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CN111246865A - 程序化以在肿瘤细胞中产生免疫调节剂和抗癌治疗剂的微生物 - Google Patents

程序化以在肿瘤细胞中产生免疫调节剂和抗癌治疗剂的微生物 Download PDF

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CN111246865A
CN111246865A CN201880046649.3A CN201880046649A CN111246865A CN 111246865 A CN111246865 A CN 111246865A CN 201880046649 A CN201880046649 A CN 201880046649A CN 111246865 A CN111246865 A CN 111246865A
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gene
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李宁
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Synchronic Operation Co
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Abstract

公开了基因程序化微生物(例如细菌或病毒)，其药物组合物，以及调控和治疗癌症的方法。

Description

程序化以在肿瘤细胞中产生免疫调节剂和抗癌治疗剂的微 生物
相关申请
本申请要求2017年07月12日提交的美国临时申请号62/531,784；2017年08月09日提交的美国临时申请号62/543,322；2017年08月30日提交的美国临时申请号62/552,319；2017年11月29日提交的美国临时申请号62/592,317；2017年12月18日提交的美国临时申请号62/607,210；2018年01月05日提交的PCT申请号PCT/US2018/012698；2018年02月09日提交的美国临时申请号62/628,786；2018年03月13日提交的美国临时申请号62/642,535；2018年04月13日提交的美国临时申请号62/657,487；以及2018年06月22日提交的美国临时申请号62/688,852的优先权。前述申请各自的全部内容均通过引用明确地并入本文。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII拷贝创建于2018年7月10日，名称为126046_31320_SL.txt，大小为1,784,310个字节。
背景技术
目前的癌症疗法通常采用使用免疫疗法、外科手术、化疗、放射治疗、或其某种组合(美国癌症协会)。虽然这些药物对癌症患者显示出巨大的益处，但许多癌症仍然难以使用常规疗法治疗。目前，许多常规癌症疗法全身施用并对健康组织产生不利影响，导致显著的副作用。例如，许多癌症疗法专注于激活免疫系统以增强患者的抗肿瘤反应(Kong等，2014)。然而，尽管有这样的疗法，肿瘤周围的微环境仍然具有高度免疫抑制作用。此外，全身改变的免疫调节引发免疫功能失调，包括机会性自身免疫疾病和免疫相关的不良事件的发作。
在过去几十年中已经做出了重大努力来开发特异性靶向癌细胞的细胞毒性药物。近年来，肿瘤学已经发生了范式转变，其中癌症的临床问题不仅被认为是癌细胞中基因异常的积累，而且还被认为是免疫系统对这些异常细胞的耐受性。因此，最近的抗癌疗法专门被设计为靶向免疫系统而非癌细胞。这样的疗法旨在逆转癌症免疫耐受性并刺激有效的抗肿瘤免疫应答。例如，目前的免疫疗法包括免疫刺激分子，其是靶向渗入肿瘤微环境的各种免疫细胞群的模式识别受体(PRR)激动剂或免疫刺激性单克隆抗体。然而，尽管它们具有免疫靶向设计，但这些疗法已经在临床上开发为犹如它们是依赖于免疫治疗剂的全身施用(例如，每2-3周静脉内输注)的常规抗癌药物。结果是许多目前的免疫疗法由于高剂量需求而遭受毒性，并且还经常导致不期望的自身免疫应答或其他免疫相关的不良事件。
因此，对于能够靶向血管化不良的缺氧肿瘤区域、特异性靶向癌细胞，同时最小程度地影响正常组织并增强免疫系统以对抗肿瘤，包括避免或逆转肿瘤免疫耐受的有效癌症治疗存在未满足的需求。
发明内容
本公开提供了微生物的组合物、方法和用途，所述微生物选择性地靶向肿瘤和肿瘤细胞，并且能够产生在肿瘤位点处局部产生的一种或多种免疫调节剂，例如免疫引发剂或一种或多种免疫引发剂和/或一种或多种免疫维持剂的组合。在某些方面，本公开提供了被工程化以产生一种或多种免疫调节剂(例如，免疫引发剂和/或维持剂)的微生物。在某些方面，工程化微生物是细菌，例如鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌Nissle、Clostridium novyiNT和Clostridium butyricum miyairi，以及本文提供的能够选择性地归巢于肿瘤微环境的其他示例性细菌菌株。因此，在某些实施方式中，全身施用工程化微生物，例如，通过口服施用、静脉内注射、皮下注射、肿瘤内注射或其他手段，并且能够选择性地定植肿瘤位点。
在一个方面中，本文公开了一种修饰微生物，其能够生产至少一种免疫引发剂。在一个方面中，本文公开了一种修饰微生物，其能够生产至少一种免疫维持剂。在一个方面中，本文公开了一种修饰微生物，其能够生产至少一种免疫引发剂和至少一种免疫维持剂。
在另一个方面中，本文公开了一种组合物，其包含免疫引发剂，例如细胞因子、趋化因子、单链抗体、配体、新陈代谢转化剂、T细胞共刺激受体、T细胞共刺激受体配体、工程化的化学疗法或裂解肽；和能够生产至少一种免疫维持剂的第一修饰微生物。在又一个方面中，本文公开了一种组合物，其包含免疫维持剂，例如趋化因子、细胞因子、单链抗体、配体、新陈代谢转化剂、T细胞共刺激受体或T细胞共刺激受体配体；和能够生产至少一种免疫引发剂的第一修饰微生物。在另一个方面中，本文公开了一种组合物，其包含能够生产至少一种免疫引发剂的第一修饰微生物和能够生产至少一种免疫维持剂的至少第二修饰微生物。
在一个实施方式中，免疫引发剂能够增强溶瘤作用、激活抗原提呈细胞(APC)和/或初免和激活T细胞。在另一个实施方式中，免疫引发剂能够增强溶瘤作用。在另一个实施方式中，免疫引发剂能够激活APC。在又一个实施方式中，免疫引发剂能够初免和激活T细胞。
在一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种基因编码的治疗性分子。在一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种基因编码的酶生产的治疗性分子。在一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种基因编码的至少一种生物合成或分解代谢途径的酶。在一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种基因编码的至少一种生物合成或分解代谢途径的酶生产的至少一种治疗性分子。在一个实施方式中，免疫引发剂是介导RNA干扰、microRNA应答或抑制、TLR应答、反义基因调控、靶蛋白结合或基因编辑的核酸分子。
在一个实施方式中，免疫引发剂是细胞因子、趋化因子、单链抗体、配体、新陈代谢转化剂、T细胞共刺激受体、T细胞共刺激受体配体、工程化的化学疗法或裂解肽。在一个实施方式中，免疫引发剂是分泌的肽或展示的肽。
在一个实施方式中，免疫引发剂是STING激动剂、精氨酸、5-FU、TNFα、IFNγ、IFNβ1、激动性抗-CD40抗体、CD40L、SIRPα、GMCSF、激动性抗-OXO40抗体、OXO40L、激动性抗-4-1BB抗体、4-1BBL、激动性抗-GITR抗体、GITRL、抗-PD1抗体、抗-PDL1抗体或天青蛋白。在一个实施方式中，免疫引发剂是STING激动剂。在一个实施方式中，免疫引发剂是精氨酸生物合成途径的至少一种酶。在一个实施方式中，免疫引发剂是精氨酸。在一个实施方式中，免疫引发剂是5-FU。在一个实施方式中，免疫引发剂是TNFα。在一个实施方式中，免疫引发剂是IFNγ。在一个实施方式中，免疫引发剂是IFNβ1。在一个实施方式中，免疫引发剂是激动性抗-CD40抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂是SIRPα。在一个实施方式中，免疫引发剂是CD40L。在一个实施方式中，免疫引发剂是GMCSF。在一个实施方式中，免疫引发剂是激动性抗-OXO40抗体。在另一个实施方式中，免疫引发剂是OXO40L。在一个实施方式中，免疫引发剂是激动性抗-4-1BB抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂是4-1BBL。在一个实施方式中，免疫引发剂是激动性抗-GITR抗体。在另一个实施方式中，免疫引发剂是GITRL。在一个实施方式中，免疫引发剂是抗-PD1抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂是抗-PDL1抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂是天青蛋白。
在一个实施方式中，免疫引发剂是STING激动剂。在一个实施方式中，STING激动剂是c-diAMP。在一个实施方式中，STING激动剂是c-GAMP。在一个实施方式中，STING激动剂是c-diGMP。
在一个实施方式中，修饰微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码生产所述免疫引发剂的酶。在一个实施方式中，编码免疫引发剂的至少一种基因序列是dacA基因序列。在一个实施方式中，编码免疫引发剂的至少一种基因序列是cGAS基因序列。在一个实施方式中，cGAS基因序列是人cGAS基因序列。在一个实施方式中，cGAS基因序列选自人cGAS基因序列、Verminephrobacter eiseniae cGAS基因序列、反硝化金氏菌(Kingelladenitrificans)cGAS基因序列和杆状奈瑟氏菌(Neisseria bacilliformis)cGAS基因序列。
在一个实施方式中，编码免疫引发剂的至少一种基因序列被整合至修饰微生物的染色体中。在一个实施方式中，编码免疫引发剂的至少一种基因序列存在于质粒上。在一个实施方式中，编码免疫引发剂的至少一种基因序列可操作地连接至诱导型启动子。在一个实施方式中，诱导型启动子是由低氧、厌氧或缺氧条件所诱导。
在一个实施方式中，免疫引发剂是精氨酸。在另一个实施方式中，免疫引发剂是编码精氨酸生物合成途径的至少一种酶。
在一个实施方式中，微生物包含编码精氨酸生物合成途径的至少一种酶的至少一种基因序列。在一个实施方式中，编码精氨酸生物合成途径的至少一种酶的至少一种基因序列包含反馈抗性argA。在一个实施方式中，编码精氨酸生物合成途径的至少一种酶的至少一种基因序列选自以下：argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、argJ、carA和carB。在一个实施方式中，所述微生物还包含精氨酸阻遏基因(argR)中的缺失或突变。在一个实施方式中，用于生产精氨酸的至少一种基因序列被整合至修饰微生物的染色体中。在一个实施方式中，用于生产精氨酸的至少一种基因序列存在于质粒上。在一个实施方式中，用于生产精氨酸的至少一种基因序列可操作地连接至诱导型启动子。在一个实施方式中，诱导型启动子是由低氧、厌氧或缺氧条件所诱导。
在一个实施方式中，免疫引发剂是5-FU。
在一个实施方式中，微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码能够将5-FC转化为5-FU的酶。在一个实施方式中，至少一种基因序列是codA。在一个实施方式中，至少一种基因序列被整合至修饰微生物的染色体中。在另一个实施方式中，至少一种基因序列存在于质粒上。在一个实施方式中，编码免疫引发剂的至少一种基因序列可操作地连接至诱导型启动子。在一个实施方式中，诱导型启动子是FNR启动子。
在一个实施方式中，免疫维持剂能够增强T细胞的运输和浸润、增强T细胞对癌细胞的识别、增强效应T细胞的应答和/或克服免疫抑制。在一个实施方式中，免疫维持剂能够增强T细胞的运输和浸润。在一个实施方式中，免疫维持剂能够增强T细胞对癌细胞的识别。在一个实施方式中，免疫维持剂能够增强效应T细胞的应答。在一个实施方式中，免疫维持剂能够克服免疫抑制。
在一个实施方式中，免疫维持剂是由至少一种基因编码的治疗性分子。在一个实施方式中，免疫维持剂是由至少一种基因编码的酶生产的治疗性分子。在一个实施方式中，免疫维持剂是由至少一种基因编码的至少一种生物合成或分解代谢途径的酶。在一个实施方式中，免疫维持剂是由至少一种基因编码的至少一种生物合成或分解代谢途径的酶生产的至少一种治疗性分子。在一个实施方式中，免疫维持剂是介导RNA干扰、microRNA应答或抑制、TLR应答、反义基因调控、靶蛋白结合或基因编辑的核酸分子。
在一个实施方式中，免疫维持剂是细胞因子、趋化因子、单链抗体、配体、新陈代谢转化剂、T细胞共刺激受体、T细胞共刺激受体配体或者分泌肽或展示肽。
在一个实施方式中，免疫维持剂是新陈代谢转化剂、精氨酸、STING激动剂、CXCL9、CXCL10、抗-PD1抗体、抗-PDL1抗体、抗-CTLA4抗体、激动性抗-GITR抗体或GITRL、激动性抗-OX40抗体或OX40L、激动性抗-4-1BB抗体或4-1BBL、IL-15、IL-15sushi、IFNγ或IL-12。在一个实施方式中，免疫维持剂是分泌肽或展示肽。
在一个实施方式中，免疫维持剂是新陈代谢转化剂。在一个实施方式中，新陈代谢转化剂是犬尿氨酸消耗途径的至少一种酶。在另一个实施方式中，新陈代谢转化剂是腺苷消耗途径的至少一种酶。在另一个实施方式中，新陈代谢转化剂是精氨酸生物合成途径的至少一种酶。
在一个实施方式中，微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码犬尿氨酸消耗途径的至少一种酶。在一个实施方式中，编码犬尿氨酸消耗途径的至少一种酶的至少一种基因序列是犬尿氨酸酶基因序列。在一个实施方式中，至少一种基因序列是kynU。在一个实施方式中，至少一种基因序列可操作地连接至组成型启动子。在一个实施方式中，编码犬尿氨酸消耗途径的至少一种酶的至少一种基因序列被整合至微生物的染色体中。在另一个实施方式中，编码犬尿氨酸消耗途径的至少一种酶的至少一种基因序列存在于质粒上。在一个实施方式中，微生物包含trpE中的缺失或突变。
在一个实施方式中，微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码腺苷消耗途径的至少一种酶。在一个实施方式中，编码腺苷消耗途径的至少一种酶的至少一种基因序列选自add、xapA、deoD、xdhA、xdhB和xdhC。在一个实施方式中，编码腺苷消耗途径的至少一种酶的至少一种基因序列可操作地连接至由低氧、厌氧或缺氧条件所诱导的启动子。在一个实施方式中，编码腺苷消耗途径的至少一种酶的至少一种基因序列被整合至微生物的染色体中。在另一个实施方式中，所述至少一种基因序列存在于质粒上。在一个实施方式中，修饰微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码用于将腺苷导入微生物的酶。在一个实施方式中，编码用于将腺苷导入微生物的酶的至少一种基因序列是nupC或nupG。
在一个实施方式中，免疫维持剂是精氨酸。在一个实施方式中，微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码精氨酸生物合成途径的至少一种酶。在一个实施方式中，编码精氨酸生物合成途径的至少一种酶的至少一种基因序列包含反馈抗性argA。在一个实施方式中，编码精氨酸生物合成途径的至少一种酶的至少一种基因序列选自以下：argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、argJ、carA和carB。在一个实施方式中，编码精氨酸生物合成途径的至少一种酶的至少一种基因序列可操作地连接至由低氧、厌氧或缺氧条件所诱导的启动子。在一个实施方式中，编码精氨酸生物合成途径的至少一种酶的至少一种基因序列被整合至修饰微生物的染色体中或存在于质粒上。在一个实施方式中，所述微生物还包含精氨酸阻遏基因(argR)中的缺失或突变。
在一个实施方式中，免疫维持剂是STING激动剂。在一个实施方式中，STING激动剂是c-diAMP、c-GAMP或c-diGMP。在另一个实施方式中，修饰微生物包含编码生产STING激动剂的酶的至少一种基因序列。在一个实施方式中，编码免疫维持剂的至少一种基因序列是dacA基因序列。在一个实施方式中，编码免疫维持剂的至少一种基因序列是cGAS基因序列。在一个实施方式中，cGAS基因序列选自人cGAS基因序列、Verminephrobacter eiseniaecGAS基因序列、反硝化金氏菌cGAS基因序列和杆状奈瑟氏菌cGAS基因序列。
在一个实施方式中，免疫引发剂与免疫维持剂是不同的。在一个实施方式中，免疫引发剂是不同于免疫维持剂的。
在一个实施方式中，修饰微生物包含能够生产STING激动剂的酶的至少一种基因序列。在一个实施方式中，编码STING激动剂的至少一种基因序列是dacA基因。在一个实施方式中，编码STING激动剂的至少一种基因序列是cGAS基因。在一个实施方式中，STING激动剂是c-diAMP。在一个实施方式中，STING激动剂是c-GAMP。在一个实施方式中，STING激动剂是c-diGMP。
在一个实施方式中，，所述细菌是基因上的营养缺陷型，当细菌存在于肿瘤中时，所述基因不足(complemented)。在一个实施方式中，当细菌存在于肿瘤中时，不足的基因是dapA基因。在一个实施方式中，dapA基因的表达微调一种或多种免疫引发剂的表达。在一个实施方式中，所述细菌是基因上的营养缺陷型，当细菌存在于肿瘤中时，所述基因是充足(complemented)的。在一个实施方式中，当细菌存在于肿瘤中时充足的基因是thyA基因。
在一个实施方式中，细菌还包含在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一个实施方式中，至少一种基因序列可操作地连接至诱导型启动子。在一个实施方式中，诱导型启动子是由低氧或厌氧条件诱导的。在一个实施方式中，诱导型启动子是由肿瘤的缺氧环境诱导的。在一个实施方式中，启动子是FNR启动子。
在一个实施方式中，至少一种基因序列被整合至细菌的染色体中。在一个实施方式中，至少一种基因序列位于细菌的质粒中。
在一个实施方式中，细胞是非致病性的。在一个实施方式中，细菌是大肠杆菌Nissle。
在一个方面中，本文公开了能够生产效应分子的修饰微生物，其中所述效应分子选自下述：CXCL9、CXCL10、透明质酸酶和SIRPα。
在一个实施方式中，修饰微生物包含编码CXCL9的至少一种基因序列。在一个实施方式中，编码CXCL9的至少一种基因序列连接至诱导型启动子。
在一个实施方式中，修饰微生物包含编码CXCL10的至少一种基因序列。在一个实施方式中，编码CXCL10的至少一种基因序列连接至诱导型启动子。
在一个实施方式中，修饰微生物包含编码透明质酸酶的至少一种基因序列。在一个实施方式中，编码透明质酸酶的至少一种基因序列连接至诱导型启动子。
在一个实施方式中，修饰微生物包含编码SIRPα的至少一种基因序列。在一个实施方式中，编码SIRPα的至少一种基因序列连接至诱导型启动子。
在一个实施方式中，效应分子是分泌的。在另一个实施方式中，效应分子展示在细胞表面上。
在一个方面中，本文公开了能够将5-FC转化为5-FU的修饰微生物。在另一个方面中，本文公开了能够将5-FC转化为5-FU的修饰微生物，其中所述修饰微生物还能够生产STING激动剂。
在一个实施方式中，微生物包含至少一种基因序列，其编码能够将5-FC转化为5-FU的酶。在一个实施方式中，至少一种基因序列是codA。在一个实施方式中，至少一种基因序列是codA::upp融合。在一个实施方式中，至少一种基因序列可操作地连接至诱导型启动子或组成型启动子。在一个实施方式中，诱导型启动子是FNR启动子。在一个实施方式中，至少一种基因序列被整合至微生物的染色体中或存在于质粒上。
在一个实施方式中，能够将5-FC转化为5-FU的微生物还能够生产STING激动剂。在一个实施方式中，STING激动剂是c-diAMP、c-GAMP或c-diGMP。在一个实施方式中，修饰微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码生产STING激动剂的酶。在一个实施方式中，编码生产STING激动剂的酶的至少一种基因序列是dacA基因序列。在一个实施方式中，编码生产STING激动剂的酶的至少一种基因序列是cGAS基因序列。在一个实施方式中，cGAS基因序列是人cGAS基因序列。在一个实施方式中，编码生产STING激动剂的酶的至少一种基因序列可操作地连接至诱导型启动子。在一个实施方式中，诱导型启动子是FNR启动子。在一个实施方式中，编码生产STING激动剂的酶的至少一种基因序列被整合至微生物的染色体中或存在于质粒上。
在另一个方面中，本文公开了能够分泌二聚化IL-12的修饰微生物，其中所述修饰微生物包含基因序列和分泌标签序列，所述基因序列含有通过接头序列与p40 IL-12亚基基因序列连接的p35 IL-12亚基基因序列。在一个实施方式中，分泌标签序列选自下述：SEQID NO:1235、1146-1154、1156和1168。在一个实施方式中，接头序列包含SEQ ID NO:1194。在一个实施方式中，p35 IL-12亚基基因序列包含SEQ ID NO:1192，以及其中p40 IL-12亚基基因序列包含SEQ ID NO:1193。在一个实施方式中，基因序列包含选自下述的序列：SEQID NO:1169-1179。在一个实施方式中，基因序列可操作地连接至诱导型启动子。在一个实施方式中，诱导型启动子是FNR启动子。在一个实施方式中，基因序列被整合至微生物的染色体中或存在于质粒上。
在另一个方面中，本文公开了能够分泌IL-15融合蛋白的修饰微生物，其中所述修饰微生物包含含有与sushi结构域序列融合的IL-15基因序列的序列。在一个实施方式中，所述序列选自下述：SEQ ID NO:1195-1198。
在一个实施方式中，本文公开的修饰微生物是细菌。在一个实施方式中，本文公开的修饰微生物是酵母。在一个实施方式中，修饰微生物是大肠杆菌细菌。在一个实施方式中，修饰微生物是大肠杆菌Nissle细菌。
在一个实施方式中，本文公开的修饰微生物在导致一种或多种营养缺陷的基因中包含至少一种突变或缺失。在一个实施方式中，所述至少一种缺失或突变是在dapA基因和/或thyA基因中。
在一个实施方式中，本文公开的修饰微生物包含噬菌体缺失。
在一个方面中，本文公开了一种组合物，其包含能够生产免疫引发剂的至少第一修饰微生物和能够生产免疫维持剂的至少第二修饰微生物。
在一个方面中，本文公开了一种组合物，其包含免疫维持剂和能够生产免疫引发剂的至少一种修饰微生物。在一个实施方式中，至少一种修饰微生物能够生产免疫引发剂和免疫维持剂两者。在另一个实施方式中，至少一种修饰微生物能够生产免疫引发剂，和至少第二修饰微生物能够生产免疫维持剂。在又一个实施方式中，免疫维持剂不是由组合物中的修饰微生物生产。
在一个方面中，本文公开了一种组合物，其包含免疫引发剂和能够生产免疫维持剂的至少一种修饰微生物。在一个实施方式中，至少一种修饰微生物能够生产免疫引发剂和免疫维持剂两者。在另一个实施方式中，至少一种修饰微生物能够生产免疫维持剂，和至少第二修饰微生物能够生产免疫引发剂。在又一个实施方式中，免疫引发剂不是由组合物中的修饰微生物生产。
在一个实施方式中，免疫引发剂不是精氨酸、TNFα、IFNγ、IFNβ1、GMCSF、抗-CD40抗体、CD40L、激动性抗-OX40抗体、OXO40L、激动性抗-41BB抗体、41BBL、激动性抗-GITR抗体、GITRL、抗-PD1抗体、抗-PDL1抗体和/或天青蛋白。在一个实施方式中，免疫引发剂不是精氨酸。在一个实施方式中，免疫引发剂不是TNFα。在一个实施方式中，免疫引发剂不是IFNγ。在一个实施方式中，免疫引发剂不是IFNβ1。在一个实施方式中，免疫引发剂不是抗-CD40抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂不是CD40L。在一个实施方式中，免疫引发剂不是GMCSF。在一个实施方式中，免疫引发剂不是激动性抗-OXO40抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂不是OXO40L。在一个实施方式中，免疫引发剂不是激动性抗-4-1BB抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂不是4-1BBL。在一个实施方式中，免疫引发剂不是激动性抗-GITR抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂不是GITRL。在一个实施方式中，免疫引发剂不是抗-PD1抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂不是抗-PDL1抗体。在一个实施方式中，免疫引发剂不是天青蛋白。
在一个实施方式中，免疫维持剂不是犬尿氨酸消耗途径的至少一种酶、腺苷消耗途径的至少一种酶、抗-PD1抗体、抗-PDL1抗体、抗-CTLA4抗体、IL-15、IL-15sushi、IFNγ、激动性抗-GITR抗体、GITRL、激动性抗-OX40抗体、OX40L、激动性抗-4-1BB抗体、4-1BBL或IL-12。在一个实施方式中，免疫维持剂不是犬尿氨酸消耗途径的至少一种酶。在一个实施方式中，免疫维持剂不是腺苷消耗途径的至少一种酶。在一个实施方式中，免疫维持剂不是精氨酸。在一个实施方式中，免疫维持剂不是精氨酸生物合成途径的至少一种酶。在一个实施方式中，免疫维持剂不是抗-PD1抗体。在一个实施方式中，免疫维持剂不是抗-PDL1抗体。在一个实施方式中，免疫维持剂不是抗-CTLA4抗体。在一个实施方式中，免疫维持剂不是激动性抗-GITR抗体。在一个实施方式中，免疫维持剂不是GITRL。在一个实施方式中，免疫维持剂不是IL-15。在一个实施方式中，免疫维持剂不是IL-15sushi。在一个实施方式中，免疫维持剂不是IFNγ。在一个实施方式中，免疫维持剂不是激动性抗-OX40抗体。在一个实施方式中，免疫维持剂不是OX40L。在一个实施方式中，免疫维持剂不是激动性抗-4-1BB抗体。在一个实施方式中，免疫维持剂不是4-1BBL。在一个实施方式中，免疫维持剂不是IL-12。
在一个方面中，本文公开了一种药学上可接受的组合物，其包含本文所述的修饰微生物，和药学上可接受的载体。在一个方面中，本文公开了一种药学上可接受的组合物，其包含本文公开的组合物和药学上可接受的载体。在一个实施方式中，配制所述组合物用于瘤内注射。在另一个实施方式中，将药学上可接受的组合物用于治疗患有癌症的受试者。在另一个实施方式中，将药学上可接受的组合物用于在受试者中诱导和调节免疫应答。
在一个方面中，本文公开了一种试剂盒，其包含本文公开的药学上可接受的组合物，及其使用说明书。
在一个方面中，本文公开了一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文公开的药学上可接受的组合物，从而在受试者中治疗癌症。
在一个方面中，本文公开了一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用本文公开的药学上可接受的组合物，从而在受试者中诱导和维持免疫应答。
在一个方面中，本文公开了一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用本文公开的药学上可接受的组合物，从而在受试者中诱导和维持免疫应答。
在另一个方面中，本文公开了一种在患有肿瘤的受试者中诱导远位效应的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的药学上可接受的组合物，从而在受试者中诱导远位效应。
在一个方面中，本文公开了一种在患有肿瘤的受试者中诱导免疫记忆的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的药学上可接受的组合物，从而在受试者中诱导免疫记忆。
在一个方面中，本文公开了一种在受试者中诱导肿瘤的部分消退的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的药学上可接受的组合物，从而在受试者中诱导肿瘤的部分消退。在一个实施方式中，部分消退是肿瘤尺寸缩小至少约10％、至少约25％、至少约50％或至少约75％。
在一个方面中，本文公开了一种在受试者中诱导肿瘤的完全消退的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的药学上可接受的组合物，从而在受试者中诱导肿瘤的完全消退。在一个实施方式中，在施用药学上可接受的组合物后，在受试者中未检测到肿瘤。
在一个方面中，本文公开了一种在受试者中治疗癌症的方法，其包括向受试者施用第一修饰微生物，其中所述第一修饰微生物能够生产免疫引发剂；和向受试者施用第二修饰微生物，其中所述第二修饰微生物能够生产免疫维持剂，从而在受试者中治疗癌症。
在一个方面中，本文公开了一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用第一修饰微生物，其中所述第一修饰微生物能够生产免疫引发剂；和向受试者施用第二修饰微生物，其中所述第二修饰微生物能够生产免疫维持剂，从而在受试者中诱导和维持免疫应答。
在一个实施方式中，施用步骤同时进行。在一个实施方式中，向受试者施用第一修饰微生物发生在向受试者施用第二修饰微生物之前。在一个实施方式中，向受试者施用第二修饰微生物发生在向受试者施用第一修饰微生物之前。
在一个方面中，本文公开了一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用第一修饰微生物，其中所述第一修饰微生物能够生产免疫引发剂；和向受试者施用免疫维持剂，从而在受试者中治疗癌症。
在一个方面中，本文公开了一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用第一修饰微生物，其中所述第一修饰微生物能够生产免疫引发剂；和向受试者施用免疫维持剂，从而在受试者中诱导和维持免疫应答。
在一个实施方式中，施用步骤同时进行。在一个实施方式中，向受试者施用第一修饰微生物发生在向受试者施用免疫维持剂之前。在另一个实施方式中，向受试者施用免疫维持剂发生在向受试者施用第一修饰微生物之前。
在一个方面中，本文公开了一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用免疫引发剂；和向受试者施用第一修饰微生物，其中所述第一修饰微生物能够生产免疫维持剂，从而在受试者中治疗癌症。
在一个方面中，本文公开了一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用免疫引发剂；和向受试者施用第一修饰微生物，其中所述第一修饰微生物能够生产免疫维持剂，从而在受试者中诱导和维持免疫应答。
在一个实施方式中，施用步骤同时进行。在一个实施方式中，向受试者施用第一修饰微生物发生在向受试者施用免疫引发剂之前。在一个实施方式中，向受试者施用免疫引发剂发生在向受试者施用第一修饰微生物之前。
在一个实施方式中，施用是瘤内注射。
因此，本公开提供了组合物，其包含编码一种或多种免疫调节剂的一种或多种修饰细菌。在一些实施方式中，所述免疫调节剂是免疫引发剂，例如其可以调节，例如促进肿瘤裂解、树突状细胞或巨噬细胞的抗原提呈或者T细胞激活或初免。这样的免疫引发剂的实例包括细胞因子或趋化因子，如TNFα、IFN-γ和IFN-β1，单链抗体，如抗-CD40抗体，或(3)配体，如SIRPα或CD40L，代谢酶(生物合成或分解代谢)，如生产STING激动剂的酶，或(5)细胞毒性化疗剂。免疫调节剂(例如，免疫引发剂)可以可操作地连接至不与天然基因序列结合的启动子。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够生产一种或多种STING激动剂，如c-di-AMP、3’3’-cGAMP和/或c-2’3’-cGAMP。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列，如DacA，例如来自单核细胞增多性李斯特氏菌的。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码3’3’-cGAMP合酶的基因序列。本公开内容中描述的3’3’-cGAMP合酶的非限制性实例包括来自Verminephrobacter eiseniae(EF01-2蚯蚓共生体)的3’3’-cGAMP合酶、来自反硝化金氏菌(ATCC 33394)的3’3’-cGAMP合酶和来自杆状奈瑟氏菌(ATCC BAA-1200)的3’3’-cGAMP合酶。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码2’3’-cGAMP合酶的基因序列，如人cGAS。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码共刺激受体激动剂的基因序列，包括但不限于OX40、GITR、41BB。
在一些实施方式中，本公开的组合物包含基因工程化细菌，其包含编码工程化的化疗剂(chemotherapy)的基因序列。工程化的化疗剂的一个实例可以由能够在肿瘤背景下将5-FC转化为5-FU的工程化细菌提供。
在一些实施方式中，所述组合物还包含一种或多种基因工程化微生物，其包含用于生产免疫维持剂的基因序列，所述免疫维持剂可以调节(例如，增强)肿瘤浸润或T细胞应答，或者调节(例如，减轻)免疫抑制。此类维持剂可以选自细胞因子或趋化因子、单链抗体、拮抗性肽或配体以及代谢酶途径。
可以由基因工程化细菌生产的免疫维持细胞因子的实例包括IL-15和CXCL10，其可以分泌到肿瘤微环境中。单链抗体的非限制性实例包括抗-PD-1、抗-PD-L1或抗-CTLA-4，其可以分泌到肿瘤微环境中或者在微生物细胞表面上展示。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码用于一种或多种代谢转化的回路的基因序列，即细菌能够进行一种或多种酶催化反应，其性质上可以是生物合成或分解代谢。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌能够生产调节(例如，促进或有助于)免疫引发和/或免疫维持的代谢产物，或者能够消耗调节(例如，促进)免疫抑制的代谢产物。例如，在一些实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述细菌能够消耗免疫抑制性代谢产物犬尿氨酸，例如通过表达犬尿氨酸酶，例如来自荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)的。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷分解代谢途径和任选地腺苷转运蛋白的基因序列，并且能够破坏肿瘤微环境内促进肿瘤生长的代谢产物腺苷。在其他实施方式中，基因工程化细菌能够生产精氨酸(T细胞激活和初免的刺激剂)。在一些实施方式中，所述细菌能够在肿瘤微环境中消耗氨，从而减少了支持肿瘤生长的氮的获取。
在任何这些组合物中，与用于生产免疫调节剂(例如，免疫引发剂和/或免疫维持剂)的基因序列可操作地连接的启动子可以是诱导型启动子。在一些实施方式中，启动子由低氧或厌氧条件(如肿瘤的缺氧环境)诱导。本公开的此类低氧诱导型启动子的非限制性实例包括FNR-诱导型启动子、ANR-诱导型启动子和DNR-诱导型启动子。在一些实施方式中，与用于生产免疫调节剂(例如，免疫引发剂和/或免疫维持剂)的基因序列可操作地连接的启动子是由正常情况下在肿瘤中不存在的化学诱导剂直接或间接诱导的。在一些实施方式中，启动子是在体外发酵过程中在适宜的生长容器中诱导的。在一些实施方式中，化学诱导剂选自四环素、IPTG、阿拉伯糖、cumate和水杨酸。
在一些实施方式中，所述组合物包含针对特定代谢产物是营养缺陷型的细菌，例如细菌基因上的营养缺陷型，当微生物在肿瘤中存在时，所述基因不足。在一些实施方式中，细菌是在DapA基因中的营养缺陷型。在一些实施方式中，所述组合物包含针对特定代谢产物是营养缺陷型的细菌，例如细菌是在基因上的营养缺陷型，当微生物在肿瘤中存在时，所述基因不足。在一些实施方式中，细菌是在ThyA基因中的营养缺陷型。在一些实施方式中细菌是在TrpE基因中的营养缺陷型。
在一些实施方式中，细菌是革兰氏阳性细菌。在一些实施方式中，细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，细菌是专性厌氧细菌。在一些实施方式中，细菌是兼性厌氧细菌。本公开中涉及的细菌的非限制性实例包括诺维梭菌(Clostridium novyi NT)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。在一些实施方式中，细菌选自大肠杆菌Nissle和大肠杆菌K-12。
在一些实施方式中，细菌包含抗生素抗性基因序列。在一些实施方式中，编码免疫调节剂的一种或多种基因序列存在于染色体上。在一些实施方式中，编码免疫调节剂的一种或多种基因序列存在于质粒上。
另外，提供了药物组合物，其还包含一种或多种免疫检查点抑制剂，如CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。此类检查点抑制剂可以与基因工程化细菌联合、顺序或同时施用。
另外，提供了药物组合物，其还包含一种或多种共刺激受体的激动剂，如OX40、GITR和/或41BB，包括但不限于激动性分子，如能够与共刺激受体结合的配体或激动性抗体如OX40、GITR和/或41BB。此类激动性分子可以与基因工程化细菌联合、顺序或同时施用。
在任何这些实施方式中，可以将工程化细菌与常规癌症疗法联用，如手术、化疗、靶向疗法、放疗、断层疗法、免疫疗法、癌症疫苗、激素疗法、热疗、干细胞移植(外周血、骨髓和脐带血移植)、光动力疗法、疗法和血制品捐赠和输血以及溶瘤病毒。在任何这些实施方式中，工程化细菌可以生产一种或多种细胞毒素或裂解肽。在任何这些实施方式中，可以将工程化细菌用于与癌症或肿瘤疫苗联用。
在一个实施方式中，本文公开了一种修饰细菌，其包含至少一种免疫引发剂，其中所述免疫引发剂能够生产干扰素基因(STING)激动剂的刺激剂。
附图说明
图1描绘了显示在抗原提呈细胞中的STING途径的示意图。
图2描绘了柱状图，显示通过LC/MS测量的体外胞外和胞内环-二-AMP累积(SYN3527)。在不含有dacA表达构建体的对照菌株中未测量到环-二-AMP累积。
图3描绘了柱状图，显示SYN3527诱导后的环-二-AMP产生。
图4A和图4B描绘了在用活细菌(图4A)和热杀灭细菌(图4B)处理的RAW 267.4细胞中相对IFNb1 mRNA表达。SYN＝链霉素抗性Nissle。SYN-STING＝包含p15-ptet-DacA(来自细胞增多性李斯特氏菌)的SYN3527。
图5A和图5B描绘了图，显示在用SYN3527(包含来自细胞增多性李斯特氏菌的四环素诱导型DacA)刺激后4小时的WT或TLR4-/-小鼠骨髓来源的树突状细胞培养物中INF-b1生产(图5A)或IFN-b1 mRNA表达(图5B)。SYN3527是未经诱导的(“STING-UN”)或在实验前使用四环素诱导的“STING-IN”。TLR4-/-细胞不能对LPS产生应答。未诱导细菌的IFNb的水平低至阴性表明IFNb的诱导取决于STING激动剂的表达。在WT和TLR4-/-中观察到相似水平的IFNb诱导，表明STING激动剂介导的IFNb诱导不依赖于LPS/TLR4。图5C和图5D描绘了图，显示在用SYN3527(包含来自细胞增多性李斯特氏菌的四环素诱导型DacA)刺激后4小时的WT或TLR4-/-小鼠骨髓来源的树突状细胞中IL-6 mRNA表达(图5C)或CD80 mRNA表达(图5D)。SYN3527是未经诱导的(“STING-UN”)或在实验前使用四环素诱导的“STING-IN”。TLR4-/-细胞不能对LPS产生应答。与未经诱导的或SYN94相比，在暴露于诱导的SYN3527后，IL-6和CD80的水平相似，表明LPS/TLR4信号传导可能导致了引起IL-6和CD80上调的大部分信号。
图6A和图6B描绘了在4小时(图6A)以及在4小时和在45min(图6B)在不同感染复数(MOI)下STING激动剂生产菌株对在RAW 264.7细胞中诱导IFN-β1的活性的体外分析的线图，并且表明SYN3527(包含四环素诱导型dacA构建体)在RAW 264.7细胞(永生化的鼠巨噬细胞系)中驱动了剂量依赖性的IFN-β1诱导。简言之，将细菌(WT Nissle(在图中标记为“SYN”))或SYN3527(在图中标记为“SYN-STING”；包含来自细胞增多性李斯特氏菌的四环素诱导型DacA)以不同的感染复数(MOI)与0.5x106个RAW 264.7细胞共培养。SYN3527是未经诱导的或在实验前如所示的使用四环素诱导的。如所示的将共培养物孵育4小时或45分钟并对蛋白提取物进行分析。
图7A描绘了显示体内小鼠研究的概况的示意图，其结果示于图7B和图7C。图7B描绘了显示植入B16-F10肿瘤并用盐水、SYN94(链霉素抗性野生型Nissle)或SYN3527(包含四环素诱导型dacA构建体)处理的小鼠的平均肿瘤体积的线图。图7C描绘了显示研究中的个体小鼠的肿瘤体积的线图。图7D描绘了显示在第9天的肿瘤重量的图。图7E描绘了显示通过流式细胞术测量的在第9天在肿瘤引流淋巴结中的总T细胞数。图7F描绘了显示CD4(常规)和CD8T细胞亚组中的激活的(CD44高)T细胞的百分比的图，图7G描绘了显示通过流式细胞术测量的在第9天在肿瘤引流淋巴结中STING注射后缺乏Treg的激活的图。图7H描绘了显示肿瘤定植的图。N.D.＝未检测。
图8A和图8B描绘了柱状图，显示与用盐水或链霉素抗性Nissle处理的小鼠相比，tet-诱导型STING激动剂生产菌株SYN3527施用和诱导后，在第2天(图8A)或第9天(图8B)时通过Luminex小珠测定所测量的在B16肿瘤中的IFN-b1浓度。
图9A、图9B和图9C显示了用SYN-STING处理的B16F10肿瘤的细胞因子动力学分析。如本文所述对B16F10肿瘤进行处理，并在治疗开始后2天和9天收集肿瘤队列(cohort)。将肿瘤匀浆，用蛋白酶抑制剂处理并冷冻以备将来分析之用。利用定制的Luminex细胞因子阵列对解冻的匀浆物进行分析。图9A中的小图显示了提示固有免疫细胞应答的细胞因子，其应答于SYN-STING处理而显示上调。图9B和图9C中的小图显示了与细胞溶解和激活的效应T细胞相关的细胞因子。图9D中的小图显示了应答于细菌注射而上调的细胞因子。使用针对队列内多重T检验比较实验组调整的Holm-Sidak法确定统计学显著性。与盐水组比较；*P<0.05，**P<0.005。与SYN(WT)比较；#P<0.05。图9A描绘了柱状图，其显示与用盐水或链霉素抗性Nissle处理的小鼠相比，在tet诱导型STING激动剂产生菌株SYN3527的施用和诱导后，在第2天和第9天通过Luminex小珠测定测量的B16肿瘤中的IL-6(左小图)、IL-1β(中小图)和MCP-1(右小图)的浓度。图9B描绘了柱状图，其显示与用盐水或链霉素抗性Nissle处理的小鼠相比，在tet诱导型STING激动剂产生菌株SYN3527的施用和诱导后，在第2天和第9天通过Luminex小珠测定测量的B16肿瘤中的颗粒酶B(左小图)、IL-2(中小图)和IL-15(右小图)的浓度。图9C描绘了柱状图，其显示与用盐水或链霉素抗性Nissle处理的小鼠相比，在tet诱导型STING激动剂产生菌株SYN3527的施用和诱导后，在第2天和第9天通过Luminex小珠测定测量的B16肿瘤中的IFNg(上小图)和IL-12p70(下小图)的浓度。图9D描绘了柱状图，其显示与用盐水或链霉素抗性Nissle处理的小鼠相比，在tet诱导型STING激动剂产生菌株SYN3527的施用和诱导后，在第2天和第9天通过Luminex小珠测定测量的B16肿瘤中的TNF-a(上小图)和GM-CSF(下小图)的浓度。在图9A、图9B和图9C中，每个小图中的柱以与图9A和图9B中相同的顺序排列，即盐水(左)、链霉素抗性野生型Nissle(中)和SYN3527(SYN-STING，右)。
图10A、图10B和图10C描述了显示与树突状细胞(DC)和巨噬细胞共培养后SYN-STING(SYN3527)活性的体外分析的图。简言之，评估了在抗原提呈细胞群中SYN-STING激活STING途径的能力。将细菌(WT Nissle或SYN3527(包含来自细胞增多性李斯特氏菌的四环素诱导型DacA))以不同感染复数(MOI)与0.5x106个RAW 264.7细胞(永生化的鼠巨噬细胞系)或鼠骨髓来源DC共培养。SYN3527是未经诱导的(“STINGun”)或在实验前使用四环素诱导的“STINGin”。如所示的，将共培养物孵育2或4小时并对蛋白提取物进行分析，或收集mRNA以通过定量PCR测量IFNβ1基因诱导。图10A和图10B描述了显示在刺激后4小时(图10A)或者刺激后2和4小时(图10B)在小鼠骨髓来源的树突状细胞中IFNβ1(图10A)或IFN-b1mRNA诱导(图10B)的图。图10C描绘了2小时时在RAW 264.7细胞中平均IFNβ1基因诱导(mRNA水平)。在60℃下进行30min产生热杀灭细菌。平均Ctrl＝对照PBS；LPS＝100ng/mL脂多糖。所有信号均标准化至PBS处理对照。
图11描绘了线图，其显示在三个不同剂量下(1X10^7、5X10^7和1X10^8)STING激动剂生产菌株对肿瘤体积随着时间变化的影响的体内分析，并且表明SYN3527(包含四环素诱导型细胞增多性李斯特氏菌dacA构建体)在A20淋巴瘤模型中驱动剂量依赖性肿瘤控制。
图12A、图12B、图12C和图12D描绘了显示用于图11中所示研究的各个个体小鼠的线图。
图13描绘了显示由SYN3527(WT Tet-STING)引起的完全消退导致在A20肿瘤模型中的长期免疫记忆的线图。与天然
Figure BDA0002364453000000221
对照相反的是，在此前用SYN3527处理且显示出完全消退的动物中，二次植入物被完全排斥。图显示了所示实验组的每个肿瘤测量结果。
图14A描绘了本公开内容的非限制性实例的示意图，其中微生物被基因工程化以表达编码用于生产STING激动剂的一种或多种酶的基因序列以及另外地用于表达犬尿氨酸消耗酶的一种或多种基因序列。用于生产STING激动剂的此类酶的非限制性实例包括dacA，例如来自细胞增多性李斯特氏菌。此类犬尿氨酸消耗酶的非限制性实例包括犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶)。更一般地，可以将免疫引发剂回路(STING激动剂生产者或本文所述的其他物质)与免疫维持剂回路(例如，犬尿氨酸消耗剂或本文所述的其他物质)联用。图14B描绘了显示本公开内容的一个实施方式的图的示意图，其中经基因工程化以表达免疫引发剂回路(STING激动剂)和免疫维持剂回路(犬尿氨酸回路)的微生物首先产生高水平的免疫刺激剂(STING激动剂生产酶，例如DacA，例如来自细胞增多性李斯特氏菌)并且在随后的时间点产生免疫维持剂(犬尿氨酸酶，例如来自荧光假单胞菌)。在一些实施方式中，免疫引发剂(在该情况下，STING激动剂生产酶，例如dacA)的表达是由诱导剂诱导的。在一些实施方式中，免疫维持剂(在该情况下，犬尿氨酸酶)是由诱导剂诱导的。在一些实施方式中，免疫引发剂(STING激动剂生产酶，例如dacA)和免疫维持剂(例如，犬尿氨酸酶)均是由一种或多种诱导剂诱导的。诱导剂#1(例如，诱导免疫引发剂dacA表达)和诱导剂#2(例如，诱导免疫维持剂犬尿氨酸酶表达)可以是相同的或不同的诱导剂。诱导剂#1和诱导剂#2可以顺序或同时施用。诱导剂的非限制性实例包括肠道或肿瘤微环境的体内条件(例如，低氧、某些营养物等)、体外生长条件或化学诱导剂(例如，阿拉伯糖、cumate和水杨酸、IPTG或本文所述的其他化学诱导剂)。在其他实施方式中，免疫引发剂(例如，STING激动剂生产酶，例如dacA)和免疫维持剂(例如，犬尿氨酸酶)由组成型启动子驱动，包括但不限于本文所述的那些。在一些实施方式中，免疫引发剂(例如，STING激动剂生产酶，例如dacA)由诱导型启动子驱动和免疫维持剂(例如，犬尿氨酸酶)由组成型启动子驱动。在一些实施方式中，免疫引发剂(例如，STING激动剂生产酶，例如dacA)由组成型启动子驱动和免疫维持剂(例如，犬尿氨酸酶)由诱导型启动子驱动。在一些实施方式中，这两个回路都可以整合至细菌染色体中。在一些实施方式中，这两个回路都可以存在于质粒上。在一些实施方式中，这两个回路都可以存在于质粒上。在一些实施方式中，一个回路可以整合至细菌染色体中，另一个回路可以存在于质粒上。
在又一个实施方式中，表达STING激动剂生产回路(例如，dacA)的基因工程化细菌的一个或多个菌株与表达犬尿氨酸消耗回路(例如，犬尿氨酸酶)的基因工程化细菌的一个或多个单独的菌株可以顺序施用，例如STING激动剂生产剂(免疫刺激剂)可以在犬尿氨酸消耗剂(免疫维持剂)之前施用。更一般地，可以将用于免疫引发的细菌菌株表达回路与用于免疫维持的单独细菌菌株表达回路联用，例如免疫引发剂菌株可以在免疫维持剂菌株之前施用。例如，用于免疫引发的细菌菌株表达回路(例如，免疫引发剂菌株)可以在用于免疫维持的单独细菌菌株表达回路之前施用。或者，用于免疫引发的细菌菌株表达回路(例如，免疫引发剂菌株)可以在用于免疫维持的单独细菌菌株表达回路之后施用。在又一个实施方式中，用于免疫引发的细菌菌株表达回路(例如，免疫引发剂菌株)可以与用于免疫维持的单独细菌菌株表达回路同时施用。
图15描绘了示意图，显示本公开的基因工程化细菌如何可以通过在免疫缺陷中补充基质以实现宽抗肿瘤活性来转化肿瘤微环境。
图16描绘了示意图，显示用于改善的抗肿瘤活性的机制组合。
图17A和图17B描绘了柱状图，显示STING激动剂生产者SN3527、犬尿氨酸消耗者SYN2028以及组合菌株(STING激动剂生产者加犬尿氨酸消耗者)SYN3831的环-二-AMP生产(图17A)和犬尿氨酸消耗(图17B)。
图18A描绘了图，显示如所示的在72小时时间段内在CT26肿瘤中营养缺陷型突变体ΔUraA、ΔThyA和ΔDapA的生长(CFU/克肿瘤组织)。图18B和图18C描绘了图，显示如所示的在72小时时间段内在B16F10(图18B)和EL4(图18C)肿瘤中与野生型E.coli Nissle(SYN94)相比营养缺陷型突变体ΔThyA(SYN1605)的生长(CFU/克肿瘤组织)。
图19A描绘了线图，显示与盐水对照相比在B16F10模型中在两个不同剂量下(1e7和1e8 CFU)SYN4023(包含四环素诱导型细胞增多性李斯特氏菌dacA构建体和ΔDapA突变)对肿瘤生长(中位肿瘤体积)随时间变化的影响的体内分析。图19B、图19C和图19D描绘了线图，显示用于图19A中所示研究的各个个体小鼠。
图20A和图20B描绘了图，显示如所示的在不同时间点在植入B16F10肿瘤并且随后用1e7 CFU SYN3527(dacA，给药后4小时使用四环素诱导)、1e7 CFU SYN3527(dacA，未进行诱导)、1e8 CFU SYN4023(dacA和ΔDapA，诱导)、SYN94(未修饰的细菌)或盐水作为对照处理的小鼠血液中与脓毒症和细胞因子风暴相关的细胞因子IL-1β(图20A)和TNF-α(图20B)的浓度。包括LPS处理作为脓毒症的阳性对照。图20C和图20D描绘了图，显示如所示在不同时间点在肿瘤中c-di-AMP浓度(图20C)或CFU计数(图20D)。
图21A描绘了体内分析的线图，显示在A20肿瘤模型中SYN4023(包含四环素诱导型细胞增多性李斯特氏菌dacA构建体和ΔDapA突变)与盐水注射对照相比对肿瘤生长(中位肿瘤体积)的影响。图21B和图21C描绘了线图，显示用于图21A中所示研究的各个个体小鼠。
图22A描绘了体内分析的线图，显示与对照或单一药剂(SYN4023、抗-ox40、抗-41BB或抗-GITR抗体加盐水)相比在B16F10模型中SYN4023(DAP-STING，包含四环素诱导型细胞增多性李斯特氏菌dacA构建体和ΔDapA突变)单独或与免疫刺激剂(激动性抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体)联用对肿瘤中位体积随时间变化的影响。图22B、图22C、图22D、图22E、图22F、图22G和图22H描绘了线图，显示用于图22A中所示研究的各个个体小鼠。
图23A描绘了线图，显示在A20肿瘤模型中SYN4023(包含tet诱导型dacA和ΔdapA)与瘤内注射的抗-OX40抗体联用能够激发远位效应。显示了每个治疗组的平均中位肿瘤体积。图的右侧显示了已治疗/已注射的肿瘤，而左侧显示了未接受治疗(未注射)的肿瘤。图23B和图23C描述了线图，显示随时间变化每只小鼠(图23B中为天然小鼠，和图23C中为用SYN4023处理的小鼠)的肿瘤体积。图23D描绘了显示在图23A所示的研究期间小鼠存活的图。图23E描绘了显示在研究期间平均体重的图。图23F描绘了显示再挑战研究结果的线图，其中在此前用SYN4023处理的小鼠(如图23A-23E中所示，并且在至少30天的监测中已显示出完全消退)中植入A20肿瘤(在左侧腹侧)和CT26肿瘤(在右侧腹侧)并与植入相同肿瘤的年龄匹配的天然小鼠进行比较。显示了每个治疗组的平均中位肿瘤体积。图23G和图23H描绘了线图，显示随着时间的推移图23F所示研究的各个个体小鼠的肿瘤体积(图23G中为天然小鼠，和图23H中为此前用SYN4023处理的小鼠)。图23I描绘了显示整个2部分研究的图，涉及远位效应和免疫记忆潜能(描绘了使用A20再挑战)的图。图中显示了所示实验组的每个肿瘤测量。
图24描绘了柱状图，显示如所示的在1和16小时在存在或不存在诱导剂的情况下在B16肿瘤模型中使用ATC、阿司匹林、cumate和低氧(FNR)诱导型启动子达到的GFP表达水平的体内分析。在回收的所有细菌中(RFP+)诱导(GFP+)细菌的百分比。
图25显示了针对图24中所述分析的GFP+/RFP+细菌通过几何平均荧光强度(MFI)测量的基因表达水平。
图26A、图26B、图26C和图26D描绘了体内分析中每只小鼠的线图，显示在三个不同剂量下(1e7(图26B)、1e8(图26C)和1e9(图26D))随着时间的推移STING激动剂生产菌株SYN4449对B16-F10肿瘤体积的影响，并且表明以1e9剂量施用SYN4449导致在B16.F10肿瘤模型中在该时间段内肿瘤生长排斥或控制。图26A描绘了用盐水对照处理的每只小鼠的线图。
图27A、图27B和图27C描绘了体内分析中每只小鼠的线图，显示在三个不同剂量下(1e6、1e7和1e8)随着时间的推移STING激动剂生产菌株SYN4449对肿瘤体积的影响，并且表明SYN4449(包含基于质粒的FNR-dacA和ΔDapA)在A20淋巴瘤模型中驱动剂量依赖性肿瘤控制。CR＝完全应答。图27D描绘了用盐水对照处理的每只小鼠的线图。
图28A描绘了柱状图，显示与SYN94(链霉素抗性Nissle)相比在质粒上包含dapA突变和FNR-dacA的SYN4449(ΔDAP，15A-fnr-dacA)，表明SYN4449产生c-di-AMP。图28B和图28C描绘了柱状图，显示与SYN94相比SYN4910(图28B)和SYN4939(图28C)在体外产生c-diAMP。图28D描绘了柱状图，显示在0、2和4小时SYN2306、SYN4939和SYN94体外犬尿氨酸消耗的比较。SYN4910包含噬菌体缺失、DAPA营养缺陷、ThyA营养缺陷和在HA9/10位点整合的FNR-DacA(ΔΦ，ΔDAP，ΔThyA，HA9/10::fnr-DacA)。SYN4939(c-diAMP生产和犬尿氨酸消耗联合菌株)包含染色体整合的在组成型启动子控制下的犬尿氨酸酶、TrpE缺失、噬菌体缺失、DapA营养缺陷和ThyA营养缺陷以及在HA9/10位点整合的FNR-DacA(PSynJ23119-pKYNase，ΔTrpE，ΔΦ，ΔDAP，ΔThyA，HA9/10::fnr-DacA)。SYN2306包含组成型表达的犬尿氨酸酶(荧光假单胞菌)和TrpE缺失(HA3/4::PSynJ23119-pKYNaseΔTrpE)。SYN94对照：链霉素抗性Nissle。
图29A和图29B描绘了柱状图，显示SYN4739(图29A)或SYN4939(图29B)与SYN94(链霉素抗性Nissle)的体外c-diAMP生产的比较。图29C和图29D描绘了柱状图，显示在0、2和4小时SYN2028和SYN4739(图29C)或SYN2306和SYN4939(图29D)与SYN94体外犬尿氨酸消耗的比较。SYN4739包含组成型表达的来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶、TrpE缺失和ThyA营养缺陷(HA3/4::PSynJ23119-pKYNase，ΔTrpE，ΔThyA，HA9/10::fnr-DacA)。SYN4939(c-diAMP生产和犬尿氨酸消耗联合菌株)包含染色体整合的在组成型启动子控制下的犬尿氨酸酶、TrpE缺失、噬菌体缺失、DAPA营养缺陷和ThyA营养缺陷以及在HA9/10位点整合的FNR-DacA(PSynJ23119-pKYNase，ΔTrpE，ΔΦ，ΔDAP，ΔThyA，HA9/10::fnr-DacA)。SYN2028包含染色体整合的在组成型启动子控制下的来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶和TrpE缺失(HA3/4::PSynJ23119-pKYNaseΔTrpE)。SYN2306包含组成型表达的犬尿氨酸酶(荧光假单胞菌)和TrpE缺失(HA3/4::PSynJ23119-pKYNaseΔTrpE)。SYN94：链霉素抗性Nissle。
图30和图31描绘了柱状图，显示在SYN2306、SYN4789、SYN4939和SYN94之间在0、2和4小时体外c-diAMP生产和体外犬尿氨酸消耗的比较。SYN2306包含组成型表达的犬尿氨酸酶(荧光假单胞菌)和TrpE缺失(HA3/4::PSynJ23119-pKYNaseΔTrpE)。SYN94：链霉素抗性Nissle。SYN4789包含组成型表达的来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶、TrpE缺失和ThyA营养缺陷(HA3/4::PSynJ23119-pKYNase，ΔTrpE，ΔThyA，HA9/10::fnr-DacA)。SYN4939(c-diAMP生产和犬尿氨酸消耗联合菌株)包含染色体整合的在组成型启动子控制下的犬尿氨酸酶、TrpE缺失、噬菌体缺失、DAPA营养缺陷和ThyA营养缺陷以及在HA9/10位点整合的FNR-DacA(PSynJ23119-pKYNase，ΔTrpE，ΔΦ，ΔDAP，ΔThyA，HA9/10::fnr-DacA)。SYN94：链霉素抗性Nissle。
图32描绘了在4小时在不同感染复数(MOI)下在RAW 264.7细胞中STING激动剂生产菌株SYN4737对IFN-β1诱导的活性的体外分析的线图，表明SYN4737(包含噬菌体缺失、DAPA营养缺陷和在HA9/10位点整合的FNR-DacA(ΔΦ，ΔDAP，HA9/10::fnr-DacA))在RAW264.7细胞(永生化的鼠巨噬细胞系)中驱动剂量依赖性IFN-β1诱导。简言之，在厌氧室中将细菌(WT Nissle(在图中标记为“SYN”))或SYN4737预孵育4小时以诱导STING激动剂合成，然后在不同感染复数(MOI)下与0.5x106个RAW 264.7细胞共同孵育4小时，并分析在RAW264.7细胞上清液中存在的蛋白。
图33A和图33B描绘了图，显示包含cGAS直系同源物(推定的cGAMP合酶)的各种菌株的c-di-AMP和细菌cGAMP体外产生。
图34A和图34B描绘了柱状图，显示大肠杆菌Nissle菌株SYN3529(Nissle p15APtet-CodA)和SYN3620(Nissle p15A Ptet-CodA::Upp融合)将5-FC转化为5-FU的能力。该图显示在2小时的测定时间后的5-FC水平(图34A)和5-FU水平(图34B)。
图35A描绘了显示体内小鼠研究的概况的示意图，其结果示于图35B、图35C、图35D和图35E。图35B描绘了线图，显示植入B16-F10肿瘤并用PBS、SYN3620(包含pUC-Kan-tet-CodA::Upp融合)或SYN3529(包含pUC-Kan-tet-CodA(胞嘧啶脱氨酶))处理的小鼠的平均肿瘤体积。图35C描绘了显示研究中的个体小鼠的肿瘤体积的线图。图35D描绘了显示第6天的肿瘤重量的图。图35E描绘了显示通过质谱法测量的第6天的5-FC的肿瘤内浓度的图。
图36A描绘了显示体内小鼠研究的概况的示意图，其结果示于图36B和36C中。图36B描绘了显示通过菌落形成单位(CFU)测量的肿瘤的细菌定植的图。图36C描绘了图，显示通过流式细胞术测量的在第8天通过从CT26肿瘤分离的肿瘤内淋巴细胞的指示免疫细胞群的中值平均荧光强度(MFI)测量的CCR7(左)或CD40(右)的相对表达。
图37描绘了显示基于细胞的测定的结果的图，其显示在用TNFα分泌者SYN2304(PAL::Cm p15a TetR Ptet-phoA TNFα)、母体对照SYN1557和重组IL-15对照的上清液处理后HeLa细胞中的IkappaBalpha降解。
图38A描绘了显示体内小鼠研究的概况的示意图，其结果示于图38B-38D中。图38B描绘了显示通过菌落形成单位(CFU)测量的肿瘤的细菌定植的图。图38C描绘了显示通过ELISA测量的CT26肿瘤中TNFα的相对浓度的图。图38D描绘了线图，显示植入CT26肿瘤并用SYN(DOM突变体)或SYN-TNFα(包含PAL::CM p15a TetR Ptet-PhoA-TNFα)处理的小鼠的平均肿瘤体积。
图39A和图39B描绘了显示基于细胞的测定的结果的图，其显示在用IFNγ分泌者SYN3543(PAL::Cm p15a Ptet-87K PhoA-mIFNg)、母体对照SYN1557和重组IL-15对照的上清液处理后小鼠RAW264.7细胞中的STAT1磷酸化。
图40A描绘了显示体内小鼠研究的概况的示意图，其结果示于图40B和40C中。图40B描绘了显示通过菌落形成单位(CFU)测量的肿瘤的细菌定植的图。图40C描绘了显示通过ELISA测量的CT26肿瘤中IFNγ的相对浓度的图。
图41描绘了在氧气存在(+O2)或不存在(-O2)的情况下，在诱导(+ATC)和非诱导(-ATC)条件下，由链霉素抗性Nissle(SYN-UCD103)、SYN-UCD205和SYN-UCD204产生的体外精氨酸水平的柱状图。SYN-UCD103是对照Nissle构建体。SYN-UCD205包含在低拷贝质粒上在FNR诱导型启动子的控制下表达的ΔArgR和argAfbr。SYN-UCD204包含在低拷贝质粒上在四环素诱导型启动子的控制下表达的ΔArgR和argAfbr。
图42A和图42B描绘了在厌氧诱导后的各个时间点的培养基中的氨水平的柱状图。图42A描绘了在0、30、60和120分钟测量的SYN-UCD205、SYN-UCD206和SYN-UCD301的精氨酸生产的水平的柱状图。图42B描绘了SYN-UCD204(包含低拷贝质粒上的ΔArgR、PfnrS-ArgAfbr和野生型ThyA)、SYN-UCD301、SYN-UCD302和SYN-UCD303(其全部三个均包含整合的FNR-ArgAfbr构建体；SYN-UCD301包含ΔArgR和wtThyA；SYN-302和SYN-UCD303均包含ΔArgR和ΔThyA，分别具有氯霉素或卡那霉素抗性)的精氨酸生产的水平的柱状图。结果表明，FNR ArgA fbr的染色体整合导致相似水平的精氨酸生产，如用表达相同构建体的低拷贝质粒菌株所见。
图43描绘了线图，显示对具有由malEK基因座处的fnr诱导型启动子驱动的ArgAfbr的染色体插入和具有ΔArgR和ΔThyA及无抗生素抗性的工程化细菌菌株中的体外功效(从氨产生精氨酸)进行评估(SYN-UCD303)。链霉素抗性大肠杆菌Nissle(Nissle)用作参比。
图44A描绘了显示在40A、40B、40C、44E和44F所示的研究的施用方案的图。图44B、44C、44D、44E和44F描绘了各个个体小鼠中化学治疗剂环磷酰胺(非清髓化疗，预调理)和精氨酸生产菌株(SYN-UCD304；整合的FNR-ArgAfbr构建体；ΔArgR，图44E)或犬尿氨酸消耗菌株(SYN2028，图44F)的组合处理对肿瘤体积的影响的体内分析。将组合处理的效果与单独的载剂(图44B)、单独的环磷酰胺(图44C)，或SYN94(链霉素抗性野生型Nissle，图44D)的处理进行比较。数据表明产生精氨酸和消耗犬尿氨酸的菌株与环磷酰胺组合的抗肿瘤活性。在该研究中，BALB/c小鼠被植入CT26肿瘤；环磷酰胺(CP)以100mg/kg IP施用；细菌以1×10e7(在100ul体积中)肿瘤内施用。施用方案如图44A所示。
图45A和图45B描绘了人T细胞Transwell测定的结果，其中在SYN细菌上清液中添加以各种浓度稀释的SYN-CXCL10上清液后，通过流式细胞术测量迁移细胞的数量。将抗CXCR3加入到含有100％SYN-CXCL10上清液的对照孔中，以验证迁移对CXCL10-CXCR3途径的特异性。图45A描绘了迁移细胞的总数。图45B描绘了相对于无细胞因子对照的迁移。
图46描绘了显示基于细胞的测定的结果的线图，其显示在用IL-15分泌者SYN3525(PAL::Cm p15a Ptet-PpiA(ECOLIN_18620)-IL-15-Sushi)、母体对照SYN1557和重组IL-15对照的上清液处理后CD3+IL15RAalpha+T细胞中的STAT5磷酸化。
图47描绘了显示菌株SYN1565(包括PfnrS-nupC)、SYN1584(包括PfnrS-nupC；PfnrS-xdhABC)、SYN1655(包括PfnrS-nupC；PfnrS-add-xapA-deoD)和SYN1656(包括PfnrS-nupC；PfnrS-xdhABC；PfnrS-add-xapA-deoD)可以体外降解腺苷，即使在葡萄糖存在时的柱状图。
图48描绘了显示在底物限制条件下在1um腺苷的存在下(其对应于体内肿瘤环境中预期的腺苷水平)的腺苷降解的柱状图。结果显示低浓度的激活的SYN1656(1e6个细胞)(以及所描绘的其他菌株)能够将腺苷降解至低于定量限。
图49描绘了通过工程化大肠杆菌Nissle(SYN1656)进行的腺苷消耗单独或与抗PD-1组合对肿瘤体积的效果的体内分析的线图。数据表明消耗腺苷的菌株作为单一药剂和与aPD-1组合的抗肿瘤活性。
图50A和图50B描绘了显示腺苷消耗菌株SYN1656(SYN-Ade)与抗-PD-1/抗-CTLA4混合物联用激发较高数量肿瘤排斥的图。为了考察SYN1656与抗-PD-1/抗-CTLA4检查点抑制剂联用的抗肿瘤活性，在C57BL6小鼠中建立了MC38肿瘤。当肿瘤尺寸为60-80mm3时，每两周一次瘤内给予动物盐水对照，腹腔内给予动物抗-PD-1和抗-CTLA4抗体混合物(分别为10和5mg/kg)或者使用未经修饰的细菌(SYN)或SYN1656(SYN-Ade)与抗-PD-1/抗-CTLA4的组合，并且每周两次评估肿瘤体积。图50A描绘了中位肿瘤体积和图50B描绘了使用<2000mm3作为存活替代指标随着时间的推移仍在研究中的动物的百分比；图50C、图50、图50E和图50F描绘了显示每个治疗组的每只动物肿瘤体积的图。
图51描绘了显示在补充有75uM犬尿氨酸的M9培养基中原始和ALE进化犬尿氨酸酶表达菌株的犬尿氨酸消耗速率的柱状图。菌株标记如下：SYN1404：包含Trp:E中的缺失和在四环素诱导型启动子控制下表达来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的中等拷贝质粒的大肠杆菌Nissle(Nissle delta TrpE::CmR+Ptet-Pseudomonas KYNU p15a KanR)；SYN2027：包含Trp:E中的缺失和在在HA3/4位点处整合到基因组中的组成型启动子(内源性lpp启动子)的控制下表达来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的大肠杆菌Nissle(HA3/4::Plpp-pKYNaseKanR TrpE::CmR)；SYN2028：包含Trp:E中的缺失和在在HA3/4位点处整合到基因组中的组成型启动子(合成J23119启动子)的控制下表达来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的大肠杆菌Nissle(HA3/4::PSynJ23119-pKYNase KanR TrpE::CmR)；SYN2027-R1：源自ALE的第一进化菌株，衍生自母体SYN2027菌株(Plpp-pKYNase KanR TrpE::CmR进化菌株复制1)。SYN2027-R2：源自ALE的第二进化菌株，衍生自母体SYN2027菌株(Plpp-pKYNase KanRTrpE::CmR进化菌株复制2)。SYN2028-R1：源自ALE的第一进化菌株，衍生自母体SYN2028菌株(HA3/4::PSynJ23119-pKYNase KanR TrpE::CmR进化菌株复制1)。SYN2028-R2：源自ALE的第二进化菌株，衍生自母体SYN2028菌株(HA3/4::PSynJ23119-pKYNase KanR TrpE::CmR进化菌株复制1)。
图52A和图52B描绘了显示通过产生来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的菌株进行的肿瘤内犬尿氨酸耗尽的点图。图52A描绘了显示对在中等拷贝质粒上携带组成型表达的荧光假单胞菌犬尿氨酸酶的犬尿氨酸消耗菌株SYN1704观察到的肿瘤内浓度的点图。图52B描绘了显示对携带组成型表达的荧光假单胞菌犬尿氨酸酶的染色体整合拷贝的犬尿氨酸消耗菌株SYN2028观察到的肿瘤内浓度的点图。IDO抑制剂INCB024360用作阳性对照。
图53A和图53B描绘了显示在施用盐水或SYN1704的植入CT26肿瘤的小鼠中测量的肿瘤内犬尿氨酸(图53A)和血浆犬尿氨酸(图53B)的浓度的点图。与盐水对照相比，对于犬尿氨酸消耗菌株SYN1704，观察到犬尿氨酸的肿瘤内(P<0.001)和血浆(P<0.005)浓度的显著降低。色氨酸水平保持恒定(数据未示出)。
图54A、54B和54C描绘了图，显示在CT26肿瘤中单次施用KYN消耗菌株对肿瘤(图54A)和血浆(图54B)中肿瘤KYN水平以及肿瘤重量(图54C)的影响。通过肿瘤内给药以1e8CFU/mL向小鼠给药SYN94或SYN1704。处死动物并在指定时间收集血液和组织。
图55描绘了细菌上清液的蛋白印迹分析，显示由大肠杆菌菌株SYN3366和SYN3367分泌的鼠CD40L1(47-260)和CD40L2(112-260)被mCD40抗体检测到。
图56描绘了与单独的载剂或抗CTLA-4抗体相比，携带荧光假单胞菌犬尿氨酸酶的组成型表达的染色体整合拷贝的犬尿氨酸消耗菌株SYN2028进行的犬尿氨酸消耗单独或与抗CTLA4抗体组合对肿瘤体积的影响的体内分析的线图。数据表明作为单个药剂和与抗CTLA4抗体组合的犬尿氨酸消耗菌株的抗肿瘤活性，并且SYN2028改善了CT26中αCTL-4介导的抗肿瘤活性。在该研究中，BALB/c小鼠被植入CT26肿瘤；以100μg/小鼠IP施用抗CTLA4抗体；细菌以1×10e7进行肿瘤内施用；细菌和抗体全部每两周施用一次。
图57A、57B、57C和57D描绘了显示用于图56中所示研究的各个个体小鼠的线图。图57E描绘了相应的Kaplan–Meier曲线。
图58A、图58B、图58C、图58D、图58E描绘了线图，显示Kyn消耗者SYN2028与αυτιCTL-4和抗PD-1抗体组合在MC38肿瘤中具有改善的抗肿瘤活性。图58B、58C、58D和58E描绘了显示图58A中所示研究的各个个体小鼠的线图。Kyn消耗者SYN2028与抗CTL-4和抗PD-1抗体组合相对于单独的载剂(图58B)、抗CTLA4和抗PD-1抗体(图58C)，或者SYN94(链霉素抗性大肠杆菌Nissle)加上抗CTLA4和抗PD-1抗体(图58D)在MC38肿瘤中具有改善的抗肿瘤活性(图58E)；即，犬尿氨酸消耗者具有改善抗CTLA-4/抗PD1抗体介导的抗肿瘤活性的能力。图58F描绘了相应的Kaplan-Meier图。
图59A和图59B描绘了在B16F10肿瘤模型中犬尿氨酸消耗菌株SYN2028(SYN-Kyn)的肿瘤定植和体内活性的分析。在肿瘤尺寸达到～40-80mm3后，小鼠通过瘤内注射接受1e6CFU未经修饰的(SYN-WT)或SYN2028(SYN-Kyn)。在注射后24和72小时，将肿瘤匀浆，并通过在LB抗生素选择平板上铺板确定集落形成单位(CFU)(图59A)或通过LCMS确定犬尿氨酸水平(图59B)。
图60A和图60B描绘了显示瘤内施用后SYN1565(SYN-Ade)和SYN2028(SYN-Kyn)显示出稳健的肿瘤定植的图。为评估腺苷消耗菌株SYN1565或犬尿氨酸消耗菌株SYN2028定植肿瘤的能力，在C57BL6小鼠中建立B16.F10肿瘤。当肿瘤尺寸达到100-150mm3时，将SYN1565、SYN2028(1e6个细胞/剂)或盐水对照作为单次注射瘤内施用。注射7天后计算每克肿瘤组织的集落形成单位(CFU)，结果如图60A中所示。为了进行比较，将1e6个细胞/剂单次注射后7天每克未修饰Nissle底盘(chassis)(SYN)肿瘤组织的CFU包括在内(图60B)。
图61描绘了野生型大肠杆菌(泳道1)和表达抗PD-1scFv的菌株(泳道2)的总细胞溶质提取物的蛋白印迹分析。
图62描绘了与来自表达tet诱导型抗PD-1-scFv的菌株的提取物一起孵育的表达PD1的EL4细胞的流式细胞术分析的示意图，显示大肠杆菌中表达的抗PD-1-scFv结合小鼠EL4细胞上的PD1。
图63描绘了分泌抗PD-1scFv的各种菌株的总细胞溶质提取物的蛋白印迹分析。在泳道1-6中检测到约34kDa的单一条带，分别对应于来自SYN2767、SYN2769、SYN2771、SYN2773、SYN2775和SYN2777的提取物。
图64描绘了与来自分泌tet诱导型抗PD-1-scFv的大肠杆菌Nissle菌株的提取物一起孵育的表达PD1的EL4细胞的流式细胞术分析的示意图，显示从大肠杆菌Nissle分泌的抗PD-1-scFv结合小鼠EL4细胞上的PD1。
图65描绘了与来自分泌tet诱导型抗PD1-scFv的大肠杆菌Nissle菌株的不同量的提取物(0、2、5、和15ul)一起孵育的表达PD1的EL4细胞的流式细胞术分析的示意图，显示从大肠杆菌Nissle分泌的抗PD1-scFv以剂量依赖性方式结合小鼠EL4细胞上的PD1。
图66A和66B描绘了EL4细胞的流式细胞术分析的示意图。图66A描绘了竞争测定，其中将来自分泌tet诱导型抗PD1-scFv的大肠杆菌Nissle菌株的提取物与不同量的可溶性PDL1(0、5、10和30ug)一起孵育，显示PDL1可以剂量依赖性地和从大肠杆菌Nissle分泌的抗PD1-scFv与小鼠EL4细胞上的PD1竞争结合。图66B显示IgG对照。
图67描绘了来自SYN2996(泳道1)、SYN3159(泳道2)、SYN3160(泳道3)、SYN3021(泳道4)、SYN3020(泳道5)和SYN3161(泳道6)的细菌上清液的蛋白印迹分析，显示WT mSIRPα、mCV1SIRPα、mFD6x2SIRPα、mCV1SIRPα-IgG4、mFD6SIRPα-IgG4和抗mCD47 scFv分别从这些菌株分泌。
图68描绘了与来自SYN1557(1；delta PAL母体菌株)、SYN2996(2；表达tet诱导型mSIRPα)、SYN3021(3；表达tet诱导型抗mCD47scFv)、SYN3161(4；表达tet诱导型mCV1SIRPα-hIgG融合)的上清液一起孵育的表达CD47的CT26细胞的流式细胞术分析的示意图，显示在大肠杆菌中表达的分泌产物可与小鼠CT26细胞上的CD47结合。
图69描绘了与来自SYN1557(1；delta PAL母体菌株)、SYN3020(2；表达tet诱导型mFD6SIRPα-hIgG融合)、SYN3160(3；表达tet诱导型FD1x2SIRPα)、SYN3159(4；表达tet诱导型mCV1SIRPα)、SYN3021(5；表达tet诱导型mCV1SIRPα-hIgG融合)的上清液一起孵育的表达CD47的CT26细胞的流式细胞术分析的示意图，显示在大肠杆菌中表达的分泌产物可与小鼠CT26细胞上的CD47结合。
图70描绘了CT26细胞的流式细胞术分析的示意图。进行竞争测定，其中来自分泌tet诱导型鼠SIRPalpha的大肠杆菌Nissle菌株的提取物与重组SIRPalpha一起孵育，表明重组SIRPalpha可以和大肠杆菌Nissle分泌的SIRPalpha与CT26细胞上的CD47竞争结合。
图71描绘了CT26细胞的流式细胞术分析的示意图。进行竞争测定，其中来自分泌tet诱导型鼠SIRPalpha的大肠杆菌Nissle菌株的提取物与抗CD47抗体一起孵育，显示该抗体可以和大肠杆菌Nissle分泌的SIRPalpha与CT26细胞上的CD47竞争结合。
图72描绘了来自SYN2997(泳道1)和SYN2998(泳道2)的细菌上清液的蛋白印迹分析，显示小鼠和人透明质酸酶分别从这些菌株分泌。
图73描绘了显示在ELISA测定中作为透明质酸(hyaluronan)降解的量度的SYN1557(母体菌株delta PAL)、SYN2997和SYN2998的透明质酸酶活性的柱状图。
图74A描绘了来自表达四环素诱导型水蛭透明质酸酶的SYN3369(泳道1)和SYN1557(母体菌株delta PAL)(泳道2)的细菌上清液的蛋白印迹分析，显示水蛭透明质酸酶从SYN3369分泌。M＝标志物。图74B和图74C描绘了显示透明质酸酶活性作为ELISA测定中透明质酸降解的量度的柱状图。图74B显示了具有重组透明质酸酶的阳性对照。图74C显示SYN1557(母体菌株delta PAL)和表达四环素诱导型水蛭透明质酸酶的SYN3369的透明质酸酶活性。
图75描绘了大肠杆菌1917Nissle染色体内的示例性整合位点的图。这些位点表示可以将回路组分插入到染色体内而不干扰必需基因表达的区域。反斜杠(/)用于显示插入将发生在发散或会聚表达的基因之间。生物合成基因(例如thyA)内的插入可用于产生营养缺陷型。在一些实施方式中，将个体回路组分插入到一个以上的指示位点中。在一些实施方式中，将多个不同的回路插入到一个以上指示位点中。因此，通过将回路插入到大肠杆菌1917Nissle染色体的多个位点中，基因工程化细菌可以包含允许多种作用机制(MoAs)的回路。
图76描绘了显示使用100ul SYN94(链霉素抗性Nissle)或SYN1557(NissleΔPAL::CmR)(1e7个细胞/剂)瘤内(IT)给药后在不同时间点在肿瘤中检测到的细菌CFU的图。在这些时间点在血液中未检测到细菌。
图77描绘了显示以1e7和1e8个细胞/剂量使用100ul SYN94(链霉素抗性Nissle)瘤内(IT)给药后在不同时间点在肿瘤(CT26)中检测到的细菌CFU的图。两个剂量下肿瘤组织中的细菌计数相似。
图78A和图78B描绘了图，显示瘤内施用107CFU/剂量SYN94(链霉素抗性Nissle)或施用盐水后48小时以及在天然动物中在不同组织中检测到的细菌浓度(图78A)以及在血清、肿瘤和肝脏中测量的TNFa水平(图78B)。细菌主要存在于肿瘤中并且不存在于其他检测的组织中。在SYN94、给予盐水的组和天然动物组之间，在所有血清、肿瘤和肝脏中测得的TNFa水平相似。
图79描述了图，显示使用低氧启动子(FNR启动子)驱动DacA(基于质粒的FNR-DacA，ΔDAP)的表达通过厌氧诱导在体内实现高水平的c-diAMP生产。以2e5植入B16细胞；并且在植入后第14天，当肿瘤达到约～250-400mm3时，将小鼠分成三个实验组。组1注射1次PBS(n＝1)；组2(n＝3)注射SYN766(DAP-WT；1e9个细胞)。组3(n＝3)注射SYN4449(基于质粒的FNR-DacA，ΔDAP；1e9个细胞)。在给药后24小时，提取肿瘤，并通过LC-MS/MS测量c-di-AMP的生产。
图80描绘了图，显示使用低氧启动子(FNR启动子)驱动整合的DacA表达通过诱导厌氧在体内实现高水平的c-diAMP生产。以2e5植入B16细胞；并且在植入后第14天，当肿瘤达到约～250-400mm3时，将小鼠分成两个实验组。组1注射1次PBS(n＝3)；组2(n＝3)注射SYN4910(整合的DAP-FNR-STING还包含ΔThyA和ΔDapA营养缺陷以及噬菌体缺失；1e9个细胞)；在给药后24小时，提取肿瘤，并通过LC-MS/MS测量c-di-AMP的生产。
图81A、81B、81C和81D描绘了图，显示SYN4910(整合的DAP-FNR-STING还包含ΔThyA和ΔDapA营养缺陷以及噬菌体缺失)在B16模型中的功效。简言之，如上所述植入B16细胞。监测肿瘤生长直至肿瘤达到～100mm^3。在第0天，将小鼠随机分组(N＝每组10只)进行瘤内给药，如下所示：PBS(组1，载剂对照)，SYN4740(ΔThyA，ΔDapA，Δφ；组2，1e9 CFU)和SYN4910(组3，1e9 CFU)。在第0、2和5天测量肿瘤尺寸并向小鼠I.T.注射细菌或PBS。每周两次记录肿瘤体积。结果表明在B16肿瘤淋巴瘤模型中施用SYN4910驱动了肿瘤控制和排斥。
图82描绘了显示通过表达人环GAMP合酶(hcGAS)产生人环GAMP(2’3’-cGAMP)类似物的图。hcGAS的基因回路包含p15a起始质粒和驱动hcGAS蛋白的编码序列表达的四环素诱导型启动子(Ptet)，所述编码序列经密码子优化后可在大肠杆菌中表达。如所示的，产生了如下所示的菌株(1)仅包含质粒的菌株；(2)包含p15-ptet-hcGAS和dapA营养缺陷修饰的菌株；(3)包含p15-ptet-hcGAS和犬尿氨酸消耗回路(在组成型启动子控制下的染色体整合的犬尿氨酸酶)的菌株；(4)包含p15-ptet-hcGAS，在组成型启动子控制下的染色体整合的犬尿氨酸酶，在低氧诱导型FNR启动子控制下的包含反馈抗性ArgA的精氨酸产生回路以及缺失内源性或天然argR基因的菌株。为了生产2’3’-cGAMP类似物，将过夜培养物和对照菌株在含有适当抗生素的LB中生长。将其重新稀释到含有0.5％％葡萄糖和适当抗生素的M9基本培养基中。将其培养两个小时，然后用500ng/mL无水四环素(ATC)诱导，随后再孵育2小时。移出1mL培养物，8000xg离心5分钟并弃去上清液。然后，将这些沉淀用于通过LC/MS定量2’3’-cGAMP STING激动剂的胞内浓度。
具体实施方式
使用常规疗法特别难以控制某些肿瘤。缺氧是实体瘤的特征性特征，其中癌细胞在非常低的氧浓度下存在。缺氧区域通常围绕坏死组织并且作为实体形式的癌症发展过大而不适于其脉管系统。当血管供应不能满足肿瘤的代谢需求时，肿瘤的微环境变得缺氧。肿瘤内的多个区域含有<1％的氧气，而正常组织中的氧气含量为3-15％(Vaupel和Hockel，1995)，无血管区域可构成肿瘤质量的25-75％(Dang等，2001)。大约95％的肿瘤在某种程度上是缺氧的(Huang等，2004)。全身递送的抗癌剂依赖于肿瘤脉管系统来递送，然而，不良的血管形成阻碍了向快速分裂的细胞供氧，使得它们对在血管化不良的低氧性肿瘤区域中靶向细胞增殖的治疗剂不太敏感。放射疗法不能杀死缺氧细胞，因为氧气是辐射诱导的细胞死亡所需的效应物。与具有正常氧水平的细胞相比，缺氧细胞对放射治疗的抗性高达三倍(Bettegowda等，2003；Tiecher，1995；Wachsberger等，2003)。由于所有这些原因，使用常规疗法特别难以管理不可切除的局部晚期肿瘤。
除了与靶向缺氧环境相关的挑战之外，特异性靶向和摧毁癌症的疗法必须识别正常组织和恶性组织之间的差异，包括导致具有缺氧和坏死区域的异质肿块的遗传改变和病理生理学变化。
本公开涉及基因工程化微生物，例如基因工程化细菌，其药物组合物，以及调节或治疗癌症的方法。在某些实施方式中，基因工程化细菌能够靶向癌细胞。在某些实施方式中，基因工程化细菌能够靶向癌细胞，特别是在低氧条件下，例如在缺氧肿瘤环境中。在某些实施方式中，基因工程化细菌局部递送至肿瘤细胞。在某些方面，本文公开的组合物和方法可用于将一种或多种免疫调节剂递送至癌细胞或在癌细胞中产生一种或多种免疫调节剂。
本公开涉及局部和肿瘤特异性递送免疫调节剂以治疗癌症的组合物和治疗方法。在某些方面，本公开涉及基因工程微生物，其能够靶向癌细胞并产生一种或多种效应分子，例如免疫调节剂，例如本文提供的任何效应分子。在某些方面，本公开涉及基因工程化细菌，其能够靶向癌细胞并产生一种或多种效应分子，例如免疫调节剂。在某些方面，本公开涉及基因工程化细菌，其能够靶向癌细胞，特别是在肿瘤的缺氧区域中，并且在氧水平诱导型启动子的控制下产生一种或多种效应分子，例如免疫调节剂。与现有的常规疗法相反，肿瘤的缺氧区域为厌氧细菌的生长提供了完美的生态位，厌氧细菌的使用提供了以精确方式根除晚期局部肿瘤的机会，从而不伤害周围良好血管化的含氧量正常的组织。
具体地，在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生一种或多种免疫引发剂。在一些实施方式中，基因工程细菌能够产生与一种或多种免疫引发剂组合的一种或多种免疫维持剂。
在一些方面，本公开提供了基因工程化微生物，其能够将一种或多种效应分子例如效应调节剂，例如免疫引发剂和/或免疫维持剂递送至肿瘤细胞或肿瘤微环境。在一些方面，本公开涉及基因工程微生物，其例如通过本公开中描述的任何递送方式全身递送，并且能够产生一种或多种效应分子，例如本文描述的免疫引发剂和/或免疫维持剂。在一些方面，本公开涉及基因工程微生物，其例如通过局部肿瘤内施用局部递送，并且能够产生一种或多种效应分子，例如免疫引发剂和/或免疫维持剂。在一些方面，本文公开的组合物和方法可用于将一种或多种效应分子，例如免疫引发剂和/或免疫维持剂，选择性地递送至肿瘤细胞，从而减少全身细胞毒性或系统性免疫功能障碍，例如自身免疫事件或其他免疫相关不良事件的发作。
为了更容易理解本公开，首先定义某些术语。应根据本公开的其余部分并且如本领域普通技术人员所理解的那样阅读这些定义。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在整个详细描述中阐述了另外的定义。
对癌症产生免疫力是一个潜在的自我传播的循环过程，其被称为“癌症免疫循环”(Chen和Mellman,Oncology Meets Immunology:The Cancer-Immunity Cycle；Immunity(2013)39,:1-10)，并且其能够导致T细胞应答的放宽和放大。该循环被抑制因子所抵消，这些抑制因子在循环的不同步骤中导致免疫调控反馈机制，并且能够阻止发育或限制免疫力。
该循环主要包括一系列步骤，成功进行抗癌免疫应答需要进行这一系列步骤。该循环包括为引发免疫应答而必须发生的步骤，以及随后必须发生的第二系列事件，以使得免疫应答得以持续(即，允许其进行并扩展而不衰减)。这些步骤被称为“癌症免疫循环”(Chen和Mellman,2013)，并且基本上如下所示：
1.释放(溶瘤)和/或获取肿瘤细胞内容物；肿瘤细胞破裂并溢出其内容物，导致新抗原的释放，新抗原被抗原提呈细胞(树突状细胞和巨噬细胞)吸收进行加工。或者，抗原提呈细胞可以直接主动吞噬肿瘤细胞。
2.激活抗原提呈细胞(APC)(树突状细胞和巨噬细胞)；除了上述第一步以外，下一步必需涉及促炎性细胞因子的释放或促炎性细胞因子的产生，从而导致从濒死肿瘤细胞释放DAMP或PAMP，以使得抗原提呈细胞激活以及随后的抗癌T细胞应答。抗原提呈细胞激活对于避免肿瘤来源抗原的外周耐受至关重要。如果被正确激活，则抗原呈递细胞会在MHCI和MHCII分子的背景下将先前内化的抗原呈递给适当的共刺激信号(CD80/86、细胞因子等)以初免和激活T细胞。
3.T细胞的初免和激活：由DC和巨噬细胞呈递的抗原引起针对癌症特异性抗原的效应T细胞反应的初免和激活，这些抗原被免疫系统视为是“外来的”。通过确定效应T细胞的数量和质量以及调节性T细胞的贡献，这一步骤对于抗癌免疫应答的强度和广度至关重要。此外，适当的T细胞初免能够导致优异的记忆T细胞形成和长寿命的免疫力。
4.运输和浸润：接下来，激活的效应T细胞必需运输至肿瘤并浸润肿瘤。
5.由T细胞和T细胞支持识别癌细胞，以及增强和扩展效应T细胞应答：一旦到达肿瘤部位，T细胞就可以通过其T细胞受体(TCR)识别并与癌细胞结合，后者与癌细胞中MHC分子内呈递的其同源抗原特异性结合，并随后杀死靶癌细胞。杀死癌细胞通过肿瘤细胞的裂解释放肿瘤相关抗原，并重新开始循环，从而增加随后几轮循环中应答的量。MHC-I或MHC-II限制性T细胞对抗原的识别能够导致其他效应功能，如趋化因子和效应细胞因子的释放，从而进一步增强强大的抗肿瘤应答。
6.克服免疫抑制：最后，克服对癌症的免疫应答中的某些缺陷和/或克服癌症的防御策略，即克服癌症在抵抗免疫应答中所采用的突破，可以被视为是在该循环中的另一个关键步骤。在一些情况下，即使已经发生了T细胞的初免和激活，其他免疫抑制细胞子集也被主动募集并激活至肿瘤微环境中，即调节性T细胞或髓系来源的抑制性细胞。在其他情况下，T细胞可能没有收到正确的信号以正确归巢于肿瘤，或者可能被从浸润肿瘤中主动排除。最后，在肿瘤微环境中存在某些机制，这些机制能够抑制或阻遏由该循环产生的效应细胞。此类抗性机制共同选择了通常被称为免疫检查点的免疫抑制途径，该途径通常介导免疫耐受并减轻癌症组织损伤(参见例如，Pardoll(2012),The blockade of immunecheckpoints in cancer immunotherapy；Nature Reviews Cancer第12卷，第252–264页)。
一个重要的免疫检查点受体是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，其下调T细胞激活的幅度。一些免疫检查点受体(如程序性细胞死亡蛋白1(PD1))，会限制组织内T细胞的效应功能。通过上调PD1的配体，肿瘤细胞和抗原提呈细胞在肿瘤微环境中阻断了抗肿瘤免疫应答。多种其他的免疫检查点受体和配体(其中的一些在各种类型的肿瘤细胞中选择性上调)是阻断的主要靶点，特别是与增强抗肿瘤免疫应答的启动或激活的方法结合使用时。
已开发出在6个步骤中的一个或多个促进和支持癌症免疫循环进展的疗法。这些疗法可大致分为促进免疫应答引发的疗法和有助于维持免疫应答的疗法。
如在本文中所使用的，术语“免疫引发”或“引发免疫应答”是指通过导致免疫应答产生和建立的步骤进行的进展。例如，这些步骤可以包括上文所述的癌症免疫循环的前三个步骤，即抗原获取过程(步骤(1))，树突状细胞和巨噬细胞的激活(步骤(2))，和/或T细胞的初免和激活(步骤(3))。
如在本文中所使用的，术语“免疫维持”或“维持免疫应答”是指通过某些步骤进行的进展，所述步骤确保免疫应答随着时间的推移而扩大和增强，并防止免疫应答的减弱或抑制。例如，这些步骤可以包括所述循环的步骤4至6，即细胞运输和肿瘤浸润，通过TCR识别癌细胞，以及克服免疫抑制，即耗竭或抑制调节性T细胞以及阻止效应物应答的其他活性抑制的建立。
因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌能够通过调节(例如，激活、促进支持)循环中的一个或多个步骤调节(例如，推进)癌症免疫循环。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够调节(例如，促进)调节(例如，增强)免疫应答引发的步骤。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够调节(例如，激发)循环中增强免疫应答维持的某些步骤。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够调节(例如，强化)免疫应答引发和调节(例如，增强)免疫应答维持。
因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生一种或多种效应分子(例如，免疫调节剂)，其调节(例如，强化)免疫应答的引发。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生一种或多种效应分子(例如，免疫调节剂)，其调节(例如，增强)免疫应答的维持。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生一种或多种效应分子(例如，免疫调节剂)，其调节(例如，强化)免疫应答的引发和一种或多种效应分子(例如，免疫调节剂)，其调节(例如，增强)免疫应答的维持。
因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种效应分子(例如，免疫调节剂)的基因序列，所述效应分子调节(例如，强化)免疫应答的引发。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种效应分子(例如，免疫调节剂)的基因序列，所述效应分子调节(例如，增强)免疫应答的维持。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种效应分子(例如，免疫调节剂)的基因序列，所述效应分子调节(例如，强化)免疫应答的引发，和编码异种或多种效应分子(例如，免疫调节剂)的基因序列，所述效应分子调节(例如，增强)免疫应答的维持。
“效应物”、“效应物质”或“效应分子”指一种或多种目标分子、治疗性物质或药物。在一个实施方式中，“效应物”是由修饰微生物(例如，细菌)生产的。在另一个实施方式中，将能够生产本文所述的第一效应物的修饰微生物与第二效应物联合施用，例如第二效应物不是由修饰微生物生产的，但是在生产第一效应物的修饰微生物施用之前、同时或之后施用。
此类效应物或效应分子的非限制性实例是“免疫调节剂”，其包括本文所述的免疫维持剂和/或免疫引发剂。在一些实施方式中，修饰微生物能够生产两种或多种效应分子或免疫调节剂。在一些实施方式中，修饰微生物能够生产3、4、5、6、7、8、9或10种效应分子或免疫调节剂。在一些实施方式中，效应分子或免疫调节剂是用于调节或治疗癌症的治疗性分子。在另一个实施方式中，将能够生产本文所述的第一免疫调节剂的修饰微生物与第二免疫调节剂联合施用，例如第二免疫调节剂不是由修饰微生物生产的，但是在生产第一免疫调节剂的修饰微生物施用之前、同时或之后施用。
在一些实施方式中，效应物或免疫调节剂是由至少一种基因编码的治疗性分子。在其他实施方式中，效应物或免疫调节剂是由至少一种基因编码的酶生产的治疗性分子。在替代的实施方式中，效应物或免疫调节剂是由至少一种基因编码的生物化学或生物合成途径生产的治疗性分子。在另一个实施方式中，效应物或免疫调节剂是由至少一种基因编码的生物化学、生物合成或分解代谢途径的至少一种酶。在一些实施方式中，效应分子或免疫调节剂可以是介导RNA干扰、microRNA应答或抑制、TLR应答、反义基因调控、靶蛋白结合(适体或诱饵寡核苷酸)或基因编辑(如CRISPR干扰)的核酸分子。本文描述和列出了其他类型的效应物和免疫调节剂。
效应分子和/或免疫调节剂的非限制性实例包括免疫检查点抑制剂(例如，CTLA-4抗体、PD-1抗体、PDL-1抗体)、细胞毒性剂(例如，ClyA、FASL、TRAIL、TNFα)、免疫刺激细胞因子和共刺激分子(例如，OX40抗体或OX40L、CD28、ICOS、CCL21、IL-2、IL-18、IL-15、IL-12、IFN-γ、IL-21、TNF、GM-CSF)、抗原和抗体(如肿瘤抗原、新抗原、CtxB-PSA融合蛋白、CPV-OmpA融合蛋白、NY-ESO-1肿瘤抗原、RAF1、抗免疫抑制分子抗体、抗VEGF、抗CXR4/CXCL12、抗GLP1、抗GLP2、抗半乳糖凝集素1、抗半乳糖凝集素3、抗Tie2、抗CD47、抗免疫检查点的抗体、抗免疫抑制细胞因子和趋化因子的抗体)、DNA转移载体(如内皮抑素、血小板反应蛋白-1、TRAIL、SMAC、Stat3、Bcl2、FLT3L、GM-CSF、IL-12、AFP、VEGFR2)和酶(例如，大肠杆菌CD、HSV-TK)，产生其的免疫刺激性代谢物和生物合成途径酶(STING激动剂，例如c-di-AMP、3’3’-cGAMP和2’3’-cGAMP；精氨酸、色氨酸)。
效应物还可以包括酶或其他多肽(如转运蛋白或调控蛋白)或其他修饰(如某些内源性基因的失活，例如营养缺陷型)，其导致免疫抑制性或促进肿瘤生长的代谢产物的(如犬尿氨酸、腺苷和氨)的分解代谢。本文描述了犬尿氨酸、腺苷和氨消耗回路的非限制性实例。
免疫调节剂尤其包括免疫引发剂和免疫维持剂。
如在本文中所使用的，术语“免疫引发剂”或“引发剂”指一类效应物或分子(例如，免疫调节剂或物质)。免疫引发剂可以调节(例如，强化或增强)癌症免疫循环的一个或多个步骤，包括(1)裂解肿瘤细胞(溶瘤)；(2)激活APC(树突状细胞和巨噬细胞)；和/或(3)初免和激活T细胞。在一个实施方式中，免疫引发剂可以由本文所述的修饰微生物(例如，细菌)生产，或者可以与本文公开的修饰微生物联合施用。例如，将能够生产本文所述第一免疫引发剂或免疫维持剂的修饰微生物与第二免疫引发剂联合施用，例如第二免疫引发剂不是由修饰微生物生产的，但是在生产第一免疫引发剂或免疫维持剂的修饰微生物之前、同时或之后施用。此类免疫引发剂的非限制性实例在本文中进一步详细描述。
在一些实施方式中，免疫引发剂是由至少一种基因编码的治疗性分子。本文描述了此类治疗性分子的非限制性实例，并且包括但不限于细胞因子、趋化因子、单链抗体(激动性或拮抗性)、配体(激动性或拮抗性)、共刺激受体/配体等。在另一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种基因编码的酶生产的治疗性分子。本文描述了此类酶的非限制性实例，并且包括但不限于DacA和cGAS，其生产STING激动剂。在另一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种基因编码的生物合成途径的至少一种酶。本文描述了此类生物合成途径的非限制性实例，并且包括但不限于参与生产精氨酸的酶。在另一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种基因编码的分解代谢途径的至少一种酶。本文描述了此类分解代谢途径的非限制性实例，并且包括但不限于参与有害代谢产物分解代谢的酶。在另一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种基因编码的生物合成途径的至少一种酶生产的至少一种分子。在另一个实施方式中，免疫引发剂是由新陈代谢转化生产的治疗性分子，即免疫引发剂是新陈代谢转化剂。在其他实施方式中，免疫引发剂可以是介导RNA干扰、microRNA应答或抑制、TLR应答、反义基因调控、靶蛋白结合(适体或诱饵寡核苷酸)、基因编辑(如CRISPR干扰)的核酸分子。
术语“免疫引发剂”还可以内源性基因的任何修饰(如突变或缺失)。在一些实施方式中，细菌是经工程化的以表达生物化学、生物合成或分解代谢途径。在一些实施方式中，细菌是经工程化的以生产第二信使分子。
从广义上讲，当其能够生产“免疫引发剂”时，在本文中可以将微生物(例如，细菌)称为“免疫引发剂微生物”。
在特定的实施方式中，修饰微生物能够生产一种或多种免疫引发剂，其调节(例如，强化)一个或多个下述步骤(1)裂解肿瘤细胞和/或摄取肿瘤抗原，(2)激活APC和/或(3)初免和激活T细胞。在一些实施方式中，修饰微生物包含用于生产一种或多种免疫引发剂的基因回路，其调控(例如，强化)一个或多个下述步骤：(1)裂解肿瘤细胞和/或摄取肿瘤抗原，(2)激活APC和/或(3)初免和激活T细胞。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫引发剂的一种或多种基因，其调控(例如，强化)一个或多个下述步骤：(1)裂解肿瘤细胞和/或摄取肿瘤抗原，(2)激活APC和/或(3)初免和激活T细胞。可以将免疫引发剂与一种或多种其他相同或不同的免疫引发剂联用，其调节癌症免疫循环中的相同或不同步骤。
在一个实施方式中，修饰微生物生产一种或多种免疫引发剂，其调节溶瘤或肿瘤抗原摄取(步骤(1))。调节抗原获取的免疫引发剂的非限制性实例如本文所述以及是本领域公知的，并且包括但不限于裂解肽、CD47阻断抗体、SIRP-α和变体、TNFα、IFN-γ和5FU。在一个实施方式中，修饰微生物生产一种或多种免疫引发剂，其调节APC的激活(步骤(2))。调节APC激活的免疫引发剂的非限制性实例如本文所述以及是本领域公知的，并且包括但不限于Toll样受体激动剂、STING激动剂、CD40L和GM-CSF。在一个实施方式中，修饰微生物生产一种或多种免疫引发剂，其调节(例如，增强)T细胞的初免和激活(步骤(3))。调节(例如，增强)T细胞的初免和激活的免疫引发剂的非限制性实例如本文所述以及是本领域公知的，并且包括但不限于抗-OX40抗体、OXO40L、抗-41BB抗体、41BBL、抗-GITR抗体、GITRL、抗-CD28抗体、抗-CTLA4抗体、抗-PD1抗体、抗-PDL1抗体、IL-15和IL-12等。
如在本文中所使用的，术语“免疫维持剂”或“维持剂”指一类效应物或分子(例如，免疫调节剂或物质)。免疫维持剂可以调节(例如，激发或增强)癌症免疫循环的一个或多个步骤，包括(4)运输和浸润；(5)由T细胞和T细胞支持识别癌细胞；和/或(6)能够克服免疫抑制。在一个实施方式中，免疫维持剂可以由本文所述的修饰微生物(例如，细菌)生产。在另一个实施方式中，免疫维持剂可以与本文所述的修饰微生物联合施用。例如，将本文所述的生产第一免疫引发剂或免疫维持剂的修饰微生物与第二免疫维持剂联合施用，例如第二免疫维持剂不是由修饰微生物生产的，但是在生产第一免疫引发剂或免疫维持剂的修饰微生物之前、同时或之后施用。
在一些实施方式中，免疫维持剂是由至少一种基因编码的治疗性分子。本文描述了此类治疗性分子的非限制性实例，并且包括细胞因子、趋化因子、单链抗体(激动性或拮抗性)、配体(激动性或拮抗性)等。在另一个实施方式中，免疫维持剂是由至少一种基因编码的酶生产的治疗性分子。本文描述了此类酶的非限制性实例，并且包括但不限于表8中描述的那些。在另一个实施方式中，免疫维持剂是由至少一种基因编码的生物合成途径或分解代谢途径中的至少一种酶。本文描述了此类生物合成途径的非限制性实例，并且包括但不限于参与生产精氨酸的酶；以及本文描述了此类分解代谢途径的非限制性实例，并且包括但不限于参与犬尿氨酸催化作用的酶或参与腺苷催化作用的酶。在另一个实施方式中，免疫维持剂是由至少一种基因编码的生物合成、生物化学或分解代谢途径的至少一种酶生产的至少一种分子。在另一个实施方式中，免疫维持剂是由新陈代谢转化生产的治疗性分子，即免疫引发剂是新陈代谢转化剂。在其他实施方式中，免疫维持剂可以是介导RNA干扰、microRNA应答或抑制、TLR应答、反义基因调控、靶蛋白结合(适体或诱饵寡核苷酸)、基因编辑(如CRISPR干扰)的核酸分子。
在特定的实施方式中，例如通过阻止癌症免疫循环的进展，修饰微生物能够分解有害的代谢产物(例如，促进细胞分裂、增殖、癌症生长和/或抑制免疫系统的代谢产物)。因此，术语“免疫维持剂”还可以指减少或消除有害的分子。在这种情况下，术语“免疫维持剂”还用于指分解代谢途径的一种或多种酶，其分解有害代谢产物，其可以由一种或多种基因编码。术语“免疫维持剂”可以指编码分解代谢酶的回路，用于生产分解代谢酶的回路或者由微生物表达分解代谢酶。
术语“免疫维持剂”还可以指在内源性基因中的任何修饰(如突变或缺失)。在一些实施方式中，对微生物进行修饰以表达生物化学、生物合成或分解代谢途径。在一些实施方式中，对微生物进行工程化以生产第二信使分子。
从广义上讲，当其能够生产“免疫维持剂”时，在本文中可以将微生物(例如，细菌)称为“免疫维持剂微生物”。
在一些实施方式中，修饰微生物能够生产一种或多种免疫维持剂，其调节(例如，激发)一个或多个下述步骤(4)T细胞运输和浸润，(5)由T细胞和/或T细胞支持识别癌细胞和/或(6)克服免疫抑制的能力。可以将免疫维持剂与一种或多种其他免疫维持剂联用，其调节相同或不同步骤。在一些实施方式中，修饰微生物包含用于生产一种或多种免疫维持剂的基因回路，其调节(例如，激发)一个或多个下述步骤(4)T细胞运输和浸润，(5)由T细胞和/或T细胞支持识别癌细胞和/或(6)克服免疫抑制的能力。在一些实施方式中，修饰微生物包含编码一种或多种免疫维持剂的一种或多种基因，其调节(例如，激发)一个或多个下述步骤(4)T细胞运输和浸润，(5)由T细胞和/或T细胞支持识别癌细胞和/或(6)克服免疫抑制的能力。
在一个实施方式中，修饰微生物生产一种或多种免疫维持剂，其调节T细胞运输和浸润(步骤(4))。调节T细胞运输和浸润的免疫维持剂的非限制性实例如本文所述以及是本领域公知的，并且包括但不限于趋化因子(如CXCL9和CXCL10)或上游激活剂，其诱导此类细胞因子的表达。在一个实施方式中，修饰微生物生产一种或多种免疫维持剂，其调节由T细胞和T细胞支持识别癌细胞(步骤(5))。调节由T细胞和T细胞支持识别癌细胞的免疫维持剂的非限制性实例如本文所述以及是本领域公知的，并且包括但不限于抗-PD1/PD-L1抗体(拮抗性)、抗-CTLA-4抗体(拮抗性)、犬尿氨酸消耗、腺苷消耗、抗-OX40抗体(激动性)、抗-41BB抗体(激动性)和抗-GITR抗体(激动性)。在一个实施方式中，修饰微生物生产一种或多种免疫维持剂，其调节(例如，增强)克服免疫抑制的能力(步骤(6))。调节(例如，增强)克服免疫抑制的能力的免疫维持剂的非限制性实例如本文所述以及是本领域公知的，并且包括但不限于IL-15和IL-12及其变体。
任意一种或多种免疫引发剂可以与任意一种或多种免疫维持剂联用。因此，在一些实施方式中，将能够生产一种或多种免疫引发剂的修饰微生物与一种或多种免疫维持剂联用，所述免疫引发剂调节(例如，强化)一个或多个下述步骤(1)溶瘤，(2)激活APC和/或(3)初免和激活T细胞，所述免疫维持剂调节(例如，激发)一个或多个下述步骤(4)T细胞运输和浸润，(5)由T细胞和/或T细胞支持识别癌细胞和/或(6)克服免疫抑制的能力。
在一些实施方式中，某些免疫调节剂在癌症免疫循环的多个阶段起作用，例如免疫起始的一个或多个阶段，或者免疫维持的一个或多个阶段，或者免疫起始的一个或多个阶段和免疫维持的一个或多个阶段。
如在本文中所使用的，“新陈代谢转化”指细胞(例如，细菌细胞)内的化学转化，其是酶催化反应产生的。酶催化反应在性质上可以是生物合成的或分解代谢的。
如在本文中所使用的，术语“新陈代谢转化剂”指生物合成或分解代谢回路，即包含编码一种或多种酶的基因的回路，其催化化学转化，即其消耗、生产或转化代谢产物。在一个实施方式中，基因是非天然基因。在另一个实施方式中，基因可以由天然基因编码，但是回路进一步被修饰以包含一种或多种非天然基因和/或一种或多种非天然营养缺陷型。在一些实施方式中，术语“新陈代谢转化剂”指由至少一种基因编码的合成代谢途径的至少一种酶生产的至少一种分子。
“新陈代谢转化剂”还指由回路以及在内源性基因中的任何修饰(如突变或缺失)编码的生物合成或分解代谢酶。术语“新陈代谢转化剂”还可以指编码分解代谢酶和/或内源性基因的修饰的一种或多种基因。例如，新陈代谢转化剂能够消耗毒性或免疫抑制性代谢产物或产生抗癌代谢产物或者这两者。新陈代谢转化剂的非限制性实例包括犬尿氨酸消耗剂、腺苷消耗剂、精氨酸产生剂和/或氨消耗剂，即回路，其编码用于消耗犬尿氨酸或腺苷或者用于生产精氨酸和/或消耗氨的酶。
从广义上讲，当其包含或能够生产“新陈代谢转化剂”时，微生物(例如，细菌)在本文中可以称为“新陈代谢转化剂微生物”或“新陈代谢转化剂细菌”。
如在本文中所使用的，术语“部分消退”指在向患有肿瘤的受试者施用修饰微生物和/或免疫调节剂后，肿瘤生长抑制和/或肿瘤消退(例如，在尺寸上)。在一个实施方式中，“部分消退”可以指肿瘤消退(例如，在尺寸上)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或者至少约90％。在另一个实施方式中，“部分消退”可以指肿瘤尺寸减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％或者至少约90％。在一个实施方式中，“部分消退”指肿瘤消退(例如，在尺寸上)，但是其中肿瘤在受试者中仍是可检测的。
如在本文中所使用的，术语“完全消退”指向患有肿瘤的受试者施用修饰微生物和/或免疫调节剂后，肿瘤完全消退(例如，在尺寸上)。当发生“完全消退”时，肿瘤在受试者中无法检测到。
如在本文中所使用的，术语“应答百分比”指施用修饰微生物和/或免疫调节剂之后，在受试者人群中显示出如本文所定义的部分消退或完全消退的受试者的百分比。例如，在一个实施方式中，在受试者群体中约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或者约95％的受试者显示出部分应答或完全应答。
如在本文中所使用的，术语“病情稳定”指癌症或肿瘤既不生长也不缩小。“病情稳定”还指其中没有发展成新的肿瘤，并且癌症或肿瘤没有(例如，通过转移)扩散到身体的任何新区域或面积的疾病状态。
“瘤内施用”意在包括将微生物递送至肿瘤内部位的任何和所有手段，并且不限于瘤内注射方式。本文详细讨论了用于工程化微生物的递送方式的实例。
“癌症”或“癌的(cancerous)”用于指以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。在一些实施方式中，癌症是指肿瘤。“肿瘤”用于指任何肿瘤细胞生长或增殖或任何癌前或癌细胞或组织。肿瘤可以是恶性的或良性的。癌症的类型包括但不限于肾上腺癌，肾上腺皮质癌，肛门癌，阑尾癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌(例如，尤文肉瘤，骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤)，脑癌(例如，星形细胞瘤，脑干胶质瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤)，支气管肿瘤，中枢神经系统肿瘤，乳腺癌，Castleman病，宫颈癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，眼癌，胆囊癌，胃肠道癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤，妊娠滋养细胞疾病，心脏癌，卡波西肉瘤，肾癌，喉癌，下咽癌，白血病(如急性淋巴细胞白血病，急性髓性白血病，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病)，肝癌，肺癌，淋巴瘤(如艾滋病相关淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤)，恶性间皮瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常综合征，鼻腔癌，鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌，胰腺癌，阴茎癌，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，横纹肌样瘤，唾液腺癌，肉瘤，皮肤癌(如基底细胞癌，黑色素瘤)，小肠癌，胃癌，畸胎瘤，睾丸癌，咽喉癌，胸腺癌，甲状腺癌，不寻常的儿童癌症，尿道癌，子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。癌症治疗的副作用可能包括但不限于机会性自身免疫性疾病，全身毒性，贫血，食欲不振，膀胱内层刺激，出血和瘀伤(血小板减少症)，味觉或嗅觉改变，便秘，腹泻，口干，吞咽困难，水肿，疲劳，脱发(脱发)，感染，不孕，淋巴水肿，口腔溃疡，恶心，疼痛，周围神经病变，蛀牙，尿路感染，和/或记忆和注意力问题(NationalCancer Institute)。
如本文所用，“远位”和“远位效应”是指其中肿瘤的局部治疗不仅缩小或以其他方式影响所治疗的肿瘤，而且还缩小或以其他方式影响局部治疗范围之外的其他肿瘤的效应。在一些实施方式中，基因工程化细菌可引起远位效应。在一些实施方式中，在施用基因工程化细菌时未观察到远位效应。
在观察到远位效应的任何这些实施方式中，与在天然动物或受试者中相同类型的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，在远离施用部位的相同类型肿瘤中肿瘤生长时间延迟至少约0至2天、至少约2至4天、至少约4至6天、至少约6至8天、至少约8至10天、至少约10至12天、至少约12至14天、至少约14至16天、至少约16至18天、至少约18至20天、至少约20至25天、至少约25至30天、至少约30至35天。
在观察到远位效应的任何这些实施方式中，与在天然动物或受试者中相同类型的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，在相同类型的远端肿瘤中以肿瘤体积衡量的肿瘤生长时间延迟至少约0至2周、至少约2至4周、至少约4至6周、至少约6至8周、至少约8至10周、至少约10至12周、至少约12至14周、至少约14至16周、至少约16至18周、至少约18至20周、至少约20至25周、至少约25至30周、至少约30至35周、至少约35至40周、至少约40至45周、至少约45至50周、至少约50至55周、至少约55至60周、至少约60至65周、至少约65至70周、至少约70至80周、至少约80至90周或者至少约90至100周。
在观察到远位效应的任何这些实施方式中，与在天然动物或受试者中的生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，在远离施用部位的相同类型肿瘤中以肿瘤体积衡量的肿瘤生长时间延迟至少约0至2年、至少约2至4年、至少约4至6年、至少约6至8年、至少约8至10年、至少约10至12年、至少约12至14年、至少约14至16年、至少约16至18年、至少约18至20年、至少约20至25年、至少约25至30年、至少约30至35年、至少约35至40年、至少约40至45年、至少约45至50年、至少约50至55年、至少约55至60年、至少约60至65年、至少约65至70年、至少约70至80年、至少约80至90年或者至少约90至100年。
在又一个实施方式中，与在天然受试者中的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，存活率是至少约1.0-1.2倍、至少约1.2-1.4倍、至少约1.4-1.6倍、至少约1.6-1.8倍、至少约1.8-2倍或者至少约2倍。在又一个实施方式中，与在天然受试者中的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，存活率是至少约2至3倍、至少约3至4倍、至少约4至5倍、至少约5至6倍、至少约6至7倍、至少约7至8倍、至少约8至9倍、至少约9至10倍、至少约10至15倍、至少约15至20倍、至少约20至30倍、至少约30至40倍或者至少约40至50倍、至少约50至100倍、至少约100至500倍或者至少约500至1000倍。在该实例中，“肿瘤再次挑战”还可以包括转移形成，其可以在处于癌症进展某个阶段的受试者中出现。
免疫记忆代表了在哺乳动物中免疫应答的一个重要方面。记忆应答形成了对抗癌细胞的疫苗的效力的基础。如在本文中所使用的，术语“免疫记忆(immune memory)”或“免疫记忆(immunological memory)”指其中长寿命的抗原特异性淋巴细胞是可用的并且在重复暴露于特定抗原后能够迅速引发应答的状态。免疫记忆在癌症免疫治疗中的重要性是众所周知的，并且记忆T细胞的转运性质和持久的抗肿瘤能力在控制恶性肿瘤以及防止转移或复发中起着至关重要的作用。B淋巴细胞和T细胞均存在免疫记忆，并且目前认为其存在于多种其他免疫细胞中，包括NK细胞、巨噬细胞和单核细胞。(参见例如，Farber等，Immunological memory:lessons from the past and a look to thefuture.Nat.Rev.Immunol.(2016)16:124-128)。记忆B细胞是能够长时间产生抗体的浆细胞。记忆B细胞已经经历了克隆扩增和分化以及亲和性成熟，因此其能够更快地分裂多次并产生具有更高亲和性的抗体。记忆T细胞可以是CD4+和CD8+。这些记忆T细胞不需要进一步的抗原刺激即可增殖，从而其不需要通过MHC发出信号。
例如，可以通过在给予修饰微生物达到完全消退后通过对动物模型进行再次挑战来在动物模型中测量免疫记忆。然后，向动物移植来自癌细胞系的癌细胞并监测其生长情况，并与此前未暴露于肿瘤的相同类型的年龄匹配的天然动物进行比较。将此类肿瘤再次挑战用于证明针对抗肿瘤细胞的全身性和长期免疫力，并且其可能代表了抵抗未来复发或转移形成的能力。本文在实施例中使用A20肿瘤模型描述了此类实验。与天然动物相比，免疫记忆将阻止或减缓在再次挑战的动物中肿瘤的复发。在细胞水平上，可以通过肿瘤抗原特异性记忆或效应记忆T细胞的扩增和/或持久性测量免疫记忆的形成。
在一些实施方式中，通过施用本文所述的修饰微生物在受试者中实现免疫记忆。在一些实施方式中，通过使用本文所述的修饰微生物在癌症患者中实现免疫记忆。
在一些实施方式中，通过施用本文所述的修饰微生物在受试者中实现完全应答。在一些实施方式中，通过使用本文所述的修饰微生物在癌症患者中实现完全应答。
在一些实施方式中，通过施用本文所述的修饰微生物在受试者中实现完全缓解。在一些实施方式中，通过使用本文所述的修饰微生物在癌症患者中实现完全缓解。
在一些实施方式中，通过施用本文所述的修饰微生物在受试者中实现部分应答。在一些实施方式中，通过使用本文所述的修饰微生物在癌症患者中实现部分应答。
在一些实施方式中，通过施用本文所述的修饰微生物在受试者中实现病情稳定。在一些实施方式中，通过使用本文所述的修饰微生物在癌症患者中实现部分应答。
在一些实施方式中，通过施用本文所述的修饰微生物在组内的受试者子集中实现部分或完全应答。在一些实施方式中，通过施用本文所述的修饰微生物在组内的患者子集中实现部分或完全应答。
在观察到免疫记忆的任何这些实施方式中，与在天然动物或受试者中的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，肿瘤生长时间延迟至少约0至2天、至少约2至4天、至少约4至6天、至少约6至8天、至少约8至10天、至少约10至12天、至少约12至14天、至少约14至16天、至少约16至18天、至少约18至20天、至少约20至25天、至少约25至30天、至少约30至35天。
在观察到免疫记忆的任何这些实施方式中，与在天然动物或受试者中的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，以肿瘤体积衡量的肿瘤生长时间延迟至少约0至2周、至少约2至4周、至少约4至6周、至少约6至8周、至少约8至10周、至少约10至12周、至少约12至14周、至少约14至16周、至少约16至18周、至少约18至20周、至少约20至25周、至少约25至30周、至少约30至35周、至少约35至40周、至少约40至45周、至少约45至50周、至少约50至55周、至少约55至60周、至少约60至65周、至少约65至70周、至少约70至80周、至少约80至90周或者至少约90至100周。
在观察到免疫记忆的任何这些实施方式中，与在天然动物或受试者中的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，以肿瘤体积衡量的肿瘤生长时间延迟至少约0至2年、至少约2至4年、至少约4至6年、至少约6至8年、至少约8至10年、至少约10至12年、至少约12至14年、至少约14至16年、至少约16至18年、至少约18至20年、至少约20至25年、至少约25至30年、至少约30至35年、至少约35至40年、至少约40至45年、至少约45至50年、至少约50至55年、至少约55至60年、至少约60至65年、至少约65至70年、至少约70至80年、至少约80至90年或者至少约90至100年。
在又一个实施方式中，与在天然受试者中的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，存活率是至少约1.0-1.2倍、至少约1.2-1.4倍、至少约1.4-1.6倍、至少约1.6-1.8倍、至少约1.8-2倍或者至少约2倍。在又一个实施方式中，与在天然受试者中的肿瘤生长情况(肿瘤体积)相比，肿瘤再次挑战后，存活率是至少约2至3倍、至少约3至4倍、至少约4至5倍、至少约5至6倍、至少约6至7倍、至少约7至8倍、至少约8至9倍、至少约9至10倍、至少约10至15倍、至少约15至20倍、至少约20至30倍、至少约30至40倍或者至少约40至50倍、至少约50至100倍、至少约100至500倍或者至少约500至1000倍。
如在本文中所使用的，“热肿瘤”指T细胞发炎的肿瘤，即与浸润到肿瘤中的大量T细胞相关。“冷肿瘤”的特征在于不存在浸润肿瘤的效应T细胞，并进一步分为“免疫排斥”肿瘤，其中免疫细胞被肿瘤吸引但不能浸润肿瘤微环境，以及“免疫忽略”表型，其中根本没有发生募集免疫细胞(在Van der Woude等，Migrating into the Tumor:a Roadmap for TCells.Trends Cancer.2017Nov；3(11):797-808中进行了进一步综述)。
“缺氧”用于指相比生理水平降低的组织氧供应，从而产生缺氧环境。“常氧”指的是组织氧供应的生理水平。缺氧是实体瘤的标志，其特征在于由于灌注不足而导致的低氧和坏死区域(Groot等，2007)。
如本文所用，“有效负载”是指由基因工程微生物(例如细菌或病毒)产生的一种或多种感兴趣的分子。在一些实施方式中，有效负载是治疗性有效负载，例如效应物或免疫调节剂，例如免疫引发剂或免疫维持剂。在一些实施方式中，有效负载是调节性分子，例如转录调节因子，例如FNR。在一些实施方式中，有效负载包含调节元件，例如启动子或阻遏物。在一些实施方式中，有效负载包含诱导型启动子，例如来自FNRS。在一些实施例中，有效载荷包括阻遏元件，例如终止开关。在一些实施方式中，有效负载由基因或多个基因或操纵子编码。在替代性实施方式中，有效负载通过生物合成或生物化学途径产生，其中生物合成或生物化学途径可任选地对微生物是内源的。在一些实施方式中，基因工程微生物包含两种或更多种有效负载。
如本文所用，术语“低氧(low oxygen)”是指氧气(O2)的水平、量或浓度低于大气中存在的氧气的水平、量或浓度(例如，<21％O2；<160托O2))。因此，术语“低氧条件或条件”或“低氧环境”是指含有比大气中存在的氧气的水平低的氧气的条件或环境。
在一些实施方式中，术语“低氧”是指在哺乳动物肠道中发现的氧气(O2)的水平、量或浓度，例如，腔，胃，小肠，十二指肠，空肠，回肠，大肠，盲肠，结肠，远端乙状结肠，直肠和肛管。在一些实施方式中，术语“低氧”是指O2的水平、量或浓度为0-60mmHg O2(0-60托O2)(例如，0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，和60mmHg O2)，包括任何和所有其增量部分(例如，0.2mmHg，0.5mmHg O2，0.75mmHg O2，1.25mmHg O2，2.175mmHg O2，3.45mmHg O2，3.75mmHg O2，4.5mmHgO2，6.8mmHg O2，11.35mmHg O2，46.3mmHg O2，58.75mmHg，等等，这些示例性的部分在此列出用于说明性目的，并不意味着以任何方式进行限制)。在一些实施方式中，“低氧”是指约60mmHg O2或更低(例如，0至约60mmHg O2)。术语“低氧”也可以指的是0-60mmHg O2(含端点)之间范围O2水平、量或浓度，例如，0-5mmHg O2，<1.5mmHg O2，6-10mmHg，<8mmHg，47-60mmHg，等等，这些示例性的范围在此列出用于说明目的，并不意味着以任何方式进行限制。参见，例如，Albenberg等，Gastroenterology，147(5)：1055-1063(2014)；Bergofsky等，JClin.Invest.，41(11)：1971-1980(1962)；Crompton等，J Exp.Biol.，43：473-478(1965)；He等，PNAS(USA)，96：4586-4591(1999)；McKeown，Br.J.Radiol.，87：20130676(2014)(doi：10.1259/brj.20130676)，其各自讨论了在各种物种的哺乳动物肠中发现的氧水平，并且其各自全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，术语“低氧”是指在除肠以外的哺乳动物器官或组织中发现的氧(O2)的水平、量或浓度，例如泌尿生殖道，肿瘤组织等，其中氧以降低的水平存在，例如，在低氧(hypoxic)或缺氧(anoxic)水平。在一些实施方式中，“低氧”是指存在于部分需氧，半需氧，微需氧，无氧，微氧，低氧，缺氧和/或厌氧条件下的氧气(O2)的水平、量或浓度。例如，表1总结了各种器官和组织中存在的氧气量。在一些实施方式中，氧气(O2)的水平、量或浓度表示为溶解氧的量(“DO”)，其是指液体中存在的游离的非化合物氧(O2)的水平和通常以毫克/升(mg/L)，百万分率(ppm；1mg/L＝1ppm)或微摩尔(μmole)(1μmol O2＝0.022391mg/L O2)报告。Fondriest Environmental,Inc.,“Dissolved Oxygen”,Fundamentals of Environmental Measurements,19Nov 2013,www.fondriest.com/ environmental-measurements/parameters/water-quali ty/dissolved-oxygen/>。
在一些实施方式中，术语“低氧”是指氧(O2)的水平、量或浓度为约6.0mg/L DO或更低，例如6.0mg/L，5.0mg/L，4.0mg/L，3.0mg/L，2.0mg/L，1.0mg/L或0mg/L，及其中任何部分，如3.25mg/L，2.5mg/L，1.75mg/L，1.5mg/L，1.25mg/L，0.9mg/L，0.8mg/L，0.7mg/L，0.6mg/L，0.5mg/L，0.4mg/L，0.3mg/L，0.2mg/L和0.1mg/L DO，这里列出的示例性部分用于说明目的，并不意味着以任何方式进行限制。氧的液体或溶液水平也可以被报告为空气饱和度的百分比或氧饱和度的百分比(在稳定平衡下在某个温度、压力和盐度下溶液中的溶解氧(O2)的浓度与将溶解于溶液中的氧的最大量的比率)。没有氧气生产者或消费者的充分通气的溶液(例如，经受混合和/或搅拌的溶液)是100％空气饱和的。
在一些实施方式中，术语“低氧”是指40％或更低的空气饱和度，例如40％，39％，38％，37％，36％，35％，34％，33％，32％，31％，30％，29％，28％，27％，26％，25％，24％，23％，22％，21％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％和0％空气饱和度，包括其中任何和所有增量部分(例如，30.25％，22.70％，15.5％，7.7％，5.0％，2.8％，2.0％，1.65％，1.0％，0.9％，0.8％，0.75％，0.68％，0.5％。0.44％，0.3％，0.25％，0.2％，0.1％，0.08％，0.075％，0.058％，0.04％。0.032％，0.025％，0.01％等)和在0-40％之间含端点(例如，0-5％，0.05-0.1％，0.1-0.2％，0.1-0.5％，0.5-2.0％，0-10％，5-10％，10-15％，15-20％，20-25％，25-30％等)的任何范围的空气饱和度水平。
这里列出的示例性部分和范围是出于说明性目的，并不意味着以任何方式进行限制。在一些实施方式中，术语“低氧”意指9％O2饱和度或更低，例如9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0％O2饱和度，包括其任何和所有增量分数(例如，6.5％，5.0％，2.2％，1.7％，1.4％，0.9％，0.8％，0.75％，0.68％，0.5％。0.44％，0.3％，0.25％，0.2％，0.1％，0.08％，0.075％，0.058％，0.04％。0.032％，0.025％，0.01％等)和在0-9％之间含端点(例如0-5％，0.05-0.1％，0.1-0.2％，0.1-0.5％，0.5-2.0％，0-8％，5-7％，0.3-4.2％O2等)的任何范围的O2饱和度水平。这里列出的示例性部分和范围是出于说明性目的，并不意味着以任何方式进行限制。
表1.
