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CN111182924A - 与抗肿瘤免疫应答的抗性相关的细胞内激酶及其用途 - Google Patents

与抗肿瘤免疫应答的抗性相关的细胞内激酶及其用途 Download PDF

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CN111182924A CN201880041301.5A CN201880041301A CN111182924A CN 111182924 A CN111182924 A CN 111182924A CN 201880041301 A CN201880041301 A CN 201880041301A CN 111182924 A CN111182924 A CN 111182924A
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菲利普·贝克哈弗
蒂尔曼·米歇尔斯
尼斯特·瀚德渥
迈克尔·布特罗斯
马克·布罗尼格
彼得·森汉
塞巴斯蒂安·米尔-伊沃特
瓦伦蒂娜·沃尔平
瑟·门恩斯
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Aomax Treatment Co Ltd
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Abstract

本发明基于令人惊奇的发现，即SIK3与抗肿瘤免疫应答的抗性有关。具体来说，本发明提供了使用SIK3的抑制剂、特别是SIK3的核酸或小分子抑制剂来治疗增殖性疾病的方法。还提供了将SIK3抑制剂与某些促炎性信号传导途径的配体或激动剂一起使用，使涉及增殖性障碍的细胞对此类信号传导途径的细胞毒性效应敏感和/或杀死此类细胞的方法，和/或用于治疗增殖性疾病的方法。本发明提供的其他方法包括那些涉及SIK3抑制剂以增强或克服与利用此类信号传导途径的治疗相关的某些副作用的方法，以及基于从受试者获得的样品中SIK3的检测的诊断、预后和监测方法和药剂盒，以及可用于鉴定或表征SIK3抑制剂的筛选方法。

Description

与抗肿瘤免疫应答的抗性相关的细胞内激酶及其用途
技术领域
本发明基于SIK3与抗肿瘤免疫应答的抗性相关这样一个出乎意料的发现。具体来说，本发明提供了使用SIK3的抑制剂、特别是SIK3的核酸或小分子抑制剂来治疗增殖性疾病的方法。还提供了将SIK3抑制剂与某些促炎性信号传导途径的配体或激动剂一起使用，使涉及增殖性障碍的细胞对此类信号传导途径的细胞毒性效应敏感和/或杀死此类细胞的方法，和/或用于治疗增殖性疾病的方法。本发明提供的其他方法包括那些涉及SIK3抑制剂以增强或克服与利用此类信号传导途径的治疗相关的某些副作用的方法，以及基于从受试者获得的样品中SIK3的检测的诊断、预后和监测方法和药剂盒，以及可用于鉴定或表征SIK3抑制剂的筛选方法。
背景技术
在癌症的治疗中，疗法可以凭借许多方法导致肿瘤细胞的消除，包括直接或间接涉及或利用免疫系统的一种或多种组分的那些方法。与这些疗法相关的限制之一是癌细胞经常利用免疫检查点避开患者的免疫系统，例如通过阻止免疫识别或下调肿瘤特异性细胞毒性T细胞(CTL)反应，从而产生针对免疫应答的抗性(Rabinovich等，2007，Annu RevImmunol 25：267；Zitvogel等，2006，Nat Rev Immunol 6：715)。在正常情况下，这种免疫调节检查点对于维持生理条件下的自我耐受至关重要，但人们日益认识到它们也可以在癌症中发挥重要作用(Hanahan和Weinberg 2011，Cell；144：646)；癌细胞可以接管这些机制来逃避和抑制免疫系统，以便发展成肿瘤(Drake等，2006，Adv Immunol 90：51)。
癌症疗法的现有技术包括阻断目前已知并且其作用机理已被了解的几个免疫调节检查点。例如，针对表面表达的免疫调节蛋白例如CTLA4和PD-L1的阻断抗体(Chambers等，2001，Annu Rev Immunol 19：565；Blank等，2004，Cancer Res 64：1140)可以增强抗肿瘤免疫力，并已针对多种癌症类型表现出临床成功(Page等，2014，Annu Rev Med 65：185)。然而，大部分癌症患者对这种检查点阻断疗法没有反应(Bu等，2016，Trends Mol Med 22：448；Hugo等，2016，Cell 165：35；Topalian等，2012，New Engl J Med 366：2443)，表明其他免疫检查点途径可能是活跃的。事实上，几种免疫调节途径之间的协同合作维持了针对肿瘤的免疫耐受性，这可能解释了为什么仅阻断一个免疫调节检查点节点仍可导致肿瘤逃逸(Woo等，2012，Cancer Res 72：917；Berrien-Elliott等，2013，Cancer Res 73：605)。然而，对于这些免疫调节途径的作用机制至关重要的分子因素，人们知之甚少。事实上，成功的癌症免疫疗法需要系统地描述由肿瘤表达的整个免疫调节回路，即“免疫调节组”。因此，目前对鉴定可能充当免疫调节检查点的其他分子靶仍存在着未满足的需求，尤其是诸如在医学、诊断和研究中对调节、检测和以其他方式利用这些可能的检查点靶的手段和方法，仍存在着未满足的需求。
盐诱导型激酶(SIK)构成丝氨酸酪氨酸激酶(STK)亚家族，其属于单磷酸腺苷激活的激酶(AMPK)家族。到目前为止已经鉴定到三个成员(SIK1、-2和-3)。在激酶结构域中，SIK1与SIK2和SIK3的氨基酸同源性分别为78％和68％。在高盐饮食喂养的大鼠的肾上腺中丰富表达的SIK1(也被称为SIK和SNF1LK)的克隆，导致随后主要在脂肪组织中表达的SIK2(也被称为QIK、KIAA0781和SNF1LK2)以及相当普遍的SIK3(也被称为QSK、KIAA0999或L19)的克隆(Katoh等，2004，Mol Cell Endocrinol 217：109)。这三种SIK具有相似的结构(图1)，具有N-端激酶结构域(催化结构域)、中间的遍在蛋白结合结构域(据认为对于被LKB1的磷酸化很重要)和长的C-端序列(据认为是被PKA进一步磷酸化的位点)。然而，各种SIK可能牵涉非常多样化的作用。例如，各种SIK已被暗示参与多种多样的生物学过程，从骨细胞对副甲状腺激素的反应(Wein等，2016，Nature Commun 7：13176)到SIK1被胃泌素的诱导和胃腺癌细胞迁移的抑制(Selvik等，2014，PLoS ONE 9：e112485)。
具体来说，SIK2和SIK3各自与多种生物学过程有关。对于SIK2来说，这些过程包括(以及免疫抑制，如下文更详细描述的)糖异生、神经元存活、黑色素生成、肝脂肪变性和中心体分裂，同样的SIK2与癌症的进展有关，某些卵巢癌依赖SIK2激酶来维持细胞增殖和化疗耐药性，并且最近发现SIK2作为有丝分裂纺锤体形成所需的中心体激酶，且作为卵巢癌和乳腺癌疗法的潜在靶点，尤其是其在调节卵巢癌对紫杉醇的敏化中的作用，包括SIK2抑制剂诸如ARN-3236及其类似物(例如ARN-3261)的用途(Zhou等，2016，doi：10.1158/1078-0432.CCR-16-1562，及其中的讨论/参考文献；WO2014/093383；AACR摘要LB-296，Washington DC，2017)。对于SIK3来说，这些过程包括(以及免疫抑制，如下文更详细描述的)小鼠中的葡萄糖和脂质稳态(Uebi等，2012，PloS ONE 7：e37803)、小鼠中骨骼发育期间的软骨细胞肥大(Sasagawa等，2012，Development 139：1153)、小鼠中的骨关节炎(Yahara等，2016，Nature Commun 7：10959)，在小鼠中SIK3缺乏加重了脂多糖(LPS)引起的内毒素休克并伴有促炎性分子水平升高(Sanosaka等，2015，Immunology 145：268)，SIK3作为与卵巢癌的肿瘤发生相关的肿瘤抗原(Chareonfuprasert等，2011，Oncogene 20：3570)，并且作为新型有丝分裂调节剂和用于增强抗有丝分裂治疗剂介导的细胞死亡的靶点(Chen等，2014，Cell Death and Disease 5：e1177)，且SIK3过表达诱导细胞周期蛋白D和E的上调，导致G1/S细胞周期进程的加速(Du等，2015，Exp Opin Therap Targ 4：477)。
受到SIK调控的相关细胞信号传导途径是多种多样的(Walkinshaw等，2013，JBiol Chem 288：9345)，其中不仅糖原异生通过CRTC2/CREB调控及脂肪生成通过p300/ChREBP调控，而且Walkinshaw等人显示LKB1激活SIK2和SIK3，以磷酸化IIa类HDAC并促进它们的细胞质定位。然而，在相同的实验条件下，SIK1被显示不能做到这一点。与SIK2不同，也已报告SIK3具有独特的性质，例如能够不依赖于它的激酶活性促进IIa类HDAC的输出，并能够刺激HDAC4和HDAC7的组成型核突变体的胞质定位，从而突出了SIK家族成员之间的差异。此外，Walkinshaw报告了PKA抵消LKB1、SIK2和SIK3，以抑制IIa类HDAC的核输出。
SIK家族成员已被鉴定为关键的分子开关，其抑制将巨噬细胞重编程为抗炎性表型，然后巨噬细胞显示出细胞因子表达的相应变化(在使用泛SIK小分子抑制剂MRT67307、MRT199665、KIN112和HG-9-91-01治疗后，白介素10(IL-10)的表达提高，并且肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达降低)(Clark等，2012，PNAS 109：16986)。Clark报告了HG-9-91-01似乎是最强力的SIK家族成员抑制剂，也是对SIK家族成员最特异性的抑制剂，但仍显示出对所有三个成员的有意义的抑制，其中对SIK1的效力最高而对SIK3的效力最低，并且这些抑制剂通过诱导cAMP响应元件结合蛋白(CREB)调控的转录辅激活物(CRTC)3的去磷酸化来提高IL-10的生产。SIK抑制剂对IL-10生产的效应在表达SIK2的耐药性突变体的巨噬细胞中丧失。Clark提出，靶向SIK的药物可能具有潜力治疗与不想要的炎症相关的障碍如炎症性肠病(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)和/或自体免疫障碍(WO 2013/136070)。
Sundberg等，2014(PNAS 111：12468；WO 2016/023014)进一步支持了SIK在免疫细胞中的抗炎性作用，描述了使用类似于HG-9-91-01的各种小分子抑制剂(例如WO 2015/006492、WO 2016/014551、WO 2016/014552)来增强树突状细胞(DC)中IL-10的生产以及活化的DC向抗炎性表型的转化。SIK抑制(特别是SIK2抑制)对IL-10生产的这种刺激效应还与促炎性细胞因子IL-1-β、IL-6、IL-12和TNF-α的生产减少相关。
使用被活化DC的上调的IL-10产量表型筛查来测试一组由FDA批准药物组成的超过150种激酶抑制剂的集合，Sundberg还发现批准的药物达沙替尼和博舒替尼也通过涉及CRT3/CREB信号传导的机制上调这种IL-10产量，并且这种对IL-10生产的效应与这些药物与SIK1和SIK2的强力结合相关。事实上，Ozanne等，2015(Biochem J 465：271)证实，在生化分析中达沙替尼和博舒替尼两者都是泛SIK抑制剂(尽管它们对SIK3的抑制效能比SIK1或SIK2低3至5倍)，并且这两种激酶抑制剂(而不是其他蛋白酪氨酸激酶抑制剂)在巨噬细胞中提高IL-10产量，并诱导类似“调节性”巨噬细胞所特有的细胞因子生产模式，特别是IL6、IL12和TNF-α生产的抑制。还已显示，博舒替尼和达沙替尼在巨噬细胞中诱导IL10的这种机制涉及CRTC3去磷酸化和CREB依赖性基因转录，并且巨噬细胞中耐药性SIK2突变体的表达阻断了由博舒替尼和达沙替尼引起的IL10生产。
达沙替尼(SPRYCEL)这种Abl和Src家族蛋白酪氨酸激酶(特别是BCR-ABL)的小分子抑制剂，被批准用于治疗费城染色体阳性(Ph+)慢性髓系白血病(CML)和Ph+急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。达沙替尼已经或正被调查用于大量其他癌症类型，包括实体肿瘤如乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌和非小细胞肺癌，尤其是正在进行与抗PD-1单克隆抗体纳武单抗(OPDIVO)相组合用于治疗复发或难治性Ph+ALL的临床试验。然而，大量报道达沙替尼具有免疫抑制作用，包括在达沙替尼治疗的CML患者中导致感染增加和皮肤癌的形成(Sillaber等，2009，Br J Haematol 144：195)；有实验证据支持达沙替尼对免疫应答的这种抑制。例如：(i)Schade等，2007(Immunobiology 111：1366)报道了达沙替尼在体外以及在使用体内小鼠模型时均抑制外周血T淋巴细胞(PBT)中T细胞的活化和增殖。这种抑制性活性不由凋亡诱导，而且还导致对促炎性细胞因子(例如TNF-α)的生产的抑制。(ii)Fraser等，2009(Exp Hematol 37：1435)报道，达沙替尼治疗的小鼠对LPS施用做出相应的TNF-α血清水平降低，以及IL-10血清水平升高；(iii)Futosi等，2012(Blood 119：4981)报道了达沙替尼引起成年人嗜中性粒细胞的促炎性功能的抑制，导致TNF-α生产和嗜中性粒细胞趋化性二者的抑制，并提出达沙替尼可能在中性粒细胞相关的炎性疾病中有益。
相反，来自一个长期使用达沙替尼治疗的研究小组的某些临床观察表明了达沙替尼对免疫系统的影响的双重作用：(i)Ph+白血病患者的一个子集(n＝22)显示出T/NK细胞的克隆扩增，并具有在这类患者中常见的不良反应比如结肠炎和胸膜炎(Mustjoki等，2009，Leukemia 23：1389)；并且(ii)在某些(n＝55)Ph+白血病患者中，由达沙替尼诱导的细胞毒性淋巴细胞的快速动员密切反映了药物血浆浓度(Mustjoki等，2013，Leukemia 27：914)。一些实验证据支持了这种与达沙替尼治疗相关的免疫增强的对比观察：(i)Wu等，2014(Leukemia 28：179)报告了3种蛋白酪氨酸激酶抑制剂的离体作用，其中只有达沙替尼在长期诱导离体环境中显示出γ-δT细胞的增殖和抗肿瘤应答；(ii)Kreutzman等，2014(OncoImmunology 3：e28925)报道了使用来自于CML患者的原代样品(n＝23)，达沙替尼在表达颗粒酶B的T细胞中促进Th1类型的应答；(iii)Hekim等，2017(Cancer Immunol DOI：10.1158/2326-606)最近报道了在几个鼠类实体肿瘤模型中达沙替尼改变免疫细胞谱，并伴随有肿瘤生长减少。
最近已经阐明了各种不同SIK抗炎作用的进一步特异性。例如：(i)Darling等，2016(Biochem DOI：10.1042/BCJ20160646)使用SIK1、SIK2和SIK3的敲入突变体，显示了所有SIK家族成员都对以高水平的抗炎性细胞因子，包括IL-10，的分泌为特征的巨噬细胞表型有贡献。然而，对于IL-10生产来说，SIK2似乎比SIK3更重要，因为尽管与SIK2不同，突变体SIK3敲入显示出IL-10 mRNA的增加，但对实际IL-10分泌的作用有限。然而，重要的是，任何突变体SIK的敲入都导致TNF-α生产以及其他促炎性细胞因子的减少。(ii)研究了HG-9-91-01和另一种SIK2抑制剂ARN-3236两者，Lombardi等，2016(J Leuk Biol 99：711)报道了人髓系细胞中的SIK抑制调节TLR和IL-1R信号传导并诱导抗炎表型；(iii)Sundberg等，2016(ACS Chem Biol 11：2105)开发了用于研究体内SIK功能的化学探针。他们使用基于MARK3/Par-1激酶结构域的结合模型，证实了可以开发对单个SIK具有增高选择性的SIK抑制剂，例如YKL-05-099，其具体来说对SIK2显示出增高的选择性。他们能够在体内重演他们先前观察到的抗炎表型(包括TNF-α生产的减少)，并显示出YKL-05-099治疗引起总脾白细胞中HDAC5在SIK调控的Ser25处的磷酸化的剂量依赖性降低。
肿瘤坏死因子(TNF)，旧称肿瘤坏死因子α(TNF-α)，因其诱导实验性癌症的快速出血性坏死能力在1975年首次被发现(并在1984年被克隆)，尽管其历史可以追溯到到1890年代Coley的工作。随着人们认识到重组细胞因子可以诱导内毒素休克的征兆和症状，对TNF将成为一种强有力的抗癌细胞因子的早期希望很快消失：治疗指数很小(Balkwill 2009，Nature Rev Cancer 9：361)。因此，毫不奇怪，TNF(tasonermin；BEROMUN)自从在欧盟获批以来仅用于特定应用：通过温和的低温隔离肢体灌注与美法仑联合使用，以预防或延迟因肢体软组织肉瘤引起的截肢。然而，最近人们对TNF的潜在治疗用途重新产生了兴趣，特别是因为现在对它在抗肿瘤和促肿瘤作用两者中的双重作用，以及尤其是通过NF-κB控制的这些作用之间的转换，特别是如何控制这些转换(例如通过使用本发明的教导)，已了解得更多。
与许多对TNF进行的早期抗癌试验并行地，下述观察也被显著关注，即针对TNF的中和抗体(由被动免疫诱导)保护小鼠免受致死性的TNF介导的内毒素血症。这些研究有助于证明TNF既有效地杀肿瘤，又是炎症的必需介导物。实际上，很快明朗的是，TNF既独立地，又通过它诱导IL-6表达的能力，而成为一种高度促炎性药剂。这些早期发现代表了那些直接导致与假定有效的癌症疗法相反的开创性的研究，及是中和TNF以抑制炎症的方法(Sedger&McDermott 2014，Cytokine&Growth Factor Reviews 25：543)。此后，已经开发了大量抗TNF治疗剂，包括结合到(并隔离)TNF的抗体或同样结合到(并隔离)TNF的重组TNF受体的片段，由此降低游离/活性TNF的水平。抗TNF药物的实例包括：嵌合小鼠Fv和人Fc抗TNF单克隆Ig英夫利昔单抗(IFX)，人源化或完全人类Fv抗TNF单克隆Ig阿达木单抗(ADA)，戈利木单抗(GOL)和humicade(HUM)；基于TNFR2的人Ig Fc依那西普(ETA)，聚乙二醇化的重组细胞外TNFR1奥那西普(ONE)和聚乙二醇化的人IgG1 Fab’赛妥珠单抗(CET)。这些获批的产品被批准用于诸如类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、斑块型银屑病和克罗恩病的障碍。然而，也有关于使用抗TNF生物制剂的患者发生淋巴瘤和其他血液恶性肿瘤的报道。这些报告包括淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤、未知亚型的B细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、未指明的淋巴瘤和肝脾性T细胞或γ-δT细胞淋巴瘤)和急性白血病的报告(参见Sedger&McDermott 2014中的参考文献)。作为可察觉的血液恶性肿瘤的增加，以及这些和其他免疫抑制药剂的广泛使用，的直接结果，WHO肿瘤分类现在包括“与医源性免疫缺陷相关的淋巴增殖性疾病”类别。
因此，从上述一个或多个观点出发，对于这样的新方法存在着需求，即使与增殖性障碍(例如肿瘤)有关的细胞对免疫系统更加敏感，特别是回避肿瘤免疫逃逸机制。本发明尤其力图提供涉及现有或新化合物的新的治疗手段和方法，例如使这些细胞对免疫系统或其组分的细胞毒性反应敏感的化合物。此外，本发明力图提供诊断、预后和/或监测对这种免疫应答或组分的细胞抗性的新策略，以及用于鉴定可用于治疗增殖性障碍的化合物的筛选方法。因此，本发明的目的是提供替代、改进、更简单、更廉价和/或集成的装置或方法，以解决一个或多个这些或其他问题。通过如本文中任何地方公开或定义的主题内容，例如通过随附的权利要求书的主题内容，这个构成本发明的基础的目的得以解决。
