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CN111235035A - 一种裂殖壶菌突变株及其用于制备二十二碳六烯酸油脂的方法和应用 - Google Patents

一种裂殖壶菌突变株及其用于制备二十二碳六烯酸油脂的方法和应用 Download PDF

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CN111235035A
CN111235035A CN201911399018.2A CN201911399018A CN111235035A CN 111235035 A CN111235035 A CN 111235035A CN 201911399018 A CN201911399018 A CN 201911399018A CN 111235035 A CN111235035 A CN 111235035A
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schizochytrium
docosahexaenoic acid
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汪志明
陆姝欢
余超
李慕梓
杨艳红
李翔宇
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Cabio Biotech Wuhan Co Ltd
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Cabio Biotech Wuhan Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种裂殖壶菌突变株及其用于制备二十二碳六烯酸油脂的方法和应用，该菌株于2019年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCCM2019990。本发明采用紫外诱变结合离子束诱变技术，通过高通量培养以及裂殖壶菌的沉降特性，筛选获得了裂殖壶菌突变株CCTCCM2019990，并将该突变株用于生产二十二碳六烯酸油脂，得到的二十二碳六烯酸油脂中长链饱和脂肪酸含量低，C18:0的含量最低至0.4wt％，C16:0的含量最低至12.5wt％，DHA含量最高可达57.08wt％，更加有利于糖尿病人群的摄入。

Description

一种裂殖壶菌突变株及其用于制备二十二碳六烯酸油脂的方 法和应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种裂殖壶菌突变株及其用于制备二十二碳六烯酸油脂的方法和应用。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病时长期存在的高血糖，会导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。老年人、男性、城市居民、经济发达地区居民、超重和肥胖者的糖尿病患病率更高。
糖尿病分为1型和2型糖尿病，胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要病理生理特征之一，已有众多研究表明以DHA为首的n-3多不饱和脂肪酸可以通过多种分子机制如调节免疫、减少炎症因子的释放，进而改善2型糖尿病脂质代谢,提高胰岛素敏感性,从而有利于防治糖尿病及并发症，另外DHA的膳食摄入还能够有效维持膳食平衡、防御心血管等慢性疾病.
目前DHA的主要来源为海洋微生物所产油脂，所涉及的海洋微生物有破囊壶菌、裂殖壶菌等。微生物油脂中除了多不饱和脂肪酸之外，还含有大量的长链饱和脂肪酸，尤其是棕榈酸C16:0，含量通常高于2wt％，在某些微生物所产的油脂中C16:0高达50wt％。有证据表明过多摄入长链饱和脂肪酸可使体内脂质积聚引起脂毒性，导致骨骼肌、脂肪组织和肝脏的胰岛素抵抗。另外，有研究通过敲除小鼠的长链脂肪酸延长酶6，引起脂肪酸组成的比例和改变，恢复其胰岛素敏感性，表明长链脂肪酸延长酶可能是胰岛素抵抗、糖尿病、心血管疾病及其他代谢疾病治疗的潜在靶点。这些研究说明，内源性和外源性长链脂肪酸，均会对2型糖尿病产生负面影响。
由于此类糖尿病风险人群存在高油的饮食习惯，摄入DHA的同时减少长链饱和脂肪酸的摄入，就成了此类人群的迫切需求，而高含量的DHA油脂可以在满足DHA正常摄入量的情况下，尽可能的减少C16：0以及其他长链饱和脂肪酸的摄入。因此急需开发一种DHA含量丰富而长链饱和脂肪酸，尤其是棕榈酸C16:0含量较低的DHA微生物油脂。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种裂殖壶菌突变株及其用于制备二十二碳六烯酸油脂的方法和应用。
第一方面，本发明提供一种裂殖壶菌突变株(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-Ⅱ，其保藏信息如下：保藏编号为CCTCCM2019990；分类命名为：Schizochytrium sp.；保藏单位为中国典型培养物保藏中心；保藏地址中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072；保藏日期为2019年12月2日。
本发明采用紫外诱变结合离子束诱变技术，通过高通量培养以及裂殖壶菌的沉降特性，筛选获得了一种裂殖壶菌突变株，通过培养特征、显微形态特征、生理生化特征和遗传特征，确定裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ符合裂殖壶菌株的特征。