Figure BDA0002364453000000601
如本文所用，术语“基因”或“基因序列”是指表达多肽或蛋白质的任何序列，包括基因组序列，cDNA序列，天然存在的序列，人工序列和密码子优化的序列。术语“基因”或“基因序列”尤其包括内源基因的修饰，例如在自然界中通常不与之相关的启动子的控制下的天然和非天然基因的缺失，突变和表达。
如本文所用，术语“基因盒”和“回路”或“回路”尤其是指表达多肽或蛋白质的任何序列，包括基因组序列，cDNA序列，天然存在的序列，人工序列，和密码子优化的序列，包括内源基因的修饰，例如在自然界中通常不与之相关的启动子的控制下的天然和非天然基因的缺失，突变和表达。
抗体通常是指免疫球蛋白家族的多肽或包含免疫球蛋白片段的多肽，其能够非共价地、可逆地和以特异性方式结合相应的抗原。示例性抗体结构单元包含四聚体，其由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)，通过二硫键连接。
如本文所用，术语“抗体”或“抗体”意在包括具有一种或多种特定结合特异性的抗体及其片段的所有变体。因此，术语“抗体”或“抗体”意指包括全长抗体，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体(ScFv，骆驼科)，Fab，Fab'，这些片段的多聚体形式(例如，F(ab')2)，单域抗体(sdAB，VHH片段)，重链抗体(HCAb)，纳米抗体，双抗体和微抗体。抗体可具有一种以上的结合特异性，例如是双特异性的。术语“抗体”还意味着包括所谓的抗体模拟物，即可以特异性结合抗原但不具有抗体相关结构。
“单链抗体”或“单链抗体”通常是指包含免疫球蛋白的重链，免疫球蛋白的轻链和任选的接头或键(例如二硫键)的肽。单链抗体缺乏传统抗体中发现的恒定Fc区。在一些实施方式中，单链抗体是天然存在的单链抗体，例如骆驼科抗体。在一些实施方式中，单链抗体是合成的，工程化的或修饰的单链抗体。在一些实施方式中，尽管添加了接头并去除了恒定区，但与原始免疫球蛋白相比，单链抗体能够保留基本上相同的抗原特异性。在一些方面，单链抗体可以是“scFv抗体”，其是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白(没有任何恒定区)，任选地连接有10至约25个氨基酸的短接头肽，例如美国专利No.4,946,778中描述的，其内容通过引用整体并入本文。Fv片段是保持抗体的结合位点的最小片段，该结合位点可以在一些方面维持原始抗体的特异性。用于产生单链抗体的技术描述于美国专利号4,946,778中。
如本文所用，术语“多肽”包括“多肽”以及“多肽”，并且是指由通过酰胺键(即肽键)线性连接的氨基酸单体组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指特定长度的产物。因此，“肽”，“二肽”，“三肽”，“寡肽”，“蛋白质”，“氨基酸链”或用于指代两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可用于代替这些术语中的任何术语，或与这些术语中的任何术语互换。术语“多肽”还意指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，衍生化，蛋白水解切割或非天然存在的氨基酸修饰。在一些实施方式中，多肽由本发明的基因工程化细菌产生。本发明的多肽可具有约3或更多，5或更多，10或更多，20或更多，25或更多，50或更多，75或更多，100或更多，200或更多，500或更多，1,000或更多，或2,000或更多个氨基酸。
“分离的”多肽或其片段，变体或衍生物是指不在其天然环境中的多肽。特定水平的纯化是不需要的。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质，包括但不限于细菌或哺乳动物细胞，被认为出于本发明的目的是分离的，如是已被通过任何合适的技术分离，分级，或部分或基本上纯化的天然或重组多肽。重组肽，多肽或蛋白质是指通过重组DNA技术产生的肽，多肽或蛋白质，即由通过编码多肽的外源重组DNA表达构建体转化的微生物或哺乳动物细胞产生的。在大多数细菌培养物中表达的蛋白质或肽通常不含聚糖。还包括前述多肽的片段，衍生物，类似物或变体，及其任何组合作为多肽。术语“片段”，“变体”，“衍生物”和“类似物”包括具有与原始肽的氨基酸序列足够相似的氨基酸序列的多肽，并且包括保留相应的原始多肽的至少一种或多种性质的任何多肽。本发明的多肽的片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。片段还包括衍生自本文所述任何多肽的特异性抗体或生物活性片段或免疫活性片段。变体可以天然存在或非天然存在。可以使用本领域已知的诱变方法产生非天然存在的变体。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸取代，缺失或添加。
多肽还包括融合蛋白。如本文所用，术语“变体”包括融合蛋白，其包含原始肽的序列或与原始肽足够相似。如本文所用，术语“融合蛋白”是指包含两种或更多种不同蛋白质的氨基酸序列的嵌合蛋白质。通常，融合蛋白由众所周知的体外重组技术产生。融合蛋白可具有与作为融合蛋白的组分的个体原始蛋白质相似的结构功能(但不一定到了相同的程度)，和/或类似的调节功能(但不一定到了相同的程度)，和/或类似的生化功能(但不一定到了相同的程度)和/或免疫活性(但不一定到了相同的程度)。“衍生物”包括但不限于肽，其含有20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物。通过比较一个肽的氨基酸序列与第二个肽的序列来确定两种肽之间的“相似性”。如果一个肽的氨基酸是相同的或保守的氨基酸取代，则其与第二个肽的相应氨基酸相似。保守取代包括在Dayhoff，MO，ed.，The Atlas of Protein Sequence and Structure 5，National Biomedical ResearchFoundation，Washington，DC(1978)和Argos，EMBO J.8(1989)，779-785中描述的那些。例如，属于下组之一的氨基酸代表保守的变化或取代：-Ala，Pro，Gly，Gln，Asn，Ser，Thr；-Cys，Ser，Tyr，Thr；-Val，Ile，Leu，Met，Ala，Phe；-Lys，Arg，His；-Phe，Tyr，Trp，His；和-Asp，Glu。
在任何这些组合实施方式中，基因工程化细菌可包含编码一种或多种融合蛋白的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与稳定化多肽融合的效应物例如免疫调节剂的基因序列。此类稳定化多肽是本领域已知的并且包括Fc蛋白。在一些实施方式中，由基因工程化细菌编码的融合蛋白是Fc融合蛋白，例如IgG Fc融合蛋白或IgA Fc融合蛋白。
在一些实施方式中，免疫调节剂通过肽接头或肽键与稳定化多肽共价融合。在一些实施方式中，稳定化多肽包含免疫球蛋白Fc多肽。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含至少一部分免疫球蛋白重链CH2恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白重链CH3恒定区的至少一部分。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白重链CH1恒定区的至少一部分。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白可变铰链区，免疫球蛋白重链CH2恒定区和免疫球蛋白重链CH3恒定区的至少一部分。权利要求2-64和权利要求112-122中任一项的基因工程化细菌，其中免疫球蛋白Fc多肽是人IgG Fc多肽。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽是人IgG4 Fc多肽。在一些实施方式中，接头包含富含甘氨酸的肽。在一些实施方式中，富含甘氨酸的肽包含序列[GlyGlyGlyGlySer]n，其中n为1，2，3，4，5或6。在一些实施方式中，融合蛋白包含SIRPαIgG FC融合多肽。在一些实施方式中，融合蛋白包含SIRPαIgG4 Fc多肽。在一些实施方式中，富含甘氨酸的肽接头包含序列SGGGGSGGGGSGGGGS。在一些实施方式中，SIRPα的N末端通过包含SGGGGSGGGGSGGGGS的肽接头与IgG4Fc的C末端共价融合。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多聚体多肽组分的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，多肽是二聚体。二聚体蛋白质的非限制性实例包括细胞因子，例如IL-15(异二聚体)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种多肽的一种或多种基因，其中所述一种或多种多肽包含第一单体和第二单体。在一些实施方式中，第一单体多肽通过肽接头或肽键与第二单体多肽共价连接。在一些实施方式中，接头包含富含甘氨酸的肽。在一些实施方式中，第一和第二单体具有相同的多肽序列。在一些实施方式中，第一和第二单体各自具有不同的多肽序列。在一些实施方式中，第一单体是IL-12p35多肽，第二单体是IL-12p40多肽。在一些实施方式中，接头包含GGGGSGGGS。
在一些实施方式中，基因工程化细菌编码hIGg4融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:1117中的一个或多个具有约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的hIgG4部分。在另一个实施方式中，hIgG4部分包含SEQ ID NO:1117。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽的hIgG4部分由SEQ ID NO:1117组成。
在一些实施方式中，编码融合蛋白(例如hIGg4融合蛋白)的核酸包含与SEQ IDNO:1103具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同一性的序列。在一些实施方式中，编码融合蛋白的核酸包含SEQ ID NO:1103。在一些实施方式中，编码hIgG4的核酸部分由SEQ ID NO:1103组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌编码融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:1121中的一个或多个具有约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的接头部分。在另一个实施方式中，接头部分包含SEQ ID NO:1121。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽的接头部分由SEQ ID NO:1121组成。
在一些实施方式中，可以通过与促进效应物功能的另一多肽融合来改善免疫调节剂的效应物功能。这种融合的非限制性实例是IL-15与IL-15Rα的Sushi结构域的融合，如本文所述。因此，在一些实施方式中，第一单体多肽是IL-15单体，第二单体是IL-15Rαsushi结构域多肽。
在任何这些实施方式和所有组合实施方式中，基因工程化细菌包含编码本文所述的一种或多种分泌标签的一个或多个基因序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌包含内源膜相关蛋白中的一个或多个突变，从而允许可扩散的外膜表型。本文描述了合适的外膜突变。
如本文所用，术语“足够相似”是指第一氨基酸序列，其相对于第二氨基酸序列含有足够或最少数量的相同或等同的氨基酸残基，使得第一和第二氨基酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，包含至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或至少约100％同一性的共同结构域的氨基酸序列在本文中定义为足够相似。优选地，变体与本发明的肽的氨基酸序列足够相似。这些变体通常保留了本发明的肽的功能活性。变体包括氨基酸序列分别与天然肽和野生型肽相差一个或多个氨基酸缺失，添加和/或取代的肽。这些可以是天然存在的变体以及人工设计的变体。
如本文所用，术语“接头”，“接头肽”或“肽接头”或“接头”是指连接或连接两个多肽序列，例如，连接两个多肽域的合成的或非天然或非天然存在的氨基酸序列。如本文所用，术语“合成的”是指非天然存在的氨基酸序列。本文描述了示例性接头。另外的示例性接头在US20140079701中提供，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，接头是富含甘氨酸的接头。在一些实施方式中，接头是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n。在一些实施方式中，接头包含SEQ ID NO:979。
如本文所用，术语“密码子优化的序列”是指序列，其是从现有编码序列修饰，或设计例如用于改善在从编码序列转录的转录物RNA分子的表达宿主细胞或生物体中的翻译，或改善编码序列的转录。密码子优化包括但不限于包括选择用于编码序列的密码子以适合表达宿主生物的密码子偏好的过程。
许多生物显示出对使用特定密码子编码在生长的多肽链中插入特定氨基酸的偏倚或偏好。遗传密码的简并性允许密码子偏好或密码子偏倚，生物体之间的密码子使用的差异，并且在许多生物体中有很好的记录。密码子偏倚通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而后者又被认为依赖于，尤其是被翻译的密码子的性质和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选择的tRNA在细胞中的优势通常是肽合成中最常使用的密码子的反映。因此，可以基于密码子优化来定制基因以用于给定生物中的最佳基因表达。
如本文所用，术语“分泌系统”或“分泌蛋白”是指能够从微生物(例如细菌细胞质)分泌或输出免疫调节剂的天然或非天然分泌机制。革兰氏阴性细菌分泌系统的非限制性实例包括修饰的III型鞭毛，I型(例如，溶血素分泌系统)，II型，IV型，V型，VI型和VII型分泌系统，抗性-结瘤-分裂(RND)多药外排泵，各种单膜分泌系统。分泌系统的非限制性实例在本文中描述。
如本文所用，术语“转运蛋白”意指用于将分子从细胞外环境导入微生物的机制，例如一种或多种蛋白质。
免疫系统最广义地通常分为两类，固有免疫和适应性免疫，尽管与这些免疫相关的免疫反应并不相互排斥。“固有免疫”是指在外来因子或抗原在体内出现时立即或在数小时内激活的非特异性防御机制。这些机制包括物理屏障，如皮肤，血液中的化学物质，以及免疫系统细胞，如树突状细胞(DC)，白细胞，吞噬细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和自然杀伤细胞(NK)，它们攻击身体中的外来物质或细胞和改变免疫系统对于外来物质存在的静止。在固有免疫应答期间，产生细胞因子和趋化因子，与免疫抗原呈递组合以激活适应性免疫细胞和引发完全展开的免疫应答。“适应性免疫”或“获得性免疫”是指抗原特异性免疫应答。必须首先通过抗原呈递细胞(APC)处理或呈递抗原。抗原呈递细胞或辅助细胞是在其表面上展示直接或与主要组织相容性复合物(MHC)复合的抗原的细胞。专业的抗原呈递细胞，包括巨噬细胞，B细胞，和树突细胞，专门用于将外来抗原以MHC-II限制性方式呈递给T辅助细胞，而其他细胞类型可以将来自细胞内的抗原以MHC-I限制性方式呈递给细胞毒性T细胞。一旦抗原被呈递并被识别，适应性免疫系统就会激活一群专门设计用于攻击该抗原的免疫细胞。与先天系统一样，适应性系统包括体液免疫组分(B淋巴细胞)和细胞介导的免疫(T淋巴细胞)组分。B细胞被激活以分泌抗体，其通过血流并与外来抗原结合。辅助T细胞(调节性T细胞，CD4+细胞)和细胞毒性T细胞(CTL，CD8+细胞)在其T细胞受体与抗原结合的MHC分子相互作用时被激活。细胞因子和共刺激分子帮助T细胞成熟，成熟细胞反过来产生细胞因子，从而产生额外的T细胞的初免和扩增，维持应答。一旦被激活，辅助T细胞释放细胞因子，其调节和指导不同免疫细胞类型(包括APC，巨噬细胞，中性粒细胞和其他淋巴细胞)的活性，以杀死和去除靶细胞。辅助T细胞还分泌额外的信号，有助于帮助维持免疫应答的细胞毒性T细胞的激活。激活后，CTL经历克隆选择，其中它获得功能、快速分裂以产生激活的效应细胞团和形成准备好快速应答于将来的威胁的长效记忆T细胞。然后，激活的CTL遍布全身，寻找具有独特MHC I类和抗原的细胞。效应器CTL释放细胞毒素，在靶细胞的质膜中形成孔，引起细胞凋亡。适应性免疫还包括“记忆”，使得针对特定抗原的未来反应更有效。在感染消退后，T辅助细胞和细胞毒性T细胞死亡并被吞噬细胞清除，然而，这些细胞中的一些仍然作为记忆细胞。如果稍后遇到相同的抗原，则这些记忆细胞迅速分化成效应细胞，缩短了产生有效反应所需的时间。
“免疫检查点抑制剂”或“免疫检查点”是指完全或部分减少，抑制，干扰或调节一种或多种免疫检查点蛋白质的分子。免疫检查点蛋白调节T细胞激活或功能，并且是本领域已知的。非限制性实例包括CTLA-4及其配体CD80和CD86，以及PD-1及其配体PD-L1和PD-L2。免疫检查点蛋白负责T细胞反应的共刺激或抑制相互作用，并调节和维持自身耐受性和生理免疫反应。
“共刺激”分子或“共刺激子”是免疫调节剂，其增加或激活刺激免疫应答或炎症反应的信号。
如本文所用，基因工程微生物，例如工程化细菌，或“抑制”癌细胞的免疫调节子，是指与对照相比，例如，在相同条件下的未处理的对照或相同亚型的未修饰的微生物，能够减少细胞增殖，减少肿瘤生长和/或减少肿瘤体积的细菌或病毒或分子，减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
如本文所用，基因工程微生物，例如工程化细菌，或“抑制”生物分子的免疫调节剂，例如免疫调节剂，例如细胞因子，趋化因子，免疫调节代谢物或任何其他免疫调节剂，因子或分子，是指与对照相比，例如，在相同条件下的未处理的对照或相同亚型的未修饰的微生物，能够减少，降低或消除该生物分子的生物活性，生物学功能和/或数量的细菌或病毒或免疫调节剂。
如本文所用，基因工程微生物，例如工程化细菌，或“激活”或“刺激”生物分子的免疫调节剂，例如细胞因子，趋化因子，免疫调节代谢物或任何其他免疫调节剂，因子或分子，是指与对照相比，例如，在相同条件下的未处理的对照或相同亚型的未修饰的微生物，能够激活，增加，增强或促进该生物分子的生物活性，生物学功能和/或数量的细菌或病毒或免疫调节剂。
“用于肿瘤内施用的细菌”是指能够将其自身引导至癌细胞的细菌。用于肿瘤内施用的细菌可以天然地能够将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织。在一些实施方式中，不是天然能够将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织的细菌经基因工程改造以将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织。可以进一步改造用于肿瘤内施用的细菌以增强或改善所需的生物学特性，减轻全身毒性和/或确保临床安全性。这些物种，菌株和/或亚型可以减毒，例如，缺失毒素基因。在一些实施方式中，用于肿瘤内施用的细菌具有低感染能力。在一些实施方式中，用于肿瘤内施用的细菌是运动的。在一些实施方式中，用于肿瘤内施用的细菌能够深入渗透到肿瘤中，在那里标准治疗无法到达。在一些实施方式中，用于肿瘤内施用的细菌能够定植至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或至少95％的恶性肿瘤。用于肿瘤内施用的细菌的实例包括但不限于Bifidobacterium,Caulobacter,Clostridium,Escherichia coli,Listeria,Mycobacterium,Salmonella,Streptococcus,and Vibrio,e.g.,Bifidobacterium adolescentis,Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium breveUCC2003,Bifidobacterium infantis,Bifidobacterium longum,Clostridiumacetobutylicum,Clostridium butyricum,Clostridium butyricum M-55,Clostridiumbutyricum miyairi,Clostridium cochlearum,Clostridium felsineum,Clostridiumhistolyticum,Clostridium multifermentans,Clostridium novyi-NT,Clostridiumparaputrificum,Clostridium pasteureanum,Clostridium pectinovorum,Clostridiumperfringens,Clostridium roseum,Clostridium sporogenes,Clostridium tertium,Clostridium tetani,Clostridium tyrobutyricum,Corynebacterium parvum,Escherichia coli MG1655,Escherichia coli Nissle 1917,Listeria monocytogenes,Mycobacterium bovis,Salmonella choleraesuis,Salmonella typhimurium和Vibriocholera(Cronin等，2012；Forbes，2006年；Jain和Forbes，2001年；Liu等，2014；Morrissey等，2010；Nuno等，2013；Patyar等，2010；Cronin等，Mol Ther 2010；18：1397-407)。在一些实施方式中，用于肿瘤内施用的细菌是非致病细菌。在一些实施方式中，肿瘤内施用通过注射进行。
“微生物”是指微观，亚显微或超微尺寸的生物或微生物，其通常由单个细胞组成。微生物的实例包括细菌，病毒，寄生虫，真菌，某些藻类，原生动物和酵母。在一些方面，将微生物修饰(“修饰微生物”)从其天然状态以产生一种或多种效应物或免疫调节剂。在某些实施方式中，修饰微生物是修饰细菌。在一些实施方式中，修饰微生物是基因工程化细菌。在某些实施方式中，修饰微生物是修饰的酵母。在其他实施方式中，修饰的微生物是基因工程化酵母。
如本文所用，术语“重组微生物”是指微生物，例如细菌，酵母或病毒细胞，或细菌，酵母或病毒，其已经从其天然状态进行遗传修饰。因此，“重组细菌细胞”或“重组细菌”是指已经从其天然状态进行基因工程化细菌细胞或细菌。例如，重组细菌细胞可以具有引入其DNA的核苷酸插入，核苷酸缺失，核苷酸重排和核苷酸修饰。这些遗传修饰可以存在于细菌或细菌细胞的染色体中，或存在于细菌或细菌细胞中的质粒上。本文公开的重组细菌细胞可包含质粒上的外源核苷酸序列。或者，重组细菌细胞可包含稳定引入其染色体中的外源核苷酸序列。
“编程或工程微生物”是指微生物，例如细菌，酵母或病毒细胞，或细菌，酵母或病毒，其已经从其天然状态进行遗传修饰以执行特定功能。因此，“编程或工程化细菌细胞”或“编程或工程化细菌”是指已经从其天然状态进行遗传修饰以执行特定功能的细菌细胞或细菌。在某些实施方式中，编程或工程化细菌细胞已被修饰以表达一种或多种蛋白质，例如，一种或多种具有治疗活性或用于治疗目的的蛋白质。编程或工程化细菌细胞可另外具有一旦表达感兴趣的一种或多种蛋白质就停止生长或自我破坏的能力。
“非致病性细菌”是指不能在宿主中引起疾病或有害反应的细菌。在一些实施方式中，非致病细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，非致病细菌是革兰氏阳性细菌。在一些实施方式中，非致病细菌不含有脂多糖(LPS)。在一些实施方式中，非致病细菌是共生细菌。非致病性细菌的实例包括，但不限于属于以下属的某些菌株：Bacillus,Bacteroides,Bifidobacterium,Brevibacteria,Clostridium,Enterococcus,Escherichia coli,Lactobacillus,Lactococcus,Saccharomyces,and Staphylococcus,e.g.,Bacillus coagulans,Bacillus subtilis,Bacteroides fragilis,Bacteroidessubtilis,Bacteroides thetaiotaomicron,Bifidobacterium bifidum,Bifidobacteriuminfantis,Bifidobacterium lactis,Bifidobacterium longum,Clostridium butyricum,Enterococcus faecium,Escherichia coli Nissle,Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus bulgaricus,Lactobacillus casei,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus paracasei,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus rhamnosus,Lactococcus lactis和Saccharomyces boulardii(Sonnenborn等，2009；Dinleyici等，2014；美国专利号6835376；美国专利号6203797；美国专利号5589168；美国专利号7731976)。天然致病细菌可以通过基因工程化以减少或消除致病性。
“益生菌”用于指活的非致病微生物，例如细菌，其可赋予含有适量微生物的宿主生物以健康益处。在一些实施方式中，宿主生物是哺乳动物。在一些实施方式中，宿主生物是人。在一些实施方式中，益生菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，益生菌是革兰氏阳性细菌。目前，一些非致病细菌的物种，菌株和/或亚型被认为是益生菌。益生菌细菌的实例包括，但不限于属于以下属的某些菌株：Bifidobacteria,Escherichia coli,Lactobacillus,and Saccharomyces,e.g.,Bifidobacterium bifidum,Enterococcusfaecium,Escherichia coli strain Nissle,Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus bulgaricus,Lactobacillus paracasei,Lactobacillus plantarum和Saccharomyces boulardii(Dinleyici等，2014；美国专利号5589168；美国专利号6203797；美国专利号6835376)。益生菌可以是细菌的变体或突变菌株(Arthur等，2012；Cuevas-Ramos等，2010；Olier等，2012；Nougayrede等，2006)。可以对非致病细菌进行基因工程改造以增强或改善所需的生物学特性，例如生存能力。可以对非致病细菌进行基因工程以提供益生菌特性。益生菌可以通过基因工程改造或编程以增强或改善益生菌特性。
如本文所用，“溶瘤病毒”(OV)是具有特异性感染和裂解癌细胞的能力，同时使正常细胞不受伤害的病毒。感兴趣的溶瘤病毒包括但不限于腺病毒，柯萨奇病毒，呼肠孤病毒，单纯疱疹病毒(HSV)，牛痘，禽痘，水疱性口炎病毒(VSV)，麻疹和细小病毒，还包括狂犬病，西尼罗河病毒，新城疫及其基因改造版本。OV的非限制性实例是TalimogeneLaherparepvec(T-VEC)，其是由FDA作为癌症治疗剂许可的第一种溶瘤病毒。
“可操作地连接”是指核酸序列，例如编码用于生产STING激动剂的酶的基因，例如二腺苷酸环化酶或c-di-GAMP合酶其以允许核酸序列表达的方式与调节区序列连接，例如以顺式作用。调节区是核酸，其可以引导感兴趣的基因的转录，并且可以包括启动子序列，增强子序列，应答元件，蛋白质识别位点，可诱导元件，启动子控制元件，蛋白质结合序列，5'和3'非翻译区，转录起始位点，终止序列，多腺苷酸化序列和内含子。
“诱导型启动子”是指与一个或多个基因可操作地连接的调节区，其中基因的表达在所述调节区的诱导物的存在下增加。
“外源环境条件”是指诱导本文所述启动子的环境或环境。在一些实施方式中，外源环境条件对含有癌细胞(例如肿瘤)的恶性生长是特异性的。短语“外源环境条件”意指完整(未溶解的)工程微生物外部的环境条件，但是对于肿瘤环境或宿主受试者环境是内源的或天然的。因此，“外源的”和“内源的”可互换使用，指其中环境条件对哺乳动物体为内源，但对完整微生物细胞是外部或外源的环境条件。在一些实施方式中，外源环境条件是低氧，微需氧或厌氧条件，例如低氧和/或坏死组织。一些实体瘤与低细胞内和/或细胞外pH相关；在一些实施方式中，外源环境条件是低pH环境。在一些实施方式中，本公开的基因工程微生物包含pH依赖性启动子。在一些实施方式中，本公开的基因工程微生物包含氧水平依赖性启动子。在一些方面，细菌已经进化出能够感测氧水平的转录因子。不同的信号传导途径可以由不同的氧水平触发并且以不同的动力学发生。“氧水平依赖性启动子”或“氧水平依赖性调节区”是指一种或多种氧水平感应转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合和/或激活激活下游基因表达。
氧水平依赖性转录因子的实例包括但不限于FNR(富马酸盐和硝酸盐还原酶)，ANR和DNR。相应的FNR响应性启动子，ANR(厌氧硝酸盐呼吸)-响应性启动子和DNR(异化硝酸盐呼吸调节剂)-响应性启动子是本领域已知的(参见，例如，Castiglione等，2009；Eiglmeier等，1989；Galimand等，1991；Hasegawa等，1998；Hoeren等，1993；Salmon等，2003)，非限制性实例示于表2中。
在一个非限制性实例中，启动子(PfnrS)衍生自大肠杆菌Nissle富马酸和硝酸盐还原酶基因S(fnrS)，已知其在低环境氧或无环境氧条件下高度表达(Durand和Storz，2010；Boysen等，2010)。PfnrS启动子在厌氧条件下被天然存在于Nissle中的全局转录调节因子FNR激活。在厌氧条件下，FNR形成二聚体并与其控制下的特定基因的启动子中的特定序列结合，从而激活它们的表达。然而，在有氧条件下，氧与FNR二聚体中的铁-硫簇反应并将它们转化为无活性形式。以这种方式，采用PfnrS诱导型启动子来调节蛋白质或RNA的表达。PfnrS在本申请中与FNRS，fnrs，FNR，P-FNRS启动子和其他此类相关名称可互换使用以指示启动子PfnrS。
表2.转录因子和响应基因和调节区的实例
Figure BDA0002364453000000731
Figure BDA0002364453000000741
如本文所用，“非天然”核酸序列是指通常不存在于微生物中的核酸序列，例如内源序列的额外拷贝，或异源序列，例如来自不同物种，菌株，或细菌或病毒的亚株的序列，或与来自相同亚型的细菌或病毒的未修饰序列相比被修饰和/或突变的序列。在一些实施方式中，非天然核酸序列是合成的非天然存在的序列(参见，例如，Purcell等，2013)。非天然核酸序列可以是调节区，启动子，基因和/或基因盒中的一个或多个基因。在一些实施方式中，“非天然的”是指两种或更多种核酸序列，其在自然界中彼此不存在相同的关系。非天然核酸序列可以存在于质粒或染色体上。在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌包含可操作地连接至直接或间接诱导型启动子的基因，所述启动子与所述基因天然无关，例如，可操作地与编码免疫调节剂的基因连锁的FNR反应性启动子(或本文所述的其他启动子)。
在一个实施方式中，效应物或免疫调节剂是由至少一种非天然基因编码的治疗性分子。在一个实施方式中，效应物或免疫调节剂是由至少一种非天然基因编码的酶生产的治疗性分子。在一个实施方式中，效应物或免疫调节剂是由至少一种非天然基因编码的生物合成途径的至少一种酶。在另一个实施方式中，效应物或免疫调节剂是由至少一种非天然基因编码的生物合成途径的至少一种酶生产的至少一种分子。
在一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种非天然基因编码的治疗性分子。在一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种非天然基因编码的酶生产的治疗性分子。在一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种非天然基因编码的生物合成途径的至少一种酶。在另一个实施方式中，免疫引发剂是由至少一种非天然基因编码的生物合成途径的至少一种酶生产的至少一种分子。
在一个实施方式中，免疫维持剂是由至少一种非天然基因编码的治疗性分子。在一个实施方式中，免疫维持剂是由至少一种非天然基因编码的酶生产的治疗性分子。在一个实施方式中，免疫维持剂是由至少一种非天然基因编码的生物合成途径的至少一种酶。在另一个实施方式中，免疫维持剂是由至少一种非天然基因编码的生物合成途径的至少一种酶生产的至少一种分子。
“组成型启动子”是指能够促进在其控制下和/或与其可操作连接的编码序列或基因连续转录的启动子。组成型启动子和变体在本领域是熟知的，并且本文和2017年1月11日提交以WO2017/123675公开的国际专利申请PCT/US2017/013072描述了组成型启动子的非限制性实例，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，此类启动子在体外具有活性，例如在培养，扩增和/或制造条件下。在一些实施方式中，此类启动子在体内具有活性，例如在体内环境中发现的条件下，例如肠和/或肿瘤微环境。
如本文所用，“稳定维持的”或“稳定的”细菌或病毒用于指携带非天然遗传物质的细菌或病毒宿主细胞，例如免疫调节剂，使得非天然遗传物质是保留，表达和传播。稳定的细菌或病毒能够在体外存活和/或生长，例如在培养基中和/或体内，例如在缺氧和/或坏死组织中。例如，稳定细菌或病毒可以是基因工程化细菌，其包含编码免疫调节剂的非天然遗传物质，其中携带非天然遗传物质的质粒或染色体稳定地保持在细菌或病毒中，使得免疫调节剂可以在细菌或病毒中表达，并且细菌或病毒能够在体外和/或体内存活和/或生长。
如本文所用，术语“调节”和“治疗”及其同源物是指癌症或其至少一种可辨别的症状的改善。在另一个实施方式中，“调节”和“治疗”是指至少一种可测量的物理参数的改善，不一定是患者可辨别的。在另一个实施方式中，“调节”和“治疗”是指在物理上(例如，可辨别的症状的稳定)，生理学上(例如，物理参数的稳定化)或两者来抑制癌症的进展。在另一个实施方式中，“调节”和“治疗”是指减缓癌症的进展或逆转癌症的进展。如本文所用，“预防”及其同源性是指延迟发作或降低获得给定癌症的风险。
需要治疗的那些可以包括已经患有特定癌症的个体，以及处于患有所述癌症的风险的那些，或可以最终患有所述癌症的那些。例如，通过与癌症的发生相关的一种或多种风险因素的存在(例如，酒精使用，烟草使用，肥胖，过度暴露于紫外线，高水平的雌激素，家族史，遗传易感性)，癌症的存在或进展，或患有癌症的受试者对治疗的可能接受，来评估治疗需求。癌症是由受影响细胞内的基因组不稳定性和高突变率引起的。治疗癌症可以包括消除与癌症相关的症状和/或调节受试者肿瘤的生长和/或体积，并且不一定包括消除癌症的潜在原因，例如潜在的遗传易感性。
如本文所用，术语“常规癌症治疗”或“常规癌症疗法”是指被大多数医疗保健专业人员广泛接受和使用的治疗或疗法。它与替代或补充疗法不同，后者没有广泛使用。常规癌症治疗的实例包括手术，化学疗法，靶向疗法，放射疗法，Tomotherapy，免疫疗法，癌症疫苗，激素疗法，体温过高，干细胞移植(外周血，骨髓和脐带血移植)，光动力疗法，疗法，和血液制品捐赠和输血。
如本文所用，“药物组合物”是指本公开的基因工程微生物与其他组分(例如生理学上合适的载体和/或赋形剂)的制剂。
可互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所施用的细菌或病毒化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。这些短语包括佐剂。
术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分给药的惰性物质。实例包括但不限于碳酸氢钙，磷酸钙，各种糖和淀粉类型，纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙二醇和表面活性剂，包括例如聚山梨醇酯20。
术语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”用于指导致预防，延迟症状发作或改善病症(例如癌症)症状的化合物的量。治疗有效量可以例如足以治疗，预防，降低严重性，延迟发作，和/或降低与癌细胞相关的病症的一种或多种症状发生的风险。治疗有效量以及治疗有效的给药频率可以通过本领域已知的方法确定并在下面讨论。
在一些实施方式中，术语“治疗性分子”指导致预防、延迟症状发作或减轻病况(例如，癌症)的分子或化合物。在一些实施方式中，例如，治疗性分子可以是细胞因子、趋化因子、单链抗体、配体、新陈代谢转化剂(例如，精氨酸、犬尿氨酸消耗剂或腺苷消耗剂)、T细胞共刺激受体、T细胞共刺激受体配体、工程化的化学疗法或裂解肽等等。
除非另有明确说明，否则本文所用的冠词“一”和“一个”应理解为表示“至少一个”。
当在列表中的要素之间使用时，短语“和/或”旨在表示(1)仅存在单个列出的要素，或(2)存在列表的多于一个要素。例如，“A，B和/或C”表示选择可以仅A；仅B；仅C；A和B；A和C；B和C；或A，B和C。短语“和/或”可以与列表中的要素中的“至少一个”或“一个或多个”互换使用。
细菌
在一些实施方式中，修饰微生物可以是细菌，例如基因工程化细菌。修饰微生物或基因工程化微生物，例如本公开的修饰细菌，能够局部和肿瘤特异性递送效应物和/或免疫调节剂，从而减少与全身施用所述分子相关的全身细胞毒性和/或免疫功能障碍。工程化细菌可以全身，口服，局部和/或肿瘤内给药。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够靶向癌细胞，特别是在肿瘤的缺氧区域，并产生效应分子，例如本文提供的调节剂，例如免疫刺激剂或维持剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达效应物例如免疫调节剂的细菌，其在启动子的控制下表达效应物，例如免疫调节剂，所述启动子由低氧条件(例如肿瘤的低氧环境)激活。
在一些实施方式中，肿瘤靶向微生物是天然能够将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织的细菌。例如，可以在细菌或宿主中没有任何特异性遗传修饰的情况下实现肿瘤的细菌定植(Yu等，2008)。在一些实施方式中，肿瘤靶向细菌是天然不能将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织的细菌，但是经基因工程改造以这样做。在一些实施方式中，基因工程化细菌血行传播以到达靶向肿瘤。细菌感染与肿瘤消退有关(Hall，1998；Nauts和McLaren，1990)，并且已经显示某些细菌物种定位并裂解坏死的哺乳动物肿瘤(Jain和Forbes，2001)。肿瘤靶向细菌的非限制性实例显示在表3中。
表3.具有肿瘤靶向能力的细菌
Figure BDA0002364453000000781
Figure BDA0002364453000000791
在一些实施方式中，目标基因在增强免疫疗法功效的细菌中表达。最近的研究表明，某些类型的肠道微生物在小鼠中的存在可以增强癌症免疫治疗的抗肿瘤作用，而不增加毒副作用(M.Vétizou等，“Anticancer immunotherapy by CTLA-4blockade relies onthe gut microbiota,”Science,doi:10.1126/aad1329,2015；A.Sivan等，“CommensalBifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitates anti–PD-L1efficacy,”Science,doi:0.1126/science.aac4255,2015)。在这些小鼠研究中鉴定的肠道微生物物种是否在人类中具有相同的效果尚不清楚。Vetizou等(2015)描述了特异性针对Bacteroides thetaiotaomicron或脆弱拟杆菌的T细胞应答，其与小鼠和患者中CTLA-4阻断的功效相关。Sivan等(2015)说明了双歧杆菌对黑素瘤小鼠模型中抗肿瘤免疫和抗PD-L1抗体(PD-1配体)功效的重要性。在一些实施方式中，表达一种或多种免疫调节剂的细菌是拟杆菌。在一些实施方式中，表达一种或多种免疫调节剂的细菌是双歧杆菌。在一些实施方式中，表达一种或多种免疫调节剂的细菌是大肠杆菌Nissle。在一些实施方式中，表达一种或多种免疫调节剂的细菌是Clostridium novyi-NT。在一些实施方式中，表达一种或多种免疫调节剂的细菌是Clostridium butyricum miyairi。
在某些实施方式中，修饰微生物或基因工程化细菌是专性厌氧细菌。在某些实施方式中，基因工程化细菌是兼性厌氧细菌。在某些实施方式中，基因工程化细菌是需氧细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是革兰氏阳性细菌并且缺乏LPS。在一些实施方式中，基因工程化细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是革兰氏阳性和专性厌氧细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是革兰氏阳性和兼性厌氧细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是非致病细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是共生细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是益生菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是天然致病细菌，其被修饰或突变以减少或消除致病性。示例性细菌包括但不限于Bacillus,Bacteroides,Bifidobacterium,Brevibacteria,Caulobacter,Clostridium,Enterococcus,Escherichia coli,Lactobacillus,Lactococcus,Listeria,Mycobacterium,Saccharomyces,Salmonella,Staphylococcus,Streptococcus,Vibrio,Bacillus coagulans,Bacillus subtilis,Bacteroides fragilis,Bacteroidessubtilis,Bacteroides thetaiotaomicron,Bifidobacterium adolescentis,Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium breve UCC2003,Bifidobacteriuminfantis,Bifidobacterium lactis,Bifidobacterium longum,Clostridiumacetobutylicum,Clostridium butyricum,Clostridium butyricum M-55,Clostridiumbutyricum miyairi,Clostridium cochlearum,Clostridium felsineum,Clostridiumhistolyticum,Clostridium multifermentans,Clostridium novyi-NT,Clostridiumparaputrificum,Clostridium pasteureanum,Clostridium pectinovorum,Clostridiumperfringens,Clostridium roseum,Clostridium sporogenes,Clostridium tertium,Clostridium tetani,Clostridium tyrobutyricum,Corynebacterium parvum,Escherichia coli MG1655,Escherichia coli Nissle 1917,Listeria monocytogenes,Mycobacterium bovis,Salmonella choleraesuis,Salmonella typhimurium,Vibriocholera和表3所示细菌。在某些实施方式中，基因工程化细菌选自Enterococcus faecium,Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus bulgaricus,Lactobacillus casei,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus paracasei,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus rhamnosus,Lactococcus lactis,和Saccharomyces boulardii。在某些实施方式中，基因工程化细菌选自Bacteroidesfragilis,Bacteroides thetaiotaomicron,Bacteroides subtilis,Bifidobacteriumbifidum,Bifidobacterium infantis,Bifidobacterium lactis,Clostridiumbutyricum,Escherichia coli Nissle,Lactobacillus acidophilus,Lactobacillusplantarum,Lactobacillus reuteri,和Lactococcus lactis。在一些实施方式中，乳杆菌用于一种或多种免疫调节剂的肿瘤特异性递送。已经发现静脉内注射干酪乳杆菌在肿瘤中积聚，其通过硝酸甘油(NG)(一种常用的NO供体)增强，可能是由于NO在增加血管流向血管内肿瘤中的作用(Methods Mol Biol.2016；1409:9-23.Enhancement of Tumor-TargetedDelivery of Bacteria with Nitroglycerin Involving Augmentation of the EPREffect)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌是专性厌氧菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是梭菌并且能够肿瘤特异性递送免疫调节剂。梭菌属于专性厌氧细菌，其产生孢子并且天然能够定植并且在一些情况下溶解缺氧肿瘤(Groot等，2007)。在实验模型中，梭菌已用于递送前药转化酶并增强放射治疗(Groot等，2007)。在一些实施方式中，基因工程化细菌选自Clostridium novyi-NT,Clostridium histolyticium,Clostridium tetani,Clostridium oncolyticum,Clostridium sporogenes,和Clostridium beijerinckii(Liu等，2014)。在一些实施方式中，梭菌属天然是非致病性的。例如，溶瘤梭菌(Clostridiumoncolyticum)是致病性的并且能够裂解肿瘤细胞。在替代性实施方式中，梭菌属天然致病性但经过修饰以降低或消除致病性。例如，Clostridium novyi是天然致病性的，并且Clostridium novyi-NT被修饰以去除致死毒素。Clostridium novyi-NT和Clostridiumsporogenes已用于递送单链HIF-1α抗体以治疗癌症，并且是“优良的肿瘤定植梭菌属菌株”(Groot等，2007)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌兼性厌氧菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是沙门氏菌，例如鼠伤寒沙门氏菌，并且能够肿瘤特异性递送免疫调节剂。沙门氏菌是非孢子形成的革兰氏阴性细菌，是兼性厌氧菌。在一些实施方式中，沙门氏菌是天然致病性的，但经过修饰以减少或消除致病性。例如，对鼠伤寒沙门氏菌进行修饰以去除致病位点(减毒)。在一些实施方式中，基因工程化细菌是双歧杆菌并且能够肿瘤特异性递送免疫调节剂。双歧杆菌是革兰氏阳性，分支的厌氧细菌。在一些实施方式中，双歧杆菌天然是非致病性的。在替代性实施方式中，双歧杆菌是天然致病性的，但经过修饰以降低或消除致病性。已显示双歧杆菌和沙门氏菌优先靶向并在肿瘤的缺氧和坏死区域中复制(Yu等，2014)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是大肠杆菌。例如，已显示大肠杆菌Nissle在口服或静脉内给药后优先在体内定植肿瘤组织(Zhang等，2012和Danino等，2015)。大肠杆菌也显示出强大的肿瘤特异性复制(Yu等，2008)。在一些实施方式中，基因工程化细菌是大肠杆菌菌株Nissle 1917(大肠杆菌Nissle)，肠杆菌科的革兰氏阴性细菌，“已经进化为最佳表征的益生菌之一”(Ukena等，2007)。该菌株的特征在于其完全无害(舒尔茨，2008)，并且具有GRAS(通常识别为安全)状态(Reister等，2014，强调)。
本发明的基因工程化细菌可以被破坏，例如通过组织或血清中的防御因子(Sonnenborn等，2009)。在一些实施方式中，重复施用基因工程化细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌施用一次。
在某些实施方式中，本文所述的效应物和/或免疫调节剂在基因工程化细菌的一个物种、菌株或亚型中表达。在替代性实施方式中，效应物和/或免疫调节剂在基因工程化细菌的两个或更多个物种、菌株和/或亚型中表达。本领域普通技术人员将理解，本文公开的遗传修饰可以被修饰并适用于其他物种、菌株和细菌亚型。
适合的细菌的其他实例描述于国际专利公开WO/2014/043593中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，突变此类细菌以减弱一种或多种毒力因子。
在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌在肿瘤中增殖和定植。在一些实施方式中，定植持续数天、数周、数月、数年或无限期。在一些实施方式中，基因工程化细菌不在肿瘤中增殖，并且注射后细菌计数迅速下降(例如，少于注射后一周)直至不再能够检测到。
噬菌体
在一些实施方式中，本公开的基因工程化细胞包含处于其天然状态的一种或多种溶原性、休眠、温带、完整、有缺陷的、隐性或卫星噬菌体或细菌素/噬菌体尾或基因转移剂。在一些实施方式中，原噬菌体或噬菌体存在于特定目标细菌的所有分离物中。在一些实施方式中，细菌是包含一种或多种此类噬菌体的亲本菌株的基因工程化衍生物。在本申请所述的任何实施方式中，细菌可以包含在原噬菌体或噬菌体基因组内的一种或多种修饰或突变，所述修饰或突变改变了噬菌体的性质或行为。在一些实施方式中，修饰或突变阻止原噬菌体进入或完成裂解过程。在一些实施方式中，修饰或突变阻止噬菌体感染相同或不同类型的其他细菌。在一些实施方式中，修饰或突变改变细菌宿主的健康。在一些实施方式中，修饰或突变不改变细菌宿主的健康。在一些实施方式中，修饰或突变影响所需的效应功能，例如在基因工程化细菌效应分子(例如，免疫调节剂，例如免疫刺激剂或维持剂)的表达水平上。在一些实施方式中，修饰或突变对所需的功能不具有影响，例如在效应分子的表达水平上或者在效应分子的活性水平上。
噬菌体的基因组大小有所不同，范围从最小的明串珠菌属噬菌体L5(2,435bp)、～11.5kbp(例如，支原体噬菌体P1)、～21kbp(例如，乳球菌噬菌体c2)和～30kbp(例如，巴斯德氏菌噬菌体F108)至接近500kbp的巨大芽孢杆菌噬菌体G的基因组(Hatfull和Hendrix；Bacteriophages and their Genomes,Curr Opin Virol.2011Oct 1；1(4):298–303，以及其中的参考文献)。噬菌体基因组可以编码少于10个基因至多达数百个基因。温带噬菌体或原噬菌体通常整合至细菌宿主的染色体中，尽管还存在整合到细菌质粒中的噬菌体的一些实例(Little,Loysogeny,Prophage Induction,and Lysogenic Conversion.In:WaldorMK,Friedman DI,Adhya S,editors.Phages Their Role in Bacterial Pathogenesisand Biotechnology.Washington DC:ASM Press；2005.pp.37–54)。在一些情况下，噬菌体总是位于细菌宿主染色体内的相同位置，并且该位置对于每种噬菌体都是特异性的，即不同噬菌体位于不同位置。其他噬菌体可以在很多不同的位置整合。
因此，本公开内容的细菌包含一种或多种噬菌体基因组，其长度可以从至少约1bp至10kb、从至少约10kb至20kb、从至少约20kb至30kb、从至少约30kb至40kb、从至少约30kb至40kb、从至少约40kb至50kb、从至少约50kb至60kb、从至少约60kb至70kb、从至少约70kb至80kb、从至少约80kb至90kb、从至少约90kb至100kb、从至少约100kb至120kb、从至少约120kb至140kb、从至少约140kb至160kb、从至少约160kb至180kb、从至少约180kb至200kb、从至少约200kb至180kb、从至少约160kb至250kb、从至少约250kb至300kb、从至少约300kb至350kb、从至少约350kb至400kb、从至少约400kb至500kb、从至少约500kb至1000kb变化。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含长度大于1000kb的噬菌体基因组。
在一些实施方式中，本公开内容的细菌包含一种或多种噬菌体基因组，其包含编码一种或多种多肽的一个或多个基因。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含噬菌体基因组，其含有至少约1至5个基因、至少约5至10个基因、至少约10至15个基因、至少约15至20个基因、至少约20至25个基因、至少约25至30个基因、至少约30至35个基因、至少约35至40个基因、至少约40至45个基因、至少约45至50个基因、至少约50至55个基因、至少约55至60个基因、至少约60至65个基因、至少约65至70个基因、至少约70至75个基因、至少约75至80个基因、至少约80至85个基因、至少约85至90个基因、至少约90至95个基因、至少约95至100个基因、至少约100至115个基因、至少约115至120个基因、至少约120至125个基因、至少约125至130个基因、至少约130至135个基因、至少约135至140个基因、至少约140至145个基因、至少约145至150个基因、至少约150至160个基因、至少约160至170个基因、至少约170至180个基因、至少约180至190个基因、至少约190至200个基因、至少约200至300个基因。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含噬菌体基因组，其含有不超过约300个基因。
在一些实施方式中，在特定物种中，噬菌体总是或几乎总是位于细菌宿主染色体内的相同位置或部位。在一些实施方式中，在特定物种中，发现噬菌体整合在宿主染色体内的不同位置。在一些实施方式中，噬菌体位于质粒上。
在一些实施方式中，原噬菌体可以是有缺陷的或隐性原噬菌体。有缺陷的原噬菌体不能再经历裂解周期。隐性原噬菌体可能无法经历裂解周期或从未经历过裂解周期(Bobay等，2014)。在一些实施方式中，细菌包含一种或多种卫星噬菌体基因组。除此之外，卫星噬菌体是功能性噬菌体，其不携带其自身的结构蛋白，并且具有被配置为被其他特异性噬菌体的结构蛋白封装的基因组(Six and Klug Bacteriophage P4:a satellitevirus depending on a helper such as prophage P2,Virology，第51卷，第2期，1973年2月，第327-344页)。
在一些实施方式中，细菌包含一种或多种尾菌素(tailiocins)。很多细菌(革兰氏阳性和革兰氏阴性)都会产生多种类似于噬菌体尾的颗粒，这些颗粒在没有相关噬菌体头的情况下具有功能(称为尾菌素)，并且其中的很多已显示出具有细菌素的性质(参见综述Ghequire和Mot,The Tailocin Tale:Peeling off Phage；Trends in Microbiology，2015年10月，Vol.23,No.10)。噬菌体尾样细菌素分为两个不同的家族：可收缩的噬菌体尾样(R-型)和不可收缩但是柔性的噬菌体尾样(F-型)。在一些实施方式中，细菌包含一种或多种基因转移剂。基因转移剂(GTA)是由一些细菌基因组编码的噬菌体样元件。尽管GTA类似于噬菌体，但是其缺乏定义典型噬菌体的标志性功能，并且其包装宿主细胞DNA的随机片段，然后将其水平转移至相同物种的其他细菌中(参见综述Lang等，Gene transfer agents:phage-like elements of genetic exchange,Nat Rev Microbiol.2012 Jun 11；10(7):472–482)。这里，DNA可以通过同源重组替代驻留的同源染色体区域。然而，这些颗粒不能作为病毒传播，因为绝大多数颗粒不携带编码GTA的基因。在一些实施方式中，细菌包含一种或多种丝状病毒体。丝状病毒体整合为dsDNA原噬菌体(参见综述Marvin DA等，Structureand assembly of filamentous bacteriophages,Prog Biophys Mol Biol.2014Apr；114(2):80-122)。在任何这些实施方式中，本文所述的细菌包含有缺陷的或隐性原噬菌体、卫星噬菌体基因组、尾菌素、基因转移剂、丝状病毒体，其可以在其序列内包含一种或多种修饰或突变。
原噬菌体可以通过实验或计算来鉴定。实验方法涉及通过使宿主细菌暴露于UV线或其他破坏DNA的条件下诱导其释放噬菌体颗粒。然而，在一些情况下，诱导原噬菌体的条件是未知的，并且因此在噬菌斑测定中不存在噬菌斑并不一定能够证明不存在原噬菌体。此外，这种方法仅能够显示存在活的噬菌体，而不能揭示存在有缺陷的原噬菌体。这样，从基因组序列数据计算对原噬菌体进行鉴定已经成为最优选的途径。
2018年06月21日提交的共同待决的国际专利申请PCT/US18/38840(其全部内容通过引用并入本文)提供了益生菌的非限制性实例，如通过Phaster评分所确定的所述益生菌在细菌基因组中含有数个潜在的噬菌体。在phaster.ca以及在Zhou等(“PHAST:A FastPhage Search Tool”Nucl.Acids Res.(2011)39(suppl 2):W347-W352)和Arndt等(Arndt等，(2016)PHASTER:a better,faster version of the PHAST phage searchtool.Nucleic Acids Res.,2016年05月03日)中对Phaster评分进行了详细描述。简言之，使用三种方法以不同的标准对提供的细菌基因组序列内的原噬菌体区域(完整、可以或不完整)进行评分。
在本申请所述的任何实施方式中，本文所述的细菌可以在现有原噬菌体或噬菌体基因组内包含一种或多种修饰或突变。在一些实施方式中，这些修饰改变了原噬菌体的性质或行为。在一些实施方式中，修饰或突变阻止原噬菌体进入或完成裂解过程。在一些实施方式中，修饰或突变阻止噬菌体感染相同或不同类型的其他细菌。在一些实施方式中，修饰或突变改变细菌宿主的健康。在一些实施方式中，修饰或突变不改变细菌宿主的健康。在一些实施方式中，修饰或突变对所需的效应功能具有影响，例如基因修饰的细菌的。在一些实施方式中，修饰或突变对所需的效应功能不具有影响，例如基因修饰的细菌的。
在一些实施方式中，修饰或突变将原噬菌体裂解过程的进入或完成减少至少约1至2倍、至少约2至3倍、至少约3至4倍、至少约4至5倍、至少约5至10倍、至少约10至100倍、至少约100至1000倍。在一些实施方式中，修饰或突变完全阻止原噬菌体裂解过程的进入或完成。
在一些实施方式中，修饰或突变将原噬菌体裂解过程的进入或完成减少至少约1％至10％、至少约10％至20％、至少约20％至30％、至少约30％至40％、至少约40％至50％、至少约50％至60％、至少约60％至70％、至少约70％至80％、至少约80％至90％或者至少约90％至100％。
在一些实施方式中，突变包括在噬菌体基因组序列内的一种或多种缺失。在一些实施方式中，突变包括在噬菌体基因组序列中的一种或多种插入。在一些实施方式中，可以将抗生素表达盒插入噬菌体基因组序列内的一个或多个位置中。在一些实施方式中，突变包括在噬菌体基因组序列内的一种或多种取代。在一些实施方式中，突变包括在噬菌体基因组序列内的一种或多种倒位。在一些实施方式中，在噬菌体基因组内的修饰是一种或多种噬菌体基因组基因内的两种或多种插入、缺失、取代或倒位的组合。在本申请所述的任何实施方式中，这些修饰可以导致噬菌体基因组内的一种或多种基因的一种或多种移码突变。
在任何这些实施方式中，突变可以位于编码各种功能的蛋白的一种或多种基因内或者涵盖所述基因，所述功能例如裂解(例如，蛋白酶或溶素)、毒素、抗生素抗性、翻译、结构(例如，头、尾、项或外壳蛋白)、噬菌体装配、重组(例如，整合酶、转化酶或转座酶)或复制(例如，引发酶、tRNA相关蛋白)、噬菌体插入、附着、包装或末端酶。
在一些实施方式中，本文所述的基因工程化细菌是经工程化的大肠杆菌菌株Nissle 1917(E.coli Nissle)。如在2018年06月21日提交的共同待决的国际专利申请PCT/US18/38840(其全部内容通过引用并入本申请)所述的，本文在实施例中更加详细地描述了鉴定由大肠杆菌Nissle 1917(E.coli Nissle)以及相关工程化的衍生物生产噬菌体的常规检测程序。为确定噬菌体的来源，对E.coli Nissle以及经工程化的衍生物的基因组进行了协同的生物信息学评估，以分析菌株基因组的序列用于得到原噬菌体的证据，以评估任何鉴定的原噬菌体元件产生功能性噬菌体的可能性，以将任何功能性噬菌体元件与在细菌基因组序列中已鉴定出的其他已知噬菌体进行比较，以及以评价在其他测序的大肠杆菌(E.coli)基因组中发现原噬菌体元件的频率。评估工具包括噬菌体预测软件(PHAST andPHASTER)、SPAdes基因组组装软件、用于针对较大参照基因组的低差异序列作图的软件(BWA MEM)、基因组序列比对软件(MUMmer)和美国国家生物技术信息中心(NCBI)非冗余数据库。评估结果表明，所分析的E.coli Nissle和经工程化的衍生物含有三种候选的原噬菌体元件，这三种中的两种(噬菌体2和噬菌体3)含有完整噬菌体基因组的大部分遗传特征。还鉴定了另外两个可能的噬菌体元件。值得注意的是，经工程化改造的菌株不含任何其他在亲本E.coli Nissle中未鉴定出的噬菌体元件，表明由这些菌株产生的噬菌斑形成单位来源于这些内源性噬菌体之一(噬菌体3)。有趣的是，噬菌体3在大约6000个已测序的E.coli基因组集合中对E.coli Nissle而言是唯一的，尽管在少数基因组中发现了与其他推定原噬菌体元件具有同源性的限于较短区域的相关序列。发现噬菌体3而非任何其他噬菌体是诱导型的并且在诱导后导致细菌裂解。
原噬菌体在E.coli菌株中非常普遍，与已经良好表征的一组已测序的E.coli基因组中发现的平均数量相比，E.coli Nissle中含有相对较少的原噬菌体序列。这样，在经工程化的菌株中存在的原噬菌体是该物种天然状态的一部分，并且所分析的经工程化的菌株的原噬菌体性质与祖先菌株E.coli Nissle一致。
在一些实施方式中，本文所述的细菌含有在E.coli Nissle噬菌体3基因组内的一种或多种修饰或突变，其改变了噬菌体3的性质或行为。在一些实施方式中，修饰或突变阻止噬菌体3进入或完成裂解过程。在一些实施方式中，修饰或突变阻止E.coli Nissle噬菌体3感染相同或不同类型的其他细菌。在一些实施方式中，修饰或突变改善了细菌宿主的健康。在一些实施方式中，未观察到对细菌宿主健康的影响。在一些实施方式中，修饰或突变对所需的效应功能具有影响，例如免疫调节剂的表达。在一些实施方式中，未观察到对所需效应功能的影响，例如免疫调节剂的表达。
在一些实施方式中，引入细菌底盘(chassis)的突变包括在E.coli Nissle噬菌体3基因组序列内的一种或多种缺失。在一些实施方式中，突变包括在E.coli Nissle噬菌体3基因组序列内的一种或多种插入。在一些实施方式中，可以将抗生素表达盒插入E.coliNissle噬菌体3基因组序列内的一个或多个位置。在共同待决的美国临时申请62/523,202和62/552,829中更加详细地描述了噬菌体3中的突变，其全部内容通过引用并入本文。
表4.E.coli Nissle噬菌体3的基因组
Figure BDA0002364453000000891
Figure BDA0002364453000000901
Figure BDA0002364453000000911
Figure BDA0002364453000000921
Figure BDA0002364453000000931
在一个特异性的实施方式中，E.coli Nissle噬菌体3基因组的至少约9000至10000bp发生突变，例如，在一个实例中，E.coli Nissle噬菌体3的9687bp缺失。
在本申请所述的任何实施方式中，修饰包含在位于选自下述的一个或多个基因中：ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09975、ECOLIN_09980、ECOLIN_09985、ECOLIN_09990、ECOLIN_09995、ECOLIN_10000、ECOLIN_10005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10035、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10055、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340和ECOLIN_10345。
在一个实施方式中，突变是下述中的一个或多个的完全或部分缺失：ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170和ECOLIN_10175。在一个特异性的实施方式中，突变是ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170和ECOLIN_10175的完全或部分缺失。在一个特异性的实施方式中，突变是ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165和ECOLIN_10170的完全缺失，以及ECOLIN_10175的缺失突变。在一个实施方式中，噬菌体基因组在位于SEQ ID NO:1285内的一个或多个位置突变或缺失。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1432的至少约0-1％、1％-10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％从噬菌体基因组中缺失。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1432的至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或者至少约100％从噬菌体基因组中缺失。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1432的至少约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％从噬菌体基因组中缺失。在一个实施方式中，包含SEQ ID NO:1432的序列从噬菌体3基因组中缺失。在一个实施方式中，SEQ ID NO:1432所示的序列从噬菌体3基因组中缺失。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含含有SEQ ID NO:1433的修饰的噬菌体基因组序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含由SEQ ID NO:1433组成的修饰的噬菌体基因组序列。
效应分子
固有免疫应答的溶瘤和激活
在某些实施方式中，本公开的一种或多种效应分子或一种或多种免疫调节剂产生了固有抗肿瘤免疫应答。在某些实施方式中，本公开的一种或多种免疫调节剂产生了局部抗肿瘤免疫应答。在一些方面中，效应分子或免疫调节剂能够激活针对远距离肿瘤细胞的系统性抗肿瘤免疫力。在某些实施方式中，一种或多种免疫调节剂产生系统性或适应性抗肿瘤免疫应答。在一些实施方式中，一种或多种免疫调节剂导致长期免疫记忆。一种或多种适宜的免疫调节剂的实例(例如，免疫引发剂和/或免疫维持剂)如本文所述。
在一些实施方式中，一种或多种免疫调节剂可以由本文所述的修饰微生物生产。在其他实施方式中，一种或多种免疫调节剂可以与能够生产一种或多种第二免疫调节剂的修饰微生物联合施用。例如，一种或多种免疫引发剂可以与能够生产一种或多种免疫维持剂的修饰微生物联合施用。在另一个实施方式中，一种或多种免疫维持剂可以与能够生产一种或多种免疫引发剂的修饰微生物联合施用。或者，一种或多种第一免疫引发剂可以与能够生产一种或多种第二免疫引发剂的修饰微生物联合施用。或者，一种或多种第一免疫维持剂可以与能够生产一种或多种第二免疫维持剂的修饰微生物联合施用。
在肿瘤微环境中发现的许多免疫细胞表达模式识别受体(PRR)，这些受体通过激活促炎信号传导通路、刺激吞噬反应(巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞)或作为分泌蛋白质结合微生物而在固有免疫应答中发挥关键作用。PRR识别两类分子：与微生物病原体相关的病原体相关分子模式(PAMP)，和与在细胞损伤、死亡应激或组织损伤过程中释放的细胞组分相关的损伤相关分子模式(DAMP)。PAMP对于每种病原体是独特的，并且是病原体存活所需的必需分子结构，例如细菌细胞壁分子(例如脂蛋白)、病毒衣壳蛋白以及病毒和细菌DNA。PRR可以识别各种微生物病原体，包括细菌、病毒、寄生虫、真菌和原生动物。PRR主要由固有免疫系统的细胞表达，例如，抗原呈递巨噬细胞和树突状细胞，但也可以由其他细胞(免疫细胞和非免疫细胞两者)表达，并且定位于细胞表面以检测细胞外病原体或定位于内体和细胞基质内，在那里它们检测细胞内入侵病毒。
PRR的实例包括Toll样受体(TLR)，其是具有检测感染病原体的细胞外结构域的1型跨膜受体。TLR1、2、4和6识别细菌脂质，TLR3、7和8识别病毒RNA，TLR9识别细菌DNA，TLR5和10识别细菌或寄生虫蛋白。PRR的其他实例包括C型凝集素受体(CLR)，例如I组甘露糖受体和II组脱唾液酸糖蛋白受体，细胞质(细胞内)PRR，核苷酸寡聚化(NOD)样受体(NLR)，例如NOD1和NOD2，视黄酸诱导基因I(RIG-I)样受体(RLR)，例如RIG-I、MDA5和DDX3，以及分泌的PRR，例如集合素、五聚蛋白、纤维凝胶、脂质转移酶、肽聚糖识别蛋白(PGR)和富含亮氨酸的重复受体(LRR)。
PRR启动信号通路的激活，例如刺激共刺激分子和促炎细胞因子的产生的NF-κB通路，例如I型IFN、IL-6、TNF和IL-12，其机制在激活针对感染性病原体的炎症和免疫应答中起作用。这样的应答引发参与适应性免疫应答的肿瘤微环境中存在的免疫细胞的激活(例如，抗原提呈细胞(APC)，例如B细胞、DC、TAM和其他髓系来源的抑制细胞)。最近的证据表明，由PAMP和DAMP激活的免疫机制也在激活针对肿瘤细胞的免疫应答中起作用(LeMercier等，Canc Res,73:4629-40(2013)；Kim等，Blood,119:355-63(2012))。
另一种PRR亚家族是被认为是在病毒感染时的双链病毒RNA的感测子和可以被靶向用于肿瘤内免疫刺激的RIG-I样受体(RLR)。在刺激时，例如，在肿瘤内递送溶瘤病毒时，RLR触发宿主细胞释放I型IFN并导致其通过细胞凋亡而死亡。这样的细胞因子和肿瘤相关抗原(TAA)释放也导致抗肿瘤免疫应答的激活。鉴于RLR在所有肿瘤类型中内源表达，它们是通用的免疫原性治疗靶点，并且特别与通过局部递送溶瘤病毒产生的免疫应答相关。
在一些方面中，细菌底盘本身可以激活一种或多种RRR受体(例如，TLR或RIGI)，并且刺激固有免疫应答。在一些方面中，PRR(例如，TLR或RIGI)被由基因工程化的细菌产生的一种或多种免疫调节剂激活。
裂解肽
由于存在PAMP和DAMP，本公开内容的细菌本身可以导致肿瘤部位的细胞裂解，这将引发固有免疫应答。此外，一些细菌具有裂解微生物的附加特征，具有裂解肿瘤细胞的能力。因而，在一些实施方式中，工程化微生物产生天然或天然裂解肽。在一些实施方式中，可以进一步改造细菌以产生一种或多种细胞毒性分子，例如裂解肽，其具有在递送至肿瘤部位时在肿瘤微环境中局部裂解癌症或肿瘤细胞的能力。在细胞裂解后，肿瘤细胞释放肿瘤相关抗原，其用于促进适应性免疫应答。PAMP和DAMP的存在促进抗原提呈细胞的成熟，例如树突状细胞，其激活抗原特异性CD4+和CD8+T细胞应答。因而，在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生一种或多种细胞毒素。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够身缠一种或多种裂解肽分子。可以由基因工程化细菌生产的示例性裂解肽和细胞毒素以及其是如何表达、诱导和调控的，参见2017年01月11日提交的国际专利申请PCT/US2017/013072和2018年01月01日提交的PCT/US2018/012698，其每一个的全部内容均通过引用并入本文。
在任何这些实施方式中，包含编码裂解肽的一个或多个基因序列的基因工程化细菌进一步包含编码一种或多种其他效应分子的基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢调节剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码裂解肽的回路可以与编码本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在本文所述的组成型或诱导型启动子(例如，低氧诱导型启动子)或任何其他组成型或诱导型启动子的控制下。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码裂解肽的一种或多种基因序列可以与编码本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码裂解肽的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在本文所述的组成型或诱导型启动子(例如，低氧诱导型启动子，如FNR)或任何其他组成型或诱导型启动子的控制下。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码裂解肽的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在本文所述的组成型或诱导型启动子(例如，低氧诱导型启动子，如FNR)或任何其他组成型或诱导型启动子的控制下。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以进一步包含噬菌体修饰，例如在如本文所述的内源性原噬菌体中的突变或缺失。
抗原/疫苗
通过将肿瘤抗原(例如肿瘤特异性抗原，肿瘤相关抗原(TAA(s))和/或新抗原引入局部肿瘤环境，可以产生针对特定目标癌症或肿瘤细胞的免疫应答，已知其与新抗原相关。如在本文中所使用的，术语“肿瘤抗原”意指肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原(TAA)和新抗原。如在本文中所使用的，肿瘤抗原还包括“致癌病毒抗原”、癌胚抗原、组织分化抗原和癌-睾丸抗原。可以改造工程化微生物，使得肽(例如，肿瘤抗原)可以锚定在微生物细胞壁中(例如，在微生物细胞表面)。因而，在一些实施方式中，基因工程化细菌被工程化以产生一种或多种肿瘤抗原。可以由本公开的细菌生产的此类肿瘤抗原的非限制性实例描述在例如2017年01月11日提交的国际专利申请PCT/US2017/013072中，以及2018年01月01日提交的公开号WO2017/123675和PCT/US2018/012698中，其每一个的全部内容均通过引用并入本文或者以其他方式在本领域中是公知的。
在任何这些实施方式中，包含编码抗原的一种或多种基因序列的基因工程化的细菌进一步包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码抗原的回路可以与编码本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在本文所述的组成型或诱导型启动子(例如，低氧诱导型启动子)或任何其他组成型或诱导型启动子的控制下。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码抗原的基因序列可以与编码如本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的基因序列组合。在一些实施方式中，与编码抗原的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在本文所述的组成型或诱导型启动子(例如，低氧诱导型启动子，如FNR)或任何其他组成型或诱导型启动子的控制下。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码抗原的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在本文所述的组成型或诱导型启动子(例如，低氧诱导型启动子，如FNR)或任何其他组成型或诱导型启动子的控制下。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以进一步包含噬菌体修饰，例如在如本文所述的内源性原噬菌体中的突变或缺失。
前药
前药治疗提供较少反应性和细胞毒性的抗癌药物。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够将前药转化为其活性形式。合适的前药系统的一个实例是5-FC/5-FU系统。
细胞毒性和放射增敏剂5-氟尿嘧啶(5-FU)用于治疗许多癌症，包括胃肠道癌症、乳腺癌、头颈癌和结肠直肠癌(Duivenvorrden等，2006,Sensitivity of 5-fluorouracil-resistant cancer cells to adenovirus suicide gene therapy；Cancer Gene Therapy(2006)14,57–65)。然而，毒性限制了其在较高浓度下的给药。为了在肿瘤中获得更高浓度且毒性更小，开发了前药系统。胞嘧啶脱氨酶使前药5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨基成5-FU。可以以相对高的浓度引入5-FC，允许在肿瘤部位产生的5-FU达到高于可以全身安全施用的浓度。在肿瘤部位，然后通过细胞酶将5-FU转化为有效的嘧啶抗代谢物，5-FdUMP、5-FdUTP和5-FUTP。这些代谢产物作为代谢阻滞剂起作用，抑制胸苷酸合成酶，将核糖核苷酸转化为脱氧核糖核苷酸，从而抑制DNA合成(Horani等，2015,.Anticancer Prodrugs-Three DecadesOf Design；wjpps；第4卷，第07期，1751-1779，以及其中的参考文献)。
该系统通过包含将5-FU转化为5-氟尿苷一磷酸的UPRT进一步改进，这是其激活途径的第一步，类似于哺乳动物乳清酸磷酸核糖转移酶的作用(Tiraby等，1998；Concomitantexpression of E.coli cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferaseimproves the cytotoxicity of 5-fluorocytosine.FEMS Microbiol Lett 1998；176:41–49)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够将5-FC转化为5-FU。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够在肿瘤微环境中将5-FC转化为5-FU。在一些实施方式中，5-FC是全身性施用的。在一些实施方式中，5-FC是口服、静脉内或皮下施用的。在一些实施方式中，5-FC是通过瘤内注射施用的。基因工程化细菌包含编码胞嘧啶脱氨酶的基因序列(EC3.5.4.1)。
在一些实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌。在一些实施方式中，胞嘧啶脱氨酶是codA。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达来自酵母的胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达codA-upp融合蛋白。
适用于基因工程化细菌中异源表达的胞嘧啶脱氨酶的非限制性实例包括鲾鱼发光杆菌曼达帕姆svers.1.1亚种(PMSV_1378)，门多萨假单胞菌NK-01(MDS_1548)，天蓝色链霉菌A3(2)(SCO4634)，木糖氧化无色杆菌AXX-A(AXXA_10715，AXXA_16292)，葡糖醋杆菌属sp.SXCC-1(CODA)，鸭源鸡杆菌UMN179(UMN179_00049)，产酸克雷伯菌KCTC 1686(KOX_14050,KOX_04555)，Taylorella asinigenitalis MCE3(TASI_1310)，玫瑰红球菌RHA1(RHA1_RO00599，RHA1_RO00597)，产气肠杆菌KCTC 2190(EAE_13265，EAE_05115)，分节丝状菌sp.SFB-小鼠-日本(SFBM_1249)，青枯雷尔氏菌Po82(CODA)，深层盐水球形菌E1L3A(SSPSH_07086)，粘多糖芽孢杆菌KNP414(KNP414_03230，KNP414_03233)，大豆慢生根瘤菌USDA 6(BJ6T_60100，BJ6T_60090)，分节丝状菌sp.SFB-大鼠-Yit(RATSFB_1079)，恶臭假单胞菌S16(PPS_2740)，Weissella koreensis KACC 15510(WKK_05060)，阴沟肠杆菌EcWSU1(YAHJ，CODA)，Bizionia argentinensis JUB59(BZARG_2213)，根癌农杆菌F2(AGAU_L101956)，脱氮副球菌SD1(PDI_1216)，嗜酸性硫杆菌TPY(CODA)，塔氏弧菌ATCC 19109(VITU9109_13741)，沃森硝化球菌C-113(NWAT_2475)，蟑螂杆状体属sp.(达尔文澳白虫义)str.MADAR(CODA)，蟑螂杆状体属sp.(隐尾蠊)str.Cpu(CODA)，Pelagibacteriumhalotolerans B2(KKY_852，KKY_850)，伯克氏菌属sp.YI23(BYI23_A018410，BYI23_A008960)，聚球藻属sp.CC9605(SYNCC9605_0854)，荧光假单胞菌F113(AEV61892.1)，弧菌属EJY3(VEJY3_16491)，细长聚球藻PCC 7942(SYNPCC7942_0568)，慢生根瘤菌属sp.ORS278(BRADO1789,BRADO0862)，集胞藻属sp.PCC 6803(CODA)，原型微鞘藻PCC 7420(MC7420_274)，原绿球藻str.AS9601(CODA)，大肠杆菌O157:H7 str.EDL933(YAHJ,CODA)，恶臭假单胞菌KT2440(CODA)，聚球藻属sp.WH 8109(SH8109_1371)，海藻原球菌亚种marinusstr.CCMP1375(SSNA)，原绿球藻str.MIT 9515(CODA)，原绿球藻str.MIT 9301(CODA)，原绿球藻str.NATL1A(CODA)，根癌农杆菌str.C58(ATU4698)，自养脱硫杆菌HRM2(CODA)，蓝藻属sp.PCC 7001(CPCC7001_2605)，鼠疫耶尔森氏菌KIM10(CODA)，产气荚膜梭菌ATCC 13124(CODA)，类诺卡氏属sp.JS614(NOCA_1495)，有效棒杆菌YS-314(CODA)，谷氨酸棒杆菌ATCC13032(CGL0076，CODA)，炭疽杆菌str.Ames(BAS4389)，Dickeya dadantii 3937(CODA)，大肠杆菌CFT073(CODA，YAHJ)，红海束毛藻IMS101(TERY_4570)，荧光假单胞菌Pf0-1(CODA，PFL01_3146)，长双歧杆菌NCC2705(CODA)，肉食杆菌属sp.17-4(CAR_C04640，ATZC)，铜绿假单胞菌PAO1(CODA)，破伤风梭菌E88(CTC_01883)，鼠疫耶尔森氏菌CO92(CODA)，新洋葱伯克霍尔德菌J2315(BCAM2780，CODA)，荧光假单胞菌SBW25(CODA)，创伤弧菌CMCP6(VV2_0789)，Salmonella bongori NCTC 12419(CODA)，肠沙门氏菌亚种肠血清型Typhi str.CT18(CODA)，荧光假单胞菌Pf-5(CODA)，伊希海洋杆菌HTE831(OB1267)，聚球藻属sp.RS9916(RS9916_32902)，聚球藻属sp.RS9917(RS9917_02061)，产琥珀酸曼氏杆菌MBEL55E(SSNA)，副溶血弧菌RIMD 2210633(VPA1243)，大豆慢生根瘤菌USDA 110(BLL3846，BLL7276)，Marinobacter adhaerens HP15(HP15_2772)，粪肠球菌V583 3seqs EF_1061，EF_1062，EF_0390)，蜡样芽孢杆菌ATCC 14579(BC_4503)，聚球藻属sp.CB0101(SCB01_010100001875)，聚球藻属sp.CB0205(SCB02_010100013621)，鼻疽伯克霍尔德氏菌ATCC 23344(CODA)，Labrenzia alexandrii DFL-11(SADFL11_5050)，黄色粘球菌DK 1622(MXAN_5420)，Ruegeria pomeroyi DSS-3(SPO2806)，无类囊体蓝藻PCC 7421(GLL2528)，链霉菌属sp.C(SSNG_03287，SSNG_04186)，真氧产碱杆菌JMP134(REUT_B3993)，热醋穆尔氏菌ATCC 39073(MOTH_0460)，Rubrobacter xylanophilus DSM 9941(RXYL_0224)，异种伯克霍尔德氏菌LB400(BXE_A2120，BXE_A1533)，苜蓿中华根瘤菌1021(R02596)，中慢生型百脉根根瘤菌MAFF303099(MLR5363，MLL2061)，青枯雷尔氏菌GMI1000(CODA)，细长聚球藻PCC 6301(CODA)，越南伯克氏菌G4(BCEP1808_4874)，深红螺菌ATCC 11170(RRU_A2788)，海杆菌属sp.ELB17(MELB17_06099)，葡糖酸醋杆菌PAl 5(GDIA_2518，GDI3632)，肺炎克雷伯菌肺炎亚种MGH 78578(KPN_00632，CODA)，多杀巴斯德氏菌多杀巴氏杆菌亚种str.Pm70(PM0565)，类球红细菌2.4.1(RSP_0341)，戊糖片球菌ATCC 25745(PEPE_0241)，假单胞菌铁氧化酶2002(FURADRAFT_0739)，乙酰硫脱硫尿单胞菌DSM 684(DACE_0684)，Aurantimonasmanganoxydans SI85-9A1(SI859A1_01947)，慢生根瘤菌属sp.BTAi1(BBTA_2105，BBTA_7204)，阪崎肠杆菌ATCC BAA-894(ESA_03405)，金黄节杆菌TC1(AAUR_3889，AAUR_0925)，节杆菌属sp.FB24(ARTH_3600)，Jannaschia sp.CCS1(JANN_1306)，极地单胞菌属sp.JS666(BPRO_1960)，嗜压发光菌SS9(Y3946)，弗兰克氏菌sp.EuI1c(FRAEUI1C_4724，FRAEUI1C_4625)，Thermomicrobium roseum DSM 5159(TRD_1845)，葡萄土壤杆菌S4(AVI_2101，AVI_2102)，放射形土壤杆菌K84 5 seqs ARAD_9085，ARAD_9086，ARAD_8033，ARAD_3518，ARAD_9893)，费氏弧菌ES114(CODA)，鞘丝藻属sp.PCC 8106(L8106_10086)，聚球藻属sp.BL107(BL107_11056)，芽胞杆菌属sp.NRRL B-14911(B14911_04044)，玫瑰杆菌属sp.MED193(MED193_17224)，玫瑰变色菌属sp.217(ROS217_10957)，Pelagibaca bermudensisHTCC2601(R2601_16485，R2601_00530)，海单胞菌属sp.MED121(MED121_23629)，日本乳杆菌sakei亚种23K(LCA_1212)，韦氏芽孢杆菌KBAB4(BCERKBAB4_4331)，沼泽红假单胞菌HaA2(RPB_2084)，Aliivibrio salmonicida LFI1238(CODA)，聚球藻属sp.CC9902(SYNCC9902_1538)，大肠杆菌str.K-12substr.W3110(CODA,，YAHJ)，脱氮副球菌PD1222(PDEN_1057)，聚球藻属sp.WH 7803(CODA)，聚球菌属sp.JA-3-3Ab(CYA_1567，CODA)，聚球菌属sp.JA-2-3Ba(2-13)(CYB_1063，CODA)，亚麻短杆菌BL2(BLINB_010200009485)，棕色固氮菌DJ(CODA)，类芽孢杆菌属sp.JDR-2 6seqs PJDR2_6131，PJDR2_6134，PJDR2_3617，PJDR2_3622，PJDR2_3255，PJDR2_3254)，弗兰克氏菌ACN14a(FRAAL4250)，短双歧杆菌UCC2003(CODA)，蟑螂杆状体属sp.(德国小蠊)str.Bge(BLBBGE_353)，α变形杆菌BAL199(BAL199_01644，BAL199_09865)，肉食杆菌属sp.AT7(CAT7_10495，CAT7_05806)，亚硝化单胞菌C91(NEUT_1722)，哈维氏弧菌ATCC BAA-1116(VIBHAR_05319)，伯克霍尔德氏菌AMMD(BAMB_3745，BAMB_4900)，产琥珀酸放线杆菌130Z(ASUC_1190)，类球红细菌ATCC 17025(RSPH17025_0955)，罗伊氏乳杆菌100-23(LR0661)，隐藏嗜酸菌JF-5(ACRY_0828)，Hahella chejuensis KCTC 2396(HCH_05147)，碱性嗜碱菌OhILA(CLOS_1212，CLOS_2457)，杜氏伯克霍尔德氏菌AUO158(BDAG_04094，BDAG_03273)，玫瑰杆菌属sp.AzwK-3b(RAZWK3B_08901)，恶臭假单胞菌F1(PPUT_2527)，植物发酵乳杆菌ISDg(CPHY_3622)，短短芽孢杆菌NBRC 100599 4seqsBBR47_15870，BBR47_15630，BBR47_15620，BBR47_15610)，禽波氏杆菌197N(CODA)，大肠杆菌536(CODA，YAHJ)，北极噬菌体CJ2(PNAP_4007)，塔塔木霉菌TTB310(CODA)，詹氏菌属sp.Marseille(CODA)，施氏假单胞菌A1501(CODA)，嗜水气单胞菌嗜水亚种ATCC 7966(CODA)，真氧产碱杆菌H16(CODA，SSNA)，虫媒假单胞菌L48(PSEEN3598)，Labrenziaaggregata IAM 12614(SIAM614_16372，SIAM614_21000)，短乳杆菌ATCC 367(LVIS_1932)，Sagittula stellata E-37(SSE37_18952)，芽孢杆菌属sp.B14905 3seqs BB14905_20948，BB14905_12010，BB14905_12015)，恶臭假单胞菌W619 3seqs PPUTW619_3228，PPUTW619_2210，PPUTW619_2162)，嗜麦芽寡养单胞菌R551-3(SMAL_2348)，瘤状伯克霍尔德菌STM815(BPHY_1477)，Vibrionales bacterium SWAT-3(VSWAT3_26556)，玫瑰杆菌属sp.GAI101(RGAI101_2568)，志贺弧菌AK1(VSAK1_17107)，土地杆菌属sp.BAL39(PBAL39_00410)，玫瑰变色菌属sp.TM1035(RTM1035_18230，RTM1035_17900)，南极杆菌238(OA238_4970)，Phaeobacter gallaeciensis DSM 17395(CODA)，Oceanibulbus indolifex HEL-45(OIHEL45_14065，OIHEL45_01925)，南极杆菌307(OA307_78)，七叶树红杆菌EF01-2(VEIS_0416，VEIS_4430)，武氏希瓦氏菌ATCC 51908(SWOO_1853)，小肠结肠炎耶尔森氏菌肠结肠炎亚种8081(CODA)，解纤维梭菌H10(CCEL_0909)，多噬伯克霍尔德氏菌ATCC 17616(CODA，BMUL_4281)，霍氏纤发菌SP-6(LCHO_0318)，瓜类果斑病菌AAC00-1(AAVE_3221)，植物伯克霍尔德氏菌PsJN(BPHYT_2598，BPHYT_2388)，代尔夫特食酸菌SPH-1(DACI_4995)，Shewanella pealeana ATCC 700345(SPEA_2187)，Dinoroseobacter shibae DFL 12(CODA)，门多萨假单胞菌ymp(PMEN_3834)，变形斑沙雷菌568(SPRO_0096，SPRO_4594)，肠杆菌属sp.638(ENT638_3792，ENT638_3140)，海单胞菌属sp.MWYL1(MMWYL1_1583)，红色糖多孢菌NRRL 2338(SERYN2_010100001217)，嗜线虫致病杆菌ATCC 19061(XNC1_2097)，Nocardioidaceae bacterium Broad-1(NBCG_02556)，荷叶光养菌DFL-43(HPDFL43_16047)，副球菌属sp.TRP(PATRP_010100008956)，蓝丝菌属sp.PCC 8801(PCC8801_1952)，Shewanella sediminis HAW-EB3(SSED_2803)，甲基杆菌属sp.4-46(M446_3603，M446_0933)，Methylobacterium radiotolerans JCM 2831(MRAD2831_4824)，固氮根瘤菌ORS571(AZC_1945)，人苍白杆菌ATCC 49188(OANT_3311)，鲁杰氏菌属sp.R11(RR11_1621)，蓝丝菌属sp.ATCC 51142(CODA)，棒状链霉菌ATCC 27064(SCLAA2_010100026671，SCLAV_5539)，球形溶菌C3-41(BSPH_4231)，肉毒杆菌NCTC 2916(CODA)，大肠杆菌厌氧杆菌DSM17241(ANACOL_03998，ANACOL_02279，ANACOL_01309)，奇迹束丝放线菌DSM 43827(AMIR_0538)，Sanguibacter keddieii DSM 10542(SKED_28020，SKED_17260)，Stackebrandtianassauensis DSM 44728(SNAS_1703)，铜绿微囊藻NIES-843(MAE_05360)，产气荚膜梭菌NCTC 8239(CODA)，Kitasatospora setae KM-6054(KSE_36300，KSE_36320)，氯酚节杆菌A6(ACHL_1061)，灰链霉菌灰褐色亚种NBRC 13350(SGR_6458)，梭菌属sp.7_2_43FAA(CSBG_02087)，Clostridiales bacterium1_7_47FAA(CBFG_00901)，白色链霉菌J1074(SSHG_05633)，哈里法氏希瓦氏菌HAW-EB4(SHAL_2160)，Methylobacterium nodulans ORS 2060(MNOD_3349)，链霉菌属sp.Mg1(SSAG_05271)，塔斯马尼亚欧文氏菌Et1/99(CODA)，大肠杆菌BL21(DE3)(YAHJ，CODA，B21_00295，B21_00283)，沃氏弓形杆菌DSM 14684(CWOE_5700，CWOE_5704，CWOE_0344)，柠檬酸杆菌属sp.30_2(CSAG_03013，CSAG_02691)，伯克霍尔德氏菌1_1_47(HMPREF0189_01313)，肠杆菌科细菌9_2_54FAA(HMPREF0864_03568)，溃疡梭杆菌ATCC 49185(FUAG_02220)，可变梭杆菌ATCC 27725(FVAG_00901)，Beutenbergia cavernaeDSM 12333(BCAV_1683，BCAV_1451)，斯氏普罗威登斯菌ATCC 25827(PROSTU_04183)，彭氏变形杆菌ATCC 35198(PROPEN_03672)，粉红链孢囊菌DSM 43021(SROS_3184，SROS_4847)，类芽孢杆菌属sp.Y412MC10(GYMC10_2692，GYMC10_4727，GYMC10_3398)，大肠杆菌ATCC8739(YAHJ，CODA)，Ktedonobacter racemifer DSM 44963(KRAC_3038)，Marinomonasposidonica IVIA-Po-181(MAR181_2188)，蓝丝菌属sp.PCC 7822(CYAN7822_1898)，迟缓爱德华氏菌EIB202(CODA)，拉氏普罗威登斯菌DSM 4541(PROVRUST_05865)，生癌肠杆菌ATCC35316(ENTCAN_08376，ENTCAN_08631)，杨氏柠檬酸杆菌ATCC 29220(CIT292_10672，CIT292_09697)，柠檬胞菌属sp.SE45(CSE45_2970)，艾伯特埃希菌TW07627(ESCAB7627_0317)，食羧假单胞菌OM5(OCAR_4627，CODA)，大肠杆菌str.K-12substr.MG1655(YAHJ，CODA)，布氏乳杆菌NRRL B-30929(LBUC_2038)，极大节旋藻CS-328(AMAXDRAFT_2897)，泛菌属sp.aB(PANABDRAFT_0565，PANABDRAFT_2938)，两形真杆菌DSM 3989(EUBIFOR_01772)，产碱普罗威登斯菌DSM 30120(PROVALCAL_01131，PROVALCAL_02804)，雷氏普罗威登斯菌DSM1131(PROVRETT_08714，PROVRETT_08169)，嗜麦芽寡养单胞菌K279a(ATZC2)，乳酸厌氧球菌ATCC 51172(CODA)，四头厌氧球菌ATCC 35098(HMPREF0077_0097)，粘金黄杆菌ATCC 35910(DAN2)，布氏乳杆菌ATCC 11577(CODA)，阴道乳酸杆菌ATCC 49540(CODA)，格氏利斯特菌DSM 20601(HMPREF0556_10753，HMPREF0556_10751，ATZC)，状脱硫微菌DSM 4028(DBAC_2936)，普氏厌氧球菌DSM 20548(APRE_1112)，Sebaldella termitidis ATCC 33386(STERM_0789)，Meiothermus silvanus DSM 9946(MESIL_2103)，奇异变形杆菌HI4320(CODA)，机会中生根瘤菌WSM2075(MESOP_0162)，争论贪噬菌S110(VAPAR_2654)，巨大芽孢杆菌QM B1551(BMQ_0980)，假小链双歧杆菌DSM 20438＝JCM 1200(BIFPSEUDO_04382)，Ferrimonas balearica DSM 9799(FBAL_2173)，球菌科细菌D16(HMPREF0866_00501)，不对称光杆菌非共生体亚种ATCC 43949(PAU_00294)，Halothiobacillus neapolitanus c2(HNEAP_0844)，副猪嗜血杆菌SH0165(CODA)，水稻基腐病菌Ech1591(DD1591_0763)，沃氏嗜胆菌3_1_6(HMPREF0179_03393)，鹑鸡肠球菌EG2(EGBG_00349)，铅黄肠球菌EC20(ECBG_00307)，Spirochaeta smaragdinae DSM 11293(SPIRS_1052，SPIRS_0110)，琼氏不动杆菌SH205(HMPREF0026_02783)，灿烂弧菌LGP32(VS_II0327)，Dickeya dadantii Ech703(DD703_0777)，莫雷氏菌sp.PE36(PE36_15643)，Hirschia baltica ATCC 49814(HBAL_0036)，Aminomonas paucivorans DSM 12260(APAU_2064)，类肠膜魏斯氏菌ATCC 33313(CODA)，Dickeya dadantii Ech586(DD586_3388)，链霉菌属sp.SPB78(SSLG_06016)，链霉菌属sp.AA4(SSMG_05855，SSMG_03227)，绿产色链霉菌DSM 40736(SSQG_04727)，灰黄链霉菌ATCC 33331(SFLA_1190)，氢假单胞菌ATCC BAA-1850(HMPREF1705_02256)，泛菌属sp.At-9b(PAT9B_3678，PAT9B_1029，PAT9B_0855)，争论贪噬菌EPS(VARPA_3257，VARPA_0920)，海藻原球菌亚种pastoris str.CCMP1986(CODA)，聚球菌属sp.WH 7805(WH7805_05676)，蟑螂杆状体属sp.(美洲大蠊)str.BPLAN(CODA)，水稻细菌性谷枯病菌BGR1(BGLU_1G17900)，固氮弓菌属sp.BH72(CODA)，丁酸梭菌E4 str.BoNT E BL5262(CODA)，欧文氏杆菌Ep1/96(CODA)，Erwinia billingiae Eb661(EBC_35430，CODA，EBC_32850，EBC_32780)，鮰爱德华氏菌93-146(NT01EI_3615)，柠檬酸杆菌ICC168(CODA)，Starkeya novella DSM506(SNOV_3614，SNOV_2304)，伯克氏菌属sp.CCGE1001(BC1001_2311)，伯克氏菌属sp.CCGE1002(BC1002_1908，BC1002_1610)，伯克氏菌属sp.CCGE1003(BC1003_1147)，阿氏肠杆菌LF7a(ENTAS_4074，ENTAS_3370)，中间苍白杆菌LMG 3301(OINT_2000395，OINT_2001541)，Clostridium lentocellum DSM 5427(CLOLE_1291)，埃及脱硫弧菌Aspo-2(DAES_2101)，Gordonia neofelifaecis NRRL B-59395(SCNU_19677)，聚球菌属sp.CC9311(SYNC_0740)，玛丽安热杆菌DSM 12885(TMAR_1477)，万尼氏红微菌ATCC 17100(RVAN_3395)，解纤维芽孢杆菌DSM 2522(BCELL_1091，BCELL_1234)，蓝丝菌属sp.PCC 7424(PCC7424_0235)，链霉菌属细菌3_1_57FAA_CT1(HMPREF0994_04419)，芽胞杆菌属sp.2_A_57_CT2(HMPREF1013_04901，HMPREF1013_04902，HMPREF1013_01532，HMPREF1013_04888)，阿菲波菌属sp.1NLS2(AFIDRAFT_3092)，克劳氏芽孢杆菌KSM-K16(ABC4032)，气味沙雷菌DSM 4582(YAHJ，CODA)，溶藻弧菌40B(VMC_19080)，Pseudonocardia dioxanivoransCB1190(PSED_5383)，溶珊瑚弧菌ATCC BAA-450(VIC_002709)，东方弧菌CIP 102891＝ATCC33934(VIA_000851)，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种CIP 102761(VDA_000799)，口颊普雷沃菌ATCC 35310(HMPREF0650_2329)，气味沙雷菌4Rx13(SOD_G01050，SOD_H00810)，聚球菌属sp.WH 5701(WH5701_16173，WH5701_07386)，钝顶节旋藻NIES-39(BAI89358.1)，弧菌属sp.N418(VIBRN418_08807)，阴沟肠杆菌SCF1(ENTCL_0362)，Pediococcus clausseniiATCC BAA-344(CODA)，菠萝泛菌LMG 20103(CODA，YAHJ)，缓生根瘤菌细菌SG-6C(CSIRO_2009)，Pantoea vagans C9-1(CODA，YAHJ)，发酵乳杆菌CECT 5716(LC40_0597)，Lactobacillus iners AB-1(LINEA_010100006044)，梭形芽孢杆菌ZC1(BFZC1_05123，BFZC1_05118)，涡状芽孢杆菌V453(PVOR_16204，PVOR_25863)，阴沟肠杆菌泄殖腔亚种ATCC13047(ECL_04741，ECL_03997)，Marinomonas mediterranea MMB-1(MARME_0493)，阴沟肠杆菌泄殖腔亚种NCTC 9394(ENC_29090，ENC_34640)，拉恩氏菌属sp.Y9602(RAHAQ_4063，RAHAQ_0278)，皮氏无色杆菌ATCC 43553(HMPREF0004_2397，ATZC，CODA)，Sutterellawadsworthensis3_1_45B(HMPREF9464_00595)，黄褐假单胞菌12-X(PSEFU_1564)，水生拉恩菌CIP 78.65＝ATCC 33071(AEX50243.1，AEX53933.1)，原绿球藻str.MIT 9312(PMT9312_1400)，原绿球藻str.MIT 9313(CODA)，荧光假单胞菌WH6(YAHJ)，永达尔梭菌DSM 13528(CLJU_C19230)，冰城链霉菌BCW-1(SBI_06150)，地中海氏拟无枝菌酸菌U32(AMED_1997)，具鞘微鞘藻FGP-2(MICVADRAFT_2986，MICVADRAFT_1253)，Ketogulonigenium vulgarumWSH-001(CODAB，KVU_1143)，木糖氧化无色杆菌A8(AXYL_01223，AXYL_05738，AXYL_01981，CODA)，Pedobacter saltans DSM 12145(PEDSA_0106)，Mesorhizobium ciceri biovarbiserrulae WSM1271(MESCI_0163)，恶臭假单胞菌GB-1(PPUTGB1_2651，PPUTGB1_3590)，自养黄杆菌Py2(XAUT_4058)，聚球菌属sp.WH 8102(CODA)，可变棒杆菌DSM 44702(CODA)，土壤杆菌属sp.H13-3(AGROH133_09551)，乳酸片球菌DSM 20284(CODA)，副流感嗜血杆菌T3T1(PARA_18250)，有毒威克斯菌DSM 16922(WEEVI_1993)，尿气球菌ACS-120-V-Col10a(CODA)，地下嗜热杆菌DSM 13965(THESUDRAFT_1163)，豚鼠气单胞菌Ae398(ACAVA_010100000636)，根瘤伯克霍尔德菌HKI 454(RBRH_03808)，肠沙门氏菌亚种亚利桑那血清型str.RSK2980(SARI_04290)，幽门螺杆菌ATCC 19624(HGR_11321)，Aggregatibactersegnis ATCC 33393(CODA)，Roseovarius nubinhibens ISM(ISM_11230)，白头台共生菌(PSTAS_010100016161，PSTAS_010100013574)，哈氏肺炎杆菌ACS-146-V-Sch2b(CODA)，Pseudovibrio sp.FO-BEG1(PSE_0768)，食窦魏斯氏菌KACC 11862(WCIBK1_010100001529)，聚球菌属sp.PCC 7335(S7335_2052，S7335_109，S7335_1731)，嗜热厌氧菌UNI-1(ANT_02950)，海藻原球菌str.MIT 9211(CODA)，海藻原球菌str.MIT 9215(CODA)，Fructobacillus fructosus KCTC 3544(FFRUK3_010100004834)，香肠乳杆菌KCTC 3681(LFARK3_010100001847)，食果糖乳杆菌KCTC 3543(LFRUK3_010100002075)，嗜盐四联球菌NBRC 12172(TEH_05430，TEH_14850，TEH_02220)，巴西弧菌LMG 20546(VIBR0546_1454)，Cupriavidus taiwanensis LMG 19424(CODA)，睾丸微杆菌StLB037(MTES_1247，MTES_3600)，土芽孢杆菌HPL-003(HPL003_22070)，苯妥英红单胞菌JA2(RBXJA2T_04743)，Polymorphum gilvum SL003B-26A1(SL003B_2461)，肠沙门氏菌肠型鼠伤寒杆菌亚种str.LT2(STM3334)，灰橙链霉菌M045(SGM_3210)，维氏气单胞菌B565(B565_3987)，嗜盐单胞菌属sp.TD01(GME_08209)，唐菖蒲伯克霍尔德菌BSR3(BGLA_2G13660)。
在一些实施方式中，基因工程化的细菌瘤内施用和5-FC全身性施用。在一些实施方式中，基因工程化的细菌和5-FC均全身性施用。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下(例如在体外或体内条件下)相同细菌亚型的未修饰细菌相比从5-FC产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的5-FU。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比从5-FC产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的5-FU。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下(例如在体外或体内条件下)相同细菌亚型的未修饰细菌相比从5-FC产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的5-FU。
在任何这些实施方式中，经基因工程化以产生5-FU的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的增加数量的5-FC。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的5-FC。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比生产约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的增加数量的5-FC。
在任何这些实施方式中，包含编码5-FC到5-FU的转化途径的基因序列的基因工程细菌与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比能够将细胞增殖降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更高。在任何这些实施方式中，包含编码5-FC转化为5-FU的途径的基因序列的基因工程细菌与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤生长降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在这些实施方式中的任何一个中，包含编码5-FC转化为5-FU的途径的基因序列的基因工程细菌与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤大小降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些转化实施方式中，包含编码将5-FC转化为5-FU的回路的基因序列的基因工程细菌与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更高。在这些实施方式的任一个中，包含编码5-FC转化为5-FU的途径的基因序列的基因工程细菌与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比能够减少肿瘤重量至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CodA的基因序列。在一个实施方式中，CodA基因与SEQ ID NO:1213具有至少约80％同一性。在另一个实施方式中，CodA基因与SEQ ID NO:1213具有至少约85％同一性。在一个实施方式中，CodA基因与SEQ ID NO:1213具有至少约90％同一性。在一个实施方式中，CodA基因与SEQ ID NO:1213具有至少约95％同一性。在另一个实施方式中，CodA基因与SEQ ID NO:1213具有至少约96％、97％、98％或99％同一性。因此，在一个实施方式中，CodA基因与SEQ ID NO:1213具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方式中，CodA基因包含SEQ ID NO:1213的序列。在又一个实施方式中，CodA基因由SEQ ID NO:1213的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CodA多肽的基因序列，所述CodA多肽与SEQ ID NO:1216或SEQ ID NO:1217具有至少约80％同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CodA多肽的基因序列，所述CodA多肽与SEQ ID NO:1216或SEQ ID NO:1217具有至少约90％同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CodA多肽的基因序列，所述CodA多肽与SEQ ID NO:1216或SEQ ID NO:1217具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CodA多肽的基因序列，所述CodA多肽与SEQ IDNO:1216或SEQ ID NO:1217或其功能性片段具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码CodA多肽的基因序列，所述CodA多肽包含SEQ ID NO:1216或SEQ ID NO:1217。在又一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽由SEQ ID NO:1216或SEQ ID NO:1217组成。
在一些实施方式中，胞嘧啶脱氨酶被修饰和/或突变，例如，以增强稳定性，或增加5-FU产生。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在诱导条件下，例如在与免疫抑制和/或肿瘤微环境相关的条件下产生胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件或缺氧条件下，在存在某些分子或代谢物的情况下，在存在与癌症或某些组织，免疫抑制或炎症相关的分子或代谢物的情况下，或在存在肠道，循环或肿瘤中可能存在或可能不存在的一些其他代谢物，例如阿拉伯糖、cumate、水杨酸的情况下，产生胞嘧啶脱氨酶。
在一些实施方式中，基因工程化细菌编码来自大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方式中，来自大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶被修饰和/或突变，例如，以增强稳定性，或增加5-FU产生。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在诱导条件下生产胞嘧啶脱氨酶，例如在与免疫抑制和/或肿瘤微环境相关的条件下。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件或缺氧条件下，在存在某些分子或代谢产物的情况下，在存在与癌症或某些组织，免疫抑制或炎症相关的分子或代谢产物的情况下，或在存在肠道，循环或肿瘤中可能存在或可能不存在的一些其他代谢产物，例如阿拉伯糖、cumate、水杨酸的情况下，产生胞嘧啶脱氨酶。
在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠或肿瘤内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖、cumate和水杨酸和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述回路，包括但不限于表达来自大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶的回路。在一些实施方式中，基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在细菌和/或其他微生物扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。在任何这些实施方式中，任何一个或多个所描述的回路，包括但不限于表达例如来自大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶的回路存在于一个或多个质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到细菌和/或其他微生物染色体的一个或多个位点中。
在任何这些实施方式中，包含编码胞嘧啶脱氨酶的一种或多种基因序列的基因工程化细菌进一步包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码胞嘧啶脱氨酶的回路可以与编码本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在本文所述的组成型或诱导型启动子(例如，低氧诱导型启动子)或任何其他组成型或诱导型启动子的控制下。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码胞嘧啶脱氨酶的一种或多种基因序列可以与编码本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码胞嘧啶脱氨酶的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在本文所述的组成型或诱导型启动子(例如，低氧诱导型启动子，如FNR)或任何其他组成型或诱导型启动子的控制下。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码胞嘧啶脱氨酶的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在本文所述的组成型或诱导型启动子(例如，低氧诱导型启动子，如FNR)或任何其他组成型或诱导型启动子的控制下。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如在本文所述的内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4抗体或抗PD-1或抗-PD-L1抗体。
吞噬作用逃逸的抑制-CD47-SIRPα途径
癌症具有上调“不要吃我”信号的能力，以允许逃避内源性“吃我”信号，这些信号是作为程序性细胞死亡和程序性细胞去除的一部分诱导的，以促进肿瘤进展。
CD47是涉及细胞迁移和T细胞和树突细胞激活的细胞表面分子。此外，CD47通过结合在吞噬细胞上表达的信号调节蛋白α(SIRPα)起到吞噬作用的抑制剂的作用，导致酪氨酸磷酸酶激活和抑制吞噬细胞突触的亚膜组装位点处的肌球蛋白积累。结果，CD47传达了“不要吃我的信号”。CD47的缺失导致老化或受损细胞的稳态吞噬作用。
在多种人肿瘤类型中观察到升高的CD47表达水平，允许肿瘤通过吞噬吞噬作用逃离固有免疫系统。该过程通过肿瘤细胞上的CD47与吞噬细胞上的SIRPα结合而发生，从而促进吞噬作用和肿瘤存活的抑制。
抗CD47抗体已经在体外和小鼠异种移植模型中证实了针对许多不同人类癌症的临床前活性(Chao等，CurrOpinImmunol。2012年4月；24(2)：225-232。The CD47-SIRPαPathway in Cancer Immune Evasion and Potential Therapeutic Implications，以及其中的参考文献)。除CD47外，SIRPα也可作为治疗策略的靶点；例如，体外施用的抗SIRPα抗体引起巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用(Chao等，2012)。
在第三种方法中，使用人SIRPα的单个14kDaCD47结合结构域(不含跨膜部分的可溶形式)作为人CD47的竞争性拮抗剂开发了CD47靶向疗法(如Weiskopf等，EngineeredSIRPαvariants as immunotherapeutic adjuvants to anti-cancer antibodies；Science.2013 Jul 5；341(6141):10.1126/science.1238856，其全部内容通过引用并入本文。因为野生型SIRPα对CD47显示出相对低的亲和力，所以通过酵母表面展示的体外进化产生突变的SIRPα，其显示作为CD47的强结合物和拮抗剂。这些变体包括CV1(共有变体1)和高亲和力变体FD6，以及这些变体的Fc融合蛋白。导致亲和力增加的氨基酸变化位于人SIRPα的d1结构域中。SIRPα变体的非限制性实例也描述于WO/2013/109752中，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制表达于巨噬细胞的CD47和/或抑制SIRPα和/或抑制或防止CD47和SIRPα之间的相互作用的一种或多种免疫调节剂。例如，基因工程化微生物可以编码针对CD47的抗体和/或针对SIRPα的抗体，例如针对CD47的单链抗体和/或针对SIRPα的单链抗体。在另一个非限制性实例中，基因工程化微生物可编码包含SIRPαCD47结合结构域的竞争性拮抗剂多肽。这样的竞争性拮抗剂多肽可以通过CD47的竞争性结合的作用，防止CD47与SIRP的相互作用α对巨噬细胞表达。在一些实施方式中，竞争性拮抗剂多肽是可溶的，例如，从微生物分泌。在一些实施方式中，竞争性拮抗剂多肽展示在微生物的表面上。在一些实施方式中，编码所述竞争性拮抗剂多肽的基因工程化微生物编码SIRPαCD47结合结构域的野生型形式。在一些实施方式中，编码竞争性拮抗剂多肽的基因工程化微生物编码SIRPαCD47结合结构域的突变或变体形式。在一些实施方式中，所述变体形式是CV1SIRPα变体。在一些实施方式中，变体形式是FD6变体。在一些实施方式中，αSIRP变体是Weiskopf等，和/或国际专利公开WO/2013/109752描述的变体。在一些实施方式中，编码所述竞争性拮抗剂多肽的基因工程化微生物编码SIRPαCD47结合结构域或其变体融合到稳定多肽。在一些实施方式中，编码所述竞争性拮抗剂多肽的基因工程化微生物编码的野生型形式SIRPαCD47结合结构域融合到稳定多肽。在一个非限制性示例中，稳定多肽融合于野生型αSIRPCD47结合结构域多肽是Fc部分。在一些实施方式中，稳定多肽融合于野生型αSIRPCD47结合结构域多肽是IgG的Fc部分。在一些实施方式中，稳定多肽融合于野生型αSIRPCD47结合结构域多肽是IgG4的Fc部分。在一些实施方式中，编码竞争性拮抗剂多肽的基因工程化微生物编码与稳定化多肽融合的SIRPαCD47结合结构域的突变或变体形式。在一些实施方式中，融合到稳定多肽变体形式是CV1SIRPα变体。在一些实施方式中，与稳定化多肽融合的变体形式是F6变体。在一些实施方式中，融合到稳定多肽的SIRPα变体是Weiskopf等，和/或国际专利公开WO/2013/109752描述的变体。在一个非限制性示例中，稳定多肽融合到所述变体SIRPαCD47结合结构域多肽是Fc部分。在一些实施方式中，稳定多肽融合到所述变体SIRPαCD47结合结构域多肽是IgG的Fc部分。在一些实施方式中，与变体SIRPαCD47结合域多肽融合的稳定化多肽是IgG4Fc部分。
在一些实施方式中，基因工程化细菌是细菌，其表达抗CD47抗体和/或抗SIRPα抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是细菌，其表达竞争性拮抗剂SIRPαCD47结合结构域(WT或突变以改善CD47亲和力)。在一些实施方式中，基因工程化细菌是细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗CD47抗体和/或抗SIRPα抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达竞争性拮抗剂SIRPαCD47结合结构域(WT或具有改善的CD47亲和力的突变变体)。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗-CD47抗体和/或抗-SIRPα，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达竞争性拮抗剂SIRPαCD47结合结构域(WT或具有改善的CD47亲和力的突变变体)。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，例如本文描述的任何启动子的控制下表达抗CD47抗体和/或抗SIRPα抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码竞争性拮抗剂SIRPαCD47结合结构域(WT或具有改善的CD47亲和力的突变变体)的一种或多种基因，其在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下。在任何这些实施方式中，基因工程化微生物还可以产生一种或多种能够刺激Fc介导的功能的免疫调节剂，例如ADCC，和/或M-CSF和/或GM-CSF，导致阻断吞噬作用抑制。
基因工程化细菌和/或其他微生物可包含编码任何合适的抗CD47抗体，抗SIRPα抗体或竞争性SIRPαCD47结合域多肽(具有改善的CD47结合亲和力的野生型或突变变体)的一种或多种基因用于抑制或预防CD47-SIRPα相互作用。在一些实施方式中，修饰和/或突变抗体(或)或竞争性多肽，例如，以增强稳定性，增加CD47拮抗作用。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在诱导条件下，例如在与免疫抑制和/或肿瘤微环境相关的条件下产生抗体或竞争性多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件或缺氧条件下，在存在某些分子或代谢物的情况下，在存在与癌症或某些组织，免疫抑制或炎症相关的分子或代谢物的情况下，或在存在肠道，循环或肿瘤中可能存在或可能不存在的一些其他代谢物，例如阿拉伯糖、cumate和水杨酸的情况下，产生抗体或竞争性多肽。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码B6H12-抗CD47-scFv的抗CD47基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码与SEQ ID NO:994至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码包含SEQ ID NO:994的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码由SEQ ID NO:994组成的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码5F9-抗-CD47-scFv的抗-CD47基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码与选自SEQ ID NO:996的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码包含SEQ ID NO:996的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码由SEQ ID NO:996组成的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码5F9antihCD47scFv-V5-HIS的抗CD47基因序列。在一些实施方式中，抗CD47scFv序列与选自SEQ ID NO：993和SEQ ID NO:995的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源，不包括非编码区和编码标签的序列。在一些实施方式中，基因序列包含选自SEQ ID NO:993和SEQ ID NO:995的序列，不包括非编码区和编码标签的序列。在一些实施方式中，基因序列由选自SEQ ID NO:993和SEQ ID NO:995的序列组成，不包括非编码区和编码标签的序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SIRPα多肽的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1118，SEQ ID NO:1231，SEQ ID NO:1119，SEQ ID NO:1120的序列具有至少约80％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SIRPα多肽的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1118，SEQ ID NO:1231，SEQ ID NO:1119，SEQ ID NO:1120的序列具有至少约90％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SIRPα多肽的基因序列，所述SIRPα多肽与选自SEQ ID NO:1118，SEQ ID NO:1231，SEQ ID NO:1119，SEQ ID NO:1120的序列具有至少约95％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SIRPα多肽的基因序列，其具有与选自SEQ ID NO:1118，SEQ ID NO:1231，SEQID NO：1119，SEQ ID NO:1120的序列约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性，或其功能片段。在另一个实施方式中，SIRPα多肽包含选自SEQ ID NO:1118，SEQ ID NO:1231，SEQ ID NO:1119和SEQ ID NO:1120的序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽由选自SEQ ID NO:1118，SEQID NO:1231，SEQ ID NO:1119和SEQ ID NO:1120的序列组成。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的SIRPα，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)，或SIRPalpha-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的SIRPα，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的SIRPalpha，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPalpha-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)。
在任何这些实施方式中，经基因工程化以产生SIRPα，SIRPα变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或90％至100％更多的SIRPalpha，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPalpha-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的SIRPα，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的SIRPalpha，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPalpha-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)。
在一些实施方式中，经基因工程化以分泌SIRPα，SIRPα变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将细胞增殖减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程化以分泌SIRPα，SIRPα变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比使肿瘤生长减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程化以分泌SIRPα，SIRPα变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤大小减小至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程化以分泌SIRPα，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将肿瘤体积减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程化以分泌SIRPα，SIRPα变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将肿瘤重量减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生分泌的SIRPα，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将应答率提高至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程化以分泌SIRPα，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将肿瘤细胞的吞噬作用增加至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或90％至100％更多的抗CD47scFv。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的抗CD47scFv。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的抗CD47scFv。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的抗-CD47scFv。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的抗CD47scFv。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的抗CD47scFv。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将细胞增殖减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤尺寸减小至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将应答率提高至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤细胞的吞噬作用增加至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比使肿瘤细胞的吞噬作用增加至少1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比增加肿瘤细胞的吞噬作用三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖、cumate和水杨酸和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述SIRPα或抗CD47回路。在一些实施方式中，基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在细菌和/或其他微生物扩增，生产和/或制造期间表达，如所述于此。在一些实施方式中，基因序列存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到细菌和/或其他微生物染色体中的一个或多个位点中。
在任何这些实施方式中，包含编码SIRPα或其变体或者抗-CD47多肽的一种或多种基因序列的基因工程化细菌进一步包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码SIRPα或其变体或者抗-CD47多肽的回路可以与编码本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在本文所述的组成型或诱导型启动子(例如，低氧诱导型启动子)或任何其他组成型或诱导型启动子的控制下。
在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码SIRPα或其变体或者抗-CD47多肽的一种或多种基因序列可以与编码本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码SIRPα或其变体或者抗-CD47多肽的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在本文所述的组成型或诱导型启动子(例如，低氧诱导型启动子，如FNR)或任何其他组成型或诱导型启动子的控制下。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码SIRPα或其变体或者抗-CD47多肽的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在本文所述的组成型或诱导型启动子(例如，低氧诱导型启动子，如FNR)或任何其他组成型或诱导型启动子的控制下。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。
在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如在本文所述的内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一些实施方式中，任何一种或多种所述的回路存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合至一条或多条细菌和/或其他微生物染色体的一个或多个位点上。而且，在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物进一步地能够表达任何一种或多种所述的回路，以及进一步包含下述中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，如本领域公知的和本文中提供的任何营养缺陷型，例如thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀伤开关回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何杀伤开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何分泌回路，一种或多种表面展示回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的任何表面展示回路，(7)用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢产物(例如，犬尿氨酸、色氨酸、腺苷、精氨酸)的一种或多种回路，和(8)一种或多种此类其他回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂联用，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
抗原提呈细胞的激活
STING激动剂
干扰素基因刺激物(STING)蛋白已显示出是由来源于DNA病毒、细菌的胞质核酸以及来源于肿瘤的DNA触发的信号传导的关键媒介物。STING诱导I型干扰素产生的能力导致了在抗肿瘤免疫应答方面的研究，结果，STING已成为抗肿瘤免疫治疗中潜在的强有力的靶点。由STING激活引起的大部分抗肿瘤作用可能取决于由APC产生IFN-β，以及由这些细胞改善抗原提呈，其促进了针对肿瘤相关抗原的CD8+ T细胞初免。然而，STING蛋白还在包括来源于髓系的抑制细胞(MDSC)和癌细胞本身在内的多种细胞类型中广泛表达，该途径的功能尚未被很好地表征(Sokolowska,O.&Nowis,D；STING Signaling in Cancer Cells:Important or Not？；Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis；Arch.Immunol.Ther.Exp.(2018)66:125)。
干扰素基因刺激物(STING)，也称为跨膜蛋白173(TMEM173)，干扰素调节因子3激活介质(MITA)，MPYS或内质网干扰素刺激因子(ERIS)，是一种二聚体蛋白，主要在巨噬细胞，T细胞，树突细胞，内皮细胞和某些成纤维细胞和上皮细胞中表达。STING在先天性免疫反应中起着重要作用-缺乏STING的小鼠虽然在接触各种微生物后容易发生致命性感染但仍然存活。STING以细胞溶质环状二核苷酸(CDN)(例如cGAMP和细菌第二信使c-di-GMP和c-di-AMP)的形式作为第二信使的细胞溶质受体起作用。在CDN刺激后，STING发生构象变化。STING从ER转运到高尔基体，其羧基末端被释放，这导致TBK1(TANK结合激酶1)/IRF3(干扰素调节因子3)，NF-κB和STAT6信号转导途径，从而促进I型干扰素和促炎细胞因子应答。CDNs包括经典的环状二-GMP(c[G(30-50)pG(30-50)p]或环状二-AMP或环状GAMP(cGMP-AMP)(Barber，STING-dependent cytosolic DNA sensing pathways；TrendsImmunol.2014Feb；35(2):88-93)。
CDN可以是外源(即，细菌)和/或内源产生的(即，在暴露于dsDNA时通过宿主酶在宿主内)。STING能够识别各种细菌第二信使分子环二鸟苷酸一磷酸(c-di-GMP)和环二腺苷酸一磷酸(c-di-AMP)，其触发固有免疫信号传导应答(Ma等，The cGAS-STING DefensePathway and Its Counteraction by Viruses；Cell Host&Microbe 19,February 10,2016)。另外，环状GMPAMP(cGAMP)也可以与STING结合并导致IRF3失活和β-干扰素产生。由霍乱弧菌产生的3’5’-3’5’cGAMP(3’3’cGAMP)和后生动物第二信使循环[G(2’,5’)pA(3’5’)](2’3’cGAMP)两者均能够通过STING途径激活固有免疫应答(Yi et al.,SingleNucleotide Polymorphisms of Human STING Can Affect Innate Immune Response toCyclic Dinucleotides；PLOS One(2013).8(10)e77846，以及其中的参考文献)。细菌和后生动物(例如，人)c-di-GAMP合成酶(cGAS)利用GTP和ATP产生能够STING激活的cGAMP。与具有两个经典30-50磷酸二酯键的原核CDN相比，人cGAS产物含有独特的20-50键，产生混合连接环GMP-AMP分子，表示为2'，3'cGAMP(如(Kranzusch等，Ancient Origin of cGAS-STINGReveals Mechanism of Universal 2’,3’cGAMP Signaling；Molecular Cell 59,891–903，2015年9月17日及其中的参考文献)。细菌霍乱弧菌(Vibrio cholerae)编码一种名为DncV的酶，它是cGAS的结构同源物，并通过规范的3'-5'键(3'，3'cGAMP)合成相关的第二信使。
干扰素基因(STING)途径的刺激物成分在免疫系统检测肿瘤细胞中起重要作用。在临床前研究中，环状二核苷酸(CDN)，天然存在的或合理设计的合成衍生物，能够促进侵袭性抗肿瘤反应。例如，当与STINGVAX形式的经辐射的GM-CSF分泌的全细胞疫苗共同配制时，合成的CDNs增加了抗肿瘤效力，并且STINGVAX结合PD-1阻断诱导已建立肿瘤的消退(Fu等，STING agonist formulated cancer vaccines can cure established tumorsresistant to PD-1 blockade；Sci Transl Med.2015Apr 15；7(283):283ra52)。在另一个例子中，Smith等进行了一项研究，显示STING激动剂可通过刺激免疫反应来增强CART治疗，从而消除过继转移的淋巴细胞无法识别的肿瘤细胞，从而提高CART细胞治疗的有效性(Smith等，Biopolymers co-delivering engineered T cells and STING agonists caneliminate heterogeneous tumors；J Clin Invest.2017 Jun 1；127(6):2176-2191)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生一种或多种STING激动剂。可以通过本公开的基因工程化细菌产生的STING激动剂的非限制性实例包括3’3’cGAMP,2’3’-cGAMP,2’2’-cGAMP,2’2’-cGAMP VacciGradeTM(Cyclic[G(2’,5’)pA(2’,5’)p]),2’3’-cGAMP,2’3’-cGAMP VacciGradeTM(Cyclic[G(2’,5’)pA(3’,5’)p]),2’3’-cGAM(PS)2(Rp/Sp),3'3'-cGAMP,3’3’-cGAMP VacciGradeTM(Cyclic[G(3’,5’)pA(3’,5’)p]),c-di-AMP,c-di-AMP VacciGradeTM(Th1/Th2应答的环二腺苷酸单磷酸盐),2'3'-c-di-AMP,2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)(c-di-AMP的双硫代磷酸酯类似物,Rp异构体),2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)VacciGradeTM,c-di-GMP,c-di-GMP VacciGradeTM,2’3’-c-di-GMP,和c-di-IM。在一些实施方式中，基因工程化细菌是包含编码一种或多种酶的基因，用于产生一种或多种STING激动剂。Cyclic-di-GAMP合酶(cdi-GAMP合酶或cGAS)从一个ATP和一个GTP产生环二-GAMP。在一些实施方式中，酶是c-di-GAMP合酶(cGAS)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于在EC2.7.7.86中表达酶的基因序列。在一些实施方式中，此类酶是细菌酶。在一些实施方式中，酶是细菌c-di-GMP合酶。在一些实施方式中，酶是细菌c-GAMP合酶(GMP-AMP合酶)。在一些实施方式中，细菌能够产生3’3’c-dGAMP。
在一些实施方式中，细菌能够产生3’3’-cGAMP。根据本公开的内容，已经鉴定了若干适于由基因工程化细菌生产3’3’-cGAMP的酶。这些酶包括来自Verminephrobactereiseniae(EF01-2蚯蚓共生体)、反硝化金氏菌(ATCC 33394)和来自杆状奈瑟氏菌(ATCCBAA-1200)的霍乱弧菌cGAS的直系同源物。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自霍乱弧菌的cGAS的基因序列。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自选自Verminephrobacter eiseniae(EF01-2蚯蚓共生体)、反硝化金氏菌(ATCC 33394)和来自杆状奈瑟氏菌(ATCC BAA-1200)物种的一种或多种霍乱弧菌cGAS直系同源物的基因序列。在一些实施方式中，细菌包含编码DncV的基因序列。在一些实施方式中，DncV来自霍乱弧菌。在一个实施方式中，DncV直系同源物来自Verminephrobacter eiseniae。在一个实施方式中，DncV直系同源物来自反硝化金氏菌。在一个实施方式中，DncV直系同源物来自杆状奈瑟氏菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自选自下述物种的DncV直系同源物的基因序列：无菌水杆菌(Enhydrobacter aerosaccus)、反硝化金氏菌、杆状奈瑟氏菌、Phaeobacter gallaeciensi、柠檬酸微菌属sp.、滨海玫瑰杆菌(Roseobacterlitoralis)、玫瑰变色菌属sp.、Methylobacterium populi、赤杆菌属sp.、滨海红杆菌(Erythrobacter litoralis)、Methylophaga thiooxydans、Methylophaga thiooxydans、鹅气单胞菌(Herminiimonas arsenicoxydans)、七叶树红杆菌(Verminephrobactereiseniae)、滕氏甲基杆菌(Methylobacter tundripaludum)、北极杆菌(Psychrobacterarcticus)、霍乱弧菌、弧菌属sp、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、气味沙雷菌(Serratia odorifera)、Verminephrobacter eiseniae和食葡萄糖食甲基菌(Methylovorus glucosetrophus)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够生产2’3’-cGAMP。人cGAS已知生产2’3’-cGAMP。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码人cGAS的基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加肿瘤微环境中c-GAMP(2’3’或3’3’)水平。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加胞内空间c-GAMP水平。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加真核细胞内c-GAMP水平。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加免疫细胞内c-GAMP(2’3’或3’3’)水平。在一些实施方式中，细胞是吞噬细胞。在一些实施方式中，细胞是巨噬细胞。在一些实施方式中，细胞是树突状细胞。在一些实施方式中，细胞是中性粒细胞。在一些实施方式中，细胞是MDSC。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加癌细胞内的c-GAMP(2’3’或3’3’)。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加体外细菌细胞中和/或生长培养基中c-GAMP的水平。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自霍乱弧菌的细菌c-di-GAMP合酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，酶是DncV。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自Verminephrobacter eiseniae的c-di-AMP合酶的一种或多种基因序列。在一个实施方式中，细菌c-di-GAMP合酶是来自Verminephrobacter eiseniae(EF01-2蚯蚓共生体)的DcnV直系同源物。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码含有SEQ ID NO:1262或其功能性片段的一种或多种多肽的c-di-GAMP合酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的基因序列，所述多肽与SEQ ID NO:1262或其功能性片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或者至少约99％同一性。在一些实施方式中，多肽与SEQ ID NO:1262具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:1262。在另一个特定的实施方式中，多肽由SEQ ID NO:1262组成。在某些实施方式中，细菌c-di-GAMP合酶与SEQ IDNO:1265具有至少约80％同一性。在某些实施方式中，序列与SEQ ID NO:1265具有至少约90％同一性。在某些实施方式中，序列与SEQ ID NO:1265具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，序列与SEQ ID NO:1265具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，基因序列包含SEQ ID NO:1265。在另一个特定的实施方式中，基因序列由SEQ ID NO:1265组成。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自反硝化金氏菌(ATCC 33394)的c-di-AMP合酶的一种或多种基因序列。在一个实施方式中，细菌c-di-GAMP合酶是来自反硝化金氏菌的DcnV直系同源物。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码含有SEQ IDNO:1260或其功能性片段的一种或多种多肽的c-di-GAMP合酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的基因序列，所述多肽与SEQ ID NO:1260或其功能性片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或者至少约99％同一性。在一些实施方式中，多肽与SEQ ID NO:1260具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:1260。在另一个特定的实施方式中，多肽由SEQ ID NO:1260组成。在某些实施方式中，细菌c-di-GAMP合酶与SEQ ID NO:1263具有至少约80％同一性。在某些实施方式中，基因序列与SEQ ID NO:1263具有至少约90％同一性。在某些实施方式中，基因序列与SEQ ID NO:1263具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，基因序列与SEQ IDNO:1263具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，基因序列包含SEQ ID NO:1263。在另一个特定的实施方式中，基因序列由SEQ ID NO:1263组成。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自杆状奈瑟氏菌(ATCC BAA-1200)的c-di-AMP合酶的一种或多种基因序列。在一个实施方式中，细菌c-di-GAMP合酶是来自杆状奈瑟氏菌的DcnV直系同源物。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码含有SEQ ID NO:1261或其功能性片段的一种或多种多肽的c-di-GAMP合酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的基因序列，所述多肽与SEQ ID NO:1261或其功能性片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或者至少约99％同一性。在一些实施方式中，多肽与SEQ ID NO:1261具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:1261。在另一个特定的实施方式中，多肽由SEQ ID NO:1261组成。在某些实施方式中，c-di-GAMP合酶与SEQ ID NO:1264具有至少约80％同一性。在某些实施方式中，基因序列与SEQ ID NO:1264具有至少约90％同一性。在某些实施方式中，基因序列与SEQ ID NO:1264具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，基因序列与SEQ ID NO:1264具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，基因序列包含SEQ ID NO:1264。在另一个特定的实施方式中，基因序列由SEQ ID NO:1264组成。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码哺乳动物c-di-GAMP酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，STING激动剂生产酶是人的酶。在一些实施方式中，一种或多种基因序列经密码子优化以在微生物宿主细胞中表达。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码人多肽cGAS的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种多肽的人cGAS的一种或多种基因序列，所述多肽含有SEQ ID NO:1254或其功能性片段。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的基因序列，所述多肽与SEQ ID NO:1254或其功能性片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或者至少约99％同一性。在一些实施方式中，多肽与SEQ ID NO:1254具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:1254。在另一个特定的实施方式中，多肽由SEQID NO:1254组成。在某些实施方式中，人cGAS序列与SEQ ID NO:1255具有至少约80％同一性。在某些实施方式中，基因序列与SEQ ID NO:1255具有至少约90％同一性。在某些实施方式中，基因序列与SEQ ID NO:1255具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，基因序列与SEQ ID NO:1255具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，基因序列包含SEQ ID NO:1264。在另一个特定的实施方式中，基因序列由SEQ ID NO:1255组成。
在一些实施方式中，细菌能够生产环-二-GMP。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种二鸟苷酸环化酶的一种或多种基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加肿瘤微环境中环-二-GMP水平。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加胞内空间的环-二-GMP水平。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加真核细胞内的环-二-GMP水平。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加免疫细胞内的环-二-GMP水平。在一些实施方式中，细胞是吞噬细胞。在一些实施方式中，细胞是巨噬细胞。在一些实施方式中，细胞是树突状细胞。在一些实施方式中，细胞是中性粒细胞。在一些实施方式中，细胞是MDSC。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加癌细胞内环-二-GMP水平。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加体外细菌细胞中和/或生长培养基中c-GMP的水平。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够生产c-diAMP。二腺苷酸环化酶从两个ATP分子产生一个分子环二磷酸。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于表达二乙二醇化环化酶的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于在EC2.7.7.85类中表达酶的基因序列。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶是细菌二乙酸酯化环化酶。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶是DacA。在一个实施方式中，DacA来自单核细胞增多性李斯特氏菌。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种多肽的DacA的一种或多种基因序列，所述多肽含有SEQ ID NO:1257或其功能性片段。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的基因序列，所述多肽与SEQ ID NO:1257或其功能性片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或者至少约99％同一性。在一些实施方式中，多肽与SEQ ID NO:1257具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，多肽包含SEQ IDNO:1257。在另一个特定的实施方式中，多肽由SEQ ID NO:1257组成。在某些实施方式中，Dac A序列与SEQ ID NO:1258具有至少约80％同一性。在某些实施方式中，基因序列与SEQID NO:1258具有至少约90％同一性。在某些实施方式中，基因序列与SEQ ID NO:1258具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，基因序列与SEQ ID NO:1258具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，基因序列包含SEQ ID NO:1258。在另一个特定的实施方式中，基因序列由SEQ ID NO:1258组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含与启动子可操作地连接的DacA的一种或多种基因序列，所述启动子是在低氧条件下可诱导的，例如本文所述的FNR诱导型启动子。在某些实施方式中，与FNR诱导型启动子可操作地连接的DacA基因的序列与SEQ ID NO:1284具有至少约80％同一性。在某些实施方式中，与FNR诱导型启动子可操作地连接的DacA基因的序列与SEQ ID NO:1258具有至少约90％同一性。在某些实施方式中，与FNR诱导型启动子可操作地连接的DacA基因的序列与SEQ ID NO:1258具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，与FNR诱导型启动子可操作地连接的DacA基因的序列与SEQ ID NO:1258具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，与FNR诱导型启动子可操作地连接的DacA基因的序列包含SEQ ID NO:1258。在其他特定的实施方式中，与FNR诱导型启动子可操作地连接的DacA基因的序列由SEQ ID NO:1258组成。
