CN111206113B - 一种辅助选择水稻早抽穗基因的InDel分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辅助选择水稻早抽穗基因的InDel分子标记及其应用，属于分子标记技术领域。本发明利用全基因组重测序BSA技术初步鉴定水稻抽穗期相关的候选区域，然后利用亲本全基因组重测序发展的InDel标记对该候选区域中的9311/CL33杂交构建的F₂分离群体中的500个早抽穗单株进行标记分析，发现PSM8‑8标记与基因共分离，最终将早抽穗期基因qEH8‑1精细定位在InDel标记PSM8‑6至PSM8‑9之间270kb左右的范围内。根据本发明设计的InDel分子标记PSM8‑8对水稻植株基因组进行扩增，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图判断检测植株是否具有早抽穗的性状。

Description

一种辅助选择水稻早抽穗基因的InDel分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，尤其涉及一种辅助选择水稻早抽穗基因的InDel分子标记及其应用。

背景技术

水稻抽穗期(生育期)是水稻重要的农艺性状之一，水稻抽穗期长短直接决定水稻品种的地域适应性和季节适应性，对水稻品种的高产、稳产起重要作用，是水稻育种的重要目标。选育早熟高产的水稻品种一直为水稻育种工作者所重视。水稻品种的抽穗期主要由其感光性、感温性和基本营养生长性决定；感光性对强感光的品种来说具有支配熟期的决定作用。而对同一地区具有相同光温反应的品种来说，抽穗期的长短主要决定于基本营养生长期的长短。感光性和基本营养生长性组合的多样性及强弱的不同，使得抽穗期呈现多种多样的变化；这一方面为不同生态型育种提供了丰富的资源，另一方面也使得抽穗期的遗传表现异常复杂。因此，深入了解水稻抽穗期基因/QTL的遗传规律，并对相关的抽穗期基因/QTL进行精细定位和克隆，对水稻生育期育种具有重要的指导和实践意义。

抽穗期是一个复杂的遗传性状，其QTL的检测依赖于所用分离群体的遗传结构。常用的群体主要有F₂/F₃、BC1、DH和RIL等类型，这些群体的遗传背景较为复杂，对QTL定位存在一定影响。不同亲本组合检测到的抽穗期QTL不同，相同组合的分离群体在不同环境中检测到的影响抽穗期的QTL位点也不完全相同，难以准确估测不同染色体区段对抽穗期的影响。为了更精确的定位水稻抽穗期QTL以及对它们的效应进行分析，近年来，一些减少遗传背景干扰的次级作图群体，如近等基因系(IL)、染色体片段代换系(CSSLs)和单片段代换系(SSSLs)已经被相继建立，并广泛应用于水稻抽穗期QTL的精细定位。研究表明，由于在每个单片段代换系的基因组内都只有来自供体亲本的一个纯合染色体片段，而基因组的其余部分与受体亲本相同，因此所有单片段代换系与其受体亲本之间的差异以及单片段代换系之间所有可遗传的变异都只与代换片段相联系。

籼稻品种9311(扬稻6号)是一个优良的杂交稻骨干亲本，利用其做父本已培育出了2个大面积推广的超级稻组合两优培九和Y两优1号，但在广西以及整个华南双季稻作区，由于其全生育期偏长，不太适宜晚造的生产种植，严重影响了其推广应用，制约了粮食的增产。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种辅助选择水稻早抽穗基因的InDel分子标记和用于扩增所述分子标记的引物，以及所述分子标记的应用。本发明通过对以广西普通野生稻为供体，籼稻9311为受体的染色体片段代换系文库进行抽穗期鉴定，发现其中一个染色体片段代换系的抽穗期比受体9311早15天左右。拟通过利用该染色体片段代换系与受体9311进行杂交，利用其F₂分离群体将该早熟抽穗期QTL精细定位在1cM之内，并对其进行分子标记辅助选择培育适应华南双季稻区生态条件的早熟恢复系品种以及杂交组合，本发明对水稻生育期育种具有重要的指导和实践意义。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：

根据本发明的一方面，本发明提供了用于扩增一种水稻InDel分子标记的寡核苷酸引物对，上述引物对为SEQ ID No.1和下游引物SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

本发明也请求保护其他用于扩增上述InDel分子标记的寡核苷酸引物对。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种鉴定水稻植株早抽穗基因型的方法，包括如下步骤：