本发明提供的裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ生理特征如下：
(1)营养细胞为单细胞，近球形，直径4-11μm，进行典型的二分裂方式增殖；
(2)在液体培养中，菌体一般聚集成大的集合体；
(3)最适宜培养温度为25℃。
本发明进一步提供包含上述裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ的菌剂。
第二方面，本发明提供利用上述裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ或菌剂生产二十二碳六烯酸油脂的方法，包括：将上述裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ或菌剂发酵，收集发酵产物进行分离纯化。
作为一种优选的实施方式，本发明提供一种利用上述裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ或菌剂生产二十二碳六烯酸油脂的方法，具体步骤如下：
(1)种子活化培养：将上述裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ或上述菌剂接种于活化培养基中振摇培养获得种子活化培养液；
(2)种子扩大培养：将上述步骤(1)振摇培养的种子培养液接种到扩大培养基中振摇培养获得种子扩大培养液；
(3)发酵培养：将上述步骤(2)振摇培养的种子培养液接种到装有发酵培养基的发酵瓶中发酵培养；
或根据最终发酵罐的大小，将上述步骤(2)摇瓶培养的种子培养液逐级扩大培养，获得种子扩大培养液，然后接种到发酵罐中进行发酵培养。
(4)将发酵液经后处理得到二十二碳六烯酸油脂。
进一步地，所述的步骤(1)为：将上述裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ接种到活化培养基中培养，培养温度25-30℃，摇床振摇转速为150-250r/min，培养时间40-48h，所述活化培养基为：葡萄糖10-20g/L，谷氨酸钠20-30g/L，酵母浸膏5-10g/L，氯化钠10-20g/L，硫酸镁0.5-1g/L，pH自然。
进一步地，所述的步骤(2)为：当步骤(1)中种子活化培养液菌浓达到3-6％(体积浓度)时，按照5-20％(体积比)接种量接种到扩大培养基中进行培养，培养温度25-30℃，培养时间32-48h，摇床振摇转速为150-250转/分钟，所述摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖30-50g/L，谷氨酸钠20-40g/L，酵母浸膏5-10g/L，氯化钠10-20g/L，硫酸镁5-10g/L，磷酸二氢钾5-10g/L，氯化钙0.5-1g/L，pH自然。
进一步地，所述步骤(3)也可以是：根据最终发酵罐的大小，将上述步骤(2)摇瓶培养的种子培养液逐级扩大培养，获得种子扩大培养液，当种子扩大培养液的菌浓达到3％～6％(体积浓度)时，接种到发酵罐中进行发酵培养，接种量10-20％(体积比)，发酵罐温度25-30℃，搅拌速度100-250转/分钟，通气量0.5-2vvm(L/L·min)即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为1-2L，罐压0.05-0.1Mpa，培养96-120h，所述发酵罐中的发酵培养基为：葡萄糖40-60g/L，酵母浸膏4-6g/L，谷氨酸钠20-40g/L，氯化钠1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，硫酸镁5-10g/L，氯化钙0.5-1g/L，碳酸氢钠0.5-1g/L，硫酸钠5-10g/L，硫酸铵5-20g/L，氯化钾0.5-1g/L，pH自然。
在一种更为优选的实施方式中，步骤(3)可以在发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中碳源浓度在5-20g/L。
在一种更为优选的实施方式中，步骤(3)可以在发酵过程中通过补加柠檬酸或者盐酸，来控制发酵液的pH值在6-8之间。
进一步地，所述步骤(4)的后处理为将发酵液中菌体经碱性蛋白酶破壁后，然后加入萃取剂提取。
上述菌浓是将培养液离心后下层菌体的体积占总体系体积的比例。
以此方法得到的二十二碳六烯酸油脂中C16:0含量低于15.50％，长链饱和脂肪酸C16:0和C18:0含量低于16.01wt％，DHA含量高于50.40％。
第三方面，本发明提供上述裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ和菌剂在制备二十二碳六烯酸油脂中的应用。
进一步地，所述二十二碳六烯酸油脂中C16:0的含量低于15.50wt％，优选低于15.00wt％，进一步优选低于14.12wt％，更进一步优选低于12.50wt％。
进一步地，所述二十二碳六烯酸油脂中C18:0的含量低于0.51wt％，优选低于0.41wt％，进一步优选低于0.40wt％。
进一步地,所述二十二碳六烯酸油脂中长链饱和脂肪酸C16:0和C18:0的含量之和低于16.01wt％，优选低于15.41wt％，进一步优选低于14.52wt％，更进一步优选低于12.90wt％。
进一步地，所述二十二碳六烯酸油脂中DHA含量高于50.40wt％，优选高于52.37wt％，进一步优选高于54.90wt％，更进一步优选高于57.08wt％。
本发明进一步提供上述裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ和上述菌剂和上述二十二碳六烯酸油脂在制备食品、饲料、化妆品或药物中的应用。