其他合适的二腺苷酸环化酶是本领域已知的，包括EggNog数据库(http://eggnogdb.embl.de)中包括的那些。可以由细菌表达的二乙酸酯酶环化酶的非限制性实例包括Megasphaera sp.UPII 135-E(HMPREF1040_0026),Streptococcus anginosus SK52＝DSM 20563(HMPREF9966_0555),Streptococcus mitis bv.2str.SK95(HMPREF9965_1675),Streptococcus infantis SK1076(HMPREF9967_1568),Acetonema longum DSM 6540(ALO_03356),Sporosarcina newyorkensis 2681(HMPREF9372_2277),Listeria monocytogenesstr.Scott A(BN418_2551),Candidatus Arthromitus sp.SFB-mouse-Japan(SFBM_1354),Haloplasma contractile SSD-17B 2seqs HLPCO_01750,HLPCO_08849),Lactobacilluskefiranofaciens ZW3(WANG_0941),Mycoplasma anatis 1340(GIG_03148),Streptococcus constellatus subsp.pharyngis SK1060＝CCUG 46377(HMPREF1042_1168),Streptococcus infantis SK970(HMPREF9954_1628),Paenibacillusmucilaginosus KNP414(YBBP),Nostoc sp.PCC 7120(ALL2996),Mycoplasma columbinumSF7(MCSF7_01321),Lactobacillus ruminis SPM0211(LRU_01199),CandidatusArthromitus sp.SFB-rat-Yit(RATSFB_1182),Clostridium sp.SY8519(CXIVA_02190),Brevibacillus laterosporus LMG 15441(BRLA_C02240),Weissella koreensis KACC15510(WKK_01955),Brachyspira intermedia PWS/A(BINT_2204),Bizioniaargentinensis JUB59(BZARG_2617),Streptococcus salivarius 57.I(SSAL_01348),Alicyclobacillus acidocaldarius subsp.acidocaldarius Tc-4-1(TC41_3001),Sulfobacillus acidophilus TPY(TPY_0875),Streptococcus pseudopneumoniae IS7493(SPPN_07660),Megasphaera elsdenii DSM20460(MELS_0883),Streptococcusinfantarius subsp.infantarius CJ18(SINF_1263),Blattabacterium sp.(Mastotermesdarwiniensis)str.MADAR(MADAR_511),Blattabacterium sp.(Cryptocercuspunctulatus)str.Cpu(BLBCPU_093),Synechococcus sp.CC9605(SYNCC9605_1630),Thermus sp.CCB_US3_UF1(AEV17224.1),Mycoplasma haemocanis str.Illinois(MHC_04355),Streptococcus macedonicus ACA-DC 198(YBBP),Mycoplasma hyorhinis GDL-1(MYM_0457),Synechococcus elongatus PCC 7942(SYNPCC7942_0263),Synechocystissp.PCC 6803(SLL0505),Chlamydophila pneumoniae CWL029(YBBP),Microcoleuschthonoplastes PCC 7420(MC7420_6818),Persephonella marina EX-H1(PERMA_1676),Desulfitobacterium hafniense Y51(DSY4489),Prochlorococcus marinus str.AS9601(A9601_11971),Flavobacteria bacterium BBFL7(BBFL7_02553),Sphaerochaeta globusstr.Buddy(SPIBUDDY_2293),Sphaerochaeta pleomorpha str.Grapes(SPIGRAPES_2501),Staphylococcus aureus subsp.aureus Mu50(SAV2163),Streptococcus pyogenes M1GAS(SPY_1036),Synechococcus sp.WH 8109(SH8109_2193),Prochlorococcus marinussubsp.marinus str.CCMP1375(PRO_1104),Prochlorococcus marinus str.MIT 9515(P9515_11821),Prochlorococcus marinus str.MIT 9301(P9301_11981),Prochlorococcus marinus str.NATL1A(NATL1_14891),Listeria monocytogenes EGD-e(LMO2120),Streptococcus pneumoniae TIGR4 2 seqs SPNET_02000368,SP_1561),Streptococcus pneumoniae R6(SPR1419),Staphylococcus epidermidis RP62A(SERP1764),Staphylococcus epidermidis ATCC 12228(SE_1754),Desulfobacteriumautotrophicum HRM2(HRM2_32880),Desulfotalea psychrophila LSv54(DP1639),Cyanobium sp.PCC 7001(CPCC7001_1029),Chlamydophila pneumoniae TW-183(YBBP),Leptospira interrogans serovar Lai str.56601(LA_3304),Clostridium perfringensATCC 13124(CPF_2660),Thermosynechococcus elongatus BP-1(TLR1762),Bacillusanthracis str.Ames(BA_0155),Clostridium thermocellum ATCC 27405(CTHE_1166),Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides ATCC 8293(LEUM_1568),Oenococcusoeni PSU-1(OEOE_1656),Trichodesmium erythraeum IMS101(TERY_2433),Tannerellaforsythia ATCC 43037(BFO_1347),Sulfurihydrogenibium azorense Az-Fu1(SULAZ_1626),Candidatus Koribacter versatilis Ellin345(ACID345_0278),Desulfovibrioalaskensis G20(DDE_1515),Carnobacterium sp.17-4(YBBP),Streptococcus mutansUA159(SMU_1428C),Mycoplasma agalactiae(MAG3060),Streptococcus agalactiaeNEM316(GBS0902),Clostridium tetani E88(CTC_02549),Ruminococcuschampanellensis 18P13(RUM_14470),Croceibacter atlanticus HTCC2559(CA2559_13513),Streptococcus uberis 0140J(SUB1092),Chlamydophila abortus S26/3(CAB642),Lactobacillus plantarum WCFS1(LP_0818),Oceanobacillus iheyensisHTE831(OB0230),Synechococcus sp.RS9916(RS9916_31367),Synechococcus sp.RS9917(RS9917_00967),Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168(YBBP),Aquifexaeolicus VF5(AQ_1467),Borrelia burgdorferi B31(BB_0008),Enterococcus faecalisV583(EF_2157),Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482(BT_3647),Bacillus cereusATCC 14579(BC_0186),Chlamydophila caviae GPIC(CCA_00671),Synechococcussp.CB0101(SCB01_010100000902),Synechococcus sp.CB0205(SCB02_010100012692),Candidatus Solibacter usitatus Ellin6076(ACID_1909),Geobacillus kaustophilusHTA426(GK0152),Verrucomicrobium spinosum DSM 4136(VSPID_010100022530),Anabaena variabilis ATCC 29413(AVA_0913),Porphyromonas gingivalis W83(PG_1588),Chlamydia muridarum Nigg(TC_0280),Deinococcus radiodurans R1(DR_0007),Geobacter sulfurreducens PCA2 seqs GSU1807,GSU0868),Mycoplasma arthritidis158L3-1(MARTH_ORF527),Mycoplasma genitalium G37(MG105),Treponema denticolaATCC 35405(TDE_1909),Treponema pallidum subsp.pallidum str.Nichols(TP_0826),butyrate-producing bacterium SS3/4(CK3_23050),Carboxydothermushydrogenoformans Z-2901(CHY_2015),Ruminococcus albus 8(CUS_5386),Streptococcus mitis NCTC 12261(SM12261_1151),Gloeobacter violaceus PCC 7421(GLL0109),Lactobacillus johnsonii NCC 533(LJ_0892),Exiguobacterium sibiricum255-15(EXIG_0138),Mycoplasma hyopneumoniae J(MHJ_0485),Mycoplasma synoviae 53(MS53_0498),Thermus thermophilus HB27(TT_C1660),Onion yellows phytoplasma OY-M(PAM_584),Streptococcus thermophilus LMG 18311(OSSG),CandidatusProtochlamydia amoebophila UWE25(PC1633),Chlamydophila felis Fe/C-56(CF0340),Bdellovibrio bacteriovorus HD100(BD1929),Prevotella ruminicola 23(PRU_2261),Moorella thermoacetica ATCC 39073(MOTH_2248),Leptospira interrogans serovarCopenhageni str.Fiocruz L1-130(LIC_10844),Mycoplasma mobile 163K(MMOB4550),Synechococcus elongatus PCC 6301(SYC1250_C),Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406(CHU_3222),Geobacter metallireducens GS-15 2 seqs GMET_1888,GMET_1168),Bacillus halodurans C-125(BH0265),Bacteroides fragilis NCTC 9343(BF0397),Chlamydia trachomatis D/UW-3/CX(YBBP),Clostridium acetobutylicum ATCC 824(CA_C3079),Clostridium difficile 630(CD0110),Lactobacillus acidophilus NCFM(LBA0714),Lactococcus lactis subsp.lactis Il1403(YEDA),Listeria innocuaClip11262(LIN2225),Mycoplasma penetrans HF-2(MYPE2120),Mycoplasma pulmonisUAB CTIP(MYPU_4070),Thermoanaerobacter tengcongensis MB4(TTE2209),Pediococcuspentosaceus ATCC 25745(PEPE_0475),Bacillus licheniformis DSM 13＝ATCC 14580 2seqs YBBP,BL02701),Staphylococcus haemolyticus JCSC1435(SH0877),Desulfuromonas acetoxidans DSM 684(DACE_0543),Thermodesulfovibrioyellowstonii DSM 11347(THEYE_A0044),Mycoplasma bovis PG45(MBOVPG45_0394),Anaeromyxobacter dehalogenans 2CP-C(ADEH_1497),Clostridium beijerinckiiNCIMB8052(CBEI_0200),Borrelia garinii PBi(BG0008),Symbiobacteriumthermophilum IAM 14863(STH192),Alkaliphilus metalliredigens QYMF(AMET_4313),Thermus thermophilus HB8(TTHA0323),Coprothermobacter proteolyticus DSM 5265(COPRO5265_1086),Thermomicrobium roseum DSM 5159(TRD_0688),Salinibacter ruberDSM 13855(SRU_1946),Dokdonia donghaensis MED134(MED134_03354),Polaribacterirgensii 23-P(PI23P_01632),Psychroflexus torquis ATCC 700755(P700755_02202),Robiginitalea biformata HTCC2501(RB2501_10597),Polaribacter sp.MED152(MED152_11519),Maribacter sp.HTCC2170(FB2170_01652),Microscilla marina ATCC 23134(M23134_07024),Lyngbya sp.PCC8106(L8106_18951),Nodularia spumigena CCY9414(N9414_23393),Synechococcus sp.BL107(BL107_11781),Bacillus sp.NRRL B-14911(B14911_19485),Lentisphaera araneosa HTCC2155(LNTAR_18800),Lactobacillussakei subsp.sakei 23K(LCA_1359),Mariprofundus ferrooxydans PV-1(SPV1_13417),Borrelia hermsii DAH(BH0008),Borrelia turicatae 91E135(BT0008),Bacillusweihenstephanensis KBAB4(BCERKBAB4_0149),Bacillus cytotoxicus NVH 391-98(BCER98_0148),Bacillus pumilus SAFR-032(YBBP),Geobacter sp.FRC-32 2 seqsGEOB_2309,GEOB_3421),Herpetosiphon aurantiacus DSM 785(HAUR_3416),Synechococcus sp.RCC307(SYNRCC307_0791),Synechococcus sp.CC9902(SYNCC9902_1392),Deinococcus geothermalis DSM 11300(DGEO_0135),Synechococcus sp.PCC 7002(SYNPCC7002_A0098),Synechococcus sp.WH 7803(SYNWH7803_1532),Pedosphaeraparvula Ellin514(CFLAV_PD5552),Synechococcus sp.JA-3-3Ab(CYA_2894),Synechococcus sp.JA-2-3Ba(2-13)(CYB_1645),Aster yellows witches-broomphytoplasma AYWB(AYWB_243),Paenibacillus sp.JDR-2(PJDR2_5631),Chloroflexusaurantiacus J-10-fl(CAUR_1577),Lactobacillus gasseri ATCC 33323(LGAS_1288),Bacillus amyloliquefaciens FZB42(YBBP),Chloroflexus aggregans DSM 9485(CAGG_2337),Acaryochloris marina MBIC11017(AM1_0413),Blattabacterium sp.(Blattellagermanica)str.Bge(BLBBGE_101),Simkania negevensis Z(YBBP),Chlamydophilapecorum E58(G5S_1046),Chlamydophila psittaci 6BC 2 seqs CPSIT_0714,G5O_0707),Carnobacterium sp.AT7(CAT7_06573),Finegoldia magna ATCC 29328(FMG_1225),Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei str.Goettingen(SWOL_2103),Syntrophobacterfumaroxidans MPOB(SFUM_3455),Pelobacter carbinolicus DSM 2380(PCAR_0999),Pelobacter propionicus DSM 2379 2 seqs PPRO_2640,PPRO_2254),Thermoanaerobacter pseudethanolicus ATCC33223(TETH39_0457),Victivallisvadensis ATCC BAA-548(VVAD_PD2437),Staphylococcus saprophyticussubsp.saprophyticus ATCC 15305(SSP0722),Bacillus coagulans 36D1(BCOA_1105),Mycoplasma hominis ATCC 23114(MHO_0510),Lactobacillus reuteri100-23(LREU23DRAFT_3463),Desulfotomaculum reducens MI-1(DRED_0292),Leuconostoccitreum KM20(LCK_01297),Paenibacillus polymyxa E681(PPE_04217),Akkermansiamuciniphila ATCC BAA-835(AMUC_0400),Alkaliphilus oremlandii OhILAs(CLOS_2417),Geobacter uraniireducens Rf4 2 seqs GURA_1367,GURA_2732),Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903(CSAC_1183),Pyramidobacterpiscolens W5455(HMPREF7215_0074),Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo-bovis L550(LBL_0913),Roseiflexus sp.RS-1(ROSERS_1145),Clostridiumphytofermentans ISDg(CPHY_3551),Brevibacillus brevis NBRC 100599(BBR47_02670),Exiguobacterium sp.AT1b(EAT1B_1593),Lactobacillus salivarius UCC118(LSL_1146),Lawsonia intracellularis PHE/MN1-00(LI0190),Streptococcus mitis B6(SMI_1552),Pelotomaculum thermopropionicum SI(PTH_0536),Streptococcuspneumoniae D39(SPD_1392),Candidatus Phytoplasma mali(ATP_00312),Gemmatimonasaurantiaca T-27(GAU_1394),Hydrogenobaculum sp.Y04AAS1(HY04AAS1_0006),Roseiflexus castenholzii DSM 13941(RCAS_3986),Listeria welshimeri serovar 6bstr.SLCC5334(LWE2139),Clostridium novyi NT(NT01CX_1162),Lactobacillus brevisATCC 367(LVIS_0684),Bacillus sp.B14905(BB14905_08668),Algoriphagus sp.PR1(ALPR1_16059),Streptococcus sanguinis SK36(SSA_0802),Borrelia afzelii PKo 2seqs BAPKO_0007,AEL69242.1),Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC11842(LDB0651),Streptococcus suis 05ZYH33(SSU05_1470),Kordia algicida OT-1(KAOT1_10521),Pedobacter sp.BAL39(PBAL39_03944),Flavobacteriales bacteriumALC-1(FBALC1_04077),Cyanothece sp.CCY0110(CY0110_30633),Plesiocystis pacificaSIR-1(PPSIR1_10140),Clostridium cellulolyticum H10(CCEL_1201),Cyanothecesp.PCC 7425(CYAN7425_4701),Staphylococcus carnosus subsp.carnosus TM300(SCA_1665),Bacillus pseudofirmus OF4(YBBP),Leeuwenhoekiella blandensis MED217(MED217_04352),Geobacter lovleyi SZ 2 seqs GLOV_3055,GLOV_2524),Streptococcusequi subsp.zooepidemicus(SEZ_1213),Thermosinus carboxydivorans Nor1(TCARDRAFT_1045),Geobacter bemidjiensis Bem(GBEM_0895),Anaeromyxobactersp.Fw109-5(ANAE109_2336),Lactobacillus helveticus DPC 4571(LHV_0757),Bacillussp.m3-13(BM3-1_010100010851),Gramella forsetii KT0803(GFO_0428),Ruminococcusobeum ATCC 29174(RUMOBE_03597),Ruminococcus torques ATCC 27756(RUMTOR_00870),Dorea formicigenerans ATCC 27755(DORFOR_00204),Dorea longicatena DSM 13814(DORLON_01744),Eubacterium ventriosum ATCC 27560(EUBVEN_01080),Desulfovibriopiger ATCC 29098(DESPIG_01592),Parvimonas micra ATCC 33270(PEPMIC_01312),Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799(BACCAP_01950),Clostridium scindensATCC35704(CLOSCI_02389),Eubacterium hallii DSM 3353(EUBHAL_01228),Ruminococcus gnavus ATCC 29149(RUMGNA_03537),Subdoligranulum variabile DSM15176(SUBVAR_05177),Coprococcus eutactus ATCC 27759(COPEUT_01499),Bacteroidesovatus ATCC 8483(BACOVA_03480),Parabacteroides merdae ATCC 43184(PARMER_03434),Faecalibacterium prausnitzii A2-165(FAEPRAA2165_01954),Clostridiumsp.L2-50(CLOL250_00341),Anaerostipes caccae DSM 14662(ANACAC_00219),Bacteroides caccae ATCC 43185(BACCAC_03225),Clostridium bolteae ATCC BAA-613(CLOBOL_04759),Borrelia duttonii Ly(BDU_14),Cyanothece sp.PCC 8801(PCC8801_0127),Lactococcus lactis subsp.cremoris MG1363(LLMG_0448),Geobacillusthermodenitrificans NG80-2(GTNG_0149),Epulopiscium sp.N.t.morphotype B(EPULO_010100003839),Lactococcus garvieae Lg2(LCGL_0304),Clostridium leptum DSM 753(CLOLEP_03097),Clostridium spiroforme DSM 1552(CLOSPI_01608),Eubacteriumdolichum DSM 3991(EUBDOL_00188),Clostridium kluyveri DSM 555(CKL_0313),Porphyromonas gingivalis ATCC 33277(PGN_0523),Bacteroides vulgatus ATCC 8482(BVU_0518),Parabacteroides distasonis ATCC 8503(BDI_3368),Staphylococcushominis subsp.hominis C80(HMPREF0798_01968),Staphylococcus caprae C87(HMPREF0786_02373),Streptococcus sp.C150(HMPREF0848_00423),Sulfurihydrogenibium sp.YO3AOP1(SYO3AOP1_0110),Desulfatibacillum alkenivoransAK-01(DALK_0397),Bacillus selenitireducens MLS10(BSEL_0372),Cyanothecesp.ATCC 51142(CCE_1350),Lactobacillus jensenii 1153(LBJG_01645),Acholeplasmalaidlawii PG-8A(ACL_1368),Bacillus coahuilensis m4-4(BCOAM_010100001120),Geobacter sp.M18 2 seqs GM18_0792,GM18_2516),Lysinibacillus sphaericus C3-41(BSPH_4568),Clostridium botulinum NCTC 2916(CBN_3506),Clostridium botulinum Cstr.Eklund(CBC_A1575),Alistipes putredinis DSM 17216(ALIPUT_00190),Anaerofustis stercorihominis DSM 17244(ANASTE_01539),Anaerotruncuscolihominis DSM 17241(ANACOL_02706),Clostridium bartlettii DSM 16795(CLOBAR_00759),Clostridium ramosum DSM 1402(CLORAM_01482),Borrelia valaisiana VS116(BVAVS116_0007),Sorangium cellulosum So ce 56(SCE7623),Microcystis aeruginosaNIES-843(MAE_25390),Bacteroides stercoris ATCC 43183(BACSTE_02634),CandidatusAmoebophilus asiaticus 5a2(AASI_0652),Leptospira biflexa serovar Patoc strainPatoc 1(Paris)(LEPBI_I0735),Clostridium sp.7_2_43FAA(CSBG_00101),Desulfovibrio sp.3_1_syn3(HMPREF0326_02254),Ruminococcus sp.5_1_39BFAA(RSAG_02135),Clostridiales bacterium 1_7_47FAA(CBFG_00347),Bacteroides fragilis 3_1_12(BFAG_02578),Natranaerobius thermophilus JW/NM-WN-LF(NTHER_0240),Macrococcus caseolyticus JCSC5402(MCCL_0321),Streptococcus gordoniistr.Challis substr.CH1(SGO_0887),Dethiosulfovibrio peptidovorans DSM 11002(DPEP_2062),Coprobacillus sp.29_1(HMPREF9488_03448),Bacteroides coprocola DSM17136(BACCOP_03665),Coprococcus comes ATCC 27758(COPCOM_02178),Geobacillussp.WCH70(GWCH70_0156),uncultured Termite group 1 bacterium phylotype Rs-D17(TGRD_209),Dyadobacter fermentans DSM 18053(DFER_0224),Bacteroidesintestinalis DSM 17393(BACINT_00700),Ruminococcus lactaris ATCC 29176(RUMLAC_01257),Blautia hydrogenotrophica DSM 10507(RUMHYD_01218),CandidatusDesulforudis audaxviator MP104C(DAUD_1932),Marvinbryantia formatexigens DSM14469(BRYFOR_07410),Sphaerobacter thermophilus DSM 20745(STHE_1601),Veillonella parvula DSM 2008(VPAR_0292),Methylacidiphilum infernorum V4(MINF_1897),Paenibacillus sp.Y412MC10(GYMC10_5701),Bacteroides finegoldii DSM 17565(BACFIN_07732),Bacteroides eggerthii DSM 20697(BACEGG_03561),Bacteroidespectinophilus ATCC 43243(BACPEC_02936),Bacteroides plebeius DSM 17135(BACPLE_00693),Desulfohalobium retbaense DSM 5692(DRET_1725),Desulfotomaculumacetoxidans DSM 771(DTOX_0604),Pedobacter heparinus DSM 2366(PHEP_3664),Chitinophaga pinensis DSM 2588(CPIN_5466),Flavobacteria bacterium MS024-2A(FLAV2ADRAFT_0090),Flavobacteria bacterium MS024-3C(FLAV3CDRAFT_0851),Mooreaproducta 3L(LYNGBM3L_14400),Anoxybacillus flavithermus WK1(AFLV_0149),Mycoplasma fermentans PG18(MBIO_0474),Chthoniobacter flavus Ellin428(CFE428DRAFT_3031),Cyanothece sp.PCC 7822(CYAN7822_1152),Borrelia spielmaniiA14S(BSPA14S_0009),Heliobacterium modesticaldum Ice1(HM1_1522),Thermusaquaticus Y51MC23(TAQDRAFT_3938),Clostridium sticklandii DSM 519(CLOST_0484),Tepidanaerobacter sp.Re1(TEPRE1_0323),Clostridium hiranonis DSM 13275(CLOHIR_00003),Mitsuokella multacida DSM 20544(MITSMUL_03479),Haliangium ochraceumDSM 14365(HOCH_3550),Spirosoma linguale DSM 74(SLIN_2673),unidentifiedeubacterium SCB49(SCB49_03679),Acetivibrio cellulolyticus CD2(ACELC_020100013845),Lactobacillus buchneri NRRL B-30929(LBUC_1299),Butyrivibriocrossotus DSM 2876(BUTYVIB_02056),Candidatus Azobacteroidespseudotrichonymphae genomovar.CFP2(CFPG_066),Mycoplasma crocodyli MP145(MCRO_0385),Arthrospira maxima CS-328(AMAXDRAFT_4184),Eubacterium eligens ATCC27750(EUBELI_01626),Butyrivibrio proteoclasticus B316(BPR_I2587),Chloroherpeton thalassium ATCC 35110(CTHA_1340),Eubacterium biforme DSM 3989(EUBIFOR_01794),Rhodothermus marinus DSM 4252(RMAR_0146),Borrelia bissettiiDN127(BBIDN127_0008),Capnocytophaga ochracea DSM 7271(COCH_2107),Alicyclobacillus acidocaldarius subsp.acidocaldarius DSM 446(AACI_2672),Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725(ATHE_0361),Denitrovibrio acetiphilus DSM12809(DACET_1298),Desulfovibrio desulfuricans subsp.desulfuricans str.ATCC27774(DDES_1715),Anaerococcus lactolyticus ATCC 51172(HMPREF0072_1645),Anaerococcus tetradius ATCC 35098(HMPREF0077_0902),Finegoldia magna ATCC53516(HMPREF0391_10377),Lactobacillus antri DSM 16041(YBBP),Lactobacillusbuchneri ATCC 11577(HMPREF0497_2752),Lactobacillus ultunensis DSM 16047(HMPREF0548_0745),Lactobacillus vaginalis ATCC 49540(HMPREF0549_0766),Listeria grayi DSM 20601(HMPREF0556_11652),Sphingobacterium spiritivorum ATCC33861(HMPREF0766_11787),Staphylococcus epidermidis M23864:W1(HMPREF0793_0092),Streptococcus equinus ATCC 9812(HMPREF0819_0812),Desulfomicrobiumbaculatum DSM 4028(DBAC_0255),Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589(TACI_0837),Thermobaculum terrenum ATCC BAA-798(TTER_1817),Anaerococcusprevotii DSM 20548(APRE_0370),Desulfovibrio salexigens DSM 2638(DESAL_1795),Brachyspira murdochii DSM 12563(BMUR_2186),Meiothermus silvanus DSM 9946(MESIL_0161),Bacillus cereus Rock4-18(BCERE0024_1410),Cylindrospermopsisraciborskii CS-505(CRC_01921),Raphidiopsis brookii D9(CRD_01188),Clostridiumcarboxidivorans P7 2 seqs CLCAR_0016,CCARBDRAFT_4266),Clostridium botulinumE1 str.BoNT E Beluga(CLO_3490),Blautia hansenii DSM 20583(BLAHAN_07155),Prevotella copri DSM 18205(PREVCOP_04867),Clostridium methylpentosum DSM 5476(CLOSTMETH_00084),Lactobacillus casei BL23(LCABL_11800),Bacillus megateriumQM B1551(BMQ_0195),Treponema primitia ZAS-2(TREPR_1936),Treponemaazotonutricium ZAS-9(TREAZ_0147),Holdemania filiformis DSM 12042(HOLDEFILI_03810),Filifactor alocis ATCC 35896(HMPREF0389_00366),Gemella haemolysansATCC 10379(GEMHA0001_0912),Selenomonas sputigena ATCC 35185(SELSP_1610),Veillonella dispar ATCC 17748(VEIDISOL_01845),Deinococcus deserti VCD115(DEIDE_19700),Bacteroides coprophilus DSM 18228(BACCOPRO_00159),Nostocazollae 0708(AAZO_4735),Erysipelotrichaceae bacterium 5_2_54FAA(HMPREF0863_02273),Ruminococcaceae bacterium D16(HMPREF0866_01061),Prevotella biviaJCVIHMP010(HMPREF0648_0338),Prevotella melaninogenica ATCC 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SB(SYN_02762),Lactobacillus rhamnosus GG 2seqs OSSG,LRHM_0937),Acidaminococcus intestini RyC-MR95(ACIN_2069),Mycoplasmaconjunctivae HRC/581(MCJ_002940),Halanaerobium praevalens DSM 2228(HPRAE_1647),Aminobacterium colombiense DSM 12261(AMICO_0737),Clostridiumcellulovorans 743B(CLOCEL_3678),Desulfovibrio magneticus RS-1(DMR_25720),Spirochaeta smaragdinae DSM 11293(SPIRS_1647),Bacteroidetes oral taxon 274str.F0058(HMPREF0156_01826),Lachnospiraceae oral taxon 107 str.F0167(HMPREF0491_01238),Lactobacillus coleohominis 101-4-CHN(HMPREF0501_01094),Lactobacillus jensenii 27-2-CHN(HMPREF0525_00616),Prevotella buccae D17(HMPREF0649_02043),Prevotella sp.oral taxon 299 str.F0039(HMPREF0669_01041),Prevotella sp.oral taxon 317 str.F0108(HMPREF0670_02550),Desulfobulbuspropionicus DSM 2032 2 seqs DESPR_2503,DESPR_1053),Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum DSM 571(TTHE_0484),Thermoanaerobacter italicus Ab9(THIT_1921),Thermovirga lienii DSM 17291(TLIE_0759),Aminomonas paucivoransDSM 12260(APAU_1274),Streptococcus mitis SK321(SMSK321_0127),Streptococcusmitis SK597(SMSK597_0417),Roseburia hominis A2-183(RHOM_12405),Oribacteriumsinus F0268(HMPREF6123_0887),Prevotella bergensis DSM 17361(HMPREF0645_2701),Selenomonas noxia ATCC 43541(YBBP),Weissella paramesenteroides ATCC 33313(HMPREF0877_0011),Lactobacillus amylolyticus DSM 11664(HMPREF0493_1017),Bacteroides sp.D20(HMPREF0969_02087),Clostridium papyrosolvens DSM 2782(CPAP_3968),Desulfurivibrio alkaliphilus AHT2(DAAHT2_0445),Acidaminococcusfermentans DSM 20731(ACFER_0601),Abiotrophia defectiva ATCC 49176(GCWU000182_00063),Anaerobaculum hydrogeniformans ATCC BAA-1850(HMPREF1705_01115),Catonella morbi ATCC 51271(GCWU000282_00629),Clostridium botulinum D str.1873(CLG_B1859),Dialister invisus DSM 15470(GCWU000321_01906),Fibrobactersuccinogenes subsp.succinogenes S85 2 seqs FSU_0028,FISUC_2776),Desulfovibriofructosovorans JJ(DESFRDRAFT_2879),Peptostreptococcus stomatis DSM 17678(HMPREF0634_0727),Staphylococcus warneri L37603(STAWA0001_0094),Treponemavincentii ATCC 35580(TREVI0001_1289),Porphyromonas uenonis 60-3(PORUE0001_0199),Peptostreptococcus anaerobius 653-L(HMPREF0631_1228),Peptoniphiluslacrimalis 315-B(HMPREF0628_0762),Candidatus Phytoplasma australiense(PA0090),Prochlorococcus marinus subsp.pastoris str.CCMP1986(PMM1091),Synechococcus sp.WH 7805(WH7805_04441),Blattabacterium sp.(Periplanetaamericana)str.BPLAN(BPLAN_534),Caldicellulosiruptor obsidiansis OB47(COB47_0325),Oribacterium sp.oral taxon 078 str.F0262(GCWU000341_01365),Hydrogenobacter thermophilus TK-6 2 seqs ADO46034.1,HTH_1665),Clostridiumsaccharolyticum WM1(CLOSA_1248),Prevotella sp.oral taxon 472 str.F0295(HMPREF6745_1617),Paenibacillus sp.oral taxon 786 str.D14(POTG_03822),Roseburia inulinivorans DSM 16841 2 seqs ROSEINA2194_02614,ROSEINA2194_02613),Granulicatella elegans ATCC 700633(HMPREF0446_01381),Prevotellatannerae ATCC 51259(GCWU000325_02844),Shuttleworthia satelles DSM 14600(GCWU000342_01722),Phascolarctobacterium succinatutens YIT 12067(HMPREF9443_01522),Clostridium butyricum E4 str.BoNT E BL5262(CLP_3980),Caldicellulosiruptor hydrothermalis 108(CALHY_2287),Caldicellulosiruptorkristjanssonii 177R1B(CALKR_0314),Caldicellulosiruptor owensensis OL(CALOW_0228),Eubacterium cellulosolvens 6(EUBCEDRAFT_1150),Geobacillusthermoglucosidasius C56-YS93(GEOTH_0175),Thermincola potens JR(THERJR_0376),Nostoc punctiforme PCC 73102(NPUN_F5990),Granulicatella adiacens ATCC 49175(YBBP),Selenomonas flueggei ATCC 43531(HMPREF0908_1366),Thermocrinis albusDSM 14484(THAL_0234),Deferribacter desulfuricans SSM1(DEFDS_1031),Ruminococcus flavefaciens FD-1(RFLAF_010100012444),Desulfovibriodesulfuricans ND132(DND132_0877),Clostridium lentocellum DSM 5427(CLOLE_3370),Desulfovibrio aespoeensis Aspo-2(DAES_1257),Syntrophothermuslipocalidus DSM 12680(SLIP_2139),Marivirga tractuosa DSM 4126(FTRAC_3720),Desulfarculus baarsii DSM 2075(DEBA_0764),Synechococcus sp.CC9311(SYNC_1030),Thermaerobacter marianensis DSM 12885(TMAR_0236),Desulfovibrio sp.FW1012B(DFW101_0480),Jonquetella anthropi E3_33 E1(GCWU000246_01523),Syntrophobotulus glycolicus DSM 8271(SGLY_0483),Thermovibrio ammonificans HB-1(THEAM_0892),Truepera radiovictrix DSM 17093(TRAD_1704),Bacilluscellulosilyticus DSM 2522(BCELL_0170),Prevotella veroralis F0319(HMPREF0973_02947),Erysipelothrix rhusiopathiae str.Fujisawa(ERH_0115),Desulfurispirillumindicum S5(SELIN_2326),Cyanothece sp.PCC 7424(PCC7424_0843),Anaerococcusvaginalis ATCC 51170(YBBP),Aerococcus viridans ATCC 11563(YBBP),Streptococcusoralis ATCC 35037 2 seqs HMPREF8579_1682,SMSK23_1115),Zunongwangia profundaSM-A87(ZPR_0978),Halanaerobium hydrogeniformans(HALSA_1882),Bacteroidesxylanisolvens XB1A(BXY_29650),Ruminococcus torques L2-14(RTO_16490),Ruminococcus obeum A2-162(CK5_33600),Eubacterium rectale DSM 17629(EUR_24910),Faecalibacterium prausnitzii SL3/3(FPR_27630),Ruminococcus sp.SR1/5(CK1_39330),Lachnospiraceae bacterium 3_1_57FAA_CT1(HMPREF0994_01490),Lachnospiraceae bacterium 9_1_43BFAA(HMPREF0987_01591),Lachnospiraceaebacterium 1_4_56FAA(HMPREF0988_01806),Erysipelotrichaceae bacterium 3_1_53(HMPREF0983_01328),Ethanoligenens harbinense YUAN-3(ETHHA_1605),Streptococcusdysgalactiae subsp.dysgalactiae ATCC 27957(SDD27957_06215),Spirochaetathermophila DSM 6192(STHERM_C18370),Bacillus sp.2_A_57_CT2(HMPREF1013_05449),Bacillus clausii KSM-K16(ABC0241),Thermodesulfatator indicus DSM 15286(THEIN_0076),Bacteroides salanitronis DSM 18170(BACSA_1486),Oceanithermus profundusDSM 14977(OCEPR_2178),Prevotella timonensis CRIS 5C-B1(HMPREF9019_2028),Prevotella buccalis ATCC 35310(HMPREF0650_0675),Prevotella amnii CRIS 21A-A(HMPREF9018_0365),Bulleidia extructa W1219(HMPREF9013_0078),Bacteroidescoprosuis DSM 18011(BCOP_0558),Prevotella multisaccharivorax DSM 17128(PREMU_0839),Cellulophaga algicola DSM 14237(CELAL_0483),Synechococcus sp.WH 5701(WH5701_10360),Desulfovibrio africanus str.Walvis Bay(DESAF_3283),Oscillibacter valericigenes Sjm18-20(OBV_23340),Deinococcus proteolyticus MRP(DEIPR_0134),Bacteroides helcogenes P 36-108(BACHE_0366),Paludibacterpropionicigenes WB4(PALPR_1923),Desulfotomaculum nigrificans DSM 574(DESNIDRAFT_2093),Arthrospira platensis NIES-39(BAI89442.1),Mahellaaustraliensis 50-1 BON(MAHAU_1846),Thermoanaerobacter wiegelii Rt8.B1(THEWI_2191),Ruminococcus albus 7(RUMAL_2345),Staphylococcus lugdunensis HKU09-01(SLGD_00862),Megasphaera genomosp.type_1 str.28L(HMPREF0889_1099),Clostridiales genomosp.BVAB3 str.UPII9-5(HMPREF0868_1453),Pediococcusclaussenii ATCC BAA-344(PECL_571),Prevotella oulorum F0390(HMPREF9431_01673),Turicibacter sanguinis PC909(CUW_0305),Listeria seeligeri FSL N1-067(NT03LS_2473),Solobacterium moorei F0204(HMPREF9430_01245),Megasphaeramicronuciformis F0359(HMPREF9429_00929),Capnocytophaga sp.oral taxon 329str.F00872 seqs HMPREF9074_00867,HMPREF9074_01078),Streptococcus anginosusF0211(HMPREF0813_00157),Mycoplasma suis KI3806(MSUI04040),Mycoplasmagallisepticum str.F(MGF_2771),Deinococcus maricopensis DSM 21211(DEIMA_0651),Odoribacter splanchnicus DSM 20712(ODOSP_0239),Lactobacillus fermentum CECT5716(LC40_0265),Lactobacillus iners AB-1(LINEA_010100006089),cyanobacteriumUCYN-A(UCYN_03150),Lactobacillus sanfranciscensis TMW 1.1304(YBBP),Mucilaginibacter paludis DSM 18603(MUCPA_1296),Lysinibacillus fusiformis ZC1(BFZC1_03142),Paenibacillus vortex V453(PVOR_30878),Waddlia chondrophila WSU86-1044(YBBP),Flexistipes sinusarabici DSM 4947(FLEXSI_0971),Paenibacilluscurdlanolyticus YK9(PAECUDRAFT_1888),Clostridium cf.saccharolyticum K10(CLS_03290),Alistipes shahii WAL 8301(AL1_02190),Eubacterium cylindroides T2-87(EC1_00230),Coprococcus catus GD/7(CC1_32460),Faecalibacterium prausnitziiL2-6(FP2_09960),Clostridium clariflavum DSM 19732(CLOCL_2983),Bacillusatrophaeus 1942(BATR1942_19530),Mycoplasma pneumoniae FH(MPNE_0277),Lachnospiraceae bacterium 2_1_46FAA(HMPREF9477_00058),Clostridium symbiosumWAL-14163(HMPREF9474_01267),Dysgonomonas gadei ATCC BAA-286(HMPREF9455_02764),Dysgonomonas mossii DSM 22836(HMPREF9456_00401),Thermus scotoductusSA-01(TSC_C24350),Sphingobacterium sp.21(SPH21_1233),Spirochaeta caldaria DSM7334(SPICA_1201),Prochlorococcus marinus str.MIT 9312(PMT9312_1102),Prochlorococcus marinus str.MIT 9313(PMT_1058),Faecalibacteriumcf.prausnitzii KLE1255(HMPREF9436_00949),Lactobacillus crispatus ST1(LCRIS_00721),Clostridium ljungdahlii DSM 13528(CLJU_C40470),Prevotella bryantii B14(PBR_2345),Treponema phagedenis F0421(HMPREF9554_02012),Clostridiumsp.BNL1100(CLO1100_2851),Microcoleus vaginatus FGP-2(MICVADRAFT_1377),Brachyspira pilosicoli 95/1000(BP951000_0671),Spirochaeta coccoides DSM 17374(SPICO_1456),Haliscomenobacter hydrossis DSM 1100(HALHY_5703),Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115(DESKU_2883),Runella slithyformis DSM19594(RUNSL_2859),Leuconostoc kimchii IMSNU 11154(LKI_08080),Leuconostocgasicomitatum LMG 18811(OSSG),Pedobacter saltans DSM 12145(PEDSA_3681),Paraprevotella xylaniphila YIT 11841(HMPREF9442_00863),Bacteroides clarus YIT12056(HMPREF9445_01691),Bacteroides fluxus YIT 12057(HMPREF9446_03303),Streptococcus urinalis 2285-97(STRUR_1376),Streptococcus macacae NCTC 11558(STRMA_0866),Streptococcus ictaluri 707-05(STRIC_0998),Oscillochloristrichoides DG-6(OSCT_2821),Parachlamydia acanthamoebae UV-7(YBBP),Prevotelladenticola F0289(HMPREF9137_0316),Parvimonas sp.oral taxon 110 str.F0139(HMPREF9126_0534),Calditerrivibrio nitroreducens DSM 19672(CALNI_1443),Desulfosporosinus orientis DSM 765(DESOR_0366),Streptococcus mitis bv.2str.F0392(HMPREF9178_0602),Thermodesulfobacterium sp.OPB45(TOPB45_1366),Synechococcus sp.WH 8102(SYNW0935),Thermoanaerobacterium xylanolyticum LX-11(THEXY_0384),Mycoplasma haemofelis Ohio2(MHF_1192),Capnocytophaga canimorsusCc5(CCAN_16670),Pediococcus acidilactici DSM 20284(HMPREF0623_1647),Prevotella marshii DSM 16973(HMPREF0658_1600),Peptoniphilus duerdenii ATCCBAA-1640(HMPREF9225_1495),Bacteriovorax marinus SJ(BMS_2126),Selenomonassp.oral taxon 149 str.67H29BP(HMPREF9166_2117),Eubacterium yuriisubsp.margaretiae ATCC 43715(HMPREF0379_1170),Streptococcus mitis ATCC 6249(HMPREF8571_1414),Streptococcus sp.oral taxon 071 str.73H25AP(HMPREF9189_0416),Prevotella disiens FB035-09AN(HMPREF9296_1148),Aerococcus urinae ACS-120-V-Col10a(HMPREF9243_0061),Veillonella atypica ACS-049-V-Sch6(HMPREF9321_0282),Cellulophaga lytica DSM 7489(CELLY_2319),Thermaerobacter subterraneusDSM 13965(THESUDRAFT_0411),Desulfurobacterium thermolithotrophum DSM 11699(DESTER_0391),Treponema succinifaciens DSM 2489(TRESU_1152),Marinithermushydrothermalis DSM 14884(MARKY_1861),Streptococcus infantis SK1302(SIN_0824),Streptococcus parauberis NCFD 2020(SPB_0808),Streptococcus porcinusstr.Jelinkova 176(STRPO_0164),Streptococcus criceti HS-6(STRCR_1133),Capnocytophaga ochracea F0287(HMPREF1977_0786),Prevotella oralis ATCC 33269(HMPREF0663_10671),Porphyromonas asaccharolytica DSM 20707(PORAS_0634),Anaerococcus prevotii ACS-065-V-Col13(HMPREF9290_0962),Peptoniphilus sp.oraltaxon 375 str.F0436(HMPREF9130_1619),Veillonella sp.oral taxon 158 str.F0412(HMPREF9199_0189),Selenomonas sp.oral taxon 137 str.F0430(HMPREF9162_2458),Cyclobacterium marinum DSM 745(CYCMA_2525),Desulfobacca acetoxidans DSM 11109(DESAC_1475),Listeria ivanovii subsp.ivanovii PAM 55(LIV_2111),Desulfovibriovulgaris str.Hildenborough(DVU_1280),Desulfovibrio vulgaris str.'Miyazaki F'(DVMF_0057),Muricauda ruestringensis DSM 13258(MURRU_0474),Leuconostocargentinum KCTC 3773(LARGK3_010100008306),Paenibacillus polymyxa SC2(PPSC2_C4728),Eubacterium saburreum DSM 3986(HMPREF0381_2518),Pseudoramibacteralactolyticus ATCC 23263(HMP0721_0313),Streptococcus parasanguinis ATCC 903(HMPREF8577_0233),Streptococcus sanguinis ATCC 49296(HMPREF8578_1820),Capnocytophaga sp.oral taxon 338 str.F0234(HMPREF9071_1325),Centipedaperiodontii DSM 2778(HMPREF9081_2332),Prevotella multiformis DSM 16608(HMPREF9141_0346),Streptococcus peroris ATCC 700780(HMPREF9180_0434),Prevotella salivae DSM 15606(HMPREF9420_1402),Streptococcus australis ATCC700641 2 seqs HMPREF9961_0906,HMPREF9421_1720),Streptococcus cristatus ATCC51100 2 seqs HMPREF9422_0776,HMPREF9960_0531),Lactobacillus acidophilus 30SC(LAC30SC_03585),Eubacterium limosum KIST612(ELI_0726),Streptococcus downeiF0415(HMPREF9176_1204),Streptococcus sp.oral taxon 056 str.F0418(HMPREF9182_0330),Oribacterium sp.oral taxon 108 str.F0425(HMPREF9124_1289),Streptococcusvestibularis F0396(HMPREF9192_1521),Treponema brennaborense DSM 12168(TREBR_1165),Leuconostoc fallax KCTC 3537(LFALK3_010100008689),Eremococcus coleocolaACS-139-V-Col8(HMPREF9257_0233),Peptoniphilus harei ACS-146-V-Sch2b(HMPREF9286_0042),Clostridium sp.HGF2(HMPREF9406_3692),Alistipes sp.HGB5(HMPREF9720_2785),Prevotella dentalis DSM 3688(PREDE_0132),Streptococcuspseudoporcinus SPIN 20026(HMPREF9320_0643),Dialister microaerophilus UPII345-E(HMPREF9220_0018),Weissella cibaria KACC 11862(WCIBK1_010100001174),Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis KCTC 3167(LCORCK3_010100001982),Synechococcus sp.PCC 7335(S7335_3864),Owenweeksia hongkongensisDSM 17368(OWEHO_3344),Anaerolinea thermophila UNI-1(ANT_09470),Streptococcusoralis Uo5(SOR_0619),Leuconostoc gelidum KCTC 3527(LGELK3_010100006746),Clostridium botulinum BKT015925(CBC4_0275),Prochlorococcus marinus str.MIT9211(P9211_10951),Prochlorococcus marinus str.MIT 9215(P9215_12271),Staphylococcus aureus subsp.aureus NCTC 8325(SAOUHSC_02407),Staphylococcusaureus subsp.aureus COL(SACOL2153),Lactobacillus animalis KCTC 3501(LANIK3_010100000290),Fructobacillus fructosus KCTC 3544(FFRUK3_010100006750),Acetobacterium woodii DSM 1030(AWO_C28200),Planococcus donghaensis MPA1U2(GPDM_12177),Lactobacillus farciminis KCTC 3681(LFARK3_010100009915),Melissococcus plutonius ATCC 35311(MPTP_0835),Lactobacillus fructivorans KCTC3543(LFRUK3_010100002657),Paenibacillus sp.HGF7(HMPREF9413_5563),Lactobacillus oris F0423(HMPREF9102_1081),Veillonella sp.oral taxon 780str.F0422(HMPREF9200_1112),Parvimonas sp.oral taxon 393 str.F0440(HMPREF9127_1171),Tetragenococcus halophilus NBRC 12172(TEH_13100),CandidatusChloracidobacterium thermophilum B(CABTHER_A1277),Ornithinibacillusscapharcae TW25(OTW25_010100020393),Lacinutrix sp.5H-3-7-4(LACAL_0337),Krokinobacter sp.4H-3-7-5(KRODI_0177),Staphylococcus pseudintermedius ED99(SPSE_0659),Staphylococcus aureus subsp.aureus MSHR1132(CCE59824.1),Paenibacillus terrae HPL-003(HPL003_03660),Caldalkalibacillus thermarumTA2.A1(CATHTA2_0882),Desmospora sp.8437(HMPREF9374_2897),Prevotellanigrescens ATCC 33563(HMPREF9419_1415),Prevotella pallens ATCC 700821(HMPREF9144_0175),Streptococcus infantis X(HMPREF1124。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加肿瘤微环境中的c-di-AMP水平。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加肿瘤胞内空间的c-diAMP水平。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加真核细胞内的c-diAMP水平。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加免疫细胞内的c-diAMP水平。在一些实施方式中，细胞是吞噬细胞。在一些实施方式中，细胞是巨噬细胞。在一些实施方式中，细胞是树突状细胞。在一些实施方式中，细胞是中性粒细胞。在一些实施方式中，细胞是MDSC。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加癌症细胞内c-GAMP(2’3’或3’3’)和/或环-二-GMP的水平。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够增加体外细菌细胞中和/或生长培养基中c-diAMP的水平。
在任何这些实施方式中，经基因工程化以产生环状二-AMP的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的环二AMP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0至1.0倍，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的环二AMP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至100倍或更多倍的环二AMP。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生环状二-AMP的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的ATP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗至少约0-10.倍，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的ATP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至100倍或更多倍的环二AMP。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生环二-GAMP的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的环二GAMP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0-1.0倍，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的环二GAMP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至100倍或更多倍的环二GAMP。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生环二-GAMP的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的ATP和/或GTP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗至少约0-1.0倍，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的ATP和/或GTP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗至少约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至100倍或更多倍的ATP和/或GTP。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比使STING激动剂的产生率增加至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比使STING激动剂的产生率增加至少约0-1.0倍，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比使STING激动剂的产生率增加约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍。
在一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加至少约80％至100％。在一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产生增加至少约90％至100％。在一个具体实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，4小时后，基因工程化细菌使STING激动剂产生增加至少约95％至100％。在一个具体实施方式中，4小时后，相对于相同细菌亚型的未修饰细菌，基因工程化细菌使STING激动剂产量增加至少约99％至100％。在另一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加至少约10-50倍。在另一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约至少50-100倍。在另一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加至少约100-500倍。在另一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加至少约500-1000倍。在另一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加至少约1000-5000倍。在另一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加至少约5000-10000倍。在另一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加至少约10000-1000倍。
在任何这些STING激动剂生产实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤细胞增殖(体外在细胞培养和/或体内)减少至少约0至10％，10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些STING激动剂生产实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤生长减少至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些STING激动剂生产实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤尺寸减少至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些STING激动剂生产实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些STING激动剂生产实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。
在一些实施方式中，包含编码dacA(和/或用于产生STING激动剂例如cGAS的另一种酶)的基因序列的基因工程化细菌能够增加巨噬细胞和/或树突细胞中的IFN-β1mRNA或蛋白水平，例如，在细胞培养物中。在一些实施方式中，IFN-β1mRNA或蛋白的增加取决于施用的细菌剂量。在一些实施方式中，包含编码dacA(和/或用于产生STING激动剂例如cGAS的另一种酶)的基因序列的基因工程化细菌能够增加巨噬细胞和/或树突细胞(例如肿瘤)中的IFN-β1mRNA或蛋白水平。在一些实施方式中，IFN-β1 mRNA或蛋白的增加取决于施用的细菌的剂量。
在一个实施方式中，与在相同条件下施用相同亚型的未修饰细菌时观察到的IFN-β1 mRNA或蛋白产生水平相比，肿瘤中IFN-β1产生约为2倍，约3倍，约4倍，例如，在第一次注射细菌后第2天。在一些实施方式中，基因工程化细菌在骨髓来源的树突细胞中诱导产生约6000至25000，15000至25000，6000至8000，20000至25000pg/ml的IFNb1mRNA，例如在刺激后4小时。
在一些实施方式中，包含编码dacA(或用于产生STING激动剂的另一种酶)的基因序列的基因工程化细菌可以剂量依赖性地增加骨髓来源的树突细胞中的IFN-b1产生，例如，在2或4小时后刺激。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，包含编码dacA(或用于产生STING激动剂的另一种酶)的基因序列的基因工程化细菌能够减少肿瘤体积，例如，在3种细菌治疗方案后4或9天。在一个非限制性实例中，9天后肿瘤体积为约0至30mm3。
在一些实施方式中，连续27天或更长时间在第1、4和12天或每周3次测量肿瘤体积。在一些实施方式中，观察到完全的肿瘤排斥。
可以将小鼠模型中的肿瘤体积用于表征菌株活性。例如，可以在肿瘤模型(如A20B细胞淋巴瘤模型，或本文所述或本领域公知的其他模型)中连续27天或更长时间在第1、4和12天或每周3次测量肿瘤体积。可以施用不同剂量，以建立显示剂量依赖性应答和以建立功效和耐受性。可以在相同条件下，在施用STING激动剂菌株和相同亚型无STING回路菌株的动物中，比较肿瘤体积。在一些实施方式中，可以连续27天或更长时间在第1、4和12天或每周3次测量肿瘤体积。在一个实施方式中，与在相同条件下(例如，在A20模型中评估的)相同细菌亚型的未修饰细菌相比STING生产菌株使肿瘤体积减小至少约1至2倍、2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍或7至8倍。在一个实施方式中，可以在A20小鼠模型中在5、8或12天在相同条件下，在STING生产菌株与相同亚型的未修饰菌株之间比较肿瘤体积。在一个实施方式中，与在12天后在相同条件下相同亚型的未修饰菌株相比，在给予10^8CFU STING生产菌株后12天时，肿瘤体积减小至少约6倍。在一个实施方式中，与在12天后在相同条件下相同亚型的未修饰菌株相比，在给予10^7CFU STING生产菌株后12天时，肿瘤体积减小至少约2倍至3倍。在一个实施方式中，与在12天后在相同条件下相同亚型的未修饰菌株相比，在给予10^7CFU STING生产菌株后12天时，肿瘤体积减小至少约3倍至4倍。
可以通过进行体外测量c-di-AMP产生情况(在细胞中或在培养基中)来定义STING激动剂生产菌株的菌株活性。可以在1、2、3、4、5、6小时或更长时间的一段时间内测量C-DI-AMP产生情况。在一个实例中，可以在0、2或4小时测量c-di-AMP水平。可以将未经修饰的Nissle作为此类测量的基线。如果STING激动剂生产酶是在由化学诱导剂诱导的启动子的控制下，则需要加入诱导剂。如果STING激动剂生产酶是在由外源性环境条件(如低氧条件)诱导的启动子的控制下，则将细菌细胞在这些条件(例如，低氧条件)下诱导。作为附加的基线测量，可以不诱导可诱导的STING激动剂生产菌株。在孵育时间后，可以通过本文所述的LC-MS测量c-diAMP水平。在一些实施方式中，每10^9诱导的STING激动剂生产菌株能够生产浓度为至少约0.01mM至1.4mM的c-di-AMP。在一些实施方式中，例如，在2或4小时后，每10^9诱导的STING激动剂生产菌株能够生产浓度为至少约0.01mM至0.02mM、0.02mM至0.03mM、0.03mM至0.04mM、0.04mM至0.05mM、0.05mM至0.06mM、0.06mM至0.07mM、0.07mM至0.08mM、0.08mM至0.09mM、0.09mM至0.10mM、0.10mM至0.12mM的c-di-AMP。在一些实施方式中，例如，在2或4小时后，每10^9诱导的STING激动剂生产菌株能够生产浓度为至少约0.1mM至0.2mM、0.2mM至0.3mM、0.3mM至0.4mM、0.4mM至0.5mM、0.5mM至0.6mM、0.6mM至0.7mM、0.7mM至0.8mM、0.8mM至0.9mM、0.9mM至1mM、1mM至1.2mM、1.2mM至1.3mM、1.3mM至1.4mM的c-di-AMP。
还可以使用体外活性的测量来测量STING激动剂生产菌株的菌株活性。在体外菌株活性测量的非限制性实例中，可以测量培养物中RAW 264.7细胞(或其他巨噬细胞或树突状细胞)中IFN-β1诱导情况。可以在不同时间点在不同感染复数(MOI)下测量菌株的活性。例如，可以在1、2、3、4、5、6小时或更长时间测量活性。在一个实例中，可以在45分钟或4小时测量活性。可以将未经修饰的Nissle作为此类测量的基线。如果STING激动剂生产酶是在由化学诱导剂诱导的启动子的控制下，则需要加入诱导剂。如果STING激动剂生产酶是在由外源性环境条件(如低氧条件)诱导的启动子的控制下，则将细菌细胞在这些条件(例如，低氧条件)下诱导。作为附加的基线测量，可以不诱导可诱导的STING激动剂生产菌株。在孵育时间后，可以从蛋白提取物中测量IFN-β水平或者可以通过例如基于PCT的方法分析RNA水平。在一些实施方式中，诱导的STING激动剂生产菌株能够激发IFN-b水平的剂量依赖性诱导。在一些实施方式中，与在相同条件下(例如，4小时后)相同亚型未经修饰的Nissle基线菌株相比，10^1至10^2的感染复数(MOI)能够诱导至少约20至25倍、25至30倍、30至35倍、35至40倍或者更多倍的IFN-β水平。在一些实施方式中，例如，4小时后，10^1至10^2的感染复数(MOI)能够诱导至少约10,000至12,000、12,000至15,000、15,000至20,000或者20,000至25,000pg/ml培养基IFN-β。
在一些实施方式中，与在相同条件下(例如，45分钟后)相同亚型野生型Nissle基线菌株相比，10^1至10^2的感染复数(MOI)能够诱导至少约10至12倍、12至15倍、15至20倍、20至25倍或者更多倍的IFN-β水平。在一些实施方式中，例如，45分钟后，10^1至10^2的感染复数(MOI)能够诱导至少约4,000至6,000、6,000至8,000、8,000至10,000或者10,000至12,000pg/ml培养基IFN-β。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生STING激动剂的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将应答率提高至少约0-10％，10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％，98％或更多。在一些实施方式中，包含编码dacA的基因序列的基因工程化细菌实现100％的应答率。
在一些实施方式中，应答率是比未修饰的细菌的观察到的至少约0-1.0倍，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比应答率是约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍或者更高。
[435部分](433)在一些实施方式中，包含编码二腺苷酸环化酶例如DacA，di-GMAP合酶和/或其他产生STING激动剂的多肽的基因序列的基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比实现肿瘤消退至少约0-10％，10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％，98％或更多。在一些实施方式中，肿瘤消退与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的相比至少约0-1.0倍，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比肿瘤消退是约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍或者更多。
在一些实施方式中，包含编码二腺苷酸环化酶例如DacA，di-GMAP合酶和/或其他产生STING激动剂的多肽的的基因序列的基因工程化细菌增加肿瘤引流淋巴结中的总T细胞数。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，肿瘤引流淋巴结中总T细胞数量增加至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更多。在一些实施方式中，总T细胞数量的增加是与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌观察到至少约0-1.0倍，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比总T细胞数量的增加是约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍或者更多。
在一些实施方式中，包含编码二腺苷酸环化酶(例如，DacA、二-GAMP合酶)和/或其他STING激动剂产生多肽的基因序列的基因工程化细菌增加了肿瘤引流淋巴结中激活的效应CD4和CD8 T细胞的百分比。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，肿瘤引流淋巴结中激活的效应CD4和CD8 T细胞的百分比是至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更高。在一些实施方式中，激活的效应CD4和CD8T细胞的百分比与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比为至少约0-1.0倍，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，激活的效应CD4和CD8 T细胞的百分比是约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍。在一个实施方式中，由细菌编码的基因是DacA，并且激活的效应CD4和CD8T细胞的百分比是在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的2至4倍更多。
在一些实施方式中，包含编码二腺苷酸环化酶(例如，DacA，二-GAMP合酶)和/或其他STING激动剂生产多肽的基因序列的基因工程化细菌实现了肿瘤内先天性细胞因子的早期升高和效应T细胞应答的晚期升高。
在一些实施方式中，包含编码肿瘤微环境中的dacA(或用于产生STING激动剂的其他酶)的基因序列的基因工程化细菌能够克服免疫抑制并产生强大的固有和适应性抗肿瘤免疫应答。在一些实施方式中，包含编码dacA的基因序列的基因工程化细菌抑制调节性T细胞的增殖或积累。
在一些实施方式中，包含编码dacA,cGAS和/或用于产生STING激动剂的其他酶的基因序列的基因工程化细菌实现肿瘤内先天细胞因子的早期升高，包括但不限于IL-6，IL-1β和MCP-1。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，IL-6是至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更多地诱导。在一些实施方式中，IL-6与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约0-1.0倍，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多地诱导。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，诱导的IL-6是约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍或更多。在一个实施方式中，由细菌编码的基因是dacA，并且诱导的IL-6的水平比在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的水平高约2-3倍。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，肿瘤中IL-1β的水平升高至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更多。在一些实施方式中，IL-1β的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更高。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，IL-1β的水平升高约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍或更多。在一个实施方式中，细菌编码的基因是二腺苷酸环化酶(例如，DacA，二-GAMP合酶)和/或其他STING激动剂生产多肽，并且与在相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，IL-1β的水平是约2倍、3倍或4倍多。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，肿瘤中MCP1的水平升高至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更多。在一些实施方式中，MCP1的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高至少约0-1.0倍，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，MCP1的水平升高约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍或更多。在一个实施方式中，细菌编码的基因是二腺苷酸环化酶(例如，DacA，二-GAMP合酶)和/或其他STING激动剂生产多肽，并且与在相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，MCP1的水平是约2倍、3倍或4倍更多。
在一些实施方式中，包含编码二腺苷酸环化酶(例如，DacA，二-GAMP合酶)和/或其他STING激动剂生产多肽的基因序列的基因工程化细菌实现了与效应T细胞应答相关分子的激活，包括但不限于颗粒酶B、IL-2和IL-15。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，肿瘤中颗粒酶B的水平升高至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更多。在一些实施方式中，颗粒酶B的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比提高至少约0-1.0倍，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，颗粒酶B的水平升高约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍或更多。在一个实施方式中，细菌编码的基因是二腺苷酸环化酶(例如，DacA，二-GAMP合酶)和/或其他STING激动剂生产多肽，并且与在相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，颗粒酶B的水平是约2倍、3倍或4倍更多。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，肿瘤中IL-2的水平升高至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更多。在一些实施方式中，IL-2的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高至少约0-1.0倍，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更高。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，IL-2的水平升高约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍或更多。在一个实施方式中，由细菌编码的基因是DacA，并且IL-2的水平比在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的水平高约3倍，4倍或5倍。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，肿瘤中IL-15的水平升高至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更多。在一些实施方式中，IL-15的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高至少约0-1.0倍，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更高。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，IL-15的水平升高约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍或更多。在一个实施方式中，由细菌编码的基因是DacA，并且IL-15的水平比在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的水平高约2倍，3倍，4倍或5倍。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，肿瘤中IFNg的水平升高至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，IFNg的水平升高至少约0至1.0倍、1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或2倍或更多。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，IFNg的水平升高约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍或更多。在一个实施方式中，细菌编码的基因是二腺苷酸环化酶(例如，DacA，二-GAMP合酶)和/或其他STING激动剂生产多肽，并且与在相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，IFNg的水平是约2倍、3倍或4倍更多。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，肿瘤中IL-12的水平升高至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，IL-12的水平升高至少约0至1.0倍、1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或2倍或更多。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，IL-12的水平升高约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍或更多。在一个实施方式中，细菌编码的基因是二腺苷酸环化酶(例如，DacA，二-GAMP合酶)和/或其他STING激动剂生产多肽，并且与在相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，IL-12的水平是约2倍、3倍或4倍更多。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，肿瘤中TNF-a的水平升高至少约0％至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，TNF-a的水平升高至少约0至1.0倍、1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或2倍或更多。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，TNF-a的水平升高约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍或更多。在一个实施方式中，细菌编码的基因是二腺苷酸环化酶(例如，DacA，二-GAMP合酶)和/或其他STING激动剂生产多肽，并且与在相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，TNF-a的水平是约2倍、3倍或4倍更多。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，肿瘤中GM-CSF的水平升高至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，GM-CSF的水平升高至少约0至1.0倍、1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或2倍或更多。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，GM-CSF的水平升高约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍或更多。在一个实施方式中，细菌编码的基因是二腺苷酸环化酶(例如，DacA，二-GAMP合酶)和/或其他STING激动剂生产多肽，并且与在相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，GM-CSF的水平是约2倍、3倍或4倍更多。
在一些实施方式中，施用基因工程化细菌导致长期免疫记忆，所述细菌包含编码二腺苷酸环化酶(例如，DacA，二-GAMP合酶)和/或其他STING激动剂生产多肽的一种或多种的基因序列。在一些实施方式中，建立了长期免疫记忆，例如与天然的年龄匹配对照相比，至少约0至10％、10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更多得到保护，使之免受继发性肿瘤挑战。在一些实施方式中，建立了长期免疫记忆，例如与天然的年龄匹配对照相比，得到了至少约0至1.0倍、1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或2倍或更多的保护，使之免受继发性肿瘤挑战。在又一个实施方式中，建立了长期免疫记忆，例如与天然的年龄匹配对照相比，得到了至少约2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至15倍、15至20倍、20至30倍、30至40倍、或40至50倍、50至100倍、100至500倍、或500至1000倍或更多的保护，使之免受继发性肿瘤挑战。
在一些实施方式中，修饰和/或突变c-di-GAMP合酶、二腺苷酸环化酶或其他STING激动剂生产多肽，例如，以增强稳定性或增加STING激动作用。在一些实施方式中，c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌或其直系同源物(例如，来自Verminephrobacter eiseniae、反硝化金氏菌和/或杆状奈瑟氏菌)或人cGAS被修饰和/或突变，例如以增强稳定性或增加STING激动作用。在一些实施方式中，来自单核细胞增多性李斯特氏菌的二腺苷酸环化酶被修饰和/或突变，例如以增强稳定性或增加STING激动作用。
在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在诱导条件下，例如在与免疫抑制和/或肿瘤微环境相关的条件下产生一种或多种二腺苷酸环化酶，c-di-GAMP合酶和/或其他产生STING激动剂的多肽。在一些实施方式中，基因工程化的细菌和/或其他微生物能够在低氧条件或缺氧条件下，在存在某些分子或代谢物的情况下，在存在与癌症或某些组织，免疫抑制或炎症相关的分子或代谢物的情况下，或在存在肠道，循环或肿瘤中可能存在或可能不存在并且其可能存在于体外菌株培养、扩增、产生和/或生产过程中的一些其他代谢物，如阿拉伯糖、cumate和水杨酸的情况下，产生二腺苷酸环化酶、c-di-GAMP合酶和/或其他STING激动剂生产多肽。在一些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶、c-di-GAMP合酶和/或其他STING激动剂生产多肽的一种或多种基因序列，其中所述二腺苷酸环化酶、c-di-GAMP合酶和/或其他STING激动剂生产多肽与可以由肿瘤微环境的外源性环境条件诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方式中，肿瘤微环境的外源性环境条件是低氧条件。在一些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶、c-di-GAMP合酶和/或其他STING激动剂生产多肽的一种或多种基因序列，其中所述二腺苷酸环化酶、c-di-GAMP合酶和/或其他STING激动剂生产多肽与可以由本文所述的cumate或水杨酸诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方式中，编码二腺苷酸环化酶、c-di-GAMP合酶和/或其他STING激动剂生产多肽的基因序列与组成型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，编码二腺苷酸环化酶、c-di-GAMP合酶和/或其他STING激动剂生产多肽的基因序列存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或者整合至细菌和/或其他微生物的一条或多条染色体的一个或多个位点上。
在任何这些实施方式中，本文所述的任意STING激动剂生产菌株可以包含营养缺陷型修饰。在任何这些实施方式中，STING激动剂生产菌株可以包含在DapA中的营养缺陷型修饰，例如在DapA中的缺失或突变。在任何这些实施方式中，STING激动剂生产菌株还可以包含在ThyA中的营养缺陷型修饰，例如在ThyA中的缺失或突变。在任何这些实施方式中，STING激动剂生产菌株可以包含DapA和ThyA营养缺陷型。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含内源性噬菌体修饰，例如在内源性噬菌体中的突变或缺失。在一个非限制性实例中，细菌宿主是E.coli Nissle，以及如本文所述的噬菌体修饰包含在Nissle噬菌体3中的修饰。在一个实例中，噬菌体修饰是一种或多种基因的缺失，例如10kb缺失。
在任何这些实施方式中，描述的基因工程化细菌包含编码一种或多种二腺苷酸环化酶、c-di-GAMP合酶或其他STING激动剂生产多肽的基因序列，所述基因工程化细菌还可以包含编码犬尿氨酸酶的一种或多种基因序列，例如来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶并且(任选地)具有修饰，例如在TrpE基因中的突变或缺失。或者，包含编码编码一种或多种二腺苷酸环化酶、c-di-GAMP合酶或其他STING激动剂生产多肽的基因序列的基因工程化细菌可以与包含编码犬尿氨酸酶(例如来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶并且(任选地)具有修饰，例如在TrpE基因中的突变或缺失)的一种或多种基因序列的基因工程化细菌组合或联合施用。
在某些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶(例如，DacA，例如来自单核细胞增多性李斯特氏菌)的一种或多种基因序列，其中二腺苷酸环化酶基因与可以在外源性环境条件下(例如，在肿瘤微环境中的条件)诱导的启动子可操作地连接。在一个实施方式中，二腺苷酸环化酶基因与可以在低氧条件下诱导的启动子(例如，FNR启动子)可操作地连接。在某些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶(例如，dacA，例如来自单核细胞增多性李斯特氏菌)的一种或多种基因序列，其中二腺苷酸环化酶与可以由如本文所述的cumate或水杨酸诱导的启动子可操作地连接。在某些实施方式中，二腺苷酸环化酶基因序列整合至细菌染色体中。适宜的整合位点如本文所述。在一个非限制性实例中，二腺苷酸环化酶基因在HA910整合。在某些实施方式中，包含编码二腺苷酸环化酶基因序列的细菌还包含营养缺陷型修饰。在一些实施方式中，修饰(例如，突变或缺失)在dapA基因中。在一些实施方式中，修饰(例如，突变或缺失)在thyA基因中。在一些实施方式中，修饰(例如，突变或缺失)在dapA和thyA基因中。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如在内源性原噬菌体中的突变或缺失。在一个实例中，原噬菌体修饰是缺失一个或多个基因，例如10kb缺失。在一个非限制性实例中，包含编码二腺苷酸环化酶基因序列的基因工程化细菌来源于E.coli Nissle，并且如本文所述的原噬菌体修饰包含在Nissle原噬菌体3中的缺失或突变。
在某些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种二腺苷酸环化酶的基因序列，所述基因工程化细菌还可以包含编码犬尿氨酸酶的一种或多种基因序列，例如来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶并且(任选地)具有修饰，例如在TrpE基因中的突变或缺失。或者，包含编码一种或多种二腺苷酸环化酶的基因序列的基因工程化细菌可以与包含编码犬尿氨酸酶(例如来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶并且(任选地)具有修饰，例如在TrpE基因中的突变或缺失)的一种或多种基因序列的基因工程化细菌组合或联合施用。
在一个特定的实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶(例如，DacA，例如来自单核细胞增多性李斯特氏菌)的一种或多种基因序列，其中所述二腺苷酸环化酶基因与可以在低氧条件下诱导的启动子可操作地连接，例如FNR启动子。dacA基因序列整合至细菌染色体中，例如在位点HA910整合。细菌还包含营养缺陷型修饰，例如在dapA或thyA或者这两个基因中的突变或缺失。细菌还可以包含内源性噬菌体修饰，例如在内源性噬菌体中的突变或缺失，例如10kb缺失。在一个特定的实施方式中，如本文所述，基因工程化细菌来源于E.coli Nissle，并且噬菌体修饰包含在Nissle噬菌体3中的缺失或突变。
在另一个特定的实施方式中，基因工程化细菌还可以包含编码犬尿氨酸酶的一种或多种基因序列，例如来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶并且(任选地)具有修饰，例如在TrpE基因中的突变或缺失。或者，基因工程化细菌可以与包含编码犬尿氨酸酶(例如来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶并且(任选地)具有修饰，例如在TrpE基因中的突变或缺失)的一种或多种基因序列的基因工程化细菌组合或联合施用。
在某些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码cGAMP合酶(例如，人cGAS)的一种或多种基因序列，其中所述cGAS基因与可以在外源性环境条件下(例如，在肿瘤微环境中的条件)诱导的启动子可操作地连接。在一个实施方式中，cGAS基因与可以在低氧条件下诱导的启动子可操作地连接，例如FNR启动子。在某些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码cGAS(例如，人cGAS)的一种或多种基因序列，其中cGAS基因与可以由本文所述的cumate或水杨酸诱导的启动子可操作地连接。在某些实施方式中，cGAS基因序列整合至细菌染色体中。适宜的整合位点如本文所述并且是本领域公知的。在某些实施方式中，包含编码cGAS的基因序列的细菌还包含营养缺陷型修饰，例如在dapA或thyA或者这两个基因中的突变或缺失。在一些实施方式中，修饰(例如，突变或缺失)在dapA基因中。在一些实施方式中，修饰(例如，突变或缺失)在thyA基因中。在一些实施方式中，修饰(例如，突变或缺失)在dapA和thyA基因中。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含原噬菌体修饰，例如在内源性原噬菌体中的突变或缺失。在一个实例中，原噬菌体修饰是一种或多种基因的缺失，例如10kb缺失。在一个非限制性实例中，如本文所述，包含编码cGAS的基因序列的基因工程化细菌来源于E.coli Nissle，并且原噬菌体修饰包含在Nissle噬菌体3中的缺失或突变。
在任何这些实施方式中，描述的基因工程化细菌包含编码一种或多种cGAS的基因序列，所述基因工程化细菌还可以包含编码犬尿氨酸酶的一种或多种基因序列，例如来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶并且(任选地)具有修饰，例如在TrpE基因中的突变或缺失。或者，包含编码一种或多种cGAS的基因序列的基因工程化细菌可以与包含编码犬尿氨酸酶(例如来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶并且(任选地)具有修饰，例如在TrpE基因中的突变或缺失)的一种或多种基因序列的基因工程化细菌组合或联合施用。
在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码cGAS(例如，人cGAS)的一种或多种基因序列，其中所述cGAS基因与可以在低氧条件下诱导的启动子可操作地连接，例如FNR启动子。cGAS基因序列整合至细菌染色体中。细菌还包含营养缺陷型修饰，例如在dapA或thyA或者这两个基因中的突变或缺失。细菌还可以包含内源性噬菌体修饰，例如在内源性噬菌体中的突变或缺失，例如10kb缺失。在一个特定的实施方式中，基因工程化细菌来源于E.coli Nissle，并且噬菌体修饰包含在Nissle噬菌体3中的缺失或突变(例如，如本文所述的)。
在另一个特定的实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种cGAS的基因序列，所述基因工程化细菌还可以包含编码犬尿氨酸酶的一种或多种基因序列，例如，来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶并且(任选地)具有修饰，例如在TrpE基因中的突变或缺失。或者，包含编码一种或多种cGAS的基因序列的基因工程化细菌可以与包含编码犬尿氨酸酶(例如来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶并且(任选地)具有修饰，例如在TrpE基因中的突变或缺失)的一种或多种基因序列的基因工程化细菌组合或联合施用。
在某些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶(例如，DacA，例如来自单核细胞增多性李斯特氏菌)和cGAMP合酶(例如，人cGAS)的一种或多种基因序列。在某些实施方式中，二腺苷酸环化酶基因和/或cGAS基因与可以在外源性环境条件(例如，在肿瘤微环境中的条件)下诱导的启动子可操作地连接。在某些实施方式中，二腺苷酸环化酶基因和/或cGAS基因与可以由cumate或水杨酸或者另一种化学诱导剂诱导的启动子可操作地连接。在某些实施方式中，二腺苷酸环化酶基因和/或cGAS基因与组成型启动子可操作地连接。在一个实施方式中，二腺苷酸环化酶基因和/或cGAS基因与可以在低氧条件下诱导的启动子可操作地连接，例如FNR启动子。在某些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶基因(例如，DacA，例如来自单核细胞增多性李斯特氏菌)和cGAS(例如，人cGAS)的一种或多种基因序列，其中所述二腺苷酸环化酶基因和/或cGAS基因与可以由本文所述的cumate或水杨酸诱导的启动子可操作地连接。在某些实施方式中，二腺苷酸环化酶和cGAS基因序列整合至细菌染色体中。适宜的整合位点如本文所述并且是本领域公知的。在某些实施方式中，包含编码二腺苷酸环化酶和cGAS基因序列的细菌还包含在dapA或thyA或者这两个基因中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含原噬菌体修饰，例如在内源性原噬菌体中的突变或缺失。在一个实例中，原噬菌体修饰是一种或多种基因的缺失，例如10kb缺失。在一个非限制性实例中，如本文所述，包含编码二腺苷酸环化酶和cGAS的基因序列的基因工程化细菌来源于E.coli Nissle，并且原噬菌体修饰包含在Nissle噬菌体3中的缺失或突变。
在任何这些实施方式中，描述的基因工程化细菌包含编码一种或多种二腺苷酸环化酶和cGAS生产多肽的基因序列，所述基因工程化细菌还可以包含编码犬尿氨酸的一种或多种基因序列，例如，来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶并且(任选地)具有修饰，例如在TrpE基因中的突变或缺失。或者，包含编码一种或多种二腺苷酸环化酶和cGAS多肽的基因序列的基因工程化细菌可以与包含编码犬尿氨酸酶(例如来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶并且(任选地)具有修饰，例如在TrpE基因中的突变或缺失)的一种或多种基因序列的基因工程化细菌组合或联合施用。
在一个特定的实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶(例如，DacA，例如来自单核细胞增多性李斯特氏菌)和cGAS(例如，人cGAS)的一种或多种基因序列，其中所述二腺苷酸环化酶基因和/或cGAS基因与可以在低氧条件下诱导的启动子可操作地连接，例如FNR启动子。二腺苷酸环化酶基因和cGAS基因序列整合至细菌染色体中。细菌还包含营养缺陷型修饰，例如在dapA或thyA或者这两个基因中的突变或缺失。细菌还可以包含内源性噬菌体修饰，例如在内源性噬菌体中的突变或缺失，例如10kb缺失。在一个特定的实施方式中，基因工程化细菌来源于E.coli Nissle，并且噬菌体修饰包含在Nissle噬菌体3中的缺失或突变(例如，如本文所述的)。
在另一个特定的实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种二腺苷酸环化酶和cGAS多肽的基因序列，所述基因工程化细菌还可以包含编码犬尿氨酸酶的一种或多种基因序列，例如，来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶并且(任选地)具有修饰，例如在TrpE基因中的突变或缺失。或者，包含编码一种或多种二腺苷酸环化酶和cGAS多肽的基因序列的基因工程化细菌可以与包含编码犬尿氨酸酶(例如来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶并且(任选地)具有修饰，例如在TrpE基因中的突变或缺失)的一种或多种基因序列的基因工程化细菌组合或联合施用。
在任何这些实施方式中，可以将一种或多种经基因工程化以生产一种或多种STING激动剂的细菌单独施用或与一种或多种本文所述的免疫检查点抑制剂联用，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。在一些实施方式中，当与检查点抑制剂疗法联用时，生产STING激动剂的一种或多种基因工程化细菌激发免疫记忆。
在任何这些实施方式中，可以将一种或多种经基因工程化以生产STING激动剂的细菌进行基因工程化以生产和分泌或者在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫检查点抑制剂，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。在一些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌在肿瘤再次挑战/复发后促进免疫记忆，所述细菌包含编码一种或多种用于生产STING激动剂的酶的基因序列和编码一种或多种免疫检查点抑制剂(例如，scFv抗体)的基因序列。
在任何这些实施方式中，可以将一种或多种经基因工程化以生产一种或多种STING激动剂的细菌单独施用或与一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂联用，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。在一些实施方式中，一种或多种生产STING激动剂的基因工程化细菌当与抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体联合施用时激发免疫记忆。
在任何这些实施方式中，可以将一种或多种经基因工程化改造以生产STING激动剂的细菌进行基因工程化以生产和分泌或者在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。在一些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌激发免疫记忆，所述细菌包含编码一种或多种STING激动剂生产酶的基因序列和编码一种或多种共刺激抗体(例如，选自抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体)的基因序列。
在一个实施方式中，当单独或与检查点抑制剂疗法和/或共刺激抗体(例如，选自抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体)联用时，施用STING激动剂生产菌株激发远位效应。在一个实施方式中，施用基因工程化细菌激发远位效应，所述细菌包含编码二腺苷酸环化酶(例如，DacA，例如来自单核细胞增多性李斯特氏菌)的一种或多种基因。在一个实施方式中，在第2天和第3天之间观察到远位效应。在一个实施方式中，施用基因工程化细菌激发远位效应，所述细菌包含编码cGAS(例如，人cGAS)的一种或多种基因。
而且，在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物还能够表达任何一种或多种所述的回路，并且还包含下述中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，如本领域公知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如dapA和thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀伤开关回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何杀伤开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的任何表面展示回路，(7)用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢产物(例如，犬尿氨酸、色氨酸、腺苷、精氨酸)的一种或多种回路，(8)一种或多种本文所述的免疫引发剂(例如，STING激动剂、CD40L、SIRPα)，(9)一种或多种本文所述的免疫维持剂(例如，IL-15、IL-12、CXCL10)，和(10)一种或多种此类其他回路的组合。
CD40
CD40是在抗原提呈细胞上发现的共刺激蛋白，并且是其激活所必需的。CD154(CD40L)在T辅助细胞上与CD40的结合激活抗原提呈细胞并诱导多种下游免疫刺激作用。在一些实施方式中，免疫调节剂是CD40的激动剂，例如，选自激动性抗CD40抗体，激动性抗CD40抗体片段，CD40配体(CD40L)多肽的激动剂，和CD40L多肽片段。因而，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码激动性抗-CD40抗体或其片段，或CD40配体(CD40L)多肽或其片段的一种或多种序列。
因而，在一些实施方式中，工程化细菌被工程化以产生激动性抗-CD40抗体或其片段，或者CD40配体(CD40L)多肽或其片段。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗-CD40抗体或其片段或者CD40配体(CD40L)多肽或其片段的序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码一个或多个针对CD40的抗体拷贝的基因序列。在一些实施方式中，CD40是人CD40。在一些实施方式中，抗-CD40抗体是scFv。在一些实施方式中，抗-CD40抗体是分泌的。在一些实施方式中，抗-CD40抗体是展示在细胞表面上的。在任何这些实施方式中，编码激动性抗-CD40抗体或其片段或者CD40配体(CD40L)多肽或其片段的基因序列还编码分泌标签(例如，如本文所述的)。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌生产至少约0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的CD40配体。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的CD40配体。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌生产三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的CD40配体。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，被基因工程化以生产CD40配体的细菌分泌至少约0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的CD40配体。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌分泌至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的CD40配体。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌分泌三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的CD40配体。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以分泌CD40配体的细菌能够将细胞增殖减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以分泌CD40配体的细菌能够将肿瘤生长减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以分泌CD40配体的细菌能够将肿瘤尺寸减小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以生产CD40配体的细菌能够将肿瘤体积减小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以生产CD40配体的细菌能够将肿瘤重量减小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以生产CD40配体的细菌能够将应答率增加至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程化以生产CD40配体的细菌能够增加树突状细胞和/或巨噬细胞上CCR7的表达。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，诱导的CCR7是至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，诱导的CCR7是约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，诱导的CCR7是约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍或更多。在一个实施方式中，在巨噬细胞中诱导的CCR7的水平比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果高25％-55％，约30-45％。
在一个实施方式中，在树突状细胞中诱导的CCR7的水平是相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果的约两倍。
在一些实施方式中，经基因工程化以生产CD40配体的细菌能够增加树突状细胞和/或巨噬细胞上CCR7的表达。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，诱导的CD40是至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％、98％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，诱导的CD40是约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果相比，诱导的CD40是约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍或更多。在一个实施方式中，在巨噬细胞中诱导的CD40的水平比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果高30-50％。
在一个实施方式中，在树突状细胞中诱导的CD40的水平比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌所观察到的结果高约10％。
因此，在一个实施方式中，基因工程化细菌编码CD40配体多肽，所述CD40配体多肽与一种或多种SEQ ID NO:1093具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:1093。在又一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽由SEQ ID NO:1093组成。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在存在癌症和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢产物的情况下，和/或在存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下，和/或在存在肠道中可能存在的代谢产物的情况下，和/或在存在可能存在或不存在于体内，并且可能存在于体外菌株培养、扩增、产生和/或生产过程中的代谢产物(如阿拉伯糖、cumate和水杨酸以及本文所述的其他物质)的情况下，表达编码激动性抗-CD40抗体或其片段或CD40配体(CD40L)多肽或其片段的任何一种或多种所述的回路。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被可以由此类条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，可以在体内施用此类诱导剂以诱导效应基因表达。在一些实施方式中，如本文所述的，一种或多种基因序列由组成型启动子控制。在一些实施方式中，如本文所述的，一种或多种基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下(例如，在扩增、产生和/或生产过程中)表达。在一些实施方式中，任何一种或多种所述的回路存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或者整合至微生物染色体中的一个或多个位点中。
在任何这些实施方式中，包含编码激动性抗-CD40抗体或其片段或者CD40配体(CD40L)多肽或其片段的一种或多种基因序列的基因工程化细菌还包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码激动性抗-CD40抗体或其片段或者CD40配体(CD40L)多肽或其片段的回路可以与编码本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。
在任何这些实施方式中，在相同或不同菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码激动性抗-CD40抗体或其片段或者CD40配体(CD40L)多肽或其片段的一种或多种基因序列可以与编码本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码激动性抗-CD40抗体或其片段或者CD40配体(CD40L)多肽或其片段的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子(如FNR)或本文所述的任何组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码激动性抗-CD40抗体或其片段或者CD40配体(CD40L)多肽或其片段的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子(如FNR)或本文所述的任何组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。
在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
而且，在一些实施方式中，基因工程化微生物能够表达任何一种或多种所述的编码激动性抗-CD40抗体或其片段或者CD40配体(CD40L)多肽或其片段的回路，并且还包含下述中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，如本领域公知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀伤开关回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何杀伤开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的任何表面展示回路，(7)用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢产物(例如，犬尿氨酸、色氨酸、腺苷、精氨酸)的一种或多种回路，(8)一种或多种此类其他回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂联用，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
GMCSF
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，也称为集落刺激因子2(CSF2)，是由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、NK细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的单体糖蛋白。GM-CSF是一种白细胞生长因子，可作为细胞因子发挥作用，促进免疫系统的发育并增强抵抗感染的能力。例如，GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞，其中单核细胞退出循环并迁移进入组织，随后其成熟为巨噬细胞和树突状细胞。GM-CSF是免疫/炎症级联反应的一部分，通过其少量巨噬细胞的激活迅速导致其数量增加，这一过程对于抵抗感染至关重要。GM-CSF通过信号转导物和转录激活因子STAT5或STAT3(其激活巨噬细胞)发出信号。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够生产调节树突状细胞激活的免疫调节剂。在一些实施方式中，免疫调节剂是GM-CSF。因而，在一些实施方式中，对工程化细菌进行工程化以生产GM-CSF。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码GM-CSF的序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码GM-CSF的序列和编码用于分泌GM-CSF的一种或多种分泌肽的序列。示例性分泌标签和分泌方法如本文所述。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在存在癌症和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢产物的情况下，和/或在存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下，和/或在存在肠道中可能存在的代谢产物的情况下，和/或在存在可能存在或不存在于体内，并且可能存在于体外菌株培养、扩增、产生和/或生产过程中的代谢产物(如阿拉伯糖、cumate和水杨酸以及本文所述的其他物质)的情况下，表达任何一种或多种所述的GM-CSF回路。在一些实施方式中，可以在体内施用此类诱导剂以诱导效应基因表达。在一些实施方式中，编码GM-CSF的一种或多种基因序列被可以由此类条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，如本文所述的，编码GM-CSF的一种或多种基因序列被组成型启动子控制。在一些实施方式中，如本文所述的，一种或多种基因序列被组成型启动子控制，并且在体内条件下和/或在体外条件下表达，例如在扩增、产生和/或生产过程中。在一些实施方式中，编码GM-CSF的任何一种或多种所述的基因序列存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或整合至微生物染色体的一个或多个位点中。
在任何这些实施方式中，包含编码GM-CSF的一种或多种基因序列的基因工程化细菌还包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码GM-CSF的回路可以与编码本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。
在任何这些实施方式中，在相同或不同菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码GM-CSF的一种或多种基因序列可以与编码本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码GM-CSF的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子(如FNR)或本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体。在一些实施方式中，与编码GM-CSF的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子(如FNR)或本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。
在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如，如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述编码GM-CSF的回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如任何营养缺陷型本领域已知的并且在本文中提供，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌物回路，例如本文所述的任何分泌回路，以及本领域，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述的任何表面展示回路，以及本领域中已知的和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种代谢物的回路(例如，本文所述的犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)(8)一种或多种这些附加回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4抗-PD1或抗-PDL1抗体。
激活和初免效应免疫细胞(免疫刺激剂)
T细胞激活剂
细胞因子和细胞因子受体
CD4(4)是在免疫细胞如细胞，单核细胞，巨噬细胞和树突细胞表面上发现的糖蛋白。CD4+T辅助细胞是白细胞，其功能是向其他类型的免疫细胞发送信号，从而在免疫过程中协助其他免疫细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活。当T细胞辅助细胞通过MHCII类分子呈递肽抗原时，它们被激活，所述MHCII类分子在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。一旦被激活，T辅助细胞分裂并分泌调节或辅助主动免疫应答的细胞因子。T辅助细胞可以分化成几种亚型之一，包括TH1，TH2，TH3，TH17，TH9或TFH细胞，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还涉及移植排斥。这些细胞也称为CD8+T细胞，因为它们在其表面表达CD8糖蛋白。细胞毒性T细胞通过结合与MHCI类分子相关的抗原识别它们的靶标，所述MHCI类分子存在于所有有核细胞的表面上。
在一些实施方式中，基因工程化微生物，例如基因工程化细菌，能够产生一种或多种调节一种或多种T效应细胞的效应分子或免疫调节剂，例如CD4+细胞和/或CD8+细胞。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生一种或多种效应分子，其激活，刺激和/或诱导一种或多种T效应细胞(例如CD4+和/或CD8+细胞)的分化。在一些实施方式中，免疫调节剂是激活，刺激和/或诱导T效应细胞(例如CD4+和/或CD8+细胞)分化的细胞因子。在一些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21，IL-18，TNF和IFN-γ的细胞因子。如本文所用，一种或多种细胞因子的产生包括融合蛋白，其包含一种或多种细胞因子，其通过与另一种细胞因子或其他免疫调节分子连接的肽融合。实例包括但不限于IL-12和IL-15融合蛋白。通常，本文所述的所有激动剂和拮抗剂可通过肽接头与另一种目的多肽融合，以改善或改变其功能。例如，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种细胞因子的序列，所述细胞因子选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21，IL-18，TNF和IFN-γ。在一些实施方式中，基因工程化微生物编码一种或多种细胞因子融合蛋白。此类融合蛋白的非限制性实例包括可操作地连接抗体多肽的一种或多种细胞因子多肽，其中抗体识别肿瘤特异性抗原，从而使细胞因子接近肿瘤。
白细胞介素12(IL-12)是一种细胞因子，其作用在固有和适应性免疫之间产生相互作用。IL-12由许多免疫细胞分泌，包括激活的树突细胞，单核细胞，巨噬细胞和嗜中性粒细胞，以及其他细胞类型。IL-12是由p35和p40亚基组成的异二聚体蛋白(IL-12-p70；IL-12-p35/p40)，并与由两个亚基IL-12R-β1和IL-12R-β2组成的受体结合。IL-12受体在许多免疫细胞上组成型或诱导型表达，包括NK细胞，T细胞和B淋巴细胞。在IL-12结合后，受体被激活并且通过JAK/STAT途径启动下游信号传导，导致对IL-12的细胞应答。IL-12通过增加来自NK和T细胞的IFN-γ的产生而起作用，IFN-γ是IL-12作用的最有效的介质。此外，IL-12促进激活的NK细胞，CD8+和CD4+T细胞的生长和细胞毒性，并将CD4+Th0细胞的分化转向Th1表型。此外，IL-12增强针对肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和IgG的诱导以及B细胞产生IgE的抑制。此外，IL-12还在骨髓衍生的抑制细胞的重编程中起作用，指导Th1型免疫应答并有助于增加MHCI类分子的表达(例如，在Waldmann等，Cancer ImmunolResMarch2015.3；219中综述)。
因此，在一些实施方式中，工程化细菌被工程化以产生IL-12。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-12的序列(即p35和p40亚基)。在一些实施方式中，工程化细菌经工程化以过表达IL-12，例如，与强启动子可操作地连接和/或包含一个以上IL-12基因序列的拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两个或更多个IL-12拷贝的序列，例如，IL-12基因的两个，三个，四个，五个，六个或更多个拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌产生一种或多种刺激IL-12产生的免疫调节剂。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-12的序列和编码用于分泌IL-12的分泌肽的序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其中两个白细胞介素-12单体亚基(IL-12A(p35)和IL-12B(p40))通过接头共价连接。在一些实施方式中，接头是富含丝氨酸甘氨酸的接头。在一个实施方式中，基因序列编码构建体，其中'GGGGSGGGGSGGGGS'的15个氨基酸接头插入两个单体亚基(IL-12A(p35)和IL-12B(p40)之间以产生强制二聚体人IL-12(diIL-12)融合蛋白。在一些实施方式中，基因序列经密码子优化用于表达，例如用于在大肠杆菌中表达。在任何实施方式中，其中基因工程化细菌包含用于表达IL-12的基因序列，其中两个亚基连接，基因序列可以进一步包含分泌标签。分泌标签包括本文所述或本领域已知的任何分泌标签。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与IL-12(p40)亚基连接的IL-12(p35)亚基的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1169，SEQ ID NO：1170，SEQ ID NO:1171，SEQID NO:1172，SEQ ID NO:1173，SEQ ID NO:1174，SEQ ID NO:1175，SEQ ID NO:1176，SEQ IDNO:1177，SEQ ID NO:1178，SEQ ID NO:1179，SEQ ID NO:1191，SEQ ID NO:1192，SEQ IDNO:1193和SEQ ID NO:1194的序列具有至少约80％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与IL-12(p40)亚基连接的IL-12(p35)亚基的基因序列，其与选自SEQ IDNO:1169，SEQ ID NO:1170，SEQ ID NO:1171，SEQ ID NO:1172，SEQ ID NO:1173，SEQ IDNO:1174，SEQ ID NO:1175，SEQ ID NO:1176，SEQ ID NO:1177，SEQ ID NO:1178，SEQ IDNO:1179，SEQ ID NO:1191，SEQ ID NO:1192，SEQ ID NO:1193和SEQ ID NO:1194的序列具有至少约90％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与IL-12(p40)亚基连接的IL-12(p35)亚基的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1169，SEQ ID NO:1170，SEQ IDNO:1171，SEQ ID NO:1172，SEQ ID NO:1173，SEQ ID NO:1174，SEQ ID NO:1175，SEQ IDNO:1176，SEQ ID NO:1177，SEQ ID NO:1178，SEQ ID NO:1179，SEQ ID NO:1191，SEQ IDNO:1192，SEQ ID NO:1193和SEQ ID NO:1194的序列具有至少约95％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与IL-12(p40)亚基连接的IL-12(p35)亚基的基因序列，其具有与选自SEQ ID NO:1169，SEQ ID NO:1170，SEQ ID NO:1171，SEQ ID NO:1172，SEQID NO:1173，SEQ ID NO:1174，SEQ ID NO:1175，SEQ ID NO:1176，SEQ ID NO:11NO：1177，SEQ ID NO:1178，SEQ ID NO:1179，SEQ ID NO:1191，SEQ ID NO:1192，SEQ ID NO:1193和SEQ ID NO:1194的序列，或其功能片段约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，与IL-12(p40)亚基连接的IL-12(p35)亚基包含选自SEQ ID NO:1169，SEQ IDNO:1170，SEQ ID NO:1171，SEQ ID NO:1172，SEQ ID NO:1173，SEQ ID NO:1174，SEQ IDNO:1175，SEQ ID NO:1176，SEQ ID NO:1177，SEQ ID NO:1178，SEQ ID NO:1179，SEQ IDNO:1191，SEQ ID NO:1192，SEQ ID NO:1193和SEQ ID NO:1194的序列。在另一个实施方式中，与基因工程化细菌表达的IL-12(p40)亚基连接的IL-12(p35)亚基由选自SEQ ID NO:1169，SEQ ID NO:1170，SEQIDNO：1171，SEQ ID NO:1172，SEQ ID NO:1173，SEQ ID NO:1174，SEQ ID NO:1175，SEQ ID NO:1176，SEQ ID NO:1177，SEQ ID NO:1178，SEQ ID NO:1179，SEQ ID NO:1191，SEQ ID NO:1192，SEQ ID NO:1193和SEQ ID NO:1194的序列组成。在其中基因工程化细菌编码与IL-12(p40)亚基连接的IL-12(p35)亚基的任何这些实施方式中，去除编码标签的一种或多种序列，例如V5，FLAG或His标签。在其他实施方式中，除去分泌标签并用不同的分泌标签代替。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的IL-12。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的IL-12。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的IL-12。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌产生至少约5-10，10-20，20-30，30-40，40-50，50-60，60-70，80-90，90-100，100-150，150-200，200-250，250-300，300-350，350-400pg/ml培养基，例如诱导4小时后。在一个实施方式中，基因工程化细菌产生至少约195，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，300，310，320，330，340，350，360，370，380，390，400，410，420，430，440，450，460，470，480，490或500，pg/ml培养基，例如诱导4小时后。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-12的细菌分泌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的IL-12。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的IL-12。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的IL-12。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IL-12的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使细胞增殖减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％，98％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IL-12的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％，98％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IL-12的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤大小减小至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-12的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，基因工程化以产生IL-12的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-12的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将应答率提高至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
IL-15在固有和适应性免疫系统的体内平衡中显示多效功能，并与IL-15受体结合，IL-15受体是由三个亚基组成的异源三聚体受体。α亚基特异于IL-15，而β(CD122)和γ(CD132)亚基与IL-2受体共享，并允许通过JAK/STAT途径共享信号传导。IL-15由几种细胞类型产生，包括树突细胞，单核细胞和巨噬细胞。在同一细胞中产生的IL-15Rα和IL-15的共表达允许IL-15与IL-15Rα的细胞内结合，然后IL-15Rα作为复合物穿梭至细胞表面。一旦进入细胞表面，那么这些细胞的IL-15Rα能够将IL-15转运至不表达IL-的CD8T细胞，NK细胞和NK-T细胞的IL-15Rβ-γc。15，诱导形成所谓的免疫突触。鼠和人IL-15Rα以膜结合和可溶形式存在。可溶性IL-15Rα(sIL-15Rα)通过蛋白水解切割从跨膜受体组成型产生。
IL-15对于淋巴样发育和固有免疫细胞的外周维持和T细胞的免疫记忆至关重要，特别是天然杀伤(NK)和CD8+T细胞群。与IL-2相反，IL-15不促进Tregs的维持，此外，已显示IL-15保护效应T细胞免受IL-2介导的激活诱导的细胞死亡。
因此，IL-15的递送被认为是长期抗肿瘤免疫的有希望的策略。在重组人IL-15的第一次人体临床试验中，在处理时观察到NK细胞的10倍扩增并显著增加γδT细胞和CD8+T细胞的增殖。此外，已开发出含有细胞因子-受体融合复合物的IL-15超级激动剂，并进行评估以增加反应的长度。这些包括L-15N72D超级激动剂/IL-15RαSushi-Fc融合复合物(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803)(Kim等，2016IL-15 superagonist/IL-15RαSushi-Fcfusion complex(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803)显著增强NK和记忆CD8+T细胞的特异性亚群，并介导针对鼠乳腺癌和结肠癌的有效抗肿瘤活性。
因此，在一些实施方式中，工程化细菌被工程化以产生IL-15。在一些实施方式中，IL-15被分泌。
通过将IL-15与融合蛋白IL-15Rα-Fc预先结合或通过与IL-15Rα的寿司结构域(hyper-IL-15)直接融合以模拟反式呈递，IL-15的生物活性得到极大改善。细胞相关的IL-15Rα对IL-15的影响IL-15单独施用或作为与IL-15Rα的复合物施用，在动物模型中显示出有效的抗肿瘤活性(Cheng等，Immunotherapy of metastatic and autochthonous livercancer with IL-15/IL-15Rαfusion protein；Oncoimmunology.2014；3(11):e963409，以及其中的参考文献)。
在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-15的基因序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-15Ra的序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-15的序列和编码IL-15Ra的序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码包含IL-15和IL-15Ra的融合多肽的序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-15的序列和编码分泌标签的序列。示例性分泌标签为本领域已知并且在本文中描述。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％IL-15的45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白。
在一些实施方式中，经基因工程化以分泌IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使细胞增殖减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤大小减小至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将应答率提高至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够促进NK细胞扩增至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进NK细胞的扩增至至少1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进NK细胞扩增至至少三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，15倍，20倍，30倍，40倍，50倍，100倍，500倍或1000倍更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使γδT细胞和/或CD8+T细胞的增殖增加至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更大程度。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比使γδT细胞和/或CD8+T细胞的增殖增加至少1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8倍-2倍或2倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比增加γδT细胞和/或CD8+T细胞的增殖至少三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够与IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白受体结合至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更高的亲和力。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比与IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白受体结合至少1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更高的亲和力。在另一个实施方式中，基因工程化细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比与IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白受体结合至少三倍，四倍，五倍，六倍，七倍。八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍，或一千倍或更高的亲和力。
在一些实施方式中，包含一种或多种编码IL-15用于分泌的基因的基因工程化细菌能够诱导STAT5磷酸化，例如在CD3+IL15RAα+T细胞中。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够诱导STAT5磷酸化至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更高水平。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比诱导STAT5磷酸化至少1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更高。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比诱导STAT5磷酸化至少三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更高。在一个实施方式中，IL-15分泌菌株在相同条件下以相同的量诱导与rhIL15相当的STAT5磷酸化。
