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CN111239412A - 聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法 - Google Patents

聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法 Download PDF

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CN111239412A
CN111239412A CN202010064305.4A CN202010064305A CN111239412A CN 111239412 A CN111239412 A CN 111239412A CN 202010064305 A CN202010064305 A CN 202010064305A CN 111239412 A CN111239412 A CN 111239412A
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CN
China
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protein
hepatocellular carcinoma
focusing
chip
liver cancer
Prior art date
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Pending
Application number
CN202010064305.4A
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English (en)
Inventor
张舒
高强
毕利军
李阳
刘羽鸣
杨思贤
刘诚喜
董良庆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhongshan Hospital Fudan University
Original Assignee
Zhongshan Hospital Fudan University
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Publication date
Application filed by Zhongshan Hospital Fudan University filed Critical Zhongshan Hospital Fudan University
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/57525—
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Abstract

本发明提供了一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，采用含有21154个重组蛋白的HuProtTM人类蛋白质组芯片对肝癌血清自身抗体进行筛选，比较和评价。本发明确定了有一定区分能力或组合区分能力的候选生物标志物，并构建了聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片(HCC Focused Arrays)，为规模化检测血清样本和建立有效肝癌诊断模型提供了强有力的技术手段。

Description

聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，与应用性基础医学研究和临床研究相联系；涵盖肿瘤学、诊断学，蛋白质组学和免疫学。
背景技术
肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，简称：HCC)是常见的恶性肿瘤之一,其发病隐匿,恶性程度高,病死率高,因此及时准确的诊断对于提高患者的生存率至关重要。目前临床上主要运用甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,简称：AFP)结合影像学及病理学检查进行肝癌的早期诊断；但是AFP对于肝癌筛查的特异性及敏感性均不十分理想。随着分子生物学的不断发展，多种新的标志物被相继发现，特别是自身抗体的诊断价值。
自身抗体是机体针对肿瘤异常抗原发生免疫响应而产生的特异性抗体，具有以下特点：(1)伴随肿瘤的发生过程产生，先于临床症状，适用于早期诊断；(2)自身抗体的产生是免疫反应的结果，经过免疫系统的放大，抗体比起蛋白更容易检测；(3)具有特定类型肿瘤特异性。研究发现存在一些抗原是肿瘤特有的，但不同肿瘤间无特异性，如p53；也有一些抗原是特定肿瘤特异性的，比如前列腺癌的很多抗原是氧化应激相关的蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，为规模化检测血清样本和建立有效肝癌诊断模型提供强有力的技术手段。
本发明提供的一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，采用含有21154个重组蛋白的HuProtTM人类蛋白质组芯片对肝癌和健康人血清进行筛选，通过响应的数据比对和分析，确定候选生物标志物，点制聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片。
进一步的，本发明的一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，为了消除不同样品、不同芯片之间的系统性差异带来的误差，进行了芯片内和芯片间归一化处理。芯片内归一化：为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，实现方式为每个蛋白的前景值与背景值比值，即F/B，并此基础上定义SNR(信噪比)，即两个重复蛋白的F/B的均值。芯片间归一化：由于实验样本及实验操作带来的系统性误差，芯片之间直接进行数据比对可能导致结果的不确定性，故在数据比对前对SNR进行片间归一化处理，实现方法为中位值线性归一化。
进一步的，本发明提供的一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，在归一化基础上，对数据进行统计学分析，以筛选出肝癌组特异性高响应蛋白，分析逻辑如下：
①参数检验t检验，p-value<0.05即认为两者存在显著性差异；
②计算组间差异倍数，fold change≥1.2时，即认为两者存在潜在差异；
③以健康组样本为对象设置cut off＝mean+2SD(99％CI)，并计算HCC阳性率，以10％作为最低筛选标准。
进一步的，本发明筛选出候选生物标志物。
进一步的，本发明优选筛选出100个有一定区分能力或组合区分能力的候选生物标志物。
进一步的，本发明利用人源重组蛋白质，点制HCC Focused Arrays。
本发明方法制备的聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片经过检测，芯片无漏点；其中,myc蛋白信噪比最低。但myc蛋白信噪比为BSA的7倍，可知myc蛋白点样合格，且其他蛋白均点样合格。通过重复蛋白的信号值绘制散点图，并进行线性拟合，拟合结果中R2值为0.99，说明芯片制备合格，为规模化检测血清样本和建立有效肝癌诊断模型提供了强有力的技术手段。
本发明的有益效果是：基于HuProtTM人类全蛋白质组芯片平台进行筛选，进而建立聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片。相较于全蛋白组芯片，这种小芯片平台利于标准化和规模化的验证，降低成本；相较于其它检测手段，这种小芯片平台利于高通量和高效率的分析。
本研究采用含有21154个重组蛋白的HuProtTM人类蛋白质组芯片对肝癌血清自身抗体进行筛选，比较和评价。HuProtTM人类蛋白质组芯片是目前最高通量的芯片，蛋白质大部分是基因全长序列，部分是不同剪切体形式，通过高通量重组蛋白质制备方式获得，表达宿主是酵母，纯化方式为GST标签亲和纯化。使用HuProtTM人类蛋白质组芯片针对肝癌血清和健康血清进行检测，单独分析每个蛋白，设置合适的cut off值，计算肝癌组阳性率，并计算fold change和p-value,确定肝癌相关抗原候选物。通过HuProtTM人类蛋白质组芯片筛选获得的初步候选肝癌相关抗原，一并构建HCC Focused Arrays。本发明方法制备的聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片为规模化检测血清样本和建立有效肝癌诊断模型提供了强有力的技术手段。
附图说明
图1为HuProtTM蛋白质组芯片检测原理图；
图2为HuProtTM蛋白质组芯片的SNR值归一化前后的boxplot展示图；
图3为候选生物标志物举例图：红色虚线为样本组分割线，前半部分为HCC组；后部分为健康对照组；红色实线为cut off值，超过的样本表示阳性。标题为蛋白名称和抗体类型；
图4为HCC Focused Arrays构建及100个人源重组蛋白质列表；
图5为重复蛋白的信号值绘制散点图，进行线性拟合，拟合结果中R2值为0.99，说明芯片制备合格。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步的描述。根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
HuProtTM人类蛋白质组芯片检测肝癌和健康对照血清
(1)每一个血清样品使用1张HuProtTM蛋白质组芯片进行检测，特异性的抗体(包括IgG、IgM)与固定于芯片上的蛋白进行结合，清洗去除未结合的抗体和其它蛋白质，再用抗人IgM荧光标记二抗(cy5标记，呈现红色)和抗人IgG荧光二抗(cy3标记，呈现绿色)检测，通过荧光扫描仪读取信号，信号的强弱与抗体的亲和力和数量呈正相关。
(2)共计检测了50例肝癌和50例健康对照血清。为了消除不同样品、不同芯片之间的系统性差异带来的误差，进行了芯片内和芯片间归一化处理。芯片内归一化：为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，实现方式为每个蛋白的前景值与背景值比值，即F/B，并此基础上定义SNR(信噪比)，即两个重复蛋白的F/B的均值。芯片间归一化：由于实验样本及实验操作带来的系统性误差，芯片之间直接进行数据比对可能导致结果的不确定性，故在数据比对前对SNR进行片间归一化处理，实现方法为中位值线性归一化。
HuProtTM蛋白质组芯片的SNR值归一化前后的boxplot展示图见图2。图中：红色为HCC组，黑色为健康对照组；其中纵坐标为SNR值大小，横坐标为各个样本。
实施例2
构建HCC Focused Arrays。
(1)在归一化基础上，对数据进行统计学分析，以筛选出肝癌组特异性高响应蛋白，分析逻辑如下：
参数检验t检验，p-value<0.05即认为两者存在显著性差异；
计算组间差异倍数，fold change≥1.2时，即认为两者存在潜在差异；
以健康组样本为对象设置cut off＝mean+2SD(99％CI)，并计算HCC阳性率，以10％作为最低筛选标准；
共计筛选出100个有一定区分能力或组合区分能力的候选生物标志物。
候选生物标志物举例见图3：红色虚线为样本组分割线，前半部分为HCC组；后部分为健康对照组；红色实线为cut off值，超过的样本表示阳性。标题为蛋白名称和抗体类型。
HCC Focused Arrays构建及100个人源重组蛋白质列表见图4。
(2)利用这100个人源重组蛋白质，点制HCC Focused Arrays。经过检测，芯片无漏点；其中,myc蛋白信噪比最低。但myc蛋白信噪比为BSA的7倍，可知myc蛋白点样合格，且其他蛋白均点样合格。通过重复蛋白的信号值绘制散点图，并进行线性拟合，拟合结果中R2值为0.99，说明芯片制备合格。重复蛋白的信号值绘制散点图见图5。

