CN111233811A - 采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，所述方法包括以下几个步骤：将原料溶解于水，上LX‑20B大孔树脂柱，洗脱，浓缩干燥，结晶提纯得产品。具有以下优点：(1)所述方法采用LX‑20B大孔树脂柱并辅助结晶的方案从茶多酚粗提物中分离高纯度EGCG单体，缩短了生产周期，提高了分离效率，减少了溶剂用量；(2)所述方法的全过程仅采用水和乙醇作为洗脱溶液，因此绿色安全无污染；(3)整个生产过程用三个梯度完成树脂的使用和再生，乙醇使用量少，降低了后续回收、浓缩的成本；(4)所得EGCG产品纯度在95％以上，EGCG总回收率大于90％，EGCG总得率大于30％，整个生产过程工艺简单，操作方便，适合工业化生产EGCG。

Description

采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯 的方法

技术领域

本发明属于食品工程技术领域，涉及一种天然产物的深加工技术，具体为采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法。

背景技术

儿茶素是茶叶中一类主要的功能活性物质，茶叶中的儿茶素类物质主要有表没食子儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)等，其中EGCG是绿茶儿茶素中含量最多的一种物质，因其具有多个酚羟基而具有广泛的良好的生物活性，现已知的EGCG的生物活性主要有抗氧化，抗癌，抗病毒，抗菌，抗炎，神经保护等。2010年卫生部和国家卫计委第17号公告已批准EGCG作为一种新食品原料，因此EGCG在食品领域也有着广泛的应用前景，目前EGCG在食品领域的应用主要有果蔬保鲜，肉类以及油脂的抗氧化，色素的护色保色以及去除异味等。此外，EGCG在医药及日化等领域也有较好的应用前景。由于茶叶中儿茶素种类多，结构接近，容易聚合、转化等因素，尚未有很好的简单、快速、低成本、环境友好的工业化生产方法。

目前已有多种方法来分离EGCG单体，主要有以下几种：

(1)吸附柱法分离EGCG

吸附柱色谱法是一种利用各组分在吸附剂上的吸附能力不同，而将不同组分分离出来的方法，常用的吸附柱主要有大孔树脂柱，凝胶柱和硅胶柱，其中大孔树脂柱分离法是工业生产EGCG的常用方法，Jin等人通过联合使用HPD826树脂柱和聚酰胺树脂柱从茶叶提取物中分离得到纯度为95.1％的EGCG(Separation and purification ofepigallocatechin-3-gallate(EGCG)from green tea using combined macroporousresin and polyamide column chromatography[J].Journal of Chromatography B,2015,1002:113-122.),但大孔树脂柱分离EGCG也存在着洗脱步骤复杂，溶剂用量大，成本高等缺点，其他吸附柱如凝胶柱和硅胶柱在使用时常用到有毒有害试剂而难以应用在工业中。

(2)制备型高效液相色谱法分离EGCG

茶叶粗提物或茶多酚粗提物通常先经过预处理除去其中的杂质，然后通过制备高效液相色谱分理出儿茶素单体。Kang等人用C18制备柱纯化儿茶素粗提物中的EGCG，所得EGCG纯度大于98％(KANG J H,CHUNG S T,GO J H,et al.Separation ofEpigallocatechin Gallate from Korean Green Tea by Rp-Hplc[J].Journal ofLiquid Chromatography&Related Technologies,2006,23(17):2739-49.)。制备高效液相法具有分离周期短，所得产品纯度高等优点，但同时也存在着载样量小，成本高，所用溶剂毒性较高等缺点，常应用于实验室制备少量儿茶素单体或是儿茶素标准品的制备中。

(3)逆流毛细管色谱法分离EGCG

逆流毛细管色谱是一种液-液色谱，它使用液体作为流动相和固定相，利用样品在两相之间的分配系数不同实现分离。逆流色谱法的优势在于避免了目标化合物的化学降解，固定相上的不可逆吸附现象，以及分离过程中的样品损失，但也存在诸如溶剂使用的安全性，成本昂贵，载样量相对较小等缺点。