发明内容
总的并且简要来说，本发明的主要方面可以如下所述：
第一方面，本发明涉及一种通过抑制SIK3和/或使与增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感，在受试者中治疗所述增殖性障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3抑制剂。
第二方面，本发明涉及一种使与增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感的方法，所述方法包括将所述与增殖性障碍有关的细胞暴露于SIK3抑制剂。
第三方面，本发明涉及一种杀死与增殖性障碍有关的细胞的方法，所述方法包括将所述与增殖性障碍有关的细胞暴露于：(i)TNF、TNF变体和/或TNFR1或TNFR2信号传导的激动剂；和(ii)SIK3抑制剂。
第四方面，本发明涉及一种在受试者中治疗增殖性障碍的方法，所述方法包括将与所述增殖性障碍有关的细胞暴露于：(i)TNF、TNF变体和/或TNFR2或TNFR1信号传导的激动剂；和(ii)SIK3抑制剂。
第五方面，本发明涉及一种在正用TNF治疗增殖性障碍的受试者中提高使用TNF的治疗的治疗指数的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3的抑制剂。
第六方面，本发明涉及一种使患有增殖性障碍的受试者对包括向所述受试者施用TNF的疗法敏感的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3的抑制剂。
第七方面，本发明涉及一种在正用抗TNF药剂治疗的受试者中降低血液增殖性障碍的风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3的抑制剂。
本发明还涉及各种不同的测定方法，对这些测定方法有用的物品和药剂盒，以及用于鉴定化合物的各种不同方法。
附图说明
附图示出了：
图1：SIK1、SIK2和SIK3的比较性结构特点的图形表示。N-端激酶结构域用灰色矩形表示，中间的遍在蛋白结合结构域用白色矩形表示，C-端序列用浅灰色条表示。
图2：用于评估siRNA转染的PANC-1-luc细胞的T细胞介导的杀死的基于萤光素酶的细胞毒性测定法。图显示了肿瘤细胞在用TIL#1或存活蛋白特异性T细胞克隆激惹20h后的剩余萤光素酶活性(RLU)，其被归一化到乱序对照siRNA(siCtrl)的信号。
图3：(A)将PANC-1-luc细胞用靶向SIK3的单一(s1、s2或s3)或合并的(合并物)siRNA序列感染。乱序siRNA被用作对照(siCtrl)。在72h后，使用qPCR评估mRNA表达。数据被归一化到GAPDH。(B)与乱序对照siRNA(siCtrl)相比，在通过各种不同的siRNA进行siRNA沉默后SIK3蛋白的Western印迹。(C)基于萤光素酶的细胞毒性测定法证实了当将PANC-1细胞(各自具有通过用所指示的siRNA转染而被沉默的SIK或PD-L1)暴露于TIL#1T细胞时所述效应的SIK3特异性。(D)在(C)中作为比率呈现的数据在两种设置(存在与不存在T细胞)下的归一化的RLU值。
图4：(A)检测在用所指示的siRNA转染后与TIL#2共培养6h后，PANC-1细胞的T-细胞介导的细胞毒性的铬释放测定法。(bB)用于检测在从所指示的siRNA转染起72h的PANC-1细胞中的PD-L1和CEACAM6蛋白质水平的Western印迹分析。乱序siRNA被用作阴性对照。
图5：使用YOYO-1染料用于评估肿瘤细胞死亡的实时活细胞显微术。从使用所指示的siRNA转染起72h，将MCF-7(A)和SW480(B)分别与存活蛋白特异性T细胞克隆或与TIL#1共培养。图显示了YOYO-1+细胞的面积/孔(μm2/孔)作为细胞死亡的度量。
图6：(A)将M579-表达萤光素酶的黑素瘤细胞(M579-A2-luc)用所指示的siRNA转染，在共转染后20h进行基于萤光素酶的杀死测定法。(B)将M579-A2-luc细胞用SIK3过表达载体(SIK3over)或对照载体(EV)转染，其中T细胞介导的细胞毒性如(A)中进行评估。
图7：(A)将PANC-1细胞与TIL#1在浓度逐渐提高的SIK抑制剂HG-9-91-01存在下共培养，并使用如图3C中的基于萤光素酶的杀死测定法测量T细胞介导的细胞毒性。细胞毒性与存活性设置之间的信号被表示为比率。(B)显示了在(A)中作为比率显示的两种设置的绝对信号。(C)基于萤光素酶的细胞毒性测定法。将PANC-1-luc细胞用所指示的siRNA转染72h，然后与所陈述的浓度的达沙替尼温育，然后用100ng/mL的rHuTNF刺激18h(或无刺激)。(D)PANC1-luc和M579-A1-luc细胞系中SIK1、SIK2和SIK3的表达，其通过qPCR确定(归一化到GAPDH表达)。(E)与PD-L1(和乱序siRNA对照)的siRNA沉默相比，在三种SIK家族成员中的每一者的siRNA沉默后PANC1-luc肿瘤细胞的流感(Flu)抗原特异性的T细胞介导的细胞毒性。(F)与PD-L1(和乱序siRNA对照)的siRNA沉默相比，在三种SIK家族成员中的每一者的siRNA沉默后M579-A2-luc肿瘤细胞的Flu抗原特异性的T细胞介导的细胞毒性。(G)与乱序siRNA对照相比，在SIK1和SIK2的siRNA沉默后，达沙替尼对M579-A2-luc肿瘤细胞的TNF介导的细胞毒性的影响。
图8：将PANC-1-luc细胞用靶向SIK3的单一(s1、s2或s3)或合并的(合并物)siRNA序列转染。乱序siRNA被用作对照(siCtrl)。在72h后，将肿瘤细胞用肿瘤活化的(A)、未刺激的(B)或CD3-CD28珠子活化的T细胞(C)的上清液(Sup)处理，在20h后，使用基于萤光素酶的杀死测定法测量所述上清液对肿瘤细胞的细胞毒性的影响。对于每个实验来说，将siRNA转染的肿瘤细胞用作为阴性对照的培养基(Unst)处理，并且没有观察到显著变化。图显示了在用所指示的上清液刺激后的剩余萤光素酶活性(RLU)，被表示为与未刺激的siCtrl处理相比萤光素酶活性的倍数变化。与乱序对照siRNA(Scr1)相比，在用SIK3 siRNA(s1、s3或合并物)转染72h后，暴露于多克隆活化T细胞(D)或仅仅培养基(E)的上清液的PANC-1细胞的WST-1存活性测定法。
图9：(A)将来自于CD3-CD28珠子刺激的T细胞的上清液与100(+)、300(++)或900(+++)ng/mL的抗TNF中和抗体温育。同型对照(Ctrl Ab)以900ng/mL的浓度使用。然后，使siSIK3转染的PANC-1-luc细胞经受所述预处理过的上清液24h，并使用基于萤光素酶的杀死测定法测量细胞毒性。图显示了肿瘤细胞的剩余萤光素酶活性(RLU)的归一化的值。(B)用于检测从TIL#1分泌的TNF的Luminex测定法。将TIL#1与PANC-1细胞或与CD3/CD28珠子(多克隆刺激)共培养。在刺激后24h，收集上清液用于TNF测量。(C)来自于CD3-CD28珠子刺激的T细胞的上清液与抗TRAIL和抗FASL中和抗体的温育(按照(A))，在SIK3温育后不导致细胞毒性降低，这不同于与所述抗TNF中和抗体的温育。
图10：(A)rHuTNF处理对用所指示的siRNA转染的PANC-1-luc细胞的存活性的剂量响应效应。细胞毒性如(图9A)中所述来测量。图显示了肿瘤细胞在用rHuTNF处理后的原始萤光素酶活性(RLU)。(B)100ng/mL TNF处理对用所指示的siRNA转染后的PANC-1细胞的存活性的影响。细胞死亡使用测量YOYO-1染料的核掺入的实时活细胞显微术来评估。图显示了6h刺激后的图像的YOYO-1+细胞的面积/孔(μm2/孔)，使用了来自于同一实验的9个不同图像的累积数据。
图11：(A)使用R-藻红蛋白AffiniPure F(ab′)2片段山羊抗小鼠IgG(H+L)(Jackson Immuno Research，目录号115-116-146 46)检测的与抗TNFR1抗体(HycultureGmbH，目录号HM2020B)温育的PANC-1细胞的FACS分析，显示出TNFR1被PANC-1细胞显著表达。与抗TNFR1抗体同样检测的与抗TNFR2抗体(Acris Antibodies GmbH，目录号：AM20008AF-N)温育的细胞的FACS分析，显示出TNFR2被TILS(B)但不被PANC-1细胞(C)显著表达。(D)TNF和TNFR1阻断对用100ng/mL rHuTNF处理后的SIK3 siRNA转染的PANC-1-luc细胞的影响。萤光素酶强度如图9A中所述来测量。(E)TNF和TNFR1阻断对用100ng/mL rHuTNF处理后的乱序对照siRNA感染的PANC-1-luc细胞的影响。萤光素酶强度如图9A中所述来测量。
图12：将SIK3或乱序对照(siCtrl)siRNA转染的PANC-1-luc细胞用100ng/mLrHuTNF处理。在所指示的时间点后，收获肿瘤细胞并分离总蛋白级分。对活性半胱天冬酶8(A)、活性半胱天冬酶9(B)和pJNK(C)进行Luminex测定。图显示了在归一化到GAPDH后被分析物特异性珠子的荧光强度中值(MFI)。
图13：(A)基于萤光素酶的细胞毒性测定法。将PANC-1-luc细胞用所指示的siRNA转染72h，并用100ng/mL rHuTNF刺激24h。图显示了肿瘤细胞的剩余萤光素酶活性。(B)将PANC-1细胞用所指示的siRNA转染72h，然后用100ng/mL rHuTNF刺激所指示的时间。然后进行ELISA以检测NF-KB的核p65亚基。图显示了归一化到未刺激的对照后的λ450nm处的吸收值。(C)将PANC-1细胞用SIK3过表达载体(SIK3 over)或用对照载体(EV)瞬时转染48h。如(B)中所述进行p65 NF-KB ELISA。
图14：在4h后受TNF显著调控并受SIK3的siRNA沉默显著影响的386个基因的二维分层聚类(转换的Z-分值，归一化的每百万的计数；曼哈顿距离，沃德法)。将通过用SIK3siRNA(siSIK3)处理剥夺SIK3的PANC1细胞和用乱序对照siRNA(siCtrl1)处理的对照细胞各自暴露和不暴露于TNF(每个条件两个平行样)。
图15：实时活细胞显微术，其显示了用shCtrl或shSIK3慢病毒构建物转导的M579细胞的TIL209介导的裂解的平均值+/-SEM。图指示了YOYO-1+细胞的面积/孔(um2/孔)。
图16：(A)体内小鼠实验的示意图。对免疫缺陷(NOD scidγ；NSG)小鼠的左胁和右胁分别进行shCtrl或shSIK3转导的M579细胞的皮下(s.c.)植入。(B)小鼠在第3、10、17和24天接受TIL209(n＝9)或单独的PBS(n＝7)的静脉内(i.v.)注射。(C)肿瘤生长曲线，其显示了用TIL209或PBS处理的小鼠中shCtrl或shSIK3移植的M579肿瘤的肿瘤体积(mm3)的平均值+/-SEM。统计学差异使用未配对单侧Mann-Whitney U检验来计算。(D)TNF与肿瘤细胞上的TNFR1(TNFR-I)的结合引起下游信号传导级联，其涉及半胱天冬酶8切割、NF-κB核易位和SIK3磷酸化。NF-κB和核保留通过它的乙酰化来维持，并且HDAC4脱乙酰酶充当NF-κB的负调控物。TNF刺激提高pLKB1水平，其进而引起SIK3活化提高。SIK3将HDAC4磷酸化，从而启动它从核向胞质的穿梭。核HDAC4的缺乏维持NF-κB的核保留。核NF-κB导致促存活和抗凋亡基因的反式激活，其进而阻碍半胱天冬酶8活化。
图17：在实施例9中所描述的使用M579-A1-luc的测定法中，单独的(正方形)或与10ng/mL TNF相组合(圆圈)的各种不同浓度的通式1的某些化合物的相对肿瘤细胞存活率(通过细胞毒性/存活性归一化的RLU)。还显示了所述化合物对SIK家族成员和对相关激酶ABL1和SRC的指示性抑制活性，所述激酶用表4使用的指示符显示。(A)泛SIK和ABL1&SRC抑制剂，化合物B1；(B)ABL1&SRC抑制剂，化合物B8；(C)SIK1、SIK2和ABL1&SRC抑制剂，化合物B4。
图18：在luc测定法中，SIK家族成员选择性抑制剂与10ng/mL相组合的M579 A2肿瘤细胞存活率(RLU)。(A)强的SIK1和SIK2抑制剂，但弱的SIK3抑制剂，化合物A11。(B)强的SIK2抑制剂，但弱的SIK3和弱的SIK1抑制剂，化合物A6。
详细描述
本发明及其特定的非限制性方面和/或实施方式，可以如下更详细地描述：
第一方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种通过抑制SIK3而在受试者中治疗增殖性障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3抑制剂。
一个可选的第一方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种通过使与增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感而在受试者中治疗所述增殖性障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3抑制剂。
另一个可选的第一方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种通过抑制SIK3及(例如，由此)使与增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感，而在受试者中治疗所述增殖性障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3抑制剂。
一个相关的第一方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种用于在受试者中治疗增殖性障碍的SIK3的抑制剂，其中所述治疗涉及(例如由其介导)：(i)使与所述增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感；和/或(ii)抑制SIK3。另一个相关的第一方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种SIK3抑制剂的用途，其用于制造在受试者中治疗增殖性疾病的药物，其中所述治疗涉及(譬如由其介导)：(i)使与所述增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感；和/或(ii)抑制SIK3。所述药物的制造优选地包括以适合于所述SIK3抑制剂向与所述增殖性障碍有关的细胞的特异性递送的形式制备、配制或以其他方式提供所述SIK3抑制剂的步骤。在这些相关实施方式的某些实施方式中，在这种治疗中，所述抑制剂：(i)使所述与所述增殖性障碍有关的细胞对所述细胞介导的免疫应答敏感；和/或(ii)抑制SIK3。在这些实施方式的某些所述方式中，所述SIK3抑制剂是能够：(i)使与所述增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感；和/或(ii)抑制SIK3的SIK3抑制剂。
另一方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种用于在受试者中，在增殖性障碍的治疗中使与所述增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3抑制剂；并且另一方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种用于在受试者中，在增殖性障碍的治疗中抑制SIK3的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3抑制剂。
相关的另一方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种SIK3的抑制剂(如SIK3抑制剂)，其作为药物用于：(i)使与增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感；和/或(ii)抑制SIK3。
又一个相关的另一方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种SIK3抑制剂，其作为药物(例如免疫肿瘤药物)用于使与增殖性障碍(例如肿瘤或癌症)有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感，例如使与增殖性障碍有关的细胞对可能由所述细胞介导的免疫应答的杀死(细胞死亡)敏感。“免疫肿瘤”药物是普通技术人员可认出的药物，并包括旨在(如被特别设计用于)针对生物体(例如人)中存在的癌或肿瘤细胞增加该生物体的免疫系统的一种或多种组分的药物。免疫肿瘤药物可以是结合到外来免疫(抑制性)检查点分子(例如本文中别处描述的检查点分子)并且(如直接)抑制T细胞对抗所述癌或肿瘤细胞的功能的药物(例如抗体)，或者免疫肿瘤药物可以是抑制所述癌或肿瘤细胞固有的免疫调节物(譬如SIK3，在本发明中)的药物，其中这种免疫调节物不主动(如直接)抑制T细胞，而是通过抗性机制保护所述肿瘤或癌细胞免受免疫应答影响。
在这些方面的特定实施方式中，可以使所述与增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答引起(例如由其诱导)的杀死(细胞死亡)敏感。
“盐诱导型激酶3”或“SIK3”(又名QSK和KIAA0999)是包括SIK1、SIK2和SIK3的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶亚家族的成员，所述亚家族属于AMP活化蛋白激酶(AMPK)家族。在本发明的情形中，SIK3蛋白通常是蛋白激酶。关于人类SIK3蛋白的相关信息可以在UniProt上访问：Q9Y2K2(2017年3月15日的条目版本138)，并且在本发明的情形中，SIK3蛋白优选地具有图1中示出的结构域结构，并且更优选地包含在SEQ ID NO：1至4中的任一者(SIK3，2017年3月15日的条目版本138)或SEQ ID NO：13至16中的任一者(SIK3，2018年3月28日的条目版本144)、特别是SEQ ID NO：1或13中示出的氨基酸序列。SIK3是一种具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的胞质蛋白，其通过激酶结构域的T-环中保守的苏氨酸残基(第163位)被LKB1复合物的磷酸化进行调控，所述磷酸化据报道对于SIK3的催化活性来说是必需的(Lizcano，J.M.等，EMBO J.23，833-843(2004))。出于本文公开的发明之目的，术语“磷酸化SIK3”应该是指基本上被磷酸化的SIK3蛋白，因为SIK3蛋白可以被(例如被)LKB1磷酸化，其中优选地这种磷酸化SIK3在第163氨基酸位置处包含磷酸-苏氨酸。在本发明的情形中，磷酸化SIK3是在其细胞-生物背景中被活化的SIK3蛋白。已知至少四种通过SIK3基因产物的可变剪接产生的蛋白亚型(SIK3-001至SIK3-004)。人类SIK3基因位于染色体位置11q23.3处(HGNC基因符号登记号：HGNC：29165)，并且在许多物种例如在黑猩猩、恒河猴、狗、奶牛、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼和蛙中是保守的。在本发明的某些实施方式中，术语SIK3也可以涉及人类SIK3蛋白的变体，其具有与SEQ ID NO：1至4中的任一者或SEQ ID NO：13至16中的任一者、特别是SEQID NO：1或13中示出的氨基酸序列基本上一致或至少80％、优选地85％、更优选地90、95、96、97、98、99或100％序列一致的氨基酸序列，正如使用例如Tatusova&Madden 1999(FEMSMicrobiol Lett 174：247-250)所描述的“Blast 2 sequences”算法所确定的，并且所述变体(优选地)保留与相应的参比SIK3一致或基本上一致的生物活性(例如将一种或多种II(例如IIa)类HDAC、例如HDAC4磷酸化)。SIK3蛋白的优选变体包含由于相应物种的群体之间和群体之内的序列多态性以及与SIK3的野生型序列相比位于SIK3的活性环或活化环(T-环)中或其附近的突变所造成的序列变体。SIK3蛋白的优选变体是SIK3 T163突变，例如影响SIK3的活化的突变。在优选实施方式中，本发明的SIK3蛋白不是SIK1(又名SIK和SNF1LK)蛋白和/或不是SIK2(又名QIK、KIAA0781和SNF1LK2)蛋白。人类SIK1(UniProt：P57059；2017年3月15日的条目版本168)和人类SIK2(UniProt：Q9H0K1；2017年3月15日的条目版本153)的氨基酸序列分别示出在SEQ ID NO：5和6中。当适用于上下文时(如果没有更具体指明)，术语SIK3可以意味着SIK3蛋白(例如上文描述的SIK3蛋白)或编码这种SIK3蛋白的mRNA分子。对于“SIK1”和“SIK2”来说，应当理解类似的含义。