本发明进一步提供一种微生物油，所述微生物油中二十二碳六烯酸油脂含量至少为50％，所述二十二碳六烯酸油脂中的长链饱和脂肪酸C16:0的含量低于15.50wt％，优选低于15.00wt％，进一步优选低于14.12wt％，更进一步优选低于12.50wt％。
本发明提供一种裂殖壶菌突变株及其用于制备二十二碳六烯酸油脂的方法和应用，具有如下有益效果：
本发明采用紫外诱变结合离子束诱变技术，通过高通量培养以及裂殖壶菌的沉降特性，筛选获得了一种裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ，利用该突变株生产的二十二碳六烯酸油脂中长链饱和脂肪酸C16：0和C18：0的含量低于16.01wt％，随着发酵状态趋于稳定和适宜，更进一步，可低于15.41wt％，也可低于14.52wt％，最低至12.90％，且DHA含量至少高于50.40wt％，最高可达到57.08wt％。本发明的优点在于所述突变株生产的微生物油脂中长链饱和脂肪酸含量低，更加有利于糖尿病人群的摄入。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的裂殖壶菌突变株(Schizochytrium sp)CABIO-A-2-Ⅱ生长繁殖过程在显微镜下观察的结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1裂殖壶菌突变株的选育
本实施例提供一种裂殖壶菌突变株的选育方法，具体步骤如下：
(1)以从海水中筛选分离得到的裂殖壶菌为出发菌株，该菌株自山东省黄海水域得到。
(2)将菌种接到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养48h至对数生长期。
(3)取1ml上述步骤(2)的活化种子培养液注入到无菌培养皿上经过紫外灯照射,紫外灯照射距离为30厘米，照射时间为60秒，紫外灯的功率为30瓦。
(4)经过紫外诱变后的菌液经无菌风风干，成为菌斑。将含菌斑的培养皿无菌移入高能粒子束注入机中，经过能量为20KeV的高能N+离子束注入诱变，N+离子束注入剂量为100*1017ions/cm2。
(5)将上述诱变处理后的菌膜用无菌水洗脱，稀释，涂布于活化培养基平板上进行培养，所述固体活化培养基为：葡萄糖10g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠20g/L，硫酸镁0.5g/L，琼脂粉20g/L，pH自然。收集诱变后的单菌落，用牙签点接到装有发酵培养基的多孔板中进行培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养96h；将多孔板中的发酵液转移到玻璃试管中，静置沉降，观察分层情况；选取细胞沉降慢的单菌落发酵液进行检测分析；将筛选出来的细胞进行真空干燥，取20mg样品进行脂肪酸成分分析，将脂肪酸组成中长链饱和脂肪酸含量低于20wt％，DHA含量高于35wt％的单菌落作为下一步诱变的出发菌株。所述发酵培养基为：葡萄糖40-60g/L，酵母浸膏4-6g/L，谷氨酸钠20-40g/L，氯化钠1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，硫酸镁5-10g/L，氯化钙0.5-1g/L，碳酸氢钠0.5-1g/L，硫酸钠5-10g/L，硫酸铵5-20g/L，氯化钾0.5-1g/L，pH自然。
本实施例经过多次诱变筛选，获得一株长链饱和脂肪酸含量低的突变株，将该菌株连续传代培养10次，其棕榈酸C16:0最低含量可达到12.50wt％，硬脂酸C18:0最低含量可达到含量为0.40wt％，DHA含量最高可大达到56.68wt％，即为本发明的裂殖壶菌突变株(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-Ⅱ，该菌株于2019年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学；邮编：430072，保藏号为CCTCCM2019990，分类命名为：Schizochytrium sp.。
上述裂殖壶菌菌株CABIO-A-2-Ⅱ具有以下特性：
(1)营养细胞为单细胞，近球形，直径4-11μm，进行典型的二分裂方式增殖，在显微镜下的生长状态如图1所示；
(2)在液体培养中，菌体一般聚集成大的集合体；
(3)最适宜培养温度为25℃。
实施例2利用裂殖壶菌突变株生产二十二碳六烯酸
本实施例利用实施例1步骤(1)筛选分离得到的出发菌株生产二十二碳六烯酸，具体方法如下：
(1)种子活化培养：出发菌株接种到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养时间48h，所述活化培养基为：葡萄糖10g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠20g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。
(2)种子扩大培养：将上述步骤(1)振摇培养的活化种子培养液按照10％(体积比)接种量接种到扩大培养基中进行培养，培养温度28℃，培养时间48h，摇床振摇转速为200转/分钟，所述摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖40g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钙0.5g/L，pH自然。