(4)移动床色谱法分离EGCG

模拟移动床单元有两个入口：进料口和解吸液口，两个出口：萃取液口和萃余液口，将整个系统分为四个标准区域。通过周期性地在液体流动方向上切换入口和出口，模拟了固定相相对于流动相的伪逆流运动，因此，保留最少的组分随流动相向前移动，而保留最多的组分与固定相一起向后移动。结果，二元混合物可以连续地从萃余液端口和萃取液端口流出分离。中国专利201710307512.6中公开了一种用模拟移动床色谱制备高纯度EGCG的方法，所得EGCG纯度在95％以上，回收率可达80％。模拟移动床色谱法具低溶剂消耗，连续过程，高纯度产物和高生产率等优点，但要选择合适的洗脱剂，对转换物料的旋转阀要求较高。

(5)分子印迹法分离EGCG

分子印迹法需要选择合适的功能性单体与印迹分子形成复合物，在引发剂和交联剂的作用下形成聚合物网络，再通过合适的溶剂洗去印迹分子，得到具有和印迹分子相匹配的聚合物网络，这种网络能够特异性识别印迹分子，产生吸附，从而将不同的物质分离开来，张春静等人制备的EGCG分子印迹复合膜成功地将EGCG纯度提升至93％(张春静,钟世安.乙酸纤维-EGCG分子印迹复合膜分离纯化茶多酚中的EGCG[J].膜科学与技术,2008,05):100-2+9.)。分子印迹技术具有选择性强，制备简单，溶剂消耗量小，稳定性好等优势，但在功能单体，交联剂和引发剂的选择上也存在着安全性和局限性。

中国专利CN201410455555.5公开了一种从茶叶中分离制备EGCG的方法，该方法包括以下步骤：茶叶原料用温水浸提，浸提液过大孔树脂柱，再上聚酰胺树脂柱，得到的液体浓缩、结晶、抽滤、洗涤、真空干燥即得。本发明所述方法用连续色谱柱进行纯化，即将大孔树脂装入柱子后，让料液流过柱子将大孔树脂得到的15-30％乙醇解析液通过聚酰胺树脂柱，选择70-85％的乙醇进行洗脱，获得EGCG的洗脱液。洗脱液除去乙醇并进一步浓缩结晶，最终获得EGCG产品。但是该专利存在以下缺陷：(1)采用温水浸泡茶鲜叶获取茶多酚原料，其原料中EGCG纯度较低，对于提取高纯度的EGCG不利；(2)采用大孔树脂柱和聚酰胺树脂柱联用的方式，易造成EGCG提取过程中的损失，且延长了整个工艺的时长。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，解决现有儿茶素单体分离技术中常用甲醇、酸碱等溶剂，毒性大，溶剂使用量大，步骤多，生产成本高以及无法获得高纯度EGCG等缺点，本发明经过大量研究提供了采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法。

技术方案：采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1：将茶叶提取物原料溶解于纯净水中，得到茶叶水提物溶液；

步骤2：将步骤1所得溶液上样至LX-20B大孔树脂柱；

步骤3：依次用纯净水、2个浓度梯度的乙醇洗脱步骤2的大孔树脂柱，并分别收集洗脱液；

步骤4：将步骤3中收集的各洗脱液经减压浓缩后进行真空干燥得固体粉末；

步骤5：将步骤4得到的固体粉末配制成过饱和溶液，在4℃下进行结晶处理，将得到的晶体洗涤干燥，得到高纯度的表没食子儿茶素没食子酸酯白色粉末。

优选的，步骤3洗脱的具体方法为：用纯净水先洗脱1-3个柱体积，收集洗脱液，称为组分1，接着用20％-25％的乙醇洗脱1-1.5个柱体积，收集洗脱液，称为组分2，继续用相同浓度的乙醇洗脱3-4个柱体积，收集洗脱液称为组分3，再用80％以上的乙醇洗脱3-4个柱体积后停止洗脱，收集洗脱液，称为组分4，最后用纯水洗脱2-4个柱体积，使柱系统恢复再用。

