布在75-159nm之间，90％以上的颗粒分布在100-139nm之间，符合慢病毒颗粒大小范围。

表3.使用表面电荷测定仪测定病毒颗粒数据

实施例6计算病毒颗粒包装效率

实施例5检测的500个病毒颗粒，其表面电荷的Zeta电位从 -89.51～-13.83mV，其中位数为-33.77mV，大部分病毒颗粒的zeta电位在中位数附近(黑色圈)，根据病毒成功包装核酸后其表面电荷会发生变化，设置2倍中位数的zeta电位为阈值，病毒表面zeta电位达到阈值范围，即小于-67.54mV的视为病毒成功包装核酸，经统计，总计18个病毒颗粒带电荷位于-67.54～-89.51 之间(红色圈)，因此有18个病毒颗粒为成功包装，其包装效率为18/500× 100％＝3.60％。

实施例7两种方法优劣比较

前述实施例中分别使用实时荧光定量PCR的方法和颗粒表面电荷测定仪的方法进行了病毒包装效率的检测，两种方法检测获得的数值分别为3.12％和 3.60％，基本一致。对这两种方法进行分析，实时荧光定量PCR的方法不仅要对收集的病毒颗粒进行检测，而且需要收集感染后的细胞进行检测，整个检测周期长达1周以上，并且需要采购相关的探针、引物、细胞培养等相关试剂，使用的仪器除实时荧光定量PCR仪外，还需要细胞培养箱等，整个过程耗时长、成本高；使用颗粒表面电荷测定仪进行检测，仅需将病毒颗粒进行稀释上机检测，一次检测所需时间在1小时左右，而且可同时得到病毒颗粒大小、病毒浓度、病毒携带电荷数量，通过获得的这些数值，直接可用计算出病毒包装效率，该方法简便易行。尤其在基因治疗领域，慢病毒作为基因携带载体，其生产过程中的检测与监控需要快速易行的方法，显然本专利的方法更加适合。

Claims

1.一种用于病毒包装效率检测的方法，其特征在于该方法基于病毒成功包装核酸后，由于核酸带有电荷，会导致病毒表面带有的电荷发生变化，通过检测病毒表面带电荷的相对情况，判断成功包装核酸的病毒颗粒数量，进而计算病毒颗粒包装效率。

2.根据权利要求1所述，由于核酸带有电荷的不同，病毒成功包装核酸后表面电荷的变化既包括表面电荷的增加也包括由于表面电荷的减少。

3.根据权利要求1所述，通过电荷检测仪器检测单位数量的病毒颗粒表面电荷，其表面电荷使用符号Z表示，Zi>＝2Zaverage的病毒颗粒判定为包装有核酸。

4.根据权利要求1所述，病毒包装效率＝(Zi>＝2Zaverage的病毒颗粒总数)/(本次检测的所有病毒颗粒总数)×100％。

5.根据权利要求1所述，可应用该方法检测的病毒包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒等。

6.根据权利要求1所述，该方法可用于评价使用病毒包装核酸和脱氧核糖核酸。

7.根据权利要求1所述，该方法可用于转基因领域、基因治疗领域。