(3)发酵瓶培养：将上述步骤(2)振摇培养的扩大种子培养液按照10％(体积比)接种量接种到装有发酵培养基的发酵瓶中发酵培养，培养温度28℃，培养时间120h，摇床振摇转速为220转/分钟，所述发酵培养基为：葡萄糖40g/L，酵母浸膏4g/L，谷氨酸钠30g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁5g/L，氯化钙0.5g/L，碳酸氢钠0.5g/L，硫酸钠8g/L，硫酸铵6g/L，氯化钾0.5g/L，pH自然。
(4)后处理：将发酵培养得到的发酵液经碱性蛋白酶破壁后，加入萃取剂正己烷进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取，如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200毫升正己烷，之后每次加入150毫升正己烷，将每次萃取充后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油酯。
(5)气相色谱分析：对步骤(4)得到的微生物油脂进行气相色谱分析，得到如表1所示结果：
表1对照实施例2所得DHA油脂中各脂肪酸含量
脂肪酸组成 含量(wt％)
14:0 5.37％
16:0 28.50％
18:0 0.91％
18:1 0.40％
18:2 0.91％
20:4n6 2.50％
20:5n3(EPA) 1.79％
22:5n6 17.36％
22:5n3 1.30％
22:6n3(DHA) 39.90％
本实施例用出发菌株所制备的DHA油脂中，棕榈酸C16:0含量为28.50wt％，硬脂酸C18:0含量为0.91wt％，长链脂肪酸含量为29.41wt％，DHA含量为39.9wt％。
实施例3利用裂殖壶菌突变株生产二十二碳六烯酸
本实施例利用实施例1得到的裂殖壶菌突变株生产二十二碳六烯酸，具体方法如下：
(1)种子活化培养：将实施例1的裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ接种到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养时间48h，所述活化培养基为：葡萄糖10g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠20g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。
(2)种子扩大培养：将上述步骤(1)振摇培养的活化种子培养液按照10％(体积比)接种量接种到扩大培养基中进行培养，培养温度28℃，培养时间48h，摇床振摇转速为200转/分钟，所述摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖40g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钙0.5g/L，pH自然。
(3)发酵瓶培养：将上述步骤(2)振摇培养的扩大种子培养液按照10％(体积比)接种量接种到装有发酵培养基的发酵瓶中发酵培养，培养温度28℃，培养时间120h，摇床振摇转速为220转/分钟，所述发酵培养基为：葡萄糖40g/L，酵母浸膏4g/L，谷氨酸钠30g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁5g/L，氯化钙0.5g/L，碳酸氢钠0.5g/L，硫酸钠8g/L，硫酸铵6g/L，氯化钾0.5g/L，pH自然。
(4)后处理：将发酵培养得到的发酵液经碱性蛋白酶破壁后，加入萃取剂正己烷进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取，如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200毫升正己烷，之后每次加入150毫升正己烷，将每次萃取充后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油酯。
(5)气相色谱分析：对步骤(4)得到的微生物油脂进行气相色谱分析，得到如表2所示结果：
表2实施例3中DHA油脂中各脂肪酸含量
Figure BDA0002347036640000091
Figure BDA0002347036640000101
本实施例突变菌株所制备的DHA油脂中，棕榈酸C16:0含量为15.5wt％，硬脂酸C18:0含量为0.51wt％，DHA含量达50.4wt％。
实施例4利用裂殖壶菌突变株生产二十二碳六烯酸
本实施例利用实施例1得到的裂殖壶菌突变株生产二十二碳六烯酸，具体方法如下：
(1)种子活化培养：将实施例1的裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ接种到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养时间48h，所述活化培养基为：葡萄糖10g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠20g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。
(2)种子扩大培养：将上述步骤(1)振摇培养的活化种子培养液按照10％(体积比)接种量接种到扩大培养基中进行培养，种子罐选用10L种子扩大发酵罐，培养温度28℃，培养时间48h，摇床振摇转速为200转/分钟，所述种子罐中的扩大培养基为：葡萄糖40g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钙0.5g/L，pH自然。