进一步的，步骤5中配制过饱和溶液采用组分3的固体粉末，且步骤5得到的表没食子儿茶素没食子酸酯纯度在95％以上。

优选的，步骤1中茶叶提取物溶液浓度w/v为20％-40％。

优选的，步骤1中茶叶提取物包括茶叶用纯水或者乙醇等有机溶剂提取得到的原料，其中EGCG纯度为30％-70％。

优选的，步骤2中LX-20B大孔树脂柱的高径比为15:1。

优选的，步骤2中LX-20B大孔树脂柱中的上样量w/v(茶叶提取物w/树脂柱体积v)为5％-8％，上样流速为每小时0.5-1.5个柱体积。

优选的，步骤3中的洗脱流速为每小时洗脱0.5-1.5个柱体积。

优选的，步骤5中过饱和溶液的浓度w/w为45％-55％。

优选的，所述方法对表没食子儿茶素没食子酸酯的总回收率大于90％，EGCG总得率大于30％。

有益效果：(1)本发明所述方法采用LX-20B大孔树脂柱并辅助采用结晶的方案从茶多酚粗提物中分离高纯度EGCG单体，缩短了生产周期，提高了分离效率，减少了溶剂用量；(2)所述方法的全过程仅采用水和乙醇作为洗脱溶液，因此绿色安全无污染；(3)整个生产过程用三个梯度完成树脂的使用和再生，乙醇使用量少，降低了后续回收、浓缩的成本；(4)所得EGCG产品纯度在95％以上，EGCG总回收率大于90％，EGCG总得率大于30％，整个生产过程工艺简单，操作方便，适合工业化生产EGCG。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

根据本发明实施例1的一种高纯度EGCG的制备方法，包含以下步骤：

步骤1：以含有45％EGCG的茶叶提取物为原料，取该原料60g，用240mL纯净水完全溶解；

步骤2：将LX-20B大孔树脂预经预处理后装入层析柱内，装柱体积为1200mL，控制其高径比为15:1，用水洗至流出液不浑浊为止；

步骤3：湿法上样：将茶多酚粗提物溶液上样至层析柱内，流速为600mL/h；

步骤4：用水洗脱2400mL，收集洗脱液，称为组分1，再用20％乙醇洗脱1600mL，收集洗脱液，称为组分2，继续用20％乙醇洗脱3600mL，收集洗脱液，称为组分3，最后用95％乙醇洗脱3600mL，收集洗脱液，称为组分4，整个洗脱过程的流速控制在600mL/h，各组分经减压浓缩后真空干燥的固体粉末，其中组分3中EGCG纯度为77.68％，EGCG总回收率为97.83％，EGCG得率为61.20％；

步骤5：将步骤4得到的组分3固体粉末配置成室温下浓度为50％(w/w)的过饱和溶液，于4℃下结晶7天，将晶体过滤洗涤干燥，得到纯度为95.34％的EGCG产品9.47g，EGCG总得率为35.07％。

实施例2

根据本发明实施例2的一种高纯度EGCG的制备方法，包含以下步骤：

步骤1：以含有35％EGCG的茶叶提取物为原料，取该原料36g，用108mL纯净水完全溶解；

步骤2：将LX-20B大孔树脂预经预处理后装入层析柱内，装柱体积为600mL，控制其高径比为15:1，用水洗至流出液不浑浊为止；

步骤3：湿法上样：将茶多酚粗提物溶液上样至层析柱内，流速为900mL/h；

步骤4：用水洗脱600mL，收集洗脱液，称为组分1，再用25％乙醇洗脱700mL，收集洗脱液，称为组分2，继续用25％乙醇洗脱2100mL，收集洗脱液，称为组分3，最后用95％乙醇洗脱1800mL，收集洗脱液，称为组分4，整个洗脱过程的流速控制在900mL/h，各组分经减压浓缩后真空干燥的固体粉末，其中组分3中EGCG纯度为76.27％，EGCG总回收率为97.26％，EGCG得率为58.53％；