(1)以水稻样品DNA为模板，使用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2或者其他引物对扩增InDel分子标记；

(2)鉴定所述水稻样品的抽穗期基因型。

进一步的，所述步骤(1)中水稻样品DNA的提取和鉴定步骤为：(1)按照CTAB法提取各水稻样品的DNA；(2)利用琼脂糖凝胶电泳分析各个样品DNA的纯度和完整性；(3)检测样品DNA的纯度，要求OD_260/280比值介于1.8～2.0之间；(4)检测样品DNA浓度，要求样品浓度>20ng/μL。

进一步的，所述步骤(1)中扩增步骤为：20μL反应体系中包括0.1-0.2μM的上游引物、0.1-0.2μM的下游引物、200μM dNTP、1×PCR反应缓冲液、50～100ng的DNA模板、1UTaq酶；所用的反应程序为：94℃预变性5min，94℃1min、55℃1min、72℃1min循环35次，最后72℃延伸5min；

所述1×PCR反应缓冲液包括50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl₂、0.01％明胶。

进一步的，所述上游引物浓度为0.15μM、下游引物浓度为0.15μM。

进一步的，所述PCR产物用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳进行鉴定。

进一步的，所述聚丙烯酰胺变性凝胶浓度为6％。

进一步的，所述条带为178bp时说明水稻样品中含有早抽穗基因。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的引物对可用于对水稻样品的分子标记检测，鉴定水稻植株的抽穗期基因型，加快培育适应华南双季稻区生态条件的早熟品种以及杂交水稻组合。

附图说明

图1为实施例1中染色体片段代换系CL33与受体亲本9311抽穗期鉴定图。

图2为实施例1中9311/CL33 F₂分离群体的抽穗期分布图。

图3为实施例1中30个极早抽穗单株混合池E1-30的SNP-index在染色体上的分布图。

图4为实施例1中30个极晚抽穗单株混合池L1-30的SNP-index在染色体上的分布图。

图5为实施例1中极早抽穗单株混合池E1-30与极晚抽穗单株混合池L1-30的△SNP-index在染色体上的分布图。

图6为实施例2中变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式

实施例1

1、染色体片段代换系抽穗期鉴定

通过对113个以籼稻9311为遗传背景的染色体片段代换系进行抽穗期鉴定，发现一个代换系CL33明显比受体亲本9311早抽穗15-20天，如图1所示。

2、CL33抽穗期基因遗传分析

通过对9311/CL33 F₂的524个分离单株进行抽穗期调查，结果如图2所示，它们的变异范围为80-109天，早和晚抽穗分离比为127:394，符合1:3的分离比例，遗传分析表明：CL33的早抽穗受1对隐性基因控制，其中迟抽穗对早抽穗为显性。

3、基于CL33、9311以及其后代混合池全基因重测序及BSA分析

为了快速定位到基因和对候选基因进行分析，本研究采用对CL33(ZP1)和9311以及极端早抽穗(80-85天)和极端晚抽穗(105-109天)的单株群体(各30株)构建的混合池E1-30和L1-30进行基于全基因组重测序的混合分组分析法(Bulk Segregant Analysis,BSA)的性状定位和目标区候选基因注释。

(1)基因组重测序深度分析

参考籼稻基因组大小为427,004,890bp(参考基因组下载地址为：ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/release-28/plants/fasta/oryza_indica)，所有样本的比对率在93.83％～98.74％之间，对参考基因组(排除N区)的平均覆盖深度在8.9X～25.84X之间，1X覆盖度(至少有一个碱基的覆盖)在92.42％以上，数据如表1所示。比对结果正常，可用于后续的变异检测及相关分析。