在一些实施方式中，包含编码IL-15用于分泌的一种或多种基因的基因工程化细菌能够诱导STAT3磷酸化，例如在CD3+IL15RAα+T细胞中。在一些实施方式中，包含编码IL-15用于分泌的一种或多种基因的基因工程化细菌能够诱导STAT3磷酸化，例如在CD3+IL15RAα+T细胞中。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够诱导STAT3磷酸化至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更高水平。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比诱导STAT3磷酸化至少1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更高水平。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比诱导STAT3磷酸化至少三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更高。在一个实施方式中，IL-15分泌菌株在相同条件下以相同的量诱导与rhIL15相当的STAT3磷酸化。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种IL-15，IL-Rα，接头和IL-15-IL15Rα融合多肽的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1133，SEQ ID NO:1134，SEQ IDNO:1135，SEQ ID NO:1136的序列具有至少约80％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种IL-15，IL-Rα，接头和IL-15-IL15Rα融合多肽的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1133，SEQ ID NO:1134，SEQ ID NO:1135，SEQ ID NO:1136序列具有至少约90％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种IL-15，IL-Rα，接头和IL-15-IL15Rα融合多肽的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1133，SEQ ID NO:1134，SEQID NO:1135，SEQ ID NO:1136序列具有至少约90％的同一性。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与选自SEQ ID NO:1133，SEQ IDNO:1134，SEQ ID NO:1135，SEQ ID NO:1136的一个或多肽的基因序列或其功能片段的一个或多个多肽具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同一性。在其他具体实施方式中，多肽由选自SEQ ID NO:1133，SEQ ID NO:1134，SEQ ID NO:1135，SEQ ID NO:1136的一种或多种多肽组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-15，IL-Rα，接头和IL-15-IL15Rα融合蛋白的基因序列，或其片段或功能变体。在一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1338，SEQ ID NO:1339，SEQ ID NO:1340，SEQ ID NO:1341，SEQ ID NO:1342，SEQ ID NO:1343，SEQ ID NO:1344的序列具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1338，SEQ ID NO:1339，SEQ ID NO:1340，SEQ ID NO:1341，SEQ ID NO:1342，SEQ ID NO:1343，SEQ ID NO:1344的序列具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1338，SEQ ID NO:1339，SEQ ID NO:1340，SEQ IDNO:1341，SEQ ID NO:1342，SEQ ID NO:1343，SEQ ID NO:1344的序列具有至少约95％的同一性。在某些实施方式中，IL-15，IL-Rα，接头和IL-15-IL15Rα融合蛋白序列具有与选自SEQID NO:1338SEQ ID NO:1339，SEQ ID NO:1340，SEQ ID NO:1341，SEQ ID NO:1342，SEQ IDNO:1343，SEQ ID NO:1344或其功能片段的一个或多个多核苷酸至少约80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在一些具体实施方式中，基因序列包含选自SEQ ID NO:1338，SEQ ID NO:1339，SEQ ID NO:1340，SEQ ID NO:1341，SEQ ID NO:1342，SEQ ID NO:1343，SEQ ID NO:1344的一种或多种多核苷酸。在其他具体实施方式中，基因序列由选自SEQ ID NO:1338，SEQ ID NO:1339，SEQID NO:1340，SEQ ID NO:1341，SEQ ID NO:1342，SEQ ID NO:1343，SEQ ID NO:1344的一种或多种多核苷酸组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列，或其片段或功能变体。在一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQ ID NO:1201，SEQIDNO：1202，SEQ ID NO:1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列具有至少约80％的同一性。在另一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQID NO:1201，SEQIDNO：1202，SEQ ID NO:1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列具有至少约85％的同一性。在一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQ ID NO:1201，SEQIDNO：1202，SEQ ID NO:1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，基因序列IL-15或IL-15融合蛋白与选自SEQ ID NO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQ ID NO:1201，SEQ ID NO:1202，SEQ ID NO:1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列具有至少约95％的同一性。在另一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQ ID NO:1201，SEQ ID NO:1202，SEQ ID NO:1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列具有至少约96％，97％，98％或99％的同一性。因此，在一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQ ID NO:1201，SEQ ID NO:1202，SEQ ID NO:1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％具有89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列包含选自SEQ ID NO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQ ID NO:1201，SEQ ID NO:1202，SEQ ID NO:1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列。在另一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列由选自SEQ IDNO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQ ID NO:1201，SEQ ID NO:1202，SEQIDNO：1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列组成。在其中基因工程化细菌编码IL-15或IL-15融合蛋白的任何这些实施方式中，除去编码标签的一种或多种序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码本文所述的IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1195，SEQ ID NO:1196，SEQIDNO：1197，和SEQ ID NO:1198的序列具有至少约80％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1195，SEQ ID NO:1196，SEQ ID NO:1197和SEQ ID NO:1198的序列具有至少约90％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1195，SEQ ID NO:1196，SEQ ID NO:1197和SEQ ID NO:1198的序列具有至少约95％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列，其具有与选自SEQ IDNO:1195，SEQIDNO：1196，SEQ ID NO:1197和SEQ ID NO:1198，或其功能片段的序列约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，IL-15或IL-15融合蛋白包含选自SEQID NO:1195，SEQ ID NO:1196，SEQ ID NO:1197和SEQ ID NO:1198的序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的IL-15或IL-15融合蛋白由选自SEQ ID NO:1195，SEQ IDNO:1196，SEQ ID NO:1197和SEQ ID NO:1198的序列组成。在其中基因工程化细菌编码IL-15或IL-15融合蛋白的任何这些实施方式中，可以除去分泌标签并用不同的分泌标签代替。
干扰素γ(IFNγ或II型干扰素)是一种对固有和适应性免疫至关重要的细胞因子对抗病毒，一些细菌和原生动物感染。IFNγ激活巨噬细胞并诱导II类主要组织相容性复合物(MHC)分子表达。IFNγ可以抑制病毒复制，并在免疫系统中具有免疫刺激和免疫调节作用。IFNγ主要由天然杀伤(NK)和天然杀伤T(NKT)细胞产生，作为固有免疫应答的一部分，并由CD4Th1和CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应T细胞产生。一旦抗原特异性免疫发展IFNγ由T辅助细胞(特别是Th1细胞)，细胞毒性T细胞(TC细胞)和NK细胞分泌。只要。它具有多种免疫刺激作用，在免疫系统中起着不同的作用，包括促进NK细胞活性，增加巨噬细胞的抗原呈递和溶酶体活性，诱导一氧化氮合酶iNOS的激活，从激活的血浆B细胞产生某些IgG，促进导致细胞免疫的Th1分化。它还可以使正常细胞增加表达I类MHC分子以及抗原呈递细胞上的II类MHC促进与白细胞迁移相关的粘附和结合，并且通过激活巨噬细胞参与肉芽肿形成，使得它们在杀死细胞内生物方面变得更强大。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％IFN-γ的比例为45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的IFN-γ。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的IFN-γ。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的IFN-γ。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的IFN-γ。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的IFN-γ。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的IFN-γ。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使细胞增殖减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，包含编码IFN-γ的一种或多种基因的基因工程化细菌在巨噬细胞系中诱导STAT1磷酸化。在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比诱导STAT1磷酸化0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％或更高。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比诱导STAT1磷酸化1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更高的水平。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比诱导STAT1磷酸化三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更高的水平。
在一个具体实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，细菌能够使肿瘤中IFNγ产生增加0.1，0.2，0.3ng/克肿瘤。在一个具体实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，细菌能够在相同条件下将IFNγ产生增加约5倍，10倍或15倍。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤大小减小至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将应答率提高至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
白细胞介素-18(IL18，也称为干扰素-γ诱导因子)是一种促炎细胞因子，属于IL-1超家族，由巨噬细胞产生。和其他细胞。IL-18与...结合白细胞介素-18受体，与IL-12一起，在脂多糖等微生物产物感染后诱导细胞免疫(LPS)。用IL-18刺激后，自然杀伤(NK)细胞和某些T辅助细胞1型细胞释放干扰素-γ(IFN-γ)或II型干扰素，其在激活巨噬细胞和其他免疫细胞中起作用。IL-18也能诱导严重炎症反应。
因此，在一些实施方式中，工程化细菌被工程化以产生IL-18。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-18的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达IL-18，例如，与强启动子可操作地连接和/或包含一个以上IL-18基因序列的拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两个或更多个IL-18基因拷贝的序列，例如，IL-18基因的两个，三个，四个，五个，六个或更多个拷贝。。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-18和/或表达分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-18和/或表达分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达IL-18和/或分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达IL-18和/或表达分泌肽。
白细胞介素-2(IL-2)是细胞因子调节的活动的白血细胞(白细胞，经常淋巴细胞)。IL-2是人体对微生物的自然反应的一部分感染，区分外国(“非自我”)和“自我”。IL-2通过与淋巴细胞表达的IL-2受体结合来介导其作用。IL-2是细胞因子家族的成员，其还包括IL-4，IL-7，IL-9，IL-15和IL-21。IL-2通过IL-2受体发出信号，IL-2受体是由α，β和γ亚单位组成的复合物。γ亚基由该细胞因子受体家族的所有成员共享。当初始T细胞被抗原刺激时，IL-2促进T细胞分化为效应T细胞并进入记忆T细胞。通过其在T细胞免疫记忆发展中的作用，其取决于抗原选择的T细胞克隆的数量和功能的扩展，它还在细胞介导的免疫中起关键作用。IL-2已经被美国食品药品管理局(FDA)和几个欧洲国家批准用于治疗癌症(恶性黑素瘤，肾细胞癌)。IL-2也用于治疗黑素瘤转移，并具有高完全反应率。
因此，在一些实施方式中，工程化细菌被工程化以产生IL-2。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-2的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达IL-2，例如，与强启动子可操作地连接和/或包含一个以上IL-2基因序列的拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两个或更多个IL-2基因拷贝的序列，例如，IL-2基因的两个，三个，四个，五个，六个或更多个拷贝。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-2和/或表达分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-2和/或表达分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达IL-2和/或分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达IL-2和/或表达分泌肽。
白细胞介素-21是一种细胞因子，对免疫系统的某些细胞具有强大的调节作用，包括自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞。IL-21诱导细胞分裂/增殖在这些细胞中。IL-21在激活的人中表达CD4+T细胞，但在大多数其他组织中没有。此外，IL-21表达在T辅助细胞的Th2和Th17亚群中上调。IL-21也表达于NKT细胞调节这些细胞的功能。当与IL-21结合时，IL-21受体通过Jak/STAT途径起作用，利用Jak1和Jak3以及STAT3同型二聚体激活其靶基因。已经显示IL-21通过富集具有IL-2产生能力的独特CD28+CD127hiCD45RO+表型的记忆型CTL群来调节人T细胞的分化程序。IL-21还通过持续和增加的CD8+细胞应答具有抗肿瘤作用，以实现持久的肿瘤免疫。IL-21已被批准用于转移性的1期临床试验黑素瘤(MM)和肾细胞癌(RCC)患者。
因此，在一些实施方式中，工程化细菌被工程化以产生IL-21。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-21的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达IL-21，例如，与强启动子可操作地连接和/或包含一个以上IL-21基因序列的拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两个或更多个IL-21拷贝的序列，例如，IL-21基因的两个，三个，四个，五个，六个或更多个拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌产生一种或多种刺激IL-21产生的免疫调节剂。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-21的序列和编码用于分泌IL-21的分泌肽的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-21和/或表达分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达II-21，和/或表达分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达IL-21和/或分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达IL-21和/或表达分泌肽。
肿瘤坏死因子(TNF)(也称为cachectin或TNFα)是一种可引起细胞溶解的细胞因子在某些条件下，某些肿瘤细胞系可刺激细胞增殖并诱导细胞分化。TNF参与系统性疾病炎症是构成急性期反应的细胞因子之一。它主要是通过激活产生的巨噬细胞虽然可以由许多其他细胞类型产生，例如CD4+淋巴细胞，NK细胞，中性粒细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞和神经元。TNF的主要作用是调节免疫细胞。
TNF可以结合两种受体，TNFR1(TNF受体1型；CD120a；p55/60)和TNFR2(TNF受体2型；CD120b；p75/80)。TNFR1在大多数组织中表达，并且可以被膜结合的和可溶的三聚体形式的TNF完全激活，而TNFR2仅在免疫系统的细胞中发现，并且对TNF同源三聚体的膜结合形式起反应。在与其受体结合后，TNF可以激活NF-κB和MAPK途径，其介导许多蛋白质的转录并介导参与细胞分化和增殖的几种途径，包括涉及炎症反应的那些途径。TNF还调节诱导细胞凋亡的途径。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生调节树突细胞激活的免疫调节剂。在一些实施方式中，免疫调节剂是TNF。因此，在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以产生TNF。在一些实施方式中，TNF分泌自如本文所述的细菌。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码TNF的序列。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或90％至100％的TNF。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生的TNF比TNF产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，TNF的三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生TNF的细菌分泌至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多两倍更多的TNF。在另一个实施方式中，基因工程化细菌分泌TNF至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌分泌三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多TNF。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌TNF的细菌能够使细胞增殖减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌TNF的细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌TNF的细菌能够将肿瘤大小减小至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生TNF的细菌能够将肿瘤体积减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一个实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤体积减少约40-60％，例如，在两剂量治疗方案的第7天减少约45-55％。在一个实施方式中，在施用表达TNF的细菌时肿瘤体积为约300mm3，相对于在相同条件下施用相同亚型的未修饰细菌约600mm3。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生TNF的细菌能够将肿瘤重量减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生TNF的细菌能够将应答率提高至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生TNF的细菌能够增加树突细胞和/或巨噬细胞上的CCR7表达。
在一些实施方式中，包含编码TNFα用于分泌的一种或多种基因的基因工程化细菌能够激活NFkappaB途径，例如在具有TNF受体的细胞中。在一些实施方式中，包含一种或多种编码TNFα的基因的基因工程化细菌能够诱导IkappaBalpha降解。在一些实施方式中，从工程化细菌分泌的分泌的TNFα水平导致IkappaBalpha降解至与相同浓度下相同浓度的重组TNFα相同的程度。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖、cumate和水杨酸和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述IL-2、IL-15、IL-12、IL-7、IL-21、IL-18、TNF和IFN-γ回路。在一些实施方式中，可以在体内施用此类诱导剂，以诱导效应基因表达。在一些实施方式中，编码IL-2、IL-15、IL-12、IL-7、IL-21、IL-18、TNF和IFN-γ的一种或多种基因序列被可以由此类条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，编码IL-2、IL-15、IL-12、IL-7、IL-21、IL-18、TNF和IFN-γ的一种或多种基因序列被如本文所述的组成型启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被组成型启动子控制，并且在体内条件和/或在体外条件下表达，例如在如本文所述的扩增、产生和/或生产过程中。在一些实施方式中，编码IL-2、IL-15、IL-12、IL-7、IL-21、IL-18、TNF和/或IFN-γ的任何一种或多种所述的基因序列存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或者整合至微生物染色体的一个或多个位点中。
在任何这些实施方式中，包含编码IL-2、IL-15、IL-12、IL-7、IL-21、IL-18、TNF和/或IFN-γ的一种或多种基因序列的基因工程化细菌还包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码IL-2、IL-15、IL-12、IL-7、IL-21、IL-18、TNF和/或IFN-γ的回路可以与编码本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。
在任何这些实施方式中，在相同或不同菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码IL-2、IL-15、IL-12、IL-7、IL-21、IL-18、TNF和/或IFN-γ的一种或多种基因序列可以与编码如本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码IL-2、IL-15、IL-12、IL-7、IL-21、IL-18、TNF和/或IFN-γ的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码IL-2、IL-15、IL-12、IL-7、IL-21、IL-18、TNF和/或IFN-γ的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。
在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物能够表达任何一种或多种所述IL-2、IL-15、IL-12、IL-7、IL-21、IL-18、TNF和/或IFN-γ回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
共刺激分子
糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)相关受体(GITR，TNFR18)是I型跨膜蛋白，是TNFR超家族的成员。1GITR主要在CD25+CD4+调节性T(Treg)细胞上高水平表达，但在常规CD25-CD4+和CD8+ T细胞上也以低水平组成型表达，并在激活后迅速上调。使用激动性抗GITR单克隆抗体(mAb；DTA-1)2,6,7或GITRL转染子和可溶性GITRL5,8,9进行的体外研究表明，GITR–GITRL途径诱导阳性共刺激信号，导致激活CD4+和CD8+效应T细胞(以及Treg细胞，尽管其具有相反的效应功能)(Piao等，(2009)Enhancement of T-cell-mediatedanti-tumour immunity via the ectopically expressed glucocorticoid-inducedtumour necrosis factor receptor-related receptor ligand(GITRL)on tumours；Immunology,127,489–499，以及其中的参考文献)。在一些实施方式中，效应物或免疫调节剂是GITR的激动剂，例如选自下述的激动剂：激动性抗-GITR抗体、激动性抗-GITR抗体片段、GITR配体多肽(GITRL)和GITRL多肽片段。因而，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码激动性抗-GITR抗体或其片段，或者GITR配体多肽或其片段的一种或多种序列。因而，在一些实施方式中，对工程化细菌进行工程化改造以生产激动性抗-GITR抗体或其片段，或者GITR配体多肽或其片段。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗-GITR抗体或其片段，或者GITR配体多肽或其片段的序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗-GITR抗体或其片段，或者GITR配体多肽或其片段的一种或多种序列，以及编码用于分泌所述抗体和多肽的一种或多种分泌肽的序列。分泌标签和适宜分泌机制的非限制性实例如本文所述。在一些实施方式中，抗体或配体展示在表面上。用于细菌表面展示的适宜技术如本文所述。
由于GITR的功能是在激活的T细胞中促进T细胞增殖和T细胞存活，因而GITR激动作用可以有利地与能够引发T细胞应答的第二种方式(免疫引发剂)结合使用，包括但不限于如本文所述的表达固有免疫刺激剂(如STING激动剂)的基因工程化细菌。
因此，在一个非限制性实例中，表达一种或多种用于生产STING激动剂的酶的一种或多种基因工程化细菌(例如，如本文所述的)与激动性抗-GITR抗体联用。在另一个非限制性实例中，将表达一种或多种用于生产STING激动剂的酶的一种或多种基因工程化细菌(例如，如本文所述的)与如本文所述的激动性抗-GITR抗体联合施用。
CD137或4-1BB是属于TNF超家族的2型跨膜糖蛋白，其表达并对激活的T淋巴细胞(例如，CD8+和CD4+细胞)具有共刺激活性。已显示它增强T细胞增殖，IL-2分泌存活和细胞溶解活性。在一些实施方式中，免疫调节剂是CD137(4-1BB)的激动剂，例如，选自激动性抗-CD137抗体或其片段，或者CD137配体多肽或其片段的激动剂。因而，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码激动性抗-CD137抗体或其片段，或者CD137配体多肽或其片段的一种或多种序列。因而，在一些实施方式中，对工程化细菌进行工程化改造以生产激动性抗-CD137抗体或其片段，或者CD137配体多肽或其片段。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗-CD137抗体或其片段，或者CD137配体多肽或其片段的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达激动性抗-CD137抗体或其片段，或者CD137配体多肽或其片段,和/或表达一种或多种分泌肽。适宜分泌标签和适宜分泌机制的非限制性实例如本文所述。在一些实施方式中，抗体或配体展示在表面上。用于细菌表面展示的适宜技术如本文所述。
在激活的小鼠和人CD8+和CD4+ T细胞上表达CD137(4–1BB)。7其是TNFR家族的成员，介导共刺激和抗凋亡功能，促进T细胞增殖和T细胞存活。10,11据报道，取决于T细胞刺激情况，CD137在刺激后12小时到5天上调(Wolfl等，Activation-induced expression ofCD137 permits detection,isolation,and expansion of the full repertoire of CD8T cells responding to antigen without requiring knowledge of epitopespecificities；BLOOD,2007年7月1日，第110卷，第1期，以及其中的参考文献)。因此，CD137(4-1BB)激动作用可以有利地与能够引发T细胞应答的第二种方式(免疫引发剂)结合使用，包括但不限于表达固有免疫刺激剂(免疫引发剂)的基因工程化细菌。表达固有免疫刺激剂(免疫引发剂)的示例性细菌如本文所述。
因此，在一个非限制性实例中，表达一种或多种用于生产STING激动剂的酶的一种或多种基因工程化细菌(例如，如本文所述的)与激动性抗-41BB(CD137)抗体联用。在另一个非限制性实例中，将表达一种或多种用于生产STING激动剂的酶的一种或多种基因工程化细菌(例如，如本文所述的)与如本文所述的激动性抗-41BB(CD137)抗体联合施用。
OX40或CD134是T细胞受体，参与保持T细胞的存活并随后增加细胞因子的产生。OX40由于其提高存活率的能力，在维持免疫应答和记忆应答方面发挥着关键作用。其还在Th1和Th2介导的反应中起重要作用。在一些实施方式中，免疫调节剂是OX40的激动剂，例如，选自激动性抗-OX40抗体或其片段，或者OX40配体(OX40L)或其片段的激动剂。因而，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码激动性抗-OX40抗体或其片段，或者OX40配体或其片段的一种或多种序列。因而，在一些实施方式中，对工程化细菌进行工程化改造以生产激动性抗-OX40抗体或其片段，或者OX40配体或其片段。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗-OX40抗体或其片段，或者OX40配体或其片段的序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗-OX40抗体或其片段，或者OX40配体或其片段的一种或多种序列，以及编码用于分泌所述抗体和多肽的一种或多种分泌肽的序列。适宜分泌标签和适宜分泌机制的非限制性实例如本文所述。在一些实施方式中，抗体或配体展示在表面上。用于细菌表面展示的适宜技术如本文所述。
最近，发现未甲基化的富含CG的寡聚脱氧核苷酸(CpG)(Toll样受体9(TLR9)的配体)与局部注射到肿瘤一个部位的抗OX40抗体的组合可协同触发局部T细胞免疫应答，从而然后攻击全身在远端部位的癌症(Sagiv-Barfi等，Eradication of spontaneousmalignancy by local immunotherapy；Sci.Transl.Med.10,eaan4488(2018))。未甲基化的富含CG的寡聚脱氧核苷酸(CpG)激活TLR9，固有免疫系统的一种成分。因此，激活免疫系统的其他机制与激动性OX40抗体联用可以产生相似的结果，其包括但不限于表达固有免疫刺激剂(免疫引发剂)的基因工程化细菌。表达固有免疫刺激剂(免疫引发剂)的示例性细菌如本文所述。
因此，在一个非限制性实例中，表达一种或多种用于生产STING激动剂的酶的一种或多种基因工程化细菌(例如，如本文所述的)与激动性OX40抗体联用。在另一个非限制性实例中，将表达一种或多种用于生产STING激动剂的酶的一种或多种基因工程化细菌(例如，如本文所述的)与如本文所述的OX40抗体联合施用。
CD28是一种在T细胞上表达的蛋白，其提供T细胞激活和存活所需的共刺激信号。在一些实施方式中，免疫调节剂是CD28的激动剂，例如，选自激动性抗-CD28抗体、激动性抗-CD28抗体片段、CD80(B7.1)多肽或其多肽片段以及CD86(B7.2)多肽或其多肽片段的激动剂。因而，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码激动性抗-CD28抗体或其片段，或者CD80多肽或其片段，或者CD86多肽或其片段的一种或多种序列。在一些实施方式中，对工程化细菌进行工程化改造以生产激动性抗-CD28抗体或其片段，或者CD80多肽或其片段，或者CD86多肽或其片段在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗-CD28抗体或其片段，或者CD80多肽或其片段，或者CD86多肽或其片段的序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗-CD28抗体或其片段，或者CD80多肽或其片段，或者CD86多肽或其片段的一种或多种序列，以及编码用于分泌所述抗体和多肽的一种或多种分泌肽的序列。适宜分泌标签和适宜分泌机制的非限制性实例如本文所述。在一些实施方式中，抗体或配体展示在表面上。用于细菌表面展示的适宜技术如本文所述。
ICOS是结构和功能上与CD28相关的诱导型T细胞共刺激剂。在一些实施方式中，免疫调节剂是ICOS的激动剂，例如，选自激动性抗-ICOS抗体或其片段或者ICOS配体多肽或其片段的激动剂。因而，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码激动性抗-ICOS抗体或其片段，或ICOS配体多肽或其片段的一种或多种序列。因而，在一些实施方式中，对工程化细菌进行工程化改造以生产激动性抗-ICOS抗体或其片段，或者ICOS配体多肽或其片段。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗-ICOS抗体或其片段，或者ICOS配体多肽或其片段的序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗-ICOS抗体或其片段，或者ICOS配体多肽或其片段的一种或多种序列，以及编码用于分泌所述抗体和多肽的一种或多种分泌肽的序列。适宜分泌标签和适宜分泌机制的非限制性实例如本文所述。在一些实施方式中，抗体或配体展示在表面上。用于细菌表面展示的适宜技术如本文所述。
CD226是在天然杀伤细胞、血小板、单核细胞和T细胞子集(例如，CD8+和CD4+细胞)的表面上表达的糖蛋白，其介导细胞与携带其配体CD112和CD155的其他细胞的粘附。除了其他以外，其参与免疫突触形成和触发自然杀伤(NK)细胞激活。在一些实施方式中，免疫调节剂是CD226的激动剂，例如，选自激动性抗-CD226抗体或其片段，CD112或CD155多肽或其片段的激动剂。因而，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码选自激动性抗-CD226抗体或其片段，CD112或CD155多肽或其片段的激动剂的一种或多种序列。因而，在一些实施方式中，对工程化细菌进行工程化改造以生产选自激动性抗-CD226抗体或其片段，CD112或CD155多肽或其片段的激动剂。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码选自激动性抗-CD226抗体或其片段，CD112或CD155多肽或其片段的激动剂的序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码选自激动性抗-CD226抗体或其片段，CD112或CD155多肽或其片段的激动剂的一种或多种序列，以及编码用于分泌所述抗体和多肽的一种或多种分泌肽的序列。适宜分泌标签和适宜分泌机制的非限制性实例如本文所述。在一些实施方式中，抗体或配体展示在表面上。用于细菌表面展示的适宜技术如本文所述。
在任何这些实施方式中，激动性抗体可以是人抗体或人源化抗体，并且可以包含不同的同种型，例如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。此外，抗体可以包含恒定区，其被修饰以增加或降低效应物功能，例如FcR结合，FcRn结合，补体功能，糖基化，C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)。在任何这些实施方式中，抗体可以是单链抗体或单链抗体片段。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在存在癌症和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢产物的情况下，和/或在存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下，和/或在存在肠道中可能存在的代谢产物的情况下，和/或在存在可能存在或不存在于体内，并且可能存在于体外菌株培养、扩增、产生和/或生产过程中的代谢产物(如阿拉伯糖、cumate和水杨酸以及本文所述的其他物质)的情况下，表达任何一种或多种所述的激动性抗-GITR抗体/GITR配体、抗-CD137/CD137配体、抗-OX40抗体/OX40配体、抗-CD28抗体/CD80或CD86多肽、抗-ICOS抗体/ICOS配体、抗-CD226抗体/CD112和/或CD155回路。在一些实施方式中，可以在体内施用此类诱导剂以诱导效应基因表达。在一些实施方式中，编码激动性抗-GITR抗体/GITR配体、抗-CD137/CD137配体、抗-OX40抗体/OX40配体、抗-CD28抗体/CD80或CD86多肽、抗-ICOS抗体/ICOS配体、抗-CD226抗体/CD112和/或CD155多肽的一种或多种基因序列被可以由此类条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，编码激动性抗-GITR抗体/GITR配体、抗-CD137/CD137配体、抗-OX40抗体/OX40配体、抗-CD28抗体/CD80或CD86多肽、抗-ICOS抗体/ICOS配体、抗-CD226抗体/CD112和/或CD155多肽的一种或多种基因序列被如本文所述的组成型启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被组成型启动子控制，并且在体内条件下和/或体外条件下表达，例如，在如本文所述的扩增、产生和/或生产过程中。在一些实施方式中，编码激动性抗-GITR抗体/GITR配体、抗-CD137/CD137配体、抗-OX40抗体/OX40配体、抗-CD28抗体/CD80或CD86多肽、抗-ICOS抗体/ICOS配体、抗-CD226抗体/CD112和/或CD155多肽的任何一种或多种所述的基因序列存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合至微生物染色体的一个或多个位点中。
在任何这些实施方式中，包含编码激动性抗-GITR抗体/GITR配体、抗-CD137/CD137配体、抗-OX40抗体/OX40配体、抗-CD28抗体/CD80或CD86多肽、抗-ICOS抗体/ICOS配体、抗-CD226抗体/CD112和/或CD155多肽的一种或多种基因序列的基因工程化细菌还包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码激动性抗-GITR抗体/GITR配体、抗-CD137/CD137配体、抗-OX40抗体/OX40配体、抗-CD28抗体/CD80或CD86多肽、抗-ICOS抗体/ICOS配体、抗-CD226抗体/CD112和/或CD155多肽的回路可以与编码如本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。
在任何这些实施方式中，在相同或不同菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码激动性抗-GITR抗体/GITR配体、抗-CD137/CD137配体、抗-OX40抗体/OX40配体、抗-CD28抗体/CD80或CD86多肽、抗-ICOS抗体/ICOS配体、抗-CD226抗体/CD112和/或CD155多肽的一种或多种基因序列可以与编码如本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码激动性抗-GITR抗体/GITR配体、抗-CD137/CD137配体、抗-OX40抗体/OX40配体、抗-CD28抗体/CD80或CD86多肽、抗-ICOS抗体/ICOS配体、抗-CD226抗体/CD112和/或CD155多肽的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码激动性抗-GITR抗体/GITR配体、抗-CD137/CD137配体、抗-OX40抗体/OX40配体、抗-CD28抗体/CD80或CD86多肽、抗-ICOS抗体/ICOS配体、抗-CD226抗体/CD112和/或CD155多肽的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因序列整合至染色体中。
在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
而且，在一些实施方式中，基因工程化微生物能够表达编码激动性抗-GITR抗体/GITR配体、抗-CD137/CD137配体、抗-OX40抗体/OX40配体、抗-CD28抗体/CD80或CD86多肽、抗-ICOS抗体/ICOS配体、抗-CD226抗体/CD112和/或CD155多肽的任意一种或多种所述回路，并且还包含下述中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，如本领域公知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀伤开关回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何杀伤开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的任何表面展示回路，(7)用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢产物(例如，犬尿氨酸、色氨酸、腺苷、精氨酸)的一种或多种回路，(8)一种或多种此类其他回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或者与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂联用，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
消除(逆转)局部免疫抑制
肿瘤细胞通常通过产生干扰树突状细胞的抗原提呈或成熟的信号来逃避破坏，从而导致它们的前体成熟为免疫抑制细胞类型。因此，一种或多种免疫调节剂的局部递送，其预防或抑制免疫调节分子的活性，所述免疫调节分子参与在肿瘤部位引发、促进和/或维持免疫抑制，单独或与一种或多种其他免疫调节剂组合，提供治疗益处。
免疫检查点抑制剂
在一些实施方式中，免疫调节剂是免疫抑制分子的抑制剂，例如免疫检查点分子的抑制剂。待抑制的免疫检查点分子可以是任何已知的或后来发现的免疫检查点分子或其他免疫抑制分子。在一些实施方式中，待抑制的免疫检查点分子或其他免疫抑制分子选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、VISTA、LAG-3、TIM1、TIM3、CEACAM1、LAIR-1、HVEM、BTLA、CD160、CD200、CD200R、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、IDO、TDO、KIR和A2aR。在某些方面中，本公开内容提供了工程化微生物，例如工程化细菌，其被工程化以产生一种或多种抑制免疫检查点或其他免疫抑制分子的免疫调节剂。在一些实施方式中，基因工程化微生物能够减少癌细胞增殖，肿瘤生长和/或肿瘤体积。在一些实施方式中，基因工程化细菌是已经被工程化以靶向癌症或肿瘤细胞的细菌。在一些实施方式中，基因工程化微生物是表达免疫检查点抑制剂或另一种免疫抑制剂分子的抑制剂的细菌，其在由低氧条件(例如，肿瘤的低氧环境)激活的启动子的控制下。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子的控制下表达一种或多种免疫检查点抑制剂，例如由所述条件激活并在本文中描述的任何启动子。
在一些实施方式中，本公开的基因工程化微生物是基因工程化细菌，其包含编码CTLA-4抑制剂的基因，例如针对CTLA-4的抗体。在任何这些实施方式中，抗-CTLA-4抗体可以是单链抗-CTLA-4抗体。在一些实施方式中，本公开的基因工程化微生物是基因工程化细菌，其包含编码PD-1抑制剂的基因，例如针对PD-1或PD-L1的抗体。在任何这些实施方式中，抗PD-1抗体可以是单链抗PD-1抗体。在一些实施方式中，本公开的基因工程化微生物是包含编码选自下述的抑制剂的基因的工程化细菌：CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、VISTA、LAG-3、TIM1、TIM3、CEACAM1、LAIR-1、HVEM、BTLA、CD160、CD200、CD200R、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、IDO、TDO、KIR和A2aR抑制剂，例如针对任何所列的免疫检查点或其他抑制分子的抗体。例如，在2017年01月11日提交的国际专利申请号PCT/US2017/013072(公开号为WO2017/123675)和2018年01月01日提交的PCT/US2018/012698中描述了此类检查点抑制剂分子的实例，其每一个的全部内容均通过引用并入本申请。在任何这些实施方式中，抗体可以是单链抗体。在一些实施方式中，表达检查点抑制剂或另一种免疫抑制剂分子的抑制剂的工程化细菌局部施用，例如通过肿瘤内注射。
在一些实施方式中，本公开提供了表达CTLA-4抑制剂的基因工程化微生物，例如工程化细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在启动子的控制下表达CTLA-4抑制剂，所述启动子由低氧条件(例如肿瘤的缺氧环境)激活。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达抗-CTLA-4抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗-CTLA-4抗体(例如单链抗体)的细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗-CTLA-4抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗-CTLA-4抗体(例如单链抗体)的细菌。
在一些实施方式中，基因工程化微生物是表达PD-1抑制剂的细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在启动子的控制下表达PD-1抑制剂，所述启动子由低氧条件(例如肿瘤的缺氧环境)激活。在一些实施方式中，基因工程化微生物是在启动子的控制下表达PD-1抑制剂的细菌，所述启动子由低氧条件(例如肿瘤的缺氧环境)激活。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达抗-PD-1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗-PD-1抗体(例如，单链抗体)的细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在启动子的控制下表达抗-PD-1抗体(例如，单链抗体)，所述启动子由低氧条件激活。在一些实施方式中，基因工程化细菌是在启动子的控制下表达抗-PD-1抗体(例如，单链抗体)的细菌，所述启动子由低氧条件激活。
在一些实施方式中，编码scFv构建体(例如，PD1-scFv)的核酸包含序列，所述序列与选自SEQ ID NO:975、SEQ ID NO:976、SEQ ID NO:977、SEQ ID NO:978、SEQ ID NO:979和/或SEQ ID NO:980的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同一性。在一些实施方式中，编码scFv构建体(例如，PD1-scFv)的核酸包含序列，所述序列选自SEQ ID NO:975、SEQ ID NO:976、SEQ ID NO:977、SEQ ID NO:978、SEQ ID NO:979和/或SEQ ID NO:980。在一些实施方式中，编码scFv构建体(例如，PD1-scFv)的核酸由选自下组的序列组成：SEQ ID NO:975、SEQ ID NO:976、SEQ ID NO:977、SEQ ID NO:978、SEQ ID NO:979和/或SEQ ID NO:980。
在一些实施方式中，基因工程化细菌表达PD-L1抑制剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达抗PD-L1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗PD-L1抗体的细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗PD-L1抗体的细菌，例如在由低氧条件激活的启动子控制下。
在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达PD-L2抑制剂的细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗PD-L2抗体(例如，单链抗体)的细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗PD-L2抗体(例如，单链抗体)的细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗PD-L2抗体的细菌，例如在由低氧条件激活的启动子控制下的单链抗体。
用于构建单链抗-CTLA-4抗体的示例性重链和轻链氨基酸序列如本文所述(例如，SEQ ID NO:761、SEQ ID NO:762、SEQ ID NO:763、SEQ ID NO:764)。
用于构建单链抗-PD-1抗体的示例性重链和轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4。
在一些实施方式中，所述序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同源。用于构建单链抗体的其他示例性重链和轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:5-46。
在一些实施方式中，单链抗体与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46所示的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同源性。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的核酸序列，其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的DNA序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同源。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在存在癌症和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢产物的情况下，和/或在存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下，和/或在存在肠道中可能存在的代谢产物的情况下，和/或在存在可能存在或不存在于体内，并且可能存在于体外菌株培养、扩增、产生和/或生产过程中的代谢产物(如阿拉伯糖、cumate和水杨酸以及本文所述的其他物质)的情况下，表达所述CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、VISTA、LAG-3、TIM1、TIM3、CEACAM1、LAIR-1、HVEM、BTLA、CD160、CD200、CD200R、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、IDO、TDO、KIR和A2aR回路的任意一种或多种。在一些实施方式中，可以在体内施用此类诱导剂，以诱导效应基因表达。在一些实施方式中，编码CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、VISTA、LAG-3、TIM1、TIM3、CEACAM1、LAIR-1、HVEM、BTLA、CD160、CD200、CD200R、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、IDO、TDO、KIR和A2aR的一种或多种基因被可以由此类条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，编码CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、VISTA、LAG-3、TIM1、TIM3、CEACAM1、LAIR-1、HVEM、BTLA、CD160、CD200、CD200R、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、IDO、TDO、KIR和A2aR的一种或多种基因序列被如本文所述的组成型启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在如本文所述的扩增、产生和/或生产过程中。在一些实施方式中，编码CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、VISTA、LAG-3、TIM1、TIM3、CEACAM1、LAIR-1、HVEM、BTLA、CD160、CD200、CD200R、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、IDO、TDO、KIR和A2aR的任何一种或多种所述的基因存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或整合至微生物染色体的一个或多个位点中。
在任何这些实施方式中，包含编码CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、VISTA、LAG-3、TIM1、TIM3、CEACAM1、LAIR-1、HVEM、BTLA、CD160、CD200、CD200R、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、IDO、TDO、KIR和A2aR的一种或多种基因序列的基因工程化细菌还包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、VISTA、LAG-3、TIM1、TIM3、CEACAM1、LAIR-1、HVEM、BTLA、CD160、CD200、CD200R、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、IDO、TDO、KIR和A2aR的回路可以与编码如本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在组成型或诱导型启动子控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。
在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、VISTA、LAG-3、TIM1、TIM3、CEACAM1、LAIR-1、HVEM、BTLA、CD160、CD200、CD200R、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、IDO、TDO、KIR和A2aR的一种或多种基因序列与编码如本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列联用。在一些实施方式中，与编码CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、VISTA、LAG-3、TIM1、TIM3、CEACAM1、LAIR-1、HVEM、BTLA、CD160、CD200、CD200R、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、IDO、TDO、KIR和A2aR的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、VISTA、LAG-3、TIM1、TIM3、CEACAM1、LAIR-1、HVEM、BTLA、CD160、CD200、CD200R、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、IDO、TDO、KIR和A2aR的一种或多种序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。
在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
而且，在一些实施方式中，基因工程化微生物能够表达编码CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、VISTA、LAG-3、TIM1、TIM3、CEACAM1、LAIR-1、HVEM、BTLA、CD160、CD200、CD200R、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、IDO、TDO、KIR和A2aR的任意一种或多种所述回路，以及还包含下述中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，如本领域公知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀伤开关回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何杀伤开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的任何表面展示回路，(7)用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢产物(例如，犬尿氨酸、色氨酸、腺苷、精氨酸)的一种或多种回路，(8)一种或多种此类其他回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂联用，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
免疫代谢和新陈代谢转化剂
色氨酸和犬尿氨酸
T调节细胞或Treg是T细胞的亚群，其通过防止过度免疫反应，维持对自身抗原的耐受性和消除自身免疫来调节免疫系统。Treg抑制其他细胞的免疫应答，例如，在成功消除入侵生物后关闭免疫应答。这些细胞通常抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖。存在不同的调节性T细胞亚群，包括表达CD4、CD25、和Foxp3的那些亚群(CD4+CD25+调节性T细胞)。Tregs是抑制效应T细胞应答的关键，因此代表了有效抗肿瘤应答的主要障碍之一，以及依赖于抗肿瘤应答的诱导或增强的现有疗法的失败。因而，在某些实施方式中，本公开的基因工程化细菌产生一种或多种消除Treg和/或抑制或阻断Treg激活的免疫调节剂。
色氨酸(TRP)至犬尿氨酸(KYN)代谢途径被确立为固有和适应性免疫的关键调节因子。通过吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)和TRP-2,3-双加氧酶2(TDO)降解必需氨基酸色氨酸，以及产生芳烃受体(AHR)激活色氨酸代谢产物(如犬尿氨酸)，是在许多类型的癌症中维持免疫抑制微环境的主要途径。例如，犬尿氨酸与AHR的结合导致重编程幼稚CD4+T-辅助(Th)细胞的分化，其有利于调节性T细胞表型(Treg)，同时抑制分化为产生白介素17(IL-17)的Th(Th17)细胞。芳基氢受体的激活还导致在树突细胞上促进耐受性表型。
在一些实施方式中，本公开的基因工程化微生物(例如，基因工程化细菌)能够通过产生色氨酸和/或降解犬尿氨酸耗竭Treg或者抑制或阻断Treg激活。在一些实施方式中，本公开的基因工程化微生物能够通过产生色氨酸和/或降解犬尿氨酸增加CD8+:Treg之比率(例如，比起Treg更偏好于产生CD8+)。
增加色氨酸
在一些实施方式中，本公开的基因工程化微生物能够产生色氨酸。在一些实施方式中，产生色氨酸的基因工程化细菌和/或其他微生物包含编码色氨酸生物合成途径的一种或多种酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自B.subtilis或E.coli.的trpE、trpD、trpC、trpF、trpB和trpA基因的一种或多种序列，以及任选地包含产生色氨酸前体分支酸的一种或多种基因序列，例如编码aroG、aroF、aroH、aroB、aroD、aroE、aroK和AroC的一种或多种序列，以及任选地野生型或反馈抗性SerA基因。任选地，AroG和TrpE被反馈抗性形式替代。在任何这些实施方式中，任选地可以缺失、突变或修饰色氨酸阻遏物(trpR)，以减少或消除其阻遏物功能。在任何这些实施方式中，tnaA基因(编码将Trp转化为吲哚的色氨酸酶)任选地可以缺失。例如，在2017年01月11日提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开号为WO2017/123675)和2018年01月01日提交的PCT/US2018/012698中描述了此类检查点抑制剂分子的实例，其每一个的全部内容均通过引用并入本文。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够在低氧条件下，和/或在存在癌症和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢产物的情况下，和/或在存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下，和/或在存在肠道中可能存在的代谢产物的情况下，和/或在存在可能存在或不存在于体内，并且可能存在于体外菌株培养、扩增、产生和/或生产过程中的代谢产物(如阿拉伯糖、cumate和水杨酸以及本文所述的其他物质)的情况下，表达所述回路的任意一种或多种。在一些实施方式中，可以在体内施用此类诱导剂，以诱导效应基因的表达。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被可以由此类条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被如本文所述的组成型启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在如本文所述的细菌扩增、产生和/或生产过程中。
在一些实施方式中，任何一种或多种所述回路存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或者整合至细菌染色体的一个或多个位点中。而且，在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物还能够表达任意一种或多种所述回路，以及还包含下述中的一种或多种：(1)一种或多种引发剂回路，包括但不限于如本文所述的用于生产STING激动剂的一种或多种酶，(2)如本文所述的，一种或多种维持剂回路，(3)一种或多种营养缺陷型，如本领域公知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀伤开关回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，如本文所述的或以其他方式本领域公知的，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的，和(7)用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢产物(新陈代谢转化)(例如，犬尿氨酸、色氨酸、腺苷、精氨酸)的一种或多种回路，和(8)一种或多种此类其他回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂联用，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1和/或抗-PD-L1抗体。
减少犬尿氨酸
在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物包含用于代谢或降解犬尿氨酸并降低细胞外环境中的犬尿氨酸水平的机制。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物包含编码犬尿氨酸酶的一种或多种基因序列。
在一个实施方式中，基因工程化微生物编码用于表达来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的基因序列，其将犬尿氨酸转化为AA(蒽环酸)，然后其可通过大肠杆菌trp操纵子的酶转化为色氨酸。任选地，可以缺失trpE基因，因为从犬尿氨酸生成色氨酸不需要它。因此，在一个实施方式中，基因工程化细菌可包含编码trpD、trpC、trpA和trpD和犬尿氨酸酶的一种或多种基因或基因盒。该缺失可以阻止通过内源性分支酸途径产生色氨酸，并且可以通过犬尿氨酸酶增加从犬尿氨酸产生色氨酸。
在替代性实施方式中，trpE基因不被缺失，以通过使用犬尿氨酸和分支酸作为底物来最大化色氨酸的产生。在本发明的一个实施方式中，包含该回路的基因工程化细菌和/或其他微生物可用于减少癌症中的免疫逃逸。
在一些实施方式中，微生物编码用于从细胞外环境(例如，肿瘤环境)摄取犬尿氨酸的转运蛋白。位于鼠伤寒沙门氏菌chr和trp操纵子之间的AroT，以及大肠杆菌trp基因座附近的类似基因aroR和aroS被发现参与芳香族氨基酸的转运。AroP是一种通透酶，参与跨越芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)的细胞质膜的转运。这些转运蛋白/通透酶的表达可用于基因工程化微生物中的犬尿氨酸输入。
本公开的基因工程化细菌编码的编码犬尿氨酸酶的示例性基因在某些实施方式中包括SEQ ID NO:65-67。
在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67中的一种或多种具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67中的一种或多种具有至少约85％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67中的一种或多种具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67中的一种或多种具有至少约95％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQ IDNO:65至SEQ ID NO:67中的一种或多种具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67中的一个或多个具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸和/或多肽包含SEQ ID NO:65至SEQ IDNO:67中的一个或多个的序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸和/或多肽由SEQID NO:65至SEQ ID NO:67中的一个或多个的序列组成。
示例性密码子优化的犬尿氨酸酶盒序列包括SEQ ID NO:68、865、69、866、70、867。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸与SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:865至SEQ ID NO:868中的一种或多种具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸与SEQ IDNO:68至SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:865至SEQ ID NO:868中的一种或多种具有至少约85％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸与SEQID NO:68至SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:865至SEQ ID NO:868中的一种或多种具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸与SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:865至SEQ ID NO:868中的一种或多种具有至少约95％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸与SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:865至SEQ ID NO:868中的一种或多种具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的一种或多种多核苷酸与SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:865至SEQ IDNO:868中的一个或多个具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸包含SEQ ID NO:68至SEQ IDNO:70和SEQ ID NO:865至SEQ ID NO:868中的一个或多个的序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸由SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:70和SEQID NO:865至SEQ ID NO:868中的一个或多个的序列组成。
在一些实施方式中，用于表达荧光假单胞菌犬尿氨酸酶的构建体与选自SEQ IDNO:116、SEQ ID NO:888、SEQ ID NO:889、SEQ ID NO:890、SEQ ID NO:891、SEQ ID NO:892和/或SEQ ID NO:893的序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同源。在一些实施方式中，用于表达荧光假单胞菌犬尿氨酸酶的构建体包含选自SEQID NO:116、SEQ ID NO:888、SEQ ID NO:889、SEQ ID NO:890、SEQ ID NO:891、SEQ ID NO:892和/或SEQ ID NO:893的序列。在一些实施方式中，用于表达荧光假单胞菌犬尿氨酸酶的构建体由选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:888、SEQ ID NO:889、SEQ ID NO:890、SEQ IDNO:891、SEQ ID NO:892，和/或SEQ ID NO:893的序列组成。其他合适的犬尿氨酸酶描述于美国专利公布20170056449中，其内容通过引用整体并入本文。
在任何这些实施方式中，经基因工程化以消耗犬尿氨酸并任选产生色氨酸的细菌在相同条件下比未修饰的相同细菌亚型的细菌消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％至45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的犬尿氨酸。在又一个实施方式中，基因工程细菌在相同条件下比未修饰的相同细菌亚型的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的犬尿氨酸。在又一个实施方式中，基因工程细菌在相同条件下比未修饰的相同细菌亚型的细菌消耗消耗约约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍，千倍或更多的犬尿氨酸。
在任何这些实施方式中，经基因工程化以消耗犬尿氨酸并任选产生色氨酸的细菌在相同条件下比未修饰的相同细菌亚型的细菌产生0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％至45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的色氨酸。在又一个实施方式中，基因工程细菌在相同条件下比未修饰的相同细菌亚型的细菌产生1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的色氨酸。在又一个实施方式中，基因工程细菌在相同条件下比未修饰的相同细菌亚型的细菌消耗产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍，千倍或更多的色氨酸。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌犬尿氨酸消耗率增加0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌的犬尿氨酸消耗率增加1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌的犬尿氨酸消耗率增加三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍。
在一个实施方式中，4小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌的犬尿氨酸消耗增加约80％至100％。在一个实施方式中，4小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌的犬尿氨酸消耗增加约90％至100％。在一个特定的实施方式中，4小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌的犬尿氨酸消耗增加约95％至100％。在一个特定的实施方式中，4小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌的犬尿氨酸消耗增加约99％至100％。在又一个实施方式中，4小时后，基因工程化细菌的犬尿氨酸消耗增加约10-50倍。在又一个实施方式中，4小时后，基因工程化细菌的犬尿氨酸消耗增加约50-100倍。在又一个实施方式中，4小时后，基因工程化细菌的犬尿氨酸消耗增加约100-500倍。在又一个实施方式中，4小时后，基因工程化细菌的犬尿氨酸消耗增加约500-1000倍。在又一个实施方式中，4小时后，基因工程化细菌的犬尿氨酸消耗增加约1000-5000倍。在又一个实施方式中，4小时后，基因工程化细菌的犬尿氨酸消耗增加约5000-10000倍。在又一个实施方式中，4小时后，基因工程化细菌的犬尿氨酸消耗增加约10000-1000倍。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使细胞增殖(例如，在肿瘤中)减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤尺寸缩小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤体积减小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤重量减小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。
在一些实施方式中，使用本文所述的分泌系统，犬尿氨酸酶分泌至胞外环境(例如，肿瘤环境)中。
在一些实施方式中，基因工程化细胞和/或其他微生物包含用于代谢或降解犬尿氨酸的机制，其在一些实施方式中也导致色氨酸的产生增加。在一些实施方式中，基因工程化细菌调节胞外环境中的TRP:KYN之比或KYN:TRP之比。在一些实施方式中，基因工程化细菌增加TRP:KYN之比或KYN:TRP之比。在一些实施方式中，基因工程化细菌降低TRP:KYN之比或KYN:TRP之比。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码酶犬尿氨酸酶的序列，以及本文所述的任何色氨酸产生回路。
基因工程化细菌和/或其他微生物可包含用于产生犬尿氨酸酶的任何合适的基因。在一些实施方式中，用于产生犬尿氨酸酶的基因被修饰和/或突变，例如，以增强稳定性，增加犬尿氨酸酶产生。在一些实施方式中，工程化细菌和/或其他微生物也具有增强的犬尿氨酸摄取或输入，例如，包含转运蛋白或其他机制，用于增加犬尿氨酸对细菌和/或其他微生物细胞的摄取。
在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在诱导条件下生产犬尿氨酸酶，例如在与免疫抑制和/或肿瘤微环境相关的一种或多种条件下。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件下，或者在存在与癌症、或某些组织、免疫抑制或炎症相关的某些分子或代谢产物的情况下，或者在存在可能存在或不存在于体内(例如，在肿瘤微环境中)，并且可能存在于体外菌株培养、扩增、产生和/或生产过程中的一些其他代谢产物(如阿拉伯糖、cumate和水杨酸)的情况下，生产犬尿氨酸酶。
在一些实施方式中，基因序列由可被这种条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，如本文所述，基因序列由组成型启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并在体内条件和/或体外条件下表达，例如在细菌和/或其他微生物扩增，生产和/或制造过程中，如本文所述。在一些实施方式中，所描述的回路中的任何一个或多个存在于一个或多个质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到细菌染色体中的一个或多个位点中。
在任何这些实施方式中，包含编码犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌)的一种或多种基因序列的基因工程化细菌还包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌)的回路可以与编码如本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何组成型或诱导型启动子。
在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，可以将犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌)的一种或多种基因序列与编码如本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌)的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌)的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述在内源性原噬菌体中的突变或缺失。任选地，细菌菌株还可以包含本文所述的色氨酸生产回路。
此外，在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)如本文所述，一种或多种引发剂回路，包括但不限于一种或多种用于产生STING激动剂的酶，(2)如本文所述的一种或多种维持剂回路，(3)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，如本文所述的或本领域已知的，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，如本文所述的或本领域已知的，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的和本领域已知，(6)一种或多种表面展示回路，如本文所述和本领域已知，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物(新陈代谢转化剂)的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4抗体，抗-PD1和/或抗-PD-L1抗体。
适应性实验室进化(ALE)
如本文所述通过引入来自荧光假单胞菌(kynU)的犬尿氨酸酶(KYNase)可以设计大肠杆菌Nissle以有效地导入KYN并将其转化为TRP。
大肠杆菌在其TRP生物合成途径中天然使用邻氨基苯甲酸。简而言之，TrpE(与TrpD复合)酶将分支酸转化为邻氨基苯甲酸。然后，TrpD、TrpC、TrpA和TrpB催化五步反应，以吲哚与丝氨酸缩合形成色氨酸而结束。通过λ-RED重组工程取代TrpE酶，随后的Nissle菌株(ΔtrpE::Cm)是一种营养缺陷型，不能在不添加TRP或邻氨基苯甲酸盐的情况下在基本培养基中生长。通过在ΔtrpE::Cm(KYNase-trpE)中表达犬尿氨酸酶，可以通过提供KYN来替代地拯救这种营养缺陷型。
如在本文中所使用的，利用KYNase-trpE中KYN的生长限制性质，采用适应性实验室进化来进化能够越来越有效利用KYN的菌株。
由于它们易于培养，生成时间短，种群密度非常高且基因组小，因此可以在缩短的时间尺度内将微生物进化为独特的表型。适应性实验室进化(ALE)是在选择压力下传代微生物以进化具有优选表型的菌株的过程。在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中描述了适应性实验室进化，其全部内容通过引用并入本文。
首先建立KYN浓度的下限，并通过降低KYN浓度的传代进化突变体。虽然这可以选择能够增加KYN输入的突变体，但细菌细胞仍然倾向于利用游离的外源性TRP。在肿瘤环境中，可以通过耗尽KYN和增加局部TRP浓度来提供双重治疗功能。因此，为了进化出相对于TRP优选KYN的菌株，可以将TRP-5-氟-L-色氨酸(ToxTRP)的毒性类似物纳入ALE实验中。然后对得到的最佳表现菌株进行全基因组测序，以便对贡献的突变进行去卷积。可以进行Lambda-RED以重新引入TrpE，以使Trp调节失活(trpR、tyrR、转录衰减子)以上调TrpABCDE表达并增加分支酸产生。由此产生的菌株现在对外部TRP不敏感，有效地将KYN转化为TRP，并且现在也过量产生TRP。
嘌呤能系统-ATP/腺苷代谢
成功的癌症免疫疗法的一个重要障碍是肿瘤采用许多机制来促进免疫逃逸，包括产生抗炎细胞因子，调节免疫子集的募集和免疫抑制代谢产物的产生。一种这样的免疫抑制途径是通过CD73产生细胞外腺苷，一种有效的免疫抑制分子。由受损或垂死的细胞和细菌释放的免疫刺激性细胞外ATP促进免疫吞噬细胞的募集并激活P2X7R，这是NLRP3炎性体的共激活因子，然后引发促炎性细胞因子如IL-1β和IL-18的产生。细胞外ATP分解为ADP、AMP和腺苷的分解代谢受CD39(外核苷三磷酸二磷酸水解酶1，E-NTPDase1)控制，将ATP水解成AMP，然后通过CD73(ecto-5'-核苷酸酶，Ecto5'NTase)将其去磷酸化为腺苷。因此，CD39和CD73协同作用以将促炎性ATP转化为免疫抑制性腺苷。除其免疫调节作用外，外核苷酸酶途径直接有助于调节癌细胞生长、分化、侵袭、迁移、转移和肿瘤血管生成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包括用于从肿瘤微环境中除去过量腺苷的手段。许多细菌从环境中清除低浓度的核苷，以通过补救的合成途径合成核苷酸和脱氧核苷酸。另外，在大肠杆菌中，核苷可以用作用于生长的氮和碳的唯一来源(Neuhard J,NygaardP.Biosynthesis and conversion of nucleotides,purines and pyrimidines.In:Neidhardt FC,Ingraham JL,Low KB,Magasanik B,Schaechter M,Umbarger HE,editors.Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular and molecularbiology.Washington DC:ASM Press；1987.pp.445–473)。两个进化上不相关的阳离子连接转运蛋白家族，浓缩核苷转运蛋白(CNT)家族和核苷：H+转运蛋白(NHS)家族，负责核苷摄取(参见例如，Cabrita等，Biochem.Cell Biol.Vol.80,2002.Molecular biology andregulation of nucleoside and nucleobase transporter proteins in eukaryotesand prokaryotes，其全部内容通过引用并入本文)。NupC和NupG是大肠杆菌中的转运蛋白家族成员。nupC和nupG基因缺陷的突变体不能以核苷作为单一碳源生长。这两种转运蛋白都是质子连接的，但它们的选择性不同。NupC是H+/核苷酸同向转运蛋白家族的核苷酸转运蛋白。NupC嘧啶核苷-H+转运蛋白介导核苷，特别是嘧啶的同向(即，H+-偶联底物摄取)。在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中发现了该家族的两个已知成员。NupG能够运输多种核苷和脱氧核苷；相反，NupC不运输鸟苷或脱氧鸟苷。来自大肠杆菌的NupG的同系物存在于广泛的真细菌中，包括人肠道病原体如鼠伤寒沙门氏菌，与牙周病相关的生物如牙龈卟啉单胞菌和中间普氏菌，以及欧文氏菌属中的植物病原体(如在Vaziri等，Mol MembrBiol.2013Mar；30(1-2):114–128；Use of molecular modelling to probe themechanism of the nucleoside transporter NupG中所述的，其全部内容通过引用并入本文)。来自CNT超家族的推定细菌转运蛋白和来自NupG/XapB家族的转运蛋白包括下表5和表6中列出的那些。另外，基于与称为尿嘧啶/尿囊素转运蛋白家族的酵母转运蛋白家族(Cabrita等，同上)的同源性鉴定codB(GenBankP25525，大肠杆菌)。
表5：推定的CNT家族转运蛋白
Figure BDA0002364453000002461
表6：来自NupG/XapB家族的细菌转运蛋白
蛋白(基因名称) GenBank登录号 生物体
1.yegT P76417 大肠杆菌
2.NupG P09452 E.coli
3.XapB P45562 E.coli
4.(CC1628) AAK23606 新月柄杆菌
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于从肿瘤微环境向工程化细菌导入腺苷的手段。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于编码核苷转运蛋白的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于编码腺苷转运蛋白的序列。在某些实施方式中，基因工程化细菌包含编码大肠杆菌核苷酸渗透酶nupG或nupC的序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是用于瘤内施用的细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于在低氧条件激活的启动子控制下编码核苷转运蛋白或腺苷转运蛋白(例如，nupG或nupC转运蛋白序列)的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，编码核苷转运蛋白或腺苷转运蛋白的序列，例如nupG或nupC转运蛋白序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，如本文描述的任何启动子的控制下编码核苷转运蛋白或腺苷转运蛋白的序列，例如nupG或nupC转运蛋白序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于代谢或降解腺苷的手段。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种酶的一种或多种基因序列，所述酶能够将腺苷转化为尿酸(参见图1、图2和图3)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自大肠杆菌的add、xapA、deoD、xdhA、xdhB和xdhC基因的一种或多种序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自大肠杆菌的add、xapA、deoD、xdhA、xdhB和xdhC基因的序列，并且包含编码核苷或腺苷转运蛋白的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自大肠杆菌的add、xapA、deoD、xdhA、xdhB和xdhC基因的序列，并且包含编码nupG或nupC的序列。示例性工程化细菌显示在图2中。
可用于腺苷降解回路的示例性序列包括SEQ ID NO:71-77。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸序列，其与选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77，或其功能性片段的一个或多个多核苷酸序列具有至少约80％同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸序列，其与选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQID NO:75、SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77，或其功能性片段的一个或多个多核苷酸序列具有至少约90％同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸序列，其与选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77，或其功能性片段的一个或多个多核苷酸序列具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸序列，其与选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的一个或多个多核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或者至少约99％的同源性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸序列，其包含选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的一个或多个多核苷酸序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸序列，其由选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的一个或多个多核苷酸序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸序列，但是为了遗传密码的冗余，编码与选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的序列相同的蛋白质。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸，但为了遗传密码的冗余，其编码与由选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的序列编码的多肽至少约80％同源的多肽，或其功能片段。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸，但为了遗传密码的冗余，其编码与由选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的序列编码的多肽至少约90％同源的多肽，或其功能片段。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸，但为了遗传密码的冗余，其编码与由选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的序列编码的多肽至少约95％同源的多肽，或其功能片段。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸，但为了遗传密码的冗余，其编码与由选自SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的序列编码的多肽至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同源的多肽。
在一个特定的实施方式中，基因工程化细菌包含整合到HA1/2(agaI/rsmI)区域的染色体中的PfnrS-nupC，整合到HA9/10(exo/cea)区域的染色体中的PfnrS-xdhABC，和整合到malE/K区域的染色体中的PfnrS-add-xapA-deoD。
在一些实施方式中，构建体包含PfnrS(SEQ ID NO:856)，PfnrS-nupC(SEQ ID NO:857)，PfnrS-xdhABC(SEQ ID NO:858)，xdhABC(SEQ ID NO:859)，PfnrS-add-xapA-deoD(SEQ ID NO:860)和add-xapA-deoD(SEQ ID NO:861)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码消耗腺苷的构建体的核酸序列，其与选自SEQ ID NO:856、SEQ ID NO:857、SEQ ID NO:858、SEQ ID NO:859、SEQ ID NO:860和/或SEQ ID NO:861，或者其变体或功能性片段的多核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或者至少约99％的同源性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码消耗腺苷的构建体的核酸序列，其包含选自SEQ ID NO:856、SEQ ID NO:857、SEQ ID NO:858、SEQ ID NO:859、SEQ ID NO:860和/或SEQ ID NO:861的一个或多个多核苷酸序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码消耗腺苷的构建体的核酸序列，其由选自SEQ ID NO:856、SEQ ID NO:857、SEQ ID NO:858、SEQ ID NO:859、SEQ ID NO:860和/或SEQ ID NO:861的一个或多个多核苷酸序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码NupC的核酸序列。在一个实施方式中，核苷酸序列编码NupC多肽，其与SEQ ID NO:78具有至少约80％同一性。在一个实施方式中，核苷酸序列编码NupC多肽，其与SEQ ID NO:78具有至少约90％同一性。在另一个实施方式中，核苷酸序列编码NupC多肽，其与SEQ ID NO:78具有至少约95％同一性。因此，在一个实施方式中，核苷酸序列编码NupC多肽，其与SEQ ID NO:78具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方式中，核苷酸序列编码NupC多肽，其包含编码SEQ ID NO:78的序列。在又一个实施方式中，核苷酸序列编码NupC多肽，其由SEQ ID NO:78组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码XdhA的核酸序列。在一个实施方式中，核酸序列编码XdhA多肽，其与SEQ ID NO:79具有至少约80％同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码XdhA多肽，其与SEQ ID NO:79具有至少约90％同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码XdhA多肽，其与SEQ ID NO:79具有至少约95％同一性。因此，在一个实施方式中，核苷酸序列编码XdhA多肽，其与SEQ ID NO:79具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方式中，核苷酸序列编码XdhA多肽，其包含编码SEQ ID NO:79的序列。在又一个实施方式中，核苷酸序列编码XdhA多肽，其由编码SEQ ID NO:79的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码XdhB的核酸序列。在一个实施方式中，核酸序列编码XdhB多肽，其与SEQ ID NO:80具有至少约80％同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码XdhB多肽，其与SEQ ID NO:80具有至少约90％同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码XdhB多肽，其与SEQ ID NO:80具有至少约95％同一性。因此，在一个实施方式中，核苷酸序列编码XdhB多肽，其与SEQ ID NO:80具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方式中，核苷酸序列编码XdhB多肽，其包含编码SEQ ID NO:80的序列。在又一个实施方式中，核苷酸序列编码XdhB多肽，其由编码SEQ ID NO:80的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码XdhC的核酸序列。在一个实施方式中，核酸序列编码XdhC多肽，其与SEQ ID NO:81具有至少约80％同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码XdhC多肽，其与SEQ ID NO:81具有至少约90％同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码XdhC多肽，其与SEQ ID NO:81具有至少约95％同一性。因此，在一个实施方式中，核苷酸序列编码XdhC多肽，其与SEQ ID NO:81具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方式中，核苷酸序列编码XdhC多肽，其包含编码SEQ ID NO:81的序列。在又一个实施方式中，核苷酸序列编码XdhC多肽，其由编码SEQ ID NO:81的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码Add的核酸序列。在一个实施方式中，核酸序列编码Add多肽，其与SEQ ID NO:82具有至少约80％同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码Add多肽，其与SEQ ID NO:82具有至少约90％同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码Add多肽，其与SEQ ID NO:82具有至少约95％同一性。因此，在一个实施方式中，核苷酸序列编码Add多肽，其与SEQ ID NO:82具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方式中，核苷酸序列编码Add多肽，其包含编码SEQ ID NO:82的序列。在又一个实施方式中，核苷酸序列编码Add多肽，其由编码SEQ ID NO:82的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码XapA的核酸序列。在一个实施方式中，核酸序列编码XapA多肽，其与SEQ ID NO:83具有至少约80％同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码XapA多肽，其与SEQ ID NO:83具有至少约90％同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码XapA多肽，其与SEQ ID NO:83具有至少约95％同一性。因此，在一个实施方式中，核苷酸序列编码XapA多肽，其与SEQ ID NO:83具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方式中，核苷酸序列编码XapA多肽，其包含编码SEQ ID NO:83的序列。在又一个实施方式中，核苷酸序列编码XapA多肽，其由编码SEQ ID NO:83的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码DeoD的核酸序列。在一个实施方式中，核酸序列编码DeoD多肽，其与SEQ ID NO:84具有至少约80％同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码DeoD多肽，其与SEQ ID NO:84具有至少约90％同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码DeoD多肽，其与SEQ ID NO:84具有至少约95％同一性。因此，在一个实施方式中，核苷酸序列编码DeoD多肽，其与SEQ ID NO:84具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方式中，核苷酸序列编码DeoD多肽，其包含编码SEQ ID NO:84的序列。在又一个实施方式中，核苷酸序列编码DeoD多肽，其由编码SEQ ID NO:84的序列组成。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经工程化以消耗腺苷的细菌消耗0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的腺苷。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的腺苷。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的腺苷。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经工程化以消耗腺苷的细菌产生至少约0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的尿酸。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的尿酸。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的尿酸。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解率增加0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解率增加1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解率增加约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍。
在一些实施方式中，当在低氧条件下诱导时，基因工程化细菌具有约1.8-10μmol/hr/10^9细胞的腺苷降解速率。在一个特定的实施方式中，基因工程化细菌具有约5-9μmol/hr/10^9细胞的腺苷降解速率。在一个特定的实施方式中，基因工程化细菌具有约6-8μmol/hr/10^9细胞的腺苷降解速率。
在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导1小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解增加约50％至70％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导1小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解增加约55％至65％。在一个特定的实施方式中，即在低氧条件下诱导1小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解增加约55％至60％。在又一个实施方式中，当在低氧条件下诱导1小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约1.5-3倍。在一个特定的实施方式中，当在低氧条件下诱导1小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约2-2.5倍。
在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导2小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解增加约85％至100％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导2小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解增加约95％至100％。在一个特定的实施方式中，即在低氧条件下诱导2小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解增加约97％至99％。
在又一个实施方式中，当在低氧条件下诱导2小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约40-50倍。在一个特定的实施方式中，当在低氧条件下诱导2小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约44-48倍。
在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导3小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解增加约95％至100％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导3小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解增加约98％至100％。在一个特定的实施方式中，即在低氧条件下诱导3小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解增加约99％至99％。在又一个实施方式中，当在低氧条件下诱导3小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约100-1000倍。在又一个实施方式中，当在低氧条件下诱导3小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约1000-10000倍。
在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导4小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解增加约95％至100％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导4小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解增加约98％至100％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导4小时后，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌使腺苷降解增加约99％至99％。在又一个实施方式中，当在低氧条件下诱导4小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约100-1000倍。在又一个实施方式中，当在低氧条件下诱导4小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约1000-10000倍。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使细胞增殖减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤尺寸缩小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤体积缩小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤重量减轻至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖、cumate和水杨酸和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述用于降解腺苷的回路。在一些实施方式中，可以在体内施用这种诱导物以诱导效应物基因表达。在一些实施方式中，编码用于腺苷降解的回路的基因序列由可被这种条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，如本文所述，基因序列由组成型启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并在体内条件和/或体外条件下表达，例如在本文所述的扩增，生产和/或制造过程中。在一些实施方式中，所描述的腺苷降解回路中的任何一个或多个存在于一个或多个质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到微生物染色体中的一个或多个位点中。
在任何这些实施方式中，包含编码本文所述的腺苷分解代谢途径和腺苷转运蛋白的一种或多种序列的基因工程化细菌还包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码腺苷分解代谢途径和腺苷转运蛋白的回路可以与编码如本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。
在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码腺苷分解代谢途径和腺苷转运蛋白的一种或多种基因序列可以与编码如本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码腺苷分解代谢途径和腺苷转运蛋白的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码腺苷分解代谢途径和腺苷转运蛋白的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于输入生物分子或基质的一种或多种转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的任何分泌回路，或本领域已知的，(6)一个或多个表面展示回路，例如本文所述和本领域中已知的任何表面展示回路，以及(7)用于产生或降解本文所述一种或多种代谢产物(例如犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)的一种或多种回路(8)一种或多种此类附加回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含增加肿瘤微环境中ATP水平的手段，例如通过增加微生物中ATP的生产和分泌。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于降低肿瘤微环境中腺苷的水平(例如，通过增加腺苷的摄取、通过代谢和/或降解腺苷)，增加肿瘤微环境中ATP的水平和/或阻止或阻断肿瘤微环境中ATP向腺苷转化的一种或多种手段。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是用于瘤内施用的细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于在由低氧条件、缺氧条件或炎性条件激活的启动子的控制下代谢腺苷的一种或多种基因，如由所述条件激活并在本文中描述的任何启动子。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌症特异性启动子、组织特异性启动子或组成型启动子(如本文所述的任何启动子)的控制下表达一种或多种用于代谢腺苷的基因。
精氨酸/精氨酸酶I代谢
L-精氨酸(L-Arg)是一种非必需氨基酸，在包括免疫应答在内的多种生物系统中起着核心作用。L-精氨酸被精氨酸酶I、精氨酸酶II和诱导型一氧化氮合酶代谢。精氨酸酶1将L-精氨酸水解为尿素和L-鸟氨酸，后者是生产多胺的主要底物，而多胺是恶性肿瘤中细胞周期快速发展所必需的。肿瘤浸润的髓系来源的抑制细胞(MDSC)的独特亚群，而不是肿瘤细胞本身，可产生高水平的精氨酸酶I和阳离子氨基酸转运蛋白2B，从而使它们能够在肿瘤微环境中快速整合L-精氨酸(L-Arg)并耗尽胞外L-Arg。这些细胞是T细胞受体表达和抗原特异性T细胞应答的有效抑制剂，以及调节性T细胞的有效诱导剂。而且，Lanzavecchia及其同事的最新研究表明，激活的T细胞还大量消耗L-精氨酸并将其迅速转化为下游代谢产物，从而导致激活后细胞内精氨酸水平显著下降。在这些研究中，向T细胞培养基中添加外源L-精氨酸会增加T细胞中细胞内游离L-精氨酸的水平，此外L-精氨酸水平的提高也会对T细胞的激活、分化和功能产生多效效应，其影响范围从生物能量和存活率的提高到体内抗肿瘤活性(Geiger等，(2016)L-Arginine Modulates T Cell Metabolism and EnhancesSurvival and Anti-tumor Activity；Cell 167,829–842，其全部内容通过引用并入本文)。因此，经过工程化以生产和分泌精氨酸的细菌可能能够促进T细胞对精氨酸的摄取，从而导致T细胞激活增强以及更为持久。因此，在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌能够生产精氨酸。
最新发现表明，肿瘤微环境具有独特的氨代谢类型，其与人体的任何其他器官不同(Spinelli等，Metabolic recycling of ammonia via glutamate dehydrogenasesupports breast cancer biomass；Science10.1126/science.aam9305(2017))。由于血管生成不良，使得在肿瘤微环境中累积的氨不是废物，而是独特地使得肿瘤将氨作为重要的氮源重新吸收到代谢途径中，以支持在快速增殖的癌细胞中对氨基酸合成的较高需求。此外，Eng等(Eng等，Ammonia Derived from Glutaminolysis Is a Diffusible Regulatorof Autophagy；Science Signaling(2010)；3(118)ra31)发现在谷氨酰胺分解过程中释放的氨会刺激自噬，其通过将大分子再循环到快速增殖的细胞存活所需的代谢前体中促进了细胞适应性。作者提出，从参与谷氨酰胺分解的肿瘤细胞中释放氨可提供促进自噬的信号，继而保护肿瘤不同区域的细胞免受内部产生或环境压力的影响。
因此，基因工程化细菌消耗的氨可能会降低用于癌症代谢或促进在癌细胞中自噬的氨的可及性。本文所述的公开内容还提供了能够减少过量氨并将氨和/或氮转化为替代副产物的基因工程化细菌。在某些实施方式中，基因工程化细菌会减少过量的氨，并将氨和/或氮转化为肿瘤微环境中的其他副产物。在某些实施方式中，基因工程化细菌通过将肿瘤中过量的氮掺入降低肿瘤对氮的可及性的分子(例如，精氨酸、瓜氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或色氨酸)中来减少过量的氨。在一些实施方式中，基因工程化细菌通过将肿瘤中过量的氮掺入抑制肿瘤生长或促进T细胞激活的分子(包括但不限于，精氨酸)中来减少过量的氨。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够消耗氨并产生精氨酸。
在本文下文所述以及在05/25/2016提交的PCT/US2016/034200，05/25/2016提交的15/164,828(公开为US20160333326)，以及12/04/2015提交的PCT/US2015/064140和12/04/2015提交的美国专利号9,487,76中更详细描述的精氨酸生产回路中，氨被细菌(例如，E.coli Nissle)摄取，转化为谷氨酸，谷氨酸随后被代谢为精氨酸。然后，精氨酸最终离开细菌细胞。这样，该回路适于消耗氨，降低肿瘤中癌细胞对氨的利用，同时产生了精氨酸，精氨酸促进T细胞激活并阻止免疫抑制。
在一些实施方式中，产生L-精氨酸和/或消耗氨的基因工程化细菌包含编码L-精氨酸生物合成途径的一种或多种酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码能够使氨掺入谷氨酸，并将谷氨酸转化为精氨酸的一种或多种酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含精氨酸操纵子。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含E.coli的精氨酸操纵子。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含另一种细菌的精氨酸操纵子。在任何这些实施方式中，精氨酸阻遏蛋白(ArgR)可以任选地被缺失、突变或修饰，从而减少或消除其阻遏蛋白的功能。
“精氨酸操纵子”、“精氨酸生物合成操纵子”和“arg操纵子”可互换使用，指在包含至少一个启动子和至少一个ARG盒的共有调控区的控制下编码精氨酸生物合成酶的一个或多个基因的簇。在一些实施方式中，一种或多种基因共转录和/或共翻译。
“突变体精氨酸调节子”或“突变的精氨酸调节子”用于指精氨酸调节子，其包含一个或多个核酸突变，其减少或消除精氨酸介导的每个操纵子的抑制，所述操纵子编码负责在精氨酸生物合成途径中将谷氨酸转化为精氨酸的酶，使得突变体精氨酸调节子在相同条件下产生比来自相同细菌亚型的未修饰调节子更多的精氨酸和/或中间副产物。
在细菌(如大肠杆菌(E.coli))中，精氨酸生物合成途径能够在八步酶促过程中将谷氨酸转化为精氨酸，如在05/25/2016提交的PCT/US2016/034200和在05/25/2016提交的15/164,828(公开为US20160333326)，以及12/04/2015提交的PCT/US2015/064140和12/04/2015提交的美国专利号9,487,764中所述，其每一个的全部内容均通过引用并入本文。精氨酸通过其与ArgR的相互作用，使所有编码这些酶的基因受到精氨酸的抑制，形成与每个基因的调控区结合并抑制转录的复合物。N-乙酰谷氨酸合成酶也仅通过精氨酸就在蛋白水平上受到变构反馈抑制作用。
在一些工程化细菌中，精氨酸调节子包括但不限于编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA；argB，编码N-乙酰谷氨酸激酶；argC，编码N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶；argD，编码乙酰鸟氨酸氨基转移酶；argE，编码N-乙酰鸟氨酸酶；argG，编码精氨琥珀酸合成酶；argH，编码精氨琥珀酸裂解酶；argF和argI中的一种或两种，每种都独立地编码鸟氨酸转氨甲酰酶；carA，编码氨基甲酰磷酸合成酶的小亚基；carB，编码氨基甲酰磷酸合成酶的大亚基；其操纵子；其操作子；其启动子；其ARG盒；和/或其调控区。在一些实施方式中，精氨酸调节子包含argJ，编码鸟氨酸乙酰转移酶(N-乙酰谷氨酸合成酶和/或N-乙酰鸟氨酸酶的补充或替代)，其操纵子；其操作子；其启动子；其ARG盒；和/或其调控区。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含精氨酸生物合成途径并且能够生产精氨酸和/或消耗氨。在一个更特定的实施方式中，基因工程化细菌包含突变体精氨酸调节子，其中与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，编码一种或多种精氨酸生物合成酶的一种或多种操纵子被去阻遏，以产生更多的精氨酸。在一些实施方式中，基因工程化细菌过量产生精氨酸。在一些实施方式中，基因工程化细菌消耗氨。在一些实施方式中，基因工程化细菌过量产生精氨酸并且消耗氨。
每个操纵子受调控区调控，所述调控区包含至少一个启动子和至少一个ARG盒，其控制所述操纵子中精氨酸生物合成基因的抑制和表达。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含精氨酸调节子，其包含一种或多种核酸突变，其减少或消除精氨酸介导的一种或多种操纵子的抑制，所述操纵子编码负责精氨酸生物合成途径中将谷氨酸转化为精氨酸的酶。通过减少或消除ArgR阻遏物结合(例如，通过突变或缺失精氨酸阻遏物或通过对编码精氨酸生物合成酶的每个操纵子突变至少一个ARG盒)和/或精氨酸与N-乙酰谷氨酸合成酶的结合(例如，通过突变N-乙酰谷氨酸合成酶以产生精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr)可以实现减少或消除精氨酸介导的抑制。
在一些实施方式中，精氨酸介导的阻遏的减少或消除可通过减少或消除ArgR阻遏物结合来实现，例如，通过突变编码精氨酸生物合成酶的一个或多个操纵子的至少一个ARG盒，或通过突变或缺失精氨酸阻遏物和/或通过减少或消除精氨酸与N-乙酰谷氨酸合成酶的结合(例如，通过突变N-乙酰谷氨酸合成酶以产生精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr)。
“ArgR”或“精氨酸阻遏物”用于指通过调节精氨酸调节子中精氨酸生物合成基因的转录能够抑制精氨酸生物合成的蛋白质。“缺乏任何功能性ArgR”和“ArgR缺失细菌”的细菌用于指其中每种精氨酸阻遏物在相同条件下与来自相同亚型的细菌的未修饰的精氨酸阻遏物相比显著降低或消除活性的细菌。ARG盒指包含共有序列的核酸序列，已知其核酸在argR、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、argJ、carA和/或carB的一个或多个调控区中以高频率出现。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含突变精氨酸调节子，其针对编码精氨酸合成酶N-乙酰谷氨酸激酶、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶、乙酰鸟氨酸氨基转移酶、N-乙酰鸟氨酸酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合酶、精氨琥珀酸裂解酶和氨甲酰磷酸合酶的一个或多个操纵子在至少一个AGR盒中包含一个或多个核酸突变，以使得精氨酸调节子去阻遏以及精氨酸盒/或中间副产物(例如，瓜氨酸)的生物合成增强。在05/25/2016提交的PCT/US2016/034200和在05/25/2016提交的15/164,828(公开为US20160333326)，以及12/04/2015提交的PCT/US2015/064140和12/04/2015提交的美国专利号9,487,764中描述了此类基因工程化细菌、突变体Arg盒盒示例性突变体精氨酸调节子，其每一个的全部内容均通过引用并入本文。
在一些实施方式中，基因工程化细菌缺乏功能性ArgR阻遏物，因此每个精氨酸生物合成操纵子的ArgR阻遏物介导的转录抑制被减少或消除。在05/25/2016提交的PCT/US2016/034200和在05/25/2016提交的15/164,828(公开为US20160333326)，以及12/04/2015提交的PCT/US2015/064140和12/04/2015提交的美国专利号9,487,764中描述了缺乏功能性ArgR阻遏物的根据本公开内容的基因工程化细菌，其每一个的全部内容均通过引用并入本文。在一些实施方式中，工程化细菌包含含有一个或多个核酸突变的突变体精氨酸阻遏物，以使得精氨酸阻遏物的功能降低或失活。在一些实施方式中，基因工程化细菌不具有精氨酸阻遏物(例如，精氨酸阻遏物基因已缺失)，导致调节子去阻遏以及精氨酸和/或中间副产物的生物合成增强和/或氨消耗增加。可通过修饰细菌argR基因或修饰argR基因的转录来产生精氨酸阻遏物活性降低或消除的细菌。在一些实施方式中，通常存在于相应的野生型细菌中的功能性argR基因的每个拷贝独立地缺失或通过一个或多个核苷酸缺失、插入或取代而失活。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr(参见例如，Eckhardt等，1975；Rajagopal等，1998)。在05/25/2016提交的PCT/US2016/034200和在05/25/2016提交的15/164,828(公开为US20160333326)，以及12/04/2015提交的PCT/US2015/064140和12/04/2015提交的美国专利号9,487,764中描述了根据本公开内容的包含argAfbr的基因工程化细菌，其每一个的全部内容均通过引用并入本文。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含含有精氨酸反馈抗性ArgA的突变体精氨酸调节子，并且当表达精氨酸反馈抗性ArgA时，与在相同条件下来自相同亚型的未修饰细菌相比，能够产生更多精氨酸盒/或中间副产物。反馈抗性argA基因可以存在于质粒或染色体上，例如在一个或多个整合位点的一个或多个拷贝中。多种不同的反馈抗性N-乙酰谷氨酸合成酶蛋白是本领域公知的，并且可以与基因工程化细菌组合。在一些实施方式中，argAfbr基因在组成型启动子控制下表达。在一些实施方式中，argAfbr基因在由肿瘤微环境诱导的启动子控制下表达。在一些实施方式中，argAfbr基因在由低氧条件下诱导的启动子(例如，FNR启动子)的控制下表达。
示例性argAfbr序列的核酸序列如SEQ ID NO:102所示。示例性argAfbr序列的多肽序列如SEQ ID NO:103所示。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQ ID NO:102所示的核酸序列或其功能性片段。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，但是该核酸序列由于遗传密码的冗余而编码与SEQ ID NO:102或其功能性片段相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含与SEQ ID NO:102或其功能性片段的DNA序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同源性的核酸序列，或者由于遗传密码的冗余与SEQ ID NO:102或其功能性片段编码相同多肽的核酸序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌编码SEQ ID NO:103所示的多肽序列或其功能性片段。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码多肽序列，该多肽序列编码相对于SEQID NO:103或其功能性片段含有一个或多个保守性氨基酸取代的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码与SEQ ID NO:103或其功能性片段的DNA序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同源性的多肽序列。
在一些实施方式中，与来自相同条件下相同亚型细菌的野生型N-乙酰谷氨酸合成酶相比，当精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合成酶具有活性时，在基因工程化细菌中N-乙酰谷氨酸合成酶的精氨酸反馈抑制减少至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％。
在一些实施方式中，含有突变或缺失的精氨酸阻遏物的遗传修饰细菌另外包含精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含反馈抗性形式的ArgA，缺乏任何功能性精氨酸阻遏物，并且能够产生精氨酸。在一些实施方式中，在基因工程化细菌中argR基因缺失。在一些实施方式中，argR基因突变以灭活ArgR的功能。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含argAfbr并缺失ArgR。在一些实施方式中，从细菌基因组中删除缺失的ArgR和/或缺失的argG，并且在质粒中存在argAfbr。在一些实施方式中，从细菌基因组中删除缺失的ArgR，并且argAfbr整合至染色体中。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生精氨酸和/或消耗氨的细菌产生至少约0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％或更多的精氨酸。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的精氨酸。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍或更多的精氨酸。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生精氨酸和/或消耗氨的细菌消耗0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的谷氨酸。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的谷氨酸。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍或更多的谷氨酸。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生精氨酸和/或消耗氨的细菌消耗0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的氨。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的氨。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍或更多的氨。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够将细胞增殖减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够将肿瘤生长减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够将肿瘤尺寸缩小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤体积减小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤重量减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。
在05/25/2016提交的PCT/US2016/034200和在05/25/2016提交的15/164,828(公开为US20160333326)，以及12/04/2015提交的PCT/US2015/064140和12/04/2015提交的美国专利号9,487,764中描述了精氨酸生产菌株和氨消耗菌株，其每一个的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，用于产生精氨酸和或消耗氨的基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在存在癌症和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢产物的情况下，和/或在存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下表达任何一种或多种所述的回路。
在一些实施方式中，用于产生精氨酸和或消耗氨的任何一种或多种所述回路存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或者整合至微生物染色体中的一个或多个位点上。而且，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述的回路，并且还包含下述中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，如本领域公知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀伤开关回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何杀伤开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的任何表面展示回路，(7)用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢产物(例如，犬尿氨酸、色氨酸、腺苷、精氨酸)的一种或多种回路，(8)一种或多种此类其他回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂联用，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在任何这些实施方式中，包含编码精氨酸生产和/或氨消耗回路的一种或多种基因序列的基因工程化细菌还包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码精氨酸生产和/或氨消耗回路的回路可以与编码如本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。
在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码精氨酸生产和/或氨消耗回路的一种或多种基因序列可以与编码如本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码精氨酸生产和/或氨消耗回路的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码精氨酸生产和/或氨消耗回路的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。
在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
吸引Th1/CD8的趋化因子
趋化因子对于吸引和募集免疫细胞至关重要，例如那些激活免疫应答的免疫细胞和诱导癌细胞凋亡的免疫细胞。趋化因子的靶细胞表达趋化因子结合并介导功能的相应受体。因此，CC和CXC趋化因子的受体分别称为CCR和CXCR。CC趋化因子与CC趋化因子受体结合，CXC趋化因子与CXC趋化因子受体结合。大多数受体通常与多于一种趋化因子结合，并且大多数趋化因子通常与多于一种受体结合。
趋化因子干扰素-γ诱导蛋白10kDa(CXCL10)是CXC趋化因子家族的成员，其与CXCR3受体结合以发挥其生物学作用。CXCL10参与趋化性，诱导细胞凋亡，调节细胞生长和介导血管生成抑制作用。CXCL10与多种人类疾病有关，包括传染病，慢性炎症，免疫功能障碍，肿瘤发展、转移和播散。更重要的是，CXCL10已被确定为介导疾病严重程度的主要生物学标记，可用作各种疾病的预后指标。在这篇综述中，我们关注当前的研究，阐明CXCL10在癌症发病机制中的新兴作用。了解CXCL10在疾病发生和发展中的作用可能为开发CXCL10作为相关人类恶性肿瘤的潜在生物标志物和治疗靶点奠定基础。
CXCL10和CXCL9各自特异性激活一种受体CXCR3，这是一种七跨膜跨膜G蛋白偶联受体，主要在激活的T淋巴细胞(Th1)，自然杀伤细胞(NK)，炎症树突细胞，巨噬细胞和B细胞上表达。干扰素诱导的血管生成抑制CXC趋化因子和干扰素诱导的T细胞化学引诱物(I-TAC/CXCL11)也激活CXCR3。这些CXC趋化因子优先在Th1淋巴细胞上表达。
免疫介导的组织特异性破坏与Th1极化，相关趋化因子(CXCR3和CCR5配体，例如CXCL10和CXCL9)以及与细胞毒性机制的激活相关的基因相关。其他研究表明，早期乳腺癌，结肠直肠癌，肺癌，肝细胞癌，卵巢癌和黑色素瘤等癌症的长期无病生存率和总生存率始终与T辅助细胞1型(Th1)细胞相关因子的激活有关，如IFN-γ，信号转导和转录激活因子1(STA1)，IL-12，IFN-调节因子1，转录因子T-bet，免疫效应因子或细胞毒性因子(颗粒酶)，穿孔素和颗粒溶素，CXCR3和CCR6配体5趋化因子(CXCL9，CXCL10和CCL5)，其他趋化因子(CXCL1和CCL2)和粘附分子(MADCAM1，ICAM1，VCAM1)。已显示化学吸引和粘附在确定肿瘤内免疫细胞的密度中起关键作用。其他研究表明，CXCL9，CXCL10和CXCL11的上调可预测治疗反应性(特别对过继转移疗法有应答)。还有其他研究表明，驱动淋巴细胞浸润的趋化因子预示着肝细胞癌患者的存活。
现在认识到癌症进展受癌细胞内在和微环境因素的调节。已经证实T辅助细胞1(Th1)和/或细胞毒性T细胞的存在与几种癌症中复发的风险降低相关，并且促炎性肿瘤微环境与肝细胞癌患者群体中延长的存活相关。已显示CXCL10，CCL5和CCL2表达与Th1，CD8+T细胞和天然杀伤细胞的肿瘤浸润相关。数据显示CXCL10，CCL5和CCL2是吸引Th1，CD8+T细胞和NK细胞进入肿瘤微环境的主要趋化因子。此外，CXCL10和TLR3(诱导CXCL10，CCL5和CCL2)表达与癌细胞凋亡相关。
CXC基序趋化因子10(CXCL10)，也称为干扰素γ诱导的蛋白质10(IP-10)或小诱导型细胞因子B10，是人类中由CXCL10基因编码的8.7kDa蛋白质。CXCL10是属于CXC趋化因子家族的小细胞因子，其由几种细胞类型响应IFN-γ分泌，包括单核细胞，内皮细胞和成纤维细胞。CXCL10具有多种作用，包括单核细胞/巨噬细胞，T细胞，NK细胞和树突细胞的化学吸引，促进T细胞与内皮细胞的粘附，抗肿瘤活性以及抑制骨髓集落形成和血管生成。该趋化因子通过与细胞表面趋化因子受体CXCR3结合而引发其作用。
在促炎条件下，CXCL10由多种细胞分泌，例如白细胞，激活的嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，单核细胞，上皮细胞，内皮细胞，基质细胞(成纤维细胞)和角质形成细胞，以响应IFN-γ。这种干扰素反应的关键调节剂，优先吸引激活的Th1淋巴细胞进入炎症区域，其表达与Th1免疫应答有关。CXCL10也是单核细胞，T细胞和NK细胞的化学引诱物。(Chew等，Gut,2012,61:427-438)。还有其他研究表明，免疫保护特征基因，如Th1型趋化因子CXCL10和CXCL9，可能在癌症中表观遗传沉默。(Peng等，Nature,2015,doi:10.1038/nature 15520)。
趋化因子(CXC基序)配体9(CXCL9)是属于CXC趋化因子家族的小细胞因子，也称为由γ干扰素(MIG)诱导的单核因子。CXCL9是由IFN-γ诱导的T细胞化学引诱物(Th1/CD8吸引趋化因子)。它与另外两种CXC趋化因子CXCL10和CXCL11密切相关。CXCL9，CXCL10和CXCL11都通过与趋化因子受体CXCR3相互作用引发其趋化功能。
在一些实施方式中，工程化细菌包含编码一种或多种趋化因子的基因序列，所述趋化因子是吸引Th1/CD8的趋化因子。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码一种或多种趋化因子的基因序列，所述趋化因子是CXCR3配体趋化因子。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码一种或多种趋化因子的基因序列，所述趋化因子是CCR5配体趋化因子。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码CXCL10的一个或多个拷贝的基因序列。
在这些实施方式中的任何一个中，基因工程细菌在相同条件下比相同细菌亚型的未修饰细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％至45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的CXCL10。在又一个实施方式中，基因工程细菌在相同条件下比相同细菌亚型的未修饰细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的CXCL10。在又一个实施方式中，基因工程细菌在相同条件下比相同细菌亚型的未修饰细菌产生至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍或五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的CXCL10。
在这些实施方式中的任何一个中，基因工程化以表达CXCL10的细菌在相同条件下比相同细菌亚型的未修饰细菌分泌至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％至45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的CXCL10。在又一个实施方式中，基因工程细菌在相同条件下比相同细菌亚型的未修饰细菌分泌至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的CXCL10。在又一个实施方式中，基因工程细菌在相同条件下比相同细菌亚型的未修饰细菌分泌至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍或五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的CXCL10。
在一些实施方式中，基因工程化以分泌CXCL10的细菌在相同条件下比相同细菌亚型的未修饰细菌能够将细胞增殖降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，基因工程化以分泌CXCL10的细菌在相同条件下比相同细菌亚型的未修饰细菌能够将细胞生长降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，基因工程化以分泌CXCL10的细菌在相同条件下比相同细菌亚型的未修饰细菌能够将细胞尺寸降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，基因工程化以分泌CXCL10的细菌在相同条件下比相同细菌亚型的未修饰细菌能够将细胞体积降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，基因工程化以分泌CXCL10的细菌在相同条件下比相同细菌亚型的未修饰细菌能够将细胞重量降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以生产CXCL10的细菌能够使应答率增加至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以生产CXCL10的细菌能够以至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更高程度吸引激活的Th1淋巴细胞。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以生产CXCL10的细菌能够以至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更高程度吸引激活的Th1淋巴细胞。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌以至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更高的程度吸引激活的Th1淋巴细胞。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌以约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更高的程度吸引激活的Th1淋巴细胞。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以生产CXCL10的细菌能够以至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更高程度促进T细胞趋化性。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌以至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更高的程度促进T细胞趋化性。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌以约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更高的程度促进T细胞趋化性。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以生产CXCL10的细菌能够以至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更高程度促进NK细胞趋化性。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌以至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更高的程度促进NK细胞趋化性。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌以约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更高的程度促进NK细胞趋化性。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以生产CXCL10的细菌能够以至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更高的亲和性与CXCR3结合。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌以至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更高的亲和性与CXCR3结合。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够以至少约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更高的程度促进T细胞的趋化性。
在一些实施方式中，基因工程细菌包含编码CXCL10多肽或其片段或功能变体的基因序列。在一个实施方式中，编码CXCL10多肽的基因序列与选自SEQ ID NO：1207或SEQ IDNO：1208的序列具有至少约80％的同一性。在另一实施方式中，编码CXCL10多肽的基因序列与选自SEQ ID NO：1207或SEQ ID NO：1208的序列具有至少约85％的同一性。在一个实施方式中，编码CXCL10多肽的基因序列与选自SEQ ID NO：1207或SEQ ID NO：1208的序列具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，基因序列CXCL10多肽与选自SEQ ID NO：1207或SEQID NO：1208的序列具有至少约95％的同一性。在另一实施方式中，编码CXCL10多肽的基因序列与选自SEQ ID NO：1207或SEQ ID NO：1208的序列具有至少约96％，97％，98％或99％的同一性。因此，在一个实施方式中，编码CXCL10多肽的基因序列与选自SEQ ID NO：1207或SEQ ID NO：1208的序列具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，编码CXCL10多肽的基因序列包含选自SEQ ID NO：1207或SEQ ID NO：1208的序列。在另一个实施方式中，编码CXCL10多肽的基因序列由选自SEQ ID NO：1207或SEQ ID NO：1208的序列组成。在这些实施方式的任一个中，其中，基因工程化细菌编码CXCL10，可以去除编码分泌标签的一个或多个序列并替换为不同的标签。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与选自SEQ ID NO：1205或SEQ IDNO：1206的序列具有至少约80％同一性的CXCL10多肽的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CXCL10多肽的基因序列，所述CXCL10多肽与选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206的序列具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CXCL10多肽的基因序列，所述CXCL10多肽与选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206或其功能性片段的序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方式中，CXCL10多肽包含选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206的序列。在又一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的CXCL10多肽由选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206的序列组成。在其中基因工程化细菌编码CXCL10多肽的任何这些实施方式中，可以除去分泌标签并替代为不同的分泌标签。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠或肿瘤内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖、cumate和水杨酸和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述CXCL10回路。在一些实施方式中，可以在体内施用此类诱导剂，以诱导效应基因的表达。在一些实施方式中，一种或多种编码CXCL10的基因序列被可以由此类条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种编码CXCL10的基因序列被如本文所述的组成型启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在如本文所述的细菌扩增、产生和/或生产过程中。
在一些实施方式中，CXCL10是分泌的。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CXCL10的一种或多种基因序列，所述CXCL10含有选自PhoA、OmpF、cvaC、TorA、FdnG、DmsA和PelB的分泌标签。在一些实施方式中，分泌标签是PhoA。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含选自lpp、nlP、tolA和PAL的外膜蛋白中的一个或多个缺失。在一些实施方式中，缺失或突变的外膜蛋白是PAL。在一些实施方式中，包含用于产生CXCL10的基因序列的基因工程化细菌还包含编码IL-15的基因序列。在一些实施方式中，IL-15是分泌的。在一些实施方式中，编码IL-15的基因序列包含选自PhoA、OmpF、cvaC、TorA、FdnG、DmsA和PelB的分泌标签。在一些实施方式中，分泌标签是PhoA。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含选自lpp、nlP、tolA和PAL的外膜蛋白中的一个或多个缺失。在一些实施方式中，缺失或突变的外膜蛋白是PAL。
在一些实施方式中，编码CXCL10的所述基因序列中的任何一个或多个存在于一个或多个质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或整合到微生物染色体中的一个或多个位点中。而且，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如thyA营养缺陷型，(2)一个或多个杀伤开关回路，例如本文所述或本领域其他已知的杀伤开关，(3)一个或多个抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，例如本文所述或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一个或多个分泌回路，例如本文所述和本领域中已知的任何分泌回路，(6)一个或多个表面显示回路，例如本文所述和本领域其他已知的表面显示回路和(7)一种或多种用于产生或降解本文所述的一种或多种代谢物(例如犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)的回路(8)一种或多种这样的附加回路的组合。在这些实施方式的任一个中，基因工程细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂联合施用，包括但不限于抗CTLA4，抗PD1或抗PD-L1抗体。
在任何这些实施方式中，编码CXCL10的一种或多种序列的基因工程化细菌还包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码CXCL10的回路可以与编码如本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。
在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码CXCL10的一种或多种基因序列可以与编码如本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码CXCL10的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码CXCL10的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。
在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的CXCL9。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的CXCL9。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生至少约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的CXCL9。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生CXCL9的细菌分泌至少约0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的CXCL9。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌分泌约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的CXCL9。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌分泌至少约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的CXCL9。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以分泌至少约CXCL9的细菌能够使细胞增殖减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以分泌CXCL9的细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以分泌CXCL9的细菌能够使肿瘤尺寸缩小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生CXCL9的细菌能够使肿瘤体积缩小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生CXCL9的细菌能够是肿瘤重量减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生CXCL9的细菌能够使应答率增加至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生CXCL9的细菌能够吸引至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更高程度的激活的Th1淋巴细胞。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌吸引至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更高程度的激活的Th1淋巴细胞。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌吸引至少约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更高程度的激活的Th1淋巴细胞。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生CXCL9的细菌能够促进至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多的T细胞趋化性。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌促进至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更高程度的T细胞趋化性。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌促进至少约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更高程度的T细胞趋化性。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生CXCL9的细菌能够促进至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多的NK细胞趋化性。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌促进至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更高程度的NK细胞趋化性。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌促进至少约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更高程度的NK细胞趋化性。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生CXCL9的细菌能够以至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更高的亲和性与CXCR3结合。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌以至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更高的亲和性与CXCR3结合。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够以至少约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更高的亲和性与CXCR3结合。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在存在癌症和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢产物的情况下，和/或在存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下，和/或在存在肠道中可能存在的代谢产物的情况下，和/或在存在可能存在或不存在于体内，并且可能存在于体外菌株培养、扩增、产生和/或生产过程中的代谢产物(如阿拉伯糖、cumate和水杨酸以及本文所述的其他物质)的情况下，表达任意一种或多种所述的CXCL9回路。在一些实施方式中，可以在体内施用此类诱导剂以诱导效应基因表达。在一些实施方式中，编码CXCL9的一种或多种基因序列被可以由此类条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，编码CXCL9的一种或多种基因序列由组成型启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下(例如，在如本文所述的扩增、产生和/或生产过程中)表达。