“SIK3的抑制剂”(或“SIK3抑制剂”)是抑制SIK3的任何组成部分，这可以意味着SIK3、特别是SIK3的mRNA和/或蛋白、特别是磷酸化SIK3的表达(例如量)、功能、活性和/或稳定性的抑制。SIK3抑制剂可以削弱、抑制、减少和/或降低细胞中SIK3(例如SIK3mRNA或蛋白)的表达。在这种情形中，术语“表达”意味着将基因转录成mRNA和随后所述mRNA翻译成蛋白质(以及在某些实施方式中，这种蛋白质的后续运输和定位)的细胞过程。因此，“基因表达”可以仅仅是指mRNA的生成而不管如此产生的mRNA的命运如何，或者可选地/另外地是指所述表达的mRNA翻译成蛋白质(或这种蛋白质的运输和定位)。另一方面，术语“蛋白质表达”可以是指蛋白质的合成和/或其运输/定位到某些细胞区室中的完整细胞过程。SIK3抑制剂可以削弱(例如引起其减小或降低)SIK3的一种或多种活性的效率、有效性、量或速率(举例来说，通过削弱SIK3蛋白的表达和/或磷酸化SIK3蛋白的量)，诸如本文中描述的一种或多种活性，例如SIK3的将II(如IIa)类HDAC(如HDAC4)磷酸化和/或使与增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感的活性。SIK3抑制剂可能对SIK3(例如SIK3 mRNA或蛋白)的稳定性具有负面影响，这应该在其最广泛的意义上理解，并且将包括诸如在细胞内干扰并降低SIK3蛋白半衰期或干扰和扰乱SIK3蛋白折叠、蛋白质呈递或运输/定位的抑制剂。
这种SIK3抑制性组成部分可以直接起作用，例如，通过结合到SIK3并降低SIK3的一种或多种特性诸如其表达、功能和/或稳定性、特别是它充当激酶(例如将HDAC4磷酸化)的能力的量或速率，譬如通过降低细胞中磷酸化SIK3的量或活性。SIK3抑制剂也可以通过削弱SIK3的表达、稳定性，例如，通过结合到SIK3蛋白或mRNA并修饰它，譬如通过移除或添加组成部分或改变它的三维构象，和通过结合到SIK3蛋白或mRNA并降低它的稳定性或构象完整性，来降低SIK3功能或活性的量或速率。可选地，SIK3抑制剂可以间接起作用，例如通过结合到调控分子或基因区以调节这些调控蛋白或基因区的功能，并因此必然地影响SIK表达(例如量)、功能/活性和/或稳定性的量或速率的降低，特别是通过削弱SIK3蛋白或mRNA的一种或多种活性(例如通过改变SIK3蛋白或mRNA的表达和/或稳定性的量或速率)。因此，SIK3抑制剂可以通过削弱，譬如降低，SIK3表达(例如量)的量或速率、功能/活性和/或稳定性的任何机制起作用。直接作用于SIK3的SIK3抑制剂的非限制性实例包括：(i)结合到SIK3 mRNA并降低其表达的siRNA或shRNA分子；和(ii)结合到SIK3的催化结构域并降低SIK3的激酶活性的小分子组成部分。间接作用于SIK3的SIK3抑制剂的非限制性实例包括：(i)结合到LKB1 mRNA并降低其表达的siRNA或shRNA分子；和(ii)结合到LKB1的催化结构域并降低LKB1的激酶活性的小分子组成部分，其在每种情况下通过降低LKB1蛋白的量或活性，间接地降低磷酸化SIK3蛋白的量(以及因此其活性)。间接SIK3抑制剂也可以是例如胰高血糖素受体(或胰岛素受体)的拮抗剂(例如阻断性抗体)，其随后降低细胞中SIK3(或phospo-SIK3)蛋白的量和/或活性。
SIK3抑制剂的一般性和特定实例在本文中别处描述，包括那些可以通过本文中阐述的适用功能和/或结构特点来表征的抑制剂。
当在本文中使用时，“受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人类，但是也包括非人类灵长动物如食蟹猴。它还包括狗、猫、马、绵羊、山羊、奶牛、兔、猪和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。应该认识到，根据本发明，特别优选的受试者是人类受试者，例如患有障碍、疾病或病症(或处于患有它们的风险下)的人，如人类患者。
当在本文中使用时，“疗法”与治疗疾病、障碍或病症同义，其包括减轻所述疾病、障碍或病症的症状，抑制所述疾病、障碍或病症的进展，引起所述疾病、障碍或病症的减退和/或治愈所述疾病、障碍或病症。
在本发明中，术语“治疗”意味着包括疗法，例如治疗性治疗以及用于疾病(或障碍或病症)的预防性或抑制性措施。因此，举例来讲，在疾病发作之前SIK3抑制剂的成功施用导致所述疾病的治疗。“治疗”还涵盖在疾病出现之后施用SIK3抑制剂，以便改善或根除所述疾病(或其症状)。在发作之后和临床症状之后施用SIK3抑制剂并伴有临床症状的可能减轻和疾病的可能改善，也构成所述疾病的治疗。那些“需要治疗的”受试者包括已经具有所述疾病、障碍或病症的受试者(例如人类受试者)，以及易于或疑似具有所述疾病、障碍或病症的受试者，包括将要在其中预防所述疾病、障碍或病症的受试者。
在本文描述的发明的情形中，所述疾病、障碍或病症是增殖性障碍(包括与这类障碍相关的病症或症状)。
“增殖性障碍”是指以细胞的异常增殖为特征的障碍。增殖性障碍不暗示对细胞生长速率的任何限制，而是仅仅指示了影响生长和细胞分裂的正常控制的丧失。因此，在某些实施方式中，增殖性障碍的细胞可以具有与正常细胞相同的细胞分裂速率，但是对限制这种生长的信号没有响应。在“增殖性障碍”的范围内包括组织或细胞的异常生长的赘生物或肿瘤。癌症是本领域已知的，并且包括以具有侵入周围组织和/或转移到新的定殖位点的能力的细胞的增殖为特征的各种不同恶性赘生物中的任一种。增殖性障碍包括癌症、动脉粥样硬化，类风湿性关节炎、特发性肺纤维化和肝硬化。非癌性增殖性障碍还包括皮肤中的细胞的过度增殖，例如银屑病及其各种临床形式、莱特尔氏综合征、毛发红糠疹、角质化障碍的过度增殖性变型(如光化性角化病、老年性角化病)、硬皮病等。
在更特定实施方式中，所述增殖性障碍是癌症或肿瘤，特别是实体肿瘤(包括与这些癌症或肿瘤相关的病症或症状)。这些增殖性障碍包括但不限于头颈癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、生殖细胞肿瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾横纹肌样瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、任何血液恶性肿瘤(如慢性成淋巴细胞性白血病、慢性髓单核细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓系白血病、急性成髓细胞白血病、慢性成髓细胞性白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓系白血病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病、肥大细胞白血病、肥大细胞赘生物、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、蕈样肉芽肿、西扎里综合征、皮肤T-细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴、慢性骨髓增殖性障碍、骨髓纤维化、髓样化生、系统性肥大细胞增多症)和中枢神经系统肿瘤(如脑癌、成胶质细胞瘤、非成胶质细胞瘤脑癌、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤和脉络丛乳头状瘤)、骨髓增殖性障碍(如真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化)、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、类癌或肝癌。
在一个优选实施方式中，本发明的各个不同方面涉及诸如将所述SIK3抑制剂用于治疗增殖性障碍，包括本文中描述的那些增殖性障碍。因此，在一个实施方式中，所述增殖性障碍可以是肿瘤，特别是实体肿瘤。
所述针对细胞介导的免疫应答进行敏化的细胞是涉及所述增殖性障碍的细胞(例如与所述增殖性障碍相关的细胞)，在某些实施方式中这种细胞是参与所述增殖性障碍的细胞(例如正异常增殖的细胞，譬如正过度增殖的细胞)。举例来讲，这种细胞可以是以影响其生长和细胞分裂的正常控制的丧失为特征的细胞，如赘生物或肿瘤的细胞。在特定实施方式中，这种细胞可以是癌细胞或源自于癌症或肿瘤的细胞，或者是癌症或肿瘤的细胞。在其他实施方式中，这种细胞可以是皮肤细胞，例如显示出过度增殖的皮肤细胞，如涉及银屑病、莱特尔氏综合征、毛发红糠疹或硬皮病的细胞。
如果，举例来讲，细胞与增殖性障碍相关联，诸如它是这种增殖性障碍中的病因因素，或者如果它受这种增殖性障碍影响，则所述细胞可能“与所述增殖性障碍有关”。具体来说，如果细胞以异常增殖譬如异常的细胞生长或细胞分裂为特征，并且如果所述异常的细胞生长或细胞分裂是增殖性疾病的病理或病因的一部分，则所述细胞“与所述增殖性障碍有关”。在其中增殖性障碍是肿瘤或癌症的实施方式中，作为非限制性实例，“与增殖性障碍有关的”细胞可以是肿瘤(或癌)细胞，或者是源自于这种肿瘤或癌症、特别是实体肿瘤的(组织)的细胞。
在某些实施方式中，所述SIK3抑制剂可以抑制与所述增殖性障碍有关的细胞(例如肿瘤细胞)中的SIK3。在特定的此类实施方式中，所述SIK3抑制剂可以偏好性地抑制这种细胞中的SIK3优于抑制这种细胞中的SIK1和/或SIK2；和/或可以偏好性地抑制这种细胞中的SIK3优于抑制一种或多种类型的免疫细胞中的SIK1和/或SIK2和/或SIK3。例如，所述SIK3抑制剂可以抑制与所述增殖性障碍有关的细胞(如肿瘤细胞)中的SIK3优于抑制巨噬细胞和/或树突状细胞(特别是能够或生产IL-10的细胞)中的SIK1和/或SIK2和/或SIK3。
所述SIK3抑制剂可以被施用到所述受试者，特别是以有效抑制SIK3和/或有效地使所述与增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感的量(例如剂量)。用于这种施用的适合的量、剂型和手段，在本文中别处描述。
在特定实施方式中，所述SIK3抑制剂以有效降低SIK3的活性、优选为所述与增殖性障碍有关的细胞中的SIK3的活性的量(例如治疗有效量)施用。在此类实施方式中，所述SIK3抑制剂的“治疗有效量”可以是能够将SIK3的活性降低到适用水平，但在所述SIK3抑制剂的其他活性方面不引起显著的(例如不可容忍的)副作用或过高剂量的量。
在此类特定实施方式中，所述SIK3抑制剂的这种量可以是不有效降低ABL1和/或SRC激酶、例如所述与增殖性障碍有关的细胞中的ABL1和/或SRC激酶的活性的量。例如(并参考本文表4中示出的活性)，如果达沙替尼将要以有效抑制SIK3的量施用，则它的主要激酶靶(ABL和SRC)也将被抑制，并且可能达到发生达沙替尼的剂量过高或其他副作用例如由ABL和/或SRC的过度抑制介导的副作用的程度。事实上，但不受理论限制，从生物化学(和/或亲和性)的观点来看，达沙替尼可能不能在体内抑制SIK3而不抑制同一细胞中的ABL和/或SRC，并且这种细胞中存在的任何ABL或SRC可能螯合所述细胞中的(大部分)达沙替尼，达到不存在足够的达沙替尼以(有效)充当SIK3抑制剂的程度。因此，在某些实施方式中，当在体内、譬如在与增殖性障碍有关的细胞中起作用时，达沙替尼可能被认为不是本发明的情形中的SIK3抑制剂。在其他某些实施方式中，本发明的情形中的AS1抑制剂可能比抑制达沙替尼更有效地抑制AS1，和/或可能比抑制达沙替尼更低效地抑制ABL和/或SRC激酶。例如，在本发明的情形中，优选的AS1抑制剂可能以低于约100nM、50nM、25nM或10nM(例如低于约25nM)的(生物化学)IC50抑制AS1，并各自以高于约25nM、50nM、100nM或500nM(例如高于约100nM)的IC50抑制ABL和SRC，其中在每种情况下这种IC50可以使用与实施例11或13中描述的生物化学激酶测定法类似的方法来确定。
优选地，SIK3的活性被有效抑制(降低)，和/或ABL和/或SRC的活性不被有效抑制(降低)；在每种情况下，优选是指所述与增殖性障碍有关的细胞中的SIK3、ABL和/或SRC激酶。例如，“有效”抑制(或降低)可以包括其中活性被降低到具有生理效应的程度(或降低到具有生理效应的水平)(如降低到治疗有效水平)，譬如相应激酶的活性降低约10％、20％、50％或超过50％例如70％或90％的抑制。对于SIK3来说，这种降低之一可能为引发治疗响应所需。对于ABL和/或SRC来说，所需的降低水平可能是比SIK3的降低所需的水平更低的水平。
术语“免疫细胞”在本领域中已知用于描述生物体、特别是哺乳动物比如人的参与这种生物体的免疫系统的任何细胞。白细胞(白血细胞)是参与先天性免疫系统的免疫细胞，而适应性免疫系统的细胞是被称为淋巴细胞的特殊类型的白细胞。B细胞和T细胞是淋巴细胞的主要类型，并且源自于骨髓中的造血干细胞。B细胞参与体液免疫应答，而T细胞参与细胞介导的免疫应答。在本发明的优选实施方式中，所述免疫细胞可以是髓系细胞例如T细胞，并且具体来说(例如当需要提高细胞介导的免疫应答以诸如治疗癌症时)，所述T细胞可以是细胞毒性T细胞(也被称为TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T-杀伤细胞、细胞裂解性T细胞、CD8+T-细胞或杀伤性T细胞)。CTL是参与杀死癌细胞、被感染(特别是被病毒感染)的细胞或以其他方式损伤的细胞的T-细胞。对于这些实施方式来说，其他优选的免疫细胞可以包括肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。TIL是离开血流并迁移到肿瘤中的白细胞。通常，TIL是比例可变的不同类型的细胞(即T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞)的混合物，T细胞是最丰富的细胞。TIL通常可以在基质中和肿瘤本身内发现，并与杀死肿瘤细胞有关。肿瘤中淋巴细胞的存在通常与更好的临床结果相关。
当在本文中使用时，术语“细胞介导的免疫应答”可以包括但不限于在宿主生物体中涉及、利用和/或促进下述任一者或其组合的应答：T细胞成熟、增殖、活化、迁移、浸润和/或分化，和/或巨噬细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞(或T细胞)、辅助性T淋巴细胞、记忆性T淋巴细胞、抑制性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞和/或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活化/调节/迁移/浸润，和/或一种或多种细胞可分泌的或细胞分泌的因子例如细胞因子或内分泌物(特别是促炎性细胞因子例如TNF)的生产、释放和/或作用，和/或这些过程中的任一者的一种或多种组分(例如细胞因子或内分泌物，特别是促炎性细胞因子例如TNF)。当在本文中使用时，术语“细胞介导的免疫应答”可以包括涉及遗传工程改造的、体外培养的、自体的、异源的、修饰的和/或转化的T淋巴细胞的细胞应答，或者它可以包括通过遗传工程产生的细胞可分泌的或细胞分泌的因子(例如细胞因子或内分泌物，特别是促炎性细胞因子例如TNF)。细胞介导的免疫应答优选地不是体液免疫应答，例如涉及抗体的释放的免疫应答。在某些实施方式中，特别是当所述增殖性障碍是癌症或肿瘤时，所述细胞介导的免疫应答是抗肿瘤的细胞介导的免疫应答。例如，引起肿瘤(细胞)生长减少的细胞介导的免疫应答，譬如杀死癌症或肿瘤的细胞的细胞毒性细胞介导的免疫应答(如细胞毒性T细胞和/或TNF暴露)。
在某些实施方式中，所述细胞介导的免疫应答可以由能够分泌(例如分泌)促炎性细胞因子的细胞例如免疫细胞介导，所述促炎性细胞因子例如选自下述的一者：白介素-1(IL-1)，IL-12和IL-18，肿瘤坏死因子(TNF)，干扰素γ(IFN-γ)，以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。在特定的这些实施方式中，所述促炎性细胞因子是肿瘤坏死因子(TNF)[α]。
在其他实施方式中，所述细胞介导的免疫应答可以是细胞可分泌的或细胞分泌的因子(例如细胞因子或内分泌物)，特别是可由或由免疫细胞分泌的因子。在特定的这些实施方式中，所述细胞介导的免疫应答是促炎性细胞因子，特别是肿瘤坏死因子(TNF)。
当在本文中用于针对细胞介导的免疫应答被致敏的细胞的情形中时，术语“致敏”、“敏化”和“使……敏感”等将被普通技术人员理解，并且包括下述含义，即所述细胞可以表现出对所述细胞介导的免疫应答对这些细胞可能具有的一种或多种效果(例如治疗效果)提高的易感性。具体来说，被如此致敏的细胞，当在细胞介导的免疫应答存在(如暴露于细胞介导的免疫应答)时，与尚未被如此致敏的自体细胞相比可以被更容易地杀死(比如更快速，细胞死亡或被杀死的比例更高，和/或在细胞介导的免疫应答的更低的量或暴露后)。举例来讲，如此致敏的细胞在暴露于更少数目的T细胞或更低浓度的TNF(例如少或低约10％、20％、30％、40％、50％或超过50％的T细胞或TNF浓度)后，可以被诱导进入细胞死亡(例如凋亡)。确定这些细胞是否已对细胞介导的免疫应答致敏(和致敏程度)的方法在本文中例如实施例中描述。因此，在本发明的某些实施方式中，可以使与所述增殖性障碍有关的细胞对由细胞介导的免疫应答(例如CTL或促炎性细胞因子例如TNF)引起的细胞死亡/杀死(比如通过进入凋亡)敏感。
