CN111183957A

CN111183957A - 一种减轻自身免疫甲状腺炎模型的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN111183957A
Application number: CN202010101220.9A
Authority: CN
Inventors: 李玉姝; 赵娜; 单忠艳
Original assignee: First Hospital of China Medical University
Current assignee: First Hospital of China Medical University
Priority date: 2020-02-19
Filing date: 2020-02-19
Publication date: 2020-05-22

Abstract

本发明涉及动物甲状腺模型的构建方法，尤其涉及一种减轻自身免疫甲状腺炎模型的构建方法及其应用。动物甲状腺两叶分别注射慢病毒；所述慢病毒为miR‑326特异性抑制剂(mmu‑mir‑326 sponge，LV‑sponge，滴度1*10⁹TU/ml)。本发明构建的减轻自身免疫甲状腺炎模型的方法具有迅速、简洁、高效和组织特异的特点；本发明所述的减轻自身免疫甲状腺炎模型构建方法，其是根据慢病毒局部作用的特点，建立减轻自身免疫甲状腺炎模型，基于该模型可实现快速、高效的建立疾病减轻模型。

Description

一种减轻自身免疫甲状腺炎模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及动物甲状腺模型的构建方法，尤其涉及一种减轻自身免疫甲状腺炎模型的构建方法及其应用。

背景技术

自身免疫性甲状腺炎是具有遗传易感且存在受环境因素影响的常见自身免疫性疾病，以血清中存在抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)和甲状腺球蛋白抗体(TgAb)，甲状腺出现淋巴细胞浸润和滤泡组织损伤，可导致甲状腺纤维化或萎缩，并伴有甲状腺功能减退症。

目前自身免疫性甲状腺炎除注意饮食外，尚无针对病因的预防和治疗手段，暂不能治愈。

NOD.H-2h4小鼠由NOD小鼠和B10.A(4R)小鼠杂交，再将表达B10.A(4R)单体的主要组织相容性复合体(MHC)的后代与NOD小鼠多次回交得到，能自发形成自身免疫性甲状腺炎，当给予碘化钠饮水时，发病进程能够被极大加速，是研究自身免疫性甲状腺炎的理想动物模型，可通过观察甲状腺组织冰冻切片中淋巴细胞浸润程度及检测血清TgAb滴度进行自身免疫性甲状腺炎的炎症程度评估。

有关自身免疫甲状腺炎疾病减轻动物模型在体干预常用的技术包括腹腔注射、皮下注射、尾静脉注射及基因敲除小鼠等。腹腔注射、皮下注射、尾静脉注射其所造成动物本身包括甲状腺在内的全身敲减作用，有可能破坏动物机体平衡稳定。而基因敲除小鼠获得实验需要的动物模型耗时长，价格高，繁殖及基因型的获得步骤繁琐。其中，全身性基因敲除小鼠除了造成全身目的基因的敲除外，也避免不了动物机体平衡稳定破坏潜在风险。虽然条件性基因敲除小鼠能有组织特异性敲除的有力作用，但同样面临基因敲除小鼠的不利条件，以及造模费用更高，限制了其在自身免疫甲状腺炎中的广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种减轻自身免疫甲状腺炎模型的构建方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种减轻自身免疫甲状腺炎模型的构建方法，动物甲状腺两叶分别注射慢病毒；所述慢病毒为miR-326特异性抑制剂(mmu-mir-326 sponge，LV-sponge，滴度1*10⁹TU/ml)。

所述慢病毒甲状腺左右两叶各注射固定量5ul的LV-sponge。

进一步的说，

1)配制慢病毒；2)将配制的慢病毒注射至动物甲状腺两叶；3)观察甲状腺的炎症水平。

所述动物为5周龄时动物。

进一步的说，通过注射方式于5周龄时动物的甲状腺两叶分别注射慢病毒，形成甲状腺组织特异性自身免疫甲状腺炎疾病减轻模型。

同时，以在甲状腺两叶分别注射固定量5ul的慢病毒特异性(LV-ctrl)作为对照。

一种构建方法所得减轻自身免疫甲状腺炎模型在自身免疫甲状腺炎疾病研究中的应用。

所述模型通过观察动物血清TgAb滴度和甲状腺淋巴细胞浸润程度评分炎症水平(通过甲状腺炎症评分和检测血清中TgAb水平以判断疾病有无减轻，水平值越高，炎症越重)判断自身免疫甲状腺炎。