(3)发酵瓶培养：将上述步骤(2)振摇培养的扩大种子培养液按照10％(体积比)接种量接种到装有30L发酵培养基的50L发酵罐中发酵培养，培养温度28℃，培养时间120h，搅拌速度为220转/分钟，发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中碳源浓度在20g/L，通过补加柠檬酸控制发酵液pH在7.2-7.8之间，所述发酵培养基为：葡萄糖40g/L，酵母浸膏4g/L，谷氨酸钠30g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁5g/L，氯化钙0.5g/L，碳酸氢钠0.5g/L，硫酸钠8g/L，硫酸铵6g/L，氯化钾0.5g/L，pH自然。
(4)后处理：将发酵培养得到的发酵液经碱性蛋白酶破壁后，加入萃取剂正己烷进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取，如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200毫升正己烷，之后每次加入150毫升正己烷，将每次萃取充后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油酯。
(5)气相色谱分析：对步骤(4)得到的微生物油脂进行气相色谱分析，得到如表3所示结果：
表3实施例4中DHA油脂中各脂肪酸含量
脂肪酸组成 含量(wt％)
14:0 5.27％
16:0 15.00％
18:0 0.41％
18:1 1.22％
18:2 2.43％
20:4n6 3.67％
20:5n3(EPA) 1.95％
22:5n6 15.00％
22:5n3 1.57％
22:6n3(DHA) 52.37％
本实施例用突变菌株所制备的DHA油脂中，棕榈酸C16:0含量为15.0wt％，硬脂酸C18:0含量为0.41wt％，DHA含量达52.37wt％。
实施例5利用裂殖壶菌突变株生产二十二碳六烯酸
本实施例利用实施例1得到的裂殖壶菌突变株生产二十二碳六烯酸，具体方法如下：
(1)种子活化培养：将实施例1的裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ接种到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养时间48h，所述活化培养基为：葡萄糖10g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠20g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。
(2)种子扩大培养：将上述步骤(1)振摇培养的活化种子培养液按照10％(体积比)接种量接种到扩大培养基中进行培养，依次选用容积为100L，1.7m3，12m3的种子罐逐级扩大培养种子液，培养温度28℃，培养时间48h，摇床振摇转速为200转/分钟，所述种子罐中的扩大培养基为：葡萄糖40g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钙0.5g/L，pH自然。
(3)发酵瓶培养：将上述步骤(2)振摇培养的扩大种子培养液按照10％(体积比)接种量接种到装有30m3发酵培养基的50m3发酵罐中发酵培养，培养温度28℃，培养时间120h，搅拌速度为220转/分钟，发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中碳源浓度在10g/L，通过补加柠檬酸控制发酵液pH在6.8-7.2之间，所述发酵培养基为：葡萄糖40g/L，酵母浸膏4g/L，谷氨酸钠30g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁5g/L，氯化钙0.5g/L，碳酸氢钠0.5g/L，硫酸钠8g/L，硫酸铵6g/L，氯化钾0.5g/L，pH自然。
(4)后处理：将发酵培养得到的发酵液经碱性蛋白酶破壁后，加入萃取剂正己烷进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取，如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200毫升正己烷，之后每次加入150毫升正己烷，将每次萃取充后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油酯。
(5)气相色谱分析：对步骤(4)得到的微生物油脂进行气相色谱分析，得到如表4所示结果：
表4实施例5中DHA油脂中各脂肪酸含量
Figure BDA0002347036640000121
Figure BDA0002347036640000131
本实施例用突变菌株所制备的DHA油脂中，棕榈酸C16:0含量为14.12wt％，硬脂酸C18:0含量为0.40wt％，DHA含量达54.90wt％。实施例6利用裂殖壶菌突变株生产二十二碳六烯酸
本实施例利用实施例1得到的裂殖壶菌突变株生产二十二碳六烯酸，具体方法如下：
(1)种子活化培养：将实施例1的裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ接种到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养时间48h，所述活化培养基为：葡萄糖10g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠20g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。
(2)种子扩大培养：将上述步骤(1)振摇培养的活化种子培养液按照10％(体积比)接种量接种到扩大培养基中进行培养，依次选用容积为10L，50L，5m3，50m3的种子罐逐级扩大培养种子液，培养温度28℃，培养时间48h，搅拌为200转/分钟，所述种子罐中的扩大培养基为：葡萄糖40g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钙0.5g/L，pH自然。