在本公开的发明的上下文中，术语“肿瘤坏死因子”和“TNF”(以前并因此另被称为肿瘤坏死因子α和TNF-α)应该被理解为是指本领域中在这些名称下已知的任何蛋白质。具体来说，术语TNF涵盖了其中存在它的任何生物体、优选为动物或哺乳动物例如人类的内源TNF。举例说明而非限制地，人类TNF可以涵盖尤其是在Pennica等，1984(Nature 312：724-9)中所公开的和UniProtKB/Swiss-Prot数据库中具有条目号P01375(例如2017年3月15日的条目版本224)的内源蛋白质，及其由人类群体之间和之内的正常序列多态性造成的任何序列变体。作为其他非限制性实例，所述术语可以涵盖在UniProtKB/Swiss-Prot数据库中为牛(Q06599)、狗(P51742)、山羊(P13296)、豚鼠(P51435)、猫(P19101)、马(P29553)、小鼠(P06804)、黑猩猩(Q8HZD9)、猪(P23563)、兔(P04924)、大鼠(P16599)等所注解的内源TNF蛋白，及其由每种相应物种的群体之间和之内的正常序列多态性造成的任何序列变体。此外，术语TNF特别地涵盖了TNF的可溶性、分泌的细胞因子形式，包括其单体形式以及优选地通常更有活性的三聚体形式(参见例如Smith&Baglioni 1987.J Biol Chem 262：6951-4)。对于相应的示例生物体来说，可溶形式的内源TNF的一级氨基酸序列在上面提到的UniProtKB/Swiss-Prot数据库条目中指明。此外，术语TNF也可以涵盖在某些细胞类型的表面上表达的膜结合形式的TNF(参见例如Kriegler等，1988.Cell 53：45-53)。此外，术语TNF也可以涵盖其一级氨基酸序列正如使用诸如由Tatusova&Madden 1999(FEMS MicrobiolLett 174：247-250)描述的“Blast 2 sequences”算法所确定的与内源TNF的序列一致或基本上一致(当在整个本说明书中使用时，“基本上一致的”通常是指≥80％例如，≥85％、优选地≥90％、更优选地≥95％、甚至更优选地≥98％或≥99％的序列一致性)，并且正如使用例如由Flick&Gifford 1984(J Immunol Methods 68：167-75)描述的细胞毒性试验所确定的(优选地)保留与相应的内源TNF一致或基本上一致的生物活性的合成或重组蛋白。正如从本发明的各个方面和实施方式的上下文中明显看出的，术语TNF在本文中可以特别指称由细胞、组织、器官或生物体、优选为人类产生的可溶和/或膜结合的、优选为可溶的内源TNF。然而，术语“TNF”也设想了肿瘤坏死因子的外源形式，特别是通过重组技术产生的外源形式，并且在某些实施方式中，可以在本发明的各个不同方面和实施方式中施用到受试者或暴露于细胞或与细胞相接触。在某些这样的实施方式中，TNF可以是用作治疗剂的重组TNF，例如他索纳明(BEROMUN)。
在某些实施方式中，所述细胞介导的免疫应答可以由分泌促炎性细胞因子的细胞例如淋巴细胞(例如T细胞)、特别是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导。
在特定实施方式中，所述细胞介导的免疫应答可以诱导与所述增殖性障碍有关的细胞的杀死(例如细胞死亡，例如通过凋亡)。例如，所述治疗(方法)可以包括(例如可以涉及)诱导这种与所述增殖性障碍有关的细胞的杀死的细胞介导的免疫应答(或者可以由其介导)。
所述与增殖性障碍有关的细胞可以被一种或多种细胞毒性过程、特别是这些细胞内源的细胞毒性过程例如程序化细胞死亡(PCD)杀死(例如诱导进入细胞死亡)。细胞死亡过程可以包括但不限于坏死(特别是坏死性凋亡)、凋亡、失巢凋亡、自噬、铁死亡、有丝分裂灾难和活化诱导的细胞死亡。在某些优选实施方式中，所述与增殖性障碍有关的细胞(例如肿瘤细胞)被细胞介导的免疫应答(例如被TNF)诱导进入凋亡。在另一个实施方式中，在不存在细胞介导的免疫应答的情况下(例如在不存在TNF的情况下)，所述SIK3抑制剂的施用不杀死这些细胞。在特定的这些其他实施方式中，所述SIK3抑制剂可以以在不存在细胞介导的免疫应答的情况下不有效杀死这些细胞的量(例如剂量)施用。本文中的实施例描述了各种不同的测定法，通过这些测定法可以确定只有在细胞介导的免疫应答存在下才有效杀死这些细胞的SIK3抑制剂的量。
在其他特定实施方式中，所述细胞介导的免疫应答可能涉及至少一种免疫细胞效应分子，特别是可以由免疫细胞分泌或由免疫细胞分泌的效应分子。在特定的这些实施方式中，所述效应分子可以是促炎性细胞因子，优选为肿瘤坏死因子(TNF)。
在某些实施方式中，所述效应分子不是选自Fas配体(FasL或CD95L)和TNF相关的凋亡诱导性配体(TRAIL、CD253或TNFSF10)细胞效应分子。
在本发明的特定实施方式中，所述SIK3抑制剂可以被施用到所述受试者(例如以有效的量或剂量)，意在(或以便)(有效地)使与所述增殖性障碍有关的细胞对TNF诱导的杀死敏感。例如，所述SIK3抑制剂可以以治疗有效量、诸如有效地使与所述增殖性障碍有关的细胞对TNF诱导的杀死(细胞死亡)敏感的量施用。
例如，所述SIK3抑制剂可以被施用到所述受试者(例如以有效的量或剂量)，以诱导由TNF介导的这些细胞的凋亡，譬如当这些细胞在TNF存在下或与TNF相接触时。在其他实施方式中，所述SIK3抑制剂可以被施用到所述受试者(以有效的量或剂量)，以在不存在TNF的情况下引起细胞毒性(例如凋亡)的量的降低，譬如以不引起这些细胞的杀死(例如凋亡)；举例来讲，所述SIK3抑制剂可以以在不存在TNF的情况下，细胞毒性(例如凋亡)不同样有效，诸如不有效诱导这种杀死，的量或剂量施用。
TNF可以通过结合到肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)和/或肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)和/或通过这些受体的信号传导来诱导促凋亡过程。因此，在某些实施方式中，所述SIK3抑制剂可以被施用到所述受试者(以有效的量或剂量)，以(有效地)使与所述增殖性障碍有关的细胞对由肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)信号传导和/或肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)信号传导介导的凋亡敏感。优选地，所述SIK3抑制剂可以被施用到所述受试者(以有效的量或剂量)，以(有效地)使与所述增殖性障碍有关的细胞对由其介导、特别是由TNFR1介导的凋亡敏感。例如，所述SIK3抑制剂可以以治疗有效量施用，所述量有效地介导TNFR1-和/或TNFR2信号传导和/或由其介导的凋亡。
例如，在某些实施方式中，所述SIK3抑制剂可以被施用到所述受试者(以有效的量或剂量)，以通过TNFR1和/或TNFR2信号传导、例如在有活性的TNFR1信号传导后诱导这些细胞的凋亡。在特定的这些实施方式中，所述SIK3抑制剂可以被施用到所述受试者(以一定的量或剂量，例如治疗有效量)，以在不存在TNFR1和/或TNFR2信号传导的情况下，比如在不存在有活性的TNFR1信号传导的情况下，(有效地)诱导细胞毒性(例如凋亡)的量的减少，例如以不诱导这些细胞的凋亡。例如，所述SIK3抑制剂可以以在不存在这些信号传导的情况下，细胞毒性(例如凋亡)不同样有效、诸如不有效诱导这种凋亡，的量或剂量施用。
因此，在某些实施方式中，所述SIK3抑制剂可以被施用到所述受试者(以一定的量或剂量)，以在不存在所述细胞介导的免疫应答的情况下，诱导细胞毒性(例如凋亡)的量的减少，诸如对与所述增殖性障碍有关的细胞来说不是细胞毒性的。
在特定实施方式中，即使所述受试者的肿瘤在治疗期间尺寸增加，所述SIK3抑制剂也可以继续施用到所述受试者。不受理论限制，在这种治疗期间肿瘤尺寸的增加可以指示针对所述肿瘤的细胞的(增强的)免疫反应(例如所述细胞已变得对所述细胞介导的免疫应答敏感)，并且因此在此类实施方式中，所述SIK3抑制剂的施用可以继续实施，以便维持这种敏感性和相关的(增强的)免疫反应。
本发明人在本文中证实了SIK3的抑制与大量关键生物学过程或表型，包括那些令人吃惊地参与细胞先天的细胞毒性过程例如凋亡的控制和/或引发的生物学过程或表型相关。例如，本发明人在实施例中首次证实了可以通过SIK3的抑制使肿瘤细胞对TNF的凋亡效应敏感，所述SIK3的抑制通过多种途径及其组分包括肝脏激酶B1(LKB1、STK11或NY-REN-19)、组蛋白脱乙酰酶4(HDAC4)、活化的B细胞的核因子κ轻链增强子(NF-κB)和受NF-κB调控的促凋亡基因例如半胱天冬酶8和半胱天冬酶9起作用。还证实了c-Jun N-端激酶(JNK)是与通过SIK3的抑制对TNF的凋亡效应的致敏相关的信号传导组分。
在本实施方式(以及在适用时其他实施方式)的情形中，术语“与……相关”可以意味着两种组分、变量、效应或表型彼此相互关联，和/或它们彼此相关(例如关联)，和/或在第一与第二组分、变量、效应或表型之间存在因果联系(例如第二者对第一者做出响应，第二者是第一者的结果，或第二者由第一者引起)。
因此，在一个这样的实施方式中，所述SIK3抑制剂的施用可以与所述与增殖性障碍有关的细胞中NF-κB活性的减损相关(例如通过增加或提高NF-κB易位到核外)。
在特定的这些实施方式中，这种NF-κB活性的减损(例如通过NF-κB易位到核外的增加)，可能与这些细胞中(活化的)TNF和/或TNFR1介导的信号传导(或TNFR2介导的信号传导)相关。
在某些实施方式中，所述SIK3抑制剂可以被施用到所述受试者(以有效的量或剂量)，以减损或抑制所述与增殖性障碍有关的细胞中的NF-κB活性，例如增加或提高这些细胞的NF-κB易位到核外。举例来讲，所述SIK3抑制剂可以以有效(有效地)减损所述与增殖性障碍有关的细胞中的NF-κB活性的量(例如治疗有效量)，特别是以有效(有效地)增加或提高所述与增殖性障碍有关的细胞的NF-κB易位到核外的量，施用到所述受试者。
在可选或另外的实施方式中，所述SIK3抑制剂的施用可能与所述与增殖性障碍有关的细胞中II(例如IIa)类HDAC例如HDAC4的活性、诸如它向这些细胞的核的易位或定位或它在所述核中的活性的提高相关(例如所述SIK3抑制剂以有效提高所述活性的量或剂量施用)，特别是在这些细胞中TNF和/或TNFR1介导的信号传导(或TNFR2介导的信号传导)之后。
在其他可选或另外的实施方式中，所述SIK3抑制剂的施用可能与核NF-κB的脱酰基化(例如在其p65亚基处的脱酰基化)和/或一种或多种抗凋亡因子的反式激活的降低相关，特别是在所述与增殖性障碍有关的细胞中TNF和/或TNFR1介导的信号传导(或TNFR2介导的信号传导)之后。举例来讲，所述SIK3抑制剂可以被施用(例如以有效的量或剂量)，以引起核NF-κB的脱酰基化(例如在其p65亚基处)和/或一种或多种抗凋亡因子的反式激活的降低。
在另一个可选或另外的实施方式中，所述SIK3抑制剂的施用可能与所述与增殖性障碍有关的细胞中半胱天冬酶8和/或半胱天冬酶9的切割的增加相关(例如，所述SIK3抑制剂以诸如有效增加所述切割的量或剂量施用)，特别是在这些细胞中TNF和/或TNFR1介导的信号传导(或TNFR2介导的信号传导)之后。
在其他可选或另外的实施方式中，所述SIK3抑制剂的施用可能与一种或多种抗凋亡因子的转录降低相关，特别是在所述与增殖性障碍有关的细胞中TNF和/或TNFR1介导的信号传导(或TNFR2介导的信号传导)之后，比如在这些细胞中一种或多种NF-κB靶基因的转录降低。特别地，所述SIK3抑制剂被施用(例如以有效的量或剂量)以降低一种或多种此类抗凋亡因子的转录，特别是在所述与增殖性障碍有关的细胞中TNF和/或TNFR1介导的信号传导(或TNFR2介导的信号传导)之后。
在一个实施方式中，所述SIK3抑制剂的施用可能与所述与增殖性障碍有关的细胞中JNK活化(例如通过磷酸化)的增加相关，例如所述SIK3抑制剂以诸如有效增加所述活化的量或剂量施用，特别是在这些细胞中TNF和/或TNFR1介导的信号传导(或TNFR2介导的信号传导)之后。
在另一个实施方式中，所述SIK3抑制剂的施用可能不与CREB途径信号传导的显著改变和/或由CREB和/或CREB调控介导的基因表达的显著改变相关。
在特定实施方式中，所述与增殖性障碍有关的细胞中所述TNF(TNFR2)和/或TNFR1介导的信号传导可能与这些细胞中pLKB1水平的提高相关。
正如根据本发明的知识现在对普通技术人员来说显而易见的，本发明的治疗方面还可以包括施用一种或多种其他组成部分的步骤，所述其他组成部分适合修改一种或多种上述这些其他途径组分的表达、活性、功能或稳定性，以便累加地或协同地有助于治疗效果。例如，在一个此类实施方式中，本发明的治疗方面还可以包括施用LKB1的抑制剂的步骤(特别是当所述SIK3抑制剂不是LKB1的抑制剂时。在另一个此类实施方式中，本发明的治疗方面还可以包括施用在所述与增殖性障碍有关的细胞的核中促进、增加或提高一种或多种II(例如IIa)类HDAC(组蛋白脱乙酰酶)譬如HDAC4的化合物的步骤。在另一个此类实施方式中，本发明的治疗方面还可以包括施用NF-κB(活化)的抑制剂的步骤。本发明还设想了可以将两种或更多种此类其他组成部分的组合与所述SIK3抑制剂一起用于治疗中，和/或与所述SIK3抑制剂一起使用其他(抗癌)治疗活性药剂。
第二方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种用于使与增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感的方法，所述方法包括将所述与增殖性障碍有关的细胞暴露于(例如接触)SIK3抑制剂。这种方法通常可以作为体外和/或离体方法来实践。
在特定实施方式中，所述细胞介导的免疫应答包括杀死所述与增殖性障碍有关的细胞，例如其中所述杀死涉及TNF、TNFR2和/或TNFR1介导的信号传导。例如，这些细胞的杀死可能涉及这些细胞的由TNF、TNFR2和/或TNFR1介导的信号传导所诱导的凋亡。在本发明的各个不同方面的这种以及其他适用实施方式中，TNFR2和/或TNFR1介导的信号传导可以由任何适合的触发分子诸如TNF、TNF的变体和/或TNFR2或TNFR1激动剂触发(例如激活)，特别是通过将所述与增殖性障碍相关的细胞暴露于(例如接触)所述触发分子(例如TNF、TNF变体或TNFR1激动剂)。这种暴露可以导致所述触发分子(例如TNF、TNF变体或TNFR1激动剂)结合到TNFR2和/或TNFR1，以及特别是TNFR1信号传导的触发(例如激活)。
第三方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种用于杀死与增殖性障碍有关的细胞的方法，所述方法包括将所述与增殖性障碍有关的细胞暴露于(例如接触)：(i)TNF、TNF变体和/或TNFR1或TNFR2信号传导(优选为TNFR1信号传导)的激动剂；并将所述与增殖性障碍有关的细胞暴露于(例如接触)(ii)SIK3抑制剂。正如普通技术人员将会认识到的，这种方法通常可以作为体外和/或离体方法来实践。
在相关的第三方面，本发明涉及一种用于治疗增殖性疾病的SIK3抑制剂，所述治疗涉及杀死与所述增殖性障碍有关的细胞，所述治疗包括将这些细胞暴露于：(i)TNF、TNF变体和/或TNFR1或TNFR2激动剂；和(ii)SIK3抑制剂。
在这些第三方面的特定实施方式中，所述与增殖性障碍有关的细胞的杀死通过使这些细胞对细胞介导的免疫应答敏感，特别是通过诱导这些细胞对涉及TNF、TNFR2和/或TNFR1介导的信号传导的凋亡的敏感性，来介导。
可以通过将所述与增殖性障碍有关的细胞与所述TNF、TNF变体和/或TNFR1或TNFR2激动剂接触，将所述细胞暴露于这些触发分子；和/或可以通过将这些细胞与所述SIK3抑制剂相接触(或引入到其中)，将这些细胞暴露于所述SIK3抑制剂。(i)TNF、TNF变体和/或TNFR1或TNFR2激动剂和/或(ii)SIK3抑制剂的量(或剂量)通常是有效量；这是在诸如使所述细胞对由TNF、TNFR2和/或TNFR1介导的信号传导诱导的凋亡敏感(例如通过所述凋亡杀死这些细胞)中有效的量(或剂量)。在其他地方公开了可以并入到本发明的这些方面中的这些活性药剂的适合的量(或确定它们的方法)，以及所述SKI3抑制剂的其他特定特征。因此，在某些实施方式中，(i)TNF、TNF变体和/或TNFR1或TNFR2激动剂和(ii)SIK3抑制剂，可以被施用到患有所述增殖性障碍的受试者(例如所述治疗可以包括将(i)TNF、TNF变体和/或TNFR1或TNFR2激动剂和(ii)SIK3抑制剂施用到所述受试者)。
所述与增殖性障碍有关的细胞可以是本文中别处所描述的细胞，特别地，这些细胞可以是癌或肿瘤细胞。例如，这些细胞可以是实体肿瘤的细胞或源自于实体肿瘤的细胞。
在这些第二和第三方面的某些实施方式中，所述方法是一种体外(和/或离体)方法。在此类方法的可选实施方式中，所述与增殖性障碍有关的细胞(如肿瘤细胞)存在于此类受试者中，特别是需要治疗的受试者中。
在这些第一、第二和第三(以及它们的相关)方面的其他实施方式中，这些方法的(治疗)效果(例如对所述与增殖性障碍有关的细胞的效果)可以通过抑制SIK3，特别是通过抑制SIK3 mRNA或蛋白质(例如磷酸化SIK3蛋白和/或如本文中别处所述)的表达、量、功能、活性和/或稳定性来介导(例如所述治疗可以包括、涉及其或由其介导)。特别地，在此类实施方式中，所述SIK3活性被(譬如有效地)降低，例如降低到治疗有效水平。
在这些第一、第二和第三(以及它们的相关)方面的其他实施方式中，这些方法的(治疗)效果(例如对所述与增殖性障碍有关的细胞的效果)可能不通过抑制Abl和/或SRC激酶，通过不(有效地)抑制Abl和/或SRC激酶或蛋白的表达、量、功能、活性和/或稳定性来介导(例如所述治疗可能不包括、涉及其或由其介导)。在特定的这些实施方式中，所述ABL1和/或SRC的活性不被(譬如有效地)降低，比如不被降低至治疗有效水平。
在此类方法的某些实施方式中，在不存在(如有效量或剂量的)所述SIK3抑制剂的情况下，所述与增殖性障碍有关的细胞(例如所述肿瘤细胞)在TNF、TNFR2和/或TNFR1介导的信号传导和/或暴露于(如有效量或剂量的)的TNF、TNF变体、TNFR2或TNFR1激动剂后不被杀死或诱导进入凋亡(例如，它们增殖)。
如上所述，在这些方法的某些实施方式中，所述SIK3抑制剂可以抑制所述与增殖性障碍有关的细胞(例如肿瘤细胞)中的SIK3。在特定的这些实施方式中，所述SIK3抑制剂可以与抑制这些细胞中的SIK1和/或SIK2相比偏好性地抑制这些细胞中的SIK3；和/或可以与抑制一种或多种类型的免疫细胞中的SIK1和/或SIK2和/或SIK3相比偏好性地抑制这些细胞中的SIK3。举例来讲，所述SIK3抑制剂可以与抑制巨噬细胞和/或树突状细胞(特别是能够或生产IL-10的此类细胞)中的SIK1和/或SIK2和/或SIK3相比偏好性地抑制所述与增殖性障碍有关的细胞(例如肿瘤细胞)中的SIK3。在特定实施方式中，所述(治疗)效果通过所述与增殖性障碍有关的细胞(例如肿瘤细胞)中的SIK3的抑制来介导(例如所述治疗包括、涉及其或由其介导)；并且在其他此类实施方式中，所述(治疗)效果不通过抑制SIK2、特别是其他细胞(例如与增殖性障碍有关的细胞或免疫细胞)中的SIK2来介导(例如所述治疗不包括、涉及其或不由其介导)，和/或所述(治疗)效果不通过抑制SIK1、特别是其他细胞(例如与增殖性障碍有关的细胞或免疫细胞)中的SIK1来介导(例如所述治疗不包括、涉及其或不由其介导)(或者所述效果由不进行所述抑制来介导)。
因此，并且正如也将从上文认识到的，在其他某些实施方式中，其他细胞中的(特别是所述与增殖性障碍有关的细胞中的或免疫细胞中的)ABL和/或SRC可以不被抑制。
因此，在一个实施方式中，所述与增殖性障碍有关的细胞的(譬如其中的)SIK3被抑制。在另一个(或其他)实施方式中，SIK2、特别是免疫细胞诸如CTL的(譬如其中的)SIK2以比SIK3(例如所述与增殖性障碍有关的细胞中的)更低的程度被抑制。在又一个(或其他)实施方式中，SIK1、特别是免疫细胞例如CTL的(譬如其中的)SIK1以比此类SIK3更低的程度被抑制。
如果另一个SIK(例如SIK3)以比给定SIK(例如SIK1或SIK2)高出超过约2倍的量，例如以比所述给定SIK高出超过约5、10、20、50、75或100倍的量被抑制，则所述给定SIK可以以比所述另一个SIK“更低的程度”被抑制。具体来说，所述另一个SIK(例如SIK3)可以以比所述给定SIK高约5至20倍、20至50倍或50至100倍之间的量被抑制。例如，所述SIK3可以以比SIK1和/或SIK2高约20至50倍之间的量被抑制。例如，所述SIK3抑制剂可以将SIK3抑制80％(即仅具有其未被抑制的活性的20％)，但将SIK1仅仅抑制4％并且将SIK2仅仅抑制8％。因此，SIK3以比SIK1高约20倍并比SIK2高10倍被抑制。在特定实施方式中，所述SIK3可以以与SIK1近似相同的程度被抑制(例如在彼此的约2至53倍之间)，并且SIK2以比SIK3和SIK1中的任一者(或两者)更低的程度被抑制：例如，在此类实施方式中，SIK3和SIK1以比SIK2(例如在免疫细胞中)的抑制高出约20至50倍之间的量被抑制。