本发明所具有的优点：

本发明构建的减轻自身免疫甲状腺炎模型的方法具有迅速、简洁、高效和组织特异的特点；具体为：

1.本发明所述的减轻自身免疫甲状腺炎模型构建方法，其是根据慢病毒局部作用的特点，建立减轻自身免疫甲状腺炎模型，基于该模型可实现快速、高效的建立疾病减轻模型；

2.本发明所述的减轻自身免疫甲状腺炎模型构建方法，可缩短造模周期，节省花费；

3.本发明动物模型小鼠10周成活率95.8％；甲状腺组织冰冻切片中淋巴细胞浸润程度及检测血清TgAb滴度明显下降。

附图说明：

图1本发明实施例提供的检测小鼠脾脏细胞miR-326水平，判断抑制内源性miR-326的活性同时并不影响它的转录过程。

图2本发明实施例提供的甲状腺炎性评价，以判断动物模型效果图；其中，A和B为NOD.H-2h4小鼠甲状腺冰冻切片HE染色及淋巴细胞浸润炎症评分；C为NOD.H-2h4小鼠血清TgAb滴度。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

实施例1

减轻自身免疫甲状腺炎动物模型的构建方法，具体步骤如下：

1)首先将小鼠麻醉，四肢及头部固定后，颈前皮肤备皮。

2)眼科剪剪开颈部正中约1cm大小切口，分离皮肤、皮下和肌肉层，暴露气管及两侧甲状腺。

3)眼科镊先推开一侧的皮肤、皮下和肌肉组织，暴露本侧甲状腺组织，使用1ml胰岛素注射针吸取5ul慢病毒液LV-sponge于甲状腺中部略倾斜进针，勿过深，以免伤到周围血管和组织，缓慢注射，可看到一侧甲状腺膨大，注射完毕；后使用同样方法，注射另一侧。

4)注射完毕后，连续缝合皮肤和皮下，碘伏消毒颈前皮肤。

5)将小鼠侧卧，保温，待苏醒，即为动物模型(NOD.H-2h4)。

同时，按照上述方法于甲状腺两叶分别注射固定量5ul的慢病毒特异性(LV-ctrl)作为对照。

即将获得注射LV-sponge组(模型组)和LV-ctrl组(对照组)。对于同一组里的动物，甲状腺两侧注射的慢病毒液一致，体积均为5ul滴度为1*10⁹TU/ml的病毒原液。

对上述构建模型进行验证：

(一)RT-PCR检测上述获得小鼠模型小鼠脾脏组织miR-326水平

(1)提取上述获得小鼠模型或对照组的小鼠脾脏组织总RNA

1)取等质量的脾脏组织于2ml离心管中，每个离心管加入500ul RNAiso Plus，使用匀浆仪匀浆，25F/8min。如匀浆不完全，可重复一次，注意低温操作。

2)匀浆完成后，将组织匀浆液转移到新的预冷的1.5ml离心管中，加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡15s后，室温静置15min。

3)13000rpm/min，4℃离心15min，使溶液分三层，上层为透明的RNA层，中间层为DNA。

4)将最上面的RNA层液体转移至新的预冷1.5mlEP管中。注意吸取时小心，勿将DNA吸起来。

5)在新的1.5ml EP管中加入等体积的异丙醇，约200ul，可比实际需要略多。上下翻转EP管30s，冰上放置10min(亦可-20℃静置1h-1.5h，可使RNA析出增加)。

6)12000rpm/min，4℃离心10min，弃上清。

7)配制75％的乙醇按体积比，DEPC水：无水乙醇＝1：3，配制75％的乙醇，置于-20℃预冷。

8)每个EP管中加入1ml预冷的75％乙醇，混匀。

9)7500rpm/min，4℃离心5min，弃上清。

10)重复一次步骤8、9。

11)用高压过的滤纸吸尽EP管管壁液体，冰上彻底干燥1h。

12)加入21μl的DEPC水，弹开沉淀。取1μl RNA溶液，检测RNA浓度和纯度。

13)如果浓度>200ng/ul,方可进行后续反转录。

RNA纯度判断：

将提取的RNA进行反转录或保存于-80℃放置。

(2)microRNAs反转录

1)反转录体系的配制：解冻2*miRNA RT Reaction Buffer并混匀，miRNA RTEnzyme Mix放于冰中备用，在冰上预冷RNase Free的反应管内加入以下试剂至总体积20ul。

2)反转录程序：振荡器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表设置进行miRNA的逆转录反应。

(3)microRNAs的RT-PCR定量

1)设计目的基因和内参基因的上下游引物序列，小鼠组织和细胞实验选用U6作为内参。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成纯化，引物序列如表所示。

2)室温融化2*miRcute Plus miRNA Premix、50*ROX Reference Dye和ReversePrimer。

3)使用时将2*miRcute Plus miRNA Premix上下颠倒轻轻混匀混合均匀，避免气泡，并轻轻离心后使用。

4)将试剂置于冰上，并按表配制反应体系(20ul)：

5)PCR反应程序设置

6)

结果如图1所示，高碘LV-ctrl和高碘LV-sponge组miR-326水平无明显变化(P＝0.239)。

(二)HE染色检测NOD.H-2h4小鼠模型甲状腺炎症浸润情况

1)取甲状腺组织于冰上完全融化后，OCT包埋剂包埋组织。

2)冰冻切片厚度设置为5μm，使用进口防脱载玻片拾取切片。冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存于低温冰箱内。