步骤5：将步骤4得到的组分3固体粉末配置成室温下浓度为45％(w/w)的过饱和溶液，于4℃下结晶7天，将晶体过滤洗涤干燥，得到纯度为96.01％的EGCG产品3.93g，EGCG总得率为31.19％。

实施例3

根据本发明实施例3的一种高纯度EGCG的制备方法，包含以下步骤：

步骤1：以含有40％EGCG的茶叶提取物为原料，取该原料15g，用40mL纯净水完全溶解；

步骤2：将LX-20B大孔树脂预经预处理后装入层析柱内，装柱体积为180mL，控制其高径比为15:1，用水洗至流出液不浑浊为止；

步骤3：湿法上样：将茶多酚粗提物溶液上样至层析柱内，流速为180mL/h；

步骤4：用水洗脱360mL，收集洗脱液，称为组分1，再用25％乙醇洗脱200mL，收集洗脱液，称为组分2，继续用25％乙醇洗脱540mL，收集洗脱液，称为组分3，最后用95％乙醇洗脱540mL，收集洗脱液，称为组分4，整个洗脱过程的流速控制在180mL/h，各组分经减压浓缩后真空干燥的固体粉末，其中组分3中EGCG纯度为74.45％，EGCG总回收率为95.58％，EGCG得率为56.37％；

步骤5：将步骤4得到的组分3固体粉末配置成室温下浓度为55％(w/w)的过饱和溶液，于4℃下结晶7天，将晶体过滤洗涤干燥，得到纯度为95.24％的EGCG产品1.87g，EGCG总得率为31.17％。

Claims (10)

1.采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1：将茶叶提取物原料溶解于纯净水中，得到茶叶水提取溶液；

步骤2：将步骤1所得溶液上样至LX-20B大孔树脂柱；

步骤3：依次用纯净水、2个浓度梯度的乙醇洗脱步骤2的大孔树脂柱，并分别收集洗脱液；

步骤4：将步骤3中收集的各洗脱液经减压浓缩后进行真空干燥得固体粉末；

步骤5：将步骤4得到的固体粉末配制成过饱和溶液，在4℃下进行结晶处理，将得到的晶体洗涤干燥，得到高纯度的表没食子儿茶素没食子酸酯白色粉末。

2.根据权利要求1所述的采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，步骤3洗脱的具体方法为：用纯净水先洗脱1-3个柱体积，收集洗脱液，称为组分1，接着用20％-25％的乙醇洗脱1-1.5个柱体积，收集洗脱液，称为组分2，继续用相同浓度的乙醇洗脱3-4个柱体积，收集洗脱液称为组分3，再用80％以上的乙醇洗脱3-4个柱体积后停止洗脱，收集洗脱液，称为组分4，最后用纯水洗脱3-4个柱体积，使系统恢复再用。

3.根据权利要求2所述的采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，步骤5中配制过饱和溶液采用组分3的固体粉末，且步骤5得到的表没食子儿茶素没食子酸酯纯度在95％以上。

4.根据权利要求1或2所述的采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，步骤1中，茶叶提取物为茶叶用纯水或乙醇提取得到的原料，其中EGCG纯度为30％-70％。

5.根据权利要求1或2所述的采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，步骤1中茶叶提取物溶液浓度w/v为20％-40％。

6.根据权利要求1或2所述的采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，步骤2中LX-20B大孔树脂柱的高径比为15:1。

7.根据权利要求1或2所述的采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，步骤2中LX-20B大孔树脂柱中的上样量，茶叶提取物w/树脂柱体积v，为5％-8％，上样流速为每小时0.5-1.5个柱体积。

8.根据权利要求1或2所述的采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，步骤3中的洗脱流速为每小时洗脱0.5-1.5个柱体积。

9.根据权利要求1或2所述的采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，步骤5中过饱和溶液的浓度w/w为45％-55％。

10.根据权利要求1或2所述的采用大孔树脂一步法制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，所述方法对表没食子儿茶素没食子酸酯的总回收率大于90％，EGCG总得率大于30％。