与使用SIK抑制剂的其他研究相反，使用根据本发明的SIK3抑制剂的治疗在某些实施方式中可能不伴有一种或多种抗炎性细胞因子生产的(有效)增加(例如所述抗炎性细胞因子可以是选自IL-1κa、IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGF-β中的一者)，并且尤其是可能不伴有IL-10生产的(有效)增加。因此，在其他或另外的实施方式中，使用根据本发明的SIK3抑制剂的治疗可能不伴有一种或多种促炎性细胞因子例如选自IL-1-β、IL-6、IL-12和TNF、IFN-γ和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中的一者的生产的(有效)降低，并且在特定实施方式中可能不伴有TNF生产的(有效)降低。因此，在某些实施方式中，所述SIK3抑制剂可以以下述量施用到受试者：(i)对(有效地)增加一种或多种(例如这些)抗炎性细胞因子的生产无效的(治疗有效)量；和/或(ii)对(有效地)降低一种或多种(例如这些)促炎性细胞因子的生产无效的(治疗有效)量。
在某些实施方式中，预期某些与所述增殖性障碍有关的细胞(譬如肿瘤细胞)对本发明的各个不同方面中SIK3抑制剂的敏化效果更佳易感。举例来讲，此类细胞可以是表现出(例如经历)TNFR2和/或TNFR1信号传导的活化，特别是活化的TNFR1的细胞。在某些实施方式中，这些细胞是表达TNFR2和/或TNFR1的细胞，特别是表达TNFR1的肿瘤细胞。因此，在某些实施方式中，这些细胞通过活化的TNFR1和/或TNFR2信号传导来鉴别或表征(或所述受试者通过具有如此鉴别或表征的与增殖性障碍有关的细胞例如肿瘤细胞来辨别或表征)。专业技术人员将了解确定此类细胞(譬如所述受试者的此类细胞)中TNFR1和/或TNFR2活化的状态的技术。举例来讲，通过检测或监测TNFR1和/或TNFR2信号传导途径中的一种或多种下游蛋白质。这些蛋白质在本文中别处描述，并且包括NF-κB和/或HDAC4。
在一个相关方面，本发明涉及一种通过抑制SIK3在受试者中治疗增殖性障碍(例如肿瘤)的方法，所述(治疗)方法包括向所述受试者施用SIK3抑制剂，其中与所述增殖性障碍有关的细胞的特征在于(譬如表现出或经历)活化的TNFR2和/或TNFR1信号传导(譬如活化的TNFR1信号传导)。在另一个相关方面，本发明涉及一种用于治疗增殖性障碍的SIK3抑制剂，其中与所述增殖性障碍有关的细胞通过活化的TNFR2和/或TNFR1信号传导(譬如活化的TNFR1信号传导)来辨别或表征(譬如表现出或经历它们)。
在本发明的各个不同方面的某些实施方式中，与所述增殖性障碍有关的细胞是暴露于适合的触发或活化分子例如TNF、TNF的变体或TNFR2或TNFR1信号传导的激动剂(优选为TNFR1信号传导的激动剂)，尤其是暴露于有效量的此类触发或活化分子的细胞。
在特定实施方式中，当所述触发或活化分子是TNF时，它是人类TNF。在某些此类实施方式中，所述TNF是重组人类TNF(rHuTNF)。然而，在其他实施方式中，所述TNF是内源TNF，譬如由所述受试者(例如人类患者)产生或以其他方式存在于所述受试者中的TNF。
研究显示，在大量类型的癌症、包括在卵巢癌中血浆TNF水平升高，并且例如当使用Quantikine人类TNF-α免疫测定法PDTA00C测量时，健康受试者中总TNF的正常上限是1.8pg/mL(Dobrzycka等，2009，Eur Cytokine Netw 20：131)。在其他癌症和测定法(例如TNF-α-EASIA试剂盒，DIAsource)中，食管癌患者和对照组的TNF血浆水平分别为12.35±9.69和4.62±3.06Pg/mL(Aydin等，2012，Turk J Med Sci 42：762)。因此，在其他实施方式中，所述与增殖性障碍有关的细胞是(譬如肿瘤是)存在于TNF的血浆浓度高于约1.5、2.5或4pg/mL，比如高于约5pg/m，特别是高于约10pg/mL(例如当通过Quantikine人类TNF-α免疫测定法PDTA00C或TNF-α-ELISA试剂盒，DIAsource测量时)的受试者中的此类细胞。
因此，在一个特定实施方式中，本发明的治疗方法中涉及的受试者可能具有高于约2pg/mL或高于约5pg/mL的TNF血浆浓度(也就是说，通过显示、具有或表现出所述血浆浓度，这个受试者可以被表征为譬如鉴别为适合于本发明的治疗方法的受试者)(举例来讲，所述与增殖性障碍有关的细胞是存在于TNF血浆浓度高于约2pg/mL或5pg/mL的受试者中的此类细胞)。
事实上，在其中所述增殖性障碍是肿瘤的实施方式中，TNF的肿瘤内浓度可能是所述肿瘤的特征，正如当所述肿瘤是实体肿瘤并且可进行活检时(Reissfelder等，2015，JClin Inv 125：739)。举例来讲，在本发明的某些实施方式中，肿瘤(比如实体肿瘤如结肠直肠癌)可以具有高于约0.2、0.5或1pg/mL，譬如高于约2pg/mL，特别是高于约5pg/mL的TNF肿瘤内浓度(比如肿瘤组织内的浓度)(例如当通过Quantikine人类TNF-α免疫测定法测量时)。
因此，在此类实施方式中，当所述增殖性障碍是肿瘤(比如实体肿瘤)时，所述实体肿瘤(比如所述受试者内的实体肿瘤)可能具有高于(约)0.5pg/mL或高于约1pg/mL的TNF肿瘤内浓度(也就是说，通过显示、具有或表现出所述肿瘤内浓度，这个受试者可以被表征为譬如鉴别为适合于本发明的治疗方法的受试者)。
因此，在相关方面中，本发明可以涉及一种在受试者中治疗增殖性障碍的方法(或在这种治疗中使用的SIK3抑制剂)，所述受试者的特征在于具有：(i)高于约2pg/mL(优选地高于约5pg/mL)的TNF血浆浓度；和/或(ii)高于约0.5pg/mL、优选地高于约1pg/mL的TNF肿瘤内浓度，所述治疗方法包括向所述受试者施用SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂：(a)在与所述增殖性障碍有关的细胞中抑制SIK3；和/或(b)使所述受试者中与所述增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感。
在特定的这些实施方式中，暴露到与所述增殖性障碍有关的细胞或施用到所述受试者的SIK3抑制剂的量(或剂量)与TNF的血浆或肿瘤内浓度有关(比如相关联)，其中在TNF的血浆或肿瘤内浓度更高的情况下，将更大量(或剂量)的SIK3抑制剂暴露于这些细胞(或施用到这些受试者)。
在其他或另外的实施方式中，所述肿瘤可能存在于在外周血或骨髓中具有肿瘤反应性T-细胞的受试者中，比如可以通过INF-γELISPOT所确定的。在其他或另外的实施方式中，所述肿瘤显示出被Treg、CD4+Tconv和/或CD8+T细胞浸润。
在其他实施方式中，所述与增殖性障碍有关的细胞在TNF的启动子区中包含与TNF的表达和癌症敏感性提高相关的单核苷酸多态性(SNP)，例如在TNF的启动子区中-308G/ASNP处具有AA或GA基因型；并且在可选实施方式中，所述肿瘤不包含与TNF的表达降低和癌症风险降低相关的SNP，例如在每种情况下在TNF的启动子区中不包含-238G/A SNP处的AA或GA基因型或-857T等位基因(Wang和Lin 2008，Acta Pharmacol Sin 28：1275)。
由此，本发明在本发明人出乎意料的发现的基础上提供了可选的组合治疗方案，所述发现即SIK3活性可以影响细胞对TNF的细胞毒性效应的敏感性。因此，第四方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种在受试者中治疗增殖性障碍的方法，所述方法包括将所述受试者中的与所述增殖性障碍有关的细胞暴露于(比如接触到)：(i)TNF、TNF变体和/或TNFR2或TNFR1信号传导的激动剂；并将所述受试者中的与所述增殖性障碍有关的细胞暴露于(比如接触到)(ii)SIK3抑制剂。在某些实施方式中，这种方法的步骤(i)不包括将所述受试者中的与所述增殖性障碍有关的细胞暴露于(比如接触到)TNF变体。
在某些实施方式中，所述增殖性障碍和/或这些细胞是肿瘤和/或肿瘤的细胞，并且在其他实施方式中，组分(i)是TNF、特别是人TNF(例如rHuTNF)；和/或组分(i)是TNFR1信号传导的激动剂。
在特定实施方式中，所述方法包括提高暴露于所述受试者中的所述与增殖性障碍有关的细胞的TNF的量(例如所述治疗包括、涉及其或尤其介导)。
在这些方面的某些实施方式中，所述治疗可以包括(譬如涉及或由其介导)提高所述受试者中的所述与增殖性障碍有关的细胞中的TNFR1和/或TNFR2信号传导。因此，在相关方面，本发明涉及一种在受试者中治疗增殖性障碍的方法，所述方法包括：(i)提高所述与增殖性障碍有关的细胞中的TNFR1和/或TNFR2信号传导；和(ii)将所述受试者中的所述与增殖性障碍有关的细胞暴露于(比如接触到)SIK3抑制剂。
具体来说，例如，所述方法可以通过SIK3抑制(譬如SIK3，如磷酸化SIK3，的表达、量、功能、活性的抑制)的结果，特别是与TNFR1和/或TNFR2信号传导的活化、譬如在所述TNF、TNF变体和/或TNFR1激动剂结合到TNFR1或TNFR2之后的结果相组合，来生效。
因此，在某些实施方式中，所述治疗效果可以涉及抑制SIK3和/或使所述与增殖性障碍有关的细胞对TNFR1或TNFR2信号传导的细胞毒性(例如凋亡)效应敏感，或由它们介导(例如引起)。在特定的这些实施方式中，所述SIK3活性可以被(有效地)降低，比如降低到治疗有效水平。
如上所述，本文中还设想了其中肿瘤细胞中的SIK3被抑制，并且任选地其中SIK2和/或SIK1、例如免疫细胞的SIK2或SIK1以较低程度被抑制的实施方式。
也如上所述，本文中还设想了某些实施方式，其中：(x)所述治疗包括、涉及SIK3活性的抑制或由所述抑制介导(例如所述SIK3抑制剂以一定量，例如对所述抑制有效的治疗有效量施用)，使得所述活性被(有效地)降低，例如，降低到治疗有效水平；和/或(y)所述治疗包括、涉及Abl和/或SRC激酶的抑制或由所述抑制介导(例如，所述SIK3抑制剂以一定量，比如对所述抑制无效的治疗有效量施用)，使得Abl和/或SRC激酶活性不被(例如有效地)降低，比如不被降低到治疗有效水平。
在这一方面的某些实施方式中，所述受试者可以施用所述SIK3抑制剂和/或可以施用TNF和TNF变体或TNFR1或TNFR2信号传导的激动剂。
在此类实施方式中，所述SIK3抑制剂和所述TNF、TNF变体或TNFR1或TNFR2激动剂可以暴露至有效量(或剂量)(例如以所述量施用)，包括在本文中别处描述的剂型或施用途径中。具体来说，设想了其中所述TNF、TNF变体或TNFR1或TNFR2激动剂被包封为脂质体或其他纳米粒子剂型的实施方式。
当所述TNF、TNF变体或TNFR1或TNFR2激动剂被暴露/施用并且所述SIK3抑制剂被暴露/施用时，这些组合治疗方案可以包含其中这些暴露/施用相伴进行的实施方式。在可选实施方式中，这些暴露/施用可以是顺序的，在特定实施方式中，所述SIK3抑制剂的暴露/施用在所述TNF、TNF变体或TNFR1或TNFR2激动剂的暴露/施用之前。例如，所述SIK3抑制剂可以在所述另一种组分(譬如之前)的约14天内，比如所述另一种组分(譬如之前)的约10天、7天、5天、2天或1天内顺序暴露/施用；并且还包括所述SIK3抑制剂可以在所述另一种组分(譬如之前)的约48小时、24小时、12小时、8小时、6小时、4小时、2小时、1小时、30min、15min或5min内顺序暴露/施用的情况。
所述TNF或TNF变体或TNFR1或TNFR2激动剂可以通过常规途径譬如s.c.、i.v.或i.m.施用，并且在某些实施方式中可以肿瘤内或通过肢体隔离灌注(ILP)譬如肝脏隔离灌注(IHP)施用；和/或可以以约5至500ug/m2/天之间的剂量如此施用(特别地，rHuTNF可以如此施用)。举例来讲，TNF可以以约25至250ug/m2/天之间譬如约50至150ug/m2/天之间或约75至100ug/m2/天之间的剂量施用；或者其中TNF当s.c.施用时以高达约50至75ug/m2/天的MTD施用，当i.v.或i.m.施用时以高达约150至200ug/m2/天的MTD施用。因此，在特定的这些实施方式中，TNF可以以约5至500ug/m2/天之间、特别是约20至200ug/m2/天之间的剂量施用到所述受试者。
在特定实施方式中，可以暴露/施用TNF的变体，譬如具有较高抗肿瘤活性和较低系统毒性的TNF变体如rHuTNF。例如，所述TNF变体可以是选自下述的变体：(i)TNF的-K90R变体；(ii)偶联到TNF的肿瘤导向肽；和(iii)TNF-抗体偶联物。
在本发明的那些涉及TNF变体的实施方式中，它可以是TNF的具有较高细胞毒性活性和较低系统毒性的变体形式。
在其他实施方式中，TNFR1或TNFR2激动剂譬如抗TNFR1单克隆抗体htr-9(Ferrero等，2001，Am J Physiol Cell Physiol 281：C1173)可以被暴露/施用，并且在其他实施方式中，可以暴露/施用淋巴毒素-α(Etemadi等，2013，FEBS J 280：5283)或其变体。
在可选实施方式中，与所述增殖性障碍有关的细胞(譬如肿瘤细胞)可以通过能够导致此类细胞暴露于(比如内源)TNF或另一种触发分子譬如TNF的变体或TNFR1或TNFR2激动剂的药剂的施用(比如施用到带有此类细胞的受试者)，暴露到TNF(或提高的TNFR1和/或TNFR2信号传导)。这种药剂可以是诸如能够诱导(比如诱导)此类细胞暴露于(例如高水平的)TNF的药剂，特别是诱导此类细胞暴露于一定TNF水平例如有效量的(譬如内源)TNF的药剂，所述水平是诸如比本文中别处描述的一种或多种水平更高的血浆或肿瘤内TNF水平。
因此，本发明包括其中所述受试者被施用能够诱导(譬如诱导)所述与增殖性障碍有关的细胞暴露到TNF、TNF变体或TNFR1或TNFR2信号传导的激动剂的药剂的实施方式。本发明还包括其中所述受试者被施用能够提高所述受试者中的TNFR1信号传导(和/或TNFR2信号传导)和/或增加暴露到与所述增殖性障碍有关的细胞的TNF的量的药剂的实施方式。
在某些此类实施方式中，所述药剂是病毒，特别是已被工程化改造以产生作为触发分子的TNF、TNF变体或TNFR1或TNFR2激动剂的病毒(特别是被工程化改造以产生人类TNF的病毒)。其他的此类实施方式包括其中这些病毒偏好性地感染所述与增殖性障碍有关的细胞(例如肿瘤细胞)和/或在这些细胞的背景中(譬如当它感染这些细胞时)偏好性地产生所述触发分子的实施方式。正如现在变得明显的，这种病毒的施用可以导致所述与增殖性障碍有关的细胞暴露到此类触发分子，特别是暴露到有效量的此类触发分子例如TNF。
因此，在某些此类方法中，所述药剂可以是能够诱导(譬如诱导)所述与增殖性障碍有关的细胞暴露到TNF、TNF变体或激动剂或TNFR1或TNFR2信号传导的病毒。
这种病毒可以是适合于诱导所述触发分子的暴露的任何病毒，尤其可以是重组病毒，例如被工程化改造以感染肿瘤细胞和/或表达TNF(例如在感染肿瘤细胞之后)的病毒。可以被如此工程化的病毒的实例包括溶瘤病毒(譬如基于腺病毒、HSV、痘苗病毒、水疱性口炎病毒或新城疫病毒的溶瘤病毒)，正如肿瘤内注射腺病毒载体以提高促炎性细胞因子和趋化因子包括TNF的血浆水平(Bernt等，2005，Cancer Res 65：4343)。在特定的这些实施方式中，所述溶瘤病毒可以是基于Kaufman等，2015(Nature Rev Drug Disc 14：642)的表1中所描述的DNA病毒的溶瘤病毒，基于Kaufman等，2015的表2中所描述的RNA病毒的溶瘤病毒，优选为在Kaufman等，2015的表3中所描述的用于临床试验的溶瘤病毒。
在其他此类实施方式中，被施用(并必然导致所述与增殖性障碍有关的细胞暴露到作为触发分子的TNF、TNF变体或TNFR1或TNFR2激动剂)的药剂是免疫细胞。在某些此类实施方式中，所述免疫细胞可能不是产生IL10的巨噬细胞，譬如所述免疫细胞可以是促炎性免疫细胞。在特定的这些实施方式中，所述施用的免疫细胞可以是淋巴系细胞诸如T细胞或自然杀伤(NK)细胞，例如产生TNF的此类细胞。
当作为本发明的此类实施方式中的药剂施用时，所述免疫细胞可以通过过继细胞转移(ACT)来施用；其意味着所述免疫细胞转移到所述受试者中(譬如通过输注或其他递送技术)。通常，执行这个过程的目的是改善所述受试者中的免疫功能和特征，并且，尽管按惯例所述被转移的免疫细胞源自于同一受试者，但它们也可能源自于另一个(适合的)个体。
当在本发明的这个实施方式中使用时，所述免疫细胞可以是诸如在本发明的治疗方法中从所述受试者提取、体外遗传修饰和培养并返回到同一受试者的T细胞。这种遗传修饰可以包括提高是免疫细胞的特异性或靶向，例如所述免疫细胞向所述与增殖性障碍有关的细胞(譬如肿瘤细胞)的靶向(比如提高它的特异性)的遗传修饰。举例来讲，在此类实施方式中使用的T细胞可以被修饰，以改变T细胞受体(TCR)的特异性或在嵌合抗原受体(CAR)中引入抗体样识别。尤其是设想了将CAR免疫细胞用于此类实施方式。CAR免疫细胞是展示工程化的受体的免疫细胞，所述受体将任意特异性(譬如对肿瘤细胞的特异性)嫁接到免疫效应细胞(譬如T细胞)上。通常，这些受体被用于将单克隆抗体的特异性嫁接到T细胞上，并且它们的编码序列的转移被反转录病毒载体促进。CAR T细胞是有希望的癌症疗法(Song等，2015，Oncotarget.6：21533)：使用ACT，将T细胞从个体(通常为所述受试者)取出并修饰，以使它们表达对所述患者的具体癌症特异的受体。这些随后可以识别受试者的癌细胞的T细胞被(重新)引入到所述受试者中，导致TNF(例如由所述CAR T细胞产生的)暴露到所述肿瘤细胞并因此杀死这些细胞，特别是通过暴露于SIK3抑制剂(例如在其施用到所述受试者后)而对这种TNF介导的细胞毒性敏感的这些细胞。因此，在特定的这些实施方式中，所述免疫细胞可以是CAR T细胞，比如被工程化改造以对所述受试者的与所述增殖性障碍有关的细胞(譬如肿瘤细胞)具有提高的特异性的CAR T细胞。
在可选实施方式中，所述与增殖性障碍有关的细胞向TNF(譬如内源TNF)的暴露可以通过其他手段或程序来诱导。因此，在此类实施方式中，所述与增殖性障碍有关的细胞向(有效量的)TNF的暴露(和/或所述与增殖性障碍有关的细胞中的TNFR1信号传导(和/或TNFR2信号传导)的提高)，可以通过提高所述受试者的血浆中和/或这些细胞的环境中TNF的量的药物、治疗或其他程序来诱导。
在某些实施方式中，这种诱导的向TNF的暴露可以通过癌症免疫疗法的施用来产生。
在一个实例中，这种诱导向TNF的暴露是通过抗肿瘤疫苗(例如癌症疫苗)来产生。此类癌症疫苗包括通过其将抗原(譬如特异性针对癌细胞或被癌细胞偏好性表达的抗原)直接或间接引入到所述受试者中，以便在所述受试者中产生或提高据设想对所述癌细胞(更加)特异的免疫应答(通常为适应性免疫应答)的癌症疫苗。癌症疫苗可以包括诸如减毒病毒，特别是用于对抗由这些病毒(例如HPV或HBV)引起的癌症比如宫颈癌或肝癌的减毒病毒。癌症疫苗也可以代表特定肿瘤抗原(譬如对癌细胞特异或被癌细胞偏好性表达的肿瘤抗原)，正如用于免疫所述受试者以便也在所述受试者中产生或提高免疫应答的肿瘤相关抗原(TAA)的个体(或组合)。癌症疫苗可以包含代表了所述TAA的重组蛋白(譬如来自于所述TAA的肽)，或者可以是肿瘤特异性糖抗原，并因此在施用后被直接引入到所述受试者中。所述癌症疫苗也可以包含编码所述蛋白(或肽)TAA的核酸(例如DNA或mRNA)，并且在所述核酸疫苗施用到所述受试者中之后，所述编码的TAA被所述受试者中的细胞靶表达，并因此被间接引入到所述受试者中。TAA可以被分成两类：共有肿瘤抗原和独特肿瘤抗原。共有抗原被许多癌症表达。独特肿瘤抗原由通过物理或化学致癌物诱导的突变产生(也被称为新生抗原)；因此它们只被个体肿瘤表达。本领域技术人员知道正处在临床试验中或已被批准使用的癌症疫苗的实例，并包括PROSTVAC(BavarianNordic)、PROVENGE(Dendreon)和CV9104(CureVac)并且知道各种不同的TAA(包括新生抗原)以及可用于将这些肿瘤抗原用于癌症疫苗中的方法。作为其他实例：(1)用与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联的作为肿瘤抗原的源自于受体的克隆骨髓瘤免疫球蛋白独特型(Id)进行免疫，已显示产生显著量的促炎性细胞因子包括TNF(Foglietta等，2013，Bone Marrow Transplant 48：269)；和(2)WT1抗原的合成的micro-consensus SynCon DNA疫苗诱导优于由本源WT1 DNA免疫原诱导的应答的新的新生抗原样应答，例如强烈的CD4和CD8 T细胞应答(包括IFN-γ、CD107a和TNF应答)。