Claims (6)

1.一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，其特征在于采用含有21154个重组蛋白的HuProtTM人类蛋白质组芯片对肝癌和健康人血清进行筛选，通过响应的数据比对和分析，确定候选生物标志物，点制聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片。
2.权利要求1所述的一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，其特征在于其中的数据比对前进行芯片内和芯片间归一化处理。
3.权利要求2所述的一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，其特征在于其中的芯片内归一化实现方式为每个蛋白的前景值与背景值比值，即F/B，并此基础上定义SNR信噪比，即两个重复蛋白的F/B的均值。
4.权利要求2所述的一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，其特征在于其中的芯片间归一化，实现方法为中位值线性归一化。
5.权利要求1所述的一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，其特征在于其中的通过响应的数据比对和分析为：在归一化基础上，对数据进行统计学分析，以筛选出肝癌组特异性高响应蛋白，分析逻辑如下：①参数检验t检验，p-value<0.05即认为两者存在显著性差异；②计算组间差异倍数，fold change≥1.2时，即认为两者存在潜在差异；③以健康组样本为对象设置cut off＝mean+2SD(99％CI)，并计算HCC阳性率，以10％作为最低筛选标准。
6.权利要求1所述的一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，其特征在于其中的候选生物标志物为100个有一定区分能力或组合区分能力的候选生物标志物。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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Application publication date: 20200605

Assignee: SHANGHAI PHARMACEUTICALS HOLDING Co.,Ltd.

Assignor: ZHONGSHAN HOSPITAL, FUDAN University

Contract record no.: X2022310000119

Denomination of invention: Preparation method of protein chiplets focusing on hepatocellular carcinoma

License type: Common License

Record date: 20220922

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200605

RJ01 Rejection of invention patent application after publication