在一些实施方式中，编码CXCL9的任何一种或多种所述基因序列存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或者整合至微生物染色体中的一个或多个位点上。而且，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述的回路，并且还包含下述中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，如本领域公知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀伤开关回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何杀伤开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的任何表面展示回路，(7)用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢产物(例如，犬尿氨酸、色氨酸、腺苷、精氨酸)的一种或多种回路，(8)一种或多种此类其他回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂联用，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在任何这些实施方式中，包含编码CXCL9的一种或多种基因序列的基因工程化细菌还包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码CXCL9回路的可以与编码如本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码CXCL9的一种或多种基因序列可以与编码如本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码CXCL9的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码CXCL9的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
基质调节
细胞外基质(ECM)成分的积累可以扭曲肿瘤和基质组织的正常结构，导致血液和淋巴管的异常构型。可能有助于肿瘤治疗抗性的一个因素是ECM的刚性，其显著压缩血管，导致灌注减少(由于扩散和对流的限制)，最终阻碍治疗剂向肿瘤细胞的递送。减少基质中的血管压缩和辅助药物递送的一种策略是酶促分解ECM支架，其在一些基质肿瘤环境中由成纤维细胞，免疫细胞和嵌入密集且复杂的ECM中的内皮细胞组成，具有丰富的透明质酸或透明质酸(HA)。。HA是一种大的线性糖胺聚糖(GAG)，由重复的N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸单元组成，由于其高胶体渗透压而保留水。HA在维持组织的结构，完整性和可塑性方面起着重要作用，特别是在胚胎发生和肿瘤发生等动态过程中。据信HA在肿瘤基质形成和维持中起作用。透明质酸酶(PEGPH20；rHuPH20)的酶促HA降解已被证明可降低小鼠胰腺导管腺癌(PDA)肿瘤中的间质液压，同时观察血管通畅，给药和存活(Provenzano等，Cancer Cell,2012,21:418-429；Thompson等，Mol Cancer Ther,2010,9:3052-64)。据信PEGPH20通过将延伸的聚合物裂解成取代基单元而释放与HA结合的水。被困水的释放将组织间液压降低至20-30mmHg的范围，使得小动脉和毛细血管塌陷(Provenzano等)。
在一些实施方式中，工程化细菌包含编码一种或多种调节基质的分子的基因序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码降解透明质酸或透明质酸(HA)的酶的一个或多个拷贝的基因序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码透明质酸酶的一个或多个拷贝的基因序列。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的透明质酸酶。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的透明质酸酶。在又一个实施方式中，基因工程化细菌产生三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的透明质酸酶。
在任何这些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生透明质酸酶的细菌降解0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的透明质酸。
在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌降解1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的透明质酸。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌降解三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的透明质酸。在一个实施方式中，包含一种或多种编码用于分泌的透明质酸酶的基因的基因工程化细菌能够在相同条件下将透明质酸降解至与相同浓度的重组透明质酸酶大约相同的程度。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以分泌透明质酸酶的细菌能够使细胞增殖减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以分泌透明质酸酶的细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以分泌透明质酸酶的细菌能够使肿瘤尺寸缩小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生透明质酸酶的细菌能够使肿瘤体积缩小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生透明质酸酶的细菌能够使肿瘤重量减小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以产生透明质酸酶的细菌能够使应答率增加至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种透明质酸酶的基因序列，其编码选自SEQ ID NO:1127、SEQ ID NO:1128、SEQ ID NO:1129、SEQ ID NO:1130、SEQ IDNO:1131或其功能性片段的一种或多种多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的基因序列，所述多肽与选自SEQ ID NO:1127、SEQ ID NO:1128、SEQ ID NO:1129、SEQID NO:1130、SEQ ID NO:1131或其功能性片段的一种或多种多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的同一性。在一些特定的实施方式中，多肽包含一种或多种选自SEQ ID NO:1127、SEQ ID NO:1128、SEQ ID NO:1129、SEQ ID NO:1130、SEQ ID NO:1131的多肽。在其他特定的实施方式中，多肽由一种或多种选自SEQ ID NO:1127、SEQ ID NO:1128、SEQ ID NO:1129、SEQ ID NO:1130、SEQ ID NO:1131的多肽组成。在某些实施方式中，透明质酸酶序列与一种或多种选自SEQ ID NO:1122、SEQ ID NO:1123、SEQ ID NO:1224、SEQ ID NO:1225、SEQ ID NO:1226或其功能性片段的多核苷酸具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些特定的实施方式中，基因序列包含一种或多种选自SEQ ID NO:1127、SEQ ID NO:1128、SEQ ID NO:1129、SEQ ID NO:1130、SEQ ID NO:1131的序列。在其他特定的实施方式中，基因序列由一种或多种选自SEQ ID NO:1127、SEQ ID NO:1128、SEQ IDNO:1129、SEQ ID NO:1130、SEQ ID NO:1131的多核苷酸组成。
在一些实施方式中，工程化细菌包含编码人透明质酸酶的一个或多个拷贝的基因序列。在一些实施方式中，透明质酸酶是水蛭透明质酸酶。在任何这些实施方式中，包含透明质酸酶的基因序列进一步编码选自PhoA、OmpF、cvaC、TorA、FdnG、DmsA和PelB的分泌标签。在一些实施方式中，分泌标签位于透明质酸酶多肽序列的N末端和透明质酸酶编码序列的5'末端。在一些实施方式中，分泌标签位于透明质酸酶多肽序列的C末端和透明质酸酶编码序列的3'末端。在一个实施方式中，分泌标签是PhoA。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码用于分泌的透明质酸酶。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码用于在细菌细胞表面上展示的透明质酸酶。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含选自lpp、nlP、tolA和PAL的外膜蛋白中的一个或多个缺失。在一些实施方式中，缺失或突变的外膜蛋白是PAL。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在存在癌症和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢产物的情况下，和/或在存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下，和/或在存在肠道中可能存在的代谢产物的情况下，和/或在存在可能存在或不存在于体内，并且可能存在于体外菌株培养、扩增、产生和/或生产过程中的代谢产物(如阿拉伯糖、cumate和水杨酸以及本文所述的其他物质)的情况下，表达任何一种或多种所述的基质调节回路或基因序列(例如，透明质酸酶回路)。在一些实施方式中，可以在体内施用此类诱导剂以诱导效应基因表达。在一些实施方式中，编码基质调节回路(例如，透明质酸酶回路)的一种或多种基因序列被可以由在体内和/或在体外的这些条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被如本文所述的组成型启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被组成型启动子控制，并且在体内和/或体外条件下表达，例如在如本文所述的扩增、产生和/或生产过程中。在一些实施方式中，任何一种或多种所述的基质调节基因序列(例如，透明质酸酶的基因序列)存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或者整合至微生物染色体中的一个或多个位点中。
在任何这些实施方式中，包含编码基质调节效应物(例如，透明质酸酶)的一种或多种基因序列的基因工程化细菌还包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码基质调节效应物(例如，透明质酸酶)的回路可以与编码如本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。
在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码基质调节效应物(例如，透明质酸酶)的一种或多种基因序列可以与编码如本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码基质调节效应物(例如，透明质酸酶)的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码基质调节效应物(例如，透明质酸酶)的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。
在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
而且，在一些实施方式中，基因工程化微生物能够表达任何一种或多种所述的基质调控(例如，透明质酸酶)回路，并且还包含下述中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，如本领域公知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀伤开关回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何杀伤开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的任何表面展示回路，(7)用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢产物(例如，犬尿氨酸、色氨酸、腺苷、精氨酸)的一种或多种回路，(8)一种或多种此类其他回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂联用，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
其他免疫调节剂
其他免疫调节剂包括治疗性核酸(RNA和DNA)，例如，RNAi分子(如siRNA、miRNA、dsRNA)、mRNA、反义分子、适体和CRISPER/Cas 9分子，如在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中所述的，其全部内容通过引用并入本文。因而，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于生产一种或多种免疫调节剂的一种或多种序列，所述免疫调节剂是RNA或DNA调节剂，例如包括选自下述的核酸分子：RNAi分子(siRNA、miRNA、dsRNA)、mRNA、反义分子、适体和CRISPR/Cas9分子。这些分子在下文提供的参考文献中举例说明和讨论。
在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，这些回路可以与用于生产如本文所述的一种或多种免疫引发剂(例如，STING激动剂)的回路组合。
免疫引发剂和免疫维持剂的组合
在一些实施方式中，选择由基因工程化细菌表达的回路以组合多种机制。例如，通过激活肿瘤微环境中的多个正交免疫调节途径，将免疫学上的冷肿瘤转化为免疫上热肿瘤。可以选择多种效应物，其对免疫应答的不同组分具有影响。可以由基因工程化细菌表达的效应物靶向的不同免疫应答组分包括免疫引发和免疫增强以及T细胞扩增(免疫维持)。
在一些实施方式中，可以将生产至少第一免疫调节剂(例如，免疫引发剂或免疫维持剂)的第一修饰微生物与生产至少第二免疫调节剂(例如，免疫引发剂或免疫维持剂)的第二修饰微生物(例如，之前、同时或之后)联合施用。在其他实施方式中，一种或多种免疫调节剂可以与能够生产一种或多种第二免疫调节的修饰微生物(例如，之前、同时或之后)联合施用。例如，一种或多种免疫引发剂可以与能够生产一种或多种免疫维持剂的修饰微生物(例如，之前、同时或之后)联合施用。在另一个实施方式中，一种或多种免疫维持剂可以与能够生产一种或多种免疫引发剂的修饰微生物(例如，之前、同时或之后)联合施用。或者，一种或多种第一免疫引发剂可以与能够生产一种或多种第二免疫引发剂的修饰微生物(例如，之前、同时或之后)联合施用。或者，一种或多种第一免疫维持剂可以与能够生产一种或多种第二免疫维持剂的修饰微生物(例如，之前、同时或之后)联合施用。在一些实施方式中，免疫引发剂和/或免疫维持剂还可以与基质调节剂(例如，透明质酸酶)组合。
在一些实施方式中，一种或多种微生物被基因工程化以表达编码一种或多种免疫调节效应物或者两种或多种这些效应物的组合的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫调节效应物或者两种或多种这些效应物的组合的回路。或者，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含不同的或单独的基因工程化细菌的组合(例如，两种或多种)，每种细菌编码一种或多种免疫调节效应物。此类独特的或不同的细菌菌株可以同时或顺序施用。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含能够调节免疫引发(包括例如激活和初免)和免疫维持(包括例如免疫增强或T细胞扩增)的回路。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫引发剂和一种或多种免疫维持剂的回路或基因序列。
或者，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或多种)，每种细菌编码一种或多种免疫引发剂和/或一种或多种免疫维持剂。此类独特的或不同的细菌菌株可以同时或顺序施用。
本文所述的一种或多种基因序列、回路、效应物、免疫调节剂、免疫引发剂或免疫维持剂的每种组合可以作为在一个细菌菌株中的组合回路，或者替代地在两个或多个不同的或单独的细菌菌株的组合中提供，每个菌株表达一种或多种基因序列、回路、效应物、免疫调节剂、免疫引发剂或免疫维持剂。例如，包含用于生产免疫引发剂的回路和用于生产免疫维持剂的基因回路的一种或多种基因工程化细菌可以在包含这两个回路的一个菌株或者在两个或多个菌株(每个包含至少一个回路)中提供。
在本公开的一些实施方式中，其中对微生物进行基因工程化以表达免疫引发剂回路和免疫维持剂回路，微生物首先生产高水平的免疫刺激剂，并且在随后的时间点生产免疫维持剂。在某些实施方式中，一种或一种基因序列在本领域公知的或本文所述的诱导型启动子的控制下。例如，此类诱导型启动子可以在低氧条件下诱导，如FNR启动子。在一些实施方式中，一种或多种基因序列与诱导型启动子直接或间接地可操作地连接，所述启动子在如本文所述的炎性条件下(例如，RNS、ROS)被诱导。在其他实施方式中，启动子在存在某些分子或代谢产物的情况下被诱导，例如在存在与肿瘤微环境和/或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下。在一些实施方式中，启动子在某些组织类型中被诱导。在一些实施方式中，启动子在存在某些肠道特异性或肿瘤特异性分子或代谢产物的情况下被诱导。在一些实施方式中，启动子在存在一些其他代谢产物的情况下被诱导，所述代谢产物可能存在或可能不存在于肠道或肿瘤中，如阿拉伯糖、cumate和水杨酸或者本领域公知的或本文所述的另一种化学或营养诱导剂。在某些实施方式中，一种或多种表达盒在本文所述的或本领域公知的组成型启动子的控制下，例如其表达可以使用不同强度的核糖体结合位点进行微调。此类微生物任选地还包含营养缺陷型修饰，例如营养缺陷型修饰的氨基酸或核苷酸代谢。可以被修饰的基因的非限制性实例是ThyA和DapA或者这两者(ΔDapA或ΔThyA或者这两者)。
在一些实施方式中，免疫引发剂的表达在由化学诱导剂诱导的启动子的控制下。在一些实施方式中，免疫维持剂是在由化学诱导剂诱导的启动子的控制下。在一些实施方式中，免疫引发剂和免疫维持剂是在由化学诱导剂诱导的启动子的控制下。诱导剂(诱导免疫刺激剂表达)和第二诱导剂(诱导免疫维持剂表达)可以是相同的或不同的诱导剂。第一诱导剂和第二诱导剂可以顺序或同时施用。在一些实施方式中，免疫维持剂和/或免疫引发剂可以在体内条件下诱导，例如通过肠道或肿瘤微环境(例如，低氧、某些营养物质等)条件，在细胞培养或体外生长条件下诱导或者使用化学诱导剂(例如，阿拉伯糖、cumate和水杨酸、IPTG或本文所述的其他化学诱导剂)，其可以在体外或体内施用。
在一些实施方式中，免疫引发剂被诱导型启动子控制或者与其直接或间接地连接，免疫维持剂被组成型启动子控制或者与其直接或间接地连接。在一些实施方式中，免疫引发剂被组成型启动子控制或者与其直接或间接地连接，免疫维持剂被诱导型启动子控制或者与其直接或间接地连接。
在一些实施方式中，这两个回路可以整合至细菌染色体。在一些实施方式中，这两个回路可以存在于质粒上。在一些实施方式中，这两个回路可以存在于质粒上。在一些实施方式中，一个回路可以整合至细菌染色体中和另一个回路可以存在于质粒上。
在另一个实施方式中，表达用于免疫引发的回路的细菌菌株可以与表达用于免疫维持的回路的单独的细菌菌株联合施用。例如，表达免疫抑制回路的基因工程化细菌的一个或多个菌株和表达免疫维持剂回路的基因工程化细菌的一个或多个单独的菌株可以顺序施用，例如可以将免疫刺激剂在免疫维持剂之前施用。在另一个实例中，免疫引发剂菌株可以在免疫维持剂菌株之后施用。在又一个实例中，免疫引发剂菌株可以与免疫维持剂菌株同时施用。
无论施用顺序或时机如何(同时或顺序)，在顺序或同时施用后工程化菌株均可以表达用于免疫维持剂的回路，即使用本文所述的一种或多种机制微调表达时机和水平，所述机制包括但不限于启动子和核糖体结合位点。
在一个更具体的实例中，可以在含有这两个回路的一个菌株中或者在两个或多个菌株(每个均包含至少一个回路)中提供一种或多种基因工程化细菌，所述细菌包含编码用于生产STING激动剂的酶的一种或多种基因序列和编码用于消耗犬尿氨酸的酶的一种或多种基因序列。在施用的一个非限制性实例中，首先施用免疫引发剂生产菌株，然后再施用免疫维持剂生产菌株。在施用的一个更加具体的非限制性实例中，首先施用STING激动剂生产菌株，然后再施用犬尿氨酸消耗菌株。
表7和表8中描述了免疫引发剂和维持剂的非限制性实例。
表7：免疫引发剂
Figure BDA0002364453000002951
表8：免疫维持剂
Figure BDA0002364453000002952
在一些组合实施方式中，表7的一种或多种效应物可与表8的一种或多种效应物组合。
可以选择多种效应物，其对免疫应答的不同组分具有影响。可由一种或多种基因工程化细菌表达的效应物靶向的不同免疫应答组分包括溶瘤、APC的免疫激活、T细胞的激活和初免(“免疫引发剂”)，运输和浸润、免疫增强，T细胞扩增(“免疫维持剂”)。在一些组合实施方式中，“免疫引发剂”与“免疫维持剂”组合。在一些实施方式中，免疫引发剂和/或免疫维持者可进一步与基质调节剂例如透明质酸酶组合。在一些实施方式中，可以组合并同时或依次施用包含编码免疫起始基因和免疫维持者的基因的两种或更多种不同细菌，以及任选的基质调节剂。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生启动免疫反应的效应物或免疫调节剂，即免疫引发剂。本文所述的靶向免疫激活和引发的这样的效应物的非限制性实例包括可溶性SIRPα，抗CD47抗体和抗CD40抗体，CD40-配体，TNF-α，IFN-γ，5-FC至5-FU转化，和STING激动剂。本文所述的用于靶向免疫增强的效应物的非限制性实例包括犬尿氨酸降解，腺苷降解，精氨酸产生，CXCL10，IL-15，IL-12分泌和检查点抑制，例如通过抗PD-1分泌或展示。本文所述的靶向T细胞扩增的效应物的非限制性实例包括抗PD-1和抗PD-L1抗体，抗-CTLA-4抗体和IL-15。
在一个实施方式中，免疫引发剂与免疫维持剂是不同的。作为一个非限制性实例，其中免疫引发剂是IFN-γ，免疫维持剂不是IFN-γ。在一个实施方式中，免疫引发剂与免疫维持剂是不同的。作为一个非限制性实例，其中免疫引发剂是IFN-γ，免疫维持剂不是IFN-γ。
在一个组合的实施方式中，基因工程化细菌包含用于产生一种或多种免疫引发剂的基因序列，其与一种或多种基因序列组合以产生一种或多种免疫维持者。在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物。在一个这样的组合物实施方式中，包含用于产生一种或多种免疫引发剂的基因序列的一种或多种基因工程化细菌可以与一种或多种基因工程化细菌组合，所述细菌包含用于产生一种或多种免疫维持者的基因序列。或者，组合物中的每种细菌可以同时具有免疫维持剂和免疫引发剂。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂可以是趋化因子或细胞因子。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂是趋化因子或细胞因子，一种免疫维持者是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是趋化因子或细胞因子，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是趋化因子或细胞因子，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是趋化因子或细胞因子，并且一种免疫维持者是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是趋化因子或细胞因子，并且一种免疫维持者是代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。在一些实施方式中，趋化因子或细胞因子引发剂选自TNF-α，IFN-γ和IFN-β1。在任何这些实施方式中，免疫维持者或增强剂可选自抗PD-1单链抗体，抗-CTLA4单链抗体，IL-15，CXCL10或代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂可以是单链抗体。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂是单链抗体，一种免疫维持者是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是单链抗体，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是单链抗体，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是单链抗体，一种免疫维持者是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是单链抗体，一种免疫维持者是代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。在任何这些实施方式中，免疫维持者或增强剂可选自抗PD-1单链抗体，抗-CTLA4单链抗体，IL-15，CXCL10或代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂可以是受体配体。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂是受体配体，一种免疫维持者是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是受体配体，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是受体配体，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是受体配体，并且一种免疫维持者是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是受体配体，并且一种免疫维持者是代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。在一些实施方式中，其中一种免疫引发剂是受体配体，免疫引发剂是CD40L。在任何这些实施方式中，免疫维持者或增强剂可选自抗PD-1单链抗体，抗-CTLA4单链抗体，IL-15，CXCL10或代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。在一些实施方式中，受体配体是SIRPα，或其片段，变体或融合蛋白。在任何这些实施方式中，免疫维持者或增强剂可选自抗PD-1单链抗体，抗-CTLA4单链抗体，IL-15，CXCL10或代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂可以是代谢转化剂。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂是代谢转化，一种免疫维持者是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是代谢转化，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是代谢转化，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是代谢转化，一种免疫维持者是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是代谢转化，并且一种免疫维持者是代谢转化，例如选自犬尿氨酸消耗者，色氨酸生产者，精氨酸生产者和腺苷消耗者。在一些实施方式中，引发剂代谢转化是STING激动剂生产者，例如二腺苷酸环化酶，例如DacA。在任何这些实施方式中，免疫维持者或增强剂可选自抗PD-1单链抗体，抗-CTLA4单链抗体，IL-15，CXCL10或代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂可以是工程化免疫疗法。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂是工程化学疗法，一种免疫维持者是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是工程化学疗法，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是工程化学疗法，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是工程化化学疗法，并且一种免疫维持者是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是工程化化学疗法，并且一种免疫维持者是代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。在一些实施方式中，启动子工程化学疗法是5FC至5FU转化，例如通过codA，或其变体或融合蛋白。在任何这些实施方式中，免疫维持者或增强剂可选自抗PD-1单链抗体，抗-CTLA4单链抗体，IL-15，CXCL10或代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者可以是单链抗体。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者是单链抗体，免疫引发剂是细胞因子或趋化因子。在一些实施方式中，一种免疫维持者是单链抗体，免疫引发剂是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是单链抗体，免疫引发剂是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是单链抗体，免疫引发剂是代谢转化。在一些实施方式中，一种免疫维持者是单链抗体，免疫引发剂是工程化学疗法。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是抗PD-1抗体。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是抗CTLA4抗体。在任何这些实施方式中，免疫引发剂可选自TNF-α，IFN-γ，IFN-β1，SIRPα，CD40L，STING激动剂和5FC->5FU。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者可以是受体配体。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者是受体配体，免疫引发剂是细胞因子或趋化因子。在一些实施方式中，一种免疫维持者是受体配体，免疫引发剂是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是受体配体，免疫引发剂是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是受体配体，免疫引发剂是代谢转化。在一些实施方式中，一种免疫维持者是受体配体，免疫引发剂是工程化学疗法。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是PD1或PDL1或CTLA4，或其片段，变体或融合蛋白。在任何这些实施方式中，免疫引发剂可选自TNF-α，IFN-γ，IFN-β1，SIRPα，CD40L，STING激动剂和5FC->5FU。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者可以是细胞因子或趋化因子。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者是细胞因子或趋化因子，免疫引发剂是细胞因子或趋化因子。在一些实施方式中，一种免疫维持者是细胞因子或趋化因子，免疫引发剂是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是细胞因子或趋化因子，免疫引发剂是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是细胞因子或趋化因子，并且免疫引发剂是代谢转化。在一些实施方式中，一种免疫维持者是细胞因子或趋化因子，免疫引发剂是工程化学疗法。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是IL-15，或其片段，变体或融合蛋白。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是CXCL10，或其片段，变体或融合蛋白。在任何这些实施方式中，免疫引发剂可选自TNF-α，IFN-γ，IFN-β1，SIRPα，CD40L，STING激动剂和5FC->5FU。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者可以是代谢转化。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者是代谢转化，免疫引发剂是细胞因子或趋化因子。在一些实施方式中，一种免疫维持者是代谢转化，免疫引发剂是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是代谢转化，免疫引发剂是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是代谢转化，免疫引发剂是代谢转化。在一些实施方式中，一种免疫维持者是代谢转化，免疫引发剂是工程化学疗法。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是犬尿氨酸消耗。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是精氨酸产生。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是腺苷消耗。在任何这些实施方式中，免疫引发剂可选自TNF-α，IFN-γ，IFN-β1，SIRPα，CD40L，STING激动剂和5FC->5FU。
在任何这些组合实施方式中，基因工程化细菌可包含编码用于消耗犬尿氨酸(和任选地产生色氨酸)的酶的基因序列和用于产生免疫引发剂的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的基因序列和用于产生免疫引发剂的基因序列。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是单链抗体。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是受体配体。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是代谢转化，例如STING激动剂生产者，例如二腺苷酸环化酶，例如dacA。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是工程化学疗法，例如，用于将5FC转化为5FU的codA。在一些实施方式中，免疫引发剂选自TNF-α，IFN-γ，IFN-β1，SIRPα，CD40L，STING激动剂和5FC->5FU。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿喹啉酶的基因序列和编码TNF-α的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿嘧啶酶的基因序列和编码IFN-γ的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿喹啉酶的基因序列和编码IFN-β1的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的基因序列和编码本文所述的SIRPα或其变体的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿喹啉酶的基因序列和编码CD40L的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿喹啉酶的基因序列和编码用于产生STING激动剂(例如dacA)的酶的基因序列，用于产生环二-AMP。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的基因序列和编码用于将5FC转化为5FU的酶的基因序列，例如codA或其变体或融合蛋白。在任何这些犬尿氨酸消耗和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，可以缺失trpE。
在任何这些组合实施方式中，基因工程化细菌可包含编码用于产生STING激动剂的酶的基因序列和用于产生免疫维持者的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码例如二腺苷酸环化酶的基因序列，例如dacA，和用于产生免疫维持者的基因序列。在一些实施方式中，与dacA组合的免疫维持者是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，与dacA组合的免疫维持者是单链抗体。在一些实施方式中，免疫维持剂与二腺苷酸环化酶(例如dacA)组合是受体配体。在一些实施方式中，与二腺苷酸环化酶(例如dacA)组合的免疫维持者是代谢转化，例如精氨酸生产者，犬尿氨酸消耗者和/或腺苷消耗者。在一些实施方式中，免疫维持者选自抗PD-1抗体，抗-CTLA4抗体，抗PD-L1抗体，IL-15，CXCL10，精氨酸生产者，腺苷消耗者和犬尿氨酸消耗者。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码dacA的基因序列和编码抗PD-1抗体的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列，例如dacA和编码抗-CTLA4抗体的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码dacA的基因序列和编码IL-15的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列，例如dacA和编码CXCL10的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列，例如dacA和编码用于产生精氨酸的回路的基因序列，例如，如本文所述。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列，例如dacA和编码用于消耗犬尿氨酸的酶的基因序列，例如犬尿激酶，例如来自荧光假单胞菌。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列，例如dacA和编码用于消耗腺苷的酶的基因序列，如本文所述。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，dacA来自单核细胞增多性李斯特氏菌。
在任何这些组合物实施方式中，包含编码用于消耗犬尿氨酸(和任选地产生色氨酸)的酶的基因序列的一种或多种不同的基因工程化细菌可以与包含用于产生免疫引发剂的基因序列的一种或多种不同的基因工程化细菌组合。在一些实施方式中，包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含用于产生免疫引发剂的基因序列。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是单链抗体。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是受体配体。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是代谢转化，例如STING激动剂生产者，例如二腺苷酸环化酶，例如dacA。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是工程化学疗法，例如，用于将5FC转化为5FU的codA。在一些实施方式中，免疫引发剂选自TNF-α，IFN-γ，IFN-β1，SIRPα，CD40L，STING激动剂和5FC->5FU。在一个实施方式中，一种或多种不同的基因工程化细菌包含编码犬尿喹啉酶的基因序列和编码TNF-α的基因序列。在一个实施方式中，将包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种包含编码IFN-γ的基因序列的不同基因工程化细菌组合。在一个实施方式中，将包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种包含编码IFN-β1的基因序列的不同基因工程化细菌组合。在一个实施方式中，将包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码本文所述的SIRPα或其变体的基因序列。在一个实施方式中，将包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种包含编码CD40L的基因序列的不同基因工程化细菌组合。在一个实施方式中，包含编码犬尿喹啉酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码用于产生STING激动剂的酶的基因序列，例如用于生产的dacA。环二正电子。在一个实施方式中，包含编码犬尿喹啉酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码用于将5FC转化为5FU的酶的基因序列，例如codA或变体。或其融合蛋白。在任何这些犬尿氨酸消耗和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，可以缺失trpE。
在任何这些组合物实施方式中，可以包含编码用于产生STING激动剂的酶的基因序列的一种或多种不同的基因工程化细菌可以与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含用于产生免疫维持者的基因序列。在一些实施方式中，将包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌(例如dacA)与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含用于产生免疫维持者的基因序列。在一些实施方式中，免疫维持剂与二腺苷酸环化酶(例如dacA)组合是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，与dacA组合的免疫维持者是单链抗体。在一些实施方式中，免疫维持剂与脱腺苷酸环化酶(例如dacA)组合是受体配体。在一些实施方式中，与二腺苷酸环化酶(例如dacA)组合的免疫维持者是代谢转化，例如精氨酸生产者，犬尿氨酸消耗者和/或腺苷消耗者。在一些实施方式中，免疫维持者选自抗PD-1抗体，抗-CTLA4抗体，IL-15，CXCL10，精氨酸生产者，腺苷消耗者和犬尿氨酸消耗者。在一个实施方式中，将包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌例如dacA与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码抗PD-1抗体的基因序列。在一个实施方式中，将包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌例如dacA与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码抗-CTLA4抗体的基因序列。在一个实施方式中，将包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌(例如dacA)与一种或多种包含编码IL-15的基因序列的不同基因工程化细菌组合。在一个实施方式中，包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌，例如dacA，与包含编码CXCL10的基因序列的一种或多种不同的基因工程化细菌组合。在一个实施方式中，包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌，例如dacA，与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码用于产生精氨酸的回路的基因序列，例如，这里描述的。在一个实施方式中，包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌，例如dacA，与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码用于犬尿氨酸的酶的基因序列，例如犬尿氨酸酶。例如，来自荧光假单胞菌。在一个实施方式中，将包含编码dacA的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码用于消耗腺苷的酶的基因序列，如本文所述。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，dacA来自单核细胞增多性李斯特氏菌。
在癌症免疫循环中，任何一种或多种免疫引发剂可以与任何一种或多种免疫维持剂组合。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生一种或多种免疫引发剂，其调节(例如，强化)癌症免疫循环的一个或多个下述步骤(1)溶瘤，(2)APC的激活和/或(3)T细胞的初免和激活与一种或多种免疫维持剂组合，其调节(例如，激发)一个或多个下述步骤(4)T细胞运输和浸润，(5)由T细胞和/或T细胞支持识别癌细胞和/或(6)克服免疫抑制的能力。本文提供了调节步骤(1)、(2)和(3)的免疫引发剂的非限制性实例。本文提供了调节步骤(4)、(5)和(6)的免疫维持剂的非限制性实例。因此，任何这些示例性免疫调节剂可以是免疫引发剂/免疫维持剂组合的一部分，其能够调节如本文所述的一个或多个癌症免疫循环步骤。因此，包含编码一种或多种免疫引发剂/一种或多种免疫维持剂的组合的基因序列的基因工程化细菌可以调节(例如，如下所述的)癌症免疫循环步骤的组合：步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(4)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(4)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(4)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(2)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(3)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(3)、步骤(4)；步骤(1)、步骤(3)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(3)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)；步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(3)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)；步骤(2)、步骤(3)、步骤(5)；步骤(2)、步骤(3)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(4)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(4)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(1)、步骤(4)；步骤(1)、步骤(5)；步骤(1)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(4)、步骤(5)；步骤(2)、步骤(4)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(2)、步骤(4)；步骤(2)、步骤(5)；步骤(2)、步骤(6)；步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)；步骤(3)、步骤(4)、步骤(6)；步骤(3)、步骤(5)、步骤(6)；步骤(3)、步骤(4)；步骤(3)、步骤(5)；步骤(3)、步骤(6)。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌在低氧条件下生产免疫引发剂和/或免疫维持剂，并且与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，其能够使细胞增殖、肿瘤生长和/或肿瘤体积减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌在组成型启动子的控制下生产免疫引发剂和/或免疫维持剂，并且与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，其能够使细胞增殖、肿瘤生长和/或肿瘤体积减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。
编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码免疫引发剂或免疫维持剂的一种或多种基因序列可以与编码如本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码免疫引发剂或免疫维持剂的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码免疫引发剂或免疫维持剂的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在任何这些实施方式和所有组合实施方式中，可以将工程化细菌与常规癌症疗法联用，如手术、化学疗法、靶向疗法、放射疗法、断层疗法、免疫疗法、癌症疫苗、激素疗法、热疗、干细胞移植(外周血、骨髓和脐血移植)、光动力疗法、溶瘤病毒疗法以及献血和输血。在用于生产免疫调节剂的任何这些实施方式中，可以将一种或多种工程化细菌用于与用于治疗癌症的其他常规免疫疗法联用，如检查点抑制剂、Fc-介导的ADCC、BiTE、TCR、过继细胞疗法(TIL、CAR、NK/NKT等)，以及本文所述的和本领域另外公知的任何其他免疫疗法。在任何这些实施方式中，可以将工程化细菌与癌症或肿瘤疫苗联用。
免疫引发剂和免疫引发剂的组合
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生两种或多种引发剂，其调节(例如，强化)一个或多个下述步骤：(1)、(2)和/或(3)。或者，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或多种)，每种细菌编码一种或多种免疫引发剂。在又一个实施方式中，本公开提供了与能够生产免疫引发剂的修饰微生物联用(例如，之前、同时或之后)的免疫引发剂的施用。此类独特的或不同的组合和/或细菌菌株可以同时或顺序施用。无论施用顺序或时机如何(同时或顺序)，在顺序或同时施用后工程化菌株均可以表达用于免疫维持剂的回路，即使用本文所述的一种或多种机制微调表达时机和水平，所述机制包括但不限于启动子和核糖体结合位点。
在本公开的一些实施方式中，其中对微生物进行基因工程化以表达两种或多种免疫引发剂回路，微生物首先产生较高水平的第一免疫刺激剂，并且在随后的时间点产生第二免疫引发剂。在本公开的一些实施方式中，其中对微生物进行基因工程化以表达两种或多种免疫引发剂回路，微生物同时产生第一免疫刺激剂和第二免疫引发剂。在某些实施方式中，一种或多种基因序列在本领域公知的或本文所述的诱导型启动子的控制下。例如，此类诱导型启动子可以在低氧条件下诱导，如FNR启动子。在一些实施方式中，编码免疫引发剂的一种或多种基因序列直接或间接地可操作地与诱导型启动子连接，所述启动子在如本文所述的炎性条件下(例如，RNS、ROS)被诱导。在其他实施方式中，启动子在存在某些分子或代谢产物的情况下被诱导，例如在存在与肿瘤微环境和/或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下。在一些实施方式中，启动子在某些组织类型中被诱导。在一些实施方式中，启动子在存在某些肠道特异性或肿瘤特异性分子或代谢产物的情况下被诱导。在一些实施方式中，启动子在存在一些其他代谢产物的情况下被诱导，所述代谢产物可能存在或可能不存在于肠道或肿瘤中，如阿拉伯糖、cumate和水杨酸或者本领域公知的或本文所述的另一种化学或营养诱导剂。在某些实施方式中，两种或多种免疫引发剂回路在本文所述的或本领域公知的组成型启动子的控制下，例如其表达可以使用不同强度的核糖体结合位点进行微调。此类微生物任选地还包含营养缺陷型修饰，例如在氨基酸或核苷酸代谢中的营养缺陷型修饰。非限制性实例包括ΔDapA或ΔThyA或者这两者。
控制两种或多种免疫引发剂表达的启动子是相同的或不同的，并且可以由相同的化学或环境诱导剂或者不同的化学或环境诱导剂诱导。第一诱导剂和第二诱导剂可以顺序或同时施用。在一些实施方式中，一种引发剂在低氧启动子的控制下。在一些实施方式中，这两种引发剂在低氧启动子的控制下。在一些实施方式中，一种引发剂在组成型启动子的控制下。在一些实施方式中，这两种引发剂在组成型启动子的控制下。
在一些实施方式中，这两个回路可以整合至细菌染色体中。在一些实施方式中，这两个回路可以存在于质粒上。在一些实施方式中，这两个回路可以存在于质粒上。在一些实施方式中，一个回路可以整合至细菌染色体上和另一个回路可以存在于质粒上。
任何免疫引发剂可以与一种或多种其他相同或不同的免疫引发剂组合，其调节癌症免疫循环中的相同或不同步骤。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够生产一种或多种免疫引发剂，其调节(例如，强化)一个或多个下述步骤：(1)肿瘤细胞的裂解，(2)APC的激活和/或(3)T细胞的初免或激活。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够生产两种或多种引发剂，其调节(例如，强化)一个或多个下述步骤：(1)、(2)和/或(3)。在一些实施方式中，基因工程化细菌生产两种或多种免疫引发剂，其调节(例如，强化)癌症免疫循环的相同步骤。在一个实例中，基因工程化细菌生产两种或多种免疫引发剂，其调节溶瘤(步骤(1))。基因工程化细菌生产两种或多种免疫引发剂，其调节APC的激活(步骤(2))。在一个实例中，基因工程化细菌生产两种或多种免疫引发剂，其调节(例如，增强)T细胞的初免和激活(步骤(3))。在一些实施方式中，基因工程化细菌生产两种或多种免疫引发剂，其调节(例如，强化)相同步骤。在一个非限制性实例中，基因工程化细菌生产一种或多种免疫引发剂，其调节(例如，强化)溶瘤(步骤(1))，和一种或多种免疫引发剂，其调节(例如，强化)APC的激活(步骤(2))。在另一个非限制性实例中，基因工程化细菌生产一种或多种免疫引发剂，其调节(例如，强化)溶瘤(步骤(1))，和一种或多种免疫引发剂，其调节(例如，强化)T细胞的初免和激活(步骤(3))。在另一个非限制性实例中，基因工程化细菌生产一种或多种免疫引发剂，其调节(例如，强化)APC的激活(步骤(2))，和一种或多种免疫引发剂，其调节(例如，强化)T细胞的初免和激活(步骤(3))。在又一个非限制性实例中，基因工程化细菌生产一种或多种免疫引发剂，其调节(例如，强化)步骤(1)溶瘤，一种或多种免疫引发剂，其调节(例如，强化)APC的激活(步骤(2))，和一种或多种免疫引发剂，其调节(例如，强化)T细胞的初免和激活(步骤(3))。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于生产一种或多种免疫引发剂的基因回路，其调节(例如，强化)一个或多个下述步骤：(1)溶瘤，(2)APC的激活和/或(3)T细胞的初免和激活。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫引发剂的一种或多种基因，其调节(例如，强化)一个或多个下述步骤：(1)溶瘤，(2)APC的激活和/或(3)T细胞的初免和激活。可以将任何免疫引发剂与另一种免疫引发剂组合，其调节相同或不同步骤。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码两种或多种引发剂的一种或多种基因序列，其调节(例如，强化)一个或多个下述步骤：(1)溶瘤，(2)APC的激活和/或(3)T细胞的初免和激活。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码两种或多种免疫引发剂的一种或多种基因序列，其调节(例如，强化)相同步骤。在一个实例中，基因工程化细菌包含编码两种或多种免疫引发剂的一种或多种基因序列，其调节步骤(1)肿瘤细胞的裂解(溶瘤)。在一个实例中，基因工程化细菌包含编码两种或多种免疫引发剂的一种或多种基因序列，其调节APC的激活(步骤(2))。在一个实例中，基因工程化细菌包含编码两种或多种免疫引发剂的一种或多种基因序列，其调节T细胞的初免和激活(步骤(3))。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码两种或多种免疫引发剂的一种或多种基因序列，其调节(例如，强化)相同步骤。在一个非限制性实例中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫引发剂(其调节(例如，强化)溶瘤(步骤(1)))和一种或多种免疫引发剂(其调节(例如，强化)APC的激活(步骤(2)))的一种或多种基因序列。在另一个非限制性实例中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫引发剂(其调节(例如，强化)溶瘤(步骤(1)))和一种或多种免疫引发剂(其调节(例如，强化)T细胞的初免和激活(步骤(3)))的一种或多种基因序列。在另一个非限制性实例中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫引发剂(其调节(例如，强化)APC的激活(步骤(2)))和一种或多种免疫引发剂(其调节(例如，强化)T细胞的初免和激活(步骤(3)))的一种或多种基因序列。在又一个非限制性实例中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫引发剂(其调节(例如，强化)溶瘤(步骤(1)))，一种或多种免疫引发剂(其调节(例如，强化)APC的激活(步骤(2)))和一种或多种免疫引发剂(其调节(例如，强化)T细胞的初免和激活(步骤(3)))的一种或多种基因序列。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌在低氧条件下生产两种或多种免疫引发剂，并且与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，其能够使细胞增殖、肿瘤生长和/或肿瘤体积减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌在组成型启动子的控制下生产两种或多种免疫引发剂，并且与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，其能够使细胞增殖、肿瘤生长和/或肿瘤体积减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。
在任何这些实施方式和所有组合实施方式中，可以将工程化细菌与常规癌症疗法联用，如手术、化学疗法、靶向疗法、放射疗法、断层疗法、免疫疗法、癌症疫苗、激素疗法、热疗、干细胞移植(外周血、骨髓和脐血移植)、光动力疗法、溶瘤病毒疗法以及献血和输血。
编码免疫引发剂的回路可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。
在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码免疫引发剂的一种或多种基因序列可以与编码如本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码免疫引发剂的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码免疫引发剂的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。
在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在用于生产免疫调节剂的任何这些实施方式中，可以将一种或多种工程化细菌用于与用于治疗癌症的其他常规免疫疗法联用，如检查点抑制剂、Fc-介导的ADCC、BiTE、TCR、过继细胞疗法(TIL、CAR、NK/NKT等)，以及本文所述的和本领域另外公知的任何其他免疫疗法。在任何这些实施方式中，可以将工程化细菌用于与癌症或肿瘤疫苗联用。
免疫维持剂和免疫维持剂的组合
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够生产两种或多种维持剂，其调节(例如，强化)一个或多个下述步骤：(1)、(2)和/或(3)。或者，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或多种)，每种细菌编码一种或多种免疫维持剂。在又一个实施方式中，本公开提供了与能够生产免疫维持剂的修饰微生物联用(例如，之前、同时或之后)的免疫维持剂的施用。此类独特的或不同的组合和/或细菌菌株可以同时或顺序施用。无论施用顺序或时机如何(同时或顺序)，在顺序或同时施用后工程化菌株均可以表达用于免疫维持剂的回路，即使用本文所述的一种或多种机制微调表达时机和水平，所述机制包括但不限于启动子和核糖体结合位点。
在本公开的一些实施方式中，其中对微生物进行基因工程化以表达两种或多种免疫维持剂回路，微生物首先产生较高水平的第一免疫维持剂，并且在随后的时间点产生第二免疫维持剂。在本公开的一些实施方式中，其中对微生物进行基因工程化以表达两种或多种免疫维持剂回路，微生物同时产生第一免疫刺激剂和第二免疫维持剂。在某些实施方式中，一种或多种基因序列在本领域公知的或本文所述的诱导型启动子的控制下。例如，此类诱导型启动子可以在低氧条件下诱导，如FNR启动子。在一些实施方式中，编码免疫维持剂的一种或多种基因序列直接或间接地可操作地与诱导型启动子连接，所述启动子在如本文所述的炎性条件下(例如，RNS、ROS)被诱导。在其他实施方式中，启动子在存在某些分子或代谢产物的情况下被诱导，例如在存在与肿瘤微环境和/或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下。在一些实施方式中，启动子在某些组织类型中被诱导。在一些实施方式中，启动子在存在某些肠道特异性或肿瘤特异性分子或代谢产物的情况下被诱导。在一些实施方式中，启动子在存在一些其他代谢产物的情况下被诱导，所述代谢产物可能存在或可能不存在于肠道或肿瘤中，如阿拉伯糖、cumate和水杨酸或者本领域公知的或本文所述的另一种化学或营养诱导剂。在某些实施方式中，两种或多种免疫维持剂回路在本文所述的或本领域公知的组成型启动子的控制下，例如其表达可以使用不同强度的核糖体结合位点进行微调。此类微生物任选地还包含营养缺陷型修饰，例如在氨基酸或核苷酸代谢中的营养缺陷型修饰，如ΔDapA或ΔThyA或者这两者。
控制两种或多种免疫维持剂表达的启动子是相同的或不同的，并且可以由相同的化学或环境诱导剂或者不同的化学或环境诱导剂诱导。第一诱导剂和第二诱导剂可以顺序或同时施用。在一些实施方式中，一种维持剂在低氧启动子的控制下。在一些实施方式中，这两种维持剂在低氧启动子的控制下。在一些实施方式中，一种维持剂在组成型启动子的控制下。在一些实施方式中，这两种维持剂在组成型启动子的控制下。
在一些实施方式中，这两个回路可以整合至细菌染色体中。在一些实施方式中，这两个回路可以存在于质粒上。在一些实施方式中，这两个回路可以存在于质粒上。在一些实施方式中，一个回路可以整合至细菌染色体上和另一个回路可以存在于质粒上。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够生产一种或多种免疫维持剂，其调节(例如，激发)，一个或多个下述步骤：(4)T细胞运输和浸润，(5)由T细胞和/或T细胞支持的癌细胞识别和/或(6)克服免疫抑制的能力。可以将任何免疫维持剂与另一种免疫维持剂组合，其调节相同或不同步骤。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够生产两种或多种维持剂，其调节(例如，激发)，一个或多个下述步骤：(4)、(5)和/或(6)。在一些实施方式中，基因工程化细菌生产两种或多种免疫维持剂，其调节(例如，激发)相同步骤。在一个实例中，基因工程化细菌生产两种或多种免疫维持剂，其调节T细胞运输和浸润(步骤(4))。在一个实例中，基因工程化细菌生产两种或多种免疫维持剂，其调节步骤(5)由T细胞和/或T细胞支持的癌细胞识别。在一个实例中，基因工程化细菌生产两种或多种免疫维持剂，其调节(例如，增强)克服免疫抑制的能力(步骤(6))。在一些实施方式中，基因工程化细菌生产两种或多种免疫维持剂，其调节(例如，激发)相同步骤。在一个非限制性实例中，基因工程化细菌生产一种或多种免疫维持剂，其调节(例如，激发)T细胞运输和浸润(步骤(4))，和一种或多种免疫维持剂，其调节(例如，激发)由T细胞和/或T细胞支持的癌细胞识别(步骤(5))。在另一个非限制性实例中，基因工程化细菌生产一种或多种免疫维持剂，其调节(例如，激发)T细胞运输和浸润(步骤(4))，和一种或多种免疫维持剂，其调节(例如，激发)克服免疫抑制的能力(步骤(6))。在另一个非限制性实例中，基因工程化细菌生产一种或多种免疫维持剂，其调节(例如，激发)由T细胞和/或T细胞支持的癌细胞识别(步骤(5))，和一种或多种免疫维持剂，其调节(例如，激发)克服免疫抑制的能力(步骤(6))。在又一个非限制性实例中，基因工程化细菌生产一种或多种免疫维持剂，其调节(例如，激发)步骤(4)T细胞运输和浸润，一种或多种免疫维持剂，其调节(例如，激发)，由T细胞和/或T细胞支持的癌细胞识别(步骤(5))，和一种或多种免疫维持剂，其调节(例如，激发)克服免疫抑制的能力(步骤(6))。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于生产一种或多种免疫维持剂的基因回路，其调节(例如，激发)一个或多个下述步骤：(4)T细胞运输和浸润，(5)由T细胞和/或T细胞支持的癌细胞识别和/或(6)克服免疫抑制的能力。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码一种或多种免疫维持剂的一种或多种基因，其调节(例如，激发)一个或多个下述步骤：(4)T细胞运输和浸润，(5)由T细胞和/或T细胞支持的癌细胞识别和/或(6)克服免疫抑制的能力。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码两种或多种维持剂的一种或多种基因序列，其调节(例如，激发)一个或多个下述步骤：(4)T细胞运输和浸润，(5)由T细胞和/或T细胞支持的癌细胞识别和/或(6)克服免疫抑制的能力。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码两种或多种免疫维持剂的一种或多种基因序列，其调节(例如，激发)相同步骤。在一个实例中，基因工程化细菌包含编码两种或多种免疫维持剂的一种或多种基因序列，其调节T细胞运输和浸润(步骤(4))。在一个实例中，基因工程化细菌包含编码两种或多种免疫维持剂的一种或多种基因序列，其调节由T细胞和/或T细胞支持的癌细胞识别(步骤(5))。在一个实例中，基因工程化细菌包含编码两种或多种免疫维持剂的一种或多种基因序列，其调节克服免疫抑制的能力(步骤(6))。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码两种或多种免疫维持剂的一种或多种基因序列，其调节(例如，激发)相同步骤。在一个非限制性实例中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫维持剂(其调节(例如，激发)T细胞运输和浸润(步骤(4)))和一种或多种免疫维持剂(其调节(例如，激发)由T细胞和/或T细胞支持的癌细胞识别(步骤(5)))的一种或多种基因序列。在另一个非限制性实例中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫调节剂(其调节(例如，激发)T细胞运输和浸润(步骤(4)))和一种或多种免疫调节剂(其调节(例如，激发)克服免疫抑制的能力(步骤(6)))的一种或多种基因序列。在另一个非限制性实例中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫维持剂(其调节(例如，激发)由T细胞和/或T细胞支持的癌细胞识别(步骤(5)))和一种或多种免疫维持剂(其调节(例如，激发)克服免疫抑制的能力(步骤(6)))的一种或多种基因。在又一个非限制性实例中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫维持剂(其调节(例如，激发)T细胞运输和浸润(步骤(4)))、一种或多种免疫维持剂(其调节(例如，激发)由T细胞和/或T细胞支持的癌细胞识别(步骤(5)))和一种或多种免疫维持剂(其调节(例如，激发)克服免疫抑制的能力(步骤(6)))的一种或多种基因序列。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌在低氧条件下生产两种或多种免疫维持剂，并且与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，其能够使细胞增殖、肿瘤生长和/或肿瘤体积减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌在组成型启动子的控制下生产两种或多种免疫维持剂，并且与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，其能够使细胞增殖、肿瘤生长和/或肿瘤体积减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。
编码免疫维持剂的回路可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。
在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码免疫维持剂的一种或多种基因序列可以与编码如本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码免疫维持剂的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码免疫维持剂的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。
在任何这些组合的实施方式中，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在任何这些实施方式和所有组合实施方式中，可以将工程化细菌与常规癌症疗法联用，如手术、化学疗法、靶向疗法、放射疗法、断层疗法、免疫疗法、癌症疫苗、激素疗法、热疗、干细胞移植(外周血、骨髓和脐血移植)、光动力疗法、溶瘤病毒疗法以及献血和输血。在用于生产免疫调节剂的任何这些实施方式中，可以将一种或多种工程化细菌用于与用于治疗癌症的其他常规免疫疗法联用，如检查点抑制剂、Fc-介导的ADCC、BiTE、TCR、过继细胞疗法(TIL、CAR、NK/NKT等)，以及本文所述的和本领域另外公知的任何其他免疫疗法。在任何这些实施方式中，可以将工程化细菌用于与癌症或肿瘤疫苗联用。
STING激动剂的组合
STING激动剂和犬尿氨酸消耗
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码用于产生STING激动剂的酶的基因，其与一种或多种编码用于消耗犬尿氨酸的酶的基因组合。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是c-di-AMP。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码二乙酸酯化环化酶的基因序列与编码犬尿氨酸酶的基因序列的组合。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增多性李斯特氏菌。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增多性李斯特菌，犬尿嘧啶酶来自荧光假单胞菌。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是环二-GAMP。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码c-di-GAMP合酶的基因序列以及编码犬尿氨酸酶的基因序列。在一个实施方式中，c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌。在一个实施方式中，cGAS是人cGAS。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌，而犬尿喹啉酶来自荧光假单胞菌。在一个特定的实施方式中，c-二-GAMP合酶是人cGAS和犬尿氨酸酶是来自荧光假单胞菌的。在一个特定的实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶是染色体整合的，并且在组成型启动子的控制下。
在一些实施方式中，本公开的微生物经基因工程化以表达编码用于生产STING激动剂的一种或多种酶的一种或多种基因序列和另外地用于表达犬尿氨酸消耗酶的一种或多种基因序列。用于生产STING激动剂的此类酶的非限制性实例包括dacA，例如来自单核细胞增多性李斯特氏菌的。此类犬尿氨酸消耗酶的非限制性实例包括犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸)。更一般地，可以将免疫引发剂回路(STING激动剂生产剂或本文所述的其他物质)与免疫维持剂(例如，犬尿氨酸消耗剂或本文所述的其他物质)组合。
在本公开的一些实施方式中，其中微生物经基因工程化以表达STING激动剂和犬尿氨酸消耗回路，微生物首先生产较高水平的STING激动剂生产酶(例如，DacA，例如来自单核细胞增多性李斯特氏菌)和在较晚的时间点生产犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌)。在一些实施方式中，STING激动剂生产酶(例如，dacA)的表达是由诱导剂诱导的。在一些实施方式中，犬尿氨酸酶是由诱导剂诱导的。在一些实施方式中，STING激动剂生产酶(例如，dacA)和犬尿氨酸酶是由一种或多种诱导剂诱导的。第一诱导剂(例如，诱导dacA表达)和第二诱导剂(例如，诱导犬尿氨酸酶表达)可以是相同的或不同的诱导剂。第一和第二诱导剂可以顺序或同时施用。诱导剂的非限制性实例包括肠道或肿瘤微环境(例如，低氧、某些营养物质等)的条件，在细胞培养过程中的某些体外条件或化学诱导剂(例如，阿拉伯糖、cumate和水杨酸、IPTG或本文所述的其他化学诱导剂)，其可以在体外或体内加入。在其他实施方式中，STING激动剂生产酶(例如，dacA)和犬尿氨酸酶被组成型启动子控制或者与其直接或间接地连接，包括但不限于本文所述的那些。在一些实施方式中，STING激动剂生产酶(例如，dacA)被诱导型启动子控制或者与其直接或间接地连接，以及犬尿氨酸酶被组成型启动子控制或者与其直接或间接地连接。在一些实施方式中，STING激动剂生产酶(例如，dacA)被组成型启动子控制或者与其直接或间接地连接，以及犬尿氨酸酶被诱导型启动子控制或者与其直接或间接地连接。在一些实施方式中，这两个回路可以整合至细菌染色体中。在一些实施方式中，这两个回路可以存在于质粒上。在一些实施方式中，这两个回路可以存在于质粒上。在一些实施方式中，一个回路可以整合至细菌染色体上和另一个回路可以存在于质粒上。
在又一个实施方式中，表达STING激动剂生产回路(例如，dacA)的基因工程化细菌的一种或多种菌株和表达犬尿氨酸消耗回路(例如，犬尿氨酸酶)的基因工程化细菌的一种或多种独立的菌株可以顺序施用，例如STING激动剂生产剂可以在犬尿氨酸消耗剂之前施用。在其他实施方式中，STING激动剂生产剂可以在犬尿氨酸消耗剂之后施用。在又一个实施方式中，STING激动剂生产剂可以与犬尿氨酸消耗剂同时施用。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码用于产生STING激动剂的酶的一种或多种基因和包含一种或多种编码用于消耗犬尿氨酸的酶的基因的基因工程化细菌。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是c-di-AMP。在一个实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含编码二乙二醇化环化酶的基因序列和包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的基因工程化细菌。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增多性李斯特氏菌。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增多性李斯特菌，犬尿嘧啶酶来自荧光假单胞菌。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是环二-GAMP。在一个实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含编码c-di-GAMP合酶的基因序列和包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的基因工程化细菌。在一个实施方式中，c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌。在一个特定的实施方式中，c-二-GAMP合酶来自霍乱弧菌和犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于生产人cGAS的序列。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，c-di-GAMP合酶是cGAS，而犬尿喹啉酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。
在任何这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的STING激动剂(例如环状二-AMP)。
在任何这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％犬尿氨酸45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或90％至100％更多的犬尿氨酸。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的STING激动剂。例如，环状二-AMP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的STING激动剂，例如环二磷酸腺苷。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的犬尿氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的犬尿氨酸。
在任何这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或90％至100％更多的ATP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的ATP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的ATP。
在非限制性实例中，可以测量血液中犬尿氨酸水平的降低情况，作为表达犬尿氨酸的菌株活性的指标。
在任何这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的色氨酸。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌使犬尿氨酸消耗率增加0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌使犬尿氨酸消耗速率增加1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌使犬尿氨酸消耗速率增加约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍。
在一个实施方式中，在4小时后，相对于相同条件下的相同细菌亚型的未修饰细菌，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗增加约80％至100％。在一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使犬尿氨酸消耗增加约90％至100％。在一个具体实施方式中，4小时后，在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约99％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使犬尿氨酸消耗增加约10-50倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使犬尿氨酸消耗增加约50-100倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使犬尿氨酸消耗增加约100-500倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使犬尿氨酸消耗增加约500-1000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使犬尿氨酸消耗增加约1000-5000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使犬尿氨酸消耗增加约5000-10000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使犬尿氨酸消耗增加约10000-1000倍。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使STING激动剂的产生率增加0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使STING激动剂的产生率增加1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使STING激动剂的产生速率增加约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一个实施方式中，4小时后，基因工程化细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使STING激动剂产量增加约80％至100％。在一个实施方式中，在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产生增加约90％至100％。在一个具体实施方式中，4小时后，在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产生增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，4小时后，在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌，基因工程化细菌使STING激动剂产量增加约99％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约10-50倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约50-100倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约100-500倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约500-1000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使STING激动剂产量增加约1000-5000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使STING激动剂产量增加约5000-10000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使STING激动剂产量增加约10000-1000倍。
在这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗的任何实施方式中，基因工程细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比能够将细胞增殖降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在这些STING激动剂产生和犬尿氨酸消耗的任何实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤生长降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在这些STING激动剂产生和犬尿氨酸消耗的任何实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤大小降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在这些STING激动剂产生和犬尿氨酸消耗的任何实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在这些STING激动剂产生和犬尿氨酸消耗的任何实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗的实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在存在癌症和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢产物的情况下，和/或在存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下，和/或在存在肠道中可能存在的代谢产物的情况下，和/或在存在可能存在或不存在于体内，并且可能存在于体外菌株培养、扩增、产生和/或生产过程中的代谢产物(如阿拉伯糖、cumate和水杨酸以及本文所述的其他物质)的情况下，表达任何一种或多种所述的用于降解腺苷和犬尿氨酸的回路。在一些实施方式中，可以在体内施用此类诱导剂以诱导效应基因表达。在一些实施方式中，编码用于生产STING激动剂和降解犬尿氨酸的回路的一种或多种基因被可以由此类条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被如本文所述的组成型启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在如本文所述的扩增、产生和/或生产过程中。
在任何这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗的实施方式中，任何一种或多种所述的STING激动剂生产回路和犬尿氨酸消耗回路存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或者整合至微生物染色体中的一个或多个位点中。而且，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述的回路并且还包含下述中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，如本领域公知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如thyA和/或dapA营养缺陷型，(2)一种或多种杀伤开关回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何杀伤开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的任何表面展示回路，(7)用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢产物(例如，犬尿氨酸、色氨酸、腺苷、精氨酸)的一种或多种回路，(8)一种或多种此类其他回路的组合。
在任何这些实施方式中，一种或多种基因工程化以生产STING激动剂和消耗犬尿氨酸的细菌可以单独施用或者与一种或多种本文所述的免疫检查点抑制剂联用，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。在任何这些实施方式中，可以对一种或多种经基因工程化以生产STING激动剂和消化犬尿氨酸的细菌进行基因工程化以生产和分泌或在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫检查点抑制剂，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在任何这些实施方式中，一种或多种基因工程化以生产STING激动剂和消耗犬尿氨酸的细菌可以单独施用或者与一种或多种本文所述的免疫刺激激动剂联用，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。在任何这些实施方式中，可以对一种或多种经基因工程化以生产STING激动剂和消化犬尿氨酸的细菌进行基因工程化以生产和分泌或在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。
在某些实施方式中，可以对表达任何一种或多种所述的用于生产一种或多种STING激动剂盒一种或多种犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌)的回路的一种或多种基因工程化细菌进行基因工程化以生产和分泌或在其表面上展示本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码DacA(例如，来自单核细胞增多性李斯特氏菌)的一种或多种基因序列，其中DacA与可以在低氧条件下诱导的启动子(例如，FNR启动子)可操作地连接。包含编码dacA的基因序列的细菌包含在dapA中的突变或缺失。一种或多种基因工程化细菌还包含编码来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的基因序列，并且包含编码犬尿氨酸的基因序列的细菌还包含在TrpE中的突变或缺失。在某些实施方式中，dacA和犬尿氨酸酶序列整合至细菌染色体中。在一个特定的实施方式中，一种或多种基因工程化的细菌还可以包含在ThyA中的一个或多个突变或缺失。在一个特定的实施方式中，检查点抑制剂是PD-1。在一个特定的实施方式中，检查点抑制剂是PD-L1。在一个特定的实施方式中，检查点抑制剂是CTLA-4。
在一个实施方式中，dacA回路(例如，来自单核细胞增多性李斯特氏菌，例如在低氧启动子的控制下和染色体整合的)，犬尿氨酸回路(例如，来自荧光假单胞菌，例如在组成型启动子的控制下和染色体整合的)和营养缺陷型突变(在TrpE、DapA和ThyA中的突变或缺失)和检查点抑制剂分泌或展示回路(例如，在组成型启动子或诱导型启动子的控制下和染色体整合的)被组合在一个细菌中。在一个替代的实施方式中，细菌组合物包含含有编码dacA(例如，来自单核细胞增多性李斯特氏菌，例如在低氧启动子的控制下和染色体整合的)基因序列的第一细菌，还包含在DapA中的突变或缺失，和任选地在ThyA中的突变或缺失，以及包含编码犬尿氨酸回路(例如，来自荧光假单胞菌，例如在组成型启动子的控制下和染色体整合的)的基因序列的第二细菌，在TrpE中的突变或缺失，以及任选地在ThyA中的突变或缺失。组合物还包含经工程化以分泌或展示检查点抑制剂的第三细菌。或者，对第一或第二细菌进行工程化以分泌或展示检查点抑制剂。
在任何这些组合的实施方式中，其中基因工程化细菌编码用于生产一种或多种STING激动剂的回路，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，其中基因工程化细菌编码用于生产一种或多种STING激动剂的回路，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
STING激动剂和腺苷消耗
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码用于产生STING激动剂的酶的基因，其与一种或多种编码用于消耗腺苷的酶的基因组合。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是c-di-AMP。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码二乙酸酯化环化酶的基因序列以及编码腺苷降解途径的基因序列。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增多性李斯特氏菌。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，所述二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增多性李斯特氏菌，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在一个实施方式中，产生的STING激动剂是环二-GAMP。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码c-di-GAMP合酶的基因序列以及编码腺苷降解途径的基因序列。在一个实施方式中，c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌。在一个实施方式中，c-di-GAMP合酶是人cGAS。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个特定的实施方式中，c-二-GAMP合酶来自霍乱弧菌，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA、xdhB、xdhC、add、xapA、deoD和nupC，例如来自E.coli。在一个特定的实施方式中，c-二-GAMP合酶来自人cGAS，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA、xdhB、xdhC、add、xapA、deoD和nupC，例如来自E.coli。在一个具体实施方式中，编码腺苷降解途径的基因是染色体整合的并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码用于产生STING激动剂的酶的一种或多种基因，所述基因包括基因工程化细菌，所述细菌包含编码用于消耗腺苷的酶的一种或多种基因。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是c-di-AMP。在一个实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含编码二乙二醇化环化酶的基因序列与基因工程化细菌的组合，所述基因工程化细菌包含编码腺苷降解途径的基因序列。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增多性李斯特氏菌。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，所述二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增多性李斯特氏菌，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在一个实施方式中，产生的STING激动剂是环二-GAMP。在一个实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含编码c-di-GAMP合酶的基因序列与基因工程化细菌的组合，所述基因工程化细菌包含编码腺苷降解途径的基因序列。在一个实施方式中，c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌。在一个实施方式中，c-二-GAMP合酶是人cGAS。
在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个特定的实施方式中，c-二-GAMP合酶来自霍乱弧菌，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA、xdhB、xdhC、add、xapA、deoD和nupC，例如来自E.coli。在一个特定的实施方式中，c-二-GAMP合酶是人cGAS，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA、xdhB、xdhC、add、xapA、deoD和nupC，例如来自E.coli。在一个具体实施方式中，编码腺苷降解途径的基因是染色体整合的并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌产生至少约0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的STING激动剂，例如环-二-AMP。
在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的腺苷。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的STING激动剂，例如，环-二-AMP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的STING激动剂，例如环二磷酸腺苷。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的腺苷。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多腺苷。
在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的ATP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的腺苷。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多ATP。
在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌产生至少约0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的尿酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的尿酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的尿酸。
在这些STING激动剂产生和腺苷消耗的任何实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比能够将细胞增殖降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在这些STING激动剂产生和腺苷消耗的任何实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤生长降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在这些STING激动剂产生和腺苷消耗的任何实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤大小降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在这些STING激动剂产生和腺苷消耗的任何实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在这些STING激动剂产生和腺苷消耗的任何实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量降低至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些STING激动剂生产和腺苷消耗的实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在存在癌症和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢产物的情况下，和/或在存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下，和/或在存在肠道中可能存在的代谢产物的情况下，和/或在存在可能存在或不存在于体内，并且可能存在于体外菌株培养、扩增、产生和/或生产过程中的代谢产物(如阿拉伯糖、cumate和水杨酸以及本文所述的其他物质)的情况下，表达任何一种或多种所述的用于生产STING激动剂和降解腺苷的回路。在一些实施方式中，可以在体内施用此类诱导剂以诱导效应基因表达。在一些实施方式中，编码用于生产STING激动和降解腺苷的回路的一种或多种序列被可以由此类条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被如本文所述的组成型启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在如本文所述的扩增、产生和/或生产过程中。
在任何这些生产STING激动剂和消耗腺苷的实施方式中，任何一种或多种所述的STING激动剂生产回路和腺苷消耗回路存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或者整合至微生物染色体中的一个或多个位点中。而且，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述的回路并且还包含下述中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，如本领域公知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如thyA和/或dapA营养缺陷型，(2)一种或多种杀伤开关回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何杀伤开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的任何表面展示回路，(7)用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢产物(例如，犬尿氨酸、色氨酸、腺苷、精氨酸)的一种或多种回路，(8)一种或多种此类其他回路的组合。
在任何这些实施方式中，一种或多种基因工程化以生产STING激动剂和消耗犬尿氨酸的细菌可以单独施用或者与一种或多种本文所述的免疫检查点抑制剂联用，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。在任何这些实施方式中，可以对一种或多种基因工程化以生产STING激动剂和消耗腺苷的细菌进行基因工程化以生产和分泌或在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫检查点抑制剂，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在任何这些实施方式中，一种或多种基因工程化以生产STING激动剂和消耗腺苷的细菌可以单独施用或者与一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂联用，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。在任何这些实施方式中，可以对一种或多种基因工程化以生产STING激动剂和消耗腺苷的细菌进行基因工程化以生产和分泌或在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。
STING激动剂和精氨酸生产/氨消耗
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码用于产生STING激动剂的酶的基因，其与一种或多种编码用于产生精氨酸和/或消耗氨的酶的基因组合。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是c-di-AMP。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码二乙酸酯化环化酶的基因序列以及编码精氨酸产生和/或氨消耗途径的基因序列。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增多性李斯特氏菌。在一个实施方式中，编码精氨酸产生和/或氨消耗回路的基因序列包含反馈抗性ArgA(ArgAfbr)和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失。在一个实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码用于产生STING激动剂的酶的一种或多种基因，所述基因与包含一种或多种编码用于产生精氨酸的酶的基因的基因工程化细菌组合。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是c-di-AMP。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码二乙二醇化环化酶的基因序列以及包含编码精氨酸产生途径的基因序列的基因工程化细菌。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增多性李斯特氏菌。在一个实施方式中，编码精氨酸产生回路的基因序列包含反馈抗性ArgA(ArgAfbr)和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失。在一个实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。
在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产和/或氨消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多STING激动剂(例如环状二-AMP)。
在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产和/或氨消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌产生至少约0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多精氨酸。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的STING激动剂。例如，环状二-AMP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的STING激动剂，例如环二磷酸腺苷。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的精氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的精氨酸。
在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产和/或氨消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的ATP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的精氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的谷氨酸。
在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产和/或氨消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的谷氨酸。
在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产和/或氨消耗的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗0％至2％、2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的氨。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的氨。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的氨。
在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产和/或氨消耗的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使细胞增殖减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产和/或氨消耗的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产和/或氨消耗的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤尺寸缩小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产和/或氨消耗的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤体积缩小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产和/或氨消耗的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤重量减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。
在一些STING激动剂生产和精氨酸生产/氨消耗的实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在存在癌症和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢产物的情况下，和/或在存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下，和/或在存在肠道中可能存在的代谢产物的情况下，和/或在存在可能存在或不存在于体内，并且可能存在于体外菌株培养、扩增、产生和/或生产过程中的代谢产物(如阿拉伯糖、cumate和水杨酸以及本文所述的其他物质)的情况下，表达用于STING激动剂生产和精氨酸生产/氨消耗的任何一种或多种所述的回路在一些实施方式中，可以在体内施用此类诱导剂以诱导效应基因表达。在一些实施方式中，编码用于STING激动剂生产和精氨酸生产/消耗的回路的一种或多种基因序列被可以由此类条件和/或诱导剂诱导的启动子的控制下在一些实施方式中，一种或多种基因序列被如本文所述的组成型启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在如本文所述的扩增、产生和/或生产过程中。
在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产/氨消耗的实施方式中，任何一种或多种所述的STING激动剂生产回路和精氨酸生产/氨消耗回路存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或者整合至微生物染色体中的一个或多个位点中。而且，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述的回路并且还包含下述中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，如本领域公知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如thyA和/或dapA营养缺陷型，(2)一种或多种杀伤开关回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何杀伤开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的任何表面展示回路，(7)用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢产物(例如，犬尿氨酸、色氨酸、腺苷、精氨酸)的一种或多种回路，(8)一种或多种此类其他回路的组合。
在任何这些实施方式中，可以将一种或多种经基因工程化以生产STING激动剂和生产精氨酸和/或消耗氨的细菌单独施用或与一种或多种本文所述的免疫检查点抑制剂联用，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。在任何这些实施方式中，可以对一种或多种经基因工程化以生产STING激动剂和生产精氨酸和/或消耗氨的细菌进行基因工程化以生产和分泌或在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫检查点抑制剂，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在任何这些实施方式中，可以将一种或多种经基因工程化以生产STING激动剂和生产精氨酸和/或消耗氨的细菌单独施用或与一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂联用，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。在任何这些实施方式中，可以对一种或多种经基因工程化以生产STING激动剂和生产精氨酸和/或消耗氨的细菌进行基因工程化以以生产和分泌或在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。
在某些实施方式中，表达任何一种或多种所述的用于生产一种或多种STINg激动剂和一种或多种犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌的)的回路的一种或多种基因工程化细菌还包含用于分泌或展示检查点抑制剂(例如，抗-PD-1、抗-PD-L1或抗-CTLA-4)的回路。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码DacA(例如，来自单核细胞增多性李斯特氏菌的)的一种或多种序列，其中DacA与可以在低氧条件下诱导的启动子(例如，FNR启动子)可操作地连接。包含编码dacA的基因序列的细菌包含在dapA中的突变或缺失。一种或多种基因工程化细菌还包含编码反馈抗性ArgA的基因序列，以及包含编码反馈抗性ArgA的基因序列的细菌还包含在ArgA中的突变或缺失。在某些实施方式中，dacA和反馈抗性ArgA序列整合至细菌染色体中。在一个特定的实施方式中，一种或多种基因工程化细菌还可以包含在ThyA中的一种或多种突变或缺失。在一个特定的实施方式中，检查点抑制剂是PD-1。在一个特定的实施方式中，检查点抑制剂是PD-L1。在一个特定的实施方式中，检查点抑制剂是CTLA-4。检查点抑制剂可以在组成型或诱导型启动子的控制下。
在一个实施方式中，dacA回路(例如，来自单核细胞增多性李斯特氏菌的，例如在低氧启动子的控制下和染色体整合的)，精氨酸生产/氨消耗回路(例如，包含ArgAfbr，例如在低氧诱导型启动子的控制下以及是染色体整合的和ΔArgR)，用于分泌或展示检查点抑制剂(例如，抗-PD-1、抗-PD-L1或抗-CTLA-4)的回路和营养缺陷型突变(在dapA和ThyA中的突变或缺失)被组合在一个细菌中，在一个替代的实施方式中，细菌组合物包含第一细菌，其包含编码dacA(例如，来自单核细胞增多性李斯特氏菌的，例如在低氧启动子的控制下和染色体整合的)的基因序列，还包含在DapA中的突变或缺失，以及可选地在ThyA中的突变或缺失，和第二细菌，其包含编码精氨酸生产/氨消耗回路的基因序列(例如，包含ArgAfbr，例如在低氧诱导型启动子的控制下以及是染色体整合的和ΔArgR)和可选地在ThyA中的突变或缺失。组合物还包含经工程化以分泌或展示检查点抑制剂的第三细菌。或者，将第一或第二细菌工程化以分泌或展示检查点抑制剂。
STING激动剂和检查点抑制剂
在一些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌编码用于生产一种或多种STING激动剂的酶的一种或多种基因与编码一种或多种检查点抑制剂(例如，抗-PD-1、抗-PD-L1和/或抗-CTLA4抗体)的一种或多种基因的组合。在一些实施方式中，抗体是从细菌中分泌的。在一些实施方式中，抗体展示在细菌表面上。在一个实施方式中，生产的STING激动剂是c-二-AMP。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列和编码一种或多种检查点抑制剂(例如，抗-PD-1、抗-PD-L1和/或抗-CTLA4抗体)的基因序列的组合。在一些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌还包含DOM(可扩散外膜)突变(例如，ΔPAL)，以改善检查点抑制剂的分泌。在一个实施方式中，二腺苷酸环化酶来自单核细胞增多性李斯特氏菌。在一个实施方式中，检查点抑制剂是PD-1。在一个实施方式中，检查点抑制剂是PD-L1。在一个实施方式中，检查点抑制剂是CTLA-4。在一个特定的实施方式中，检查点抑制剂基因回路整合至染色体中并且在低氧启动子(例如，FNR)的控制下。
在替代的实施方式中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或多种)，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一个实施方式中，组合物包含含有编码用于生产一种或多种STING激动剂的一种或多种基因序列的基因工程化细菌与含有编码一种或多种检查点抑制剂(例如，抗-PD-1、抗-PD-L1和/或抗-CTLA4抗体)的一种或多种基因的基因工程化细菌的组合。在一个实施方式中，所生产的STING激动剂是c-二-AMP。在一个实施方式中，组合物包含含有编码二腺苷酸环化酶的基因序列的基因工程化细菌与含有编码一种或多种检查点抑制剂(例如，抗-PD-1、抗-PD-L1和/或抗-CTLA4抗体)的基因序列的基因工程化细菌的组合。在一些实施方式中，编码基因工程化细菌的检查点抑制剂还包含DOM(可扩散外膜)突变(例如，ΔPAL)，以改善检查点抑制剂的分泌。在一个实施方式中，二腺苷酸环化酶来自单核细胞增多性李斯特氏菌。在一个实施方式中，检查点抑制剂是PD-1。在一个实施方式中，检查点抑制剂是PD-L1。在一个实施方式中，检查点抑制剂是CTLA-4。在一个特定的实施方式中，检查点抑制剂基因回路整合至染色体中并且在低氧启动子(例如，FNR)的控制下。
在任何生产这些STING激动剂和检查点抑制剂的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的STING激动剂(例如，环-二-AMP)。
在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的STING激动剂(例如，环-二-AMP)。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的STING激动剂(例如，环-二-AMP)。
在任何生产这些STING激动剂和检查点抑制剂的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗0％至2％、2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的ATP。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的精氨酸。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的谷氨酸。
在任何生产这些STING激动剂和检查点抑制剂的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使细胞增殖减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在任何生产这些STING激动剂和检查点抑制剂的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在任何生产这些STING激动剂和检查点抑制剂的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤尺寸缩小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在任何生产这些STING激动剂和检查点抑制剂的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤体积缩小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在任何生产这些STING激动剂和检查点抑制剂的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤重量减轻至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。
在任何生产这些STING激动剂和检查点抑制剂的实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在存在癌症和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢产物的情况下，和/或在存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下，和/或在存在肠道中可能存在的代谢产物的情况下，和/或在存在可能存在或不存在于体内，并且可能存在于体外菌株培养、扩增、产生和/或生产过程中的代谢产物(如阿拉伯糖、cumate和水杨酸以及本文所述的其他物质)的情况下，表达用于生产STING激动剂和生产检查点抑制剂(例如，生产抗-PD-1、抗-PD-L1和/或抗-CTLA4)的任何一种或多种所述的回路。在一些实施方式中，可以在体内施用此类诱导剂以诱导效应基因表达。在一些实施方式中，编码用于生产STING激动剂和生产检查点抑制剂(例如，生产抗-PD-1、抗-PD-L1和/或抗-CTLA4)的回路的一种或多种基因序列被可以由此类条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被如本文所述的组成型启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在如本文所述的扩增、产生和/或生产过程中。
在任何这些生产STING激动剂和生产检查点抑制剂(例如，抗-PD-1、抗-PD-L1和/或抗-CTLA4)的实施方式中，任何一种或多种所述的STING激动剂生产回路和检查点抑制剂生产回路存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或者整合至微生物染色体中的一个或多个位点中。而且，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述的回路并且还包含下述中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，如本领域公知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如thyA和/或dapA营养缺陷型，(2)一种或多种杀伤开关回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何杀伤开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的任何表面展示回路，(7)用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢产物(例如，犬尿氨酸、色氨酸、腺苷、精氨酸)的一种或多种回路，(8)一种或多种此类其他回路的组合。
在任何这些实施方式中，一种或多种经基因工程化以生产STING激动剂并且包含检查点抑制剂生产回路的细菌可以单独施用或与一种或多种本文所述的免疫检查点抑制剂联用，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。在任何这些实施方式中，可以对经基因工程化以生产STING激动剂并且包含检查点抑制剂生产回路的细菌进行基因工程化以生产和分泌或在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫检查点抑制剂，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在任何这些实施方式中，一种或多种经基因工程化以生产STING激动剂并且包含检查点抑制剂生产回路的细菌可以单独施用或者与一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂联用，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。在任何这些实施方式中，可以对经基因工程化以生产STING激动剂并且包含检查点抑制剂生产回路的细菌进行基因工程化以生产和分泌或在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。
STING激动剂和免疫刺激性激动剂
在一些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码用于生产一种或多种STING激动剂的一种或多种基因与编码一种或多种免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR抗体)的一种或多种基因的组合。在一些实施方式中，抗体由细菌分泌。在一些实施方式中，抗体展示在细菌表面上。在一个实施方式中，所生产的STING激动剂是c-二-AMP。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码二腺苷酸环化酶的基因序列与编码一种或多种免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR抗体)的基因序列的组合。在一些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌还包含DOM(可扩散外膜)突变(例如，ΔPAL)，以改善检免疫刺激性激动剂的分泌。在一个实施方式中，二腺苷酸环化酶来自单核细胞增多性李斯特氏菌。在一个实施方式中，免疫刺激性激动剂是OX40。在一个实施方式中，免疫刺激性激动剂是41BB。在一个实施方式中，免疫刺激性激动剂是GITR。在一个特定的实施方式中，检测点抑制基因回路整合至染色体中并且在低氧启动子(例如，FNR)的控制下。
在替代的实施方式中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或多种)，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一个实施方式中，组合物包含含有用于生产一种或多种STING激动剂的一种或多种基因的基因工程化细菌与含有编码一种或多种免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR抗体)的一种或多种基因的基因工程化细菌的组合。在一个实施方式中，所生产的STING激动剂是c-二-AMP。在一个实施方式中，组合物包含含有编码二腺苷酸环化酶的基因序列的基因工程化细菌与含有编码一种或多种免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR抗体)的基因序列的基因工程化细菌的组合。在一些实施方式中，编码免疫刺激性激动剂的基因工程化细菌还包含DOM(可扩散外膜)突变(例如，ΔPAL)，以改善检免疫刺激性激动剂的分泌。在一个实施方式中，二腺苷酸环化酶来自单核细胞增多性李斯特氏菌。在一个实施方式中，免疫刺激性激动剂是OX40。在一个实施方式中，免疫刺激性激动剂是41BB。在一个实施方式中，免疫刺激性激动剂是GITR。在一个特定的实施方式中，检测点抑制基因回路整合至染色体中并且在低氧启动子(例如，FNR)的控制下。
在任何这些生产STING激动剂和生产免疫刺激性激动剂的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的STING激动剂(例如，环-二-AMP)。
在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的STING激动剂(例如，环-二-AMP)。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌产生约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的STING激动剂(例如，环-二-AMP)。
在任何这些生产STING激动剂和免疫刺激性激动剂的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗0％至2％、2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的ATP。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的精氨酸。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的谷氨酸。
在任何这些生产STING激动剂和免疫刺激性激动剂的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使细胞增殖减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在任何这些生产STING激动剂和免疫刺激性激动剂的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在任何这些生产STING激动剂和免疫刺激性激动剂的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤尺寸缩小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在任何这些生产STING激动剂和免疫刺激性激动剂的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤体积缩小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在任何这些生产STING激动剂和免疫刺激性激动剂的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌能够使肿瘤重量减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。
在任何这些生产STING激动剂和免疫刺激性激动剂的实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在存在癌症和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢产物的情况下，和/或在存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢产物的情况下，和/或在存在肠道中可能存在的代谢产物的情况下，和/或在存在可能存在或不存在于体内，并且可能存在于体外菌株培养、扩增、产生和/或生产过程中的代谢产物(如阿拉伯糖、cumate和水杨酸以及本文所述的其他物质)的情况下，表达用于生产STING激动剂和生产免疫刺激性激动剂(例如，生产抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的任何一种或多种所述的回路。在一些实施方式中，可以在体内施用此类诱导剂以诱导效应基因表达。在一些实施方式中，编码用于生产STING激动剂和生产免疫刺激性激动剂(例如，生产抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的回路的一种或多种基因序列被可以由此类条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被如本文所述的组成型启动子控制。在一些实施方式中，一种或多种基因序列被组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在如本文所述的扩增、产生和/或生产过程中。
在任何这些生产STING激动剂和生产免疫刺激性激动剂(例如，生产抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的实施方式中，任何一种或多种所述的STING激动剂生产回路和免疫刺激性激动剂生产回路存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上，或者整合至微生物染色体中的一个或多个位点中。而且，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述的回路并且还包含下述中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，如本领域公知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如thyA和/或dapA营养缺陷型，(2)一种或多种杀伤开关回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何杀伤开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于导入生物分子或底物的一种或多种转运蛋白，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，如本文所述的或以其他方式本领域公知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，如本文所述的和以其他方式本领域公知的任何表面展示回路，(7)用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢产物(例如，犬尿氨酸、色氨酸、腺苷、精氨酸)的一种或多种回路，(8)一种或多种此类其他回路的组合。
在任何这些实施方式中，一种或多种经基因工程化以生产STING激动剂并且包含免疫刺激性激动剂生产回路的细菌可以单独施用或与一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂联用，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD-1或抗-PD-L1抗体。在任何这些实施方式中，可以对一种或多种经基因工程化以生产STING激动剂并且包含免疫刺激性激动剂生产回路的细菌进行基因工程化以生产和分泌或在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD-1或抗-PD-L1抗体。
在任何这些实施方式中，一种或多种经基因工程化以生产STING激动剂并且包含免疫刺激性激动剂生产回路的细菌可以单独施用或与一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂联用，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。在任何这些实施方式中，可以对一种或多种经基因工程化以生产STING激动剂并且包含免疫刺激性激动剂生产回路的细菌进行基因工程化以生产和分泌或在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。
5-FC至5-FU的组合
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码用于将5-FC转化为5-FU的酶的基因与一种或多种编码用于消耗犬尿氨酸的酶的基因的组合。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码胞嘧啶脱氨酶的基因序列以及编码犬尿氨酸酶的基因序列。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自酵母。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌，犬尿嘧啶酶来自荧光假单胞菌。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码用于将5-FC转化为5-FU的酶的一种或多种基因，所述基因与包含一种或多种编码用于消耗犬尿氨酸的酶的基因的基因工程化细菌组合。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码胞嘧啶脱氨酶的基因序列以及包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的基因工程化细菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自酵母。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌，犬尿嘧啶酶来自荧光假单胞菌。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。
在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％。％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，90％至100％的更多的STING激动剂，例如环二磷酸。
在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的犬尿氨酸。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比将1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的5-FC的转化为5-FU。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的5-FU。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的犬尿氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的犬尿氨酸。
在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的5-FC。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的5-FC。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的5-FC。
在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％。％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或者多90％至100％的更多的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的色氨酸。
在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比能够将细胞增殖减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比能够将肿瘤尺寸减小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比能够将肿瘤体积减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比能够将肿瘤重量减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码用于将5-FC转化为5-FU的酶的基因与一种或多种编码用于消耗腺苷的酶的基因的组合。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码胞嘧啶脱氨酶的基因序列与编码腺苷降解途径的基因序列的组合。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自酵母。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌，编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含一种或多种编码酶的基因，所述酶用于将5-FC转化为5-FU与一种或多种编码用于消耗腺苷的酶的基因组合。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码胞嘧啶脱氨酶的基因序列以及包含编码腺苷降解途径的基因序列的基因工程化细菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自酵母。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌，编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗实施方式中的任一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的STING激动剂，例如环状二-AMP。
在任何这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗的实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，90％至100％更多的腺苷。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多5-FU。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的5-FU。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的腺苷。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍腺苷，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多腺苷。
在这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％多100％的5-FC。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的腺苷。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的5-FC。
在这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗实施方式中的任一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％。％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或者90％至100％的更多的尿酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的尿酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的尿酸。
在这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗实施方式中的任何一种中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比能够将细胞增殖减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗实施方式中的任何一种中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比能够将肿瘤尺寸减小至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗实施方式中的任何一种中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比能够将肿瘤体积减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗实施方式中的任何一种中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比能够将肿瘤重量减少至少约10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码用于产生5-FU的酶的基因，其与一种或多种编码用于产生精氨酸的酶的基因组合。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码胞嘧啶脱氨酶的基因序列与编码精氨酸产生途径的基因序列的组合。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自酵母。在一个实施方式中，编码精氨酸产生回路的基因序列包含反馈抗性ArgA(ArgAfbr)和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失。在一个实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一个实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含编码用于产生5-FU的酶的一种或多种基因与基因工程化细菌的组合，所述基因工程化细菌包含编码用于产生精氨酸的酶的一种或多种基因。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码胞嘧啶脱氨酶的基因序列以及包含编码精氨酸产生途径的基因序列的基因工程化细菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自酵母。在一个实施方式中，编码精氨酸产生回路的基因序列包含反馈抗性ArgA(ArgAfbr)和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失。在一个实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。
在这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中的任一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％。％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，90％至100％更多的5-FU。
在任何5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至80％至90％或90％至100％更多的精氨酸。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多5-FU。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的5-FU。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的精氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的精氨酸。
在这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中的任一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或者90％至100％更多的5-FC。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的5-FC。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的5-FC。
在这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中的任一个中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％。％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或90％至100％更多的谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下于相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的谷氨酸。
在任何这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下于相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将细胞增殖减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下于相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤生长减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下于相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤尺寸减小至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中的任一个中，基因工程化细菌在相同条件下于相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下于相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在任何将免疫激活和引发与免疫增强相结合的实施方式中，编码用于靶向免疫激活和引发的效应物的基因序列和编码用于免疫增强的效应物的基因序列可以与一个或多个直接可操作地连接或者间接诱导型启动子。在一些实施方式中，两种或更多种基因序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子在外源环境条件下诱导，例如在肠道中发现的条件，肿瘤微环境或其他组织特异性条件。在一些实施方式中，所述两种或更多种基因序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子由在肠道，肿瘤微环境或其他特定条件中发现的代谢物诱导。在一些实施方式中，所述两种或更多种基因序列与在低氧或厌氧条件下诱导的直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，两种或更多种基因序列与在炎性条件下诱导的直接或间接诱导型启动子(例如，RNS，ROS)可操作地连接，如本文所述。在一些实施方式中，两种或更多种基因序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子在免疫抑制条件下诱导，例如，如在肿瘤中发现的，如本文所述。在一些实施方式中，所述两种或更多种基因序列与通过暴露化学或营养诱导物诱导的直接或间接诱导型启动子连接，所述化学或营养诱导物可以在体内条件下存在或不存在并且可以在体内存在期间存在。体外条件(例如菌株培养，扩增，制造)，例如四环素或阿拉伯糖、cumate和水杨酸，或本文所述的其他。在一些实施方式中，两种或更多种有效负载都与组成型启动子连接。本文描述了合适的组成型启动子。在一些实施方式中，两个或更多个基因序列与相同的启动子序列可操作地连接。在一些实施方式中，两个或更多个基因序列与两个或更多个不同的启动子序列可操作地连接，所述启动子序列可以全部是组成型的(相同或不同的组成型启动子)，所有可诱导的(通过相同或不同的诱导物)，或组成型的混合物。和诱导型启动子。
在任何上述免疫激活和免疫增强组合实施方式中，用于产生一种或多种免疫激活和免疫增强效应物的基因序列可以存在于细菌的染色体上。在任何上述组合实施方式中，用于产生一种或多种免疫激活和免疫增强效应物的基因序列可以存在于细菌中的质粒上。在任何上述组合实施方式中，用于产生一种或多种免疫激活和免疫增强效应物的基因序列可以存在于质粒和细菌中的染色体上。在任何上述组合实施方式中，细菌可以是营养缺陷型，其包含细胞存活和/或生长所需的基因中的缺失或突变，例如，其中所述基因选自thyA，dapD和dapA。在任何上述组合实施方式中，基因工程化细菌可包含杀灭开关。
在一些免疫引发剂和维持者组合和/或组合物中，基因工程化微生物能够表达任何一种或多种所述免疫引发剂回路和免疫维持器回路，用于在低氧条件下和/或在癌症存在下和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢物，和/或存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物，和/或存在于肠道中可能存在的代谢物，和/或在体内可能存在或不存在的代谢物存在下，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在，例如阿拉伯糖、cuamte和水杨酸和本文所述的其他物质。在一些实施方式这样的诱导剂可以体内施用以诱导效应物基因表达。在一些免疫引发剂和维持者组合和/或组合物中，编码免疫引发剂和免疫维持者的回路的基因序列由可被这样的条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在任何这些免疫引发剂和维持者组合和/或组合物中，任何一种或多种免疫引发剂回路和免疫维持者回路存在于一种或多种质粒上(例如，高拷贝或低拷贝)或整合到一种或多种质粒中。微生物染色体中的位点。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA和/或dapA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌可单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在任何这些实施方式中，其中对微生物进行基因工程化以表达一种或多种免疫引发剂回路和免疫维持剂回路，微生物可以首先产生高水平的免疫刺激剂，并且在随后的时间产生免疫维持剂。在任何这些免疫引发剂/维持剂的实施方式中，免疫引发剂的表达可以由诱导剂诱导。在任何这些免疫引发剂/维持剂的实施方式中，免疫维持剂的表达可以由诱导剂诱导。在任何这些免疫引发剂/维持剂的实施方式中，免疫引发剂和免疫维持剂两者均可以被一种或多种诱导剂诱导。第一种诱导剂(诱导免疫刺激剂表达)和第二种诱导剂(诱导免疫维持剂表达)可以是相同的或不同的诱导剂。在任何这些免疫引发剂/维持剂的实施方式中，第一诱导剂和第二诱导剂可以顺序或同时施用。诱导剂的非限制性实例包括肠道或肿瘤微环境(例如，低氧、某些营养物质等)的条件，在细胞培养过程中的某些体外条件或化学诱导剂(例如，阿拉伯糖、cumate和水杨酸、IPTG或本文所述的其他化学诱导剂)，其可以在体外或体内加入。在任何这些免疫引发剂/维持剂的实施方式中，免疫引发剂和免疫维持剂两者可以被组成型启动子控制或者直接或间接地与其连接，包括但不限于本文所述的那些。在任何这些免疫引发剂/维持剂的实施方式中，免疫引发剂可以被诱导型启动子控制或者直接或间接地与其连接，以及免疫维持剂可以被组成型启动子控制或者直接或间接地与其连接。在任何这些免疫引发剂/维持剂的实施方式中，免疫引发剂可以被组成型启动子控制或者直接或间接地与其连接，以及免疫维持剂可以被诱导型启动子控制或者直接或间接地与其连接。
在任何这些免疫引发剂/维持剂的实施方式中，表达用于免疫引发的回路的细菌菌株可以与表达用于免疫维持的回路的单独的细菌菌株联合施用。例如，表达免疫引发剂回路的基因工程化细菌的一种或多种菌株与表达免疫维持剂回路的基因工程化细菌的一种或多种单独的菌株可以顺序施用，例如免疫刺激剂可以在免疫维持剂之前施用。在另一个实例中，免疫引发剂菌株可以在免疫维持剂菌株之后施用。在又一个实例中，免疫引发剂菌株可以与免疫维持剂菌株同时施用。
在任何这些免疫引发剂/维持剂的实施方式中，无论施用顺序或时机如何(同时或顺序)，在顺序或同时施用后工程化菌株均可以表达用于免疫维持剂的回路，即使用本文所述的一种或多种机制微调表达时机和水平，所述机制包括但不限于启动子和核糖体结合位点。
代谢回路的组合
腺苷和犬尿氨酸的消耗
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含产生和/或消耗一种或多种代谢物的回路。或者，本公开提供了包含组合(例如，两种或更多种)不同基因工程化细菌的组合物，每种细菌编码一种或多种酶，用于产生和/或消耗一种或多种代谢底物。此类独特的或不同的细菌菌株可以同时或顺序施用。此类底物的非限制性实例包括犬尿氨酸、色氨酸、腺苷和精氨酸。
本文所述的回路、效应物或免疫调节剂的每种组合可以作为在一个细菌菌株中的组合回路，或者替代地在两个或多个不同的或单独的细菌菌株的组合中提供，每个菌株表达一个或多个回路的组合。例如，包含用于消耗犬尿氨酸的回路和用于生产精氨酸的基因回路的一种或多种基因工程化细菌可以在一个菌株(包含两个回路)或在两个或多个菌株(每个均包含至少一个回路)中提供。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于腺苷降解和犬尿氨酸消耗的回路。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的基因序列以及腺苷降解途径。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，犬尿嘧啶酶来自荧光假单胞菌，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。在任何这些实施方式中，可以缺失TrpE。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一些实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含用于降解腺苷和基因工程化细菌的回路，以消耗犬尿氨酸。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码犬尿嘧啶酶的基因序列以及包含编码腺苷降解途径的基因序列的基因工程化细菌。在任何这些实施方式中，可以缺失TrpE。
在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，犬尿嘧啶酶来自荧光假单胞菌，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。在任何这些实施方式中，可以缺失TrpE。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，经基因工程以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的腺苷。在另一个实施方式中，经基因工程以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的腺苷。在另一个实施方式中，经基因工程以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍。二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的腺苷。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的尿酸。在另一个实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的尿酸。在另一个实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的尿酸。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，经基因工程以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解速率增加0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或90％至100％。在另一个实施方式中，经基因工程以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解速率增加1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍，或两倍更多。在另一个实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解速率提高约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍。相对于相同细菌亚型的未修饰细菌，折叠，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，当在低氧条件下诱导时，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌可具有约1.8-10μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。在一个具体实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌具有约5-9μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。在一个具体实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌具有约6-8μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比在低氧条件诱导下1小时后可使腺苷降解增加约50％至70％。在一个实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，在低氧条件下诱导在1小时后，使腺苷降解增加约55％至65％。在一个具体实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，在低氧条件下诱导1小时之后，使腺苷降解增加约55％至60％。在另一个实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在低氧条件下诱导1小时后使腺苷降解增加约1.5-3倍。在一个具体实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在低氧条件下诱导1小时后使腺苷降解增加约2-2.5倍。
在一种腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，即在低氧条件下诱导2小时后，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解增加约85％至100％。在一个实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在低氧条件下诱导2小时后时，使腺苷降解增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在低氧条件下诱导2小时之后，使腺苷降解增加约97％至99％。
在一种腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比在低氧条件下诱导2小时后使腺苷降解增加约40-50倍。在一个具体实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比在低氧条件下诱导2小时后使腺苷降解增加约44-48倍。
在一种腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在低氧条件下诱导3个小时后，使腺苷降解增加约95％至100％。在一个实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在低氧条件下诱导3小时后，使腺苷降解增加约98％至100％。在一个具体实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下(即，在低氧条件下诱导3小时后)后，使腺苷降解增加约99％至99％。在另一个实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在低氧条件下诱导3小时后使腺苷降解增加约100-1000倍。在另一个实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在低氧条件下诱导3小时后使腺苷降解增加约1000-10000倍。