3.染色前固定：室温放置30分钟后，入4℃丙酮或95％乙醇固定10分钟。

4)HE染色：苏木素浸泡3分钟，盐酸-酒精浸泡数秒，蒸馏水冲洗反蓝15分钟，伊红染色30秒，梯度酒精脱水(70％-80％-90％-100％)各10分钟，二甲苯透明5分钟,待载玻片表面基本无液体时(保证二甲苯不干燥)，中性树胶封片。

5)形态学定量、定性分析：采用高精密显微镜照相系统，每张HE染色取100倍、200倍、400倍视野。400倍光镜下观察淋巴细胞浸润情况。

6)炎性细胞浸润程度依据文献标准，通过甲状腺组织切片HE染色进行甲状腺炎症程度评分，评分依据淋巴细胞浸润面积进行考量，评分标准如下：

0分：无炎症细胞浸润

1分：浸润面积达1％-10％

2分：浸润面积达10％-30％

3分：浸润面积达30％-50％

4分：广泛浸润面积达50％以上

结果如图2A和B所示，与高碘LV-ctrl相比，高碘LV-sponge组小鼠甲状腺炎症评分(放大倍数200x)显著下降(P<0.05)。

(三)ELISA检测NOD.H-2h4小鼠模型血清TgAb滴度

1)mTg溶液稀释，解冻后1mg/ml的mTg用包被液稀释至10ug/ul，以每孔100ul加入96孔板中，用保鲜膜封好，4℃过夜。

2)弃去板内的液体，用PBST每孔200μl清洗3次，每次轻晃96孔板1分钟，最后1次拍干。

3)每孔加1％的BSA 200μl，室温封闭10分钟，倒尽拍干(勿清洗)。

4)每孔加入小鼠稀释血清100ul，保鲜膜封闭，37℃恒温水浴箱2小时。

5)弃去板内液体，用PBST每孔200μl清洗3次，每次轻晃96孔板1分钟，最后1次拍干。

6)每孔加1％的BSA 200μl，室温封闭10分钟，倒尽拍干(勿清洗)。

7)用PBS 1：5000倍稀释二抗(羊抗小鼠IgG)，每孔加入100μl抗小鼠IgG。37℃孵育30分钟。

8)弃去板内液体，用PBST每孔200μl清洗3次，每次轻晃96孔板1分钟，最后1次拍干。

9)每孔加入l00μl的TMB显色液。室温下避光显色5～10分钟，观察待空白孔显色较弱，阳性对照显示出适当的蓝色时迅速加入100μl终止液终止反应。

10)酶标仪450nm波长下观察结果，结果以OD值表示。

由图2C所示，与高碘LV-ctrl相比，高碘LV-sponge组血清TgAb水平显著降低(*P<0.05)，说明在体抑制miR-326后，小鼠的甲状腺炎症水平下降。

由上述可见，本发明建立的动物模型具有对自身免疫甲状腺炎特征。经一定剂量慢病毒(LV-sponge)注射至经高碘水喂养的正常小鼠发生自身免疫甲状腺炎的程度减轻，由构建的Sponge是能与miR-326结合的miR-326特异的假目标，来抑制内源性miR-326的活性而不影响它的转录过程，进而可见由慢病毒治疗自身免疫甲状腺炎。本发明研究结果认为miR-326与自身免疫甲状腺炎的炎症发展相关，能够为自身免疫甲状腺炎的治疗、评价疗效等提供依据。

Claims

1.一种减轻自身免疫甲状腺炎模型的构建方法，其特征在于：动物甲状腺两叶分别注射慢病毒；所述慢病毒为miR-326特异性抑制剂(mmu-mir-326sponge，LV-sponge，滴度1*10⁹TU/ml)。

2.按权利要求1所述的减轻自身免疫甲状腺炎模型的构建方法，其特征在于：所述慢病毒甲状腺左右两叶各注射固定量5ul。

3.按权利要求1或2所述的减轻自身免疫甲状腺炎模型的构建方法，其特征在于：

4.按权利要求3所述的减轻自身免疫甲状腺炎模型的构建方法，其特征在于：所述慢性病毒于动物5周龄时注射于其甲状腺两叶。

5.按权利要求3所述的减轻自身免疫甲状腺炎模型的构建方法，其特征在于：通过注射方式于5周龄时动物的甲状腺两叶分别注射慢病毒，形成甲状腺组织特异性自身免疫甲状腺炎疾病减轻模型。

6.一种权利要求1所述构建方法所得减轻自身免疫甲状腺炎模型在自身免疫甲状腺炎疾病研究中的应用。

7.按权利要求6所述的应用，其特征在于：所述模型通过观察动物血清TgAb滴度和甲状腺淋巴细胞浸润程度评分炎症水平判断自身免疫甲状腺炎。