在另一个实例中，这种诱导向TNF的暴露可以通过配体(例如抗体如单克隆抗体)的施用来产生，所述配体诸如通过结合到所述与增殖性障碍有关的细胞(例如肿瘤细胞)表面上的TAA或受体而结合到这种细胞的表面的配体。细胞表面受体是这些配体(抗体)疗法的常见靶，并且包括CD52和CD20。在结合到这种癌抗原后，所述抗体可以诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，激活补体系统，或阻止受体与其配体相互作用，所有这些均可导致细胞死亡。作为抗体被批准的此类配体包括阿仑单抗、奥法木单抗和利妥昔单抗。在某些实施方式中，与SIK3抑制剂组合使用的此类配体可以包括激活T细胞或其他细胞介导的免疫应答的配体。例如：(1)抗CD137单克隆抗体可以强烈促进细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞的增殖和TNF的表达(Zhu等，2009，Biomed Pharmacother 63：509)；(2)激动剂抗OX40单克隆抗体可以通过增强T-细胞分化来提高抗肿瘤免疫应答(Redmond等，2014，Cancer ImmunolRes.2014，2：142)。
在另一个实例中，施用到所述受试者的配体是结合到免疫(抑制性)检查点分子的配体。例如，这种检查点分子可以是选自下述的一者：A2AR，B7-H3，B7-H4，CTLA-4，IDO，KIR，LAG3，PD-1(或其配体PD-L1和PD-L2之一)，TIM-3(或其配体半乳糖凝集素-9)，TIGIT和VISTA。在特定的这些实施方式中，所述配体结合到选自CTLA-4、PD-1和PD-L1的检查点分子。在其他更特定实施方式中，所述配体是选自下述的抗体：伊匹单抗，纳武单抗，派姆单抗，BGB-A317，阿特朱单抗，avelumab和durvaluma；特别是选自下述的抗体：伊匹单抗(YERVOY)，纳武单抗(OPDIVO)，派姆单抗(KEYTRUDA)和阿特朱单抗(TECENTRIQ)。在其他实施方式中，所述结合到免疫(抑制性)检查点分子的配体可以是非抗体肽，例如高亲和性PD-1变体(如Maute等，2015；PNAS 112：E6506)、靶向所述免疫检查点分子的肽(如AurigeneDiscovery Technologies的AUNP-12，US 2011/0318373)或阻断免疫检查点分子之间的相互作用的D肽(如PDL1-PD1相互作用和(D)PPA-1，Chang等，2015；Anyeg Chem Int 54：11760)。在其他实施方式中，所述结合到免疫(抑制性)检查点分子的配体可以是小分子，例如靶向PDL1的BMS-202或BMS-8(Zak等，2016；Oncotarget 7：30323)、被称为BMS-1001或BMS-1166的PDL1/D1的抑制剂(Skalniak等，2017；Oncotarget 8：72167)、正经历1期试验的Curis/Aurigen的PDL1和VISTA拮抗剂CA-170(Powderly等，Ann Onc 28：Issue suppl 5，mdx376.007)或靶向PDL1和TIM3的Curis/Aurigen的CA-327。
在另一个特定实施方式中，这种诱导的向TNF的暴露可以通过放疗来产生。
放疗是癌症或肿瘤的一种局部治疗方法，其使用辐射通过阻断所述癌细胞繁殖的能力和/或刺激针对它们的免疫应答(例如作为对死亡或垂死癌细胞的存在的响应而产生的应答)，来破坏所述癌细胞。在本发明的情形中，放疗特别是由电离辐射的治疗性应用构成。所述放疗和相关的电离辐射是常用并且被本领域技术人员已知的放疗和相关的电离辐射。具体来说，放疗包括使用电离辐射例如γ-射线、X-射线和/或发源于放射性同位素的辐射。在本发明的情形中，更具体来说是X-射线辐射。所述放疗可以在一个或多个周期中以分部方式施用，例如一个周期可以在1至4周的范围内，更特别为3周。所述周期限定了所述施用计划的开始与结束之间的时间间隔。当所述周期采用三周时，放疗可以在三周内施用，在其间相隔一周。所述放疗具体对于所需的周数来说，可以以7天中的5天每天一次辐射的频率施用。在(光子)放射疗法中使用的辐射的量以戈瑞(Gy)为单位度量，并且随着待治疗的癌症的类型和阶段而变。对于治愈性情况来说，用于实体上皮肿瘤的典型剂量在60至80Gy的范围内，而淋巴瘤使用20至40Gy来治疗。
当所述SIK3抑制剂与任何其他此类程序(诸如所述其他药剂、癌症免疫疗法、癌症疫苗、抗体或放疗，在每种情况下如本文中所描述)一起用于组合治疗时，这些组合治疗方案可以包括其中这些暴露/施用相伴进行的实施方式。在可选实施方式中，这些施用可以是顺序的，特别是其中所述SIK3抑制剂在这些其他程序之前施用的实施方式。举例来说，所述SIK3抑制剂可以在所述其他程序(譬如之前)的约14天内，例如所述其他程序(譬如之前)的约10天、7天、5天、2天或1天内顺序施用；并且还包括所述SIK3抑制剂可以在所述其他程序(譬如之前)的约48小时、24小时、12小时、8小时、6小时、4小时、2小时、1小时、30min、15min或5min内顺序施用的情况。
不受理论限制，预见到在所述TNF、TNF变体或TNFR1或TNFR2激动剂的施用之前，或在这些其他程序(例如所述其他药剂、癌症免疫疗法、癌症疫苗、抗体或放疗)的施用之前，所述SIK3抑制剂的施用(以及因此诸如在肿瘤细胞中SIK3的表达、量、功能、活性或稳定性的抑制)，在使所述与增殖性障碍有关的细胞对所述细胞介导的免疫应答的细胞毒性效应敏感中特别有效。
如上所述，涉及TNF的施用和/或抗TNF分子的使用的现有疗法(或正在临床试验的疗法)遭受某些已知的缺点和特定副作用。本发明提供了可用于减轻(或减少)此类缺点和/或特定副作用的方法。
第五方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种在正用TNF治疗增殖性障碍(例如癌症或肿瘤)的受试者中提高TNF治疗的治疗指数的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3的抑制剂。
在相关方面中，本发明涉及一种用于在患有增殖性障碍(例如癌症或肿瘤)的受试者中支持TNF疗法的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3的抑制剂。
第六方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种使患有增殖性障碍(例如癌症或肿瘤)的受试者对包括向所述受试者施用TNF的疗法敏感的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3的抑制剂。术语“致敏”等当在本文中在使受试者对疗法(例如包括TNF的施用的疗法)敏感的情形中使用时，应该被普通技术人员所理解，并且包括下述含义，即所述受试者提高对这种疗法对所述受试者可能具有的一种或多种(治疗)效果、尤其是功效效果的易感性。具体来说，如此致敏的受试者当经历这种疗法时，与尚未如此“致敏”的类似受试者相比可能显示出提高的响应(例如更快速、更高程度的响应和/或在这种疗法的更低的量或暴露后)。
第七方面，并且正如可能在本文中进一步描述、定义、宣称或以其他方式公开的，本发明涉及一种用于在正用抗TNF药剂治疗的受试者中降低(发生)血液增殖性障碍(作为继发性障碍)的风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3的抑制剂。例如，这一方面可以可选地被当作是一种用于在正用抗TNF药剂治疗的受试者中预防血液增殖性障碍(作为继发性障碍)的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3的抑制剂。
本发明的这一方面是基于如上所述的观察，即存在着接受抗TNF生物制剂的患者发生淋巴瘤和其他血液恶性肿瘤的报道。事实上，此类障碍通常描述在包装说明书/处方信息中作为使用抗TNF药剂的治疗的可能(但罕见)的副作用。作为血液恶性肿瘤的可感知的增加以及这些和其他免疫抑制药剂的广泛使用的直接结果，WHO肿瘤分类现在包括“与医源性免疫缺陷相关的淋巴增殖性疾病”类别。
因此，在这些方面中，通常所述患者正用抗TNF药剂治疗增殖性障碍之外的指征，并且在特定的此类实施方式中，所述受试者在开始所述抗TNF治疗后，不患有血液增殖性障碍。事实上，通常所述受试者患有和/或正用所述抗TNF药剂治疗自体免疫障碍，优选为选自类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、斑块型银屑病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、银屑病、化脓性汗腺炎和难治性哮喘的自体免疫障碍，例如选自类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、斑块型银屑病和克罗恩病的自体免疫疾病，特别是类风湿性关节炎。
在某些实施方式中，所述抗TNF药剂是选自下述名单的一者：英夫利昔单抗，阿达木单抗，戈利木单抗，humicade，依那西普，奥那西普和赛妥珠单抗，特别是英夫利昔单抗或humicade。
在某些实施方式中，所述血液恶性肿瘤增殖性障碍可以是淋巴增殖性疾病，特别是与医源性免疫缺陷相关的淋巴增殖性疾病。
在这些第五至第七方面的某些实施方式中，(治疗)效果(例如治疗指数的提高、受试者的致敏或风险的降低)由下述介导(诸如所述治疗包括或涉及)：(i)抑制SIK3(譬如通过抑制SIK3，比如磷酸化SIK3的表达、量、功能、活性和/或稳定性)，特别是通过抑制与所述增殖性障碍有关的细胞中的SIK3；和/或(ii)使这些细胞对TNF的杀死效应敏感。在其他实施方式中，所述(治疗)效果可能不由抑制SIK2和/或SIK1来介导(譬如所述治疗可能不包括或涉及它)，特别是不由抑制免疫细胞中的SIK2和/或SIK1(和/或SIK3)来介导(比如所述治疗不包括或涉及它)。
本发明的或用于本发明的SIK3抑制剂：
在本发明的所有方面中包括其中所述SIK3抑制剂可以特异性(比如选择性)针对SIK3(例如SIK3特异性抑制剂)的实施方式。
在特定的这些实施方式中，所述SIK3抑制剂抑制SIK3(例如SIK3的表达、量、功能、活性和/或稳定性)(特别是磷酸化SIK3的功能或活性)可能比它抑制一种或多种其他激酶诸如SIK2和/或SIK1(例如其的表达、量、功能、活性和/或稳定性)(特别是磷酸化SIK2和/或磷酸化SIK1的功能或活性)和/或ABL或SRC激酶更加有效。因此，在某些实施方式中，所述SIK3抑制剂抑制SIK3比它抑制ABL1和/或SRC激酶更加有效。
如果SIK3抑制剂相比于抑制SIK2和/或SIK1偏好性地抑制SIK3，则所述SIK3抑制剂可以被认为“特异性”(例如“选择性”)针对SIK3或“更加有效地”抑制SIK3。在某些此类实施方式中，所述SIK3抑制剂相比于抑制一种或多种其他丝氨酸酪氨酸激酶(STK)包括但不限于Abl、Src和/或Bcr-Abl偏好性地抑制SIK3。例如，所述SIK3特异性抑制剂(例如选择性SIK3抑制剂)可能以比它针对给定的其他SIK(或STK)的效能高出约2倍的效能抑制SIK3，例如以比它针对所述给定的其他SIK(或STK)的效能高出约5、10、20、50、100、200、500或1000倍的效能。具体来说，所述SIK3抑制剂针对SIK3的效能可能比它针对所述给定的其他SIK(或STK)的效能高出约50至500倍、10至200倍或50至1000倍之间的量。例如，所述SIK3抑制剂针对SIK3的效能可能比它针对SIK1和/或SIK2的效能高出约20至500倍之间的量。在其他实施方式中，所述SIK3抑制剂显示的对SIK3抑制的IC50比对SIK1和/或SIK2抑制的IC50低正如在本段中所描述的倍数-量(或其范围)。举例表明，所述SIK3抑制剂可能以约2nM的IC50抑制SIK3，但以仅仅100nM的IC50抑制SIK1并以仅仅200nM的IC50抑制SIK2。因此，这种SIK3抑制剂抑制SIK3比SIK1有效50倍并且比SIK2有效100倍。
在某些实施方式中，所述SIK3抑制剂抑制与增殖性障碍有关的细胞中的SIK3。例如，所述SIK3抑制剂抑制这种SIK3比它抑制这些细胞中的SIK1和/或SIK2更加有效，和/或比它抑制免疫细胞中的SIK1和/或SIK2和/或SIK3(尤其是SIK2)更加有效。
在其他实施方式中，所述SIK3抑制剂可以抑制SIK3以及另一种SIK，在特定的此类实施方式中，所述SIK3抑制剂可以比抑制SIK2更加有效地抑制SIK3和SIK1。例如，所述SIK3抑制剂可能以近似相同的效能抑制SIK3和SIK1(例如在彼此的约2至5倍之内)，但可能比它抑制SIK2更加有效地抑制SIK3(和SIK1)(例如高出约5、10、20、50、100、200、500或1000倍的量)。在更特定的此类实施方式中，所述SIK3抑制剂可以抑制与增殖性障碍有关的细胞中的SIK3和SIK1，可选地，比它抑制这些细胞中的SIK2更加有效，和/或比它抑制免疫细胞中的SIK2更加有效。
这种对SIK3(和可选地，SIK1)或其他激酶如ABL和/或SRC激酶的特异性(选择性或偏好性效能)，可以在体外譬如在体外生物化学测定法中测量，例如由DiscoverX、ProQinase、Reaction Biology或ThermoFisher所提供的。可选地，所述对SIK3的特异性(选择性或偏好性效能)在体内例如在基于细胞的模型或动物模型中测量。
因此，在本发明的某些实施方式中，在基于细胞的模型或动物模型中，所述SIK3抑制剂抑制与增殖性障碍有关的细胞中的SIK3(例如其表达、量、功能、活性和/或稳定性)(特别是磷酸化SIK3的功能或活性)，可以比它抑制细胞(例如免疫细胞，或者对于ABL、SRC和SIK2来说，与所述增殖性障碍有关的细胞)中的ABL和/或SRC激酶和/或SIK2(和/或SIK1)(例如其表达、量、功能、活性和/或稳定性)、特别是磷酸化SIK2和/或磷酸化SIK1和/或SIK3的功能或活性、优选为免疫细胞中的SIK2，更加有效。
在其他实施方式中，所述(治疗)效果可以由SIK3(比如与增殖性障碍有关的细胞中的SIK3)(例如其表达、量、功能、活性和/或稳定性)的抑制并且不由诸如免疫细胞中的ABL和/或SRC激酶和/或SIK2(和/或SIK3)(例如其表达、量、功能、活性和/或稳定性)的抑制所介导(譬如所述治疗可以包括、涉及它们或者由它们所介导)，特别地，所述(治疗)效果可以可选地另外由这些细胞中的SIK1的抑制所介导(譬如所述治疗可以包括、涉及它或者由它所介导)。
因此，在某些实施方式中，所述SIK3抑制剂抑制与所述增殖性障碍有关的细胞中的SIK3比它抑制这些细胞中的ABL1和/或SRC激酶更加有效，并且(优选地)比它抑制这些细胞中的SIK2和/或SIK1更加有效。
在其他实施方式中，所述SIK3抑制剂抑制达沙替尼的激酶靶(例如Abl、Src和/或Bcr-Abl)的IC50比达沙替尼抑制这些靶的IC50更低，譬如低约2、3、5或10倍的系数。
在某些实施方式中，SIK3的抑制剂是下述特定分子和/或分子类别：所述SIK3抑制剂可以选自多肽、肽、糖蛋白、肽模拟物、抗体或抗体样分子(如胞内抗体)；核酸诸如DNA或RNA，譬如反义DNA或RNA、核酶、RNA或DNA适体、siRNA、shRNA等，包括其变体或衍生物例如肽核酸(PNA)；用于靶向基因编辑的遗传构建物，譬如CRISPR/Cas9构建物和/或指导RNA/DNA(gRNA/gDNA)和/或tracrRNA；异双功能化合物(例如PROTAC或HyT分子)；糖类，譬如多糖或寡糖等，包括其变体或衍生物；脂类例如脂肪酸等，包括其变体或衍生物；或小有机分子，包括但不限于小分子配体或细胞渗透性小分子。
本发明的SIK3抑制剂可以采取前体药物形式。特定化合物的前体药物形式是其他化合物(例如所述特定化合物的酯形式)，其在施用到受试者后在生理条件下经历化学转变以提供所述特定化合物。此外，前体药物可以在离体环境中通过化学或生物化学方法转变成所述特定化合物。例如，前体药物当例如被放置在具有适合的酶或化学试剂的透皮贴片储库中时，可以被缓慢地转变成所述特定化合物。示例性的前体药物是在体内可水解的酯或酰胺。
核酸SIK3抑制剂：
在特定的一组实施方式中，所述SIK3抑制剂是核酸。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”在整个本文中可互换使用，并包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物(例如肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)及其杂交体。所述核酸分子可以是单链或双链的。
在SIK3抑制剂是CRISPR/Cas9构建物和/或指导RNA/DNA(gRNA/gDNA)和/或tracrRNA的情况下，用于设计CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法的基本规则对于专业技术人员来说是已知的，并在例如Wiles MV等(Mamm Genome 2015，26：501)或
Figure BPA0000282270360000521
N和SchwankG(Transl Res 2016，168：15)中综述。
在特定实施方式中，所述SIK3抑制剂可以是抑制性核酸分子，比如反义核苷酸分子包括siRNA或shRNA分子，作为在下文中详细描述的例子。
在更特定的此类实施方式中，所述抑制性核酸(如siRNA或shRNA)可以结合到，譬如特异性结合到，编码或调控下述基因的表达、量、功能、活性或稳定性的核酸(例如mRNA)：(i)SIK3(如磷酸化SIK3)；或(ii)控制SIK3的表达、量、功能和/或稳定性的基因(例如LKB1或胰高血糖素受体)，并例如由此调节SIK3(如磷酸化SIK3)的表达、量、功能、活性和/或稳定性。
作为核酸的SIK3抑制剂可以是诸如反义核苷酸分子、RNA、DNA或PNA分子或适体分子。反义核苷酸分子可以凭借它包含反义核苷酸序列，结合到细胞内的靶核酸分子(如基于序列互补性)并调节SIK3的表达(转录和/或翻译)水平，或者它可以调节控制SIK3的表达、功能和/或稳定性的另一个基因的表达。同样地，RNA分子譬如催化性核酶，可以结合到SIK3基因并改变其表达，或者它可以结合到控制SIK3的表达、功能和/或稳定性的其他基因譬如SIK3的转录因子或阻遏蛋白和/或LKB1或胰高血糖素受体，并改变它们的表达。适体是核酸分子，其序列具有赋予其形成能够结合到分子靶的三维结构的能力。