在一种腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在低氧条件下诱导4个小时后，使腺苷降解增加约95％至100％。在一个实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在低氧条件下诱导4小时后，使腺苷降解增加约98％至100％。在一个实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在低氧条件下诱导4小时后，使腺苷降解增加约99％至99％。在另一个实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在低氧条件下诱导4小时后使腺苷降解增加约100-1000倍。在另一个实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在低氧条件下诱导4小时后使腺苷降解增加约1000-10000倍。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％。％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的犬尿氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的犬尿氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗约三倍，四倍，约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的犬尿氨酸。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，经基因工程化以消耗犬尿氨酸和任选产生色氨酸的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或者多90％至100％更多的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的色氨酸。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使犬尿氨酸消耗率增加0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％。在另一种腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使犬尿氨酸消耗速率增加1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使犬尿氨酸消耗速率增加约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍。
在一个腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约80％至100％。在一个腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后在相同条件下使犬尿氨酸消耗增加约90％至100％。在一个特定的腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌在4小时在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使犬尿氨酸消耗增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使犬尿氨酸消耗增加约99％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约10-50倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约50-100倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约100-500倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约500-1000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约1000-5000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约5000-10000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约10000-1000倍。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将细胞增殖减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤尺寸减小至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖、cumate和水杨酸和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述回路，在一些实施方式，这样的诱导剂可以体内施用以诱导效应物基因表达。在一些实施方式中，编码用于降解腺苷和/或犬尿氨酸的回路的基因序列由可由这些条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，任何一种或多种所述腺苷降解回路和犬尿氨酸消耗回路存在于一种或多种质粒上(例如，高拷贝或低拷贝)或整合到一个或多个质粒中。微生物染色体。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA和/或dapA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。
在任何这些实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的一种或多种细菌可单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。在任何这些实施方式中，可以对经基因工程化以消耗腺苷的一种或多种细菌进行基因工程化以生产和分泌或在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫检查点抑制剂，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在任何这些实施方式中，一种或多种经工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌可以单独施用或与一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂联用，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。在任何这些实施方式中，可以对一种或多种经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌进行基因工程化以生产和分泌或在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。
消耗腺苷和产生精氨酸
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于降解腺苷和精氨酸产生和/或消耗氨的回路。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码精氨酸产生和/或消耗氨回路的基因序列以及腺苷降解途径。在一个实施方式中，编码精氨酸产生和/或消耗氨回路的基因序列包含反馈抗性ArgA(ArgAfbr)和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失。在一个实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。
在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，反馈抗性ArgA(ArgAfbr)来自大肠杆菌，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一些实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含用于降解腺苷和基因工程化细菌的回路，其包含用于产生精氨酸和/或消耗氨的序列。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码反馈抗性ArgA(ArgAfbr)的基因序列和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失，以及包含编码腺苷降解途径的基因序列的基因工程化细菌。
在一个组合物实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。在一个组合物实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，所述二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增多性李斯特氏菌，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的腺苷。在另一个实施方式中，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的腺苷。在另一个实施方式中，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的腺苷。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的尿酸。在另一个实施方式中，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的尿酸。在另一个实施方式中，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍。四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的尿酸。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解速率增加0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％。在另一个实施方式中，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解速率增加1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍。在另一个实施方式中，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比将降解速率提高约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，当在低氧条件下诱导时，细菌可具有约1.8-10μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。在一个具体实施方式中，细菌具有约5-9μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。在一个具体实施方式中，细菌具有约6-8μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，即在低氧条件下诱导1小时后，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比可使腺苷降解增加约50％至70％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导1小时后时，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解增加约55％至65％。在一个具体实施方式中，即在低氧条件下诱导1小时后，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解增加约55％至60％。在另一个实施方式中，当在低氧条件下诱导1小时后，细菌使腺苷降解增加约1.5-3倍。在一个具体实施方式中，在低氧条件下诱导1小时后，细菌使腺苷降解增加约2-2.5倍。
在一种腺苷消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，即在低氧条件下诱导2小时后，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解增加约85％至100％。在一个实施方式中，即在2小时后在低氧条件下诱导时，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，即在低氧条件下诱导2小时后，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解增加约97％至99％。
在一种腺苷消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，在低氧条件下诱导2小时后，细菌可使腺苷降解增加约40-50倍。在一个具体实施方式中，细菌在2小时后在低氧条件下诱导时使腺苷降解增加约44-48倍。
在一种腺苷消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，即在低氧条件下诱导3小时后，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解增加约95％至100％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导3小时后，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解增加约98％至100％。在一个具体实施方式中，即在低氧条件下诱导3小时后，细菌使腺苷降解增加约99％至99％。在另一个实施方式中，细菌在低氧条件下诱导3小时后使腺苷降解增加约100-1000倍。在另一个实施方式中，细菌在低氧条件下诱导3小时后使腺苷降解增加约1000-10000倍。
在一种腺苷消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，即在低氧条件下诱导4小时后，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解增加约95％至100％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导4小时后，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解增加约98％至100％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导4小时后，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比使腺苷降解增加约99％至99％。在另一个实施方式中，细菌在低氧条件下诱导4小时后使腺苷降解增加约100-1000倍。在另一个实施方式中，细菌在低氧条件下诱导4小时后使腺苷降解增加约1000-10000倍。
在任何腺苷消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的精氨酸。
在另一种腺苷消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的精氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的精氨酸。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的谷氨酸。
在任何这些消耗腺苷和产生精氨酸和/或消耗氨的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗0％至2％、2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的氨。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的氨。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的氨。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将细胞增殖减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤尺寸减小至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些腺苷消耗和精氨酸生产和/或消耗氨消耗实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖、cuamte和水杨酸和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述回路，用于在低氧条件下和/或在存在癌症的情况下降解腺苷和产生精氨酸。在一些实施方式这样的诱导剂可以体内施用以诱导效应物基因表达。在一些实施方式中，编码腺苷降解和精氨酸产生的回路的基因序列由这些条件和/或诱导物可诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸产生和/或消耗氨实施方式中，任何一种或多种所述腺苷降解回路和精氨酸产生回路存在于一种或多种质粒上(例如，高拷贝或低拷贝)或整合到一个或多个位点中。微生物染色体。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA和/或dapA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。
在任何这些实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷和产生精氨酸和/或消耗氨的细菌可单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1。抗体。在任何这些实施方式中，可以对一种或多种经基因工程化以消耗腺苷和产生精氨酸和/或消耗氨的细菌进行基因工程化以生产和分泌或者在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫检查点抑制剂，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在任何这些实施方式中，一种或多种经基因工程化以消耗腺苷和产生精氨酸和/或消耗氨的细菌可以单独施用或与一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂联用，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。在任何这些实施方式中，可以对一种或多种经基因工程化以消耗腺苷和产生精氨酸和/或消耗氨的细菌进行基因工程化以生产和分泌或者在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。
消耗犬尿氨酸和产生精氨酸
在一些实施方式中，基因工程化细菌包括用于消耗犬尿氨酸和精氨酸产生和/或消耗氨的回路。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码精氨酸产生和/或消耗氨回路的基因序列以及犬尿氨酸消耗(和任选的色氨酸产生)途径。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的基因序列与精氨酸产生途径的组合。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。在一个实施方式中，编码精氨酸产生和/或消耗氨回路的基因序列包含反馈抗性ArgA(ArgAfbr)和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失。在一个实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。在任何这些实施方式中，可以缺失TrpE。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一些实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含用于消耗犬尿氨酸和基因工程化细菌的回路，其包含用于产生精氨酸和/或消耗氨的回路。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码精氨酸产生回路的基因序列，所述基因序列与基因工程化细菌组合，所述基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸消耗(和任选的色氨酸产生)途径的基因序列。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的基因序列以及包含编码精氨酸产生途径的基因序列的基因工程化细菌。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。在一个实施方式中，编码精氨酸产生和/或消耗氨回路的基因序列包含反馈抗性ArgA(ArgAfbr)和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失。在一个实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。在任何这些实施方式中，可以缺失TrpE。
在任何这些犬尿氨酸消耗和精氨酸和/或消耗氨生产实施方式中，细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的犬尿氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的犬尿氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗约三倍，四倍，约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的犬尿氨酸。
在任何这些犬尿氨酸消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，经基因工程化以消耗犬尿氨酸和任选地产生色氨酸的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，90％至100％更多的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的色氨酸。
在任何这些犬尿氨酸消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比将犬尿氨酸消耗速率提高0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％。在另一种犬尿氨酸消耗和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比将犬尿氨酸消耗速率提高1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍，或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比将犬尿氨酸消耗速率提高约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一种犬尿氨酸消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约80％至100％。在一种犬尿氨酸消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约90％至100％。在一种特定的犬尿氨酸消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约99％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约10-50倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约50-100倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约100-500倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约500-1000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约1000-5000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约5000-10000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约10000-1000倍。
在任何犬尿氨酸消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的精氨酸。
在另一种犬尿氨酸消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的精氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的精氨酸。
在任何这些犬尿氨酸消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰菌株相比消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的谷氨酸。
在任何这些消耗犬尿氨酸和生产精氨酸和/或消耗氨的实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗0％至2％、2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至18％、18％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％至80％、80％至90％或90％至100％更多的氨。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多的氨。在又一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌消耗约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍更多的氨。
在任何这些犬尿氨酸消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将细胞增殖减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤生长减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤尺寸减小至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在任何这些实施方式中，细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。
在一些犬尿氨酸消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，基因工程化微生物能够表达任何一种或多种所述回路，用于在低氧条件下和/或在癌症和/或存在下的犬尿氨酸消耗和精氨酸产生。肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢物，和/或存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物，和/或存在于肠道中的代谢物，和/或存在下代谢物可以存在或不存在于体内，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在，例如阿拉伯糖、cuamte和水杨酸和本文所述的其他物质。在一些实施方式这样的诱导剂可以体内施用以诱导效应物基因表达。在一些实施方式中，编码用于犬尿氨酸消耗和精氨酸产生的回路的基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。在任何这些犬尿氨酸消耗和精氨酸生产和/或消耗氨实施方式中，任何一种或多种所述腺苷降解回路和犬尿氨酸消耗回路存在于一种或多种质粒上(例如，高拷贝或低拷贝)或整合到微生物染色体的一个或多个位点中。
此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA和/dapA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。
在任何这些实施方式中，经基因工程化以消耗犬尿氨酸和产生精氨酸和/或消耗氨的细菌可单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。在任何这些实施方式中，可以对一种或多种经基因工程化以消耗犬尿氨酸和产生精氨酸和/或消耗氨的细菌进行基因工程化以生产和分泌或者在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫检查点抑制剂，包括但不限于抗-CTLA4、抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在任何这些实施方式中，一种或多种经基因工程化以消耗犬尿氨酸和产生精氨酸和/或消耗氨的细菌可以单独施用或者与一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂联用，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。在任何这些实施方式中，可以对一种或多种经基因工程化以消耗犬尿氨酸和产生精氨酸和/或消耗氨的细菌进行基因工程化以生产和分泌或者在其表面上展示一种或多种本文所述的免疫刺激性激动剂，例如激动性抗体，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB或抗-GITR抗体。
在任何这些新陈代谢转化剂与回路组合的实施方式中(即，AD+Kyn、AD+Arg/NH4+、Kyn+Arg)，包含编码新陈代谢转化剂组合的一种或多种基因序列的基因工程化细菌还包含编码一种或多种其他效应分子的一种或多种基因序列，即一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码新陈代谢转化剂组合的回路可以与编码如本文所述的一种或多种免疫引发剂或免疫维持剂的回路组合。编码免疫引发剂或免疫维持剂的回路可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在任何这些实施方式中，在相同或不同细菌菌株中(组合回路或菌株的混合物)，编码新陈代谢转化剂组合的一种或多种基因序列可以与编码如本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种基因序列组合。在一些实施方式中，与编码新陈代谢转化剂组合的一种或多种基因序列组合的基因序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，dacA基因整合至染色体中。在一些实施方式中，与编码新陈代谢转化剂组合的一种或多种基因序列组合的基因序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码cGAS的基因整合至染色体中。
在任何这些新陈代谢转化剂组合的实施方式中(即，AD+Kyn、AD+Arg/NH4+、Kyn+Arg)，细菌还可以包含营养缺陷型修饰，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
效应物和免疫调节剂的调控表达
在一些实施方式中，细菌细胞包含携带编码有效负载的基因的稳定维持的质粒或染色体，使得有效负载可在宿主细胞中表达，并且宿主细胞能够存活并且/或体外生长，例如在培养基中和/或体内，例如在肠道中或在肿瘤微环境中。在一些实施方式中，细菌细胞包含两种或更多种不同的有效载荷或操纵子，例如，两种或更多种有效载荷基因。在一些实施方式中，细菌细胞包含三种或更多种不同的转运蛋白或操纵子，例如三种或更多种有效负载基因。在一些实施方式中，细菌细胞包含4，5，6，7，8，9，10或更多个不同的有效载荷或操纵子，例如4，5，6，7，8，9，10或更多个有效载荷基因。
本文中术语“有效负载”“目的多肽”或“目的多肽”，“目的蛋白质”，“目的蛋白质”，“有效负载”，“效应分子”，“效应物”是指本文所述的一种或多种效应分子和/或起到产生这种效应分子所需的酶的功能的一种或多种酶或多肽。有效载荷的非限制性实例包括IL-12，IL-2，IL-15，IL-18，IL-7，IL-21，CD40激动剂，CD40激动剂，CD226激动剂，CD137激动剂，ICOS激动剂，OXO40激动剂，GM-CSF，CXCL10，CXCL9，抗体，例如scFv，包括但不限于检查点抑制剂(例如，PD1，PDL1，CTLA4，抗LAG3，抗TIM3和本文所述的其他)，犬尿氨酸酶，色氨酸和/或精氨酸产生酶，腺苷降解酶。
如本文所用，术语“目的多肽”或“目的多肽”，“目的蛋白质”，“目的蛋白质”，“有效负载”，“有效负载”还包括任何或多种任何色氨酸合成酶，犬尿氨酸降解酶，腺苷降解酶，产生精氨酸的酶和本文所述的其他代谢途径酶。如本文所用，术语“感兴趣的基因”或“感兴趣的基因序列”包括编码本文描述的免疫调节剂的一种或多种基因和/或一种或多种基因序列和/或基因盒。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含相同有效负载基因的多个拷贝。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于质粒上并可操作地连接至直接或间接诱导型启动子。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于质粒上并可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于质粒上并可操作地连接至在低氧或厌氧条件下诱导的启动子。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于质粒上并且可操作地连接于通过暴露于四环素或阿拉伯糖、cumate和水杨酸或本文所述的另一种化学或营养诱导物而诱导的启动子。
在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于染色体上并且可操作地连接至直接或间接诱导型启动子。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于染色体上并且与组成型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于染色体中并且与在低氧或厌氧条件下诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于染色体上并且与通过暴露于四环素或阿拉伯糖、cumate和水杨酸或本文所述的另一种化学或营养诱导物诱导的启动子可操作地连接。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含两种或更多种有效载荷，所有有效载荷都存在于染色体上。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含两种或更多种有效载荷，所有有效载荷都存在于一种或多种相同或不同的质粒上。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含两种或更多种有效负载，其中一些存在于染色体上，并且其中一些存在于一种或多种相同或不同的质粒上。
在上述任何实施方式中，用于产生效应物或免疫调节剂组合的一种或多种有效负载与一种或多种直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，一种或多种有效负载与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子在外源环境条件下诱导，例如在肠道，肿瘤微环境或其他组织特异性条件中发现的条件。在一些实施方式中，一种或多种有效负载与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子由在肠道，肿瘤微环境或其他特定条件中发现的代谢物诱导。在一些实施方式中，一种或多种有效负载可操作地连接至在低氧或厌氧条件下诱导的直接或间接诱导型启动子。在一些实施方式中，一种或多种有效负载可操作地连接至在炎性条件下诱导的直接或间接诱导型启动子(例如，RNS，ROS)，如本文所述。在一些实施方式中，一种或多种有效负载与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子在免疫抑制条件下诱导，例如，如在肿瘤中发现的，如本文所述。在一些实施方式中，所述两种或更多种基因序列与通过暴露化学或营养诱导物诱导的直接或间接诱导型启动子连接，所述化学或营养诱导物可以在体内条件下存在或不存在并且可以在体内存在期间存在。体外条件(例如菌株培养，扩增，制造)，例如四环素或阿拉伯糖、cumate和水杨酸，或本文所述的其他条件。在一些实施方式中，两种或更多种有效负载都与组成型启动子连接。
在一些实施方式中，如本文所述，在体内条件下诱导启动子，例如肠。在一些实施方式中，如本文所述，在体外条件下诱导启动子，例如各种细胞培养和/或细胞制造条件。在一些实施方式中，如本文所述，在体内条件下诱导启动子，例如肠，并且在体外条件下，例如各种细胞培养和/或细胞产生和/或制造条件，如本文所述。
在一些实施方式中，与编码有效负载的基因可操作地连接的启动子直接由外源环境条件(例如，体内和/或体外和/或生产/制造条件)诱导。在一些实施方式中，与编码有效负载的基因可操作地连接的启动子由外源环境条件(例如，体内和/或体外和/或生产/制造条件)间接诱导。
在一些实施方式中，启动子直接或间接地由哺乳动物肠道特异性的外源环境条件诱导。在一些实施方式中，启动子直接或间接地由对哺乳动物的肿瘤和/或小肠的缺氧环境特异的外源环境条件诱导。在一些实施方式中，启动子直接或间接地由低氧或厌氧条件诱导，例如肿瘤的低氧环境和/或哺乳动物肠的环境。在一些实施方式中，启动子直接或间接地由对肿瘤，特定组织或哺乳动物的肠特异的分子或代谢物诱导。在一些实施方式中，启动子由与细菌细胞共同施用的分子直接或间接诱导。
FNR依赖性调控
本发明的基因工程化细菌包含用于产生免疫调节剂的基因或基因盒，其中所述基因或基因盒与由外源环境条件控制的直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，诱导型启动子是氧水平依赖性启动子，并且免疫调节剂在低氧，微需氧或厌氧条件下表达。例如，在低氧条件下，氧水平依赖性启动子被相应的氧水平感应转录因子激活，从而驱动免疫调节剂的产生。
细菌已经进化出能够感知氧水平的转录因子。不同的信号传导途径可以由不同的氧水平触发并且以不同的动力学发生。氧水平依赖性启动子是一种或多种氧水平感应转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合和/或激活激活下游基因表达。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含用于在氧水平依赖性启动子控制下产生有效负载的基因或基因盒。在更具体的方面，基因工程化细菌包括基因或基因盒，用于在氧水平依赖性启动子的控制下产生有效载荷，所述启动子在低氧或厌氧环境下激活，例如肿瘤的低氧环境和/或哺乳动物肠道的环境。
在某些实施方式中，细菌细胞包含编码与富马酸和硝酸还原酶调节剂(FNR)响应性启动子可操作地连接的有效负载的基因。在某些实施方式中，细菌细胞包含编码在富马酸盐和硝酸盐还原酶调节剂(FNR)响应性启动子控制下表达的有效负载的基因。在大肠杆菌中，FNR是控制从需氧代谢到无氧代谢转换的主要转录激活因子(Unden等，1997)。在厌氧状态下，FNR二聚化成活性DNA结合蛋白，激活数百个负责适应厌氧生长的基因。在好氧状态下，FNR被氧气防止二聚化并且是无活性的。FNR应答启动子包括但不限于SEQ ID NO:563-579的FNR应答启动子。下划线序列是预测的核糖体结合位点，粗体序列是用于克隆的限制性位点。
FNR启动子序列是本领域已知的，并且任何合适的FNR启动子序列可用于本发明的基因工程化细菌中。任何合适的FNR启动子可以与任何合适的有效载荷组合。
如在本文中所使用的，术语“有效负载”指一种或多种效应分子，例如一种或多种免疫调节剂，包括但不限于本文所述的免疫引发剂和免疫维持剂。
非限制性FNR启动子序列提供在SEQ ID NO:563-579中。在一些实施方式中，本公开的基因工程细菌包含有效载荷，例如效应物或免疫调节剂，其有效连接至低氧诱导型例如FNR调节的启动子，所述启动子包含括：SEQ ID NO:563，SEQ ID NO:564，SEQ ID NO:565，SEQ ID NO:566，SEQ ID NO:567，SEQ ID NO:568，SEQ ID NO:569，nirB1启动子(SEQ IDNO:570)，nirB2启动子(SEQ ID NO:571)，nirB3启动子(SEQ ID NO:572)，ydfZ启动子(SEQID NO:573)，nirB与强核糖体结合位点(SEQ ID NO:574)融合的启动子，与强核糖体结合位点(SEQ ID NO:575)融合的ydfZ启动子，fnrS，厌氧诱导的小RNA基因(fnrS1启动子SEQ IDNO:576或fnrS2启动子SEQ ID NO:577)，与crp结合位点融合的nirB启动子(SEQ ID NO:578)，和与crp结合位点融合的fnrS(SEQ ID NO:579)。在一些实施方式中，FNR应答启动子与选自SEQIDNO:563-579的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，所述基因序列包含FNR响应性启动子，所述启动子包含选自SEQ ID NO:563-579的序列。在另一个实施方式中，FNR应答启动子由选自SEQ ID NO：563-579的序列组成。在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌包含编码效应分子(例如，免疫引发剂或免疫刺激剂)的基因，其与FNR响应性启动子可操作地连接，所述启动子与选自SEQ ID NO:1281或SEQ ID NO:1282的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的同源性。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含与FNR响应性启动子可操作地连接的效应分子，所述启动子包含选自SEQ ID NO:1281或SEQ ID NO:1282的序列在又一个实施方式中，FNR响应性启动子由选自SEQ ID NO:1281或SEQ ID NO:1282的序列组成。
在一些实施方式中，将多种不同的FNR核酸序列插入基因工程化细菌中。在替代性实施方式中，基因工程化细菌包含编码在交替氧水平依赖性启动子控制下表达的有效负载的基因，例如DNR(Trunk等，2010)或ANR(Ray等，1997)。在这些实施方式中，有效负载基因的表达在低氧或厌氧环境中特别是在肠道中被激活。在一些实施方式中，通过本领域已知的方法进一步优化基因表达，例如通过优化核糖体结合位点和/或增加mRNA稳定性。在一个实施方式中，哺乳动物肠是人哺乳动物肠。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含用于产生在精氨酸脱亚胺酶和硝酸盐还原转录调节剂(ANR)的厌氧调节的控制下表达的免疫调节剂的基因或基因盒。在铜绿假单胞菌中，ANR“是表达在限氧或厌氧条件下可诱导的生理功能所必需的”(Winteler等，1996；Sawers，1991)。铜绿假单胞菌ANR与大肠杆菌FNR同源，并且“共有FNR位点(TTGAT----ATCAA)被ANR和FNR有效识别”(Winteler等，1996)。与FNR一样，在厌氧状态下，ANR激活许多负责适应厌氧生长的基因。在有氧状态下，ANR无效。荧光假单胞菌，恶臭假单胞菌，丁香假单胞菌和门多萨假单胞菌都具有ANR的功能类似物(Zimmermann等，1991)。由ANR调节的启动子是本领域已知的，例如arcDABC操纵子的启动子(参见，例如，Hasegawa等，1998)。
在其他实施方式中，用于产生有效负载的一种或多种基因序列在氧水平依赖性启动子的控制下表达，所述启动子与转录激活因子(例如CRP)的结合位点融合。CRP(环状AMP受体蛋白或分解代谢物激活蛋白或CAP)通过抑制负责摄取，代谢和同化较不利的碳源的基因，在存在快速代谢的碳水化合物(如葡萄糖)时，在细菌中发挥重要的调节作用(Wu等，2015)。这种对葡萄糖的偏好被称为葡萄糖抑制，以及碳分解代谢物抑制(Deutscher，2008；
Figure BDA0002364453000003971
和Stülke，2008)。在一些实施方式中，用于产生免疫调节剂的基因或基因盒由与CRP结合位点融合的氧水平依赖性启动子控制。在一些实施方式中，有效负载的一种或多种基因序列由与CRP结合位点融合的FNR启动子控制。在这些实施方式中，当环境中不存在葡萄糖时，环AMP结合CRP。这种结合导致CRP的构象变化，并允许CRP紧密结合其结合位点。然后CRP结合通过直接蛋白质-蛋白质相互作用将RNA聚合酶募集到FNR启动子来激活基因或基因盒的转录。在葡萄糖存在下，环AMP不与CRP结合，并且抑制用于产生有效负载的基因或基因盒的转录。在一些实施方式中，使用与转录激活因子的结合位点融合的氧水平依赖性启动子(例如，FNR启动子)来确保当足够量的用于产生有效负载的基因或基因盒在厌氧条件下不表达。例如，通过在体外向生长培养基中添加葡萄糖，可以存在葡萄糖。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含来自不同物种，菌株或细菌亚群的氧水平依赖性启动子。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含来自不同物种，菌株或细菌亚群的氧水平感应转录因子，例如FNR，ANR或DNR。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含氧水平感应转录因子和来自不同物种，菌株或细菌亚群的相应启动子。异源氧水平依赖性转录调节因子和/或启动子增加与所述启动子可操作连接的基因的转录，例如，用于在低氧或厌氧环境中产生有效负载的一种或多种基因序列，如与相同条件下细菌中的天然基因和启动子相比较。在某些实施方式中，非天然氧水平依赖性转录调节因子是来自淋病奈瑟氏球菌的FNR蛋白(参见，例如，Isabella等，2011)。在一些实施方式中，相应的野生型转录调节因子保持完整并保留野生型活性。在替代性实施方式中，缺失或突变相应的野生型转录调节因子以减少或消除野生型活性。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含野生型氧水平依赖性转录调节因子，例如FNR，ANR或DNR，以及相对于来自相同亚型细菌的野生型启动子突变的相应启动子。与野生型启动子相比，突变启动子增强与野生型转录调节因子的结合并增加与所述启动子可操作地连接的基因的转录，例如，在低氧或厌氧环境中编码有效负载的基因。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含野生型氧水平依赖性启动子，例如FNR，ANR或DNR启动子，以及相对于来自相同亚型的细菌的野生型转录调节子突变的相应转录调节子。与野生型转录调节因子相比，突变的转录调节因子增强与野生型启动子的结合并增加与所述启动子可操作地连接的基因的转录，例如编码有效负载的基因，在低氧或厌氧环境中。在相同的条件下。在某些实施方式中，突变氧水平依赖性转录调节因子是包含增强二聚化和FNR活性的氨基酸取代的FNR蛋白(参见，例如，Moore等，(2006)。在一些实施方式中，相对于来自相同亚型的细菌的野生型序列，氧水平感应转录调节因子和相应的启动子都是突变的，以便在低氧条件下增加有效负载的表达。
在一些实施方式中，细菌细胞包含编码中的氧气水平感测转录调节，例如，FNR基因的内源基因的多个拷贝。在一些实施方式中，编码氧水平感应转录调节因子的基因存在于质粒上。在一些实施方式中，编码氧水平感应转录调节因子的基因和编码有效负载的基因存在于不同的质粒上。在一些实施方式中，编码氧水平感应转录调节因子的基因和编码有效负载的基因存在于同一质粒上。
在一些实施方式中，编码氧水平感应转录调节因子的基因存在于染色体上。在一些实施方式中，编码氧水平感应转录调节因子的基因和编码有效负载的基因存在于不同的染色体上。在一些实施方式中，编码氧水平感应转录调节因子的基因和编码有效负载的基因存在于同一染色体上。在一些情况下，在诱导型启动子的控制下表达氧水平感应转录调节因子以增强表达稳定性可能是有利的。在一些实施方式中，转录调节子的表达由与控制编码有效负载的基因的表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方式中，转录调节因子的表达受控制有效负载表达的相同启动子控制。在一些实施方式中，转录调节子和有效负载从启动子区域发散转录。
RNS依赖性调控
在一些实施方式中，在启动子控制下表达有效负载的基因工程化细菌被炎性条件激活。在一个实施方式中，用于产生有效负载的基因在炎性环境中激活的炎性依赖性启动子的控制下表达，例如活性氮物种或RNS启动子。在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含直接或间接地被转录因子控制的可调节调控区域，所述转录因子能够感测到至少一种活性氮物质。在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072中(公开为WO2017/123675)描述了适宜的RNS诱导型启动子(例如，可以由活性氮物质诱导)，其全部内容通过引用并入本文。
感测RNS及其相应的RNS响应基因，启动子和/或调节区的转录因子的实例包括但不限于表9中所示的那些。
表9 RNS感应转录因子和RNS响应基因的实例
Figure BDA0002364453000003991
ROS依赖性调控
在一些实施方式中，基因工程化细菌在启动子的控制下表达有效负载，所述启动子被细胞损伤条件激活。在一个实施方式中，用于产生有效负载的基因在细胞损伤依赖性启动子的控制下表达，所述启动子在存在细胞或组织损伤的环境中被激活，例如活性氧物质或ROS启动子。在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含直接或间接地被转录因子控制的可调节调控区域，所述转录因子能够感测到至少一种活性氧物质。在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072中(公开为WO2017/123675)描述了适宜的ROS诱导型启动子(例如，可以由活性氧物质诱导)，其全部内容通过引用并入本文。
感测ROS及其相应的ROS响应基因，启动子和/或调节区的转录因子的实例包括但不限于表10中所示的那些。
表10 ROS感应转录因子和ROS响应基因的实例
Figure BDA0002364453000004001
其他启动子
在一些实施方式中，基因工程细菌包含用于产生免疫调节剂的基因或基因盒，所述免疫调节剂在对环境(例如肿瘤微环境，特异性组织或哺乳动物的肠)中的特定分子或代谢物响应的诱导型启动子的控制下表达。在哺乳动物的肠，处于健康和/或疾病状态或肿瘤微环境中发现的任何分子或代谢物都可用于诱导有效载荷表达。
在替代实施方式中，用于产生免疫调节剂的基因或基因盒可操作地与营养或化学诱导物连接，所述营养或化学诱导物在环境中不存在，例如，肿瘤微环境，特定组织或哺乳动物的肠。在一些实施方式中，营养或化学诱导剂与基因工程化细菌先施用，同时或顺序施用。
其他诱导型启动子
在一些实施方式中，本文所述的编码目的多肽的一个或多个基因序列存在于质粒上，并且可操作地连接至由一种或多种营养和/或化学诱导剂和/或代谢物直接或间接诱导的启动子。在一些实施方式中，细菌细胞包含携带编码免疫调节剂的基因的稳定维持的质粒或染色体，其由一种或多种营养和/或化学诱导剂和/或代谢产物诱导，从而使免疫调节剂可以在宿主细胞中表达，并且该宿主细胞能够在体外，例如在培养条件下，和/或在体内，例如在肠和/或肿瘤微环境中存活和/或生长。
在一些实施方式中，一种或多种免疫调节剂和/或其他目的多肽的表达由体内的一种或多种阿拉伯糖，cumate和水杨酸诱导型启动子直接或间接驱动。在一些实施方式中，启动子由与本发明的基因工程细菌共同施用的化学和/或营养诱导剂和/或代谢物直接或间接诱导。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在腹腔内施用诱导剂。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在腹腔内施用诱导剂。在一些实施方式中，在腹腔内施用诱导剂与将细菌注射进入肿瘤同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在静脉内施用诱导剂。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在静脉内施用诱导剂。在一些实施方式中，在静脉内施用诱导剂与将细菌注射进入肿瘤同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点皮下施用诱导剂。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点皮下施用诱导剂。在一些实施方式中，在皮下施用诱导剂与将细菌注射进入肿瘤同时进行。
在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在瘤内施用诱导剂。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在瘤内施用诱导剂。在一些实施方式中，在瘤内施用诱导剂与将细菌注射进入肿瘤同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在腹腔内施用诱导剂。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在腹腔内施用诱导剂。在一些实施方式中，在腹腔内施用诱导剂与细菌静脉内施用同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在静脉内施用诱导剂。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在静脉内施用诱导剂。在一些实施方式中，在静脉内施用诱导剂与细菌静脉内施用同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点皮下施用诱导剂。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点皮下施用诱导剂。在一些实施方式中，在皮下施用诱导剂与细菌静脉内施用同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在瘤内施用诱导剂。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在瘤内施用诱导剂。在一些实施方式中，在瘤内施用诱导剂与细菌静脉内施用同时进行。
在一些实施方式中，一种或多种免疫调节剂和/或其他目的多肽的表达在体内施用之前在菌株的体外生长、制备或制造过程中由化学和/或营养诱导剂和/或代谢物诱导的一种或多种启动子直接或间接驱动。在一些实施方式中，由化学和/或营养诱导剂和/或代谢物诱导的启动子在培养中被诱导，例如在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中生长，例如在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造的过程。在一些实施方式中，启动子由添加至细菌培养物中以诱导表达的分子直接或间接诱导，并在施用之前用一种或多种免疫调节剂和/或其他目的多肽预载细菌在一些实施方式中，由化学和/或营养诱导物和/或代谢物诱导的培养物是需氧生长的。在一些实施方式中，由化学和/或营养诱导剂和/或代谢产物诱导的培养物厌氧生长。
在一个实施方式中，编码效应物或免疫调节剂的基因与启动子可操作地连接，所述启动子被水杨酸或其衍生物诱导。经过100多年的临床使用，水杨酸仍是世界上使用最广泛的“非处方药”之一，并且仍将其作为评估新药的标准镇痛/解热/抗炎剂(Clissold；Salicylate and related derivatives of salicylic acid；Drugs.1986；32Suppl 4:8-26)。在一个非限制性实例中，免疫调节剂与启动子PSal可操作地连接，将其作为水杨酸PSal/NahR生物传感器回路(部分：BBa_J61051)的一部分，其最初来自恶臭假单胞菌。nahR基因是从恶臭假单胞菌的83kb萘降解质粒NAH7中提取的，其编码34kDa的蛋白，该蛋白与nah和sal启动子结合以响应诱导剂水杨酸以激活转录(Dunn,N.W.,and I.C.Gunsalus(1973)Transmissible plasmid encoding early enzymes of naphthalene oxidationin Pseudomonas putida.J.Bacteriol.114:974-979)。在该系统中，NahR是由组成型启动子(Pc)组成型表达的，并且目标蛋白(例如，免疫调节剂)的表达是在存在诱导剂(例如，水杨酸)的情况下被NahR正向调控的。因而，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码免疫调节剂的基因序列，其与水杨酸诱导型启动子(例如，PSal)可操作地连接。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含编码NahR的一种或多种基因序列，其与启动子可操作地连接。在一些实施方式中，NahR在本文所述的或本领域公知的组成型启动子的控制下。在一些实施方式中，NahR在本文所述的或本领域公知的诱导型启动子的控制下。在本文所述的一些实施方式中，在组成型启动子和PSal启动子的驱动下，将Biobrick BBa_J61051(含有编码NahR的基因)克隆至此前的dacA中。
在一个实施方式中，一种或多种目的免疫调节蛋白，例如一种或多种治疗性多肽的表达是由一种或多种水杨酸诱导型启动子直接或间接驱动的。
在一些实施方式中，水杨酸诱导型启动子可用于或在体内表达一种或多种目的蛋白质的过程中被诱导。在一些实施方式中，一种或多种目的免疫调节蛋白的表达在体内由一种或多种水杨酸诱导型启动子直接或间接驱动。在一些实施方式中，启动子由与本发明的基因工程细菌例如水杨酸共同施用的分子直接或间接诱导。
在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在腹腔内施用水杨酸。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在腹腔内施用水杨酸。在一些实施方式中，在腹腔内施用水杨酸与将细菌注射进入肿瘤同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在静脉内施用水杨酸。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在静脉内施用水杨酸。在一些实施方式中，在静脉内施用水杨酸与将细菌注射进入肿瘤同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点皮下施用水杨酸。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点皮下施用水杨酸。在一些实施方式中，在皮下施用水杨酸与将细菌注射进入肿瘤同时进行。
在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在瘤内施用水杨酸。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在瘤内施用水杨酸。在一些实施方式中，在瘤内施用水杨酸与将细菌注射进入肿瘤同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在腹腔内施用水杨酸。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在腹腔内施用水杨酸。在一些实施方式中，在腹腔内施用水杨酸与细菌静脉内施用同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在静脉内施用水杨酸。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在静脉内施用水杨酸。在一些实施方式中，在静脉内施用水杨酸与细菌静脉内施用同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点皮下施用水杨酸。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点皮下施用水杨酸。在一些实施方式中，在皮下施用水杨酸与细菌静脉内施用同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点瘤内施用水杨酸。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点瘤内施用水杨酸。在一些实施方式中，在瘤内施用水杨酸与细菌静脉内施用同时进行。
在一些实施方式中，在体内施用之前在菌株的体外生长，制备或制造过程中，一种或多种水杨酸诱导型启动子直接或间接地驱动一种或多种目的蛋白的表达。在一些实施方式中，水杨酸诱导型启动子在培养中被诱导，例如在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中生长，例如在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造过程中。在一些实施方式中，启动子由添加至细菌培养物中以诱导表达的分子直接或间接诱导，并在施用例如水杨酸之前用有效载荷预载细菌。在一些实施方式中，由水杨酸诱导的培养物是需氧生长的。在一些实施方式中，由水杨酸诱导的培养物厌氧生长。
在一些实施方式中，水杨酸诱导型启动子驱动来自本文所述的低拷贝质粒或高拷贝质粒或生物安全系统质粒的一种或多种目的蛋白质的表达。在一些实施方式中，水杨酸诱导型启动子驱动来自整合到细菌染色体中的构建体的一种或多种目的蛋白质的表达。本文描述了示例性插入位点。
在一些实施方式中，将一种或多种目的蛋白质连接至并由天然水杨酸诱导型启动子驱动。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种具有与SEQ ID NO:1273或SEQID NO:1274至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的基因序列。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1273或SEQ ID NO:1274的基因序列。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其由SEQ ID NO:1273或SEQ ID NO:1274组成。
在一些实施方式中，水杨酸诱导型构建体还包含编码NahR的基因，其在一些实施方式中，是发散地由组成型或诱导型启动子转录的。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种具有与SEQ ID NO:1278具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的基因序列。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含含有SEQ ID NO:1278的基因序列。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含由SEQ ID NO:1278组成的基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有与SEQ ID NO:1280编码的多肽具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的多肽的一种或多种基因序列。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码包含SEQ ID NO:1280的多肽的基因序列。在另一个实施方式中，基因工程化细菌表达的多肽由SEQ ID NO:1280组成。
在一个实施方式中，编码免疫调节剂的基因与启动子可操作地连接，所述启动子是由cumate或其衍生物诱导的。适宜的衍生物是本领域公知的并且例如在美国专利号7745592中所述的。cumate诱导的益处包括无毒、水溶性和便宜。此前已描述了在天然P.putida F1中cumate调控的表达功能的基本机制，以及如何将其应用于其他细菌底盘，包括但不限于大肠杆菌(参见例如，Choi等，Novel,Versatile,and Tightly RegulatedExpression System for Escherichia coli Strains；Appl.Environ.Microbiol.2010年08月，vol.76no.15 5058-5066)。本质上，cumate回路或开关包括四个组分：强启动子，阻遏蛋白结合的DNA序列或操纵子，cymR表达的阻遏蛋白和作为诱导剂的cumate。加入诱导剂产生的变化导致在cumate和CymR之间形成复合物，并导致阻遏物从其DNA结合位点去除，从而表达目的基因。在组成型启动子和cymR响应性启动子的驱动下，包含cymR基因的构建体被克隆进入此前的DacA基因中，以导致在本文其他部分描述的cumate诱导的DacA的表达。
在一个实施方式中，一种或多种目的免疫调节蛋白，例如一种或多种治疗性多肽的表达，直接或间接地由一种或多种可被cumate或其衍生物诱导的启动子驱动。
在一些实施方式中，cumate诱导型启动子可用于或在体内表达一种或多种目的蛋白质的过程中被诱导。在一些实施方式中，一种或多种目的免疫调节蛋白的表达在体内由一种或多种cumate诱导型启动子直接或间接驱动。在一些实施方式中，启动子由与本发明的基因工程细菌例如cumate共同施用的分子直接或间接诱导。
在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在腹腔内施用cumate。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在腹腔内施用cumate。在一些实施方式中，在腹腔内施用cumate与将细菌注射进入肿瘤同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在静脉内施用cumate。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在静脉内施用cumate。在一些实施方式中，在预定时间点在静脉内施用cumate。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在皮下施用cumate。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在皮下施用cumate。在一些实施方式中，在皮下施用cumate与将细菌注射进入肿瘤同时进行。
在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在瘤内施用cumate。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在瘤内施用cumate。在一些实施方式中，在瘤内施用cumate与将细菌注射进入肿瘤同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在腹腔内施用cumate。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在腹腔内施用cumate。在一些实施方式中，在腹腔内施用cumate与细菌静脉内施用同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在静脉内施用cumate。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在静脉内施用cumate。在一些实施方式中，在静脉内施用cumate与细菌静脉内施用同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在皮下施用cumate。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在皮下施用cumate。在一些实施方式中，在皮下施用cumate与细菌静脉内施用同时进行。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之前，在预定时间点在瘤内施用cumate。在一些实施方式中，在将细菌注射进入肿瘤之后，在预定时间点在瘤内施用cumate。在一些实施方式中，在瘤内施用cumate与细菌静脉内施用同时进行。
在一些实施方式中，在体内施用之前在菌株体外生长，制备或生产的期间，一种或多种目的蛋白的表达由一种或多种cumate诱导型启动子直接或间接驱动。在一些实施方式中，cumate诱导型启动子在培养物中诱导，例如，在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中生长，例如，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，制剂和/生产中使用。在一些实施方式中，启动子直接或间接地由分子诱导，所述分子在细菌培养物中添加以诱导表达并在施用前用有效负载预加载细菌，例如cumate。在一些实施方式中，由cumate诱导的培养物在需氧条件下生长。在一些实施方式中，由cumate诱导的培养物在厌氧条件下生长。
在一些实施方式中，cumate诱导型启动子驱动一种或多种来自本文所述的低拷贝质粒或高拷贝质粒或生物安全系统质粒的目的蛋白质的表达。在一些实施方式中，cumate诱导型启动子驱动一种或多种来自整合到细菌染色体中的构建体的目的蛋白质的表达。本文描述了示例性插入位点。
在一些实施方式中，一种或多种目标蛋白与天然cumate诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含与SEQ ID NO:1270或SEQ ID NO:1271具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的一种或多种基因序列。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含含有SEQ ID NO:1270或SEQ ID NO:1271的基因序列。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含由SEQ ID NO:1270或SEQ ID NO:1271组成的基因序列。
在一些实施方式中，cumate诱导型构建体还包含编码CymR的基因，其在一些实施方式中，是发散地由组成型或诱导型启动子转录的。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种基因序列，其与SEQ ID NO:1268具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含含有SEQ ID NO:1268的基因序列。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含由SEQ ID NO:1268组成的基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的一种或多种基因序列，所述多肽与由SEQ ID NO:1269编码的多肽具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的基因序列，所述多肽包含SEQ ID NO:1269。在又一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽由SEQ ID NO:1269组成。
在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中描述了本公开中涉及的其他诱导型启动子，其全部内容通过引用并入本文。此类启动子包括阿拉伯糖诱导型、鼠李糖诱导型和IPTG诱导型启动子，四环素诱导型启动子，温度诱导型启动子和PSSB启动子。可以将这些启动子彼此之间组合或与其他诱导型启动子组合，如低氧诱导型启动子或组成型启动子，以微调不同效应物的表达，例如在一种细菌中或在一个以上细菌菌株的组合物中。
组成型启动子
在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于质粒上并可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于染色体上并且与组成型启动子可操作地连接。
在一些实施方式中，组成型启动子在体内条件下是有活性的，例如肿瘤微环境的肠和/或条件，如本文所述。在一些实施方式中，启动子在体外条件下是有活性的，例如，如本文所述的各种细胞培养和/或细胞制造条件。在一些实施方式中，组成型启动子在体内条件下是活性的，例如，如本文所述的肿瘤微环境的肠和/或条件，以及在体外条件下，例如各种细胞培养和/或细胞产生和/或制造条件，如本文所述。
在一些实施方式中，与编码有效负载的基因可操作地连接的组成型启动子在各种外源环境条件下(例如，体内和/或体外和/或生产/制造条件)具有活性。
在一些实施方式中，组成型启动子在对哺乳动物肠道特异的外源环境条件和/或肿瘤微环境条件下具有活性。在一些实施方式中，组成型启动子在哺乳动物小肠特异性的外源环境条件下具有活性。在一些实施方式中，组成型启动子在低氧或厌氧条件下有活性，例如哺乳动物肠道的环境和/或肿瘤微环境的条件。在一些实施方式中，组成型启动子在哺乳动物肠道特异性的分子或代谢物和/或肿瘤微环境条件存在下具有活性。在一些实施方式中，组成型启动子由与细菌细胞共同施用的分子直接或间接诱导。在一些实施方式中，组成型启动子在体外培养，细胞生产和/或制造条件期间存在的分子或代谢物或其他条件下是有活性的。
细菌组成型启动子是本领域公知的，并且在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中对其进行了描述，其全部内容通过引用并入本文。实例包括在本文的SEQ ID NO:598-739中，并且其子集如表11中所示。
表11：启动子
Figure BDA0002364453000004101
Figure BDA0002364453000004111
在一些实施方式中，启动子是Plpp或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含SEQ ID NO:740的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:740的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是PapFAB46或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含SEQ ID NO:741的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:741的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是PJ23101+UP元件或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含SEQ ID NO:742的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:742的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是PJ23107+UP元件或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含SEQ ID NO:743的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:743的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是PSYN23119或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含SEQ ID NO:744的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:744的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。
可以与有效负载连接的其他启动子包括apFAB124(tcgacatttatcccttgcggcgaatacttacagccatagcaa(SEQ ID NO:1443))；apfab338(GGCGCGCCTTGACAATTAATCATCCGGCTCCTAGGATGTGTGGAGGGAC(SEQ ID NO:1444))，apFAB66(GGCGCGCCTTGACATCAGGAAAATTTTTCTGTATAATAGATTCATCTCAA(SEQ ID NO:1445))和apFAB54(GGCGCGCCTTGACATAAAGTCTAACCTATAGGATACTTACAGCCATACAAG(SEQ ID NO:1446))。在一些实施方式中，启动子是apFAB124或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含apFAB124的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与apFAB124的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是apFAB338或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含apFAB338的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与apFAB338的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是apFAB66或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含apFAB66的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与apFAB66的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是apFAB54或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含apFAB54的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与apFAB54的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的同源性。
核糖体结合位点
在一些实施方式中，核糖体结合位点被加入、替换或替代。通过测试几个核糖体结合位点，可以将表达水平微调至所需水平。在一些实施方式中，选择适于原核表达并且能够用于实现所需表达水平的RBS。RBS的非限制性实例在标准生物学部分注册中列出，并且在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中对其进行了描述，其全部内容通过引用并入本文。适宜的实例如SEQ ID NO：1018-1050和869-871、873-877、880-887中所示。
在菌株培养过程中诱导有效负载
在培养期间有效载荷的诱导在公开日为2017年11月11日以WO2017/123675公开的国际专利申请PCT/US2017/013072中进行了描述，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，期望在施用之前预先诱导目的有效负载或蛋白质表达和/或有效负载活性。这种目的有效负载或蛋白质可以是用于分泌的效应物，或者可以是催化代谢反应以产生效应物的酶。在其他实施方式中，目的蛋白质是使有害代谢物分解代谢的酶。在这种情况下，菌株预装有活性有效负载或目标蛋白质。在这种情况下，本发明的基因工程化细菌在细胞培养期间在细胞培养期间提供的条件下表达一种或多种目的蛋白质，在体内给药之前进行扩增，纯化，发酵和/或制造。此类培养条件可以在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中提供，例如，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造期间使用。如本文所用，术语“细菌培养物”或细菌细胞培养物“或”培养物“是指细菌细胞或微生物，其在几个生产过程中维持或体外生长，包括细胞生长，细胞扩增，回收，纯化，发酵。和/或制造。如本文所用，术语“发酵”是指在限定条件下细菌的生长，扩增和维持。在诱导剂，营养物，限定温度等存在下，发酵可在许多细胞培养条件下发生，包括厌氧或低氧或氧化条件。
选择培养条件以实现细胞的最佳活性和活力，同时保持高细胞密度(高生物量)产量。监测和调整许多细胞培养条件和操作参数以实现最佳活性，高产量和高活力，包括氧水平(例如，低氧，微氧，需氧)，培养基温度和营养素和/或不同生长。培养基中提供的培养基，化学和/或营养诱导剂和其他组分。
在一些实施方式中，直接或间接诱导一种或多种目的蛋白质，同时使菌株生长用于体内施用。不希望受理论束缚，预诱导可以增强体内活性，例如肠或肿瘤中。如果特定肠隔室中的细菌停留时间相对较短，则细菌可以通过小肠而不会达到完全的体内诱导能力。相反，如果菌株被预先诱导和预加载，菌株已经完全活跃，当细菌到达肠道时允许更快的活动。因此，没有传输时间被“浪费”，其中应变不是最佳活动的。随着细菌继续通过肠道，体内诱导发生在肠道的环境条件下(例如，低氧，或存在肠道代谢物)。类似地，如本文所述的，其他细菌的全身施用或瘤内注射，当细菌到到达肿瘤时，可以更加迅速地产生更高的活性。一旦在肿瘤中，则发生体内诱导，例如在肿瘤微环境的条件下。
在一个实施方式中，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造期间诱导一种或多种有效负载的表达。在一个实施方式中，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，制剂和/或制造过程中诱导几种不同目的蛋白的表达。
在一些实施方式中，在体内施用之前的菌株生长期间，在没有任何预诱导方案的情况下施用菌株。
厌氧诱导
在一些实施方式中，细胞在培养的厌氧或低氧条件下诱导。在这种情况下，细胞生长(例如，持续1.5至3小时)直至它们达到一定的OD，例如，OD在0.1至10的范围内，表明一定的密度，例如，范围从1×108到1×1011。和指数生长，然后切换到厌氧或低氧条件约3至5小时。在一些实施方式中，在厌氧或低氧条件下诱导菌株，例如以诱导FNR启动子活性并在一种或多种FNR启动子的控制下驱动一种或多种有效载荷和/或转运蛋白的表达。
在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达在一种或多种FNR启动子的控制下，并在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，制剂和/或制造过程中诱导。厌氧或低氧条件。在一个实施方式中，几种不同目的蛋白质的表达在一种或多种FNR启动子的控制下，并且在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或在厌氧或低温下制造期间被诱导。氧气条件。
不希望受理论的束缚，认为包含FNR启动子的控制下的一个或多个有效载荷(一个或多个)的菌株，可以允许从体外这些启动子有效载荷(一个或多个)的表达，厌氧或低氧培养条件下，和在在体内，在肠道中发现的低氧条件和/或肿瘤微环境的条件下。
在一些实施方式中，连接至感兴趣的有效负载的启动子可以由在化学和/或营养诱导剂的存在下在厌氧或低氧条件下诱导的阿拉伯糖，cumate和水杨酸，IPTG，鼠李糖，四环素和/或其他化学和/或营养诱导剂诱导。特别地，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列受FNR启动子控制，而其他基因序列受化学和/或营养诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，菌株可以包含一种或多种有效负载的基因序列和/或在一种或多种FNR启动子的控制下，以及在一种或多种本文所述的组成型启动子控制下的一种或多种有效负载的基因序列。
有氧诱导
在一些实施方式中，期望在需氧条件下制备，预加载和预诱导菌株。这允许更有效的生长和活力，并且在一些情况下，减少毒性代谢物的积累。在这种情况下，细胞生长(例如，持续1.5至3小时)直至它们达到一定的OD，例如，OD在0.1至10的范围内，表明一定的密度，例如，范围从1×108到1×1011。然后通过添加诱导物或通过其他方式诱导指数生长，例如转移到许可温度，持续约3至5小时。
在一些实施方式中，在本文所述或本领域已知的阿拉伯糖，cumate和水杨酸，IPTG，鼠李糖，四环素和/或其他化学和/或营养诱导物可诱导的启动子可在化学和/或营养诱导物存在下在需氧条件下诱导。细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制期间被诱导。和/或在有氧条件下制造。
在一些实施方式中，基因工程化菌株包含在需氧培养条件下诱导的基因序列。在一些实施方式中，这些菌株还包含用于在肿瘤微环境的肠和/或条件中体内激活的FNR诱导型基因序列。在一些实施方式中，这些菌株不进一步包含用于在肿瘤微环境的肠和/或条件中体内激活的FNR诱导型基因序列。
微需氧诱导
在一些实施方式中，通过在微需氧条件下预诱导细菌菌株来优化生存力，生长和活性。在一些实施方式中，微需氧条件最适合于在最佳生长，活性和活力条件与诱导的最佳条件之间“达到平衡”；特别地，如果一种或多种有效载荷的表达由厌氧和/或低氧启动子(例如FNR启动子)驱动。在这种情况下，细胞例如生长(例如，持续1.5至3小时)直至它们达到一定的OD，例如，OD在0.1至10的范围内，表明一定的密度，例如，范围从1×108到1×1011。然后通过添加诱导物或通过其他方式诱导指数生长，例如在允许温度下转移约3至5小时。
在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达在一种或多种FNR启动子的控制下，并且在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造期间在微需氧条件下被诱导。
不希望受理论束缚，在FNR启动子控制下包含一种或多种有效负载的菌株可允许在体外，微氧培养条件下和体内，在体外，从这些启动子表达有效负载。在肠道中发现的低氧条件和/或肿瘤微环境的条件。
在一些实施方式中，可以在化学和/或营养诱导物存在下在微需氧条件下诱导由阿拉伯糖，cumate和水杨酸，IPTG，鼠李糖，四环素和/或其他化学和/或营养诱导剂诱导的启动子。特别地，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列受FNR启动子控制，而其他基因序列受化学和/或营养诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，菌株可以包含在一种或多种FNR启动子控制下的一种或多种有效负载的基因序列，以及在一种或多种本文所述的组成型启动子控制下的一种或多种有效负载的基因序列。
在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并在微氧条件下在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造期间被诱导。
使用定相，脉冲和/或循环诱导菌株
在一些实施方式中，在细胞生长，扩增，回收，纯化，发酵和/或制造期间采用循环，定相或脉冲技术以在体内施用之前有效诱导和生长菌株。该方法用于在最佳生长，活动，细胞健康和活力条件与诱导的最佳条件之间“达到平衡”；特别是，如果在诱导条件下生长，细胞健康或生存能力受到负面影响。在这种情况下，细胞在第一阶段或循环中生长(例如，持续1.5至3小时)，直到它们达到某一OD，例如，OD在0.1至10的范围内，表明一定的密度，例如，范围从1X10。^8到1X10^11，然后通过添加诱导剂或通过其他方式诱导，例如转移到允许温度(如果启动子被温度调节)，或改变氧水平(例如，降低氧水平)在诱导FNR启动子驱动的构建体的情况下约3至5小时。在第二阶段或循环中，条件恢复到支持最佳生长，细胞健康和活力的原始条件。或者，如果使用化学和/或营养诱导剂，则可以在第二阶段或循环中向培养物中加入第二剂量的诱导物。
在一些实施方式中，采用两个循环的最佳条件和诱导条件(即，生长，诱导，恢复和生长，诱导)。在一些实施方式中，采用三个循环的最佳条件和诱导条件。在一些实施方式中，采用四个或更多个最佳条件循环和诱导条件。在非限制性实例中，这种循环和/或定相用于在厌氧和/或低氧条件下诱导(例如，诱导FNR启动子)。在一个实施方式中，细胞生长至最佳密度，然后在厌氧和/或低氧条件下诱导。在由于应激诱导条件而对生长和/或生存力产生负面影响之前，细胞返回到氧化条件以恢复，之后它们再次返回以诱导厌氧和/或低氧条件第二次。在一些实施方式中，根据需要重复这些循环。
在一些实施方式中，用化学和/或营养诱导剂将生长的培养物掺入一次。在一些实施方式中，用化学和/或营养诱导剂将生长的培养物掺入两次。在一些实施方式中，用化学和/或营养诱导剂将生长的培养物掺入三次或更多次。在一个非限制性实例中，细胞首先在最佳生长条件下生长至一定密度，例如1.5至3小时)，达到0.1至10，直至细胞密度为1×10^8至1X10^11。然后将化学诱导剂，例如阿拉伯糖或IPTG加入培养物中。3至5小时后，加入另外剂量的诱导物以重新开始诱导。可根据需要重复尖峰。
在一些实施方式中，在细胞生长、细胞扩增、发酵、回收、纯化、制剂和/或生产过程中通过使用定相或循环或脉冲或加标技术诱导的有效负载在不同诱导型启动子(例如，两种不同化学诱导剂)的控制下。在其他实施方式中，有效负载在低氧条件或微需氧条件下诱导的盒第二有效载荷是由化学诱导剂诱导的。
核酸
在一些实施方式中，本公开提供了用于生产一种或多种免疫引发剂和/或免疫维持剂的新核酸。在一些实施方式中，核酸编码一种或多种免疫引发剂和/或免疫维持剂多肽。因而，在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种免疫引发剂和/或免疫维持剂多肽的一种或多种基因序列。
在一些实施方式中，本公开提供了用于生产一种或多种STING激动剂的新核酸。在一些实施方式中，核酸编码一种或多种STING激动剂生产多肽。因而，在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种STING激动剂生产多肽的一种或多种基因。
在一些实施方式中，本公开提供了用于生产c-diAMP的新核酸。在一些实施方式中，核酸编码一种或多种c-diAMP生产多肽。因而，在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种环二腺苷酸环化酶多肽的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码DacA多肽的基因序列。在某些实施方式中，DacA多肽与SEQ ID NO:1257具有至少约80％同一性。在某些实施方式中，DacA多肽与SEQ ID NO:1257具有至少约90％同一性。在某些实施方式中，DacA多肽与SEQ ID NO:1257具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，DacA多肽与SEQ ID NO:1257具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，DacA多肽包含SEQ ID NO:1257。在其他特定的实施方式中，DacA多肽由SEQ ID NO:1257组成。在一些实施方式中，核酸包含dacA基因序列。在某些实施方式中，核酸包含与SEQ ID NO:1258具有至少约80％同一性的dacA基因序列。在某些实施方式中，核酸包含与SEQ ID NO:1258具有至少约90％同一性的dacA基因序列。在某些实施方式中，核酸包含与SEQ ID NO:1258具有至少约95％同一性的dacA基因序列。在一些实施方式中，核酸包含与SEQ ID NO:1258具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的dacA基因序列。在一些特定的实施方式中，核酸包含dacA基因序列，其含有SEQ ID NO:1258。在其他特定的实施方式中，核酸包含dacA基因序列，其由SEQ ID NO:1258组成。
在某些实施方式中，含有dacA基因序列的核酸与低氧诱导型启动子可操作地连接。在某些实施方式中，含有dacA基因序列的核酸与低氧诱导型启动子可操作地连接，并且与SEQ ID NO:1284具有至少约80％同一性。在某些实施方式中，含有dacA基因序列的核酸与低氧诱导型启动子可操作地连接，并且与SEQ ID NO:1284具有至少约90％同一性。在某些实施方式中，含有dacA基因序列的核酸与低氧诱导型启动子可操作地连接，并且与SEQID NO:1284具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，含有dacA基因序列的核酸与低氧诱导型启动子可操作地连接，并且与SEQ ID NO:1284具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，含有与低氧诱导型启动子可操作地连接的dacA基因序列的核酸包含SEQ ID NO:1284。在另一个特定的实施方式中，含有与低氧诱导型启动子可操作地连接的dacA基因序列的核酸由SEQ ID NO:1284组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于生产c-GAMP的新核酸。在一些实施方式中，核酸编码一种或多种c-GAMP生产多肽。因而，在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种环c-GAMP合酶(cGAS)多肽的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码GAMP合酶多肽的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码人GAMP合酶多肽的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码来自Verminephrobacter eiseniae的GAMP合酶多肽的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码来自反硝化金氏菌(ATCC 33394)的GAMP合酶多肽的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码来自杆状奈瑟氏菌(ATCC BAA-1200)的GAMP合酶多肽的基因序列。在某些实施方式中，cGAS多肽与选自SEQ ID NO:1254、1260、1261和1262的序列具有至少约80％同一性。在某些实施方式中，cGAS多肽与选自SEQ ID NO:1254、1260、1261和1262的序列具有至少约90％同一性。在某些实施方式中，cGAS多肽与选自SEQID NO:1254、1260、1261和1262的序列具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，cGAS多肽与选自SEQ ID NO:1254、1260、1261和1262的序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，cGAS多肽包含选自SEQ ID NO:1254、1260、1261和1262的序列。在其他特定的实施方式中，cGAS多肽由选自SEQ ID NO:1254、1260、1261和1262的序列组成。在一些实施方式中，核酸包含cGAS基因序列。在某些实施方式中，包含cGAS基因序列的核酸与选自SEQ IDNO:1255、1263、1264和1265的序列具有至少约80％同一性。在某些实施方式中，包含cGAS基因序列的核酸与选自SEQ ID NO:1255、1263、1264和1265的序列具有至少约90％同一性。在某些实施方式中，包含cGAS基因序列的核酸与选自SEQ ID NO:1255、1263、1264和1265的序列具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，包含cGAS基因序列的核酸与选自SEQ IDNO:1255、1263、1264和1265的序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，包含cGAS基因序列的核酸包含选自SEQ ID NO:1255、1263、1264和1265的序列。在其他特定的实施方式中，包含cGAS基因序列的核酸由SEQ ID NO:1255、1263、1264和1265的序列组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于去除犬尿氨酸的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种犬尿氨酸去除酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码犬尿氨酸代谢酶的核酸序列包含KynU(假单胞菌)。因此，在一个实施方式中，包含KynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:68具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含KynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:68具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含KynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:68具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含KynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:68具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含KynU基因的核酸序列包含SEQ ID NO:68。在另一个实施方式中，包含KynU基因的核酸序列由SEQ ID NO:68组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，犬尿氨酸降解酶包含犬尿氨酸酶(荧光假单胞菌)。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:65具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:65具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:65具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:65具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:65的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:65的序列组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于消耗犬尿氨酸的新核酸。在一些实施方式中，核酸编码一种或多种犬尿氨酸消耗多肽。因而，在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种犬尿氨酸消耗多肽的一种或多种基因序列。
在一些实施方式中，本公开提供了用于消耗犬尿氨酸的新核酸。在一些实施方式中，核酸编码一种或多种犬尿氨酸消耗多肽。因而，在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种犬尿氨酸酶多肽的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码犬尿氨酸酶多肽的基因序列，例如来自荧光假单胞菌的。在某些实施方式中，犬尿氨酸酶多肽与SEQ ID NO:65具有至少约80％同一性。在某些实施方式中，犬尿氨酸酶多肽与SEQ ID NO:65具有至少约90％同一性。在某些实施方式中，犬尿氨酸酶多肽与SEQ ID NO:65具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，犬尿氨酸酶多肽与SEQ ID NO:65具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，犬尿氨酸酶多肽包含SEQ ID NO:65。在其他特定的实施方式中，犬尿氨酸酶多肽由SEQ ID NO:65组成。在一些实施方式中，核酸包含kyn基因序列。在某些实施方式中，包含kyn基因序列的核酸与SEQ ID NO:68具有至少约80％同一性。在某些实施方式中，包含kyn基因序列的核酸与SEQ ID NO:68具有至少约90％同一性。在某些实施方式中，包含kyn基因序列的核酸与SEQ ID NO:68具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，包含kyn基因序列的核酸与SEQ ID NO:68具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，包含kyn基因序列的核酸包含SEQ ID NO:68。在其他特定的实施方式中，包含kyn基因序列的核酸由SEQ ID NO:68组成。在一些实施方式中，核酸包含kyn基因序列。在某些实施方式中，包含kyn基因序列的核酸与SEQ ID NO:1283具有至少约80％同一性。在某些实施方式中，包含kyn基因序列的核酸与SEQ ID NO:1283具有至少约90％同一性。在某些实施方式中，包含kyn基因序列的核酸与SEQ ID NO:1283具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，包含kyn基因序列的核酸与SEQ ID NO:1283具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，包含kyn基因序列的核酸包含SEQ ID NO:1283。在其他特定的实施方式中，包含kyn基因序列的核酸由SEQ ID NO:1283组成。
在某些实施方式中，包含kyn基因序列的核酸与如本文所述的组成型启动子(例如，PSYN23119)可操作地连接。在某些实施方式中，包含kyn基因序列的核酸与低氧诱导型启动子可操作地连接，并且与SEQ ID NO:890具有至少约80％同一性。在某些实施方式中，包含与低氧诱导因子可操作地连接的kyn基因序列的核酸与SEQ ID NO:890具有至少约90％同一性。在某些实施方式中，包含与低氧诱导因子可操作地连接的kyn基因序列的核酸与SEQ ID NO:890具有至少约95％同一性。在一些实施方式中，包含与低氧诱导因子可操作地连接的kyn基因序列的核酸与SEQ ID NO:890具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些特定的实施方式中，包含与低氧诱导因子可操作地连接的kyn基因序列的核酸包含SEQ ID NO:890。在其他特定的实施方式中，包含与低氧诱导因子可操作地连接的kyn基因序列的核酸由SEQ IDNO:890组成。
在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中描述了其他适宜的核酸序列，其全部内容通过引用并入本文。
在上述任何核酸实施方式中，用于产生效应物，例如免疫调节剂，例如免疫引发剂和/或免疫维持剂组合的一种或多种核酸序列与一种或多种直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，一种或多种核酸序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子在外源环境条件下诱导，例如在肠道，肿瘤微环境或其他组织特异性条件中发现的条件。在一些实施方式中，所述一种或多种核酸序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子由在肠道，肿瘤微环境或其他特定条件中发现的代谢物诱导。在一些实施方式中，一种或多种核酸序列与在低氧或厌氧条件下诱导的直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，一种或多种核酸序列与在炎性条件下诱导的直接或间接诱导型启动子(例如，RNS，ROS)可操作地连接，如本文所述。在一些实施方式中，一种或多种核酸序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子在免疫抑制条件下诱导，例如，如在肿瘤中发现的，如本文所述。在一些实施方式中，所述一种或更多种基因序列与通过暴露化学或营养诱导物诱导的直接或间接诱导型启动子连接，所述化学或营养诱导物可以在体内条件下存在或不存在并且可以在体内存在期间存在。体外条件(例如菌株培养，扩增，制造)，例如四环素或阿拉伯糖，cumate和水杨酸或本文所述的其他条件。在一些实施方式中，一种或更多种有效负载都与组成型启动子连接，例如如本文所述以及于2017年1月11日提交的以WO2017/123675公开的国际专利申请PCT/US2017/013072中所描述的，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，两个或更多个基因序列与相同的启动子序列可操作地连接。在一些实施方式中，两个或更多个基因序列与两个或更多个不同的启动子序列可操作地连接，所述启动子序列可以全部是组成型启动子(相同或不同的组成型启动子)，全部是诱导型启动子(通过相同或不同的诱导物)，或组成型启动子和诱导型启动子的混合物。
在一个实施方式中，编码一种或多种免疫调节剂的一种或多种核酸序列位于细菌细胞中的质粒上。在另一个实施方式中，编码一种或多种免疫调节剂的一种或多种核酸序列位于细菌细胞的染色体中。在任何这些核酸实施方式中，编码一种或多种免疫调节剂的一种或多种核酸序列可以与编码本文所述的其他免疫调节剂的任何其他核酸组合。
在任何这些实施方式中，编码如上文和本文其他部分所述的效应分子(例如，免疫调节剂(例如，免疫维持剂或免疫调节剂))的一种或多种核酸序列可以与编码一种或多种其他效应分子(即，一种或多种治疗性分子或一种或多种新陈代谢转化剂)的一种或多种核酸序列组合(在相同或在单独的核酸分子上)。编码免疫引发剂或免疫维持剂的核酸序列可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如低氧诱导型启动子或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。
在任何这些实施方式中，编码一种或多种上文所述的效应分子的一种或多种核酸序列可以与编码本文所述的一种或多种STING激动剂生产酶的一种或多种核酸序列组合(在相同或在单独的核酸分子上)。在一些实施方式中，与编码效应分子的一种或多种核酸序列组合的一种或多种核酸序列编码DacA。DacA可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，与编码效应分子的一种或多种核酸序列组合的一种或多种核酸序列编码cGAS。cGAS可以在组成型或诱导型启动子的控制下，例如，低氧诱导型启动子(如FNR)或者本文所述的任何其他组成型或诱导型启动子。
在任何这些组合的实施方式中，一种或多种核酸序列包含具有营养缺陷型修饰的一种或多种核酸序列，例如在DapA、ThyA或者这两者中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，一种或多种核酸序列包含含有噬菌体修饰的核酸序列，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
分泌
在本文所述的任何实施方式中，其中基因工程微生物产生蛋白质，多肽，肽或其他旨在从微生物分泌的免疫调节剂，DNA，RNA，小分子或其他分子，工程微生物可包含分泌机制和编码分泌系统的相应基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含天然分泌机制或非天然分泌机制，其能够在细胞外环境中从细菌细胞质分泌免疫调节剂。许多细菌已经进化出复杂的分泌系统以跨越细菌细胞包膜运输底物。诸如小分子，蛋白质和DNA的底物可以释放到细胞外空间或周质(例如肠腔或其他空间)中，注射到靶细胞中或与细菌膜结合。
在革兰氏阴性细菌中，分泌机制可能跨越内膜和外膜之一或两者。为了将蛋白质(例如治疗性多肽)转移至细胞外空间，必须首先将多肽在细胞内翻译，在内膜上移动并最终在外膜上移动。许多效应蛋白(例如，治疗性多肽)-特别是真核来源的蛋白-含有二硫键以稳定三级和四级结构。虽然这些键能够在周质伴侣的帮助下在氧化周质区中正确形成，但为了使多肽易位穿过外膜，必须减少二硫键并再次展开蛋白质。
在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中描述了用于从革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中分泌异源性多肽(例如，效应分子)的适宜分泌系统，其全部内容通过引用并入本文。此类分泌系统包括双重跨膜分泌系统，包括但不限于I型分泌系统(T1SS)、II型分泌系统(T2SS)、III型分泌系统(T3SS)、IV型分泌系统(T4SS)、VI型分泌系统(T6SS)、多药物外排泵的阻力-结瘤-分裂(RND)家族，以及VII型分泌系统(T7SS)。或者，可以使用基于溶血素的分泌系统、V型自转运蛋白分泌系统、传统的或改良的III型或类III型分泌系统(T3SS)、鞭毛III型分泌途径。在一些实施方式中，可以使用非天然的单一跨膜分泌系统(例如，Tat或Tat样系统或者Sec或Sec样系统)。根据本公开，可以将本文和PCT/US2017/013072中描述的任何分泌系统用于分泌目标多肽。
在革兰氏阴性细菌中分泌正确折叠的蛋白质的一种方法-特别是那些需要二硫键的细菌-是将还原环境周质与不稳定的外膜结合起来。以这种方式，蛋白质被动员到氧化环境中并被允许适当地折叠。与编排的细胞外分泌系统相反，蛋白质然后能够通过膜渗漏以正确折叠的形式逃离周质空间。因此，这些“渗漏的”革兰氏阴性突变体能够分泌生物活性的，适当的二硫键结合的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌具有“渗漏”或去稳定的外膜(DOM)。使细菌外膜不稳定以诱导渗漏可以通过删除或诱变负责将外膜束缚至刚性肽聚糖骨架的基因来实现，包括例如lpp，ompC，ompA，ompF，tolA，tolB和pal。Lpp是细菌细胞中最丰富的多肽，以每个细胞约500,000个拷贝存在，并且作为肽聚糖的细菌细胞壁的主要“粘合剂”。TolA-PAL和OmpA复合物的功能与Lpp相似，是其他缺失靶点，可产生渗漏表型。另外，当周质蛋白酶失活时，已观察到渗漏表型。周质非常密集地填充蛋白质，因此编码几种周质蛋白以促进蛋白质周转。去除周质蛋白酶如degS，degP或nlpI可通过促进周质蛋白的过度积累而诱导渗漏表型。蛋白酶的突变还可以通过防止这些蛋白酶的靶向降解来保留效应物多肽。
此外，这些突变的组合可以协同地增强细胞的渗漏表型，而不会在细胞活力方面造成重大牺牲。因此，在一些实施方式中，工程化细菌具有一个或多个缺失或突变的膜基因。在一些实施方式中，工程化细菌具有缺失或突变的lpp基因。在一些实施方式中，工程化细菌具有一种或多种缺失或突变的基因，选自ompA，ompA和ompF基因。在一些实施方式中，工程化细菌具有一种或多种缺失或突变的基因，选自tolA，tolB和pal基因。在一些实施方式中，工程化细菌具有一种或多种缺失或突变的周质蛋白酶基因。在一些实施方式中，工程化细菌具有一种或多种选自degS，degP和nlp1的缺失或突变的周质蛋白酶基因。在一些实施方式中，工程化细菌具有一种或多种缺失或突变的基因，选自lpp，ompA，ompF，tolA，tolB，pal，degS，degP和nlp1基因。
为了最小化对细胞活力的干扰，可以通过放置一个或多个膜或周质蛋白酶基因(例如选自lpp，ompA，ompF，tolA，tolB，pal，degS，degP和nlpl)使得渗漏表型可诱导。控制诱导型启动子。例如，可以在需要递送(分泌)治疗性多肽的条件下抑制lpp或其他细胞壁稳定性蛋白质或周质蛋白酶的表达。例如，在诱导条件下，可以表达转录抑制蛋白或设计的反义RNA，其减少靶膜或周质蛋白酶基因的转录或翻译。相反，某些肽的过表达可导致不稳定的表型，例如大肠杆菌素的过表达或TolA的第三拓扑结构域，其中可在需要递送(分泌)治疗性多肽的条件下诱导肽过表达。这些策略将使脆弱的，渗漏的表型与生物量产生分离。因此，在一些实施方式中，工程化细菌在诱导型启动子的控制下具有一种或多种膜和/或周质蛋白酶基因。
在其中一种或多种目的蛋白或治疗性蛋白从微生物分泌或输出的一些实施方式中，工程化微生物包含含有分泌标签的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，一种或多种目的蛋白或治疗性蛋白包括RNA或肽来源的“分泌标签”将一种或多种目的蛋白或治疗性蛋白导向特定的分泌系统。分泌标签可以来自sec或tat系统。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含本文所述的天然或非天然分泌系统，用于分泌免疫调节剂，例如细胞因子，抗体(例如scFv)，代谢酶，例如犬尿氨酸酶，和本文描述的其他。
在一些实施方式中，分泌标签选自PhoA，OmpF，cvaC，TorA，fdnG，dmsA，PelB，HlyA分泌信号和HlyA分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签是PhoA分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含选自SEQ ID NO:745或SEQ ID NO:746的序列。在一些实施方式中，分泌标签是OmpF分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签是OmpF分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含SEQ ID NO:747。在一些实施方式中，分泌标签是cvaC分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含SEQ ID NO:748。在一些实施方式中，分泌标签是torA分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含SEQ ID NO:749。在一些实施方式中，分泌标签是fdnG分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含SEQ ID NO:750。在一些实施方式中，分泌标签是dmsA分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含SEQ ID NO:751。在一些实施方式中，分泌标签是PelB分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含SEQ ID NO:752。在一些实施方式中，分泌标签是HlyA分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含选自SEQ ID NO:753和SEQ ID NO:754的序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌编码包含选自Adhesin(ECOLIN_19880)，DsbA(ECOLIN_21525)，GltI(ECOLIN_03430)，GspD(ECOLIN_16495)，HdeB(ECOLIN_19410)，Malde(ECOLIN_22540)，OppA(ECOLIN_07295)，PelB，PhoA(ECOLIN_02255)，PpiA(ECOLIN_18620)，TolB，tort，OmpA，PelB，DsbAmglB和lamB分泌标签的分泌标签的多肽。分泌标签的示例性序列显示于SEQ ID NO:1222，SEQ ID NO:1223，SEQ ID NO:1224，SEQ ID NO:1225，SEQ IDNO:1226，SEQ ID NO:1227，SEQ ID NO:1228，SEQ ID NO:1229，SEQ ID NO:1222NO：1230，SEQ ID NO:1141，SEQ ID NO:1142，SEQ ID NO:1143，SEQ ID NO:1144，SEQ ID NO:1145，SEQ ID NO:1253，SEQ ID NO:1157，SEQ ID NO:1158，SEQ ID NO:1159，SEQ ID NO:1160，SEQ ID NO:1161，SEQ ID NO:1162，SEQ ID NO:1163，SEQ ID NO:1164，SEQ ID NO:1165，SEQ ID NO:1166，和SEQ ID NO:1167。
在一些实施方式中，分泌标签多肽的序列可以选自SEQ ID NO:1218，SEQ ID NO:1219，SEQ ID NO:1181，SEQ ID NO:1220，SEQ ID NO:1221，SEQ ID NO:1180，SEQ ID NO:1184，SEQ ID NO:1186，SEQ ID NO:1190，SEQ ID NO:1182，SEQ ID NO:1135，SEQ ID NO:1183，SEQ ID NO:1188，SEQ ID NO:1187，SEQ ID NO:747，SEQ ID NO:1185和SEQ ID NO:1189
可以将任何分泌标签或分泌系统与本文所述的用于分泌的任何免疫调节剂组合。在一些实施方式中，将分泌系统用于与一种或多种基因组突变组合，所述突变导致渗漏或可扩散的外膜表型(DOM)，包括但不限于lpp、nlP、tolA、PAL。在一些实施方式中，由基因工程化细菌分泌的治疗性蛋白被修饰以增加对蛋白酶(例如，肠蛋白酶)的抗性。
在一些实施方式中，感兴趣的治疗性多肽，例如免疫调节剂，例如本文描述的免疫引发剂和/或免疫维持剂通过扩散外膜(DOM)系统分泌。在一些实施方式中，目标治疗性多肽与N-末端Sec依赖性分泌信号融合。这种N-末端Sec依赖性分泌信号的非限制性实例包括PhoA，OmpF，OmpA和cvaC。在备选实施方式中，目标治疗性多肽与Tat依赖性分泌信号融合。示例性Tat依赖性标签包括TorA，FdnG和DmsA。
在某些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种外膜和/或周质蛋白的缺失或突变。这些蛋白质的一个或多个可以缺失或突变的非限制性实例包括lpp，pal，tolA和/或nlpI。在一些实施方式中，lpp被删除或突变。在一些实施方式中，pal被删除或突变。在一些实施方式中，tolA被删除或突变。在其他实施方式中，nlpI被缺失或突变。在其他实施方式中，某些周质蛋白酶缺失或突变，例如，以增加多肽在周质中的稳定性。此类蛋白酶的非限制性实例包括degP和ompT。在一些实施方式中，degP被删除或突变。在一些实施方式中，ompT被删除或突变。在一些实施方式中，degP和ompT被删除或突变。
表面展示
在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或微生物编码一种或多种编码免疫调节剂的基因和/或基因盒，所述免疫调节剂锚定或展示在细菌和/或微生物的表面上。展示或锚定于细菌和/或微生物的免疫调节剂的实例是本文所述的任何抗癌分子，并且包括但不限于抗体，例如scFv片段和肿瘤特异性抗原。或新抗原。在非限制性实例中，锚定或展示在细菌细胞表面上的抗体或scFv片段针对本文所述的检查点抑制剂，包括但不限于CLTLA4，PD-1，PD-L1。
在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中描述了用于在革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的表面上对异源性多肽(例如，效应分子)进行表面展示的适宜系统，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码包含侵袭素展示标签的治疗性多肽的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码包含SEQ ID NO:990的多肽的基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码包含LppOmpA展示标签的治疗性多肽的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码包含SEQ ID NO:991的多肽的基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码包含intiminN展示标签的治疗性多肽的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码包含SEQ ID NO:992的多肽的基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含显示锚，其与选自SEQ ID NO:990，SEQID NO:991和SEQ ID NO:992的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码展示锚的基因序列，所述展示锚包含选自SEQ ID NO:990，SEQ ID NO:991和SEQ ID NO:992的序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的展示锚由选自SEQ ID NO:990，SEQ ID NO:991和SEQ ID NO:992的序列组成。
在一些实施方式中，一种或多种ScFv显示在细菌细胞表面上，单独或与其他感兴趣的治疗性多肽组合。
在一些实施方式中，细胞表面展示策略或回路与一种细菌中的分泌策略或回路组合。在一些实施方式中，显示和分泌相同的多肽。在一些实施方式中，展示第一多肽并分泌第二多肽。在一些实施方式中，显示策略或回路策略与用于细胞内产生酶并因此其底物的细胞内分解代谢的回路组合。在一些实施方式中，显示策略或显示回路与用于细胞内产生肠屏障增强剂分子和/或抗炎效应分子的回路组合。
在一些实施方式中，表面展示的多肽或融合蛋白的表达由诱导型启动子驱动。在一些实施方式中，诱导型启动子是氧水平依赖性启动子(例如，FNR诱导型启动子)。在一些实施方式中，诱导型启动子由肠道特异性和/或肿瘤特异性或由炎症或炎症反应(RNS，ROS启动子)诱导的启动子诱导，或由可能或可能不是天然存在的代谢物诱导的启动子诱导(例如，可以外源添加)在肠中，例如，阿拉伯糖，cumate，和水杨酸。在备选实施方式中，表面展示的多肽或多肽融合蛋白的表达由组成型启动子驱动。
在一些实施方式中，表面展示的多肽或融合蛋白的表达是基于质粒的。在一些实施方式中，编码用于表面展示的抗体或scFv片段的基因序列是染色体插入的。
必需基因，营养缺陷型，杀伤开关和宿主质粒依赖性
如本文所用，术语“必需基因”是指细胞生长和/或存活所必需的基因。细菌必需基因是本领域普通技术人员所熟知的，并且可以通过定向缺失基因和/或随机诱变和筛选来鉴定(参见，例如，Zhang和Lin，2009，DEG5.0，一个必需的数据库)。原核生物和真核生物中的基因，核酸。AcidsRes。，37：D455-D458和Gerdes等，Essentialgenesonmetabolicmaps，Curr。奥平。Biotechnol。，17(5)：448-456，其中每一个的全部内容通过引用明确地并入本文中)。
“必需基因”可能取决于生物体所处的环境和环境。例如，必需基因的突变，修饰或切除可导致本公开的重组细菌成为营养缺陷型。营养缺陷型修饰旨在使细菌在没有外源添加的生存或生长必需营养素的情况下死亡，因为它们缺乏产生该必需营养素所必需的基因。
营养缺陷型修饰旨在使细菌在没有外源添加的生存或生长必需营养素的情况下死亡，因为它们缺乏产生该必需营养素所必需的基因。在一些实施方式中，本文所述的任何基因工程化细菌还包含细胞存活和/或生长所需的基因中的缺失或突变。在一个实施方式中，必需基因是DNA合成基因，例如thyA。在另一个实施方式中，必需基因是细菌细胞壁合成基因，例如dapA。在另一个实施方式中，必需基因是氨基酸基因，例如serA或MetA。可以靶向细胞存活和/或生长所需的任何基因，包括但不限于cysE，glnA，ilvD，leuB，lysA，serA，metA，glyA，hisB，ilvA，pheA，proA，thrC，trpC，tyrA，thyA，uraA，dapA，dapB，dapD，dapE，dapF，flhD，metB，metC，proAB和thi1，只要相应的野生型基因产物不在细菌中产生。示例性细菌基因可被破坏或缺失以产生营养缺陷型菌株，如在2017年11月1日提交的公开为WO2017/123675的国际专利申请PCT/US2017/013072中所述，其全部内容通过引用并入本文。这些包括但不限于寡核苷酸合成，氨基酸合成和细胞壁合成所需的基因。表12列出了可以被破坏或缺失以生产营养缺陷型菌株的示例性细菌基因。这些包括但不限于寡核苷酸合成、氨基酸合成和细胞壁合成所需的基因。
表12：用于产生营养缺陷型的细菌基因的非限制性实例
氨基酸 寡核苷酸 细胞壁
cysE thyA dapA
glnA uraA dapB
ilvD dapD
leuB dapE
lysA dapF
serA
metA
glyA
hisB
ilvA
pheA
proA
thrC
trpC
tyrA
营养缺陷型突变在一些情况下很有用，在某些情况下，可能需要采用生物控制策略来防止基因工程化细菌在自然生态系统中意外繁殖。可以将上文所述的或本领域公知的在必需基因中的任何营养缺陷型突变用于此目的，例如DNA合成基因、氨基酸合成基因或用于细胞壁合成的基因。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含在一个或多个营养缺陷型基因中的一种或多种突变或缺失，例如以阻止细菌在自然环境中生长和增殖。在一些实施方式中，修饰可以位于非编码区。在一些实施方式中，修饰导致转录或翻译减弱。在一些实施方式中，修饰(例如，突变或缺失)导致必需基因的转录减少或不转录或者翻译减少或不翻译。在一些实施方式中，修饰(例如，突变或缺失)导致必需基因的无功能形式的转录和/或翻译。在一些实施方式中，修饰(例如，突变或缺失)导致必需基因截短的转录或翻译，从而产生截短的多肽。在一些实施方式中，修饰(例如，突变)位于基因的编码区内。
虽然不能在自然生态系统中生长，但某些营养缺陷型突变可以允许在施用细菌的哺乳动物宿主中(例如，在肿瘤环境中)生长和增殖。例如，由营养缺陷型突变使之失去功能的必需途径可以由肿瘤微环境中宿主产生的代谢产物来补充。结果，施用于宿主的细菌可以从环境吸收代谢产物，并且可以增殖和定植于肿瘤中。因而，在一些实施方式中，营养缺陷型基因是产生代谢产物的必需基因，所述代谢产物也由哺乳动物宿主体内(例如，在肿瘤环境中)产生。在一些实施方式中，宿主肿瘤产生的代谢产物可允许细菌吸收代谢产物，并允许细菌在肿瘤内存活和/或增殖。在一些实施方式中，包含这种营养缺陷型突变的细菌能够以与不携带营养缺陷型突变的相同亚型细菌相同的程度增殖和定植于肿瘤。
在一些实施方式中，细菌能够在肿瘤微环境中定植和增殖。在一些实施方式中，肿瘤定植细菌包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，肿瘤定植细菌不包含一种或多种营养缺陷型修饰或突变。在一个非限制性实例中，在24小时和72小时后检测到的细菌数量要比最初注入受试者的细菌数量多。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量大至少约1至2个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量大至少约2至3个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量大至少约3至4个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量大至少约4至5个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量大至少约5至6个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量大至少约1至2个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量大至少约2至3个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量大至少约3至4个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量大至少约4至5个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量大至少约5至6个对数。在一些实施方式中，可以在随后的的时间点测量CFU，如注射后至少一个星期之后，至少两个或更多个星期之后，至少一个月之后，至少两个或更多个月之后。
如本文所示，允许肿瘤增殖和定植的这类营养缺陷型基因的非限制性实例是thyA和uraA。因此，在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌可以在thyA基因中包含营养缺陷型修饰(例如，突变或缺失)。在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌可以在uraA基因中包含营养缺陷型修饰(例如，突变或缺失)。在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌可以在thyA基因和uraA基因中包含营养缺陷型修饰(例如，突变或缺失)。
或者，营养缺陷型基因是用于产生代谢产物的必需基因，所述代谢产物不能由肿瘤内的宿主产生，即营养缺陷型突变不能与肿瘤微环境中的宿主产生的代谢产物互补。结果，这种突变可能影响细菌生长和定殖于肿瘤中的能力，并且细菌计数随着时间的推移而减少。可以将这种类型的营养缺陷型突变用于调节免疫调节剂的体内活性或免疫调节剂活性的持续时间，例如在肿瘤内。本文描述了使用dapA中的营养缺陷性修饰(例如，突变)来微调免疫调节剂释放的水平和时间的方法的实例。二氨基庚二酸(Dap)是某些细菌细胞壁(例如，革兰氏阴性细菌)的特征性组分。没有二氨基庚二酸，细菌不能形成蛋白聚糖，因此无法生长。DapA不是由哺乳动物细胞产生的，因此在肿瘤中没有提供DapA的替代来源。这样，dapA营养缺陷型可能呈现出特别有用的策略，以调节和微调肿瘤中细菌存在的时机和程度和/或免疫调节剂表达和产生的水平和时机。因此，在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌包含必需基因中的突变，所述必需基因用于产生代谢产物，所述代谢产物不能由肿瘤内的宿主产生。在一些实施方式中，营养缺陷型突变是在本领域公知或本文所述的细菌细胞壁的产生和维持所必需的基因中，或在对细菌特有且不在哺乳动物细胞中存在的另一种结构所必需的基因中的突变。在一些实施方式中，与不带有营养缺陷型突变的相同亚型的细菌相比，包含这类营养缺陷型突变的细菌能够以较小的程度在肿瘤中增殖和定植。细菌生长的控制(和通过效应物水平的程度)可以进一步与其他调控策略组合，包括但不限于本文所述的代谢产物或化学诱导型启动子。
在一个非限制性实例中，在24小时和72小时后，检测的细菌数量比最初注射至受试者的细菌少。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量低至少约1至2个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量低至少约2至3个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量低至少约3至4个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量低至少约4至5个对数。在一些实施方式中，注射后24小时检测到的CFU比施用量低至少约5至6个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量低至少约1至2个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量低至少约2至3个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量低至少约3至4个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量低至少约4至5个对数。在一些实施方式中，注射后72小时检测到的CFU比施用量低至少约5至6个对数。在一些实施方式中，可以在随后的的时间点测量CFU，如注射后至少一个星期之后，至少两个或更多个星期之后，至少一个月之后，至少两个或更多个月之后。
在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌包含在dapA中的营养缺陷型修饰(例如，突变)。本文所述的非限制性实例是包含编码dacA的基因序列的用于生产c-di-AMP的基因工程化细菌。通过引入dapA营养缺陷型，可以在时间上调节或限制STING激动剂的产生。在一些实施方式中，dapA营养缺陷型提供了可调节的STING激动剂生产方法。
营养缺陷型修饰还可以用于筛选突变体细菌，所述细菌产生用于各种应用的效应分子。在一个实例中，营养缺陷可用于监测小规模和大规模细菌菌株生产中批次的纯度或“无菌性”。在这种情况下，营养缺陷型提供了一种将工程菌与潜在污染物区分开的方法。在一个非限制性实例中，在活生物治疗剂的生产过程中(即大规模生产)，营养缺陷型可能是证明原料药纯度或“无菌”的有用工具。在没有抗生素抗性基因的情况下，这种确定培养物纯度的方法特别有用，该基因通常在实验菌株中用于此目的，但在开发活的治疗药物产品时可以去除。
trpE是本文所述的另一种营养缺陷型突变。携带这一突变的细菌不能产生色氨酸。本文所述的具有trpE突变的基因工程化细菌还含有犬尿氨酸酶。犬尿氨酸酶可使细菌将犬尿氨酸转化为色氨酸前体邻氨基苯甲酸，因此，如果存在犬尿氨酸，则细菌可以在不存在色氨酸的情况下生长。
在一些实施方式中，基因工程化细菌在一个必需基因中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，基因工程化细菌在两个必需基因中包含一种或多种营养缺陷型突变(双营养缺陷型)。在一些实施方式中，基因工程化细菌在三个或更多个必需基因中包含一种或多种应用缺陷型突变。
在一些实施方式中，基因工程化细菌在dapA和thyA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，基因工程化细菌在dapA和uraA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，基因工程化细菌在thyA和uraA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，基因工程化细菌在dapA、thyA和uraA中包含一种或多种营养缺陷型突变。
在一些实施方式中，基因工程化细菌在trpE中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，基因工程化细菌在trpE和thyA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，基因工程化细菌在trpE和dapA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，基因工程化细菌在trpE和uraA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，基因工程化细菌在trpE、dapA和thyA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，基因工程化细菌在trpE、dapA和uraA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，基因工程化细菌在trpE、thyA和uraA中包含一种或多种营养缺陷型突变。在一些实施方式中，基因工程化细菌在trpE、dapA、thyA和uraA中包含一种或多种营养缺陷型突变。
在另一个非限制性实例中，可以产生条件性营养缺陷型。将dapA或thyA的染色体拷贝敲除。引入thyA或dapA的另一个拷贝，例如在低氧启动子的控制下。在厌氧条件下，可以表达dapA或thyA(视情况而定)，并且该菌株可以在没有dap或胸腺嘧啶的情况下生长。在有氧条件下，dapA或thyA表达被关闭，并且在没有dap或胸腺嘧啶的情况下菌株无法生长。还可以采用这样的策略以允许细菌在厌氧条件下，例如肠道或肿瘤微环境的条件下存活，但是阻止其在有氧条件下的存活。
在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌是合成的配体依赖性必需基因(SLiDE)细菌细胞。SLiDE细菌细胞是合成的营养缺陷型，在一种或多种必需基因中发生突变，只在特定配体存在下生长(参见Lopez和Anderson“Synthetic Auxotrophs withLigand-Dependent Essential Genes for a BL21(DE3 Biosafety Strain,”ACSSynthetic Biology(2015)DOI:10.1021/acssynbio.5b00085，其全部内容通过引用明确并入本文)。在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中描述了SLiDE细菌细胞，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌还包含灭活开关。合适的杀灭开关在2016年6月24日提交的国际专利申请PCT/US2016/39427中描述，公开为WO2016/210373，其内容通过引用整体并入本文。杀伤开关旨在主动杀死工程微生物以响应外部刺激。与细菌死亡的营养缺陷型突变相反，因为它们缺乏生存所必需的营养物质，杀灭开关由环境中的特定因子触发，该因子诱导微生物中产生导致细胞死亡的毒性分子。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌还包含经过修饰以产生宿主-质粒相互依赖性的质粒。在某些实施方式中，相互依赖的宿主-质粒平台如Wright等，2015中所述。这些和其他系统和平台在2017年11月1日提交的国际专利申请PCT/US2017/013072中描述，公开为WO2017/123675，其内容通过引用整体并入本文。
基因调控回路
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于表达本文所述构建体的多层基因调控回路。合适的多层基因调节回路描述于2016年6月24日提交的国际专利申请PCT/US2016/39434，公布为WO2016/210378。其全部内容通过引用并入本文。基因调控回路可用于筛选产生免疫调节剂或营养营养缺陷型的突变细菌。在某些实施方式中，本发明提供了用于选择产生一种或多种目的基因的基因工程化细菌的方法。
药物组合物和制剂
包含本发明的基因工程微生物的药物组合物可用于治疗，控制，改善和/或预防癌症。本发明的药物组合物包含一种或多种基因工程化细菌，单独或与预防剂，治疗剂和/或药学上可接受的载体组合。
在某些实施方式中，药物组合物包含一种物种，菌株或亚型细菌，其经工程化以包含本文所述的遗传修饰，例如编码一种或多种效应物，例如免疫调节剂的一种或多种基因。在备选实施方式中，药物组合物包含两种或更多种细菌，菌株和/或细菌亚型，其各自经工程化以包含本文所述的遗传修饰，例如编码一种或多种效应物，例如免疫调节剂的一种或多种基因。
在一些实施方式中，基因工程化细菌作为孢子全身或肿瘤内施用。作为非限制性实例，基因工程化细菌是梭菌菌株，并且施用导致肿瘤内缺氧/坏死区域的选择性定植。在一些实施方式中，孢子仅在存在于实体瘤中的缺氧/坏死区域中萌发，而在体内其他任何地方都不发芽。
本发明的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性成分加工成药用组合物。配制药物组合物的方法是本领域已知的(参见，例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences”，MackPublishing Co.，Easton，PA)。在一些实施方式中，将药物组合物进行压片，冷冻干燥，直接压片，常规混合，溶解，制粒，研磨，乳化，包封，包埋或喷雾干燥，以形成片剂，颗粒，纳米颗粒，纳米胶囊，微胶囊，微片，丸剂。或粉末，可以是肠溶包衣或未包衣的。适当的配方取决于给药途径。
基因工程微生物可以以任何合适的剂型配制成药物组合物(例如，用于口服给药的液体，胶囊，小药囊，硬胶囊，软胶囊，片剂，肠溶衣片剂，悬浮粉末，颗粒或基质缓释形式)。并且用于任何合适类型的给药(例如，口服，局部，注射，静脉内，皮下，肿瘤内，肿瘤周围，立即释放，脉冲释放，延迟释放或持续释放)。基因工程化细菌的合适剂量可以为约104至1012个细菌。组合物可以每天，每周或每月施用一次或多次。可以在餐前，餐中或餐后施用组合物。在一个实施方式中，药物组合物在受试者进餐前施用。在一个实施方式中，药物组合物目前与膳食一起施用。在一个实施方式中，药物组合物在受试者吃饭后施用。
基因工程化细菌可以配制成药物组合物，其包含一种或多种药学上可接受的载体，增稠剂，稀释剂，缓冲剂，缓冲剂，表面活性剂，中性或阳离子脂质，脂质复合物，脂质体，渗透促进剂，载体化合物和其他药学上可接受的载体或药剂。例如，药物组合物可包括但不限于添加碳酸氢钙，碳酸氢钠，磷酸钙，各种糖和类型的淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙二醇和表面活性剂，包括，例如，聚山梨醇酯20。在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌可以配制在碳酸氢钠溶液中，例如1摩尔碳酸氢钠溶液(以缓冲酸性细胞环境，例如胃)。可以施用基因工程化细菌并配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些，例如衍生自盐酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等的那些，和那些与阳离子形成的盐，例如衍生自钠，钾，铵，钙，氢氧化铁，异丙胺的阳离子，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等
基因工程微生物可以静脉内施用，例如通过输注或注射。或者，基因工程微生物可以通过肿瘤内和/或肿瘤周围给药。在其他实施方式中，基因工程微生物可以动脉内，肌肉内或腹膜内施用。在一些实施方式中，基因工程化细菌定殖肿瘤的约20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多。在一些实施方式中，基因工程化细菌与聚乙二醇化形式的rHuPH20(PEGPH20)或其他试剂共同施用，以破坏肿瘤隔膜，以增强肿瘤囊，胶原和/或基质的渗透。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生免疫调节剂以及一种或多种降解纤维组织的酶。
本公开内容的基因工程微生物可以通过瘤内注射施用，产生直接沉积在靶肿瘤内的细菌或病毒。肿瘤内注射工程化细菌或病毒可引起有效的局部炎症反应以及针对肿瘤细胞的适应性免疫应答。将细菌或病毒悬浮在溶液中，然后将其取出到1ml注射器中。在一些实施方式中，用18号多针针(Quadra-Fuse，RexMedical)注射肿瘤。注射部位是无菌制备的。如果可用，可以使用超声或CT来鉴定注射用肿瘤的坏死区域。如果未识别出坏死区域，则可以将注射引导至肿瘤的中心。将针插入预定区域一次，并均匀分配压力。缓慢取出注射针，并对注射部位进行消毒。
与静脉内施用相比，将本发明的基因工程化细菌或病毒直接瘤内注射到实体瘤中可能是有利的。使用静脉注射方法，只有一小部分细菌可能到达目标肿瘤。例如，在大肠杆菌Nissle注入4T1荷瘤小鼠的尾静脉后，大多数细菌(>99％)迅速从动物身上清除，只有一小部分施用的细菌在肿瘤中定殖(Stritzker等。，2007)。特别地，在与小鼠相比具有相对大的血容量和相对小的肿瘤的大型动物和人类患者中，肿瘤内注射可能是特别有益的。直接注射到肿瘤中允许递送更高浓度的治疗剂并避免可由全身给药引起的毒性。此外，细胞瘤内注射诱导肿瘤内强烈和局部的免疫反应。
取决于位置，肿瘤类型和肿瘤大小，可以使用不同的施用技术，包括但不限于皮肤，皮下和经皮注射，治疗性内窥镜超声波检查或支气管内肿瘤内递送。在肿瘤内给药程序之前，进行镇静与局部麻醉和标准心脏，压力和氧气监测，或患者的全麻醉。
对于一些肿瘤，可以采用经皮注射，这是侵入性最小的给药方法。超声，计算机断层扫描(CT)或荧光检查可用作引导和定位针的引导。例如，在Lencioni等人，2010中描述了经皮肿瘤内注射用于肝细胞癌。肿瘤内，皮下和淋巴结肿瘤的肿瘤内注射例如在WO/2014/036412(Amgen)中描述，用于晚期黑素瘤。
单个插入点或多个插入点可用于经皮注射方案。使用单个插入点，可以沿着多个轨道经皮注射溶液，只要针的径向范围允许。在其他实施例中，如果肿瘤大于针的径向范围，则可以使用多个注射点。针可以在不离开的情况下被拉回，并且根据需要重新定向直到注射和分散全剂量。为了保持无菌状态，每次注射使用单独的针头。针的大小和长度取决于肿瘤类型和大小。
在一些实施方式中，用18号多针针(Quadra-Fuse，RexMedical)经皮注射肿瘤。该装置由一个20厘米长的18号穿刺针组成。针头有三个可伸缩的插脚，每个插头有四个端子侧孔和一个带延长管夹的连接器。尖头从针的侧壁展开。针可以经皮引入肿瘤的中心，并且可以定位在肿瘤的最深边缘。尖头部署在肿瘤的边缘。尖头以最大长度展开，然后以规定的间隔缩回。可选地，可以执行一个或多个旋转-注射-旋转操纵，其中，尖头缩回，针旋转60度，然后重复展开尖头和另外的注射。
治疗性内镜超声检查(EUS)用于克服获得某些其他肿瘤的固有解剖学限制(Shirley等，2013)。EUS引导下的细针注射(EUS-FNI)已成功用于治疗头颈部，食管，胰腺，肝脏和肾上腺肿块的抗肿瘤治疗(Verna等，2008)。EUS-FNI已被广泛用于胰腺癌注射。细针注射需要使用曲线回声镜。小心插管食管，将回声内窥镜送入发生胰腺检查的胃和十二指肠，并确定目标肿瘤。测量最大平面以估计肿瘤体积并计算注射体积。将适当的体积吸入注射器中。将准备好的22号细针抽吸(FNA)针头送入回声镜的工作通道。在超声引导下，针头进入肿瘤。根据肿瘤的大小，可以通过将肿瘤分成切片然后将相应的体积部分注射到每个切片中来进行给药。使用安装有多普勒技术的内窥镜超声处理器确保没有动脉或静脉结构可能干扰针进入肿瘤(Shirley等，2013)。在一些实施方式中，与直型针相比，EUS-FNI的“多次注射针”(MIN)可用于改善肿瘤的注射分布(Ohara等，2013)。
如Celikoglu等人，2008中所述，可以通过支气管内肿瘤内递送方法实现肺癌的瘤内施用，例如非小细胞肺癌。进行支气管镜检查(经鼻或口腔)以观察待治疗的病变。可以通过支气管表面上的可见长度-宽度高度测量来目测估计肿瘤体积。然后通过支气管镜的工作通道引入针装置。由连接到塑料导管的金属针组成的针导管放置在护套内，以防止在推进过程中针对工作通道的损坏。针的大小和长度是变化的，并根据肿瘤的类型和大小确定。由塑料制成的针头比金属针头的刚性小，并且是理想的，因为它们可以在工作通道中绕过更尖锐的弯曲。将针插入病变部位并注射本发明的基因工程化细菌。在几个插入点处重复插入针，直到完全灌注肿瘤块。每次注射后，针头完全从肿瘤中取出，然后嵌入另一个位置。在支气管镜注射期结束时，可以使用机械解剖或伴随灌洗和抽吸的其他消融技术去除由治疗引起的任何坏死碎片的移除。
在一些实施方式中，使用包括但不限于经皮注射，EUS-FNI或支气管内肿瘤内递送方法的方法将能够将免疫调节剂递送至靶肿瘤的基因工程化细菌或病毒直接施用于肿瘤。在某些情况下，其他技术，如腹腔镜或开放手术技术被用于进入目标肿瘤，然而，这些技术更具侵入性，并带来更大的发病率和更长的住院时间。
在一些实施方式中，将细菌(例如大肠杆菌Nissle)或孢子(例如诺氏梭菌(Clostridiumnovyi)NT)溶解于无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中用于全身或肿瘤内注射。
要注射的剂量来源于肿瘤的类型和大小。本发明的药物或基因工程化细菌或病毒的剂量通常比全身静脉内给药的剂量低，例如低几个数量级。
注入每个病变的体积基于肿瘤的大小。为了获得肿瘤体积，可以进行最大平面的测量。然后，估计的肿瘤体积可以将注射体积的确定通知为总体积的百分比。例如，可以使用总肿瘤体积的约20-40％的注射体积。
例如，如WO/2014/036412中所述，对于其最大尺寸大于5cm的肿瘤，可注射至多4ml。对于最大尺寸为2.5至5厘米的肿瘤，可注射最多2毫升的肿瘤。对于最大尺寸为2.5至5厘米的肿瘤，可注射最多2毫升的肿瘤。对于最大尺寸在1.5到2.5厘米之间的肿瘤，可以注射高达1毫升的肿瘤。对于最大尺寸在0.5和1.5厘米之间的肿瘤，可以注射高达0.5毫升的肿瘤。对于最大尺寸等于或小于0.5的肿瘤，可注射高达0.1ml的肿瘤。或者，超声扫描可用于确定肿瘤可以吸收的注射体积而不会泄漏到周围组织中。
在一些实施方式中，治疗方案将包括一次或多次瘤内施用。在一些实施方式中，治疗方案将包括初始剂量，其后是至少一个后续剂量。可以在两个或更多个循环中顺序施用一个或多个剂量。
例如，第一剂可以在第1天施用，第二剂可以在1,2,3,4,5,6天，1,2,3或4周后或更长的间隔后施用。另外的剂量可以在1,2,3,4,5,6天后或1,2,3或4周或更长的间隔后施用。在一些实施方式中，第一次和随后的施用具有相同的剂量。在其他实施方式中，施用不同剂量。在一些实施方式中，每天施用超过一个剂量，例如，可以每天施用两次，三次或更多次剂量。
所描述的给药途径和剂量仅用作指导。最佳给药途径和剂量可由熟练的从业者容易地确定。剂量可根据各种参数确定，尤其是根据肿瘤的位置，肿瘤的大小，待治疗患者的年龄，体重和状况以及给药途径和方法。
在一个实施方式中，梭菌孢子全身递送。在另一个实施方式中，通过肿瘤内注射递送梭菌孢子。在一个实施方式中，通过肿瘤内注射递送大肠杆菌Nissle。在其他实施方式中，已知通过静脉内注射或口服施用已知可磨损肿瘤的大肠杆菌Nissle，如例如Danino等，2015或Stritzker等，2007的小鼠模型中所述，其全部内容通过引用并入本文。用于降低毒性的大肠杆菌Nissle突变包括但不限于导致非豆蔻酰化LPS和降低内毒素活性的msbB突变体，如Stritzker等，2010中所述(Stritzker等，Bioengineered Bugs 1：2,139-145)。益生菌大肠杆菌Nissle1917的肉豆蔻酸化阴性msbB-突变体保留肿瘤特异性定植特性，但在免疫活性小鼠中显示较少的副作用。
对于静脉内注射，优选的细菌剂量是在肿瘤中发现最多细菌的剂量和在其他组织中发现的最低量。在小鼠中，Stritzker等(International Journal of MedicalMicrobiology 297(2007)151-162；Tumor specific colonization,tissuedistribution,and gene induction by Escherichia coli Nissle 1917in live mice)发现成功肿瘤所需的细菌数量最少定植为2e4CFU，其中一半小鼠显示肿瘤定植。注射2e5和2e6CFU导致所有肿瘤的定植，并且肿瘤中的细菌数量增加。然而，在较高浓度下，细菌计数在肝脏和脾脏中变得可检测到。
在一些实施方式中，本公开的微生物可以口服给药。在一些实施方式中，基因工程化细菌可用于预防，治疗或控制肝癌或肝转移。例如，Danino等人表明口服大肠杆菌Nissle能够通过在肝转移的小鼠模型中穿过胃肠道来定植肝转移灶(Danino et al.,Programmable probiotics for detection of cancer in urine.ScienceTranslational Medicine,7(289):1-10，其内容通过引用整体并入本文)。
在一个实施方式中，通过肿瘤内注射递送基因工程微生物。在一个实施方式中，基因工程微生物是胸腔内输送的。在一个实施方式中，基因工程微生物皮下注射。在一个实施方式中，基因工程微生物静脉注射。在一个实施方式中，基因工程化的微生物在胸膜内递送。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化微生物可以根据按需要多次注射的方案在肿瘤内施用。在一些实施方式中，在每次瘤内注射中施用相同细菌菌株。在一些实施方式中，先注射第一个菌株，在随后的时间点注射第二个菌株。例如，可以将能够生产免疫引发剂(例如，STING激动剂)的菌株与能够生产另一种免疫引发剂(例如，共刺激分子，例如激动性抗-OX40、41BB或GITR)的菌株同时或顺序施用。两种免疫引发剂的附加注射可以遵循同时或顺序注射。在另一个实例中，可以先施用能够生产免疫引发剂(例如，STING激动剂)的菌株，并且可以随后施用能够生产免疫维持剂(例如，犬尿氨酸消耗或者抗-PD-1/抗-PD-L1分泌或抗-PD-1/抗-PD-L1表面展示)的菌株。STING激动剂生产菌株和/或抗-PD-1/抗-PD-L1生产菌株的附加注射可以遵循同时或顺序注射。在任何这些实例中，任选地，肿瘤活检可与肿瘤内注射同时进行。任选地，在注射第二菌株之前，可以使用抗生素从肿瘤清除第一菌株。或者，可以将限制定植的营养缺陷型修饰(例如，在dapA基因中的突变)引入第一菌株，其可以在注射第二菌株之前消除第一菌株的细菌。
本发明的工程化细菌或病毒在肿瘤内递送的肿瘤类型包括局部晚期和转移性肿瘤，包括但不限于B，T和NK细胞淋巴瘤，结肠和直肠癌，黑素瘤，包括转移性黑素瘤，真菌病。真菌，Merkel癌，肝癌，包括继发于结肠直肠癌，胰腺癌，乳腺癌，滤泡性淋巴瘤，前列腺癌，难治性肝癌和Merkel细胞癌的肝细胞癌和肝转移。
在一些实施方式中，肿瘤细胞溶解是肿瘤内注射的一部分。结果，肿瘤抗原可以暴露以激发抗肿瘤应答。这种暴露可以与细菌表达的效应物一起起作用，以增强抗肿瘤作用。在一些实施方式中，肿瘤细胞裂解不会发生作为瘤内注射的一部分。
本文公开的基因工程微生物可以局部给药并以软膏，乳膏，透皮贴剂，洗剂，凝胶，洗发剂，喷雾剂，气溶胶，溶液，乳剂或本领域技术人员熟知的其他形式配制。参见，例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.，Easton，PA。在一个实施方式中，对于不可喷雾的局部剂型，使用粘性至半固体或固体形式，其包含载体或一种或多种与局部施用相容并且动态粘度大于水的赋形剂。合适的制剂包括但不限于溶液，悬浮液，乳液，乳膏，软膏，粉末，搽剂，油膏等，其可以用助剂灭菌或混合(例如，防腐剂，稳定剂，润湿剂，缓冲剂，或盐)用于影响各种性质，例如渗透压。其它合适的局部剂型包括可喷雾气溶胶制剂，其中活性成分与固体或液体惰性载体组合，与加压挥发物(例如气态推进剂，如氟利昂)或挤压瓶混合包装。保湿剂或保湿剂也可以加入药物组合物和剂型中。这些另外的成分的实例是本领域熟知的。在一个实施方式中，可以将包含本发明的重组细菌的药物组合物配制成卫生产品。例如，卫生产品可以是抗菌制剂，或发酵产品，例如发酵液。卫生产品可以是例如洗发剂，护发素，乳膏，糊剂，乳液和润唇膏。
本文公开的基因工程微生物可以口服给药并配制成片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆液，悬浮液等。口服使用的药物组合物可以使用固体赋形剂制备，任选地研磨所得混合物，并且如果需要，在加入合适的助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。合适的赋形剂包括但不限于填充剂，例如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素组合物，例如玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙二醇(PEG)。还可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。
片剂或胶囊可通过常规方法用药学上可接受的赋形剂如粘合剂(例如，预胶化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蔗糖，葡萄糖，山梨糖醇，淀粉，树胶，高岭土和黄蓍胶)制备。填料(例如，lactose，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，钙，铝，锌，硬脂酸，聚乙二醇，十二烷基硫酸钠，淀粉，苯甲酸钠，L-亮氨酸，硬脂酸镁，滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，淀粉，马铃薯淀粉，羟基乙酸淀粉钠，糖，纤维素衍生物，二氧化硅粉末)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域熟知的方法包衣。可以存在涂层壳，并且常见的膜包括但不限于聚丙交酯，聚乙醇酸，聚酐，其他可生物降解的聚合物，藻酸盐-聚赖氨酸-藻酸盐(APA)，藻酸盐-聚亚甲基-共-胍-藻酸盐(A-PMCG-A)，甲基丙烯酸羟甲酯(HEMA-MMA)，多层HEMA-MMA-MAA，聚丙烯腈(PAN-PVC)，丙烯腈/甲基烯丙基磺酸钠(AN-69)，聚乙二醇/聚五甲基环五硅氧烷/聚二甲基硅氧烷(PEG/PD5)/PDMS)，聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMAAm)，硅质包封物，硫酸纤维素/海藻酸钠/聚亚甲基-共-胍(CS/A/PMCG)，醋酸邻苯二甲酸纤维素，海藻酸钙，k-角叉菜胶-刺槐豆胶凝胶珠，结冷胶-黄原胶珠，聚(丙交酯-共-乙交酯)，角叉菜胶，淀粉聚酸酐，淀粉聚甲基丙烯酸酯，聚氨基酸和肠溶衣聚合物。
在一些实施方式中，将基因工程化细菌肠溶包衣以释放到肠道或肠道的特定区域，例如大肠中。从胃到结肠的典型pH曲线是约1-4(胃)，5.5-6(十二指肠)，7.3-8.0(回肠)和5.5-6.5(结肠)。在一些疾病中，可以修改pH曲线。在一些实施方式中，涂层在特定pH环境中降解以指定释放位点。在一些实施方式中，使用至少两种涂层。在一些实施方式中，外涂层和内涂层在不同的pH水平下降解。
在一些实施方式中，可以在一个或多个涂层(例如，外层，内层和/或中间涂层)中使用肠溶包衣材料。肠溶包衣的聚合物在低pH下保持非离子化，因此保持不溶。但随着胃肠道中pH的增加，酸性官能团能够电离，并且聚合物溶胀或变得可溶于肠液中。
用于肠溶包衣的材料包括醋酸纤维素邻苯二甲酸酯(CAP)，聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯)，醋酸偏苯三酸纤维素(CAT)，聚邻苯二甲酸乙酸乙烯酯(PVAP)和邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)，脂肪酸，蜡，紫胶(褐藻酸酯)，塑料和植物纤维。另外，还使用玉米醇溶蛋白，Aqua-Zein(不含醇的水性玉米醇溶蛋白制剂)，直链淀粉和淀粉衍生物，以及糊精(例如麦芽糖糊精)。其他已知的肠溶包衣包括乙基纤维素，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，乙酸邻苯二甲酸直链淀粉酯，乙酸邻苯二甲酸纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯。
涂料聚合物还可包含一种或多种邻苯二甲酸酯衍生物，CAT，HPMCAS，聚丙烯酸衍生物，包含丙烯酸和至少一种丙烯酸酯的共聚物，EudragitTMS(聚(甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲酯)1：2)；EudragitL100TMS(聚(甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲酯)1：1)；EudragitL30DTM，(聚(甲基丙烯酸，丙烯酸乙酯)1：1)；和(EudragitL100-55)(聚(甲基丙烯酸，丙烯酸乙酯)1：1)(EudragitTML是由甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯合成的阴离子聚合物)，聚甲基丙烯酸甲酯与丙烯酸和丙烯酸酯共聚物混合，海藻酸，海藻酸铵，海藻酸钠，钾，镁或钙，乙酸乙烯酯共聚物，聚乙酸乙烯酯30D(30％在水中的分散体)，包含聚(二甲基氨基乙基丙烯酸酯)的中性甲基丙烯酸酯(“EudragitETM”)，甲基丙烯酸甲酯的共聚物丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸三甲基铵乙酯，甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸乙酯的共聚物，玉米醇溶蛋白，虫胶，树胶或多糖，或其组合。
涂层还可包括含有羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟丙基乙基纤维素(HPEC)，羟丙基纤维素(HPC)，羟丙基乙基纤维素(HPEC)，羟甲基丙基纤维素(HMPC)，乙基羟乙基纤维素(EHEC)(乙基纤维素)，羟乙基甲基纤维素(HEMC)，羟甲基乙基纤维素(HMEC)的聚合物。，丙基羟乙基纤维素(PHEC)，甲基羟乙基纤维素(MHEC)，疏水改性羟乙基纤维素(NEXTON)，羧甲基羟乙基纤维素(CMHEC)，甲基纤维素，乙基纤维素，水溶性乙酸乙烯酯共聚物，树胶，多糖如海藻酸和藻酸盐如海藻酸铵，钠藻酸盐，海藻酸钾，碳酸酯邻苯二甲酸酯，醋酸直链淀粉邻苯二甲酸酯，醋酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)，邻苯二甲酸纤维素酯，邻苯二甲酸纤维素醚，邻苯二甲酸羟丙基纤维素(HPCP)，邻苯二甲酸羟丙基乙基纤维素(HPECP)，邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMC)P)，乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(HPMCAS)。
在一些实施方式中，将基因工程微生物肠溶包衣以释放到肠或肠的特定区域，例如大肠。从胃到结肠的典型pH曲线是约1-4(胃)，5.5-6(十二指肠)，7.3-8.0(回肠)和5.5-6.5(结肠)。在一些疾病中，可以修改pH曲线。在一些实施方式中，涂层在特定pH环境中降解以指定释放位点。在一些实施方式中，使用至少两种涂层。在一些实施方式中，外涂层和内涂层在不同的pH水平下降解。
用于口服给药的液体制剂可以采用溶液，糖浆，悬浮液或干燥产品的形式，在使用前用水或其它合适的载体配制。这些液体制剂可以通过常规方法用药学上可接受的试剂如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆，纤维素衍生物或氢化食用脂肪)制备；乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(如杏仁油，油性酯，乙醇或分级植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。制剂也可以适当含有缓冲盐，调味剂，着色剂和甜味剂。口服给药的制剂可以适当地配制用于本文所述的基因工程微生物的缓释，控释或持续释放。
在一个实施方式中，本公开内容的基因工程微生物可以配制成适于给予儿科受试者的组合物。如本领域中公知的，儿童与成人在许多方面有所不同，包括胃排空，pH值，胃肠道渗透性等的不同的速率(Ivanovska等，Pediatrics，134(2)：361-372,2014)。此外，儿科制剂的可接受性和偏好，例如给药途径和味道属性，对于实现可接受的儿科依从性是至关重要的。因此，在一个实施方式中，适于给予儿科受试者的组合物可包括易于吞咽或可溶解的剂型，或更可口的组合物，例如具有添加的调味剂，甜味剂或味道阻滞剂的组合物。在一个实施方式中，适合给予儿科受试者的组合物也适合于对成人给药。
在一个实施方式中，适于给予儿科受试者的组合物可包括溶液，糖浆，悬浮液，酏剂，用于重构的悬浮液或溶液的粉末，可分散/泡腾片剂，可咀嚼片剂，粘性的糖果，棒棒糖，冷冻流行，锭剂，口香糖，口服薄条，口腔崩解片，小袋，软明胶胶囊，撒口服粉剂或颗粒剂。在一个实施方式中，该组合物是胶状糖果，其由明胶基质制成，赋予糖果弹性，所需的耐嚼稠度和更长的保质期。在一些实施方式中，胶粘糖果还可包含甜味剂或调味剂。
在一个实施方式中，适合给予儿科受试者的组合物可包括调味剂。如本文所用，“香料”是为制剂提供独特味道和香味的物质(液体或固体)。香料还有助于改善配方的适口性。香料包括但不限于草莓，香草，柠檬，葡萄，泡泡糖和樱桃。
在某些实施方式中，基因工程微生物可以口服给药，例如，用惰性稀释剂或可同化的食用载体。该化合物也可以包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，压制成片剂，或直接掺入受试者的饮食中。对于口服治疗给药，化合物可与赋形剂混合并以可摄入的片剂，口含片，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮液，糖浆，糯米纸囊剂等形式使用。为了通过肠胃外给药以外的方式给药化合物，可能需要用化合物包被化合物或与化合物共同给药以防止其失活。
在另一个实施方式中，包含本发明的重组细菌的药物组合物可以是可食用产品，例如食品。在一个实施方式中，食品是牛奶，浓缩牛奶，发酵乳(酸奶，酸奶，冷冻酸奶，乳酸菌发酵饮料)，奶粉，冰淇淋，奶油奶酪，干奶酪，豆浆，发酵豆浆，蔬菜果汁，果汁，运动饮料，糖果，糖果，婴儿食品(如婴儿蛋糕)，营养食品，动物饲料或膳食补充剂。在一个实施方式中，食品是发酵食品，例如发酵乳制品。在一个实施方式中，发酵乳制品是酸奶。在另一个实施方式中，发酵乳制品是奶酪，牛奶，奶油，冰淇淋，奶昔或克非尔。在另一个实施方式中，将本发明的重组细菌组合在含有旨在用作益生菌的其他活细菌细胞的制剂中。在另一个实施方式中，食品是饮料。在一个实施方式中，饮料是基于果汁的饮料或含有植物或草药提取物的饮料。在另一个实施方式中，食品是果冻或布丁。适用于施用本发明重组细菌的其他食品是本领域熟知的。例如，参见US2015/0359894和US2015/0238545，其中每个的全部内容通过引用明确并入本文。在另一个实施方式中，将本发明的药物组合物注射，喷洒或撒在食品上，例如面包，酸奶或奶酪。
在一些实施方式中，通过肠溶包衣或未包衣的纳米颗粒，纳米胶囊，微胶囊或微片剂，将组合物配制用于肠内给药，空肠内给药，十二指肠内给药，内部给药，胃分流给药或宫内给药。药物组合物还可以配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，使用例如常规的栓剂基质如可可脂或其他甘油酯。该组合物可以是油性或水性载体中的悬浮液，溶液或乳液，并且可以含有悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。