(3)发酵瓶培养：将上述步骤(2)振摇培养的扩大种子培养液按照10％(体积比)接种量接种到装有130m3发酵培养基的200m3发酵瓶中发酵培养，培养温度28℃，培养时间120h，搅拌为220转/分钟，发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中碳源浓度在5g/L，通过补加柠檬酸控制发酵液pH在6.3-6.8之间，所述发酵培养基为：葡萄糖40g/L，酵母浸膏4g/L，谷氨酸钠30g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁5g/L，氯化钙0.5g/L，碳酸氢钠0.5g/L，硫酸钠8g/L，硫酸铵6g/L，氯化钾0.5g/L，pH自然。
(4)后处理：将发酵培养得到的发酵液经碱性蛋白酶破壁后，加入萃取剂正己烷进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取，如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200毫升正己烷，之后每次加入150毫升正己烷，将每次萃取充后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油酯。
(5)气相色谱分析：对步骤(4)得到的微生物油脂进行气相色谱分析，得到如表5所示结果：
表5实施例6中DHA油脂中各脂肪酸含量
脂肪酸组成 含量(wt％)
14:0 5.50％
16:0 12.50％
18:0 0.40％
18:1 1.90％
18:2 2.20％
20:4n6 3.01％
20:5n3(EPA) 1.50％
22:5n6 12.23％
22:5n3 1.25％
22:6n3(DHA) 57.08％
本实施例用突变菌株所制备的DHA油脂中，棕榈酸C16:0含量为12.50wt％，硬脂酸C18:0含量为0.40wt％，DHA含量达57.08wt％。
从上述实施例中可以看到本发明的裂殖壶菌突变株CABIO-A-2-Ⅱ生产的二十二碳六烯酸中长链脂肪酸出现了非常明显的降低，通过优化培养条件，使其脂肪酸组成发生小范围优化，其棕榈酸C16:0最低含量可达到12.50wt％，硬脂酸C18:0最低含量可达到含量为0.40wt％，DHA含量最高可达到57.08wt％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种裂殖壶菌突变株(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-Ⅱ，其特征在于，所述裂殖壶菌突变株(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-Ⅱ的保藏号为CCTCCM2019990。
2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述裂殖壶菌突变株(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-Ⅱ。
3.一种生产二十二碳六烯酸油脂的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述裂殖壶菌突变株(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-Ⅱ或权利要求2所述菌剂发酵，收集发酵产物进行分离纯化。
4.权利要求1所述裂殖壶菌突变株(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-Ⅱ或权利要求2所述菌剂在制备二十二碳六烯酸油脂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述二十二碳六烯酸油脂中C16:0的含量低于15.50wt％，优选低于15.00wt％，进一步优选低于14.12wt％，更进一步优选低于12.50wt％。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述二十二碳六烯酸油脂中C18:0的含量低于0.51wt％，优选低于0.41wt％，进一步优选低于0.40wt％。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述二十二碳六烯酸油脂中长链饱和脂肪酸C16:0和C18:0的含量之和低于16.01wt％，优选低于15.41wt％，进一步优选低于14.52wt％，更进一步优选低于12.90wt％。
8.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述二十二碳六烯酸油脂中DHA含量高于50.40wt％，优选高于52.37wt％，进一步优选高于54.90wt％，更进一步优选高于57.08wt％。
9.权利要求1所述裂殖壶菌突变株(Schizochytrium sp.)CABIO-A-2-Ⅱ或权利要求2所述菌剂或权利要求4-8任一项所述应用中述及的二十二碳六烯酸油脂在制备食品、饲料、化妆品或药物中的应用。
10.一种微生物油，其特征在于，所述微生物油中二十二碳六烯酸油脂含量至少为50％，所述二十二碳六烯酸油脂中的长链饱和脂肪酸C16:0的含量低于15.50wt％，优选低于15.00wt％，进一步优选低于14.12wt％，更进一步优选低于12.50wt％。
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