表1测序深度及覆盖度统计

备注：①Sample:样本名。

②Mappedreads：比对到reference上的reads条数(包括单端比对和双端比对)。

③Totalreads：有效测序数据的reads总条数。

④Mappingrate：比对率，比对到参考基因组上的reads数目除以有效测序数据的reads数目。

⑤Average depth：平均测序深度，比对到参考基因组的碱基总数除以基因组大小。

⑥Coverage atleast 1X：参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的百分比。

⑦Coverage atleast4X：参考基因组至少有4个碱基覆盖的位点占基因组的百分比。

(2)极早抽穗单株混合池E1-30与极晚抽穗单株混合池SNP频率差异分析

基于基因分型的结果，筛选亲本中纯合的SNP位点，共挑选出16,491个多态性标记。我们选择亲本CL33(ZP1)作为参考亲本，分析计算两个子代在亲本间16,491个标记位点的SNP-index(即SNP的频率)。其中，完全与其相同的:SNP-index为0；完全与其不同的SNP-index为1。为直观反映子代SNP-index在染色体上的分布情况，对SNP-index在染色体上的分布进行作图。默认选择1Mb为窗口，1kb为步长，计算每个窗口中SNP-index的平均值来反应子代的SNP-index分布，图3为30个极早抽穗单株混合池E1-30的SNP-index在染色体上的分布图，图4为30个极晚抽穗单株混合池L1-30的SNP-index在染色体上的分布。计算△(SNP-index)，即两个子代SNP-index作差：△(SNP-index)＝SNPindex(极端性状B)-SNPindex(极端性状A)。进行1000次置换检验，选取95％(蓝色)置信水平作为筛选的阈值，结果如图5所示。

(3)早抽穗基因定位和候选基因分析

选择95％置信水平下，大于阈值的窗口作为候选区间，为了不忽略掉微效QTL的影响，在全基因组范围内挑选两个子代在SNP-index差异显著的SNP位点，即挑选子代2(极端晚抽穗期)SNP-index接近1(本项目选取0.79)，且子代1(极端早抽穗)SNP-index接近0(本项目选取0.05)的位点，对于候选的121个多态性标记位点，提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选引起stop loss或者stop gain或者非同义突变或可变剪接的位点所在的基因作为候选基因，在第8染色体的820kb对应的日本晴参考基因组序列范围内共鉴定出了8个候选基因(表2)，它们分别是Os08g0173600，Os08g0162000，Os08g0175600，Os08g0167400，Os08g0167500，Os08g0171100，Os08g0171600和Os08g0172200。

表2全基因重测序BSA分析鉴定的抽穗期基因相关候选区域

4、基因精细定位和候选基因验证

为了验证候选基因注释结果的准确性，在候选基因区间内，利用亲本全基因组重测序发展的InDel标记对9311/CL33的F₂分离群体的500个早抽穗的单株进行标记分析(表3)，发现PSM8-8标记与基因共分离，最终将早抽穗基因qEH8-1精细定位在InDel标记PSM8-6至PSM8-9之间270kb左右的范围内(水稻基因组1cM约为250kb)。通过利用下表中的分子标记PSM8-8进行检测，判断水稻植株是否具有早抽穗的基因，其所对应的扩增上游引物为SEQID No.1和下游引物SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

SEQ ID No.1：5’-GTATTGTGGCATCAGGACTT-3’

SEQ ID No.2：5’-GCTCATTAGAGAAAACGAGG-3’

表3 InDel标记序列信息

实施例2

(1)水稻样品

早晚抽穗亲本CL33和9311，9311/CL33杂交F₂遗传分离群体中表现为早抽穗的31个植株(80-85天)，2个表现为晚抽穗的植株(105-106天)和1个抽穗期为94天的植株。

(2)DNA样品提取和检测

按照CTAB法(Murray&Thompson 1980)提取各水稻样品的DNA。利用琼脂糖凝胶电泳分析各个样品DNA的纯度和完整性；Nanodrop微量分光光度计检测样品DNA的纯度(OD_260/280比值介于1.8～2.0之间)；Qubit对样品DNA浓度进行精确定量(样品浓度>20ng/μL)。

(3)PCR扩增

PCR扩增按照Panaud等(1996)的方法稍加修改进行。20μL反应体系中包括0.15μM的引物、200μM dNTP、1×PCR反应缓冲液(50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl₂、0.01％明胶)、50～100ng的DNA模板、1UTaq酶。反应在9700型DNA扩增仪或PTC-100^TMProgrammable Thermal Controller中进行。所用的反应程序为：94℃预变性5min，循环(94℃1min、55℃1min、72℃1min)35次，最后72℃延伸5min。