本文所述的基因工程微生物可以鼻内给药，以气溶胶形式，喷雾剂，雾剂或液滴形式配制，并且以加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾形式方便地递送，使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他合适的气体)。可以通过提供递送计量量的阀来确定加压气溶胶剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如明胶)，其含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
基因工程微生物可以作为贮库制剂给药和配制。这种长效制剂可以通过植入或注射给药，包括静脉内注射，皮下注射，局部注射，直接注射或输注。例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。
在一些实施方式中，本文公开了单一剂型的药学上可接受的组合物。单剂量形式可以是液体或固体形式。单剂量形式可以直接给予患者而无需修改，或者可以在给药前稀释或重构。在某些实施方式中，单一剂型可以以大丸剂形式施用，例如单次注射，单次口服剂量，包括包含多个片剂，胶囊，丸剂等的口服剂量。在备选实施方式中，单一剂型可以在一段时间内施用，例如通过输注。
药物组合物的单剂型可通过将药物组合物分成较小等分试样，单剂量容器，单剂量液体形式或单剂量固体形式制备，例如片剂，颗粒，纳米颗粒，纳米胶囊，微胶囊，微片，小丸，或粉末，可以是肠溶包衣或未包衣的。在给予患者之前，可以通过添加液体(通常是无菌水或盐水溶液)来重构固体形式的单剂量。
在其他实施方式中，组合物可以在控释或持续释放系统中递送。在一个实施方式中，泵可用于实现控制或持续释放。在另一个实施方式中，聚合物材料可用于实现本公开内容的治疗的受控或持续释放(参见例如美国专利号5,989,463)。用于缓释制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸)，聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)，聚(甲基丙烯酸)酸)，聚乙交酯(PLG)，聚酸酐，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚丙烯酰胺，聚(乙二醇)，聚交酯(PLA)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，和聚原酸酯。用于持续释放制剂的聚合物可以是惰性的，不含可浸出的杂质，储存时稳定，无菌和可生物降解。在一些实施方式中，可以将受控或持续释放系统置于预防或治疗靶标附近，因此仅需要一小部分全身剂量。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的技术。
可以调整剂量方案以提供治疗反应。给药可取决于若干因素，包括疾病的严重性和反应性，给药途径，治疗的时间过程(数天至数月至数年)和改善疾病的时间。例如，可以一次施用单次推注，可以在预定时间段内施用几次分开的剂量，或者可以如治疗情况所示减少或增加剂量。剂量的规格取决于活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果。剂量值可能随待缓解病症的类型和严重程度而变化。对于任何特定受试者，可以根据个体需要和治疗临床医生的专业判断随时间调整特定剂量方案。本文提供的化合物的毒性和治疗功效可通过细胞培养或动物模型中的标准药学方法确定。例如，可以确定LD50，ED50，EC50和IC50，并且可以计算毒性和治疗效果之间的剂量比(LD50/ED50)作为治疗指数。可以使用表现出毒副作用的组合物，经过仔细修改以最小化潜在的损害以减少副作用。最初可以从细胞培养测定和动物模型估计剂量。从体外和体内测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的一系列剂量。
成分单独或以单位剂量形式混合在一起供应，例如，作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物，在密封容器如安瓿或小袋中，表明活性剂的量。如果给药方式是注射，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便在给药前混合各成分。
药物组合物可以包装在气密密封的容器中，例如安瓿或小药囊，表明药剂的量。在一个实施方式中，一种或多种药物组合物作为干燥灭菌的冻干粉末或无水浓缩物在密封容器中提供，并且可以重构(例如，用水或盐水)至适当的浓度以施用于受试者。在一个实施方式中，一种或多种预防或治疗剂或药物组合物作为干燥的无菌冻干粉末在密封的容器中提供，储存在2℃至8℃之间，并在1小时内，3小时内，5小时内给药。小时，6小时内，12小时内，24小时内，48小时内，72小时内，或重建后一周内。可以包括冷冻保护剂用于冻干剂型，主要是0-10％蔗糖(最佳0.5-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。其它合适的增量剂包括甘氨酸和精氨酸，其中任一种都可以以0-0.05％的浓度包含，和聚山梨醇酯-80(最佳地包括在0.005-0.01％的浓度下)。另外的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。药物组合物可以制备成可注射溶液，并且可以进一步包含可用作佐剂的试剂，例如用于增加吸收或分散的试剂，例如透明质酸酶。
在一些实施方式中，将基因工程微生物及其组合物配制用于静脉内施用，肿瘤内施用或肿瘤周围施用。基因工程微生物可以配制成长效制剂。这种长效制剂可以通过植入或注射给药。例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。
在一些实施方式中，考虑到有效递送的需要和克服宿主抗病毒免疫应答，制备基因工程化的OV用于递送。逃避抗病毒反应的方法包括施用不同的病毒血清型作为治疗方案的一部分(血清型转换)，制剂，例如聚合物包衣以掩盖病毒免于抗体识别和使用细胞作为递送载体。
在另一个实施方式中，组合物可以在控释或持续释放系统中递送。在一个实施方式中，泵可用于实现控制或持续释放。在另一个实施方式中，聚合物材料可用于实现本公开内容的治疗的受控或持续释放(参见例如美国专利号5,989,463)。用于缓释制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸)，聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)，聚(甲基丙烯酸)酸)，聚乙交酯(PLG)，聚酸酐，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚丙烯酰胺，聚(乙二醇)，聚交酯(PLA)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，和聚原酸酯。用于持续释放制剂的聚合物可以是惰性的，不含可浸出的杂质，储存时稳定，无菌和可生物降解。在一些实施方式中，可以将受控或持续释放系统置于预防或治疗靶标附近，因此仅需要一小部分全身剂量。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的技术。
本发明的基因工程化细菌可以以中性或盐形式给药和配制。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些，例如衍生自盐酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等的那些，和那些与阳离子形成的盐，例如衍生自钠，钾，铵，钙，氢氧化铁，异丙胺的阳离子，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等
治疗方法
本发明的另一方面提供了治疗癌症的方法。在一些实施方式中，本发明提供用于减少，改善或消除与癌症相关的一种或多种症状的方法。在一些实施方式中，癌症选自肾上腺癌，肾上腺皮质癌，肛门癌，阑尾癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌(例如，尤文肉瘤，骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤)，脑癌(例如，星形细胞瘤)。，脑干胶质瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤)，支气管肿瘤，中枢神经系统肿瘤，乳腺癌，Castleman病，宫颈癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，眼癌，胆囊癌，胃肠癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤，妊娠滋养细胞疾病，心脏癌，卡波西肉瘤，肾癌，喉癌，下咽癌，白血病(如急性淋巴细胞白血病，急性髓性白血病，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病)，肝脏癌症，肺癌，淋巴瘤(如艾滋病相关淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，Hogkin淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤)，恶性间皮瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增多性异常综合征，鼻腔癌，鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌，胰腺癌癌症，阴茎癌，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，横纹肌样瘤，唾液腺癌，肉瘤，皮肤癌(如基底细胞癌，黑色素瘤)，小肠癌，胃癌，畸胎瘤，睾丸癌，咽喉癌癌症，胸腺癌，甲状腺癌，不寻常的儿童癌症，尿道癌，子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。在一些实施方式中，与其相关的症状包括但不限于贫血，食欲不振，膀胱内层刺激，出血和瘀伤(血小板减少症)，味觉或嗅觉改变，便秘，腹泻，口干，吞咽困难，水肿，疲劳，脱发(脱发)，感染，不孕，淋巴水肿，口腔溃疡，恶心，疼痛，周围神经病，蛀牙，尿路感染和/或记忆和注意力问题。
该方法可包括制备具有至少一种本文所述的基因工程物种，菌株或亚型细菌的药物组合物，并以治疗有效量将该药物组合物给予受试者。遗传化的微生物可以局部施用，例如，肿瘤内或肿瘤周围施用到组织或供应容器中，或全身施用，例如通过输注或注射静脉内施用。在一些实施方式中，基因工程化细菌通过静脉内，肿瘤内，动脉内，肌肉内，腹膜内，口服或局部给药。在一些实施方式中，基因工程微生物通过静脉内给药，即全身给药。
在某些实施方式中，向受试者施用药物组合物减少了受试者中的细胞增殖，肿瘤生长和/或肿瘤体积。在一些实施方式中，与未处理或对照受试者的水平相比，本公开的方法可以将细胞增殖，肿瘤生长和/或肿瘤体积减少至少约10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多。在一些实施方式中，通过在施用药物组合物之前和之后比较受试者中的细胞增殖，肿瘤生长和/或肿瘤体积来测量减少。在一些实施方式中，治疗或改善受试者中的癌症的方法允许癌症的一种或多种症状改善至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更多。
在施用药物组合物之前，期间和之后，可以在生物样品中测量受试者中的癌细胞和/或生物标记物，例如血液，血清，血浆，尿液，腹膜液和/或来自的活组织检查。组织或器官。在一些实施方式中，所述方法可包括施用本发明的组合物以将受试者中的肿瘤体积减少至不可检测的大小，或小于约1％，2％，5％，10％，20％，25％，治疗前受试者肿瘤体积的30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％或90％。在其他实施方式中，所述方法可包括施用本发明的组合物以将受试者中的细胞增殖速率或肿瘤生长速率降低至不可检测的速率，或降低至小于约1％，2％，5％，10％，治疗前20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％或90％的比率。
对于表达基于免疫的免疫调节剂的基因工程微生物，响应模式可能与传统的细胞毒性疗法不同。例如，用免疫疗法治疗的肿瘤可能在它们消退之前扩大，和/或可能出现新的病变(Agarwala等，2015)。肿瘤大小增加可能是由于肿瘤组织中通常不存在的淋巴细胞和巨噬细胞的严重浸润。另外，响应时间可能比与标准疗法相关的响应时间慢，例如细胞毒性疗法。在一些实施方式中，免疫调节剂的递送可以调节受试者肿瘤的生长和/或改善癌症的症状，同时暂时增加肿瘤的体积和/或大小。
基因工程化细菌可以被破坏，例如，通过组织或血清中的防御因子(Sonnenborn等，2009)，或通过激活杀灭开关，在施用后数小时或数天。因此，包含用于产生免疫调节剂的基因或基因盒的药物组合物可以以治疗有效剂量和频率重新施用。在备选实施方式中，基因工程化细菌在施用后数小时或数天内不被破坏，并且可以在肿瘤中繁殖并定殖肿瘤。
药物组合物可以单独施用或与一种或多种另外的治疗剂组合施用，例如化学治疗药物或检查点抑制剂，例如，如本文所述和本领域已知的。选择一种或多种另外的治疗剂的重要考虑因素是所述药剂应与本发明的基因工程化细菌相容，例如，所述药剂不得杀死细菌。在一些研究中，抗癌免疫疗法(例如CTLA-4或PD-1抑制剂)的功效需要在微生物组中存在特定的细菌菌株(Ilda等，2013；Vetizou等，2015；Sivan等，2015)。在一些实施方式中，包含细菌的药物组合物增强了检查点抑制剂或化学治疗剂的作用，例如，允许降低全身给药的化学治疗剂或免疫治疗剂的剂量。在一些实施方式中，药物组合物与一种或多种共生或益生菌一起施用，例如双歧杆菌或拟杆菌。
在某些实施方式中，可以向受试者施用药物组合物以治疗癌症，通过向受试者施用第一基因工程化细菌，其中所述第一基因工程化细菌包含编码第一免疫引发剂的至少一种基因；和向受试者施用第二基因工程化细菌，其中所述第二基因工程化细菌包含编码第二免疫引发剂的至少一种基因。在一些实施方式中，施用步骤同时进行。在一些实施方式中，向受试者施用第一基因工程化细菌发生在向受试者施用第二基因工程化细菌之前。在一些实施方式中，向受试者施用第二基因工程化细菌发生在向受试者施用第一基因工程化细菌之前。在一些实施方式中，第一基因工程化细菌与第二基因工程化细菌之比是5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。在一些实施方式中，第二基因工程化细菌与第一基因工程化细菌之比是5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。
化学治疗剂
在一些实施方式中，基因工程化细菌依次，同时或随后与一种或多种化学治疗剂一起使用。在一些实施方式中，基因工程化细菌可依次，同时或随后与化学治疗剂一起施用，所述化学治疗剂选自Trabectedin，Belotecan，Cisplatin，Carboplatin，Bevacizumab，Pazopanib，5-氟尿嘧啶，
Figure BDA0002364453000004571
和
Figure BDA0002364453000004572
在一些实施方式中，基因工程化细菌与吉西他滨(Gemzar)一起依次，同时或随后给药。在一些实施方式中，基因工程化细菌依次，同时或随后与环磷酰胺给药一起施用。在任何这些实施方式中，一种或多种细菌全身或口服或肿瘤内给药。
在一些实施方式中，包含编码用于产生或消耗代谢物(例如犬尿氨酸或腺苷消耗者氨消耗者或精氨酸生产者和/或STING激动剂)的酶的基因序列的一种或多种工程化细菌依次，同时或随后施用于给药。用一种或多种化学治疗剂。在一些实施方式中，全身施用化学治疗剂，并且肿瘤内施用细菌。在一些实施方式中，全身施用化学治疗剂和细菌。在一些实施方式中，包含编码代谢转化体(例如犬尿氨酸消耗者或腺苷消耗者或精氨酸生产者，氨消耗者和/或STING激动剂生产者和/或氨消耗者)的基因序列的一种或多种工程化细菌依次，同时或随后与化学治疗剂给药一起施用。在一个实施方式中，化学治疗剂是环磷酰胺。
在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于降解腺苷的回路的一种或多种工程化细菌依次，同时或随后给予化学治疗剂。在一个实施方式中，化学治疗剂是环磷酰胺。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于食用犬尿氨酸的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与化学治疗剂给药。在一个实施方式中，化学治疗剂是环磷酰胺。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于产生精氨酸的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与化学治疗剂给药。在一些实施方式中，表达用于消耗和/或产生精氨酸的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与化学治疗剂顺序、同时或随后施用。在一个实施方式中，化疗剂是环磷酰胺。
在一些实施方式中，一种或多种工程化细菌，例如腺苷消耗者，犬尿氨酸消耗者，氨消耗者，精氨酸生产者，能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多，与在相同条件下单独的化疗相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，基因工程化细菌，例如腺苷消耗者，犬尿氨酸消耗者，精氨酸生产者，能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，基因工程化细菌，例如腺苷消耗者，犬尿氨酸消耗者，精氨酸生产者，能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，约三倍，四倍，约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九与化疗相比，倍数，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含用于产生免疫激活和引发效应物的基因序列，与化学治疗剂一起依次，同时或随后给药。在一些实施方式中，全身施用化学治疗剂，并且肿瘤内施用细菌。在一些实施方式中，全身施用化学治疗剂和细菌。
在一些实施方式中，与化学治疗剂一起施用的基因工程化细菌包含编码用于产生一种或多种STING激动剂的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码二乙二醇化环化酶和/或其他产生STING激动剂的酶例如人或细菌cGAS的基因序列，与化学治疗剂一起依次，同时或随后给药。在一个实施方式中，化学治疗剂是环磷酰胺。
在一些实施方式中，表达用于产生STING激动剂的腺苷酸环化酶，人或细菌cGAS，和/或其他酶的基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，表达用于产生STING激动剂的腺苷酸环化酶或其他酶的基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，表达用于产生STING激动剂的腺苷酸环化酶，cGAS和/或其他酶的基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，约三倍，四倍，约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，与a相比，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。
在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述胞嘧啶脱氨酶用于将5-FC转化为5-FU的基因工程化细菌依次，同时或随后给予化学治疗剂。在一个实施方式中，化学治疗剂是环磷酰胺。
在一些实施方式中，与化学治疗剂一起施用的基因工程化细菌包含编码用于使5-FC转化为5-FU的一种或多种酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，表达用于将5-FC转化为5-FU的胞嘧啶脱氨酶的基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。
在一些实施方式中，表达用于将5-FC转化为5-FU的胞嘧啶脱氨酶的基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多，与在相同条件下单独的化疗相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，表达用于将5-FC转化为5-FU的胞嘧啶脱氨酶的基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。
在一些实施方式中，包含编码用于生产STING激动剂的酶的基因序列和编码一种或多种用于降解腺苷，用于犬尿氨酸的消耗，用于氨的消耗和/或精氨酸的产生的酶的基因序列与本文所述的一种或多种化学治疗剂相继，同时或随后施用。在这些实施方式的任一个中，一种或多种化学治疗剂是全身或口服或肿瘤内施用的。在这些实施方式的任一个中，一种或多种细菌是全身或口服或肿瘤内施用的。
在一些实施方式中，其中基因工程化细菌与化学治疗剂组合，基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，大约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。
在一些实施方式中，包含编码一种或多种本文所述腺苷降解酶的基因序列的一种或多种基因工程化细菌与吉西他滨一起依次，同时或随后给药。在一些实施方式中，由基因工程化细菌编码的腺苷消耗酶包括add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupC中的一种或多种。在一些实施方式中，由基因工程化细菌编码的用于腺苷消耗的酶包含add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupG中的一种或多种。在一些实施方式中，本文所述包含编码用于表面展示或分泌的抗CD40抗体的基因序列的一种或多种工程菌与吉西他滨一起依次，同时或随后给药。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌包含编码用于分泌或表面展示的透明质酸酶的基因序列与吉西他滨一起依次，同时或随后给药。在任何这些实施方式中，一种或多种细菌全身或口服或肿瘤内给药。
在一些实施方式中，其中基因工程化细菌与吉西他滨组合，基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。例如，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，大约三倍，四倍，大约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。
检查点抑制
在某些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌与一种或多种检查点抑制剂、免疫刺激性抗体(抑制性或激动性)或者本领域公知的或本文所述的其他激动剂顺序、同时或随后施用。在某些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌与一种检查点抑制剂、免疫刺激性抗体(抑制性或激动性)或者本领域公知的或本文所述的其他激动剂顺序、同时或随后施用。在某些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌与两种检查点抑制剂、免疫刺激性抗体(抑制性或激动性)或者本领域公知的或本文所述的其他激动剂顺序、同时或随后施用。
免疫检查点抑制剂的非限制性实例包括CTLA-4抗体(包括但不限于Ipilimumab和Tremelimumab(CP675206))，抗-4-1BB(CD137，TNFRSF9)抗体(包括但不限于PF-05082566和Urelumab))，抗CD134(OX40)抗体，包括但不限于Anti-OX40抗体(ProvidenceHealthandServices)，抗PD-1抗体(包括但不限于Nivolumab，Pidilizumab，Pembrolizumab(MK-3475/SCH900475，lambrolizumab)，REGN2810，PD-1(Agenus))，抗PD-L1抗体(包括但不限于durvalumab(MEDI4736)，avelumab(MSB0010718C)和atezolizumab(MPDL3280A，RG7446，RO5541267))和抗KIR抗体(包括但不限于Lirilumab)，LAG3抗体(包括但不限于BMS-986016)，抗CCR4抗体(包括但不限于Mogamulizumab)，抗CD27抗体(包括但不限于Varlilumab)，抗CXCR4抗体(包括但不限于Ulocuplumab)。在一些实施方式中，所述至少一种细菌细胞与抗磷脂酰丝氨酸抗体(包括但不限于Bavituxumab)依次，同时或随后给药。
在一些实施方式中，所述至少一种细菌细胞与选自TLR9抗体的一种或多种抗体(包括但不限于MGN1703PD-1抗体(包括但不限于，MGN1703PD-1抗体)顺序，同时或随后给药；SHR-1210(Incyte/JiangsuHengrui))，抗OX40抗体(包括但不限于OX40(Agenus))，抗Tim3抗体(包括但不限于Anti-Tim3(Agenus/INcyte))，抗Lag3抗体(包括但不限于Anti-Lag3(Agenus/INcyte))，抗B7H3抗体(包括但不限于Enoblituzumab(MGA-271)，抗CT-011(hBAT，hBAT1)如WO2009101611中所述，抗PDL-2抗体(包括但不限于AMP-224(描述于WO2010027827和WO2011066342))，抗CD40抗体(包括但不限于CP-870,893))，抗CD40抗体(包括但不限于CP-870,893)。
在一些实施方式中，本文所述的包含编码用于产生或消耗代谢物的酶的基因序列，例如犬尿氨酸消耗者，腺苷消耗者，精氨酸生产者，氨生产者和/或STING激动剂生产者的一种或多种工程化细菌与一种或多种检查点抑制剂给药依次，同时或随后施用。在一些实施方式中，全身施用检查点抑制剂，并且肿瘤内施用细菌。在一些实施方式中，检查点抑制剂和细菌全身施用。在一些实施方式中，包含编码代谢转化剂(例如犬尿氨酸消耗者，腺苷消耗者，精氨酸生产者，氨生产者和/或STING激动剂生产者)的基因序列的一种或多种工程化细菌与抗PD1抗体给药依次，同时或随后施用。在一些实施方式中，包含编码代谢转化物(例如犬尿氨酸消耗者，腺苷消耗者，精氨酸生产者，氨生产者和/或STING激动剂生产者)的基因序列的一种或多种工程化细菌与抗-CTLA-4抗体给药依次，同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于腺苷降解的所述回路中的任何一个或多个的基因工程细菌与抗PD-L1抗体给药依次，同时或随后施用。
在一些实施方式中，包含编码代谢转化物(例如犬尿氨酸消耗者，腺苷消耗者，精氨酸生产者，氨生产者和/或STING激动剂生产者)的基因序列的基因工程化细菌与抗CTLA4抗体和抗PD-1抗体给药依次，同时或随后施用。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于腺苷降解的回路的基因工程化细菌与抗PD-L1抗体和CTLA4抗体给药依次，同时或随后施用。
在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于腺苷降解的回路的基因工程化细菌与检查点抑制剂给药，例如，如本文所述和本领域已知的，包括但不是限于抗PD-1，抗PD-L1和抗-CTLA-4，依次，同时或随后施用。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于腺苷降解的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后施用抗PD1抗体给药。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述的用于降解腺苷的回路的基因工程化细菌与抗-PD-L1抗体给药顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述的用于降解腺苷的回路的基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体给药顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于腺苷降解的回路的基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体和抗-PD1抗体和/或PD-L1抗体给药依次，同时或随后施用。
在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于消耗犬尿氨酸的回路的基因工程化细菌与检查点抑制剂给药例如，如本文所述和本领域已知的，包括但不限于抗PD-1，抗PD-L1和抗-CTLA-4，依次，同时或随后施用。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于消耗犬尿氨酸的回路的基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体给药依次，同时或随后施用。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于消耗犬尿氨酸的回路的基因工程化细菌与抗PD1抗体给药依次，同时或随后施用。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述的用于消耗犬尿氨酸的回路的基因工程化细菌与抗-PD-L1抗体给药顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述的用于消耗犬尿氨酸的回路的基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体和抗-PD1抗体和/或抗-PD-L1抗体给药顺序、同时或随后施用。
在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于产生精氨酸和/或氨消耗的回路的基因工程化细菌与检查点抑制剂给药，例如，如本文所述和本领域已知的，包括但不是限于抗PD-1，抗PD-L1和抗-CTLA-4，依次，同时或随后施用。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于产生精氨酸和/或氨消耗的回路的基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体给药依次，同时或随后施用。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于产生精氨酸和/或氨消耗的回路的基因工程化细菌与抗PD1抗体给药依次，同时或随后施用。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述的用于产生精氨酸和/或消耗氨的回路的基因工程化细菌与抗-PD-L1抗体给药顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于产生精氨酸和/或氨消耗的回路的基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体和抗-PD1抗体给药依次，同时或随后施用。
在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与检查点抑制剂(例如，如本文所述的和本领域公知的，包括但不限于抗-PD-1、抗-PD-L1和抗-CTLA-4)顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-PD1抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-PD-L1抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体和抗-PD1抗体和/或抗-PD-L1抗体顺序、同时或随后施用。
在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种新陈代谢转化回路的一种或多种基因工程化细菌与检查点抑制剂(例如，如本文所述的和本领域公知的，包括但不限于抗-PD-1、抗-PD-L1和抗-CTLA-4)顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种新陈代谢转化回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种新陈代谢转化回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-PD1抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种新陈代谢转化回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-PD-L1抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种新陈代谢转化回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体和抗-PD1抗体和/或抗-PD-L1抗体顺序、同时或随后施用。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌还可以在一个或多个必需基因中包含一种或多种突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在dapA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在thyA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌的)的任何一种或多种所述的回路的一种或多种基因工程化细菌与检查点抑制剂(例如，如本文所述的和本领域公知的，包括但不限于抗-PD-1、抗-PD-L1和抗-CTLA-4)顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌的)的任何一种或多种所述的回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌的)的任何一种或多种所述的回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-PD1抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌的)的任何一种或多种所述的回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-PD-L1抗体顺序、同时或随后施用。
在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌的)的任何一种或多种所述的回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体和抗-PD1抗体和/或抗-PD-L1抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，STING激动剂是c-diAMP。在一些实施方式中，STING激动剂生产酶是DacA，例如来自单核细胞增多性李斯特氏菌。在某些实施方式中，dacA与在低氧条件下诱导的启动子(例如，FNR启动子)可操作地连接。在一些实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞均，并且包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的细菌还包含在trpE中的突变或缺失。在一些实施方式中，犬尿氨酸酶与组成型启动子可操作地连接。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌还可以在一个或多个必需基因中包含一种或多种突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在dapA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在trpE中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在thyA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在某些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌的)的任何一种或多种所述的回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-PD-1、抗-PD-L1或抗-CTLA-4顺序、同时或随后施用。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌包含编码DacA的一种或多种基因序列，例如来自单核细胞增多性李斯特氏菌的，其中DacA与在低氧条件下诱导的启动子(例如，FNR启动子)可操作地连接。包含编码dacA的基因序列的细菌在dapA中包含突变或缺失。一种或多种基因工程化细菌还包含编码来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的基因序列，并且包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的细菌还包含在trpE中的突变或缺失。在某些实施方式中，dacA和犬尿氨酸酶序列整合至细菌染色体中。在一个特定的实施方式中，一种或多种基因工程化细菌还可以在thyA中包含一种或多种突变或缺失。在一个特定的实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一个特定的实施方式中，检查点抑制剂是PD-1。在一个特定的实施方式中，检查点抑制剂是PD-L1。在一个特定的实施方式中，检查点抑制剂是CTLA-4。
在一个实施方式中，dacA回路(例如，来自单核细胞增多性李斯特氏菌，例如在低氧启动子的控制下和染色体整合的)，犬尿氨酸酶回路(例如，来自荧光假单胞菌，例如在组成型启动子的控制下和染色体整合的)和营养缺陷型突变(在trpE、dapA和thyA中的突变或缺失)被组合在一个细菌中。在一个替代的实施方式中，细菌组合物包含第一细菌，其包含编码dacA的基因序列(例如，来自单核细胞增多性李斯特氏菌，例如在低氧启动子的控制下和染色体整合的)，还包含在dapA中的突变或缺失，且任选地在thyA中具有突变或缺失，和第二细菌，其包含编码犬尿氨酸酶回路的基因序列(例如，来自荧光假单胞菌，例如在组成型启动子的控制下和染色体整合的)，在trpE中的突变或缺失，且任选地在thyA中具有突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种本文所述的腺苷消耗酶的任何一种或多种所述的回路的一种或多种基因工程化细菌与检查点抑制剂(例如，如本文所述的和本领域公知的，包括但不限于抗-PD-1、抗-PD-L1和抗-CTLA-4)顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种本文所述的腺苷消耗酶的任何一种或多种所述的回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种本文所述的腺苷消耗酶的任何一种或多种所述的回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-PD-1抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种本文所述的腺苷消耗酶的任何一种或多种所述的回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-PD-L1抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种本文所述的腺苷消耗酶的任何一种或多种所述的回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体和抗-PD1抗体和/或抗-PD-L1抗体顺序、同时或随后施用。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌还可以在一个或多个必需基因中包含一种或多种突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在dapA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在trpE中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在thyA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一些实施方式中，表达本文所述的用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种生产精氨酸和/或消耗氨的回路的任何一种或多种所述回路的一种或多种基因工程化细菌与检查点抑制剂(例如，如本文所述的和本领域公知的，包括但不限于抗-PD-1、抗-PD-L1和抗-CTLA-4)顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达本文所述的用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种生产精氨酸和/或消耗氨的回路的任何一种或多种所述回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，本文所述的用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种生产精氨酸和/或消耗氨的回路的任何一种或多种所述回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-PD1抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达本文所述的用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种生产精氨酸和/或消耗氨的回路的任何一种或多种所述回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-PD-L1抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，本文所述的用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种生产精氨酸和/或消耗氨的回路的任何一种或多种所述回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体和抗-PD1抗体和/或抗-PD-L1抗体顺序、同时或随后施用。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌还可以在一个或多个必需基因中包含一种或多种突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在dapA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在trpE中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在thyA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一些实施方式中，表达本文所述的用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种生产精氨酸和/或消耗氨的回路的任何一种或多种所述回路的一种或多种基因工程化细菌与抗-CTLA4抗体和抗-PD1抗体和/或抗-PD-L1抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，STING激动剂是c-diAMP。在一些实施方式中，STING激动剂生产酶是DacA，例如来自单核细胞增多性李斯特氏菌。在某些实施方式中，dacA与在低氧条件下诱导的启动子(例如，FNR启动子)可操作地连接。在一些实施方式中，精氨酸生产/氨消耗回路包含反馈抗性ArgA，并且包含编码反馈抗性ArgA的基因序列的细菌还具有在ArgR中的突变或缺失。在一些实施方式中，反馈抗性ArgA与在低氧条件下诱导的启动子可操作地连接。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌还可以在一个或多个必需基因中包含一种或多种突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在dapA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在thyA中的突变或缺失。
在某些实施方式中，表达用于产生一种或多种STING激动剂和一种或多种犬尿氨酸酶例如来自荧光假单胞菌的任何一种或多种所述电路的一种或多种基因工程化细菌与抗PD-1，抗PD-L1或抗CTLA-4给药顺序、同时或随后施用。在一个实施方式中，一种或多种遗传工程化细菌包含编码例如来自单核细胞增多性李斯特氏菌的DacA的基因序列，其中DacA可操作地连接至在低氧条件下可诱导的启动子，例如FNR启动子。包含编码dacA的基因序列的细菌在dapA中包含突变或缺失。所述一种或多种基因工程细菌进一步包含编码抗反馈ArgA的基因序列，并且所述细菌包含编码抗反馈ArgA的基因序列进一步包含ArgR中的突变或缺失。在某些实施方式中，dacA和反馈抗性ArgA序列被整合到细菌染色体中。在一个特定的实施方式中，一种或多种基因工程细菌可进一步在thyA中包含突变或缺失。在一个特定的实施方式中，检查点抑制剂是PD-1。在一个特定的实施方式中，检查点抑制剂是PD-L1。在一个特定的实施方式中，检查点抑制剂是CTLA-4。
在一个实施方式中，dacA回路(例如，来自单核细胞增多性李斯特氏菌，例如在低氧启动子的控制下并且通过染色体整合)，精氨酸产生/氨消耗回路(例如，包含ArgAfbr，例如在低氧诱导型启动子的控制下并通过染色体整合和ΔArgR)和营养缺陷型突变(dapA和thyA中的突变或缺失)组合在一种细菌中。在一个替代的实施方式中，细菌组合物包含第一细菌，所述第一细菌包含编码dacA的基因序列(例如，来自单核细胞增多性李斯特菌，例如在低氧启动子的控制下并在染色体上整合)，其进一步在dapA中包含突变或缺失，并且具有thyA中的任选突变或缺失，以及第二种细菌，所述第二细菌包含编码精氨酸产生/氨消耗回路的基因序列(例如，包含ArgAfbr，例如在低氧诱导型启动子的控制下并通过染色体整合和ΔArgR)，以及任选地突变或thyA缺失。
在一些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌，例如腺苷消耗者，犬尿氨酸消耗者，氨消耗者，精氨酸生产者和/或STING激动剂生产者，能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，抗PD-1，抗PD-L1和/或抗CTLA-4)的抗肿瘤活性，例如，10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌，例如腺苷消耗者，犬尿氨酸消耗者，氨消耗者，精氨酸生产者和/或STING激动剂生产者，能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，抗PD-1，抗PD-L1和/或抗CTLA-4)的抗肿瘤活性，例如1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌，例如腺苷消耗者，犬尿氨酸消耗者，氨消耗者，精氨酸生产者和/或STING激动剂生产者，能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，抗PD-1，抗PD-L1和/或抗CTLA-4)的抗肿瘤活性，例如，约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。
在一些实施方式中，基因工程化以消耗腺苷的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，基因工程化以消耗腺苷的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，抗PD-1，抗PD-L1和/或抗CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，基因工程化以消耗腺苷的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，抗PD-1，抗PD-L1和/或抗CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，大约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。
在一些实施方式中，基因工程化以消耗犬尿氨酸的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，抗PD-1，抗PD-L1和/或抗CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)例如10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，基因工程化以消耗犬尿氨酸的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1，PD-L1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)例如1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，基因工程化以消耗犬尿氨酸的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1，PD-L1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，大约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。
在一些实施方式中，经基因工程化以产生精氨酸和/或消耗氨的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1，PD-L1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如，10％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％，50％至60％，60％至70％，70％至75％，75％至80％，80％至85％，85％至90％，90％至95％，95％至99％或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，基因工程化以产生精氨酸和/或消耗氨的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1，PD-L1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，基因工程化以产生精氨酸和/或消耗氨的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1，PD-L1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)，例如大约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多，与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比。
在一些实施方式中，与在相同条件下检查点抑制剂疗法单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，基因工程化以产生一种或多种STING激动剂的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，抗-PD-1、抗-PD-L1和/或抗-CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、重量)，例如10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或更多。在一些实施方式中，与在相同条件下化疗单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，基因工程化以产生一种或多种STING激动剂的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，抗-PD-1、抗-PD-L1和/或抗-CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、重量)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、重量)，例如1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍或更多。在一些实施方式中，与在相同条件下化疗单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，基因工程化以产生一种或多种STING激动剂的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，抗-PD-1、抗-PD-L1和/或抗-CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、重量)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、重量)，例如约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍或更多。
共刺激分子
在某些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌与一种或多种激动性免疫刺激分子或激动剂(包括但不限于激动性抗体)顺序、同时或随后施用。
在一些实施方式中，至少一种细菌细胞与一种或多种选自下组的抗体顺序、同时或随后施用：抗-OX40抗体(包括但不限于INCAGN01949(Agenus)；BMS 986178(Bristol-Myers Squibb)、MEDI0562(Medimmune)、GSK3174998(GSK)、PF-04518600(Pfizer))，抗-41BB/CD137(包括但不限于PF-05082566(Pfizer)、urelumab(BMS-663513；Bristol-MyersSquibb))和抗-GITR(包括但不限于TRX518(Leap Therapeutics)、MK-4166(Merck)、MK-1248(Merck)、AMG 228(Amgen)、BMS-986156(BMS)、INCAGN01876(Incyte/Agenus)、MEDI1873(AZ)、GWN323(NVS))。在一些实施方式中，包含编码用于生产或消耗代谢产物的酶(例如，犬尿氨酸消耗剂、腺苷消耗剂、精氨酸生产剂、氨消耗剂和/或STING激动剂生产剂)的一种或多种基因序列一种或多种本文所述的工程化细菌与选自抗-OX40抗体、抗-41BB和/或抗-GITR的激动性抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，激动性抗体(例如，抗-OX40抗体、抗-41BB和/或抗-GITR)是系统性施用，以及细菌是瘤内施用。在一些实施方式中，激动性抗体(例如，抗-OX40抗体、抗-41BB和/或抗-GITR)和细菌是系统性施用。在一些实施方式中，包含编码新陈代谢转化剂(例如，犬尿氨酸消耗剂、腺苷消耗剂、精氨酸生产剂、和/或氨消耗剂、和/或STING激动剂生产剂)的一种或多种基因序列的一种或多种本文所述的工程化细菌与抗-OX40抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，包含编码新陈代谢转化剂(例如，犬尿氨酸消耗剂、腺苷消耗剂、精氨酸生产剂、氨消耗剂、和/或STING激动剂生产剂)的一种或多种基因序列的一种或多种本文所述的工程化细菌与抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于降解腺苷的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体顺序、同时或随后施用。
在一些实施方式中，表达用于降解腺苷的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与激动性免疫刺激分子(例如激动性抗体，例如抗-OX40抗体、抗-41BB抗体和/或抗-GITR抗体)顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于降解腺苷的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-OX40抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于降解腺苷的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于降解腺苷的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于降解腺苷的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体和抗-OX40抗体和/或抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。
在一些实施方式中，表达用于消耗犬尿氨酸的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与激动性免疫刺激分子(例如激动性抗体，例如抗-OX40抗体、抗-41BB抗体和/或抗-GITR抗体)顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于消耗犬尿氨酸的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于消耗犬尿氨酸的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-OX40抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于消耗犬尿氨酸的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于消耗犬尿氨酸的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体和抗-OX40抗体和/或抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。
在一些实施方式中，表达用于生产精氨酸和/或消耗氨的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与激动性免疫刺激分子(例如激动性抗体，例如抗-OX40抗体、抗-41BB抗体和/或抗-GITR抗体)顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产精氨酸和/或消耗氨的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产精氨酸和/或消耗氨的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-OX40抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产精氨酸和/或消耗氨的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-OX40L抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产精氨酸和/或消耗氨的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体和抗-OX40L抗体顺序、同时或随后施用。
在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与激动性免疫刺激分子(例如激动性抗体，例如抗-OX40抗体、抗-41BB抗体和/或抗-GITR抗体)顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-OX40抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体和抗-OX40抗体和/或抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌还可以在一个或多个必需基因中包含一种或多种突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在dapA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在thyA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种新陈代谢转化回路的基因工程化细菌与激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，本文所述的和本领域公知的，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB和抗-GITR)顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种新陈代谢转化回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种新陈代谢转化回路的基因工程化细菌与抗-OX40抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种新陈代谢转化回路的基因工程化细菌与抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种新陈代谢转化回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体和抗-OX40抗体和/或抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌还可以在一个或多个必需基因中包含一种或多种突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在dapA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在thyA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌的)的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，本文所述的和本领域公知的，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB和抗-GITR)顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌的)的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌的)的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-OX40抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌的)的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种犬尿氨酸酶(例如，来自荧光假单胞菌的)的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体和抗-OX40抗体和/或抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌还可以在一个或多个必需基因中包含一种或多种突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在dapA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在trpE中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在thyA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种本文所述的腺苷消耗酶的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，本文所述的和本领域公知的，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB和抗-GITR)顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种本文所述的腺苷消耗酶的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种本文所述的腺苷消耗酶的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-OX40抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种本文所述的腺苷消耗酶的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂和一种或多种本文所述的腺苷消耗酶的任何一种或多种所述的回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体和抗-OX40抗体和/或抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌还可以在一个或多个必需基因中包含一种或多种突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在dapA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在trpE中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在thyA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种本文所述的精氨酸生产和/或氨消耗回路的基因工程化细菌与激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，本文所述的和本领域公知的，包括但不限于抗-OX40、抗-41BB和抗-GITR)顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种本文所述的精氨酸生产和/或氨消耗回路的基因工程化细菌与抗-GITR抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种本文所述的精氨酸生产和/或氨消耗回路的基因工程化细菌与抗-OX40抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种本文所述的精氨酸生产和/或氨消耗回路的基因工程化细菌与抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。在一些实施方式中，表达用于生产一种或多种STING激动剂的任何一种或多种所述的回路和一种或多种本文所述的精氨酸生产和/或氨消耗回路的基因工程化细菌与与抗-GITR抗体和抗-OX40抗体和/或抗-41BB抗体顺序、同时或随后施用。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌还可以在一个或多个必需基因中包含一种或多种突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在dapA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在trpE中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以包含一种或多种营养缺陷型修饰，例如在thyA中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌还可以包含噬菌体修饰，例如如本文所述的在内源性原噬菌体中的突变或缺失。
在一些实施方式中，与在相同条件下激动性抗体疗法单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，一种或多种基因工程化细菌(例如，腺苷消耗剂、犬尿氨酸消耗剂、氨消耗剂、精氨酸生产剂和/或STING激动剂生产剂)能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在一些实施方式中，与在相同条件下化疗单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，一种或多种基因工程化细菌(例如，腺苷消耗剂、犬尿氨酸消耗剂、氨消耗剂、精氨酸生产剂和/或STING激动剂生产剂)能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍或更多。在一些实施方式中，与在相同条件下化疗单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，一种或多种基因工程化细菌(例如，腺苷消耗剂、犬尿氨酸消耗剂、氨消耗剂、精氨酸生产剂和/或STING激动剂生产剂)能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍或更多。
在一些实施方式中，与在相同条件下激动性抗体疗法单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，基因工程化以消耗腺苷的细菌能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在一些实施方式中，与在相同条件下化疗单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，基因工程化以消耗腺苷的细菌能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍或更多。在一些实施方式中，与在相同条件下化疗单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以消耗腺苷的细菌能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍或更多。
在一些实施方式中，与在相同条件下激动性抗体疗法单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以消耗犬尿氨酸的细菌能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在一些实施方式中，与在相同条件下化疗单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以消耗犬尿氨酸的细菌能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍更多。在一些实施方式中，与在相同条件下化疗单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以消耗犬尿氨酸的细菌能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍或更多。
在一些实施方式中，与在相同条件下激动性抗体疗法单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以生产精氨酸和/或消耗氨的细菌能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在一些实施方式中，与在相同条件下化疗单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以生产精氨酸和/或消耗氨的细菌能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍或更多。在一些实施方式中，与在相同条件下化疗单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，经基因工程化以生产精氨酸和/或消耗氨的细菌能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍或更多。
在一些实施方式中，与在相同条件下激动性抗体疗法单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，基因工程化以生产一种或多种STING激动剂的细菌能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如10％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至99％或者更多。在一些实施方式中，与在相同条件下化疗单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，基因工程化以生产一种或多种STING激动剂的细菌能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如1.0-1.2倍、1.2-1.4倍、1.4-1.6倍、1.6-1.8倍、1.8-2倍或两倍或更多。在一些实施方式中，与在相同条件下化疗单用相比或与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，基因工程化以生产一种或多种STING激动剂的细菌能够改善共同施用的激动性抗体或其他免疫刺激性激动剂(例如，抗-OX40、抗-41BB和/或抗-GITR)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖情况、尺寸、体积、肿瘤)，例如约三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍、或五十倍、一百倍、五百倍、或一千倍或更多。
在一些实施方式中，基因工程微生物可以作为方案的一部分施用，其包括其他治疗方式或其他方式的组合。这些方式或药剂的非限制性实例是常规疗法(例如，放射疗法，化学疗法)，其他免疫疗法，干细胞疗法和靶向疗法(例如，BRAF或血管内皮生长因子抑制剂；抗体或化合物)，本文所述的细菌和溶瘤病毒。治疗还包括与抗体-免疫接合相关，包括Fc介导的ADCC治疗，使用将细胞毒性T细胞与肿瘤细胞(例如BiTE)连接的双特异性可溶性scFv的治疗，以及具有效应功能的可溶性TCR。免疫疗法包括疫苗(例如，病毒抗原，肿瘤相关抗原，新抗原或其组合)，检查点抑制剂，细胞因子疗法，过继性细胞疗法(ACT)。ACT包括但不限于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法，天然或工程化TCR或CAR-T疗法，天然杀伤细胞疗法和树突细胞疫苗或其他抗原呈递细胞的其他疫苗。靶向治疗包括抗体和化学化合物，并且包括例如抗血管生成策略和BRAF抑制。
通过表达未甲基化的CpG基序的合成寡脱氧核苷酸(ODN)模拟细菌DNA的免疫刺激活性。Bode et al.,Expert Rev Vaccines.2011Apr；10(4):499–511.CpG DNA as avaccine adjuvant。当用作疫苗佐剂时，CpGODN改善专职抗原呈递细胞的功能并促进体液和细胞疫苗特异性免疫应答的产生。在一些实施方式中，CpG可以与本发明的基因工程化细菌组合施用。
在一个实施方式中，基因工程微生物与肿瘤细胞裂解物组合施用。
可以基于症状的严重程度和癌症的进展来选择药物组合物的剂量和给药频率。适当的治疗有效剂量和给药频率可由治疗临床医生选择。
体内治疗
修饰微生物可以在体内评估，例如在动物模型中。可以使用与癌症相关的疾病或病症的任何合适的动物模型，例如肿瘤同系或异种移植小鼠模型(参见，例如，Yu等，2015)。基因工程化细菌可以全身或局部施用至动物，例如，通过口服施用(强饲)、静脉内或皮下注射或通过肿瘤内注射，并且例如通过测量肿瘤体积来确定治疗功效。
非限制性的动物模型的实例包括小鼠模型，如在Dang等，2001，Heap等，2014和Danino等，2015)中描述。
临床前小鼠模型确定哪种免疫疗法和组合免疫疗法将在不同的癌症中产生最佳治疗指数(最大抗肿瘤功效和最小免疫相关不良事件(irAE))。
将衍生自各种人癌细胞类型或患者肿瘤块的培养细胞植入小鼠组织部位已被广泛用于产生癌症小鼠模型(异种移植建模)。在异种移植建模中，将人肿瘤或细胞系皮下或原位植入免疫受损的宿主动物(例如裸鼠或SCID小鼠)中以避免移植排斥。因为在这样的模型中没有再现原始人肿瘤微环境，所以在这些模型中可能无法准确测量靶向免疫调节剂的抗癌剂的活性，使得具有完整免疫系统的小鼠模型是更加期望的。
因此，同系免疫活性宿主中的鼠癌细胞(同种异体移植)的植入被用于生成具有衍生自作为给定小鼠品系的相同遗传背景的肿瘤组织的小鼠模型。在同系模型中，宿主免疫系统是正常的，这可以更接近地代表肿瘤微环境的真实情况。将肿瘤细胞或癌细胞系皮下或原位植入同系免疫活性宿主动物(例如小鼠)中。可以在同系小鼠模型中用于免疫检查点基准测试的代表性小鼠肿瘤细胞系包括但不限于在01/11/2017提交的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中列出的细胞系，其全部内容通过引用并入本文。
对于来源于某些细胞系的肿瘤，可以添加卵清蛋白以进一步刺激免疫应答，从而增加应答的基线水平。取决于细胞系，可在同系小鼠模型中使用的小鼠品系的实例包括C57BL/6、FVB/N、Balb/c、C3H/HeJ、C3H/HeJ、NOD/ShiLT、A/J、129S1/SvlmJ、NOD。此外，多种进一步基因工程化小鼠品系已被报道在分子和组织学水平两者上都模拟人类肿瘤发生。这些基因工程化小鼠模型也为本领域提供了极佳的工具，此外，这些模型中产生的侵袭性肿瘤来源的癌细胞系也是同系肿瘤模型细胞系的良好资源。在01/11/2017提交的以WO2017/123675公开的国际专利申请PCT/US2017/013072(公开为WO2017/123675)中提供了基因工程化菌株的实例，,其全部内容通过引用并入本文。
通常，潜在的治疗性分子会与人的免疫调节剂相互作用并刺激人的免疫系统，而不会检测到它们的鼠类对应物，反之亦然。在研究治疗性分子时，有必要考虑到这一点。最近，已经开发出“人源化”小鼠模型，其中免疫缺陷小鼠用人免疫系统重建，并且帮助克服了与小鼠和人免疫系统之间的差异相关的问题，允许进行体内研究。组合IL2受体无效和严重联合免疫缺陷突变(scid)的严重免疫缺陷小鼠(NOD-scidIL2Rgnμll小鼠)缺乏成熟T细胞、B细胞或功能性NK细胞，并且缺乏细胞因子信号传导。这些小鼠可以被植入人造血干细胞和外周血单核细胞。将CD34+造血干细胞(hu-CD34)注射到免疫缺陷小鼠中，导致包括用于长期研究的非常好的T细胞成熟和功能的人免疫细胞群的多谱系植入。该模型具有12个月的研究期，其具有显示T细胞依赖性炎症应答而对宿主没有供体细胞免疫反应性的功能性人免疫系统。患者来源的异种移植物可以很容易地植入这些模型中，并且免疫调节剂的作用在更能反映人类肿瘤微环境(基于免疫和非免疫细胞两者)的体内环境中进行研究(Baia等，2015)。在人源化小鼠模型中使用的感兴趣的人细胞系包括但不限于HCT-116和HT-29结肠肿瘤细胞系。
如Roberts等，2014所述，大鼠F98神经胶质瘤模型和自发性犬肿瘤的效用，其全部内容通过引用整体并入本文。通过植入工程化以表达荧光素酶的F98大鼠神经胶质瘤细胞产生的局部侵袭性肿瘤被肿瘤内注射C.novyi-NT孢子，导致萌发和荧光素酶活性的快速下降。C.novyi-NT萌发通过细菌的营养形式的出现来证明。在这些研究中，C.novyi-NT被精确地训练成针对肿瘤，放过附近的细胞。
犬软组织肉瘤例如在许多品种中很常见，并且具有与人类相似的临床、组织病理学和遗传学特征(Roberts等，2014；Staedtke等，2015)，特别是在遗传方面变异和突变谱方面。Roberts等在狗中进行了一项研究，其中将C.novi-NT孢子在1至4个治疗周期中肿瘤内注射(1×108C.novyi-NT孢子)到自发发生的实体瘤中90天。观察到有效的炎症应答，表明肿瘤内注射增加了先天免疫应答。
在一些实施方式中，将本发明的基因工程化微生物全身施用至本文所述的任何模型中，例如口服、皮下、静脉内或肿瘤内施用，以评估抗肿瘤功效和任何治疗相关的不良副作用。
序列
在一些实施方式中，使用一种或多种细菌序列替代某些前体序列，包括但不限于细菌分泌信号序列。在一些实施方式中，编码细胞因子的多核苷酸序列经密码子优化以用于细菌表达。在一些实施方式中，使用一种或多种哺乳动物序列替代某些前体序列，包括但不限于哺乳动物分泌信号序列。在一些实施方式中，编码细胞因子的多核苷酸序列经密码子优化以表达哺乳动物。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码免疫调节性细胞因子的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于表达hIL-12的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1053所示多肽的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1054所示多肽的一种或多种基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含表达hIL-15的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1057所示多肽的一种或多种基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌用于表达GMCSF的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1058所示多肽的一种或多种基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于表达TNFα(例如，胞外部分)的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1059所示多肽的一种或多种基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌用于表达IFN-γ的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1060所示多肽的一种或多种基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于表达CXCL10的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1061所示多肽的一种或多种基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于表达CXCL9的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1062所示多肽的一种或多种基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的核酸序列，所述多肽与SEQID NO:1053、SEQ ID NO:1054、SEQ ID NO:1055、SEQ ID NO:1056、SEQ ID NO:1057、SEQ IDNO:1058、SEQ ID NO:1059、SEQ ID NO:1060、SEQ ID NO:1061和SEQ,ID NO:1062具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同源性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含选自SEQ ID NO:1053、SEQ ID NO:1054、SEQ ID NO:1055、SEQ ID NO:1056、SEQ ID NO:1057、SEQ ID NO:1058、SEQ ID NO:1059、SEQ ID NO:1060、SEQ ID NO:1061和SEQ,ID NO:1062的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的核酸序列，所述多肽由选自SEQ ID NO:1053、SEQ ID NO:1054、SEQ ID NO:1055、SEQ ID NO:1056、SEQ ID NO:1057、SEQ ID NO:1058、SEQ ID NO:1059、SEQ ID NO:1060、SEQ ID NO:1061和SEQ,ID NO:1062的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包括基因序列，但出于遗传密码的冗余性，该序列编码与SEQ ID NO:1063所示相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQID NO:1063。在一些实施方式中，基因工程化细菌包括基因序列，但出于遗传密码的冗余性，该序列编码与SEQ ID NO：1063所示相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQ ID NO:1064。在一些实施方式中，基因工程化细菌包括基因序列，但出于遗传密码的冗余性，该序列编码与SEQ ID NO：1067所示相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQ ID NO:1067。在一些实施方式中，基因工程化细菌包括基因序列，但出于遗传密码的冗余性，该序列编码与SEQ ID NO：1068所示相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQ ID NO:1068。在一些实施方式中，基因工程化细菌包括基因序列，但出于遗传密码的冗余性，该序列编码与SEQ ID NO：1069所示相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQ ID NO:1069。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包括基因序列，但出于遗传密码的冗余性，该序列编码与SEQ ID NO：1070所示相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQ ID NO:1070。在一些实施方式中，基因工程化细菌包括基因序列，但出于遗传密码的冗余性，该序列编码与SEQ ID NO：1071所示相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQID NO:1071。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含与SEQ ID NO:1063、SEQ ID NO:1064、SEQ ID NO:1067、SEQ ID NO:1068、SEQ ID NO:1069、SEQ ID NO:1070和/或SEQ IDNO:1071所示的DNA序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同源性的核酸序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，其含有选自SEQ ID NO:1063、SEQ ID NO:1064、SEQ ID NO:1067、SEQ ID NO:1068、SEQ ID NO:1069、SEQ ID NO:1070和/或SEQ ID NO:1071的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，其由选自SEQ ID NO:1063、SEQ ID NO:1064、SEQ ID NO:1067、SEQ ID NO:1068、SEQ ID NO:1069、SEQ ID NO:1070和/或SEQ ID NO:1071的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，其与SEQ ID NO:894、SEQ IDNO:895、SEQ ID NO:896、SEQ ID NO:897、SEQ ID NO:898、SEQ ID NO:899、SEQ ID NO:900、SEQ ID NO:901、SEQ ID NO:902、SEQ ID NO:903、SEQ ID NO:904、SEQ ID NO:905、SEQ IDNO:906、SEQ ID NO:907、SEQ ID NO:908、SEQ ID NO:909、SEQ ID NO:910、SEQ ID NO:911、SEQ ID NO:912和/或SEQ ID NO:913所示的DNA序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，其含有选自SEQ ID NO:894、SEQ ID NO:895、SEQ ID NO:896、SEQ ID NO:897、SEQ IDNO:898、SEQ ID NO:899、SEQ ID NO:900、SEQ ID NO:901、SEQ ID NO:902、SEQ ID NO:903、SEQ ID NO:904、SEQ ID NO:905、SEQ ID NO:906、SEQ ID NO:907、SEQ ID NO:908、SEQ IDNO:909、SEQ ID NO:910、SEQ ID NO:911、SEQ ID NO:912和/或SEQ ID NO:913的DNA序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，其由选自SEQ ID NO:894、SEQ ID NO:895、SEQ ID NO:896、SEQ ID NO:897、SEQ ID NO:898、SEQ ID NO:899、SEQ ID NO:900、SEQID NO:901、SEQ ID NO:902、SEQ ID NO:903、SEQ ID NO:904、SEQ ID NO:905、SEQ ID NO:906、SEQ ID NO:907、SEQ ID NO:908、SEQ ID NO:909、SEQ ID NO:910、SEQ ID NO:911、SEQID NO:912和/或SEQ ID NO:913的DNA序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，其与SEQ ID NO:914、SEQ IDNO:915、SEQ ID NO:916、SEQ ID NO:917、SEQ ID NO:918和SEQ ID NO:919所示的DNA序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，其含有选自SEQ ID NO:914、SEQ ID NO:915、SEQID NO:916、SEQ ID NO:917、SEQ ID NO:918和SEQ ID NO:919的DNA序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，其由选自SEQ ID NO:914、SEQ ID NO:915、SEQ ID NO:916、SEQ ID NO:917、SEQ ID NO:918和SEQ ID NO:919的DNA序列组成。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端OmpF分泌标签的人IL-12a构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:920)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端PhoA分泌标签的人IL-12a构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:921)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端TorA分泌标签的人IL-12a构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:922)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端OmpF分泌标签的人IL-12b构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:923)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端PhoA分泌标签的人IL-12b构建体的基因序列(例如，SEQ IDNO:924)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端TorA分泌标签的人IL-12构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:925)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端OmpF分泌标签的人GMCSF构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:932)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端PhoA分泌标签的人GMCSF构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:933)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端TorA分泌标签的人GMCSF构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:934)。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端OmpF分泌标签的人IL-15构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:935)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端PhoA分泌标签的人IL-15构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:936)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端TorA分泌标签的人IL-15构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:937)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端OmpF分泌标签的人TNFα构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:938)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端PhoA分泌标签的人TNFα构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:939)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端TorA分泌标签的人TNFα构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:940)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端OmpF分泌标签的人IFNg构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:941)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端PhoA分泌标签的人IFNg构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:942)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端TorA分泌标签的人IFNg构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:943)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端OmpF分泌标签的人CXCL9构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:1075)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端PhoA分泌标签的人CXCL9构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:1076)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端TorA分泌标签的人CXCL9构建体的基因序列(例如，SEQ ID NO:1077)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的基因序列，所述多肽与选自SEQ ID NO:920-943或1072-1078或其功能性片段或变体的多肽序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的基因序列，所述多肽与选自SEQ ID NO:920-943或1072-1078的多肽序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的基因序列，所述多肽包含选自SEQ ID NO:920-943或1072-1078的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的基因序列，所述多肽由选自SEQ ID NO:920-943或1072-1078的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含选自SEQ ID NO:953-960和SEQ ID NO:1081-1084的一种或多种核酸序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，其与选自SEQ ID NO:953-960和SEQ ID NO:1081-1084的一种或多种DNA序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的同源性。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其含有包含人IL-12a和人IL-12b的构建体。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其含有SEQ ID NO:965所示的phoA-hIL12b-phoA-hIL12a部分或SEQ ID NO:966所示的phoA-mIL12b-phoA-mIL12a部分。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其含有包含phoA-IL15的构建体。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其含有SEQ ID NO:967所示的phoA-IL15部分。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其含有包含phoA-GMCSF的构建体。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其含有SEQ ID NO:968所示的phoA-GMCSF部分。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其含有包含phoA-TNFα的构建体。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其含有SEQ ID NO:969所示的phoA-TNFα部分。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其含有包含phoA-IFNγ的构建体。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其含有SEQ ID NO:970所示的phoA-IFNγ部分。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，其与选自SEQ ID NO:965、SEQID NO:966、SEQ ID NO:967、SEQ ID NO:968、SEQ ID NO:969、SEQ ID NO:970的DNA序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的同源性，排除非编码区。
实施例
下面的实施例提供本公开的说明性实施方式。本领域普通技术人员将认识到可以在不改变本公开的精神或范围的情况下可以进行的多种修改和变化。这样的修改和变化包含在本公开的范围内。实施方式不以任何方式限制本公开。
本文的公开内容提供了与在下文实施例中描述的任何SEQ ID NO的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源性的序列。
实施例1免疫调节子
在构建单链抗CTLA-4抗体中使用的示例性核酸序列描述于2017年1月11日提交、公布为WO2017/123675的国际专利申请PCT/US2017/013072，其全部内容通过引用并入本文，例如在实施例1中。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，所述核酸序列与DNA序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源或包含所述DNA序列，所述DNA序列编码与SEQ ID NO:765、SEQ ID NO:766、SEQ ID NO:767、SEQ ID NO:768、SEQ ID NO:769、SEQ ID NO:770、SEQ ID NO:771、SEQIDNO772、SEQ ID NO:773、SEQ IDNO:774、SEQ ID NO:775和/或SEQ ID NO:776至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同源的多肽。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，所述基因序列编码包含选自SEQ ID NO:765、SEQ ID NO:766、SEQ ID NO:767、SEQ ID NO:768、SEQ ID NO:769、SEQ ID NO:770、SEQ ID NO:771、SEQ ID NO:772、SEQ ID NO:773、SEQ IDNO:774、SEQ ID NO:775和/或SEQ ID NO:776的序列的多肽。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽由选自SEQ ID NO:765、SEQ ID NO:766、SEQ ID NO:767、SEQ IDNO:768、SEQ ID NO:769、SEQ IDNO：770、SEQ ID NO:771、SEQ ID NO:772、SEQ ID NO:773、SEQ ID NO:774、SEQ ID NO:775和/或SEQ ID NO:776的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，所述核酸序列与DNA序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源或包含所述DNA序列，所述DNA序列编码与SEQ ID NO:777、SEQ ID NO:778，SEQ ID NO:779，SEQ ID NO:780，SEQ IDNO:781，SEQ ID NO:782，SEQ ID NO:783，SEQ ID NO:784，SEQ ID NO:785，SEQ ID NO:786，SEQ ID NO:787和/或SEQ ID NO:788至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同源的多肽。在另一个实施方式中，基因序列包含选自SEQ ID NO:777、SEQ IDNO:778，SEQ ID NO:779，SEQ ID NO:780，SEQ ID NO:781，SEQ ID NO:782，SEQ ID NO:783，SEQ ID NO:784，SEQ ID NO:785，SEQ ID NO:786，SEQ ID NO:787和/或SEQ ID NO:788的序列。在另一个实施方式中，基因序列由选自SEQ ID NO:777、SEQ ID NO:778，SEQ ID NO:779，SEQ ID NO:780，SEQ ID NO:781，SEQ ID NO:782，SEQ ID NO:783，SEQ ID NO:784，SEQID NO:785，SEQ ID NO:786，SEQ ID NO:787和/或SEQ ID NO:788的序列组成。
实施例2.大肠杆菌Nissle的肿瘤药代动力学
如于2017年1月11日提交的公布为WO2017/123675的国际专利申请PCT/US2017/013072所述对肿瘤药代动力学进行测定和确定，其全部内容通过引用并入本文，例如，实施例58-61。使用CT26肿瘤模型在7天内测定Nissle(1e7和1e8细胞/剂量)的肿瘤药代动力学。肿瘤组织中的细菌计数在剂量两者下相似。在任何时间点在血液中都未检测到细菌。
在CT26肿瘤模型中比较链霉素抗性Nissle和Nissle DOM突变体(NissleΔPAL::CmR)的肿瘤药代动力学。肿瘤组织中的细菌计数在菌株两者中相似。在血液中未检测到细菌。这些结果表明野生型和DOM突变体Nissle两者都可以在肿瘤环境中存活。
使用CT26肿瘤模型于1e6(组1)或1e7细胞/剂量(组2)下评估链霉素抗性Nissle对肿瘤内施用的体内细胞因子响应。在指定剂量下在小鼠CT-24模型中在SYN94肿瘤内施用后的时间过程中测量在血清和肿瘤中的水平。结果表明，在肿瘤中于较高剂量下引发细胞因子应答但不在血清中。较低剂量不引起实质性细胞因子反应。
在IT给药(1e7细胞/剂量)后在48小时评估肿瘤PK、在各种组织中细菌的水平和在这些组织中的细胞因子水平。如在国际专利申请PCT/US2017/013072(通过引用并入本文)中所见，细菌主要存在于肿瘤中而在测试的其他组织中不存在。在所有血清、肿瘤和肝脏中测量的TNFα水平在SYN94、盐水处理和初始组之间类似。当Nissle通过IV以1e8施用时，TNFα水平相对于在1.5小时测量的TNFα水平可忽略不计。然而，即使是IV施用，TNFα水平在4小时时降低至不可检测的水平。在SYN94的1e6 IV剂量下检测到TNFα的类似低水平。
实施例3A.代谢物的LC-MS/MS定量
如2017年1月11日提交的公布为WO2017/123675的国际专利申请PCT/US2017/013072所述，通过LC-MS/MS进行细菌上清液和肿瘤组织中的腺苷、犬尿氨酸、色氨酸和精氨酸的定量，其全部内容通过引用并入本文。
实施例3B.使用染色体插入的工程化细菌菌株
用于将构建体整合到大肠杆菌Nissle的基因组中的方法描述在国际专利申请PCT/US2017/013072中，其通过引用并入本文。
实施例4.腺苷降解菌株的产生
腺苷降解途径中的3个操纵子的示意图示于图47和图48中。为了产生腺苷消耗菌株，将每一个操纵子(或在nupC的情况下，单个基因)克隆到在PfnrS启动子控制下的KIKO载体中。从KIKO载体制备敲入PCR产物，并进行等位基因交换以将这些操纵子整合到大肠杆菌基因组中。通过使用如本文所述的λ红色重组酶系统促进等位基因交换。产生多种菌株组合，表13总结了在腺苷降解测定中产生和比较的菌株。表14总结了用于各个构建体的整合位点。
表13.腺苷消耗菌株
Figure BDA0002364453000004981
表14.整合位点(也可以参见菌株表)
构建体 染色体整合位点
P<sub>fnrS</sub>-nupC 整合到HA1/2(agaI/rsmI)区域
P<sub>fnrS</sub>-xdhABC 整合到HA9/10(exo/cea)区域
P<sub>fnrS</sub>-add-xapA-deoD 整合到malE/K区域
实施例5.体外腺苷降解测量
体外腺苷消耗
葡萄糖是大肠杆菌的优选碳源。然而，在没有葡萄糖的情况下，大肠杆菌也可以使用腺苷作为唯一的碳源。评估新产生的菌株降解腺苷的能力，并且是否即使在存在优选碳源即葡萄糖的情况下也能够这样做。
为了实现这一点，包括野生型对照的各菌株的过夜培养物在LB中于37℃生长，250rpm下振荡。将培养物以1:100稀释(10mL在125mL带挡板的烧瓶中)并生长1.5小时至早期对数期。一旦培养物达到早期对数，将培养物移入供给厌氧气氛(85％N2、10％CO2、5％H2)的Coy厌氧室。将培养物厌氧孵育4小时以允许诱导工程化腺苷降解途径基因。
从厌氧室中取出培养物并测试腺苷降解活性。为实现此目的，将～1e8的激活的细菌细胞在1.5mL微量离心管中旋下并重悬于腺苷测定缓冲液(含有10mM腺苷的1×M9基本培养基，其中不含葡萄糖或含0.5％葡萄糖(参见幻灯片))。将管在37摄氏度下静态孵育5小时，每小时取出上清液样品共5小时。通过LC-MS分析上清液样品以确定腺苷浓度。
结果显示在图3中，表明所有工程化菌株都能够以高于野生型对照菌株的速率降解腺苷(通过其在上清液样品中的不存在来确定)。无论是否存在大肠杆菌的优选碳源即葡萄糖，所有菌株都能够降解腺苷。
在底物限制条件下的体外活性
在先前的研究中，底物是非限制性的，即，菌株能够在Vmax下发挥功能。这样的底物浓度远远超过体内预期的浓度。接下来，在更有限的底物浓度(与体内肿瘤中的腺苷浓度更一致)和更低剂量下(与可在小鼠中IV或IT施用而不引起败血症的剂量更一致)评估工程化细菌的腺苷降解能力。
各菌株的过夜培养物在37℃下在LB中生长，以250rpm振荡。将培养物以1:100稀释(10mL在125mL带挡板的烧瓶中)并生长1.5小时至早期对数期。一旦培养物达到早期对数，将它们移入供给厌氧气氛(85％N2、10％CO2、5％H2)Coy厌氧室。将培养物厌氧孵育4小时以允许诱导工程化腺苷降解途径基因。
激活的细胞在cellometer上定量并在PBS中稀释至5e8 cfu/ml。将10μl该悬浮液(包含5e6细菌)重悬于1mL含有M9基本培养基、0.5％葡萄糖和100μM腺苷的腺苷测定缓冲液中。将细胞在37℃静态孵育。每小时取出上清液样品共5小时以确定腺苷降解速率。通过LC-MS分析上清液样品以确定腺苷浓度。报告的降解速率是0至5小时采样之间的最大线性速率(这可以不包括较晚的时间点，因为速率在极低底物(腺苷)降解下可以不是线性的)。
结果如图5和6所示，表明所有工程化菌株都能够以高于对照菌株SYN01的速率降解腺苷(通过其在上清液样品中的不存在来确定)。SYN1656是含有包含腺苷降解途径的所有三种整合的最高度工程化的菌株，其能够以最高的速率降解腺苷并且在3小时内使腺苷水平达到不可检测的水平。
线性速率在表15中显示。
表15.线性腺苷降解速率
<u>线性速率(umol/hr/10<sup>9</sup>细胞)</u>
<u>SYN001</u> <u>1.95</u>
<u>SYN1552</u> <u>5.90</u>
<u>SYN1584</u> <u>6.39</u>
<u>SYN1655</u> <u>5.65</u>
<u>SYN1656</u> <u>6.88</u>
实施例6.腺苷消耗菌株的体内作用
评估腺苷消耗菌株SYN1656(包含PfnrS-nupC；PfnrS-xdhABC；PfnrS-add-xapA-deoD)单独和与抗PD1的组合在体内的作用。
根据提供的指南培养从ATCC获得的CT26细胞。将PBS中约1e6个细胞/小鼠皮下植入每只动物(BalbC/J(雌性，8周))的右侧腹侧，并监测肿瘤生长约10天。当肿瘤达到约100-150mm3时，将动物随机分组用于给药。
为了制备细胞，链霉素抗性Nissle(SYN094)在LB培养基中生长，直到在600nm处的吸光度(A600 nm)达到0.4(对应于2×108菌落形成单位(CFU)/mL)并且在PBS中洗涤两次。将悬浮液在PBS或盐水中稀释，使得100μl可以以适当的剂量经肿瘤内注射到具有肿瘤的小鼠中。为了制备SYN1656，将细胞在LB(2L)中以1:100稀释，在需氧条件下生长1.5小时，然后转移至厌氧室4小时。在施用之前，将细胞浓缩200倍并冷冻(15％甘油、2g/L葡萄糖，在PBS中)。
CT26植入后大约10天，在第1天，将细菌悬浮于0.1ml PBS中，然后对小鼠称重、测量并随机分组至如下治疗组：组1盐水注射(100μl)(n＝14)；组2SYN94 IT 10e7(n＝14)；组3-SYN1656 IT 10e7(n＝14)；组4-SYN1656 IT 10e7加上aPD-1(BioXcell)，10mg/kg，i.p.(n＝14)；组5-aPD-1(BioXcell)，10mg/kg，i.p.(n＝9)。
在第1天和第4天，按照其分组用盐水或者单独肿瘤内(IT)用菌株或者与抗PD-1(I.P.)组合向动物给药。收集血浆用于进行进一步分析。图49显示了第1、4和7天的小鼠的肿瘤体积。结果显示，在第7天所有三个治疗组(SYN1656、抗PD1、和SYN1656加上抗PD1)与用盐水处理的对照相比肿瘤体积减少。在SYN1656和抗PD1处理组中肿瘤大小最小，然后是单独的SYN1656和单独的抗PD1，表明两种处理之间可以存在协同作用，并且表明腺苷消耗菌株作为单个药剂和与aPD-1组合的抗肿瘤活性。用SYN1656和抗PD1处理的动物中的肿瘤体积显著低于单独盐水处理(p＝0.01)。用SYN1656和抗PD1处理的动物的肿瘤体积也显著低于单独用抗PD1处理的动物的肿瘤体积。
在其他研究中，该研究扩展到包括在第10、15和18天的给药和分析，直到动物达到约2000mm3的肿瘤大小。
实施例7.适应性实验室演化(ALE)
首先，生产菌株，其包含用于表达由组成型启动子驱动的荧光假单胞菌KYNase的trpE敲除和整合构建体，如于2017年1月11日提交、公开号为WO2017/123675的国际专利申请PCT/US2017/013072；和于2018年1月5日提交的国际专利申请PCT/US2018/012698中所描述的，其全部内容通过引用并入本文。将KYNase构建体整合到HA3/4位点处，并使用两种不同的启动子；内源性lpp基因的启动子用于母体菌株SYN2027(HA3/4::Plpp-pKYNaseKanRTrpE::CmR)，而合成pSynJ23119用于母体菌株SYN2028(HA3/4::PSynJ23119-pKYNaseKanRTrpE::CMR)。生产这些菌株使得菌株将演化，其将包含荧光假单胞菌KYNase的染色体整合版本。
这些菌株在棋盘测定中验证(例如，如描述于PCT/US2017/013072)以具有与其基于质粒的Ptet对应物相似的ALE参数。使用PCT/US2017/013072中描述的棋盘测定建立用于在ALE实验中使用的犬尿氨酸(KYN)和ToxTrp浓度的下限，并且下限浓度对应于对从中等拷贝质粒表达tet诱导型KYNase的菌株观察到的下限浓度。
从母体菌株SYN2027和SYN2028衍生的突变体如下通过在较低浓度的KYN和三种不同ToxTrp浓度中传代而演化。
用补充有葡萄糖和L-犬尿氨酸(M9+KYN)的M9基本培养基在平板上培养ALE母体菌株。选择来自各母体的单菌落，重悬于20μl无菌磷酸盐缓冲盐水溶液中。然后将该菌落用于接种两种M9+KYN培养物，生长至对数晚期，并在600nm处测定光密度。然后将这些培养物在含有1mL M9+KYNU的96孔深孔板的3列中稀释至103。三行中的每一行具有不同的ToxTrp浓度(增加2倍)，而每列具有降低浓度的KYN(2倍)。每12小时，用来自培养物生长至OD600约为0.1的孔的30μl稀释平板。将该过程重复5天，然后将ToxTrp浓度加倍以维持选择压力。在两周时间后，未检测到生长速率增加，并将培养物接种到M9+KYN上。所有培养于37℃下350RPM振荡进行。选择个体菌落并在M9+KYN+ToxTrp培养基中筛选以确认增加的生长速率的表型。
选择各母体菌株的两个重复(SYN20207-R1、SYN2027-R2、SYN2028-R1、和SYN2028-R2)，并测定犬尿氨酸生产。
简言之，过夜培养物在400ml LB中1:100稀释并让其生长4小时。接下来，将2ml培养物旋下并重悬于2ml M9缓冲液中。测量培养物的OD600(在PBS中1/100稀释)。将用于针对起始细胞计数～OD0.8(～1E8)的3ml测定的必需量的细胞培养物旋下。将细胞沉淀重悬于培养管中的测定体积(3ml)中的M9+0.5％葡萄糖+75uM KYN中。在每个时间点(t＝0、2和3小时)将220μl取出到圆锥形96WP中，重复三次，并且在每个时间点取出4μl用于cfu测量。在各个时间点，将样品在锥形96WP中以3000g旋下5分钟，并将200μl从各个孔转移到透明的平底96WP中。在同一平板中制备犬尿氨酸标准曲线和空白样品。接下来，向各个孔中加入40μl30％三氯酸(v/v)并通过上下吸移混合。用铝箔密封平板并在60℃下孵育15分钟。将平板在11500rpm，4℃下旋下15分钟，将来自各个孔的125μl等分并与另外96WP中的125μl 2％Ehrlich试剂在冰醋酸中混合。将样品上下混合移液，并在OD480下测量吸光度。在图51中显示了母体菌株SYN2027和SYN2028和相应演化菌株的生长速率。
实施例8.犬尿氨酸消耗菌株降低CT26鼠肿瘤模型中的肿瘤犬尿氨酸水平
在肿瘤环境中体内评估包含来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的基因工程化细菌消耗犬尿氨酸的能力。将包含Trp:E缺失和在组成型启动子控制下表达来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的中等拷贝质粒的大肠杆菌Nissle菌株SYN1704(NissleΔTrpE::CmR+Pconstitutive-Pseudomonas KYNU KanR)用于第一项研究(研究1)。
在第二项研究(研究2)中，评估包含Trp:E缺失和在组成型启动子控制下表达来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的整合构建体的大肠杆菌Nissle菌株SYN2028(Nissle HA3/4::PSynJ23119-pKYNase KanR TrpE::CmR)的活性。
在两项研究中，根据提供的指南培养从ATCC获得的CT26细胞。将PBS中约1e6个细胞/小鼠皮下植入每只动物的右侧腹侧(BalbC/J(雌性，8周))，并监测肿瘤生长约10天。当肿瘤达到约100-150mm3时，将动物随机分组以进行给药。
对于瘤内注射，细菌在LB培养基中生长直至在600nm(A600nm)处达到0.4的吸光度(对应于2×108菌落形成单位(CFU)/mL)并在PBS中洗涤两次。将悬浮液在PBS或盐水中稀释，使得100μL可以以适当的剂量经肿瘤内注射到具有肿瘤的小鼠中。
研究1：CT26植入后大约10天，将细菌悬浮在0.1ml PBS中，对小鼠肿瘤内注射(5E6细胞/小鼠)100μl，如下所示：组1-载剂对照(n＝8)、组2-SYN94(n＝8)和组3-SYN1704(n＝8)。从第2天到研究结束，动物每周两次用100μl载剂对照或细菌以5e6细胞/小鼠给药。称重动物并每周测量肿瘤体积两次。当肿瘤达到～2000mm3时对动物实施安乐死，并且如本文所述通过LC/MS测量犬尿氨酸浓度。结果示于图52A。对于犬尿氨酸消耗菌株SYN1704和对于野生型大肠杆菌Nissle，观察到肿瘤内浓度的显著降低。与野生型Nissle相比，肿瘤内犬尿氨酸水平在SYN1704中降低，尽管由于一个异常值，差异没有达到显著性。
研究2：CT26植入后大约10天，细菌悬浮在0.1ml盐水中，对小鼠肿瘤内注射(1E8细胞/小鼠)如下所示的细菌悬浮液：组1-载剂对照(n＝10)、组2-SYN94(n＝10)、组3-SYN2028(n＝10)。组5(n＝10)每天两次通过口服强饲接受INCB024360(IDO抑制剂)作为对照。从第2天到研究结束，动物每周两次用100μl载剂对照或细菌以1e8细胞/小鼠进行肿瘤内给药。称重动物并每周测量肿瘤体积两次。组5每天两次通过口服强饲接受INCB024360作为对照直至研究结束。当肿瘤达到～2000mm3时，对动物实施安乐死。将肿瘤碎片置于预先称重的bead-buster管中并储存在冰上用于分析。如本文所述，通过LC/MS测量犬尿氨酸浓度。结果显示于图52B中。与野生型Nissle或野生型对照相比，观察到犬尿氨酸消耗菌株SYN2028的肿瘤内浓度的显著降低。在SYN2028中观察到的肿瘤内犬尿氨酸水平与对IDO抑制剂INCB024360观察到的那些相似。
实施例9.携带染色体插入和质粒的工程化细菌菌株的体外功效的比较
为了比较具有在malEK基因座处由fnr诱导型启动子驱动的argAfbr染色体插入的工程化细菌菌株和具有包含由fnr诱导型启动子驱动的argAfbr的低拷贝质粒的菌株之间的体外功效，在厌氧诱导后的不同时间点测量培养基中的精氨酸水平。另外，为了评估胸苷的营养缺陷是否可能对精氨酸生产效率有影响，比较了具有或不具有ThyA缺失的包含在低拷贝质粒上或整合在染色体上的fnr-argAfbr的工程化细菌菌株的精氨酸生产。
将过夜培养物在LB中以1:100稀释，并在37℃下振荡(250rpm)生长。生长1.5小时后，如下诱导细菌培养物：(1)在厌氧条件下在Coy厌氧室(供应90％N2、5％CO2、5％H2，和20mM硝酸)中在37℃下，在LB中在37℃下诱导包含FNR诱导型argAfbr的细菌4小时；(2)用无水四环素(100ng/mL)诱导包含四环素诱导型argAfbr的细菌。诱导后，从培养箱中取出细菌并以最大速度旋下5分钟。将细胞重悬于1mL M9葡萄糖中，并测量OD600。稀释细胞直至OD600在0.6-0.8之间。在M9葡萄糖培养基中重悬的细胞在37℃振荡下有氧生长。除去100μl细胞重悬液，在时间＝0时测量OD600。100μl等分试样在-20℃下在圆底96孔板中冷冻用于质谱分析(LC-MS/MS)。在每个后续时间点(例如，30、60和120分钟)，移除100μl细胞悬浮液并测量OD600；将100μl等分试样在-20℃下在圆底96孔板中冷冻用于质谱分析。分析样品的精氨酸浓度。在每个时间点，通过质谱法确定的相对于OD600的标准化浓度用于确定每单位时间每个细胞的精氨酸生产速率。以上提供了LC-MS/MS方法的概述。
在诱导后30、60和120分钟时在(1)Syn-UCD301(SYN-UCD304；包含在malEK基因座处整合到染色体中在FNR诱导型启动子控制下表达的ΔArgR和argAfbr)、(2)SYN-UCD205(包含在低拷贝质粒上在FNR诱导型启动子控制下表达的ΔArgR和argAfbr)、和(3)SYN-UCD206(包含在低拷贝质粒上在FNR诱导型启动子控制下表达的ΔArgR和ΔThyA和argAfbr)之间比较精氨酸生产。使用SYN-UCD103作为对照Nissle构建体，并显示结果。
本文中所显示的是在0、30、60和120分钟时测量的SYN-UCD205、SYN-UCD206、和SYN-UCD301的精氨酸生产的水平。精氨酸生产在所有三种菌株之间类似，在120分钟时观察到SYN-UCD301的最高精氨酸生产，表明FNR argAfbr的染色体整合导致与对表达相同构建体的低拷贝质粒菌株观察到的相似水平的精氨酸生产，并且可以甚至略微增加精氨酸生产速率。SYN-UCD206与SYN-UCD205和SYN-UCD-301(60分钟时较低精氨酸水平)相比表现出减弱的精氨酸生产，但在120分钟达到类似的精氨酸生产水平，表明ΔThyA可以对精氨酸生产有轻微的减弱作用。SYN-UCD103对照没有检测到精氨酸生产。
接下来，如前文所述制备样品，并且在诱导后120分钟在(1)SYN-UCD204(包含在低拷贝质粒上在四环素诱导型启动子的控制下表达的ΔArgR和argAfbr)、和(2)SYN-UCD301(包含在malEK基因座处整合到染色体中在FNR诱导型启动子的控制下表达的ΔArgR、CmR和argAfbr)、(3)SYN-UCD302(包含在malEK基因座处整合到染色体中在FNR诱导型启动子的控制下表达的ΔArgR、ΔThyA、CmR(氯霉素抗性)和argAfbr)、和(4)SYN-UCD303(包含在malEK基因座处整合到染色体中在FNR诱导型启动子的控制下表达的ΔArgR、ΔThyA、KanR(卡那霉素抗性)和argAfbr)之间比较精氨酸生产。
使用包含ΔArgR和ΔThyA的SYN-UCD106作为对照Nissle构建体。结果显示于图42B中。如图42B所示，精氨酸生产升高至0.7-0.9μmol/1×109个细胞，表明精氨酸生产在携带质粒上的argAfbr的菌株和具有argAfbr的整合拷贝的菌株中处于相似水平。
实施例10.携带染色体插入和质粒的工程化细菌菌株的体外功效比较
评估具有malEK基因座处由fnr诱导型启动子驱动的argAfbr染色体插入、具有ΔArgR和ThyA缺失且无抗生素抗性的工程化细菌菌株(SYN-UCD303)的体外功效(从氨生成精氨酸)。
将过夜培养物在LB中以1:100稀释，并在37℃下振荡(250rpm)生长。在生长1.5小时，细菌培养物在厌氧条件下在Coy厌氧室(供应90％N2、5％CO2、5％H2，和20mM硝酸)中在37℃下在LB中在37℃下诱导。诱导后，从培养箱中取出细菌并以最大速度旋下5分钟。将细胞重悬于1mL M9葡萄糖中，并测量OD600。稀释细胞直至OD600在0.6-0.8之间。在M9葡萄糖培养基中重悬的细胞在37℃振荡下有氧生长。除去100μl细胞重悬液，在时间＝0时测量OD600。100μl等分试样在-20℃下在圆底96孔板中冷冻用于质谱分析(LC-MS/MS)。在每个后续时间点(例如，20、40、60、80、100和120分钟)，移除100μl细胞悬浮液并测量OD600；将100μl等分试样在-20℃下在圆底96孔板中冷冻用于质谱分析。分析样品的精氨酸浓度。在每个时间点，通过质谱法确定的相对于OD600的标准化浓度用于确定每单位时间每个细胞的精氨酸生产速率。以上提供了LC-MS/MS方法的概述。结果显示于图43。
实施例11.用于细胞因子分泌的构建体和细菌的产生
为了产生能够分泌免疫调节多肽，例如细胞因子，例如hIL-12、mIL-12、hIL-15、GMCSF、TNF-α、IFN-γ、CXCL9和CXCL10的菌株，采用不同分泌策略设计了多种构建体。合成各种细胞因子构建体，并克隆到载体pBR322中以用于转化大肠杆菌。在一些实施方式中，编码效应分子的构建体被整合到基因组中。在一些实施方式中，编码效应分子的构建体位于质粒上，例如中等拷贝质粒。
实施例12.在MC38模型中犬尿氨酸消耗菌株与全身性抗PD-1和抗CTLA-4的组合的活性
在C57BL/6-MC38同源肿瘤模型中评估犬尿氨酸消耗菌株SYN2028增加组合的抗CTLA4和抗PD-1的抗肿瘤应答的能力。
为了制备在研究中使用的细胞，过夜培养物用于接种具有抗生素的500mL LB培养基。将菌株在37℃振荡孵育直至培养物达到对数期结束(OD600＝0.8-1.0)。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
根据表16的研究设计，将肿瘤MC38植入小鼠，并且对小鼠肿瘤内注射犬尿氨酸消耗细菌和腹膜内注射抗CTLA-4和抗PD-1抗体。在第9天向每只动物的右侧腹侧SC植入MC38细胞(1×105/小鼠/100μl)。监测肿瘤生长；当肿瘤在第1天达到～50-80mm3时，将小鼠随机分入处理组，如表16所示。
在一周内记录肿瘤体积和体重三次，在两次测量之间间隔1-2天。
表16.研究设计
Figure BDA0002364453000005081
Figure BDA0002364453000005091
图58A、58B、58C和58E的结果显示，在MC38模型中犬尿氨酸消耗菌株具有改善抗CTLA-4/抗PD-1抗体介导的抗肿瘤活性的能力。具体而言，在抗PD-1/抗CTLA-4组中，25％的小鼠对治疗有应答；抗PD-1/抗CTLA-4加SYN94组观察到相同的应答率。在抗PD-1/抗CTLA-4加SYN2028组中，71％的小鼠有应答。
实施例13.精氨酸生产者和犬尿氨酸消耗者与非清髓性化疗联合的活性
在CT26肿瘤模型中评估精氨酸生产者(SYN828)和犬尿氨酸消耗者(SYN2028)与环磷酰胺处理的组合的活性。
为了制备用于研究的细胞，过夜培养物用于接种含有抗生素的500mL LB培养基。将菌株在37℃振荡孵育直至培养物达到对数期结束(OD600＝0.8-1.0)。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
根据下文所述的时间线和图44A，将CT26肿瘤植入小鼠，并且对小鼠肿瘤内注射生产精氨酸的细菌(SYN828)和消耗犬尿氨酸的细菌(SYN2028)和对照与100mg/kg环磷酰胺(CP)的组合。
简言之，在第9天将CT26细胞SC植入(在PBS中1e6细胞/小鼠)到每只动物的右侧腹侧。监测肿瘤生长直至肿瘤达到约50-80mm3。在第0天，用100mg/kg(100μl/小鼠)环磷酰胺I.P.预处理小鼠并随机分组。在治疗的第1天，小鼠接受100μl的SYN94(WT，1e8CFU/mL)(I.T.)、SYN2028(Kyn，1e8CFU/mL)或SYN825(Arg，1e8CFU/mL)(I.T.)。在第4天、第8天、第11天和第15天，称重动物，测量肿瘤，并向小鼠给药适当的治疗/组。个体小鼠的肿瘤体积显示在图44B、44C、44D、44E和44F中，指示消耗犬尿氨酸和生产精氨酸的菌株与环磷酰胺的组合相比于单独环磷酰胺的抗肿瘤活性。
实施例14.通过LC-MS/MS对细菌细胞沉淀和肿瘤组织匀浆进行环二AMP定量
样品制备
为了生产标准品，在1.5毫升微量离心管中制备10mg/ml环二AMP，并且分别在水中制备250、100、20、4、0.8、0.16、0.032μg/mL的溶液。制备具有200、20和2μg/mL水平的QC溶液。
样品制备：对于体外样品，通过加入100μl 2:1乙腈:水、涡旋并离心抽提细菌沉淀。将20μl上清液转移到新的96孔板中，并通过添加180μl 0.1％甲酸稀释10倍。对于体内样品，通过向10μl肿瘤匀浆中加入90μl的2:1乙腈:水来抽提组织匀浆。将样品涡旋并离心。将20μl上清液转移到新的96孔板中，并通过添加180μl 0.1％甲酸稀释10倍。将板用ClearASeal片热密封并充分混合。
LC-MS/MS方法
通过使用Thermo TSQ Quantum Max三重四极质谱仪(LC-MS/MS)通过耦合到串联质谱的液相色谱测量分析物。表17-表19提供了LC-MS/MS方法的总结。
表17.
Figure BDA0002364453000005111
表18.HPLC方法
Figure BDA0002364453000005112
表19.串联质谱:
Figure BDA0002364453000005113
对于数据分析，整合SRM色谱图，并将标准品的峰面积相对于浓度作图。拟合线性曲线，并使用它们的峰面积和来自标准曲线的斜率截距形式方程计算未知物的浓度。
实施例15.在大肠杆菌Nissle细胞表面上展示抗mPD1-scFv
为了生产能够在细胞的Nissle表面上展示抗MPD1-scFv的基因工程化细菌，根据本文所述的如表20所示的方法生产构建体。序列是SEQ ID NO:987-989。展示锚多肽包括SEQ ID NO:990-992。
表20.用于展示抗mPD1-scFv的菌株
Figure BDA0002364453000005121
在一些实施方式中，展示锚与序列SEQ ID NO:990、SEQ ID NO:991、和/或SEQ IDNO:992至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源。
包含含有tet诱导型ptet-LppOmpA-抗PD-1-scFv的基于质粒的构建体的大肠杆菌Nissle在LB培养基中生长过夜。将培养物在LB中1:100稀释并振荡(200rpm)至光密度为0.8，此时将培养物冷却至室温，并将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度添加至培养物中以诱导ptet-LppOmpA-J43-scFv表达18小时。
为了测定单链抗体是否被展示到基因工程化大肠杆菌Nissle的表面上并功能性结合到PD1，进行全细胞ELISA测定。在室温下使用含有2％BSA的PBS封闭109个细胞1小时，并加入生物素化mPD1并在室温下孵育1小时。然后，用PBST(PBS/0.1％Tween-20)洗涤细胞3次，并与链霉亲和素缀合的HRP在封闭溶液中一起孵育40分钟。孵育后，将孔用PBST洗涤3次并重悬于PBS中，然后按照制造商的说明书(Thermofisher)使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物试剂盒染色。使用生物素化IgG和普通PBS代替mPD1作为阴性对照。离心除去细胞，收集上清液。使用ELISA读数器在450nm下测量上清液的信号强度。结果(数据不可用)表明J43-scFv(抗mPD1)被展示在基因工程化细菌的表面上并且可以结合mPD1(表21)。
表21.Nissle表面展示ELISA测定
Figure BDA0002364453000005131
实施例16.在大肠杆菌中的α-PD1-scFv表达
为了确定功能性scFv是否可以在大肠杆菌中表达，基于与小鼠PD1反应的J43单克隆抗体生成抗PD-1-scFv片段。
从专利EP1445264A1获得小鼠单克隆抗体J43序列。接下来，设计单链可变片段(scFv)。通过IDTDNA合成含有tet启动子、核糖体结合位点、设计的J43-scFv、C末端V5标签和C末端六组氨酸标签的片段。将构建体克隆到
Figure BDA0002364453000005132
载体(Invitrogen)中，并如本文所述转化到大肠杆菌DH5α中以产生质粒pUC-ptet-J43scFv-V5-HIS(SEQ ID NO:976-980)。
将包含tet诱导型J43-抗PD1-scFv-V5的大肠杆菌或野生型对照在LB培养基中培养过夜。将培养物在LB中1:40稀释并振荡(250rpm)至光密度为0.8，此时将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度添加至培养物中以诱导J43-抗PD1-scFv-V5表达。向野生型对照培养物中加入相同量的四环素。诱导4小时后，沉淀细菌，在PBS中洗涤、收获，重悬于2mL超声缓冲液(PBS)中，并在冰上超声裂解。将不溶性碎片在4℃下以12,000rpm旋下两次，每次15分钟。
蛋白质浓度通过BCA蛋白质测定法测定，并通过蛋白印迹分析从野生型和包含Ptet-J43-抗PD-1-ScFv-V5的菌株分离的提取物。将蛋白质转移到PVDF膜上，用HRP缀合的抗V5抗体(Biolegend)检测J43-抗PD1-scFv。在泳道2(来自J43-抗PD1-scFv-V5菌株的提取物)中检测到在27kDa处的单一条带。在泳道1(野生型提取物)中没有检测到条带。
为了确定从大肠杆菌DH5α纯化的单链抗体是否功能性结合靶蛋白PD1，进行ELISA测定。将平板在4℃下用每孔100μl 2μg/ml PD1(Rndsystems)吸收过夜。在室温下用2％BSA的PBS/0.1％Tween-20封闭孔2小时。洗涤三次后，将孔与细菌提取物(J43-scFv-V5或野生型-neg-ctrl)在室温下孵育1小时。将孔用PBST(PBS/0.1％Tween-20)洗涤4次，并与HRP缀合的抗V5抗体(Biolegend)在封闭溶液中一起孵育40分钟。孵育后，用PBST洗涤孔4次，然后用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)染色。使用ELISA读数器在450nm下测量信号强度。结果显示于表22，指示由基因工程化细菌表达的抗体可以与PD1特异性结合。
表22.ELISA结合测定
Figure BDA0002364453000005141
接下来，使用收获C末端聚组氨酸标签的pET22b载体表达重组J43-抗-scFv-V5，并使用固定的金属离子亲和层析纯化。通过280nm处的吸收测定蛋白质浓度，并通过考马斯凝胶确认纯度(数据未显示)。
为了确定大肠杆菌中表达的抗PD-1-scFv是否与小鼠EL4细胞上的表面PD1结合，使用EL4细胞进行流式细胞术分析。EL4是在其细胞表面表达PD1的小鼠淋巴瘤细胞系。
EL4细胞在含有10％FBS的Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)中生长。将细胞旋下，吸出上清液，将沉淀重悬于1ml D-PBS中，转移至冷冻测定管(1×106个细胞)中，并在含有0.5％BSA的D-PBS中洗涤2-3次。将细胞重悬于含有0.5％BSA的PBS中，向其中加入纯化的scFv-V5和抗V5-FITC抗体，并在室温下孵育1小时。阴性对照不加scFv-V5。将细胞重悬于0.5ml PBS中并在流式细胞仪上分析。结果显示在图62中。相对于仅具有单独EL4和EL4加二抗的样品，仅当纯化的抗PD1-scFv-V5和抗V5-FITC两者都存在时(显示两个不同的批次)观察到群移位(population shift)。
实施例17.抗mPD1-scFv的分泌
根据本文所述的方法产生用于抗mPD1-scFv分泌的菌株显示于表24。
表23.用于分泌抗mPD1-scFv的菌株
Figure BDA0002364453000005151
Figure BDA0002364453000005161
包含含有tet诱导型J43-抗-scFv-V5与PhoA、OmpF或PelB分泌标签(参见SEQ IDNO:981-986)的基于质粒的构建体的大肠杆菌Nissle或野生型对照在LB培养基中生长过夜。将培养物在LB中以1:100稀释并振荡(200rpm)至光密度为0.8，此时将培养物冷却至室温，并将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度添加至培养物中以诱导PhoA-、OmpF-或PelB-J43-抗-scFv-V5表达。野生型Nissle培养物中未添加四环素。在室温下诱导18小时后，沉淀细菌，收集上清液并置于冰上。
通过BCA蛋白质测定确定在培养基和细胞裂解物中的蛋白质浓度，并且通过蛋白印迹分析从野生型和包含Ptet-J43-抗-scFv-V5的菌株分离的提取物和培养基。将蛋白质转移到PVDF膜上，用HRP缀合的抗V5抗体(Biolegend)检测J43-抗scFv。结果显示在图63中。在泳道1-6中检测到在约34kDa处的单一条带，分别对应于来自SYN2767、SYN2769、SYN2771、SYN2773、SYN2775和SYN2777的提取物。
为了确定大肠杆菌Nissle中的分泌J43-抗-scFv是否结合小鼠细胞上的PD1，使用EL4细胞进行流式细胞术分析。EL4是在其细胞表面表达PD1的小鼠淋巴瘤细胞系。
EL4细胞在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的Dulbecco's Modified Eagle'sMedium(DMEM)中生长。将细胞旋下，吸出上清液，将沉淀重悬于1ml D-PBS中，转移至冷冻测定管(1×106个细胞)中，并在D-PBS中洗涤3次。将细胞重悬于含有0.5％BSA的D-PBS中，向其中加入纯化的scFv-V5和抗V5-FITC抗体，并在室温下孵育1小时。阴性对照不加分泌的J43-scFv-V5。将细胞重悬于0.5ml PBS中并在流式细胞仪上分析。结果显示在图20中。相对于仅具有单独EL4和EL4加二抗的样品，仅当纯化的抗PD1-scFv-V5(1’抗体)和抗V5-FITC(2’抗体)两者都存在时观察到群移位。用不同量的分泌的scFv(0、2、5和15μl)进行类似的研究，观察到EL4细胞的剂量依赖性染色(图65)。
接下来，进行竞争测定以确定PDL1是否可以抑制由基因工程化细菌分泌的抗PD-1-scFv与鼠PD1的结合。使EL4细胞生长并基本上如前文所述进行流式细胞术方案，不同之处在于在分泌的抗PD1-scFv-V5的孵育期间以各种浓度(0、5、10和30μg/mL)加入PDL1。大鼠IgG用作分泌的scFv的阴性对照。结果显示于图66A和图66B中。PDL1以剂量依赖性方式竞争分泌的抗mPD1-scFv与EL4细胞表面上的mPD1的结合。大鼠-IgG蛋白的阴性对照未显示类似的剂量依赖性结合竞争。
实施例18.细胞因子分泌(IL-15)
为了确定工程化细菌表达的hIL-15是否被分泌，测量来自包含hIL-15分泌构建体的工程化菌株/菌株的细菌上清液的hIL-15浓度。菌株包含Lpp(lpp::Cm)、nlpI(nlpI::Cm)、tolA(tolA::Cm)或PAL(PAL::Cm)中的缺失。所有菌株还包含表达具有PhoA分泌标签的hIL-15的质粒。
大肠杆菌Nissle菌株在LB培养基中生长过夜。将培养物在LB中1:200稀释并振荡(200rpm)2小时。将培养物稀释至0.5的光密度，此时将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度加入到培养物中以诱导hIL-1表达。诱导12小时后，将细胞离心，收集上清液。为了产生无细胞培养基，将澄清的上清液进一步通过0.22微米过滤器过滤以除去任何残留的细菌并置于冰上。另外，为了检测细胞内重组蛋白质的生产，将沉淀的细菌洗涤并用含有蛋白酶抑制剂和Ready-Lyse Lysozyme Solution(Epicenter)的BugBusterTM(Millipore)重悬浮，导致与原始培养条件相比，裂解物浓缩10倍。在室温下孵育10分钟后，将不溶性碎片在4℃以12,000rcf旋下20分钟，然后置于冰上直至进一步处理。
根据制造商的说明书，通过hIL-15ELISA(RnD Systems,Minneapolis,MN)测量在无细胞培养基和细菌细胞提取物中的hIL-15的浓度。所有样品重复三次，并使用标准曲线计算hIL-15的分泌水平。使用重组hIL-15生产标准曲线。野生型Nissle作为阴性对照包含在ELISA中，未观察到信号。表24总结了在各上清液中测量的hIL-15的水平。数据显示hIL-15从不同细菌菌株以不同水平分泌。
表24.分泌的hIL-15的浓度
Figure BDA0002364453000005181
实施例19.细胞因子分泌(GMCSF)
为了确定由工程化细菌表达的hGMCSF是否被分泌，测量来自包含hGMCSF分泌构建体的工程化菌株/菌株的细菌上清液的hGMCSF的浓度。菌株包含Lpp(lpp::Cm)、nlpI(nlpI::Cm)、tolA(tolA::Cm)或PAL(PAL::Cm)中的缺失。所有菌株还包含表达具有PhoA分泌标签的hGMCSF的质粒。
如先前IL-15的实施例所述使大肠杆菌Nissle菌株生长、诱导、处理。
根据制造商的说明书，通过hGMCSF ELISA(RnD Systems,Minneapolis,MN)测量在无细胞培养基和细菌细胞提取物中的hGMCSF的浓度。所有样品重复三次，并使用标准曲线计算hGMCSF的分泌水平。使用重组hGMCSF生产标准曲线。野生型Nissle作为阴性对照包含在ELISA中，未观察到信号。表25总结了在各上清液中测量的hGMCSF的水平。数据显示hGMCSF从不同细菌菌株以不同水平分泌。
表25.分泌的GMCSF的浓度
Figure BDA0002364453000005191
实施例20.细胞因子分泌(TNFα)
为了确定工程化细菌表达的hTNFα是否被分泌，测量来自包含hTNFα分泌构建体的工程化菌株/菌株的细菌上清液的hTNFα浓度。菌株包含Lpp(lpp::Cm)、nlpI(nlpI::Cm)、tolA(tolA::Cm)或PAL(PAL::Cm)中的缺失。所有菌株还包含表达具有PhoA分泌标签的hTNFα的质粒。
如先前IL-15的实施例所述使大肠杆菌Nissle菌株生长、诱导、处理。
根据制造商的说明书，通过hTNFαELISA(RnD Systems,Minneapolis,MN)测量在无细胞培养基和细菌细胞提取物中的hTNFα的浓度。所有样品重复三次，并使用标准曲线计算hTNFα的分泌水平。使用重组hTNFα生产标准曲线。野生型Nissle作为阴性对照包含在ELISA中，未观察到信号。表26总结了在各上清液中测量的hTNFα的水平。数据显示hTNFα从不同细菌菌株以不同水平分泌。
表26.分泌的TNFa的浓度
Figure BDA0002364453000005201
实施例21.分泌的TNF-α的功能测定
接下来，进行研究以证实从基因工程化细菌分泌的TNF-α是功能性的。基于TNF-α介导的NF-κB激活，采用基于细胞的测定。TNF-α与其受体结合导致IKK对IkBα的磷酸化和降解。TNF-α的生物活性可以通过流式细胞术定量IkB降解来确定。
简单地说，用来自SYN2304(包含PAL::Cm p15A TetR Ptet-phoA TNFα)的TNFα分泌上清液处理HeLa细胞10分钟。然后将细胞固定在基于多聚甲醛的缓冲液中，然后在Triton X-100中通透。通过流式细胞术确定IkBa降解的调节，结果显示在图37中。
如图37所示，SYN2304表现出接近rhTNFa的生物活性，并且SYN1557处理不产生可测量信号，表明没有来自细菌上清液的脱靶组分(即LPS)的混淆。
实施例22.细胞因子分泌(hIFNg)
为了确定由工程化细菌表达的hIFNg是否被分泌，测量来自包含hIFNg分泌构建体的工程化菌株/菌株的细菌上清液的hIFNg的浓度。菌株包含Lpp(lpp::Cm)、nlpI(nlpI::Cm)、tolA(tolA::Cm)或PAL(PAL::Cm)中的缺失。所有菌株还包含表达具有PhoA分泌标签的hIFNg的质粒。
如先前IL-15的实施例所述使大肠杆菌Nissle菌株生长、诱导、处理。
根据制造商的说明书，通过hIFNg ELISA(RnD Systems,Minneapolis,MN)测量在无细胞培养基和细菌细胞提取物中的hIFNg的浓度。所有样品重复三次，并使用标准曲线计算hIFNg的分泌水平。使用重组hIFNg生产标准曲线。野生型Nissle作为阴性对照包含在ELISA中，未观察到信号。表27总结了在各上清液中测量的hIFNg的水平。数据显示hIFNg从不同细菌菌株以不同水平分泌。
表27.分泌的IFNg的浓度
Figure BDA0002364453000005211
Figure BDA0002364453000005221
表28提供了对各细胞因子获得的分泌水平的总结，并列出可以解释观察到的分泌水平的一些差异的细胞因子的一些结构特征。
表28.分泌结果的总结
Figure BDA0002364453000005222
实施例23.在大肠杆菌中的抗CD47 scFv表达
为了确定功能性抗CD47-scFv是否可以在大肠杆菌中表达，基于与人CD47反应的B6H12和5F9单克隆抗体产生抗CD47-scFv片段。
从公开的专利(US20130142786A1)获得单克隆抗体B6H12和5F9(抗人CD47)序列。接下来，设计了靶向人CD47的单链可变片段(scFv)。通过IDTDNA合成含有tet启动子、核糖体结合位点、设计的抗hCD47-scFv、C末端V5标签和C末端六组氨酸标签的片段(SEQ ID NO:1252)。将构建体克隆到
Figure BDA0002364453000005232
载体(Invitrogen)中，并如本文所述转化到大肠杆菌DH5α中以产生质粒pUC-ptet-B6H12antihCD47scFv-V5-HIS(SEQ ID NO:993)和pUC-ptet-5F9antihCD47scFv-V5-HIS(SEQ ID NO:994)。
将包含pUC-ptet-B6H12antihCD47scFv-V5-HIS或pUC-ptet-5F9antihCD47scFv-V5-HIS的大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养过夜。将培养物在LB中以1:100稀释并以0.8的光密度振荡(200rpm)生长，此时将培养物冷却至室温，并将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度添加至培养物中以诱导ptet-scFv的表达18小时，然后将细菌沉淀，在PBS中洗涤、收获、重悬于2mLPBS缓冲液中并在冰上超声裂解。将不溶性碎片在4℃下以12,000rpm旋下两次，每次15分钟。
为了确定在大肠杆菌DH5α中表达的抗CD47单链抗体是否功能性结合靶蛋白，进行ELISA测定。将平板在4℃下用每孔100μl 2μg/ml靶蛋白(人CD47、小鼠CD47、IgG和PBS，来自Rndsystems)吸收过夜。在室温下用2％BSA的PBS/0.1％Tween-20封闭孔2小时。洗涤三次后，将孔与细菌提取物在室温下孵育1小时。将孔用PBST(PBS/0.1％Tween-20)洗涤4次，并与HRP缀合的抗V5抗体(Biolegend)在封闭溶液中孵育40分钟。孵育后，用PBST洗涤孔4次，然后用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)染色。使用ELISA读数器在450nm下测量信号强度。结果显示于表29，表明由基因工程化细菌表达的抗CD47-scFv可以与人CD47特异性结合。
表29.ELISA结合测定
Figure BDA0002364453000005231
Figure BDA0002364453000005241
实施例24.犬尿氨酸消耗菌株在CT26鼠肿瘤模型中降低肿瘤犬尿氨酸水平
在肿瘤环境中体内评估包含来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的基因工程化细菌消耗犬尿氨酸的能力。使用包含Trp:E缺失和在组成型启动子控制下表达来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的中等拷贝质粒的大肠杆菌Nissle菌株SYN1704(Nissle delta TrpE::CmR+Pconstitutive-Pseudomonas KYNU KanR)。
在两项研究中，根据提供的指南培养从ATCC获得的CT26细胞。将PBS中约1e6个细胞/小鼠皮下植入每只动物的右侧腹侧(BalbC/J(雌性，8周))，并监测肿瘤生长约10天。当肿瘤达到约100-150mm3时，将动物随机分组以进行给药。
对于肿瘤内注射，细菌在LB培养基中生长直至在600nm(A600nm)处达到0.4的吸光度(对应于2×108菌落形成单位(CFU)/mL)并在PBS中洗涤两次。将悬浮液在PBS或盐水中稀释，使得100μL可以以适当的剂量经肿瘤内注射到具有肿瘤的小鼠中。
CT26植入后大约10天，将细菌悬浮在0.1ml PBS中，对小鼠肿瘤内注射(1E7细胞/小鼠)100μl，如下所示：组1-盐水对照(n＝7)、组2-SYN1704(n＝7)。动物每周两次(BIW)根据它们的分组用盐水或菌株肿瘤内(IT)给药。称重动物并每周测量肿瘤体积两次。当肿瘤达到～2000mm3时对动物实施安乐死。收获血浆和肿瘤组织，并如本文所述通过LC/MS测量犬尿氨酸和色氨酸浓度。结果显示于图42A和42B。对于犬尿氨酸消耗菌株SYN1704，观察到犬尿氨酸的肿瘤内(P<0.001)和血浆(P<0.005)浓度的显著降低。色氨酸水平保持恒定(数据未示出)。
实施例25.在CT26肿瘤模型中对SYN94和SYN1704的动力学研究
评估在CT26肿瘤中KYN消耗菌株的单次施用对肿瘤KYN水平和肿瘤重量的影响。允许来自CRL的8周龄的雌性Balb/C小鼠(18-25g)适应设施至少3天。动物被放置在普通食物和水上。
在第8天，将CT26细胞(在PBS中～1e6个细胞/小鼠)SC植入到每只动物的右侧腹侧。监测肿瘤生长一周直至肿瘤达到～100-150mm3。然后根据表30(第1天)将动物称重、测量并随机分成处理组。通过肿瘤内给药以适当的浓度给动物施用SYN94或SYN1704。对于肿瘤内注射，将SYN94细胞从3.0×10e11 CFU/mL原液稀释至1×10e8CFU/mL的浓度，并将SYN1704细胞从原液稀释至1×10e8 CFU/mL的浓度。
表30.研究设计
Figure BDA0002364453000005251
Figure BDA0002364453000005261
在给药后每天观察动物与肿瘤生长有关的异常或过度疼痛的迹象。在第1天(T＝0组；组1)、第2天(T＝24h；组2和5)、第4天(T＝72h；组3和6)和第8天(T＝168h；组4和7)处死动物。
通过在适当的端点心脏流血收集各组的全血。将最大可获得的血液收集到LiHep管(BD)中。将样品保持在冰上直至它们在离心机中旋转(2000g，在4℃下10分钟)。然后将血浆转移到1.5mL Eppendorf管中并在-80℃下储存直至后来分析。将肿瘤样品分成两部分，并在重新称重的bead buster管中在适当的端点收集第一部分。将组织在管中称重，然后储存在-80℃下用于进一步分析。将肿瘤的另一部分固定在10％福尔马林中用于切片和分析。通过LCMS分析来自血液收集的血浆样品，并使用基于细胞的测定进行细胞因子分析。通过LCMS分析肿瘤样品的犬尿氨酸水平。结果如图54A-54C所示。
实施例26.小鼠CD40L的分泌
为了产生能够分泌CD40L的基因工程化细菌，根据本文所述的方法生产如表89所示的mCD40L1(47-260)和mCD40L2(122-260)构建体。mCD40L1(47-260)和mCD40L2(122-260)分别对应于全长mCD40L的细胞外部分和mCD4L的可溶形式。
表31.用于分泌鼠CD40L的菌株
Figure BDA0002364453000005262
Figure BDA0002364453000005271
包含含有ptet-PhoA-CD40L1(47-260)(SYN3366)和tet-PhoA-CD40L2(112-260)(SYN3367)的基于质粒的tet诱导型构建体的大肠杆菌Nissle和母体对照菌株SYN1557分别在LB培养基中生长过夜。将培养物在LB中以1:100稀释并振荡(200rpm)至光密度为0.8，此时将培养物冷却至室温，并将无水四环素(ATC)以100ng/ml的浓度添加至培养物中以诱导mCD40L1和mCD40L2表达。
诱导18小时后，将细胞旋下，并收集上清液。为了产生无细胞培养基，将澄清的上清液进一步通过0.22微米过滤器过滤以除去任何残留的细菌并置于冰上。
然后通过蛋白质印迹分析上清液。将来自25μl上清液的蛋白质转移到PVDF膜上，并用HRP缀合的抗V5抗体(Biolegend)检测mCD40-L1和mCD40L-2。结果显示在图55中。对于mCD40L1和mCD40L2，分别检测到在约32kDa和24kDa处的单一条带。
为了确定在澄清的上清液中由捕获的由基因工程化大肠杆菌Nissle分泌的mCD40L是否可以与mCD40功能性结合和/或通过抗mCD40L抗体检测到，通过用mCD40或抗mCD40L抗体包被的板进行ELISA测定。结果显示在表32中，表明由基因工程化细菌分泌的mCD40L1(47-260)和mCD40L2(112-260)可以与mCD40结合。
表32.CD40 ELISA结合测定
Figure BDA0002364453000005272
实施例27.SIRPα和变体和抗CD47 scFv的分泌
为了产生能够分泌抗SIRPα的基因工程化细菌，根据本文所述的方法生产在表33中显示的构建体。显示的序列包括SEQ ID NO:1094-1104和SEQ ID NO:1105-1121。
表33.用于分泌SIRPα、SIRPα变体和mCD47 scFv配体的菌株
Figure BDA0002364453000005281
将大肠杆菌Nissle菌株SYN1557、SYN2996、SYN3159、SYN3160、SYN3021、SYN3020和SYN3161在LB培养基中培养过夜。将培养物在LB中1:100稀释并振荡(200rpm)至光密度为0.8，此时将培养物冷却至室温，并将浓度为100ng/mL的无水四环素(ATC)加入培养物中以诱导SIRPα或SIRPα变体或CD47scFv表达。
诱导18小时后，将细胞旋下，并收集上清液。为了产生无细胞培养基，将澄清的上清液进一步通过0.22微米过滤器过滤以除去任何残留的细菌并置于冰上。
然后通过蛋白质印迹分析上清液。将来自25μl上清液的蛋白质转移到PVDF膜上，并用抗V5-HRP抗体(Biolegend)检测SIRPα和SIRPα变体和抗CD47 scFv。结果显示在图67中。对于WT mSIRPα、CV1SIRPα、FD6x2SIRPα、FD6SIRPα-IgG4、CV1SIRPα-IgG4和抗CD47 scFv分别检测到在约46kDa、20kDa、33kDa、42kDa、42kDa和30kDa处的单一条带。
为了确定由基因工程化大肠杆菌Nissle分泌的野生型SIRPα、SIRPα变体和抗CD47-scFv是否可以功能性结合CD47和/或通过抗SIRPα抗体检测到，通过用相应的抗体或配体包被平板进行ELISA测定。结果显示在表34中，表明基因工程化细菌分泌的mSIRPα和抗mCD47scFv两者均可与mCD47结合。
表34.SIRPα/CD47 ELISA结合测定
Figure BDA0002364453000005291
Figure BDA0002364453000005292
为了确定大肠杆菌Nissle分泌的SIRPα、SIRPα变体和抗CD47 scFv是否与小鼠细胞上的CD47结合，使用CT26细胞进行流式细胞术分析。CT26是在其细胞表面上表达CD47的小鼠结肠癌细胞系。
CT26细胞在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的Dulbecco's Modified Eagle'sMedium(DMEM)中生长。将细胞旋下，吸出上清液，将沉淀重悬于1ml D-PBS中，转移至冷冻测定管(1×106个细胞)中，并在D-PBS中洗涤3次。将细胞重悬于含有0.5％BSA的D-PBS中，向其中加入10μl上清液(10倍浓缩)并在4℃孵育1小时。使用来自SYN1557的上清液用作基线阴性对照。然后将细胞重悬于0.5ml PBS中，稀释至适当浓度并在流式细胞仪上分析。结果显示在(图68和图69)中。对含有分泌的SIRPα、SIRPα变体和抗CD47 scFv的样品，观察到相对于基线的群移位，对表达CV1SIRPα-IgG4的SYN3021观察到最大移位。
接下来，进行竞争测定以确定基因工程化细菌分泌的鼠SIRP是否可以和重组mSIRPα或抗CD47抗体与CT26细胞上的鼠CD47竞争结合。使CT26细胞生长并基本上如前文所述进行流式细胞术方案，不同之处在于在分泌的FD6x2sirpα或FD6sirpαhIgG4的孵育期间加入重组SIRPα(Rndsystems)或抗CD47抗体(Biolegend)。图70和图71分别显示与重组SIRPα和抗CD47抗体竞争的结果。重组SIRPα和抗CD47抗体两者均能够与分泌的SIRPα竞争结合CT26细胞上的CD47。
实施例28.透明质酸酶的分泌
为了产生能够分泌透明质酸酶的基因工程化细菌，根据本文所述的方法生产构建体(SYN2998：NissleΔPAL::CmR；p15A-ptet-RBS-PhoA--FLAG-human hyaluronidase-V5-His tags；SYN2997：NissleΔPAL::CmR；p15A-ptet-RBS-PhoA-FLAG-humanhyaluronidase-V5-His；SYN3369:NissleΔPAL::CmR；p15A-ptet-RBS-PhoA-FLAG-leechhyaluronidase-V5-His)。
将大肠杆菌Nissle菌株SYN1557、SYN2997(分泌小鼠透明质酸酶)、SYN2998(分泌人透明质酸酶)和SYN3369(分泌水蛭透明质酸酶)在LB培养基中培养过夜。将培养物在LB中1:100稀释并振荡(200rpm)至光密度为0.8，此时将培养物冷却至室温，并将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度添加至培养物中以诱导表达透明质酸酶。
诱导18小时后，将细胞旋下，并收集上清液。为了产生无细胞培养基，将澄清的上清液进一步通过0.22微米过滤器过滤以除去任何残留的细菌并置于冰上。
然后通过蛋白质印迹分析上清液。将来自25μl上清液的蛋白质转移到PVDF膜上，并用抗V5-HRP抗体(Biolegend)检测透明质酸酶。结果显示在图72中。对于分泌的小鼠和人透明质酸酶两者，检测到在约50kDa处的单一条带，对于水蛭透明质酸酶，检测到在约57kDa处的单一条带。
为了确定由基因工程化大肠杆菌Nissle分泌的透明质酸酶是否是有活性的，根据制造商的说明书使用生物素化的透明质酸包被的平板进行关于裂解透明质酸能力的透明质酸酶活性测定。简而言之，透明质酸酶将切割聚合物并导致平板上生物素的损失，然后可以通过链霉亲和素-HPR和底物检测。结果显示在图74A-74B中，表明由基因工程化细菌分泌的透明质酸酶能够降解透明质酸。母体菌株SYN1557用作阴性对照。对分泌的水蛭透明质酸酶获得的结果显示在图74A-74B中。
实施例29.生产IL-15的工程化大肠杆菌Nissle菌株
菌株构建和生化分析：
为了产生能够分泌具有生物活性的白细胞介素15(IL-15)的工程化大肠杆菌Nissle菌株，构建了融合蛋白，其中IL-15融合至形成功能性受体所需的IL-15Rα的最小区域(称为Sushi结构域)。IL-15和IL-15Rα形成功能性复合物，其刺激细胞信号传导，以及在称为反式呈递的过程中刺激表达IL-2Rβ和γc的相邻淋巴细胞的激活和增殖(参见，例如Ochoa等,High-density lipoproteins delivering interleukin-15；Oncoimmunology.2013Apr 1；2(4):e23410)。IL-15的生物活性通过两个不同的修饰而大大提高：在IL-15的氨基酸72处的天冬酰胺至天冬氨酸的置换(Zhu X,Marcus WD,Xu W,LeeHI,Han K,Egan JO,Yovandich JL,Rhode PR,Wong HC.Novel human interleukin-15agonists.J Immunol.2009；183:3598–3607)，和/或通过细胞相关的IL-15Rα通过模拟IL-15的反式呈递与IL-15Rα的sushi结构域直接融合(Mortier等,Soluble interleukin-15receptor alpha(IL-15R alpha)-sushi as a selective and potent agonist of IL-15action through IL-15R betagamma.Hyperagonist IL-15x IL-15R alpha fusionproteins.J Biol Chem 2006；281:1612-9)。
为了生产经修饰的重组IL-15-Sushi融合蛋白，将具有N72D突变的IL-15单体融合到由20个氨基酸接头连接的sushi结构域的C末端(78个氨基酸)。向IL-15R sushi结构域的N末端包含FLAG标签和因子Xa切割位点以促进标签的检测、纯化和去除。为了促进向外周胞质的易位，将IL15融合蛋白克隆到10个成员的质粒文库中。分泌的融合蛋白的编码序列经密码子优化以在大肠杆菌中表达，并从IDT Technologies订购为双链DNA片段。一旦接收到DNA，就使用标准克隆方法将其消化并连接到10个成员的质粒文库中。质粒文库的各成员含有低拷贝质粒骨架和驱动可变优化核糖体结合位点和分泌标签的表达的Ptet启动子。一旦将IL-15融合物C末端克隆分泌标签，将质粒转化到SYN1557(ΔPAL，可扩散外膜(DOM)表型)中以产生IL-15-Sushi分泌菌株SYN3516-SYN3525。构建体序列的非限制性实例包括SEQ IDNO:1132-1137和SEQ ID NO:1138-1144。表35提供了IL-15-Sushi菌株的描述。表36提供了使用WT IL-15产生的菌株的列表。
表35.菌株描述
Figure BDA0002364453000005321
Figure BDA0002364453000005331
表36.菌株描述
Figure BDA0002364453000005332
通过SYN3525生产IL-15和体外定量
为了测定IL-15的生产和/或定量生物活性，生长培养物并诱导，然后收集上清液并通过ELISA定量。在测定日期前，阴性对照菌株(SYN1557)和IL-15-sushi结构域生产菌株(SYN3516-SYN3525)两者被划线到LB琼脂平板上并在适宜的抗生素下在37℃下生长。对于每50ml待生长的诱导培养物，用单一菌落接种2YT培养液的2ml起始培养物，允许在37℃下生长2小时，在8000×g下旋下10分钟，并且将细胞再悬浮于具有无水四环素(aTc)诱导剂(100ng/mL)的原始体积的2YT培养基。这些培养物放置在30℃振荡4小时以诱导IL-15-sushi融合蛋白的生产。接下来，从培养箱中取出培养物并以20,000×g离心10分钟以沉淀所有细胞，并使上清液通过0.22μm过滤器以生产无菌的上清液。这些上清液用于基于细胞的测定。
为了通过质粒文库评估IL-15融合物的生产，SYN1557和生产IL-15的文库的培养物被诱导并收获重复两份。将这些上清液连续稀释并使用IL-15ELISA试剂盒(Human IL-15Quantikine ELISA Kit–D1500,R&D Systems,Minneapolis,MN)定量。显示在表37中的筛选分泌文库的数据显示来自包含来自大肠杆菌的PpiA分泌信号作为前导肽的SYN3525的最大生产。SYN1557上清液在ELISA中未显示交叉反应性(数据未显示)。
表37
Figure BDA0002364453000005341
为了进一步评估来自SYN3525的IL-15生产，在挡板烧瓶中使菌株生长并诱导以产生最大收率。从SYN3525的过滤上清液中，将SYN1557和SYN3525的样品稀释重复三份，并在ELISA试剂盒(Human IL-15Quantikine ELISA Kit-D1500,R&D Systems,Minneapolis,MN)上运行。这些分析的结果如表38所示。结果显示，在最大诱导条件下，SYN3525上清液含有733-795ng/mL的在IL-15ELISA测定中反应呈阳性的物质。相比之下，SYN1557上清液具有不可检测的水平(未显示)。
表38.来自三次不同ELISA运行的SYN3525上清结果
SYN3525 IL-15(ng/ml)
运行1 795.23
运行2 733.75
运行3 792.80
平均 773.93
SEM(n＝3) 20.10
为了比较，来自表达WT IL-15的构建体的分泌显示于表39中。
表39.