作为核酸的SIK3抑制剂也可以是诸如用于RNA干扰的双链RNA分子。RNA干扰(RNAi)是一个序列特异性基因沉默过程，通过翻译后RNA降解沉默或沉默(阻止转录)实现。RNAi使用与待沉默的靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)启动。适合用于RNAi的双链RNA(dsRNA)含有对应于所述待靶向基因的约21个连续核苷酸的正义和反义链，其形成19个RNA碱基对，在每个3′末端留下两个核苷酸的突出端(Elbashir等，Nature 411：494-498(2001)；Bass，Nature 411：428-429(2001)；Zamore，Nat.Struct.Biol.8：746-750(2001))。约25-30个核苷酸的dsRNA也已被成功地用于RNAi(Karabinos等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：7863-7868(2001))。dsRNA可以在体外合成并通过本领域中已知的方法引入到细胞中。
本发明的反义分子的特别优选的实例是小干扰RNA(siRNA)或内切核糖核酸酶制备的siRNA(esiRNA)。esiRNA是使用内切核糖核酸酶例如大肠杆菌RNase III或dicer从长的双链RNA(dsRNA)的切割产生的siRNA寡聚物的混合物。esiRNA是化学合成的siRNA用于RNA干扰(RNAi)的可替选概念。esiRNA是长的双链RNA在体外的酶消化物。
如上所述，作为RNAi分子(例如siRNA)的本发明的调节物可以结合并直接抑制或拮抗SIK3的mRNA表达。然而，作为RNAi分子(例如siRNA)的本发明的调节物可以结合并抑制或拮抗本身控制SIK3的表达(或功能或稳定性)的另一个基因的mRNA的表达。这些其他基因可以包括转录因子或阻遏蛋白或LKB1或胰高血糖素受体。
为了靶向SIK3 mRNA(或为了靶向控制SIK3的表达、功能和/或稳定性的基因的mRNA)，根据本发明的反义分子序列一致性以增加的偏好性，与本文中公开的编码SIK3蛋白的序列(或此类其他控制基因，其优选实例是LKB1基因)的区域至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％和100％一致。优选地，所述靶基因与调节性反义分子之间的序列一致性区域是所述靶基因对应于所述调节性反义分子的位置和长度的区域。例如，这种序列一致性在对应于所述调节性siRNA或shRNA分子的长度为约19至21bp的区域上。用于确定序列一致性的手段和方法在本领域中是已知的。优选地，正如本领域中已知的，使用BLAST(基本局部比对搜索工具)程序来确定针对一种或多种SIK3 RNA的序列一致性。另一方面，本发明的优选反义分子例如siRNA和shRNA优选地使用适当保护的核糖核苷氨基磷酸酯和常规RNA合成仪化学合成。RNA合成试剂的供应商包括Proligo(Hamburg，Germany)、Dharmacon Research(Lafayette，CO，USA)、Pierce Chemical(PerbioScience的分部Rockford，IL(USA))、Glen Research(Sterling，VA，USA)、ChemGenes(Ashland，MA，USA)和Cruachem(Glasgow，UK)。
反义分子siRNA和shRNA有效但可逆地在体内沉默基因的能力，使这些分子特别良好地适用于也将在下文中描述的本发明的药物组合物。将siRNA施用到人类的方式被描述在De Fougerolles等，Current Opinion in Pharmacology，2008，8：280-285中。这些方式也适合于施用其他小RNA分子如shRNA。因此，这些药物组合物可以直接配制成盐水、通过基于脂质体和基于聚合物的纳米粒子方法、作为偶联或络合的药物组合物或通过病毒递送系统来施用。直接施用包括注射到组织中、鼻内和气管内施用。基于脂质体和基于聚合物的纳米粒子方法包括阳离子脂质Genzyme Lipid(GL)67、阴离子型脂质体、壳聚糖纳米粒子和阳离子细胞穿透肽(CPP)。偶联或络合的药物组合物包括PEI络合的反义分子、siRNA、shRNA或miRNA。此外，病毒寄送系统包括流感病毒包膜和病毒体。
所述反义分子siRNA、shRNA可以包含修饰的核苷酸例如锁核酸(LNA)。LNA核苷酸的核糖组成部分被连接2′氧和4′碳的额外的桥修饰。所述桥将所述核糖“锁”在通常存在于A-型双链体中的3′-内(North)构象下。在寡核苷酸中，LNA核苷酸可以在需要时与DNA或RNA残基混合。这些寡聚物是化学合成的并且可以商购。所述锁住的核糖构象增强了碱基堆积和骨架预组织化。这显著提高了寡核苷酸的杂交性能(解链温度)。siRNA的特别优选的实例是GapmeR(LNATM GapmeRs(Exiqon))。GapmeR是用于高效抑制SIK3 mRNA(或控制SIK3的表达、功能和/或稳定性的基因的mRNA)的强力反义寡核苷酸。GapmeR含有一段位于中间的DNA单体，其两侧为LNA区段。GapmeR优选地长为14-16个核苷酸，并且任选地完全硫代磷酸酯化。所述DNA间隙激活靶向RNA的RNAse H介导降解，并且也适合于直接靶向核中的转录本。
用于靶向SIK3的优选反义分子是具有与SIK3 mRNA的核酸序列的区域(如上文描述的区域)互补序列的反义分子或构建物，所述序列优选为与SEQ ID NO：1至4中或SEQ IDNO：13至16中的任一者、特别是SEQ ID NO：1或13中示出的氨基酸序列的编码序列的区域互补序列，更优选为与SEQ ID NO：1至4中或SEQ ID NO：13至16中的任一者、特别是SEQ IDNO：1或13中示出的氨基酸序列的编码序列的约15至25bp之间(例如约19至21bp之间)的区域互补序列。
在特定实施方式中，用于靶向SIK3的反义分子可以是选自在本文中被鉴定为“s1”、“s2”、“s3”或“s4”的SIK3 siRNA分子的siRNA(例如在表A1中；分别为SEQ ID NO：7、8、9和10)。
表A1：所使用的示例性siRNA序列
Figure BPA0000282270360000561
在特定实施方式中，用于靶向SIK3的反义分子可以是在本文中被鉴定为“shSIK3”的shRNA分子(例如在表A2中；SEQ ID NO：11)。
表A2：所使用的示例性shRNA序列
Figure BPA0000282270360000562
Figure BPA0000282270360000571
在一个实施方式中，本发明的反义分子可以是分离的。在另一个实施方式中，本发明的反义分子可以是重组、合成和/或修饰的，或以任何其他非天然方式亦或不是天然产物。举例来讲，本发明的核酸相对于天然产物如人类核酸可以含有至少一个核酸替换(或缺失)修饰，例如1至5个之间的此类修饰，优选地不超过1、2或3个此类修饰。如上所述，本发明的反义分子可以利用非天然核苷酸来修饰，或者可以被偶联到另一个化学组成部分。例如，这些化学组成部分可以是提供提高的稳定性或细胞/核穿透或靶向的异源核酸，或者可以是提供这些性质的非核酸化学组成部分，或者可以是标记物。
某些优选实施方式涉及用于基因编辑的遗传构建物，其在本文描述的发明的情形中被用作SIK3的表达、功能和/或稳定性的抑制剂。通过使用基因组编辑构建物，可以调节SIK3的表达、稳定性和/或活性。基因编辑方法在本领域中是公知的，并且在相应的靶基因组序列已知时可以容易地应用。优选地，这些方法可用于使用诸如特异性靶向上文描述的靶肿瘤细胞的病毒载体的基因疗法中。
在基因组编辑的情况下，使用人工工程化改造的核酸酶或所谓的“分子剪刀”将DNA插入、替换或从基因组移除。所述核酸酶在所述基因组的所需位置处产生特异性双链断裂(DSB)，并利用细胞的内源机制通过同源重组(HR)和非同源末端联结(NHEJ)的自然过程修复所述诱导的断裂。为此，将工程化改造的核酸酶诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统，和工程化改造的大范围核酸酶重新工程化改造的归巢内切核酸酶，常规用于基因组编辑。根据另一个优选实施方式，对用于调节/抑制SIK3的基因组编辑方法来说，稀有切点的内切核酸酶是Cas9、Cpf1、TALEN、ZFN，或者可以使用归巢内切核酸酶。此外，使用DNA指导的Argonaute干扰系统(DAIS)可以方便地进行工程化改造。基本上来说，将所述Argonaute(Ago)蛋白在至少一种外源寡核苷酸(DNA指导物)存在下从引入到所述细胞中的多核苷酸异源表达，所述指导物为所述Ago蛋白提供对预选基因座的切割特异性。所述TALEN和Cas9系统分别被描述在WO 2013/176915和WO 2014/191128中。所述锌指核酸酶(ZFN)最初描述在Kim，YG；Cha，J.；Chandrasegaran，S.(“杂合体限制性酶：融合到Fok I切割结构域的锌指融合物”(Hybrid restriction enzymes：zinc fingerfusions to Fok I cleavage domain)(1996).Proc Natl Acad Sci USA 93(3)：1156-60)。Cpf1是2类CRISPR/Cas系统，其由Zhang等(Cpf1是2类CRIPR-Cas系统的单一RNA指导的内切核酸酶(Cpf1 is a single RNA-guided Endonuclease of a Class 2 CRIPR-CasSystem)(2015)Cell；163：759-771)描述。Argonaute(AGO)基因家族最初描述在Guo S，Kemphues KJ.(“为在秀丽隐杆线虫胚胎中建立极性所需的基因par-1编码一种不对称分布的推测的Ser/Thr激酶”(par-1，a gene required for establishing polarity inC.elegans embryos，encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetricallydistributed)(1995)Cell；81(4)：611-20)中。
所述CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1或Argonaute基因组编辑系统的使用被专门改编，以适合与指导RNA或指导DNA序列的转染相组合使用。在这种情形中，将所述指导RNA和编码Cas9切口酶(或类似酶)的核酸序列转染到靶细胞(优选为肿瘤细胞)中，使得它们形成能够在双链核酸靶中诱导切口事件的复合物，以便在所述核酸靶之间切开所述遗传序列。
在某些实施方式中，将所述指导RNA-纳米粒子剂型与所述Cas9分开地递送可能是有用的。在这种情况下提供了双重递送系统，以便所述Cas9可以通过载体递送，并且所述指导RNA被提供在纳米粒子剂型中，其中载体在最宽泛的意义上被简单地认为是任何递送手段，而不特指病毒载体。所述指导RNA-纳米粒子剂型和Cas9的分开递送可以是顺序的，例如，首先通过载体系统递送Cas9载体，然后递送sgRNA-纳米粒子剂型，或者所述sgRNA-纳米粒子剂型和Cas9可以基本上同时递送(即共同递送)。顺序递送可以在相隔数天、数周或甚至数月的分开的时间点进行。在某些实施方式中，可以与Cas9递送系统一起提供配制在一种或多种递送介质中的多个指导RNA(例如其中某些指导RNA被提供在载体中，其他的被配制在纳米粒子中)。在某些实施方式中，所述Cas9也在纳米粒子剂型中递送。在这种情况下，所述指导RNA-纳米粒子剂型和Cas9纳米粒子剂型可以分开地递送，或者可以基本上同时递送(即共同递送)。正如现在对普通技术人员来说显而易见的，这些基因组编辑方法的基因靶可以是SIK3的基因。或者，这种编辑的基因靶可以是控制SIK3的表达、功能和/或稳定性的另一个基因，例如LKB1或胰高血糖素受体。
在本发明的优选实施方式中，根据本发明用于基因组编辑方法的化合物至少包含使用与SIK3序列的区域(例如上文描述的区域)互补的指导RNA或DNA。在某些另外的实施方式中，所述用于本发明的基因组编辑方法的化合物可以包括与SIK3的这种区域同源的供体序列，作为用于同源性指导的修复的模板。所述供体序列包含SIK3的突变序列，其在用于靶细胞中CRISPR诱导的修复机制中时，通过同源重组插入/复制到SIK3基因组基因座中，因此产生以所表达的SIK3的表达、功能和/或稳定性降低为特征的突变的SIK3基因。癌症疗法中的CRISPR/Cas9基因组编辑综述在例如Khan FA等，CRISPR/Cas9治疗剂：用于癌症和其他遗传疾病的治愈方法(CRISPR/Cas9 therapeutics：a cure for cancer and other geneticdiseases)(Oncotarget.2016May 26.doi：10.18632/oncotarget.9646；整体通过引用并入本文)中。
异双功能化合物
在特定实施方式中，SIK3的抑制剂可以是含有通过连接物相连的两个配体的异双功能化合物，其中一个配体结合到所述靶蛋白(在这种情况下，SIK3或控制SIK3的表达、量、功能、活性和/或稳定性的基因)，并且另一个配体结合到和/或召集细胞蛋白质降解机制的组分，例如结合到遍在蛋白连接酶蛋白(如E3遍在蛋白连接酶)或例如召集伴侣蛋白。这种异双功能化合物的实例包括PROTAC(蛋白水解靶向嵌合体)或HyT(疏水性标签)分子，其在每种情况下被设计成结合到本发明的靶蛋白。PROTAC和HyT分子的一般性原理综述在Huang&Dixit 2016(Cell Research 26：484)中并具体示例在例如WO 2016/146985A1中。
由此，使用一个配体结合到靶蛋白(例如SIK3)并使用另一个配体结合到E3遍在蛋白连接酶蛋白的PROTAC，使所述连接酶和所述靶紧密接近。不受任何特定理论限制，通常理解正是这种紧密接近进而触发感兴趣的靶蛋白的多聚遍在蛋白化和随后的蛋白酶体的依赖性降解。总体上，PROTAC方法的支持性证据由已知的概念验证性实例提供，其中可替选的PROTAC已被用于降解：雌激素受体(Cyrus等，2010，Chem Bio Chem 11：1531)，雄激素受体(Sakamoto等，2003，Mol Cell Proteomics 2：1350)，甲硫氨酸氨基肽酶-2(Sakamoto等，2001，PNAS 98：8554)，以及芳基烃受体(Lee等，2007，Chem Bio Chem 8：2058)。
疏水标签的概念与PROTAC的概念相似，但代替使用配体来召集特异性E3连接酶，连接到特异性识别靶蛋白(例如SIK3)的化学组成部分的合成的疏水基团譬如金刚烷承担降解机制的“召集者”的作用。在结合到靶蛋白之后，所述疏水标签模拟或诱导错误折叠状态。不受任何特定理论限制，通常理解用大体积的疏水侧基修饰所述靶蛋白吸引伴侣机制，其主要目的是帮助错误折叠的蛋白质重新折叠。由于所述共价修饰不能被容易地除去，因此所述靶蛋白保持不折叠，并最终被遍在蛋白-蛋白酶体介导的降解清除。
在本发明的情形中，在这种异双功能化合物的某些实施方式中，其中包含的结合到靶蛋白(例如SIK3)的配体可以是(优选地特异性)结合到这种靶蛋白的肽；并且在可选实施方式中，所述结合到靶蛋白(例如SIK3)的配体可以是(优选地特异性)结合到这种靶蛋白的小分子譬如小分子SIK3抑制剂。示例性的小分子SIK3抑制剂在本文中别处描述，并且在某些实施方式中，此类本身(也就是说不被包含在异双功能化合物中)可用作抑制剂的小分子SIK3抑制剂可以被包含在异双功能化合物中。
小分子SIK3抑制剂：
在特定的另一组实施方式中，所述SIK3抑制剂可以是小分子(特别是小分子配体或细胞渗透性小分子)。
在更特定的此类实施方式中，小分子SIK3抑制剂可以结合到：(i)SIK3并抑制SIK3(例如磷酸化SIK3)的功能或活性；或(ii)控制SIK3的表达、量、功能、活性和/或稳定性并例如由此调节SIK3(例如磷酸化SIK3)的表达、量、功能、活性和/或稳定性的基因(例如LKB1或胰高血糖素受体)。
作为小分子的SIK3的抑制剂可以是譬如具有本文中所描述的SIK3抑制活性，并且分子量例如低于3000道尔顿(Da)、优选地低于1500Da、最优选地低于1000Da的任何化学结构或化合物(分子)。
通常，小分子是分子质量小于约750Da比如小于约650或600Da的化合物，(并且在某些实施方式中，小分子可以小于约550或500Da)。此外，(特别是对于细胞渗透性化合物，尤其是对于口服活性化合物来说)，所述小分子在某些实施方式中可以具有：(i)不超过5个氢键供体(氮-氢和氧-氢键的总数)；(ii)不超过10个氢键受体(所有的氮或氧原子)；和/或(iii)不大于5的辛醇-水分配系数log P。因此，在某些实施方式中，所述SIK3抑制剂可以是细胞渗透性小有机分子，例如结合到并抑制SIK3(特别是磷酸化SIK3)的功能或活性的细胞渗透性小有机分子。
在本发明的所有方面的一个特定实施方式中，所述SIK3抑制剂是达沙替尼。
达沙替尼(或BMS-354825)是由Bristol-Myers Squibb生产并在商品名SPRYCEL下销售的癌症药物。达沙替尼的化学名称是N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺，特别是其单水合物形式。达沙替尼(单水合物)的分子式是C22H26ClN7O2S·H2O，其对应于506.02的化学式量(单水合物)，并且达沙替尼(单水合物)具有下述化学结构：
Figure BPA0000282270360000621
在本发明的所有方面的可选特定实施方式中，所述SIK3抑制剂不是达沙替尼。例如，在本发明的所有方面的一个特定实施方式中，所述SIK3抑制剂是达沙替尼的变体。在小分子(例如SIK3抑制剂例如达沙替尼)的情形中，“变体”意味着具有与所述参比小分子不同的化学结构的另一个小分子(即所述变体是不同的小分子)，其中所述不同的化学结构保留了所述参比小分子的核心结构的一种或多种结构特点。变体的化学结构与所述参比小分子的化学结构的差异可以是与所述参比小分子相比至少一个原子的添加、移除或替换，或至少一个原子或基团组分的修饰、移除或替换，或原子之间的至少一个化学键的变化。例如，可以在所述参比小分子的化学结构上添加、移除或替换2、3、4、5或超过5个这种原子或基团组分，以提供所述参比分子(例如达沙替尼)的这种变体。
因此，本发明特别包括了其中所述SIK3抑制剂是达沙替尼的变体的实施方式。
例如，在某些实施方式中，所述SIK3抑制剂是EP 1 169 038 B9的权利要求3的环状化合物的单水合物，或者是其盐(或者是溶剂化物、盐、络合物、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物和组合)。
在某些实施方式中，所述SIK3抑制剂是(例如达沙替尼的变体是)WO 00/62778A1的第3至13页中所定义的“式I”或“式2”的环状化合物(在本文中分别为式I和式IIWO)，特别是在WO 00/62778A1的第13和14页上所定义的其“优选化合物”，及其盐。在某些此类实施方式中，所述化合物不是达沙替尼(或不是达沙替尼的单水合物或盐)，例如所述化合物不是EP 1 169 038 B9的权利要求3的环状化合物或其盐(或不是其溶剂化物、盐、络合物、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物和组合)。WO 00/62778A1的这些公开内容仅仅出于这种特定目的通过引用并入本文。
因此，在本发明的特定实施方式中，所述SIK3抑制剂是下式I的环状化合物(例如达沙替尼的变体)及其盐、前体药物、溶剂化物和立体异构体(或其溶剂化物、盐、络合物、立体异构体、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物和组合)：
Figure BPA0000282270360000631
其中：
Q是：
(1)5员杂芳基环；
(2)6员杂芳基环；或
(3)芳基环；
其任选地被一个或多个基团R1取代；
Z是：
(1)单键；
(2)-R16C＝CH-；或
(3)-(CH2)m-，其中m是1至2；
X1和X2各自是氢或合在一起形成＝O或＝S；
R1是：
(1)氢或R6，