(4)电泳

PCR产物用浓度为6％的聚丙烯酰胺变性凝胶电泳进行鉴定，基本操作包括以下三步：(1)制胶：称取9.6g尿素，加45mL蒸馏水和8mL 10×TBE(108g Tris-HCl、55g硼酸、7.44gEDTA加蒸馏水溶解，定容到1L)，利用玻璃棍搅拌尿素使其充分溶解，然后用小量筒加入12mL 40％的丙烯酰胺溶液(38g丙烯酰胺、2g N，N′-亚甲基双丙烯酰胺加水定容到100mL)，充分混匀，加入0.8mL 10％的过硫酸胺和35μL TEMED(参照龚永福，华南农业大学硕士学位论文，2016)，混匀后快速注入到已经用琼脂糖封好底部的两块玻璃板中间，注满后立即插入梳子，让其与桌面有一定的倾斜度靠墙放置，静置30min～45min使胶凝固。(2)点样：等凝胶充分凝结后，将梳子拔出，尽量让点样孔保持完好。将玻璃板固定在垂直电泳槽(型号：DyyⅢ-28D型)上，加入适量的1×TBE；用TBE反复冲洗，将点样孔冲洗干净至没有凝固的物质；取出PCR扩增产物，每管PCR产物中加入4μL上样缓冲液(0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯氰、50％甘油)，混和均匀后用10μL的移液枪吸取3～4μL加入点样孔。(3)电泳：使用稳压稳流电泳仪，250V恒压电泳时间约1～2h。

(5)银染和结果记录

电泳完成后，从电泳槽中把玻璃板取出，小心剥离出凝胶，用蒸馏水中冲洗两次；转移至0.1％AgNO₃溶液中染色，在摇床上轻摇约10min；然后将凝胶转移至蒸馏水中漂洗两次；最后转入显色液(6g氢氧化钠、0.076g四硼酸钠、1.6mL甲醛，加水定容至400mL)中显色约10min(参照龚永福，华南农业大学硕士学位论文，2016)，着色后转入自来水中保存，结果如图6所示，其中M表示DNA marker；1和2分别表示晚抽穗亲本9311和早抽穗的染色体片段CL33；其余34个样品为9311/CL33杂交F₂遗传分离群体单株，出现与亲本9311相同的带型(146bp)表示该植株晚抽穗；出现与染色体片段代换系CL33相同的带型(178bp)表示该植株早抽穗；同时出现杂合带型，表示该植株的抽穗期位于两者之间。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.用于扩增一种水稻InDel分子标记的寡核苷酸引物对，其特征在于，上述引物对为上游引物SEQ ID No.1和下游引物SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

所述水稻InDel分子标记用于亲本广西普通野生稻和亲本籼稻品种9311(扬稻6号)或是它们的杂交样本的早抽穗性状的鉴定，出现146bp带型表示晚抽穗，出现178bp带型表示早抽穗，同时出现杂合带型，表示抽穗期位于两者之间。

2.与抽穗期基因共分离的InDel分子标记，其由权利要求1的引物对扩增。

3.鉴定水稻植株抽穗期基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以所述水稻样品DNA为模板，用选自权利要求1中的引物对扩增InDel分子标记；

(2)鉴定所述水稻样品的抽穗期基因型。

4.如权利要求3中所述鉴定水稻植株抽穗期基因型的方法，其特征在于，所述步骤(1)中水稻样品DNA的提取和鉴定步骤为：(1)按照CTAB法提取各水稻样品的DNA；(2)利用琼脂糖凝胶电泳分析各个样品DNA的纯度和完整性；(3)检测样品DNA的纯度，要求OD_260/280比值介于1.8～2.0之间；(4)检测样品DNA浓度，要求样品浓度>20ng/μL。

5.如权利要求3中所述鉴定水稻植株抽穗期基因型的方法，其特征在于，所述步骤(1)中扩增步骤为：20μL反应体系中包括0.1-0.2μM的上游引物、0.1-0.2μM的下游引物、200μMdNTP、1×PCR反应缓冲液、50～100ng的DNA模板、1UTaq酶；所用的反应程序为：94℃预变性5min，94℃1min、55℃1min、72℃1min循环35次，最后72℃延伸5min；

所述1×PCR反应缓冲液包括50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl₂、0.01％明胶。

6.如权利要求5中所述鉴定水稻植株抽穗期基因型的方法，其特征在于，所述上游引物浓度为0.15μM、下游引物浓度为0.15μM。

7.如权利要求5或6中所述鉴定水稻植株抽穗期基因型的方法，其特征在于，所述PCR产物用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳进行鉴定。

8.如权利要求7中所述鉴定水稻植株抽穗期基因型的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺变性凝胶浓度为6％。

9.如权利要求8中所述鉴定水稻植株抽穗期基因型的方法，其特征在于，所述条带为178bp时说明水稻样品中含有早抽穗基因。

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