Figure BDA0002364453000005351
实施例30.细菌地分泌的IL-15的功能测定
接下来，进行功能测定以证实从SYN3525分泌的IL-15是功能性的。已显示STAT3和STAT5在配体结合后被IL-15Rα磷酸化。
通过Miltenyi untouched pan-T-cell试剂盒从人白细胞纯化T细胞(收率＝～5e7个细胞/制备物)。通过用Phytohaemagglutinin P(PHA)进行48小时的温和刺激来诱导IL15Rα表达。用来自表达IL15的细菌SYN 3525的上清液处理激活的T细胞15分钟。将经处理的细胞在基于多聚甲醛的溶液中固定，然后在90％甲醇中进行苛刻的通透化。在IL15R+CD3+细胞中通过多色流式细胞术定量磷酸-STAT5的调节。结果显示在图46中，显示SYN3525来源的IL15表现出与rhIL15类似的生物活性。在来自两种单独的细菌制备物的上清液之间观察到一致的结果。
实施例31.用于分泌的二聚化IL-12的构建
菌株工程化：
为了产生能够分泌具有生物活性的白细胞介素12(IL-12)异二聚体的工程化大肠杆菌Nissle菌株，产生了构建体，其中两个白细胞介素-12单体亚基(IL-12A(p35)和IL-12B(p40))通过接头共价连接。
为了便于从大肠杆菌Nissle生产重组人IL-12蛋白的二聚化，'GGGGSGGGGSGGGGS'的15个氨基酸的接头(SEQ ID NO:1247)被插入在两个单体亚基(IL-12A(P35)和IL-12B(p40))之间以产生强制二聚体人IL-12(diIL-12)融合蛋白，并对该序列进行密码子优化。
为了促进易位到外周胞质，将分泌标签添加到diIL-12融合蛋白的N末端。含有诱导型Ptet启动子、核糖体结合位点、diIL-12编码序列和其它必需接头的元件的DNA序列由IDT Technologies合成，随后克隆到高拷贝数质粒载体中。将质粒转化到SYN1555、SYN1556、SYN1557或SYN1625(分别包含nlp1、tolA、PAL或lpp缺失以产生可扩散膜表型)以产生二聚化人IL-12(diIL-12)分泌菌株。
表40.非限制性IL-12构建体序列
Figure BDA0002364453000005371
表41.非限制性IL-12构建体多肽序列
Figure BDA0002364453000005372
Figure BDA0002364453000005381
通过SYN3466至SYN3505生产diIL-12用于体外测定：
为了测定IL-12生产和/或定量生物活性，生长培养物并诱导，然后收集上清液并通过ELISA定量，使用振荡平板如下。阴性对照菌株(SYN1555、SYN1556、SYN1557或SYN1625)和diIL-12生产菌株(SYN3466至SYN3505)两者被划线到LB琼脂平板上并分别在氯霉素，或者氯霉素和羧苄青霉素下在37℃生长。在过夜生长后，挑取个体菌落并用于接种4mL 2YT培养基的起始培养物，用于将来振荡平板生长。用琼脂平板中使用的相同抗生素接种起始培养物。当起始培养物达到饱和时，将培养物以1:25反向稀释到具有适当抗生素的新的2YT振荡平板中。此起始培养物在37℃生长2小时至OD600＝～0.8-1。然后通过添加Tc诱导物(100μg/mL)诱导培养物。这些诱导的培养物在30℃下振荡孵育4小时以促进IL-12的生产。
当生产阶段完成后，从培养箱中取出培养物的振荡平板，并在20000×g离心10分钟以沉淀全部细胞。保留上清液用于ELISA分析。
通过ELISA定量上清液中的diIL-12：
为了评估上清液中diIL-12的量，使用来自R&D systems的人IL-12p70Quantikine ELISA试剂盒测定样品。这些分析的结果如表42所示。结果显示，上清液含有17至309pg/mL的在IL-12ELISA测定中反应呈阳性的物质。相比之下，SYN1557上清液具有不可检测的水平。
表42.来自ELISA分析的上清液结果(pg/mL)
Figure BDA0002364453000005391
Figure BDA0002364453000005401
实施例32.生产IL-15的工程化大肠杆菌Nissle菌株
菌株工程化
为了生产能够分泌具有生物活性的白细胞介素15(IL-15)的工程化大肠杆菌Nissle菌株，构建了融合蛋白，其中IL-15融合至形成功能性受体所需的IL-15Rα的最小区域(称为Sushi结构域)。IL-15和IL-15Rα形成功能性复合物，其刺激细胞信号传导，以及在称为反式呈递的过程中刺激表达IL-2Rβ和γc的相邻淋巴细胞的激活和增殖(参见，例如Ochoa等,High-density lipoproteins delivering interleukin-15；Oncoimmunology.2013Apr 1；2(4):e23410)。IL-15的生物活性是通过经由细胞相关的IL-15Rα通过模拟IL-15的反式呈递与IL-15Rα的sushi结构域直接融合而极大改善(Mortier等,Soluble interleukin-15 receptor alpha(IL-15R alpha)-sushi as a selectiveand potent agonist of IL-15action through IL-15R betagamma.Hyperagonist IL-15x IL-15R alpha fusion proteins.J Biol Chem 2006；281:1612-9)。
为了生产重组IL-15-Sushi融合蛋白，IL-15单体融合到由20个氨基酸的接头连接的sushi结构域的C末端。为了促进向外周胞质的易位，将19410、tort或pelB分泌标签添加到IL-15-Sushi融合蛋白的N末端。含有Ptet启动子、RBS、IL-15-Sushi编码序列和其它必需接头的DNA序列由IDT Technologies合成，随后克隆到由IDT Technologies提供的在tet诱导型启动子控制下的高拷贝数质粒载体中。将质粒转化到SYN1557(ΔPAL，可扩散外膜(DOM)表型)或SYN94(无PAL缺失大肠杆菌Nissle菌株)中以生产IL-15-Sushi分泌菌株SYN3458至SYN3463。表43和表44列出了构建体序列的许多非限制性实例。
表43.非限制性IL-15构建体多肽序列
Figure BDA0002364453000005411
表44.非限制性IL-15构建体多肽序列
Figure BDA0002364453000005412
通过SYN3458至SYN3463生产IL-15用于体外测定：
为了测定IL-15生产和/或定量生物活性，生长培养物并诱导，然后收集上清液并通过ELISA定量。在测定日期前，阴性对照菌株(SYN1557)和IL-15-sushi结构域生产菌株(SYN3458至SYN3463)两者被划线到LB琼脂平板上并在适宜的抗生素下在37℃生长。对于每50ml待生长的诱导培养物，用单一菌落接种2YT培养液的2ml起始培养物，允许在37℃下生长2小时，在8000×g下旋下10分钟，并且将细胞再悬浮于具有无水四环素(aTc)诱导剂(100ng/mL)的原始体积的2YT培养基。这些培养物放置在30℃振荡4小时以诱导IL-15-sushi融合蛋白的生产。接下来，从培养箱中取出培养物并以20,000×g离心10分钟以沉淀所有细胞，并使上清液通过0.22μm过滤器以生产无菌的上清液。这些上清液用于基于细胞的测定。
通过ELISA定量SYN3458至SYN3463上清液中的IL-15：
为了评估在过滤上清液中的IL-15的生产，将SYN1557和SYN3458至SYN3463的样品稀释重复三份，并在人IL-15Quantikine ELISA试剂盒(Ra&D Systems)上运行。这些分析的结果如表45所示。结果显示，SYN3458至SYN3463上清液含有4至275ng/mL在IL-15ELISA测定中反应呈阳性的物质。相比之下，SYN94和SYN1557上清液具有不可检测的水平(未显示)。
表45.来自三次不同ELISA运行的上清液结果
最终菌株 宿主菌株 质粒 ng/mL
SYN3460 SYN1557 ptet-pelBss-hIL15-SUSHI-融合体 275
SYN3461 SYN1557 ptet-19410ss-hIL15-SUSHI-融合体 166
SYN3458 SYN1557 ptet-tortss-hIL15-SUSHI-融合体 59
SYN3459 SYN94 ptet-tortss-hIL15-SUSHI-融合体 78
SYN3462 SYN94 ptet-pelBss-hIL15-SUSHI-融合体 4
SYN3463 SYN94 ptet-19410ss-hIL15-SUSHI-融合体 72
实施例33.CXCL10的分泌
为了生产重组CXCL10趋化因子，设计了合成构建体(未提供数据)。CXCL10蛋白的分泌/可溶形式经密码子优化以在大肠杆菌中表达，并从IDT Technologies订购为双链DNA片段。为了促进向外周胞质的易位，将CXCL10可溶性蛋白克隆到10个成员的质粒文库中。一旦接收到DNA，就使用标准克隆方法将其消化并连接到10个成员的质粒文库中。质粒文库的各成员含有低拷贝质粒骨架和驱动可变优化核糖体结合位点和分泌标签表达的Ptet启动子。一旦将CXCL10 C末端克隆分泌标签，将质粒转化到SYN1557(deltaPAL，可扩散外膜(DOM)表型)中以产生CXCL10分泌菌株SYN3404和SYN3406-SYN3414。构建体序列包括SEQ IDNO:1205、SEQ ID NO:1206、SEQ ID NO:1208和SEQ ID NO:1209。
表46.菌株描述
ID 基因型 构建体
SYN3414 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.PpiA-CXCL10
SYN3413 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.phoA-CXCL10
SYN3412 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.PelB-CXCL10
SYN3411 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.OppA-CXCL10
SYN3410 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.MalE-CXCL10
SYN3409 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.HdeB-CXCL10
SYN3408 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.GspD-CXCL10
SYN3407 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.Gltl-CXCL10
SYN3406 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.DsbA-CXCL10
SYN3404 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.Adhesin-CXCL10
为了测定CXCL10生产和/或定量生物活性，生长培养物并诱导，然后收集上清液并通过ELISA定量。在测定前日期，阴性对照菌株(SYN1557)和CXCL10生产菌株(SYN3404-SYN3414)两者被划线到LB琼脂平板上并在适宜的抗生素下在37℃生长。对于每50ml待生长的诱导培养物，用单一菌落接种2YT培养液的2ml起始培养物，允许在37℃下生长2小时，在8000×g下旋下10分钟，并且将细胞再悬浮于具有无水四环素(aTc)诱导剂(100ng/mL)的原始体积的2YT培养基。这些培养物放置在30℃振荡4小时以诱导CXCL10蛋白的生产。接下来，从培养箱中取出培养物并以20,000×g离心10分钟以沉淀所有细胞，并使上清液通过0.22μm过滤器以生产无菌的上清液。这些上清液用于基于细胞的测定。
为了通过质粒文库评估CXCL10生产，SYN1557和生产CXCL10的文库的培养物被诱导并收获重复两份。将这些上清液连续稀释并使用CXCL10 ELISA试剂盒(Human CXCL10/IP-10Quantikine ELISA Kit–DIP100,R&D Systems,Minneapolis,MN)定量。显示在表47中的筛选我们的分泌文库的数据显示来自SYN3413的最大生产，其包含来自大肠杆菌的PhoA分泌信号作为前导肽。SYN1557上清液在ELISA中未显示交叉反应性(数据未显示)。
表47.CXCL10分泌
Figure BDA0002364453000005441
为了进一步评估从SYN3413生产CXCL10，在挡板烧瓶中使菌株生长并诱导产生最大收率。从SYN3413的过滤上清液中，将SYN1557和SYN3413的样品稀释重复三份，并在ELISA试剂盒(Human CXCL10/IP-10 Quantikine ELISA Kit-DIP100，R&D Systems，Minneapolis，MN)上运行。这些分析的结果如表112所示。结果显示，在最大诱导条件下，SYN3413上清液含有199-232ng/mL在CXCL10 ELISA测定中反应呈阳性的物质。相比之下，SYN1557上清液具有不可检测的水平(未显示)。
表48.来自SYN3414的三个重复的分泌的hCXCL10的浓度
SYN3414 CXCL10(ng/ml)
运行1 199.71
运行2 231.96
运行3 232.16
平均 221.28
SEM(n＝3) 10.78
CXCL10的功能测定
为了确定从如上所述的任何菌株分泌的CXCL10是否是功能性的，进行Chemotaxis测定，基本上如Mikucki等所述(Mikucki等，Non-redundant Requirement for CXCR3Signaling during Tumoricidal T Cell Trafficking across Tumor VascularCheckpoints；Nat Commun.2015；6:7458,其全部内容通过引用并入本文)。
简言之，将细胞痕迹标记的幼稚(或扩增)人CD8+T细胞转移到顶部有T细胞(5×105细胞)、底部有rCXCL10/上清液、存在或不存在PTX或抗CXCL10的24孔transwell平板(5uM孔)中。细胞孵育3小时，并通过流式细胞术计数迁移的细胞。或者，通过流动、western或ELISA测量phosphoAKT。
实施例34.生产STING激动剂的菌株的产生
为了产生STING激动剂菌株，DacA(单核细胞增多性李斯特氏菌环二AMP合酶)克隆到Ptet启动子控制下的p15中，以产生如表50所述的菌株。总结构建体序列。
表49.c-di-AM生产菌株
Figure BDA0002364453000005451
Figure BDA0002364453000005461
实施例35.体外STING激动剂生产
首先体外评估新产生的菌株生产c-di-AMP的能力。
将大肠杆菌Nissle菌株SYN3527(包含DacA构建体)和对照菌株在LB培养基中培养过夜。将培养物在补充了0.5％(w/v)葡萄糖的M9基本培养基中稀释1:25，并在37℃下振荡(350rpm)生长2小时。将培养物稀释至光密度为0.5，此时将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度添加至培养物中以诱导DacA的表达。诱导4小时后，取出样品用于环二核苷酸生产的LC/MS分析。将样品以5000RPM离心20分钟以分离细胞和细胞外部分。然后使用细胞沉淀物确定细胞内环二-AMP，并使用培养基上清液确定环二AMP的细胞外积累。通过LC/MS确定浓度。
结果示于图2。表明工程化菌株能够在细胞内生产c-di-AMP，并且在较低程度上细胞外生产c-di-AMP。对于野生型对照，在细胞内或细胞外部分中未发现环二AMP(数据未显示)。
图3描绘了基本上如上所述进行的研究的后续。
实施例36.细菌地生产的STING激动剂诱导免疫应答
为了确定细菌地生产的STING激动剂或细菌chassi本身是否负责诱导免疫应答，将活的和热杀灭的SYN3527(包含在四环素诱导型启动子的控制下基于DacA的质粒(p15-ptet-DacA))加入到RAW267.4小鼠巨噬细胞系的上清液中，并且测量IFN-β1 mRNA的水平。
如在图4中所看到的，IFNb1 mRNA表达在c-di-AMP分泌菌株下剂量依赖性增加，但当热杀灭时不是。
实施例37.STING激动剂生产菌株的体内活性
为了确定STING激动剂生产菌株SYN3527(包含基于质粒的、来自单核细胞增多性李斯特氏菌的四环素诱导型p15a Ptet-DacA的大肠杆菌Nissle)的耐受性、定植和活性，在B16肿瘤模型中评估肿瘤体积、重量和T细胞应答。
为了生产用于该研究的细胞，将过夜培养物用于接种含有抗生素的500mL LB培养基。将菌株于37℃振荡孵育直到该培养物达到对数期(OD600＝0.8-1.0)结束。为了收获，将细胞以5000rpm旋下20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
根据如下文和图7A所述的时间线，将B16肿瘤植入小鼠，对小鼠瘤内注射STING激动剂生产细菌和对照。处理在不同时间点取得的样品用于CFU计数每克肿瘤、细胞因子分析(IFN-β和T细胞组)和肿瘤引流淋巴结(TDLN)的流式细胞术分析。
简言之，在第9天将B16细胞SC植入(在PBS中2×10e5细胞/小鼠)到每只动物的右侧腹侧。在第3天，监测肿瘤生长；当肿瘤在第1天达到约50-80mm3时，将小鼠随机分组(N＝15/组/5只小鼠/时间点)进行肿瘤内给药，如下：盐水(对照组，组1)、SYN94(链霉素抗性Nissle，组2，1×10e7)和SYN3527(STING激动剂，组3，1×10e7)。基于组将适当的细菌或盐水(用于注射的对照)给药至动物。4小时后，通过腹膜内注射用10μg ATC(无水四环素)处理小鼠。在第2天，在ATC剂量后24小时，将来自各处理组的5只小鼠处死，5只小鼠/组(组1-4)，并处理样品用于分析。在第4天，称重小鼠，测量肿瘤体积，并将适当的处理/组给药至小鼠。4小时后，向小鼠注射10μg ATC。在第5天，在ATC剂量后24小时处死5只小鼠/组。在第8天，称重剩余小鼠的肿瘤，测量并将适当的处理/组给药至小鼠。在第9天，在ATC剂量后24小时将5只小鼠/组处死。
在第1、4和9天的肿瘤体积示于图7B和对于个体小鼠示于图7C，表明在该时间段内SYN3527的施用导致排斥或肿瘤生长的控制(在第9天，对于SYN3527相对于盐水对照，p<0.02)。显示于图7D中的在施用STING激动剂生产细菌后第9天的肿瘤重量显示与盐水对照处理相比显著的肿瘤消退(p<0.02)。通过将细胞置于单细胞悬液中并用以下抗体进行染色来进行来自肿瘤引流淋巴结的淋巴细胞的流式细胞术分析：抗CD4-APC、TCR-β-PECy7、CD8-α-BV785、CD25-BV650和FoxP3-PE(均来自Biolegend)。肿瘤消退与如通过流式细胞术分析测量的肿瘤引流淋巴结(TDLN)中总T细胞数量的增加相关，(对于SYN3527相对于盐水对照，p<0.03)，其可以指示肿瘤特异性T细胞的激活和扩增(图7E)。
为了评估在对B16F10肿瘤进行SYN-STING治疗后的肿瘤定植和细菌生长，基本上如上所述对B16F10肿瘤进行治疗。在开始治疗后第9天，将肿瘤均质化。将匀浆物连续稀释并铺在LB琼脂平板上，以计算肿瘤内每克组织的活细菌(或菌落形成单位)的数量。将SYN-STING样品铺在含有适当抗生素的琼脂平板上，以确保细菌不会丢失STING回路的表达。结果显示在图7H中。
对于细胞因子分析，根据制造商的说明书进行Luminex测定。为了确定细菌地生产的STING激动剂对固有免疫系统的激活，评估了INF-β1、IL-6、IL-1β和MCP-1(Ccl2)的水平，第2天和第9天的结果显示在图8A和图8B中。结果表明，SYN3527生产的STING激动剂能够显著增加肿瘤中第2天的IFN-β生产(相对于对照或SYN94，P<0.008)，以及在第2天但不是第9天诱导相对于单独的盐水和Nissle的一般固有免疫应答，如通过IL-6(相对于对照，p<0.006)、TNF-α(相对于对照，**p<0.002，相对于SYN94，*p<0.01)和MCP-1诱导所示。第2天肿瘤内的固有应答在第9天转换为T细胞相关应答，如T细胞相关细胞因子颗粒酶B(相对于对照，p<0.006；相对于SYN94，<0.03)、IL-2(相对于对照，p<0.03)和IL-15(相对于对照或SYN94，p<0.05)的生产所示(图8B)。图9显示了通过细菌注射(即WT和SYN-STING两者)上调的细胞因子。
实施例38.在MC38肿瘤模型中腺苷消耗菌株与全身性抗PD-1和抗CTLA-4的组合的活性
在C57BL/6-MC38同系肿瘤模型中评估腺苷消耗菌株SYN1656增强组合的抗CTLA4和抗PD-1的抗肿瘤应答的能力。
为了生产在该研究中使用的细胞，将过夜培养物用于接种含有抗生素的500mL LB培养基。将菌株在37℃振荡孵育直至培养物达到对数期结束(OD600＝0.8-1.0)。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
根据表54的研究设计，将MC38肿瘤植入小鼠，并且对小鼠肿瘤内注射腺苷消耗细菌和腹膜内注射抗CTLA-4和抗PD-1抗体。在第9天，将MC38细胞(1×105/小鼠/100μl)SC植入每只动物的右侧腹侧中。监测肿瘤生长；当肿瘤在第1天达到～50-80mm3时，将小鼠随机分入处理组，如表50所示。
在一周内记录肿瘤体积和体重三次，在两次测量之间间隔1-2天。
表50.研究设计
Figure BDA0002364453000005491
Figure BDA0002364453000005501
结果表明，腺苷消耗菌株具有在MC38模型中改善抗CTLA-4/抗PD-1抗体介导的抗肿瘤活性的能力。具体地，在抗PD-1/抗CTLA-4组中，12只小鼠中的5只对处理有应答，包括12只中的1只具有完全应答。在抗PD-1/抗CTLA-4加SYN1656组中，相同数量(12只中的5只)有应答，但5个应答者中的至少4个是完全应答者。
实施例39.用于将5-FC转化为5-FU的菌株的产生
5-FU是受其全身性毒性限制的常见化学治疗剂。但是，5-FC的耐受性要好得多。使用codA(胞嘧啶脱氨酶)或codA(胞嘧啶脱氨酶)与upp(尿嘧啶磷酸核糖基转移酶)的融合物，5-FC可在肿瘤中转化为活性药物形式5F-UMP，从而最小化相关副作用。
为了产生5-FU生产菌株，将codA(胞嘧啶脱氨酶)或codA(胞嘧啶脱氨酶)与upp(尿嘧啶磷酸核糖基转移酶)的融合物克隆到在Ptet启动子控制下的p15载体中以生产如表51所述的菌株。
表51.
菌株: 基因型
SYN3529 Nissle pUC-Kan-tet-CodA(胞嘧啶脱氨酶)
SYN3620 Nissle p15A Ptet-CodA::Upp融合物
实施例40.5-FC至5-FU的体外转化
首先体外评估新产生的菌株将5-FC转化为5-FU的能力。
大肠杆菌Nissle菌株SYN3529、前文所述的SYN3620和SYN94对照(具有链霉素抗性的野生型Nissle)在LB培养基中培养过夜。培养物在补充了0.5％葡萄糖的M9基本培养基(w/v)中稀释1:50，并在37℃下振荡(350rpm)生长2小时，此时将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度加入到培养物中以诱导CodA或CodA-Upp融合体的表达。诱导2小时后，将培养物旋下，吸出培养基并将细胞沉淀重悬浮于M9+0.5％葡萄糖(w/v)+ATC(100ng/mL)+10mM 5-氟胞嘧啶
Figure BDA0002364453000005511
中。然后将这些培养物返回到37℃培养箱，并允许振荡孵育另外2个小时，此时取出样品用于5-FU生产的LC/MS分析。将样品以5000RPM离心20分钟以分离细胞和细胞外部分。然后将细胞沉淀用于测定细胞内5-FC和5-FU，并使用培养基上清液确定5-FU的细胞外积累或5-FC的消耗。
结果示于图34A和图34B，表明工程化菌株能够以高于野生型对照菌株的速率降解5-FC(图34A)并生产5-FU(图34B)。由于对于5-FUMP没有可用标准品，我们无法测量来自SYN3620的5-FUMP的累积。
实施例41.在CT26肿瘤模型中5F-C至5-FU转化者的体内活性
为了确定5-FC至5-FU转化菌株SYN3529(包含pUC-Kan-tet-CodA(胞嘧啶脱氨酶))和SYN3620(包含pUC-Kan-tet-CodA::Upp融合体)的体内活性和功效，在CT26肿瘤模型中评估肿瘤体积并与PBS对照进行比较。
为了制备用于研究的细胞，将过夜培养物用于接种含有抗生素的500mL LB培养基。将菌株在37℃振荡孵育直至培养物达到对数期结束(OD600＝0.8-1.0)。为了收获，将细胞以5000rpm旋下20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
根据如下文和图35A所述的时间线，向小鼠植入CT26肿瘤，瘤内注射生产能够将5-FC转化为5-FU的酶的细菌或载剂对照，并用5-FC给药。在不同时间点测量肿瘤体积，同时在实验结束时对肿瘤进行称重和处理，以评估5-FC的相对消耗作为菌株生物活性的量度。
简言之，在第15天将CT26细胞SC植入(在PBS中1×106个细胞/小鼠)到每只动物的右侧腹侧。监测肿瘤生长直至肿瘤达到～150-450mm3。在第0天，将小鼠随机分组(每组N＝5)用于肿瘤内给药如下：PBS(组1，载剂对照)、SYN3529(组2，1×107CFU)、SYN3620(组3，1×107CFU)。测量肿瘤大小，并在第0天、第2天和第5天用细菌或PBS I.T.注射小鼠，然后在4小时后是ATC(1ug I.P.)。从第3天开始，通过IP注射每天施用5-FC(500mg/kg)。在第6天处死小鼠用于最终分析。
在第0、2和5天的平均肿瘤体积示于图35B和对于个体小鼠示于图35C，表明SYN3529或SYN3560与5-FC一起的施用导致与PBS对照相比在该时间段内肿瘤生长的迟钝。显示于图35D中的在施用细菌后第6天、5-FC给药后第3天的肿瘤重量显示与PBS对照处理相比肿瘤质量的减少。肿瘤匀浆的质谱分析证实与PBS对照相比，细菌地定植的肿瘤的5-FC水平的降低，表明5-FC原位转化为其活性形式5-FU(图35E)。
实施例42.组合的犬尿氨酸消耗者和STING激动剂生产者的产生和菌株活性的体外测量
为了产生消耗犬尿氨酸并生产STING激动剂的菌株，用先前在SYN3527(克隆到在Ptet启动子控制下的p15载体中的DacA)中使用的构建体转化SYN2028(包含Nissle HA3/4::PSynJ23119-pKynase TrpE::CmR)，以产生如表52所述的菌株。
表52.
Figure BDA0002364453000005521
接下来，体外评估新产生的菌株消耗犬尿氨酸并生产STING激动剂的能力。大肠杆菌Nissle菌株SYN094(野生型对照)、SYN2028(KYN)、SYN3527(STING)和SYN3831(KYN+STING)在含有适当抗生素的LB培养基中生长过夜。培养物在补充了0.5％葡萄糖和适当抗生素或LB和抗生素的M9基本培养基中稀释1:25(w/v),并在37℃下生长振荡(350rpm)2小时。
对于环二AMP生产的测量，在M9培养基中的培养物用相同的M9补充培养基稀释至0.5的光密度(600nm)，此时将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度加入到培养物中以诱导DacA的表达。将细胞再诱导4小时以允许环二AMP的积累。
取出样品用于环二核苷酸生产的LC/MS分析。将样品以10000×g离心5分钟以分离细胞和细胞外部分。然后将细胞沉淀用于测定细胞内环二AMP。通过LC/MS确定浓度。
为了量化犬尿氨酸消耗，将LB培养物旋下并重悬于含有100μM L-犬尿氨酸
Figure BDA0002364453000005531
的LB中至光密度(600nm)为1.0。然后将这些培养物置于37℃振荡4小时以允许犬尿氨酸的消耗。对于犬尿氨酸消耗测量，从各培养物中取出样品并以10000×g旋转5分钟以分离细胞和细胞外部分。取出培养基上清液并用于通过LC/MS分析确定犬尿氨酸的消耗。
显示于图17A的结果表明工程化菌株SYN3831能够类似于SYN3527生产环二AMP，其中其犬尿氨酸消耗母体SYN2028不能生产环二AMP。图17B的结果表明，新的组合菌株SYN3831也保留了与其母体SYN2028类似的消耗犬尿氨酸的能力。总的来说，这些结果支持在体外组合菌株SYN3831具有生产STING激动剂环二AMP和消耗AHR激动剂犬尿氨酸的能力两者。
实施例43.对分泌的IFN-γ的功能分析
接下来，进行了研究以证实从基因工程化细菌分泌的IFN-γ是功能性的。基于在IFNγ与其受体结合后STAT1的增加的磷酸化，采用基于细胞的测定。IFN-γ的生物活性可以通过流式细胞术定量STAT1磷酸化来确定。
接下来，进行了研究以证实从基因工程化细菌分泌的IFN-γ是功能性的。基于在IFNγ与其受体结合后STAT1的增加的磷酸化，采用基于细胞的测定。IFN-γ的生物活性可以通过流式细胞术定量STAT1磷酸化来确定。
简而言之，用来自表达鼠IFNg的细菌(包含PAL::Cm P15APtet-87K PhoA-mIFNg的SYN3543)的上清液处理小鼠RAW264.7细胞15分钟。将经处理的细胞在基于多聚甲醛的溶液中固定，然后在90％甲醇中进行苛刻的通透化。通过流式细胞术定量磷酸-STAT1的调节，结果显示在图39A和39B中。
图39A和图39B显示在两个独立的测定中SYN3543的生物活性。
实施例44.CD40L分泌菌株SYN3367在体内的活性
为了确定CD40L分泌菌株SYN3367(包含PAL::Cm pUC-tet-PhoA-mCD40L 112-260；在本实施例中和图36中称为SYN-CD40L)的体内活性，在CT26肿瘤模型中通过流式细胞术评估肿瘤内抗原呈递细胞(APC)的激活，并与SYN1557(DOM突变体；在本实施例中和图36中称为SYN)或重组小鼠CD40L(R&D Systems)的处理进行比较。
为了制备用于该研究的细菌细胞，将过夜培养物用于接种含有抗生素的500mL LB培养基。将菌株在37℃振荡孵育直至培养物达到对数期结束(OD600＝0.8-1.0)。为了收获，将细胞以5000rpm旋下20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
简言之，将CT26细胞SC植入(在PBS中的1×106个细胞/小鼠)到每只动物的右侧腹侧。监测肿瘤生长；当肿瘤达到～80-100mm3时，将小鼠随机分组(每组N＝6)用于肿瘤内给药，如下：SYN1557(渗漏表型DOM突变体，组1，1×107)、SYN3367(mCD40L分泌者，组2，1×107)，和重组mCD40L(1μg；组3)。在第0天，对小鼠I.T.注射细菌。在第1、4和7天，通过I.P.注射(三次脉冲)向所有组注射1μg ATC。在第1、4和7天，通过I.T.注射用1μg重组CD40L处理组3。在第8天，处死所有小鼠，3只小鼠用于通过流式细胞术分析肿瘤内APC的激活，并且3只小鼠用于通过CFU铺板测量细菌定植。
将三个代表性肿瘤均质化，将肿瘤匀浆物连续稀释并铺板在含有适当抗生素的LB琼脂平板上，以测量菌落形成单位浓度。如图36B所示，SYN-CD40L以与SYN类似的程度定植肿瘤，达到高达1×108CFU/g肿瘤。通过在37℃下在DNA酶和Liberase TL(Sigma)的混合物中消化肿瘤30分钟、将细胞置于单细胞悬浮液中并用以下抗体进行染色，进行来自三个代表性肿瘤的肿瘤内APC的流式细胞术分析：抗MHCII(IA/IE)、CD45.2、CD40、Gr1、CD197(CCR7)、CD11b、CD11c(均来自Biolegend)。用SYN-CD40L处理CT26肿瘤导致肿瘤内树突细胞上更高水平的CCR7表达(SYN-CD40L相对于SYN对照，P<0.04)，以及朝向巨噬细胞上的更高表达的趋势(图36C)。另外，在肿瘤中的树突细胞和巨噬细胞两者上观察到朝向CD40的更高表达的趋势。这些结果表明，SYN-CD40L处理导致肿瘤内关键APC亚群的激活增加。
实施例45.hTNFα在CT26肿瘤中的活性
为了在CT26肿瘤中确定hTNFα表达菌株SYN2304(包含PAL::CMP15A TetR Ptet-PhoA-TNFα；在本实施例和图38中称为SYN-TNFα)的体内活性，评估肿瘤体积，并且与SYN1557(DOM突变体；在本实施例和图38中称为SYN)进行比较。
为了制备用于该研究的细菌细胞，将过夜培养物用于接种含有抗生素的500mL LB培养基中。将菌株在37℃振荡孵育直至培养物达到对数期结束(OD600＝0.8-1.0)。为了收获，将细胞以5000rpm旋下20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
简言之，将CT26细胞SC植入(在PBS中的1×106个细胞/小鼠)到每只动物的右侧腹侧。监测肿瘤生长；当肿瘤达到～50-80mm3时，将小鼠随机分组(每组N＝5)用于肿瘤内给药，如下：SYN(渗漏表型DOM突变体，组1，1×107)和SYN-TNFα(TNF-α分泌者，组2，1×107)。在第0天和第4天，给小鼠I.T.注射细菌。在第1天和第4天，两组通过IP注射给予1μg ATC(两次脉冲)。肿瘤大小每周测量2次。将肿瘤匀浆，将肿瘤匀浆物连续稀释并铺板在含有适当抗生素的LB琼脂平板上，以测量菌落形成单位浓度。如图38B所示，SYN-TNFα以与SYN类似的程度定植肿瘤，达到至多1×108CFU/g肿瘤。仅在SYN-TNFα处理的CT26肿瘤中检测到hTNFα的肿瘤内表达，如通过hTNFαELISA(R&D Systems)测量的(图38C)。图38D中的结果显示，在第一次细菌剂量之后第7天用SYN-TNFα处理的CT26肿瘤与SYN处理相比，肿瘤生长显著减少(P<0.02)。总的来说，这些结果证实，SYN-TNFα能够在CT26肿瘤中定植和存留，在那里它们表达可检测水平的hTNFα并导致肿瘤生长显著减少。
实施例46.mIFNγ分泌菌株SYN3367在体内的活性
为了确定IFNγ表达菌株SYN3367(包含PAL::Cm p15a Ptet-87K PhoA-mIFNg；在本文中称为SYN-IFNγ)的体内动力学，处理CT26肿瘤并与SYN1557(DOM突变体；本文中称为SYN)处理的肿瘤进行比较。
为了制备用于该研究的细菌细胞，将过夜培养物用于接种含有抗生素的500mL LB培养基。将菌株在37℃振荡孵育直至培养物达到对数期结束(OD600＝0.8-1.0)。为了收获，将细胞以5000rpm旋下20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
简言之，将CT26细胞(在PBS中的1×106个细胞/小鼠)SC植入到每只动物的右侧腹侧。监测肿瘤生长；直到肿瘤达到～50-80mm3时，将小鼠随机分组(n＝每组6只)用于肿瘤内给药如下：SYN(渗漏表型DOM突变体，组1，1×107)和SYN-IFNγ(IFNγ分泌者，组2，1×107)。在第0天和第3天向小鼠给药适当的细菌菌株。在第1、4和7天，所有小鼠I.P.注射1μg ATC(三次脉冲)。在第8天，处死所有小鼠，3只小鼠用于通过CFU铺板测量肿瘤内细菌定植，并且3只小鼠用于通过ELSIA分析肿瘤内IFNγ生产。将肿瘤匀浆，将肿瘤匀浆物连续稀释并铺板在含有适当抗生素的LB琼脂平板上，以测量菌落形成单位浓度。如图XB所示，SYN-IFNγ以与SYN相似的程度定植肿瘤，达到至多1×108CFU/g肿瘤。仅在SYN-IFNγ处理的CT26肿瘤中检测IFNγ的肿瘤内表达，如通过鼠IFNγELISA(R&D Systems)所测量的(图40C)。总的来说，这些结果证实SYN-IFNγ能够在CT26肿瘤中定植和存留，在那里它们在用ATC诱导后表达可检测水平的IFNγ。
实施例47.对分泌的CXCL10的功能分析
为了确定从任何上述菌株分泌的人CXCL10是否是功能性的，进行趋药性测定，基本上如Mikucki等所述(Mikucki,等,Non-redundant Requirement for CXCR3 Signalingduring Tumoricidal T Cell Trafficking across Tumor Vascular Checkpoints；NatCommun.2015；6:7458,其全部内容通过引用并入本文)。在该测定中，人CD8+T细胞(抗CD3/CD28扩增后8天)被细胞痕迹紫色标记并转移到顶部有T细胞、底部有细菌上清液、存在或不存在抗hCXCR3的24孔transwell板(5uM孔)中。将细胞孵育3小时，并通过流式细胞术计数从孔的底部回收的迁移细胞。
为了制备细菌上清液，解冻菌株(SYN1557对照菌株和SYN2942(包含PAL::CmPtet-87K PhoA(ECOLIN_02255)))并培养过夜，然后通过添加四环素诱导3小时以表达hCXCL10。将上清液无菌过滤，然后如下文所述使用。为了制备T细胞，在用抗CD3/CD28珠子刺激后约8天，对预分离的原代人CD8 T细胞(AllCells)进行计数、收获和重悬在T细胞培养基中。在底部有0.5ml空间和在孔顶部有0.1ml空间和具有5uM孔大小的24孔transwell板用于测定。为了制备用于孔底部的细菌上清液，将来自SYN2942的上清液稀释在取自SYN1557对照细菌的上清液中以产生含有100％、33％、11％、3.7％和0％SYN2942的混合物。为了准备孔的顶部，将100μl的T细胞加入到顶部孔(含有约2.5×10个细胞)。将抗CXCR3(小鼠IgG1；克隆G025H7)以最终浓度为1μg/ml加入到对照孔中。板在分析之前被放置在37℃培养箱中3个小时。为了分析，将每个底部孔的内容物转移到96孔板的两个孔中。将平板旋下，合并两个孔，重悬于PBS中，并在MACSQuant流式细胞仪上分析以定量迁移细胞的数量。原代人T细胞以剂量依赖性方式向SYN2942上清液运输，其通过阻断CXCL10的受体CXCR3而消除。该数据(未显示)表明SYN2942生产的hCXCL10具有生物学活性，并且是以足够浓度丰富以触发体外原代T细胞运输。
实施例48：在Balb/c-A20肿瘤模型中评价SYN3527治疗的功效
为确定SYN3527(包含基于质粒的来自单核细胞增多性李斯特氏菌的tet-诱导型dacA)的体内活性和功效，在c-A20肿瘤模型(A20 B细胞淋巴瘤)中，随着时间的推移将其以三个剂量给药并与PBS对照进行比较。
为生产用于本研究的细胞，将过夜培养物用于接种含抗生素的500mL LB培养基中。将菌株在37℃振荡孵育，直到培养物达到对数期(OD600＝0.8-1.0)结束。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
将A20肿瘤植入6周龄的雌性Balb/c小鼠中，瘤内注射三个不同剂量的产生能够产生c-diAMP的酶的细菌。在不同时间点测量肿瘤体积，同时在实验结束时对肿瘤称重并进行处理。
简言之，在第-15天时将A-20细胞(2x105个/小鼠/100μL于PBS)SC植入每只动物的右侧腹侧。监测肿瘤生长直至肿瘤达到～100mm^3。在第0天时，将小鼠随机分组(每组N＝8只)，用于肿瘤内给药如下：PBS(组1，载剂对照)，SYN3527(组2，1X10^7CFU)，SYN3527(组3，5X10^7CFU)和SYN3527(组4，5X10^8CFU)。在第0、2和5天时，测量肿瘤尺寸并向小鼠I.T.注射细菌或PBS，随后在4小时后进行ATC(1ug I.P.)。
在第0、3和7天时，按照分组向动物施用适宜的细菌或盐水(作为注射对照)。施用细菌后4小时，通过腹膜内注射用10ug ATC(无水四环素)处理小鼠。每周记录三次肿瘤体积和体重，两次测量之间的间隔为1-2天。
在第1、4和12天的肿瘤体积如图11中所示，各只小鼠长达27天的肿瘤体积如图12A(盐水对照)、图12B(1X10^7CFU)、图12C(5X10^7CFU)和图12D(5X10^8CFU)中所示。结果表明在A20淋巴瘤模型中施用SYN3527产生了剂量依赖性的肿瘤控制。
实施例49：将STING抑制剂与Kyn维持剂联用：使用aPD1检查点抑制改善了功效
单独或与检查点抑制剂疗法联用，测试了免疫引发剂/维持剂对的下一个组合。为确定引发剂STING产生菌株SYN3527(包含基于质粒的来自单核细胞增多性李斯特氏菌的四环素诱导型p15a Ptet-DacA的大肠杆菌Nissle)与维持剂犬尿氨酸消耗菌株SYN2028(包含在组成型启动子和ΔTrpE下的整合的犬尿氨酸酶)联用的功效，在被认为是免疫学上的“冷”肿瘤模型的B16F10肿瘤模型中监测了肿瘤体积、存活和体重。为评估检查点抑制是否将进一步改善引发剂/维持剂对的功效，还评估了加入全身性施用的抗-PD1抗体的作用。用2剂量STING激动剂产生菌株(引发剂)处理小鼠，随后用抗-PD1、犬尿氨酸消耗菌株或其组合(维持剂)处理小鼠。
为生产用于本研究的细胞(SYN3527和SYN2028)，将过夜培养物用于接种含抗生素的500mL LB培养基中。将菌株在37℃振荡孵育，直到培养物达到对数期(OD600＝0.8-1.0)结束。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃下冻存。通过连续铺板测试细胞的浓度。
按照下文所述的时间轴，向小鼠植入B16F10肿瘤，并向小鼠瘤内注射生产STING激动剂的细菌，随后再向小鼠注射消耗犬尿氨酸的细菌。简言之，在第-9天，将B16F10细胞(2e5个细胞/小鼠，在PBS中)SC植入每只动物的右侧腹侧。在第-3天，监测肿瘤生长；当在第0天肿瘤达到～50-80mm3时，将小鼠随机分成实验组(每组N＝10只)，用于肿瘤内给药如下：组1：盐水+同种型对照；组2：盐水+抗-PD1抗体；组3：SYN3527[1e7]+同种型对照；组4：SYN3527[1e7]+抗-PD1抗体；组5：SYN3527[1e7]->SYN3527:SYN2028[1e7]->SYN2028[1e7]+同种型对照；组6：SYN3527[1e7]->SYN3527:SYN2028[1e7]->SYN2028[1e7]+抗-PD1抗体；组7：SYN3527[1e6]->SYN3527[1e7]+同种型对照；组8：SYN3527[1e6]->SYN3527[1e7]+抗-PD1抗体。同种型对照和抗-PD1抗体的以每次注射200ug给药。在第1天、第5天和第8天根据分组向动物施用适当的细菌。每次细菌给药4小时后，通过腹膜内注射用10ug ATC(无水四环素)处理小鼠。对于完全应答者，停止细菌给药。表53提供了处理时间轴的总结。结果如表54中所示。
表53：处理时间轴的总结
Figure BDA0002364453000005601
Figure BDA0002364453000005611
表54：研究结果
Figure BDA0002364453000005612
对于显示对处理有完全或部分应答的具有肿瘤的小鼠，停止给药，并监测小鼠的持续应答50天。在这段时间内没有肿瘤复发。
接下来，通过在第一次肿瘤植入的对侧腹侧再次植入肿瘤，对显示出CR的动物进行再次挑战，以评估用SYN3527处理是否能够产生免疫记忆。简言之，在第71天将B16F10细胞再次植入来自组3-8的11个完全应答者并与天然
Figure BDA0002364453000005613
动物(n＝6)进行比较。结果如图12中所示，结果表明，与天然对照相比，在此前对初始SYN3527处理产生CR的小鼠中，肿瘤生长显著延迟，提示形成了免疫记忆。
实施例50：安全性和生物控制策略评估：在肿瘤中营养缺陷型突变的增殖
评估了在肿瘤中营养缺陷型突变株的增殖能力。生成了3种营养缺陷型菌株：SYN1193(ΔUraA::CM)、SYN1534或SYN1605(ΔThyA::CM)、SYN766(ΔDapA::CM)。
首先，在CT26模型中评估了营养缺陷型菌株的增殖。将CT26细胞(～1e6个细胞/小鼠，在PBS中)皮下植入每只动物(雌性，8周龄)的右侧腹侧，监测肿瘤生长约10天。当肿瘤达到～100-150mm3时，将动物随机分组用于给药。
为了进行瘤内注射，根据需要使细菌在含胸腺嘧啶(3mM)、二氨基庚二酸(100ug/mL DAP)或尿嘧啶的LB培养基中生长，直至在600nm(A600 nm)下的吸光度达到0.4(对应于2e8个菌落形成单位(CFU)/mL),并在PBS中洗涤两次。在PBS或盐水中稀释悬液，从而可以以适当剂量将40uL瘤内注射至具有肿瘤小鼠中。
按照如下所示，将细菌混悬在PBS中并向小鼠瘤内注射40uL悬液(1e6个细胞/小鼠)：组1-SYN94(n＝6)、组2-SYN1193(n＝6)、组3-SYN1534(n＝6)和组2-SYN766(n＝6)。在24和72小时收集肿瘤组织。将肿瘤组织匀浆系列稀释并接种在LB琼脂培养板(含有抗生素以及胸腺嘧啶、二氨基庚二酸或尿嘧啶)上，以计算在肿瘤内每克组织的活细菌数(或菌落形成单位)。图18A中的结果表明，与未修饰的大肠杆菌Nissle菌株相似，包含ΔThyA和ΔUraA突变的菌株能够在肿瘤中定植和增殖。在胸腺嘧啶途径中的突变阻止了细菌在缺乏胸腺嘧啶来源的条件下生长，然而，结果表明在肿瘤中存在足够水平的这些营养物质，从而允许定植和生长。这样，通过在不存在胸腺嘧啶的条件下阻止生长，同时不对生长和定植性质产生负面影响，并且通过在肿瘤内的延伸、效应物产生或功效，这些营养缺陷型突变可用于生物控制策略。
而相反的是，含有ΔDapA突变的菌株不能增殖，并且在24小时和72小时后检测到比最初注射的更低的细菌数量。二氨基庚二酸(Dap)是由细菌而非哺乳动物宿主产生的氨基酸。其是某些细菌细胞壁的特征性组分，例如革兰氏阴性细菌。没有二氨基庚二酸，细菌将无法形成蛋白聚糖，因此无法生长。这样，DapA营养缺陷型可能会影响在肿瘤中细菌的生长和定植，并且可能存在一种特别有用的策略以在时间上调节、定时微调细菌在肿瘤中的存在程度和/或随着时间的推移效应物表达和生产水平。
使用ThyA营养缺陷型菌株在B16F10和EL4细胞中进行了后续研究，如图18和图18C中所示。在72小时时间段内，ThyA营养缺陷型菌株能够以与WT菌株相似的速率增殖，其概括了相对于CT26模型中未修饰菌株观察到的生长模式。
实施例51：通过底盘(chassis)修饰调控时间剂量以改善使用DAP-STING菌株的治疗窗的可能性
评估了控制体内效应物产生的水平和时间的各种方法，每种方法都可以单独使用或组合使用(以实现更严格的控制)。进行了研究以评估使用诱导型启动子(四环素、cumate、水杨酸或缺氧/厌氧菌诱导型)控制或微调效应分子产生的水平和时间的能力，并在下面进行描述。
此外，评估了通过控制基因工程化细菌的丰度来调控效应物分子产生的水平和时间的能力。如前述实施例所述，有利地发现了DapA营养缺陷型菌株不能在肿瘤中生长和定植。因而，DapA营养缺陷型可能存在一种获得对细菌的负载和剂量以及通过延伸效应物有效载荷的递送和丰度的时间控制的手段。
为了检测DapA对STING生产的影响，制备了产生STING的SYN4023(含有基于质粒的来自单核细胞增多性李斯特氏菌的四环素诱导型p15a Ptet-DacA和ΔDapA的大肠杆菌Nissle)。接下来，检测了调节在肿瘤中的细菌生长或定植以及效应物生产的能力。
为确定包含DAP-STING菌株SYN4023(含有来自单核细胞增多性李斯特氏菌的p15aPtet-DacA和ΔDapA的大肠杆菌Nissle)的治疗的功效，在B16F10肿瘤模型中监测了肿瘤体积和体重。
为生产用于本研究的细胞，将过夜培养物用于接种含抗生素的500mL LB培养基中。将菌株在37℃振荡孵育，直到培养物达到对数期(OD600＝0.8-1.0)结束。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等量分装并在-80℃下冻存。通过连续铺板测试细胞的浓度。
按照下文所述的时间轴，向小鼠植入B16F10肿瘤，并向小鼠瘤内注射生产STING激动剂的细菌。简言之，在第-9天，将B16F10细胞(2e5个细胞/小鼠，在PBS中)SC植入每只动物的右侧腹侧。在第-3天，监测肿瘤生长；当在第0天肿瘤达到～50-80mm3时，将小鼠随机分组(每组N＝10只)，用于肿瘤内给药如下：盐水(对照，组1)，SYN4023(DAP-STING，组2，1e7CFU)和SYN4023(DAP-STING，组3，1e8 CFU)。在第1天、第5天和第8天根据分组向动物施用适当的细菌或盐水(作为注射对照)。细菌给药前4小时，通过腹膜内注射用10ug ATC(无水四环素)处理小鼠。对于完全应答者，停止细菌给药。
第5、8和12天的肿瘤体积如图19A中所示。每只小鼠的肿瘤体积如图19B、图19C和图19D中所示。结果表明，在该时间段内，以1e8的剂量施用SYN4023导致肿瘤生长抑制或控制。
此外，这些结果表明，通过引入DapA营养缺陷型限制细菌生长不会降低菌株的功效。
实施例52：排除细胞因子释放综合征
细胞因子释放综合征(CRS)是一种作为一些疾病或感染的并发症出现的全身性炎症应答综合征的形式，也是一些单克隆抗体药物以及过继性Tt细胞疗法(如CAR-T疗法)的不良反应。细胞因子释放综合征是由于在免疫治疗过程中细胞因子从免疫细胞大量快速释放到血液中引起的。类似地，在被称为脓毒症(sepsis)的过程中，全身性细菌感染能够导致细胞因子的迅速释放。为确保瘤内细菌治疗将不会导致在小鼠血液中出现与CRS或脓毒症相关的细胞因子水平升高，在使用STING激动剂生产细菌和相应的未修饰对照对肿瘤进行治疗后对血液中的细胞因子水平进行测量。
如本文其他地方所述，植入B16F10肿瘤并进行监测，将小鼠随机分组并根据如下所示的分组在0时间进行I.T.注射：盐水，SYN3527(STING，诱导的，1e7 CFU)、SYN3527(STING，未诱导的，1e7 CFU)、SYN4023(STING DAP，诱导的，1e8 CFU)或SYN94(未修饰细菌，1e7 CFU)(每组n＝12)。在本研究中引入了LPS诱导的脓毒症对照(500ug/100uL PBS)并对其静脉施用。每种细菌给药后4小时，用10ug ATC(无水四环素)通过腹膜内注射或PBS载剂对照(未诱导的)处理小鼠。在1、5和24小时处死小鼠(每个时间点4只小鼠)。使用定制的Luminex试剂盒，根据生产厂商的说明书对血液中的TNFα和IL-1β水平进行定量。结果如图20中所示，并且结果表明细胞因子水平均远低于在脓毒症对照中观察到的那些。这些数据表明，在具有肿瘤的小鼠中，使用SYN3527或SYN4023治疗后未发生脓毒症性休克和细胞因子风暴。
通过液相色谱质谱法分析了肿瘤匀浆(1hr、5hr、24hr)中STING激动剂c-di-AMP的产生，并且通过在LB培养板上铺板测量了CFU。图20C显示了c-diAMP的测量结果，并且证实了c-di-AMP在体内是由SYN3527和SYN4023两者产生的(当使用ATC诱导时)。图20D显示了CFU计数，并且表明SYN3527在肿瘤中以与未修饰的SYN94相似的程度定植和生长，而ΔDapA菌株SYN4023在所测量的时间段内(24hr)显示出细菌数量减少。值得注意的是，所有血液样品的细菌生长均为阴性。值得注意的是，在使用所分析的细菌菌株处理后，未出现细胞因子释放到血流中。总体而言，这些结果表明，对B16F10肿瘤的瘤内治疗并表达STING激动剂是安全的，并且不会导致与细胞因子相关的脓毒症或细胞因子风暴的全身性增加。
实施例53：STING多态性：建立另外的激动剂生产菌株以解决多个等位基因
已经描述了人STING(hSTING)的多个等位基因。不同的STING激动剂以不同的特异性激活这些等位基因(参见例如，Yi等，Single Nucleotide Polymorphisms of HumanSTING Can Affect Innate Immune Response to Cyclic Dinucleotides；PLOS One 2013年10月|第8卷|第10期|e77846，其全部内容通过引用并入本申请)。STING感测来自细菌的环二核苷酸和/或内源性环GAMP。除了本文所示的针对SYN3527生产的c-di-AMP以外，其他或替代激动剂的生产可能还可以用于增强对其他等位基因的刺激，并可以提供更多的灵活性来调节工程化菌株的功效。
基于与已知的cGAMP合酶(cGAS)DncV的同源性，鉴定了推定的cGAMP合酶(21种蛋白)的系统发育文库。为产生STING激动剂菌株，在Ptet启动子的控制下，将cGAS直系同源物克隆至p15中。然后筛选cGAS直系同源物，以鉴定能够在体外生产cGAMP的替代酶。
简言之，使包含编码cGAS直系同源性之一的异源性构建体的E.coli Nissle菌株和对照菌株在LB培养基中生长过夜。将培养物在补充了0.5％葡萄糖(w/v)的M9基本培养基中按照1：10的比例稀释，并在37℃下振荡培养(350rpm)2小时。将培养物稀释成光密度为1.0，并在此时向培养物中加入浓度为100ng/mL的无水四环素(ATC)，以诱导表达cGAS。诱导4小时后，取出样品用于对环二核苷酸的产生进行LC/MS分析。将样品在5000RPM下离心20分钟以分离细胞和胞外级分。然后，将细胞沉淀用于确定胞内3’,3’cGAMP。通过LC/MS确定浓度。
结果如图33A和图33B中所示。如前所示，SYN3527产生高水平的cdAMP。在所检测的其他菌株中未观察明显的产生。然而，鉴定出了几个重要的cGAMP生产者(SYN4251、SYN4240、SYN4241)。SYN4251表达来自Verminephrobacter eiseniae(EF01-2蚯蚓共生体)的直系同源物、SYN4240表达反硝化金氏菌(ATCC 33394)的直系同源物和SYN4241表达杆状奈瑟氏菌(ATCC BAA-1200)的直系同源物。序列如表55中所述。
表55：细菌cGAMP生产菌株
菌株名称 基因名称 Uniprot ID SEQ ID NO多肽/多核苷酸
SYN4240 HMPREF9098_1812 F0F127 SEQ ID NO:1260/SEQ ID NO:1263
SYN4241 HMPREF9123_0074 F2B8M1 SEQ ID NO:1261/SEQ ID NO:1264
SYN4251 Veis_4659 A1WRU9 SEQ ID NO:1262/SEQ ID NO:1265
实施例54：在A20肿瘤模型中SYN4023治疗的抗肿瘤功效
在A20肿瘤模型中评估了SYN4023(ptet-DacA和ΔDapA)的抗肿瘤活性。
为生产用于本研究的细胞，将过夜培养物用于接种含抗生素的500mL LB培养基中。将菌株在37℃振荡孵育，直到培养物达到对数期(OD600＝0.8-1.0)结束。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等量分装并在-80℃下冻存。通过连续铺板测试细胞的浓度。
在第-14天，将A20肿瘤(1e6个细胞/小鼠，在PBS中)SC植入每只动物的右侧腹侧。在第-3天监测肿瘤生长；当肿瘤达到～40-80mm3时(第0天)，将小鼠随机分入实验组(每组N＝12只)进行瘤内给药，如表56中所示。
表56：实验组
Figure BDA0002364453000005671
在第1天和第4天I.T.向动物施用SYN4023细菌或盐水。每种细菌给药前4小时，通过腹膜内注射预先用10ug ATC(无水四环素)处理小鼠。每周3次，测量肿瘤体积并评估动物健康状况。结果如图21中所示，结果表明，使用SYN4023对A20肿瘤进行治疗导致肿瘤控制和抑制。这些数据表明，在A20肿瘤模型中，仅使用两剂SYN4023处理就是有效的。
实施例55：使用DAP营养缺陷型STING激动剂生产菌株增强免疫刺激剂的功效
通过OX40、41BB和GITR触发免疫刺激的激动性抗体已显示通过细胞毒性CD8+和辅助性CD4+T细胞的扩增和增殖促进抗肿瘤免疫(Sanmamed,M.F.,等，(2015)."Agonists ofCo-stimulation in Cancer Immunotherapy Directed Against CD137,OX40,GITR,CD27,CD28,and ICOS."Semin Oncol 42(4):640-655，其全部内容通过引用并入本申请)，因此，我们试图评价这些治疗与我们的STING生产细菌菌株联用的功效。
为确定SYN4023(含有基于质粒的来自单核细胞增多性李斯特氏菌的四环素诱导型p15a Ptet-DacA和ΔDapA的大肠杆菌Nissle)是否能够增强aOX40、a41BB、和aGITR的功效，在B16F10肿瘤模型中对肿瘤生长进行了监测。
为生产用于本研究的细胞，将过夜培养物用于接种含抗生素的500mL LB培养基中。将菌株在37℃振荡孵育，直到培养物达到对数期(OD600＝0.8-1.0)结束。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等量分装并在-80℃下冻存。通过连续铺板测试细胞的浓度。
在第-9天，将B16F10肿瘤(2e5个细胞/小鼠，在PBS中)SC植入每只动物的右侧腹侧。在第-3天监测肿瘤生长情况；当肿瘤达到～40-80mm3时(第0天)，将小鼠随机分入实验组(每组N＝10只)进行瘤内给药，如表57中所示。
表57：实验组
组别编号(n＝10) 瘤内治疗 全身性治疗
1 PBS PBS
2 PBS αOX40
3 PBS α41BB
4 PBS αGITR
5 SYN4023(DAP-STING)[1e8] PBS
6 SYN4023(DAP-STING)[1e8] αOX40
7 SYN4023(DAP-STING)[1e8] α41BB
8 SYN4023(DAP-STING)[1e8] αGITR
在研究期间，每周两次，I.T.给予动物SYN4023细菌和I.P.给予动物适当的抗体。抗体治疗(I.P.)如下所示：抗-OX-40(抗-OX-40，每剂100μg)、抗-GITR(DTA-1，每剂350μg)和α4-1BB(LOB12.3，每剂350μg)。每种细菌给药前4小时，通过腹膜内注射预先用10ug ATC(无水四环素)处理小鼠。对于完全应答者，停止细菌给药。如图22A(中位体积)和图22B、图22C、图22D、图22E、图22F、图22G和图22H(每只小鼠)中所示，在第3、6、9和13天测量肿瘤生长。结果表明，与单独的激动性抗体相比，将SYN4023与各种激动性抗体共同施用能够更好地控制肿瘤生长和抑制肿瘤。这些数据以及上述数据证明了产生STING激动剂改善免疫检查点和免疫激动剂疗法两者的功效的能力。
实施例56：在B16F10肿瘤模型中进行的体内启动子研究
作为控制免疫有效载荷递送的方法，评价了几种诱导型启动子系统的功能和效用。在体内肿瘤微环境中评估了低氧诱导型FNR、cumate诱导型和水杨酸诱导型启动子的活性。
为了评价诱导后肿瘤内各种诱导型启动子的表达情况，产生了由待检测的各种启动子驱动的GFP报告基因构建体。将由组成型启动子驱动的RFP用于鉴定和分离肿瘤内的细菌细胞。
如本文所述植入B16F10(以2e5植入)，并在给药前允许肿瘤尺寸达到～100mm3。在研究的第1天，将小鼠随机分组(每组8只小鼠；每个时间点4只小鼠)，并用如表58中所列出的诱导型GFP菌株注射。在细菌注射后48hr(第3天)I.P.施用诱导剂。
表58：实验组
组别 菌株 诱导剂
1 SYN4360(Tet-GFP:Con-RFP)[0.5e6] aTC(10ug)
2 SYN4359(fnr-GFP:Con-RFP)[0.5e6] 无
3 SYN4352(asp-GFP:Con-RFP)[0.5e6] 水杨酸钠(100mM，150uL，在PBS中)
4 SYN4352(asp-GFP:Con-RFP)[0.5e6] 无
5 SYN4353(cum-GFP:Con-RFP)[0.5e6] 水溶性cumate(6mg，在200uL PBS中)
6 SYN4353(cum-GFP:Con-RFP)[0.5e6] 无
7 未注射对照 无
在诱导剂注射后1hr和16hr(第3天和第4天)，将肿瘤在40uM细胞过滤器中压碎，并以700g离心5min。将上清液转移至新试管中，并以4,000rpm离心10min。将沉淀重悬在500uLPBS中，并将200uL转移至96孔板中进行流式细胞术分析。结果如图24和图25中所示。图24显示了为GFP阳性(即，其中启动子是有活性的)的RFP阳性(细菌细胞，不是肿瘤细胞)的百分比。值得注意的是，其中3个启动子有活性的细菌细胞的百分比在1hr和16hr是相同的。图25描述了在整个报告基因表达水平测量的平均荧光强度(MFI)。除了tet诱导型构建体以外(其在16小时时显示出更高的表达水平)，这些表达水平在这两个时间点上也保持不变。综上所述，这些结果表明，所检测的全部3个启动子均能够在体内的肿瘤中驱动报告基因(作为免疫有效载荷的替代的)表达。
实施例57：施用WT STING菌株导致长期免疫记忆
在A20肿瘤模型中评估了由SYN3527(WT Tet-STING)激发的完全消退导致长期免疫记忆的能力。
使用在SYN3527剂量应答研究(实施例52，图65)中对SYN3527治疗具有完全消退的动物(n＝4)并与年龄匹配的天然小鼠进行比较。
在第-14天，将A20肿瘤(2e5个细胞/小鼠，在PBS中)SC植入天然对照小鼠每只动物的右侧腹侧。在初始治疗后第60天，在此前使用SYN3527治疗(已显示出完全消退)小鼠的左侧腹侧(初始肿瘤的对侧腹侧)SC植入A20肿瘤(2e5个细胞/小鼠，在PBS中)。
表59：实验组
Figure BDA0002364453000005701
每周测量3次肿瘤体积和体重，每周对动物健康状况进行3次评估。结果如图13中所示，结果表明施用WT STING菌株导致长期免疫记忆。与天然对照不同的是，在此前使用SYN3527治疗的动物中没有观察到肿瘤复发，表明存在持久的记忆应答。
实施例58：启动子研究(FNR、cumate诱导型和水杨酸诱导型启动子的比较)
评估了FNR、cumate诱导型和水杨酸诱导型启动子在体外允许可调控的和有效的效应物表达水平的能力。
所使用的水杨酸传感器回路PSal/NahR生物传感器回路(部件(part)：BBa_J61051)最初是由恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)改造得到。nahR基因是从恶臭假单胞菌的83kb萘降解质粒NAH7中提取的，其编码34kDa的蛋白，所述蛋白与nah和sal启动子结合以响应于水杨酸诱导物而激活转录(Dunn,N.W.,和I.C.Gunsalus.(1973)Transmissibleplasmid encoding early enzymes of naphthalene oxidation in Pseudomonasputida.J.Bacteriol.114:974-979)。NahR是由组成型启动子(Pc)组成型表达的，并且在诱导剂存在下，NahR正向调控感兴趣蛋白的表达。这里，将Biobrick BBa_J61051(含有由组成型启动子驱动的编码NahR的基因和PSal启动子)克隆到主链p15的dacA之前。
此前已描述了在天然P.putida F1中由cumate调控的表达功能的基本机制以及如何将其应用于大肠杆菌(参见例如，Choi等，Novel,Versatile,and Tightly RegulatedExpression System for Escherichia coli Strains；Appl.Environ.Microbiol.2010年8月，vol.76no.155058-5066)。本质上，cumate回路或开关包括四个组分：强启动子、阻遏蛋白结合DNA序列或操纵子、cymR的表达(阻遏蛋白)以及cumate诱导剂。诱导剂改变的加入使得在cumate与CymR之间形成复合物，并导致阻遏蛋白从其DNA结合位点上除去，从而使得感兴趣基因得以表达。这里，将包含由组成型启动子和cymR响应性启动子驱动的cymR基因的构建体克隆至p15中DacA基因之前，从而允许cumate诱导型表达。
评估了这些启动子驱动DacA表达以及使得在体外产生c-di-AMP的能力。将含有FNR、cumate诱导型和水杨酸诱导型启动子的片段克隆至含有dacA构建体的p15中。菌株被指定如下表60所示。
表60：诱导型DacA菌株
Figure BDA0002364453000005711
表61：未修饰的和具有ΔDapA底盘的菌株之间的活性比较
构建体 未修饰 营养缺陷型 未修饰/DeltaDap
tet-dacA SYN3527-km SYN4023-cm-km 1.06
水杨酸-dacA SYN4031-km SYN4356-cm-km 0.96
cumate-dacA SYN4340-km SYN4357-cm-km 1.05
fnr-dacA SYN4448-km SYN4449-cm-km 1.24
实施例59：ThyA营养缺陷型(ΔthyA)的产生
在缺少存活或生长所必需的外源性加入的营养物质的情况下，营养缺陷型突变会导致细菌死亡，因为其缺乏产生该必需营养物质所需的基因。为了在基因工程化菌株中产生具有营养缺陷型修饰的基因工程化细菌，将是寡核苷酸合成所必需的基因thyA缺失。在大肠杆菌Nissle中缺失thyA基因产生不能在LB平板上形成菌落的菌株，除非它们用胸腺嘧啶补充。如下所示，使用3轮PCR扩增thyA::cam PCR片段。对于第1轮PCR，含有1ng pKD3(作为模板)、25ul 2x phusion、0.2ul引物SR36和SR38以及0、0.2、0.4或0.6ul DMSO的4x50 ulPCR反应使用无核酸酶水补足至50ul体积，并在下述循环条件下扩增：
第1步：98℃下进行30s
第2步：98℃下进行10s
第3步：55℃下进行15s
第4步骤：72℃下进行20s
重复第2-4步30个循环
第5步：72℃下5min
随后，每个PCR反应物取5ul在琼脂糖凝胶上检测，以确认PCR产物具有适宜的大小。使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒，根据生产厂商的说明书，从其余PCR反应物中纯化PCR产物，并在30ul无核酸酶水中洗脱。
对于第2轮PCR，在如上文所述的4x50 ul PCR反应物中(除了使用0.2ul引物SR33和SR34以外)，将来自第1轮的1ul纯化的PCR产物作为模板。循环条件与上述第1轮PCR反应相同。如上所述，将PCR产物在琼脂糖凝胶上检测，以证实扩增，纯化并在30ul中洗脱。
对于第3轮PCR，在如上文所述的4x50 ul PCR反应物中(除了使用引物SR43和SR44以外)，将来自第2轮的1ul纯化的PCR产物作为模板。循环条件与第1轮和第2轮所述的相同。如上文所述，证实扩增，将PCR产物纯化并洗脱。使用分光光度计测量浓度和纯度。将所得到的线形DNA片段转化到含有用于重组工程而生长的pKD46的大肠杆菌Nissle 1917菌株中，所述线形DNA片段含有与thyA上游同源的92bp，侧翼为frt位点的氯霉素表达盒和与thyA基因的下游同源的98bp。电穿孔后，加入1ml含有3mM胸腺嘧啶的SOC培养基，并使得细胞在37℃振荡下恢复2h。然后，将细胞以10,000x g沉淀1分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100ul含3mM胸腺嘧啶的LB中，并在含3mM thy和20ug/ml氯霉素的LB琼脂平板上铺板。将细胞在37℃下孵育过夜。将出现在LP平板上的菌落再次划线。+cam 20ug/ml+或-thy 3mM(thyA营养缺陷型将仅在补充了3mM thy的培养基中生长)。
接下来，通过pCP20转化除去抗生素抗性。pCP20具有酵母Flp重组酶基因(FLP)、氯霉素和氨苄西林抗性基因以及温度敏感性复制。使细菌在37℃下在含有选择抗生素的LB培养基中生长直至OD600＝0.4-0.6。如下所示，处理1mL细胞：将细胞以16,000x g沉淀1分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于1mL冰冷的10％甘油中。将该步骤重复3次。将最终的沉淀重悬于70ul冰冷的10％甘油中。接下来，使用1ng pCP20质粒DNA将细胞电穿孔，并将1mL补充了3mM胸腺嘧啶的SOC立即加入比色杯中。将细胞重悬并转移至培养管中，在30℃下生长1小时。然后，将细胞以10,000x g沉淀1分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100ul含3mM胸腺嘧啶的LB中，并在含3mM thy和100ug/ml羧苄西林的LB琼脂平板上铺板，在30℃下生长16-24小时。接着，将转化子在42℃下进行非选择性菌落纯化(无抗生素)。
为了对菌落纯化的转化子进行检测，使用移液管枪头从42℃平板上挑取菌落并重悬于10μL LB中。将3μL细胞悬液吸取移动到一组3个平板上：Cam，(37℃；检测在宿主菌株基因组中存在/不存在CamR基因)，Amp，(30℃，检测存在/不存在来自pCP20质粒的AmpR)和仅LB(缺失氯霉素表达盒和pCP20质粒的期望细胞)，37℃。如果在Cam和Amp平板上均无生长，则认为菌落已固化(cured)，挑取并重新在LB平板上划线，以获得单一菌落，并在37℃下生长过夜。
随后，每个PCR反应物取5ul在琼脂糖凝胶上检测，以确认PCR产物具有适宜的大小。使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒，根据生产厂商的说明书，从其余PCR反应物中纯化PCR产物，并在30ul无核酸酶水中洗脱。
对于第2轮PCR，在如上文所述的4x50 ul PCR反应物中(除了使用0.2ul引物SR33和SR34以外)，将来自第1轮的1ul纯化的PCR产物作为模板。循环条件与上述第1轮PCR反应相同。如上所述，将PCR产物在琼脂糖凝胶上检测，以证实扩增，纯化并在30ul中洗脱。
对于第3轮PCR，在如上文所述的4x50 ul PCR反应物中(除了使用引物SR43和SR44以外)，将来自第2轮的1ul纯化的PCR产物作为模板。循环条件与第1轮和第2轮所述的相同。如上文所述，证实扩增，将PCR产物纯化并洗脱。使用分光光度计测量浓度和纯度。将所得到的线形DNA片段转化到含有用于重组工程而生长的pKD46的大肠杆菌Nissle 1917菌株中，所述线形DNA片段含有与thyA上游同源的92bp，侧翼为frt位点的氯霉素表达盒和与thyA下游同源的98bp。电穿孔后，加入1ml含有3mM胸腺嘧啶的SOC培养基，并使得细胞在37℃振荡下恢复2h。然后，将细胞以10,000x g沉淀1分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100ul含3mM胸腺嘧啶的LB中，并在含3mM thy和20ug/ml氯霉素的LB琼脂平板上铺板。将细胞在37℃下孵育过夜。将出现在LP平板上的菌落再次划线。+cam 20ug/ml+或-thy 3mM(thyA营养缺陷型将仅在补充了3mM thy的培养基中生长)。
接下来，通过pCP20转化除去抗生素抗性。pCP20具有酵母Flp重组酶基因(FLP)、氯霉素和氨苄西林抗性基因以及温度敏感性复制。使细菌在37℃下在含有选择抗生素的LB培养基中生长直至OD600＝0.4-0.6。如下所示，处理1mL细胞：将细胞以16,000x g沉淀1分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于1mL冰冷的10％甘油中。将该步骤重复3次。将最终的沉淀重悬于70ul冰冷的10％甘油中。接下来，使用1ng pCP20质粒DNA将细胞电穿孔，并将1mL补充了3mM胸腺嘧啶的SOC立即加入比色杯中。将细胞重悬并转移至培养管中，在30℃下生长1小时。然后，将细胞以10,000x g沉淀1分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100ul含3mM胸腺嘧啶的LB中，并在含3mM thy和100ug/ml羧苄西林的LB琼脂平板上铺板，在30℃下生长16-24小时。接着，将转化子在42℃下进行非选择性菌落纯化(无抗生素)。
为了对菌落纯化的转化子进行检测，使用移液管枪头从42℃平板上挑取菌落并重悬于10μL LB中。将3μL细胞悬液吸取移动到一组3个平板上：Cam，(37℃；检测在宿主菌株基因组中存在/不存在CamR基因)，Amp，(30℃，检测存在/不存在来自pCP20质粒的AmpR)和仅LB(缺失氯霉素表达盒和pCP20质粒的期望细胞)，37℃。如果在Cam和Amp平板上均无生长，则认为菌落已固化，挑取并重新在LB平板上划线，以获得单一菌落，并在37℃下生长过夜。
在其他实施方式中，使用类似方法形成其他营养缺陷型，包括但不限于dapA。
实施例60：DAPA营养缺陷型STING菌株的产生
为了控制在体内和环境中的生长，通过缺失编码细菌生长所必需的4-羟基-四氢吡啶甲酸合酶的dapA基因，将亲本大肠杆菌Nissle底盘工程化为营养缺陷型菌株。这种缺失使得细菌不能合成二氨基庚二酸酯(DAP)，从而阻止了细菌细胞壁的正确形成，除非菌株外源性补充了DAP。
为了形成dapA缺失(ΔdapA)，使用巢式引物进行两轮PCR。对于第1轮PCR而言，将pKD3作为模板DNA。设计引物以产生dsDNA片段，其含有与EcN染色体中的dapA基因座相邻的同源性和侧翼为frt位点的氯霉素限制性基因。将引物用于利用第1轮的PCR产物作为模板DNA的第2轮PCR。这些引物含有另外的与dapA的同源性，以提供用于重组工程的更长的EcN同源性。所得到的dapA敲除片段在其5’和3’端分别含有68个碱基对和70个碱基对的EcN同源性。通过电穿孔使用dapA敲除片段转化含有pKD46的菌株。在含有氯霉素(30μg/mL)和二氨基庚二酸酯(100μg/mL)的LB琼脂上选择菌落，并通过PCR验证重组事件的正确性。通过在37℃下传代将pKD46从菌株中固化。
将该DAP营养缺陷型底盘用于产生表达用于生产效应物的基因序列的细菌，如STING激动剂生产菌株SYN4023。
实施例61：全身性抗肿瘤免疫：DAP-STING与激动性抗OX40抗体联用可产生远位效应，并且具有长期免疫记忆
启动子T细胞激活的阳性共刺激受体包括CD28、CD137(也称为4-1BB)和OX40(也称为CD134或肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员4)。最近，发现将先天性免疫刺激(例如，通过Toll样受体)与激动性OX40抗体联用能够促进T细胞依赖性(CD4+和CD8+T细胞依赖性)远位效应和免疫记忆(Sagiv-Barfi等，In Situ Vaccination with a TLR9 Agonist andanti-OX40 Antibody Leads to Tumor Regression and Induces Abscopal Responsesin Murine Lymphoma；Blood 2016 128:1847；Sagiv-Barfi等，Eradication ofspontaneous malignancy by local immunotherapy Science Translation Medicine,2018)。在A20肿瘤模型中评估了SYN4023(包含基于质粒的四环素诱导型DacA和dapA营养缺陷型突变)与抗-OX40抗体联用诱导远位效应的能力。
为生产用于本研究的细胞，将过夜培养物用于接种含抗生素的500mL LB培养基中。将菌株在37℃振荡孵育，直到培养物达到对数期(OD600＝0.8-1.0)结束。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等量分装并在-80℃下冻存。通过连续铺板测试细胞的浓度。
在第-14天，将A20肿瘤(50:50Matrigel:PBS)(2e5个细胞/小鼠)SC植入小鼠的右侧腹侧，并将1e5个细胞/小鼠植入每只动物的左侧腹侧。在第-3天，监测肿瘤生长情况；当肿瘤达到～80-100mm3时，将小鼠随机分入实验组(第0天)(每组N＝10只)进行瘤内给药，如表61所示。
表62：实验组
Figure BDA0002364453000005771
在第0、3和7天I.T.给予动物3剂SYN4023细菌和I.T.给予OX40抗体。在给药后4小时，通过腹膜内注射向小鼠施用10ug ATC(无水四环素)。对于完全应答者停止给予细菌。每周3次，测量两侧腹侧的肿瘤体积，以及评估动物健康状况。结果如图23A-图23C中所示，结果表明使用SYN4023联合OX40对A20肿瘤进行治疗能够产生远位效应。未观察到对体重的显著影响(图23E)。生存期(即，动物能够在研究中而未因肿瘤负荷而被除去的时间长度)如图23D中所示。
接下来，为了测试在上述研究中由SYN4023激发的完全消退是否能够导致长期持续的免疫记忆，使用A20和CT26肿瘤进行了再次挑战研究。使用SYN4023治疗完全消退的动物并与年龄匹配的天然小鼠进行比较。
简言之，将4只14周龄的天然Balb/c雌性小鼠左侧腹侧接种在50％Matrigel中的2x105个A20细胞，以及在右侧腹侧接种在50％Matrigel中的1x105个CT26细胞。以类似的方式接种上述研究第1部分中具有肿瘤缓解的小鼠(n＝11)。每周监测小鼠2-3次，观察其肿瘤体积、体重和健康状况。
结果如图23F-H和图23I中所示，结果表明施用SYN4023菌株导致长期免疫记忆，其针对A20的再次挑战挑战起到了完全的保护作用。图23F描述了每个治疗组的平均中位肿瘤体积，以及图23G和图23H描述了显示每只小鼠的肿瘤体积随时间变化情况的线图。图23I描述了两部分研究的全部内容，其涉及远位效应和免疫记忆潜能(描述了使用A20再次攻击)。在A20再次挑战研究组中，与天然对照不同的是，在此前使用SYN4023治疗的动物中未观察到肿瘤复发，表明存在持久性记忆应答。在CT26再次挑战组中，施用SYN4023菌株部分地阻止CT26肿瘤生长。在此前使用SYN4023治疗并使用CT26再次挑战的11只动物中，有9只得到了保护而未出现肿瘤再次生长。
实施例62：在B16.F10肿瘤模型中SYN4449(DAP-FNR STING)剂量依赖性的抗肿瘤活性
在B16.F10黑色素瘤肿瘤模型中，在不同剂量下，评估了如本申请其他地方所述构建的Dap营养缺陷型菌株，所述菌株包含在FNR启动子控制下表达dacA的构建体的质粒(SYN4449；ΔDAP，p15A-fnr-dacA)。
为生产用于本研究的细胞，将过夜培养物用于接种含抗生素的500mL LB培养基中。将菌株在37℃振荡孵育，直到培养物达到对数期(OD600＝0.8-1.0)结束。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等量分装并在-80℃下冻存。通过连续铺板测试细胞的浓度。
给小鼠植入B16肿瘤，并向小鼠瘤内注射各种剂量的生产STING激动剂的细菌和对照。
简言之，在第-9天，将B16细胞SC植入(2X10e5个细胞/小鼠，在PBS中)每只动物的右侧腹侧。在第-3天，监测肿瘤生长情况；当在第1天肿瘤达到～50-80mm^3时，将小鼠随机分组(每组N＝9只)进行瘤内给药如下：组1-PBS(对照)；组2-SYN4449，1e7 CFU；组3-SYN4449，1e8 CFU；和组4-SYN4449，1e9 CFU。在第1天和第4天，根据分组给予动物适当的细菌或PBS(作为注射的对照)。对于完全应答者停止细菌给药。
对于每只小鼠，第4、7、10、12、和15天的肿瘤体积如图26A-26D所示。结果表明，施用SYN4449能够对B16-F10肿瘤生长和肿瘤抑制具有剂量依赖性作用。当剂量为1e9时(图26D)，在此期间，该治疗导致最高的抑制百分比，并且显著控制肿瘤生长。
实施例63：在A20肿瘤模型中SYN4449的剂量应答
为了确定SYN4449(包含FNR-dacA，ΔdapA(ΔDAP，p15A-fnr-dacA))的体内活性和功效，在A20肿瘤模型(B细胞淋巴瘤模型)中，随着时间的推移将其以三个剂量给药并与PBS对照进行比较。
为生产用于本研究的细胞，将过夜培养物用于接种含抗生素的500mL LB培养基中。将菌株在37℃振荡孵育，直到培养物达到对数期(OD600＝0.8-1.0)结束。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等量分装并在-80℃下冻存。通过连续铺板测试细胞的浓度。
将A20肿瘤植入6周龄的雌性Balb/c小鼠中，瘤内注射三个不同剂量产生能够产生c-diAMP的酶的细菌。在不同时间点测量肿瘤体积。
简言之，在第-15天时将A-20细胞(2x105个/小鼠/100μL于PBS)SC植入每只动物的右侧腹侧。监测肿瘤生长直至肿瘤达到～60-80mm^3。在第0天时，将小鼠随机分组(每组N＝8只)，用于肿瘤内给药如下：PBS(组1，载剂对照)，SYN4449(组2，1e6 CFU)，SYN4449(组3，1e7 CFU)和SYN4449(组4，1e8 CFU)。在第0、3和7天，根据分组给予动物适当的细菌或PBS(作为注射的对照)。连续30天，每周记录三次肿瘤体积和体重，两次测量之间的间隔为1-2天。结果如图27A-27D所示，结果表明，在A20淋巴瘤模型中，施用SYN4449产生了剂量依赖性的肿瘤控制，1e6(图27A)、1e7(图27B)和1e8 CFU(图27C)的SYN4449分别导致10只小鼠中的5只完全应答，10只小鼠中的6只完全应答和10只小鼠中的6只完全应答。
实施例64：在低氧启动子控制下STING激动剂生产菌株的构建和活性
为了产生在低氧条件下(例如，在肿瘤微环境中存在)诱导的STING激动剂生产菌株，将来自单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的dacA克隆至在FNR诱导型启动子控制下的低拷贝质粒中，并转化至还包含DapA缺失的Nissle菌株中，以产生SYN4449(ΔDAP，15A-fnr-dacA)。
为了测量SYN4449的体外活性，将SYN4449的过夜培养物和野生型对照在37℃、250rpm振荡条件下，在2YT(补充了二氨基庚二酸)中培养。将培养物再按照1:100进行稀释(10mL在125mL振荡培养瓶中)并培养2-3小时至对数早期。一旦培养物达到对数早期，将培养物移入提供厌氧氛围(85％N2，10％CO2，5％H2)的Coy厌氧室。将培养物厌氧培养3-4小时，或在37℃、250rpm下在试管中振荡过夜，以使得能够诱导dacA。接下来，将样品10000Xg离心5分钟以分离细胞和胞外级分。然后，将细胞沉淀用于确定胞内环-di-AMP。如本文所述，通过LC/MS确定浓度。结果如图28A中所示，结果表明SYN4449能够在FNR启动子控制下在体外产生c-di-AMP。
实施例65：在低氧启动子控制下各种STING激动剂生产菌株的构建
接下来，构建了包含FNR-DacA和/或人cGAS的整合拷贝的菌株。实例列于表63中。使用dapA和/或ThyA营养缺陷型构建菌株，设计具有dacA和犬尿氨酸消耗回路的菌株，并且在一些情况下，使用本文所述的和本领域公知的方法破坏大肠杆菌Nissle噬菌体3。
表63：示例性菌株
Figure BDA0002364453000005801
为了产生表63中的菌株，将本文所述的和本领域公知的方法用于各种序列中。例如，SYN4910是由野生型Nissle菌株(除了噬菌体3敲除以外)，通过添加DapA敲除、HA910-FNR-dacA敲入，然后是thyA敲除而构建的。在另一个实例中，SYN4939是由SYN2306(含有在组成型启动子控制下的整合的犬尿氨酸酶的菌株)，通过添加thyA敲除、HA910-FNR-dacA敲入、dap敲除和噬菌体敲除而构建的。
A.DacA的染色体整合
为了产生包含在FNR启动子控制下染色体整合的DacA的菌株，将来自单核细胞增多性李斯特氏菌的dacA克隆至在FNR启动子(SEQ ID NO:1281)控制下的KIKO载体中。由KIKO载体制备敲入PCR产物，并进行等位基因交换，以将这些操纵子在HA910位点整合到大肠杆菌Nissle基因组。通过使用如本文和在01/11/2017提交的PCT/US2017/013072(其全部内容通过引用并入本申请)中所述的λ红色重组酶系统促进等位基因交换。在Datsenko和Wanner(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products；PNAS，6月6日，2000.97(12)6640-6645)中描述了λ红色系统并且在现有技术中还描述了对其进行的修饰和改变。
B.噬菌体3敲除的产生
生物信息学方法帮助鉴定了推定含有活性噬菌体的3个基因组区域(如在06/21/2018提交的国际专利申请号PCT/US18/38840中所述的，其全部内容通过引用并入本申请)。使用内部开发的PCR方法，显示活性噬菌体起源于大肠杆菌Nissle基因组的碱基2,035,867和2,079,177之间的基因组基因座。
为了失活该噬菌体，将λ红色重组工程用于制备9,687个碱基对的缺失。首先，设计并合成引物，以扩增侧翼为来自质粒pKD3的翻转酶识别位点(FRT)的氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因。当引入Nissle时，该表达盒提供了对抗生素氯霉素的抗性。此外，这些引物含有与将抗生素表达盒导入噬菌体基因座的基因组同源的60个碱基对。将噬菌体3KO FWD和噬菌体3KO REV引物用于PCR扩增1178个碱基对的线形DNA片段，该片段经PCR纯化。将所得到的DNA模板用于重组工程。
为制备噬菌体缺失，首先，通过本领域公知的电穿孔，通过将含有λ红色基因的pKD46质粒转化进入大肠杆菌Nissle宿主菌株(野生型或包含其他工程化的组分)中，从而引入λ红色系统。将细胞涂布在选择性培养基培养板上，并且在30℃下孵育过夜。接下来，通过电穿孔，将重组工程构建体转化进入含有pKD46的大肠杆菌Nissle菌株中。将转化的细胞涂布在含有35μg/mL氯霉素的LB培养板上并孵育过夜。通过菌落PCR验证突变存在情况。如果CAT基因已插入基因组中(从而缺失并失活噬菌体)，则仅形成PCR产物。
使用质粒pCP20除去抗生素抗性基因。质粒pCP20是温度敏感性质粒，其表达将重组FRT位点的翻转酶重组酶，从而除去CAT基因。在37℃下，将缺失了噬菌体序列的菌株在含有抗生素的LB培养基上培养，直至其OD600达到0.4-0.6，然后通过电穿孔用pCP20对其转化。将200ul细胞涂布在羧苄西林培养板上，将200μL细胞涂布在氯霉素培养板上，并且均在37℃下培养过夜。羧苄西林培养板含有具有pCP20的细胞。氯霉素培养板提供了在电穿孔中存活了多少细胞的指示。在43℃下对来自羧苄西林培养板的转化子进行非选择性纯化，并使其生长过夜。
检测了纯化的转化子对羧苄西林和氯霉素的敏感性。如果在氯霉素或羧苄西林培养板上均未观察到菌落生长，则CAT基因和pCP20质粒均丢失，保存所述菌落用于进一步分析。将保存的菌落在LB培养板上重新划线以获得单一菌落，并在37℃下生长过夜。通过对基因组的噬菌体基因座区域进行测序并通过表型验证噬菌斑形成的缺失来确认噬菌体序列的缺失(基本上依照如下所述的方案(如06/21/2018提交的国际专利申请号PCT/US18/38840中所述，其全部内容通过引用并入本申请))。
进行敲除(如噬菌体KO)的替代方法是使用loxP识别位点替代FRT和使用pCRE质粒替代pCP20。在这种情况下，首先，设计和合成引物，以扩增侧翼为来自质粒pKD4-loxP的翻转酶识别位点(loxP)的氨基糖苷磷酸转移酶(NeoR/KanR)基因(SEQ ID NO:1442)。当引入Nissle后，该表达盒提供对抗生素卡那霉素的抗性。此外，这些引物含有与将抗生素表达盒导入噬菌体基因座的基因组同源的60个碱基对。将引物用于PCR扩增1178个碱基对的线形DNA片段，该片段经PCR纯化。将所得到的DNA模板用于重组工程。
为制备噬菌体缺失，首先，通过本领域公知的电穿孔，通过将含有λ红色基因的pKD46质粒转化进入大肠杆菌Nissle宿主菌株(野生型或包含其他工程化的组分)中，从而引入λ红色系统。将细胞涂布在选择性培养基培养板上，并且在30℃下孵育过夜。接下来，通过电穿孔，将重组工程构建体转化进入含有pKD46的大肠杆菌Nissle菌株中。将转化的细胞涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养板上并孵育过夜。通过菌落PCR验证突变存在情况。如果CAT基因已插入基因组中(从而缺失并失活活噬菌体)，则仅形成PCR产物。
使用质粒pKD4-loxP除去抗生素抗性基因。质粒pKD4-loxP是改变的pKD4，其中的FRT位点被loP位点所替代，所述质粒是温度敏感性质粒，其表达将重组loxP位点的翻转酶重组酶从而除去NeoR/KanR基因。在37℃下，在含有抗生素的LB培养基中培养缺失了噬菌体序列的菌株，直至其OD600达到0.4-0.6，然后通过电穿孔使用logic1253对其进行转化。将200ul细胞涂布在羧苄西林培养板上，将200μL细胞涂布在卡那霉素培养板上，并且均在37℃下培养过夜。羧苄西林培养板含有具有pKD4-loxP的细胞。卡那霉素培养板提供了在电穿孔中存活了多少细胞的指示。在43℃下对来自羧苄西林培养板的转化子进行非选择性纯化，并使其生长过夜。
检测了纯化的转化子对羧苄西林和卡那霉素的敏感性。如果在卡那霉素或羧苄西林培养板上均未观察到菌落生长，则NeoR/KanR基因和pKD4-loxP质粒均丢失，保存所述菌落用于进一步分析。将保存的菌落在LB培养板上重新划线以获得单一菌落，并在37℃下生长过夜。通过使用在噬菌体缺失位点的侧翼的引物(GTGATTAAGTACGTGAAATCGACTGAAC(SEQID NO:1436)和CTCTGTCGGCAACATGAGGA(SEQ ID NO:1437))对预期640-bp的片段进行PCR扩增证实了噬菌体序列的缺失。
表64列出了通过缺失失活的噬菌体3基因。
表64：通过缺失灭活的噬菌体3基因
Figure BDA0002364453000005841
C.ThyA营养缺陷型(ΔthyA)STING激动剂生产菌株的产生
在大肠杆菌Nissle中thyA基因的突变产生了不能在LB平板上形成菌落的菌株，除非向其中补充胸腺嘧啶。使用巢式引物进行三轮PCR扩增thyA::cam PCR片段。对于第1轮PCR，将pKD3作为模板。从剩余PCR反应中纯化PCR产物，并将其作为第2轮PCR反应的模板。再次，将所得到的PCR产物纯化，并作为第3轮PCR的模板。将所得到的线形DNA片段转化到含有用于使用电穿孔进行重组工程而生长的pKD46的大肠杆菌Nissle 1917菌株中，所述线形DNA片段含有与thyA上游同源的92bp，侧翼为frt位点的氯霉素表达盒和与thyA基因下游同源的98bp。在含有氯霉素(30μg/mL)和胸腺嘧啶(3mM)的LB琼脂上选择菌落，并通过PCR验证正确的重组事件。通过在37℃下传代将pKD46从菌株中固化。
接下来，使用pCP20转化除去抗生素的抗性，将细胞涂布在含有3mM胸腺嘧啶和100ug/ml羧苄西林的LB琼脂平板上，并在30℃下培养16-24小时。接着，在42℃下对转化子进行非选择性菌落纯化(无抗生素)。为了对菌落纯化的转化子进行检测，将菌落接种在Cam、Amp以及仅LB平板上，如果在Cam或Amp平板上没有生长，则认为菌落已被固化。通过PCR确认无抗生素表达盒。
D.DAPA营养缺陷型STING菌株的产生
为制备dapA缺失(ΔdapA)，使用巢式引物进行两轮PCR。对于第1轮PCR，将pKD3作为模板。设计引物以产生dsDNA片段，其含有与EcN染色体中的dapA基因座相邻的同源性和侧翼为frt位点的氯霉素限制性基因。将引物用于利用第1轮的PCR产物作为模板DNA的第2轮PCR。这些引物含有另外的与dapA的同源性，以提供用于重组工程的更长的EcN同源性。所得到的dapA敲除片段在其5’和3’端分别含有68个碱基对和70个碱基对的EcN同源性。通过电穿孔使用dapA敲除片段转化含有pKD46的菌株。在含有氯霉素(30μg/mL)和二氨基庚二酸酯(100μg/mL)的LB琼脂上选择菌落，并通过PCR验证正确的重组事件。通过在37℃下传代将pKD46从菌株中固化。
实施例66：在低氧启动子控制下各种STING激动剂生产菌株的构建和活性
检测包含双重营养缺陷型和噬菌体敲除的菌株
根据本文所述的方法构建包含FNR-DacA以及含有双重营养缺陷型和噬菌体敲除的菌株SYN4910(ΔΦ，ΔDAP，ΔThyA，HA9/10::fnr-DacA)以及组合菌株SYN4939(Nissle，ΔΦ，ΔDAP，ΔThyA，HA9/10::fnr-DacA，PSynJ23119-pKYNase，ΔTrpE)。
为了测量比较SYN4910和SYN4939的体外活性，将包括Nissle对照(SYN94，具有链霉素抗性的Nissle)在内的每个菌株的过夜培养物在37℃、250rpm下在LB中培养。将培养物再按照1:100进行稀释(10mL在125mL振荡培养瓶中)并培养2-3小时至对数早期。一旦培养物达到对数早期，将培养物移入提供厌氧氛围(85％N2，10％CO2，5％H2)的Coy厌氧室。将培养物厌氧培养3-4小时，或在37℃、250rpm下在试管中振荡过夜，以使得能够诱导dacA基因。
接下来，移出培养物用于对环二核苷酸产生情况进行LC/MS分析。将样品10000Xg离心5分钟以分离细胞和胞外级分。然后，将细胞沉淀用于确定胞内环-di-AMP。如本文所述，通过LC/MS确定浓度。
为了对犬尿氨酸消耗情况进行定量，将SYN4910和SYN4939外加犬尿氨酸消耗菌株SYN2306(包含HA3/4::PSynJ23119-pKYNaseΔTrpE)和Nissle对照(SYN94)的LB过夜培养物在补充了0.5％葡萄糖(w/v)和适当抗生素的M9基础培养基或者在LB和抗生素中按照1:25的比例稀释，并在37℃下振荡培养(250rpm)5-6小时。离心分离细胞，并重悬于含200μM L-犬尿氨酸
Figure BDA0002364453000005861
的LB中，以使其光密度(600nm)为1.0。然后，将这些培养物在37℃下振荡孵育3-4小时，以使其消耗犬尿氨酸。对于犬尿氨酸消耗情况的测量，从每种培养物中取出样品，并以10000xg离心5分钟以分离细胞和胞外级分。移出培养基上清液，并用于通过LC/MS分析确定犬尿氨酸的消耗情况。
结果如图28B和图28C中所示，结果表明SYN4910和SYN4939均产生环-di-AMP。图28D的结果表明组合菌株SYN4939也保留了与亲本SYN2306类似的消耗犬尿氨酸的能力。综上所述，这些结果表明包含噬菌体敲除和双重营养缺陷型的这些菌株保持了在体外生产环-di-AMP的能力，并且组合菌株SYN4939具有生产环-di-AMP和消耗犬尿氨酸的能力。
检测噬菌体敲除和dapA营养缺陷对菌株活性的影响
为了检测噬菌体敲除和dapA营养缺陷对菌株活性的影响，对具有和不具有噬菌体敲除和dapA敲除的菌株SYN4739(Nissle HA3/4::PSynJ23119-pKYNase，ΔTrpE，ΔThyA，HA9/10::fnr-DacA)和SYN4939(Nissle，ΔΦ，ΔDAP，ΔThyA，HA9/10::fnr-DacA，PSynJ23119-pKYNase，ΔTrpE)进行了并排比较。基本上如上所述培养菌株，用于评估c-di-AMP生产和犬尿氨酸消耗情况。
两个菌株的环-di-AMP生产情况如图29A和图29B中所示。与犬尿氨酸消耗者单一回路菌株SYN2028和SYN2306比较的犬尿氨酸生产情况如图29C和图29D中所示。在图30和图31中可以看到类似的结果。SYN4787基本上包含了与SYN4739(NissleΔThyA，HA9/10::fnr-DacA，HA3/4::PSynJ23119-pKYNase，ΔTrpE)相同的回路，但是不包含任何抗生素标志物(SYN4739具有卡那霉素抗性)。总而言之，这些结果表明噬菌体和dapA敲除不会影响菌株的体外活性。
实施例67：噬菌体检测方案：使用丝裂霉素C诱导数据分析进行大肠杆菌的细菌病毒噬菌斑测定
使用丝裂霉素C诱导程序(方法STM-V-708，来自大肠杆菌(E.coli)的细菌病毒的噬菌斑测定。使用丝裂霉素C诱导，如Sinsheimer RL.Purification and Properties ofBacteriophage X174.J.Mol.Biol.1959；1:37-42,and Clowes,RC and Hayes,W.Experiments in microbial genetics.John Wiley&Sons,NY.1968中所述，其每一个的全部内容均通过引用并入本申请)分析细胞系产生噬菌体的情况。简言之，将样品(适当时，将胸腺嘧啶加入培养基以支持细胞扩增)和对照细胞培养过夜。移出样品的一部分、阳性对照(E.coli，EMG 2:K(λ)，ATCC 23716或等效物)和阴性对照(E.coli，ATCC 13706或等效物)并离心，并在噬菌斑测定中检测每个上清液中细菌噬菌体的存在情况。将终浓度为2μg/mL的丝裂霉素C加入剩余样品、阳性和阴性细菌培养物中。然后，将培养物置于37±2℃下并以300-400RPM振荡，直至在阳性对照中发生裂解(-4.5小时)。将每个培养物用氯仿处理、离心并且0.1mL上清液用于检测细菌噬菌体的存在情况。为此，将上清液与同0.7％琼脂糖溶液混合的噬菌体敏感性大肠杆菌菌株ATCC 13706混合，并作为溶菌肉汤(lawn atoplysogeny broth)(LB)琼脂铺板。如果阳性对照有噬菌斑，而阴性对照无噬菌斑，则认为检测是有效的。
实施例68：对由SYN4737生产的c-di-AMP的功能性测定
接下来，进行了一项功能性测定以进一步确认SYN4737(delta噬菌体，delta Dap，HA9/10::FNR-dacA)的活性。评估了在抗原提呈细胞中SYN4737激活STING途径的能力。以不同感染复数(MOI)将细菌(WT Nissle或SYN4737)与0.5x106个RAW 264.7细胞(永生化的小鼠巨噬细胞系)共培养。将SYN4737在37℃、250rpm下振荡孵育1小时，并在实验前在厌氧室中诱导4-5小时。如所示将共培养物孵育4小时，并分析蛋白提取物中IFNβ1的产生情况。图32显示了SYN4737而非WT Nissle能够以依赖于MOI的方式诱导IFNβ1产生。

Claims (94)

1.一种修饰微生物，其能够生产至少一种免疫引发剂和至少一种免疫维持剂。
2.根据权利要求1所述的修饰微生物，其中所述免疫引发剂能够增强溶瘤作用、激活抗原提呈细胞(APC)和/或初免和激活T细胞。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的修饰微生物，其中所述免疫引发剂是由至少一种基因编码的治疗性分子；由至少一种基因编码的酶生产的治疗性分子；由至少一种基因编码的至少一种生物合成或分解代谢途径的酶；由至少一种基因编码的至少一种生物合成或分解代谢途径的酶生产的至少一种治疗性分子；或者介导RNA干扰、microRNA应答或抑制、TLR应答、反义基因调控、靶蛋白结合或基因编辑的核酸分子。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的修饰微生物，其中所述免疫引发剂是细胞因子、趋化因子、单链抗体、配体、新陈代谢转化剂、T细胞共刺激受体、T细胞共刺激受体配体、工程化的化学疗法或裂解肽。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的修饰微生物，其中所述免疫引发剂是STING激动剂、精氨酸、5-FU、TNFα、IFNγ、IFNβ1、激动性抗-CD40抗体、CD40L、SIRPα、GMCSF、激动性抗-OXO40抗体、OXO40L、激动性抗-4-1BB抗体、4-1BBL、激动性抗-GITR抗体、GITRL、抗-PD1抗体、抗-PDL1抗体或天青蛋白。
6.根据权利要求5所述的修饰微生物，其中所述免疫引发剂是STING激动剂。
7.根据权利要求6所述的修饰微生物，其中所述STING激动剂是c-diAMP、c-GAMP或c-diGMP。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的修饰微生物，其中所述修饰微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码生产所述免疫引发剂的酶。
9.根据权利要求8所述的修饰微生物，其中编码所述免疫引发剂的所述至少一种基因序列是dacA基因序列。
10.根据权利要求8所述的修饰微生物，其中编码所述免疫引发剂的所述至少一种基因序列是cGAS基因序列。
11.根据权利要求10所述的修饰微生物，其中所述cGAS基因序列选自人cGAS基因序列、Verminephrobacter eiseniae cGAS基因序列、反硝化金氏菌cGAS基因序列和杆状奈瑟氏菌cGAS基因序列。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的修饰微生物，其中编码所述免疫引发剂的所述至少一种基因序列被整合至所述修饰微生物的染色体中或存在于质粒上。
13.根据权利要求8-11中任一项所述的修饰微生物，其中编码所述免疫引发剂的所述至少一种基因序列可操作地连接至诱导型启动子。
14.根据权利要求13所述的修饰微生物，其中所述诱导型启动子是由低氧、厌氧或缺氧条件所诱导。
15.根据权利要求5所述的修饰微生物，其中所述免疫引发剂是精氨酸。
16.根据权利要求15所述的修饰微生物，其中所述微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码精氨酸生物合成途径的至少一种酶。
17.根据权利要求15所述的修饰微生物，其中编码所述精氨酸生物合成途径的至少一种酶的所述至少一种基因序列包含反馈抗性argA。
18.根据权利要求16所述的修饰微生物，其中编码所述精氨酸生物合成途径的至少一种酶的所述至少一种基因序列选自以下：argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、argJ、carA和carB。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的修饰微生物，其还包含精氨酸阻遏基因(argR)中的缺失或突变。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的修饰微生物，其中用于生产精氨酸的所述至少一种基因序列被整合至所述修饰微生物的染色体中或存在于质粒上。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的修饰微生物，其中用于生产精氨酸的所述至少一种基因序列可操作地连接至诱导型启动子。
22.根据权利要求21所述的修饰微生物，其中所述诱导型启动子是由低氧、厌氧或缺氧条件所诱导。
23.根据权利要求5所述的修饰微生物，其中所述免疫引发剂是5-FU。
24.根据权利要求23所述的修饰微生物，其中所述微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码能够将5-FC转化为5-FU的酶。
25.根据权利要求24所述的修饰微生物，其中所述至少一种基因序列是codA。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的修饰微生物，其中所述至少一种基因序列被整合至所述修饰微生物的染色体中或存在于质粒上。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的修饰微生物，其中编码所述免疫引发剂的所述至少一种基因序列可操作地连接至诱导型启动子。
28.根据权利要求27所述的修饰微生物，其中所述诱导型启动子是由低氧、厌氧或缺氧条件所诱导。
29.根据权利要求1所述的修饰微生物，其中所述免疫维持剂能够增强T细胞的运输和浸润、增强T细胞对癌细胞的识别、增强效应T细胞的应答和/或克服免疫抑制。
30.根据权利要求1或权利要求29所述的修饰微生物，其中所述免疫维持剂是由至少一种基因编码的治疗性分子；由至少一种基因编码的酶生产的治疗性分子；由至少一种基因编码的至少一种生物合成或分解代谢途径的酶；由至少一种基因编码的至少一种生物合成或分解代谢途径的酶生产的至少一种治疗性分子；或者介导RNA干扰、microRNA应答或抑制、TLR应答、反义基因调控、靶蛋白结合或基因编辑的核酸分子。
31.根据权利要求1、29或30中任一项所述的修饰微生物，其中所述免疫维持剂是细胞因子、趋化因子、单链抗体、配体、新陈代谢转化剂、T细胞共刺激受体或T细胞共刺激受体配体。
32.根据权利要求1或29-31中任一项所述的修饰微生物，其中所述免疫维持剂是新陈代谢转化剂、精氨酸、STING激动剂、CXCL9、CXCL10、抗-PD1抗体、抗-PDL1抗体、抗-CTLA4抗体、激动性抗-GITR抗体或GITRL、激动性抗-OX40抗体或OX40L、激动性抗-4-1BB抗体或4-1BBL、IL-15、IL-15sushi、IFNγ或IL-12。
33.根据权利要求32所述的修饰微生物，其中所述免疫维持剂是新陈代谢转化剂。
34.根据权利要求33所述的修饰微生物，其中所述新陈代谢转化剂是犬尿氨酸消耗途径的至少一种酶或腺苷消耗途径的至少一种酶。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的修饰微生物，其中所述微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码所述犬尿氨酸消耗途径的至少一种酶。
36.根据权利要求35所述的修饰微生物，其中编码所述犬尿氨酸消耗途径的至少一种酶的所述至少一种基因序列是犬尿氨酸酶基因序列。
37.根据权利要求36所述的修饰微生物，其中所述至少一种基因序列是kynU。
38.根据权利要求37所述的修饰微生物，其中所述至少一种基因序列可操作地连接至组成型启动子。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的修饰微生物，其中编码所述犬尿氨酸消耗途径的至少一种酶的所述至少一种基因序列被整合至所述微生物的染色体中或存在于质粒上。
40.根据权利要求35-39中任一项所述的修饰微生物，其中所述微生物包含trpE中的缺失或突变。
41.根据权利要求32或权利要求33所述的修饰微生物，其中所述微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码腺苷消耗途径的至少一种酶。
42.根据权利要求41所述的修饰微生物，其中编码所述腺苷消耗途径的至少一种酶的所述至少一种基因序列选自add、xapA、deoD、xdhA、xdhB和xdhC。
43.根据权利要求42所述的修饰微生物，其中编码所述腺苷消耗途径的至少一种酶的所述至少一种基因序列可操作地连接至由低氧、厌氧或缺氧条件所诱导的启动子。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的修饰微生物，其中编码所述腺苷消耗途径的至少一种酶的所述至少一种基因序列被整合至所述微生物的染色体中或存在于质粒上。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的修饰微生物，其中所述修饰微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码用于将腺苷导入所述微生物的酶。
46.根据权利要求45所述的修饰微生物，其中编码用于将腺苷导入所述微生物的所述酶的所述至少一种基因序列是nupC或nupG。
47.根据权利要求32或权利要求33所述的修饰微生物，免疫维持剂是精氨酸。
48.根据权利要求47所述的修饰微生物，其中所述微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码所述精氨酸生物合成途径的至少一种酶。
49.根据权利要求48所述的修饰微生物，其中所述精氨酸生物合成途径的至少一种酶包含反馈抗性argA。
50.根据权利要求48或权利要求49所述的修饰微生物，其中编码所述精氨酸生物合成途径的至少一种酶的所述至少一种基因序列选自以下：argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、argJ、carA和carB。
51.根据权利要求48-50中任一项所述的修饰微生物，其中编码所述精氨酸生物合成途径的至少一种酶的所述至少一种基因序列可操作地连接至由低氧、厌氧或缺氧条件所诱导的启动子。
52.根据权利要求48-51中任一项所述的修饰微生物，其中编码所述精氨酸生物合成途径的至少一种酶的所述至少一种基因序列被整合至所述修饰微生物的染色体中或存在于质粒上。
53.根据权利要求47-52中任一项所述的修饰微生物，其还包含精氨酸阻遏基因(argR)中的缺失或突变。
54.根据权利要求32或权利要求33所述的修饰微生物，其中所述免疫维持剂是STING激动剂。
55.根据权利要求54所述的修饰微生物，其中所述STING激动剂是c-diAMP、c-GAMP或c-diGMP。
56.根据权利要求54-55中任一项所述的修饰微生物，其中所述修饰微生物包含至少一种基因序列，所述基因序列编码生产所述STING激动剂的酶。
57.根据权利要求56所述的修饰微生物，其中编码所述免疫维持剂的所述至少一种基因序列是dacA基因序列。
58.根据权利要求56所述的修饰微生物，其中编码所述免疫维持剂的所述至少一种基因序列是cGAS基因序列。
59.根据权利要求58所述的修饰微生物，其中所述cGAS基因序列选自人cGAS基因序列、Verminephrobacter eiseniae cGAS基因序列、反硝化金氏菌cGAS基因序列和杆状奈瑟氏菌cGAS基因序列。
60.根据前述任一项权利要求所述的修饰微生物，其中所述修饰微生物是细菌或酵母。
61.根据前述任一项权利要求所述的修饰微生物，其中所述修饰微生物是大肠杆菌细菌。
62.根据前述任一项权利要求所述的修饰微生物，其中所述修饰微生物是大肠杆菌Nissle细菌。
63.根据前述任一项权利要求所述的修饰微生物，其中所述修饰微生物包含导致一种或多种营养缺陷的基因中的至少一种突变或缺失。
64.根据权利要求63所述的修饰微生物，其中所述至少一种缺失或突变在dapA基因和/或thyA基因中。
65.根据前述任一项权利要求所述的修饰微生物，其包含噬菌体缺失。
66.一种组合物，其包含能够生产免疫引发剂的至少一种修饰微生物和免疫维持剂。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述至少一种修饰微生物能够生产所述免疫引发剂和所述免疫维持剂。
68.根据权利要求66所述的组合物，其中所述至少一种修饰微生物能够生产所述免疫引发剂，和至少第二修饰微生物能够生产所述免疫维持剂。
69.根据权利要求66所述的组合物，其中所述免疫维持剂不是由所述组合物中的修饰微生物生产。
70.一种组合物，其包含能够生产免疫维持剂的至少一种修饰微生物和免疫引发剂。
71.根据权利要求70所述的组合物，其中所述至少一种修饰微生物能够生产所述免疫引发剂和所述免疫维持剂。
72.根据权利要求70所述的组合物，其中所述至少一种修饰微生物能够生产所述免疫维持剂，和至少第二修饰微生物能够生产所述免疫引发剂。
73.根据权利要求70所述的组合物，其中所述免疫引发剂不是由所述组合物中的修饰微生物生产。
74.一种药学上可接受的组合物，其包含权利要求1-65中任一项所述的修饰微生物或权利要求66-73中任一项所述的组合物，和药学上可接受的载体。
75.根据权利要求74所述的药学上可接受的组合物，其中配制所述组合物用于瘤内施用。
76.一种试剂盒，其包括权利要求74或权利要求75所述的药学上可接受的组合物，及其使用说明书。
77.一种在受试者中治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用权利要求74或权利要求75所述的药学上可接受的组合物，从而在所述受试者中治疗癌症。
78.一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用权利要求74或权利要求75所述的药学上可接受的组合物，从而在所述受试者中诱导和维持所述免疫应答。
79.一种在患有肿瘤的受试者中诱导远位效应的方法，其包括向所述受试者施用权利要求74或权利要求75所述的药学上可接受的组合物，从而在所述受试者中诱导所述远位效应。
80.一种在患有肿瘤的受试者中诱导免疫记忆的方法，其包括向所述受试者施用权利要求74或权利要求75所述的药学上可接受的组合物，从而在所述受试者中诱导所述免疫记忆。
81.一种在受试者中诱导肿瘤的部分消退的方法，其包括向所述受试者施用权利要求74或权利要求75所述的药学上可接受的组合物，从而在所述受试者中诱导所述肿瘤的部分消退。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述部分消退是所述肿瘤尺寸缩小至少约10％、至少约25％、至少约50％或至少约75％。
83.一种在受试者中诱导肿瘤的完全消退的方法，其包括向所述受试者施用权利要求74或权利要求75所述的药学上可接受的组合物，从而在所述受试者中诱导所述肿瘤的完全消退。
84.根据权利要求83所述的方法，其中在施用所述药学上可接受的组合物后，在所述受试者中未检测到所述肿瘤。
85.一种在受试者中治疗癌症的方法，其包括
向所述受试者施用第一修饰微生物，其中所述第一修饰微生物能够生产免疫引发剂；和
向所述受试者施用第二修饰微生物，其中所述第二修饰微生物能够生产免疫维持剂，
从而在所述受试者中治疗癌症。
86.一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，其包括
向所述受试者施用第一修饰微生物，其中所述第一修饰微生物能够生产免疫引发剂；和
向所述受试者施用第二修饰微生物，其中所述第二修饰微生物能够生产免疫维持剂，
从而在所述受试者中诱导和维持所述免疫应答。
87.根据权利要求85或权利要求86所述的方法，其中所述施用步骤同时进行；其中向所述受试者施用所述第一修饰微生物发生在向所述受试者施用所述第二修饰微生物之前；或者其中向所述受试者施用所述第二修饰微生物发生在向所述受试者施用所述第一修饰微生物之前。
88.一种在受试者中治疗癌症的方法，其包括
向所述受试者施用第一修饰微生物，其中所述第一修饰微生物能够生产免疫引发剂；和
向所述受试者施用免疫维持剂，
从而在所述受试者中治疗癌症。
89.一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，其包括
向所述受试者施用第一修饰微生物，其中所述第一修饰微生物能够生产免疫引发剂；和
向所述受试者施用免疫维持剂，
从而在所述受试者中诱导和维持所述免疫应答。
90.根据权利要求88或权利要求89所述的方法，其中所述施用步骤同时进行；其中向所述受试者施用所述第一修饰微生物发生在向所述受试者施用所述免疫维持剂之前；或者其中向所述受试者施用所述免疫维持剂发生在向所述受试者施用所述第一修饰微生物之前。
91.一种在受试者中治疗癌症的方法，其包括
向所述受试者施用免疫引发剂；和
向所述受试者施用第一修饰微生物，其中所述第一修饰微生物能够生产免疫维持剂，
从而在所述受试者中治疗癌症。
92.一种在受试者中诱导和维持免疫应答的方法，其包括
向所述受试者施用免疫引发剂；和
向所述受试者施用第一修饰微生物，其中所述第一修饰微生物能够生产免疫维持剂，
从而在所述受试者中诱导和维持所述免疫应答。
93.根据权利要求91或权利要求92所述的方法，其中所述施用步骤同时进行；其中向所述受试者施用所述第一修饰微生物发生在向所述受试者施用所述免疫引发剂之前；或者其中向所述受试者施用所述免疫引发剂发生在向所述受试者施用所述第一修饰微生物之前。
94.根据权利要求77-93中任一项所述的方法，其中所述施用是瘤内注射。
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