其中R6是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、环烯基烷基、芳基、芳烷基、杂环，或杂环烷基，其各自是未取代的或者被Z1、Z2和一个或多个(优选地一个或两个)基团Z3取代；
(2)-OH或-OR6；
(3)-SH或-SR6；
(4)-C(O)2H、-C(O)qR6或-O-C(O)qR6，其中q是1或2；
(5)-SO3H或-S(O)qR6；
(6)卤素；
(7)氰基；
(8)硝基；
(9)-Z4-NR7R8；
(10)-Z4-N(R9)-Z5-NR10R11；
(11)-Z4-N(R12)-Z5-R6；
(12)-P(O)(OR6)2；
R2和R3各自独立地是：
(1)氢或R6；
(2)-Z4-R6；或
(3)-Z13-NR7R8；
R4和R5：
(1)各自独立地是氢或R6；
(2)-Z4-N(R9)-Z5-NR10R11；
(3)-N(R9)Z4R6；或
(4)与它们附连到的氮原子一起完成未取代的或被Z1、Z2和Z3取代的3至8员饱和或不饱和杂环，所述杂环可以任选地稠合有本身未取代的或被Z1、Z2和Z3取代的苯环；
R7、R8、R9、R10、R11和R12：
(1)各自独立地是氢或R6；
(2)R7和R8可以合在一起成为亚烷基、亚烯基或杂烷基，其与它们附连到的氮原子完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；或
(3)R9、R10和R11中的任两者可以合在一起成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的氮原子完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；
R13是：
(1)氰基；
(2)硝基；
(3)-NH2；
(4)-NHO烷基；
(5)-OH；
(6)-NHO芳基；
(7)-NHCOO烷基；
(8)-NHCOO芳基；
(9)-NHSO2烷基；
(10)-NHSO2芳基；
(11)芳基；
(12)杂芳基；
(13)-O烷基；或
(14)-O芳基；
R14是：
(1)-NO2；
(2)-COO烷基；或
(3)-COO芳基；
R15是：
(1)氢；
(2)烷基；
(3)芳基；
(4)芳基烷基；或
(5)环烷基；
Z1、Z2和Z3各自独立地是：
(1)氢或Z6，其中Z6是(i)烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、环烯基烷基、芳基、芳烷基、烷基芳基、环烷基芳基、杂环或杂环烷基；(ii)本身被一个或多个相同或不同的基团(i)取代的基团(i)；或(iii)被一个或多个Z1、Z2和Z3的定义的下述基团(2)至(16)取代的基团(i)或(ii)；
(2)-OH或-OZ6；
(3)-SH或-SZ6；
(4)-C(O)qH、-C(O)qZ6或-O-C(O)qZ6；
(5)-SO3H、-S(O)qZ6或S(O)qN(Z9)Z6；
(6)卤素；
(7)氰基；
(8)硝基；
(9)-Z4-NZ7Z8；
(10)-Z4-N(Z9)-Z5-NZ7Z8；
(11)-Z4-N(Z10)-Z5-Z6；
(12)-Z4-N(Z10)-Z5-H；
(13)氧代；
(14)-O-C(O)-Z6；
(15)Z1、Z2和Z3中的任两者可以合在一起成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的原子一起完成3至8员饱和或不饱和环；或
(16)Z1、Z2和Z3中的任两者可以合在一起成为-O-(CH2)r-O-，其中r是1至5，其与它们附连到的原子一起完成4至8员饱和或不饱和环；
Z4和Z5各自独立地是：
(1)单键；
(2)-Z11-S(O)q-Z12-；
(3)-Z11-C(O)-Z12；
(4)-Z11-C(S)-Z12-；
(5)-Z11-O-Z12-；
(6)-Z11-S-Z12-；
(7)-Z11-O-C(O)-Z12；或
(8)-Z11-C(O)-O-Z12-；
Z7、Z8、Z9和Z10：
(1)各自独立地是氢或Z6；
(2)Z7和Z8或Z6和Z10可以合在一起成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的原子一起完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；或
(3)Z7或Z8与Z9一起可以成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的氮原子完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；
Z11和Z12各自独立地是：
(1)单键；
(2)亚烷基；
(3)亚烯基；或
(4)亚炔基；并且
Z13是：
(1)单键；
(2)-Z11-S(O)q-Z12-；
(3)-Z11-C(O)-Z12；
(4)-Z11-C(S)-Z12-；
(5)-Z11-O-Z12-；
(6)-Z11-S-Z12-；
(7)-Z11-O-C(O)-Z12-；
(8)-Z11-C(O)-O-Z12-；
(9)-C(NR13)-；
(10)-C(CHR14)-；或
(11)-C(C(R14)2)-。
本发明(或用于本发明)的优选化合物是所述式I的化合物及其盐，其中Q是噻唑，并且其中and wherein one或more，and especially all，of Z、X1、X2R1、R2、R3、R4和R5中的一者或多种、特别是全体都选自下述定义：Z是单键；R1选自氢、卤素、烷基、芳基、烷氧基、烷氧基羰基或芳氧基羰基，并且更优选为氢；X1和X2合在一起形成＝O或＝S，更优选地形成＝O；R2是氢；R3选自-Z4-R6或-Z13-NR7R8，更优选为-Z4-R6，其中Z4是单键并且R6是未取代的或被Z1、Z2和一个或多个(优选地一个或两个)基团Z3取代的芳基或杂芳基；R5是氢；并且R5选自被Z1、Z2和一个或多个(优选地一个或两个)基团Z3取代的芳基或杂芳基。
式I中的化合物包括下式IIWO的化合物(例如达沙替尼的变体)及其盐：
Figure BPA0000282270360000681
其中
n是1或2；
A选自碳和氮；
B选自氮、氧和硫；
X3是氧或硫；并且
R1、R2、R3、R4和R5如上所述。
下面是在本说明书中使用的术语的定义。除非另有指明，否则为本文中的基团或术语提供的初始定义在整个本说明书中适用于单个的或作为另一个基团的一部分的该基团或术语。
术语“烷基”是指具有1至12个碳原子、优选地1至8个碳原子的直链或支链烃类基团。表述“短链烷基”是指具有1至4个碳原子的烷基。
术语“烯基”是指具有至少一个双键的2至10个、优选地2至4个碳原子的直链或支链烃类基团。在烯基被键合到氮原子的情况下，优选地这个基团不直接通过带有双键的碳键合。
术语“炔基”是指具有至少一个叁键的2至10个、优选地2至4个碳原子的直链或支链烃类基团。在炔基被键合到氮原子的情况下，优选地这个基团不直接通过带有叁键的碳键合。
术语“亚烷基”是指通过单键连接的1至5个碳原子的直链桥(例如-(CH2)x-，其中x是1至5)，其可以被1至3个短链烷基取代。
术语“亚烯基”是指具有一个或两个双键的2至5个碳原子的直链桥，其通过单键连接并且可以被1至3个短链烷基取代。示例性的亚烯基是-CH＝CH-CH＝CH-、-CH2-CH＝CH-、-CH2-CH＝CH-CH2-、-C(CH3)2CH＝CH-和-CH(C2H5)-CH＝CH-。
术语“亚炔基”是指其中具有叁键、通过单键连接并且可以被1至3个短链烷基取代的2至5个碳原子的直链桥。示例性的亚炔基是-C≡C-、-CH2-C≡C-、-CH(CH3)-C≡C-和-C≡C-CH(C2H5)CH2-。
术语“芳基”是指含有6至14个碳原子的芳香族环状基团(例如6员单环、10员双环或14员三环环系统)。示例性的芳基包括苯基、萘基、联苯和蒽。
术语“环烷基”和“环烯基”是指3至12个碳原子的环状烃类基团。
术语“卤素”和“卤”是指氟、氯、溴和碘。
术语“不饱和环”包括部分不饱和的环和芳香环。
术语“杂环”是指完全饱和或不饱和的、包括芳香族(即“杂芳基”)环状基团，例如4至7员单环、7至11员双环或10至15员三环环系统，其在至少一个含有碳原子的环中具有至少一个杂原子。所述杂环基的每个含有杂原子的环可以具有1、2、3或4个选自氮原子、氧原子和/或硫原子的杂原子，其中所述氮和硫杂原子可以任选地被氧化，并且所述氮杂原子可以任选地被季铵化。所述杂环基可以在所述环或环系统的任何杂原子或碳原子处附连。
示例性的单环杂环基包括吡咯烷基、吡咯基、吡唑基、氧杂环丁烷基、吡唑啉基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、异噁唑啉基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、噁二唑基、哌啶基、哌嗪基、2-氧哌嗪基、2-氧哌啶基、2-氧吡咯烷基、2-氧氮杂环庚三烯基、氮杂环庚三烯基、4-哌啶酮基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、四氢吡喃基、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜、1，3-二氧杂环戊烷和四氢-1，1-二氧噻吩基、三唑基、三嗪基等。
是理性的双环杂环基包括吲哚基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并噻吩基、奎宁环基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、中氮茚基、苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、苯并吡喃基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基(例如呋喃并[2，3-c]吡啶基、呋喃并[3，2-b]吡啶基]或呋喃并[2，3-b]吡啶基)、二氢异吲哚基、二氢喹唑啉基(例如3，4-二氢-4-氧-喹唑啉基)、四氢喹啉基等。
示例性的三环杂环基包括咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基、氧杂蒽基等。
术语“杂芳基”是指芳香族杂环基。
示例性的杂芳基包括吡咯基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、三唑基、三嗪基等。
在q是1或2的情况下，“-C(O)qH”表示-C(O)-H或-C(O)-OH；“-C(O)qR6”或“-C(O)qZ6”分别表示-C(O)-R6或-C(O)-OR6或-C(O)-Z6或-C(O)-OZ6；“-O-C(O)qR6”或“-O-C(O)qZ6”分别表示-O-C(O)-R6或-O-C(O)-OR6或-O-C(O)-Z6或-O-C(O)-OZ6；并且“-S(O)qR6”或“-S(O)qZ6”分别表示-SO-H6或-SO2-H6或-SO-Z6或-SO2-Z6。
在某些情况下，所述式I的化合物可以形成盐。在本文中，除非另有指明，否则对式I的化合物的指称被理解为包括对其盐的指称。当在本文中使用时，术语“盐”表示由无机和/或有机酸和碱形成的酸性和/或碱性盐。两性离子(内盐)被包括在本文中使用的术语“盐”内(并且可以在例如R取代基包含酸性组成部分例如羧基的情况下形成)。本文还包括季铵盐例如烷基铵盐。可药用(即无毒性、生理上可接受的)盐是优选的，尽管其他盐在例如可能在制备期间使用的分离或纯化步骤中有用。所述式I的化合物的盐可以例如通过将化合物I与一定量例如等当量的酸或碱在介质例如所述盐在其中沉淀的介质或水性介质中反应，然后进行冷冻干燥来形成。
示例性的酸加成盐包括乙酸盐(例如与乙酸或三卤代乙酸例如三氟乙酸形成的盐)、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡萄糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(例如与硫酸形成的盐)、磺酸盐(例如本文中提到的那些)、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐等。
示例性的碱性盐(例如在R取代基包含酸性组成部分例如羧基的情况下形成)包括铵盐、碱金属盐例如钠盐、锂盐和钾盐、碱土金属盐例如钙盐和镁盐、与有机碱(例如有机胺)例如苄星青霉素、二环己胺、海巴明、N-甲基-D-葡萄糖胺、N-甲基-D-葡萄糖酰胺、叔丁胺的盐以及与氨基酸例如精氨酸、赖氨酸等的盐。碱性含氮基团可以用试剂例如短链烷基卤化物(例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)、二烷基硫酸酯(例如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯)、长链卤化物(例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物)、芳烷基卤化物(例如苯甲基和苯乙基溴化物)等季铵化。
本文中也设想了式I的化合物的前体药物和溶剂化物。当在这种情形中使用时，术语“前体药物”是指在施用到受试者后，通过代谢或化学过程经历化学转变以产生式I的化合物或其盐和/或溶剂化物的化合物。式I的化合物的溶剂化物优选为水合物。
在本发明的范围内设想了本发明的化合物的所有立体异构体，例如由于式I的化合物的R取代基上的不对称碳而可能存在的立体异构体，包括对映异构体和非对映异构体形式。本发明的化合物的各个立体异构体可以例如基本上不含其他异构体，或者可以是混合的，例如作为消旋体或具有所有其他的或其他所选的立体异构体。本发明的手性中心可以具有如IUPAC 1974推荐意见所定义的S或R构型。
在整个本说明书中，对基团及其取代基进行选择以提供稳定的组成部分和化合物。
在某些此类实施方式中，所述SIK3抑制剂是式I的化合物(例如达沙替尼的变体)，其中式I或式IIWO的R2是氢，并且式I或式IIWO的R3是Rx，其中Rx具有下式X：
Figure BPA0000282270360000721
及其溶剂化物、盐、络合物、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物和组合，其中式X的Z1、Z2和Z3如本文中或WO 00/62778A1中所定义。优选地，在式X中：
●Z1是甲基；和/或
●Z2是-Z4-NZ7Z8、-Z4-N(Z9)-Z5-NZ7Z8或Z4-N(Z10)-Z5-H(其中Z4和Z5至Z10如本文中或WO 00/62778A1中所定义，尤其是其中Z4是单键)；和/或
●Z3是氢。
在特定的这些实施方式中，式X中的Z2是选自下述的取代基：
Figure BPA0000282270360000731
在其他特定实施方式中，在式X中，Z1(优选)为甲基，Z3是氢，并且Z2(优选)为选自下述的取代基：
Figure BPA0000282270360000741
在其他实施方式中，特别是当在式X中Z1是甲基并且Z3是氢时，Z2可能不是：
Figure BPA0000282270360000742
在某些特定的此类实施方式中，所述SIK3抑制剂是式I的化合物(例如达沙替尼的变体)，其中式I或式IIWO的R2是氢，并且式I或式IIWO的R3是Rdas，其中Rdas具有下式Y：
Figure BPA0000282270360000743
及其溶剂化物、盐、络合物、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物和组合。
在其他任何此类实施方式中，式I的X1和X2合在一起形成(或式IIWO的X3是)＝O或＝S(优选为＝O)，式I的Z(优选)为键，式IIWO的n(优选)为1，式I或式IIWO的R1(优选)为氢，式I或式IIWO的R4或R5之一(优选)为氢并且式I或式IIWO的R4或R5之一为R6，特别是其中式IIWO的R4是氢并且式IIWO的R5是R6，其中R6是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、环烯基烷基、芳基、芳烷基、杂环或杂环烷基，其各自是未取代的或者被Z1、Z2和一个或多个(优选地一个或两个)基团Z3取代(其中Z1、Z2和Z3如本文中或WO 00/62778A1中所定义)。在特定的此类其他实施方式中，此类R6是芳基、芳烷基、杂环或杂环烷基(优选为芳基或杂芳基)，其各自是未取代的或者被Z1、Z2和一个或多个(优选地一个或两个)基团Z3取代(其中Z1、Z2和Z3如本文中或WO 00/62778A1中所定义)。优选地，在此类实施方式中，R6是单环芳基或杂芳基(特别是6员单环芳基或杂芳基，优选为6员杂芳基)，其被1、2或3个(特别是在所述单环芳基或杂芳基的邻位处被至少一个或两个)Zx取代，其中每个Zx可以独立地是：(i)Zy，其中Zy是C1-5(特别是C1、C2或C3)烷基、烯基或炔基；(ii)-OH或-OZy；(iii)-SH或-SZy；(iv)卤素；或(v)-SO2-Zy或-SO2-N-(Zy)(Zy)。在特定的这些实施方式中，Zx可以是非极性取代基。所述单环芳基或杂芳基R6(当式IIWO的R5是R6时)优选为苯基或吡啶基(例如吡啶-2-基或更优选地吡啶-3-基)，其任选地被1、2或3个(优选地2个)Zx取代，特别是其中一个Zx在所述苯基或吡啶基的邻位处取代，和/或特别是其中每个Zx独立地选自-Cl、-F、-Br、-Me、-OMe、-OEt和-CN(优选地选自-Cl、-F、-Me和-Br)。特别是取代的苯基或吡啶基例如R6，其中所述间位中的至少一个(或两个)不是氢(例如时本文中所定义的Zx)，和/或其中所述对位是氢。
在某些特定的此类实施方式中，所述SIK3抑制剂可以是(例如达沙替尼的变体是)WO 00/62778A1的权利要求1至21中任一项的环状化合物及其盐(或溶剂化物、盐、络合物、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物和组合)。在某些此类实施方式中，R2、R3、X1、X2、R4、R5和/或R6如本文中所定义。在特定的这些实施方式中，所述达沙替尼的变体选自由WO 00/62778A1的权利要求22构成的环状化合物及其盐。WO 00/62778A1的这些公开内容仅仅出于这种特定目的通过引用并入本文。
在其他特定的此类实施方式中，所述SIK3抑制剂可以是(例如达沙替尼的变体是)如WO 00/62778A1的权利要求23中所定义的“式III”的化合物，特别是WO 00/62778A1的权利要求23或53中所阐述的化合物及其盐。WO 00/62778A1的这些公开内容仅仅出于这种特定目的通过引用并入本文。在某些此类实施方式中，R2、R3、R4、R5和/或R6如上所定义，和/或X3(优选)为氧。
在其他特定的此类实施方式中，所述SIK3抑制剂可以是(例如达沙替尼的变体是)如WO 00/62778A1的权利要求59中所阐述的化合物及其盐。WO 00/62778A1的这些公开内容仅仅出于这种特定目的通过引用并入本文。在某些此类实施方式中，R2、R3、R4、R5和/或R6如上所定义，和/或X3(优选)为氧。
在其他特定的此类实施方式中，所述SIK3抑制剂可以是(例如达沙替尼的变体是)EP 1169038B9的权利要求1的“式II”的环状化合物(本文中的式IIEP)及其盐。这些公开内容与EP 1169038B9的段落[0010]至[0032]一起，仅仅出于这种特定目的通过引用并入本文。
因此，在此类实施方式中，SIK3抑制剂可以是其中式I是下式IIEP的环状化合物的化合物(例如达沙替尼的变体)或其盐：
Figure BPA0000282270360000761
其中：
X3是氧或硫；
R5是被一个或多个选自烷基和卤素的基团取代的芳基；
R6是：被Z1、Z2和一个或多个基团Z3取代的芳基或杂芳基，其中
(a)所述芳基被至少一个基团Z3取代，其中Z3是-Z4-NZ7Z8，其中Z4是键，Z7是氢或烷基，并且Z8是杂环取代的烷基；或
(b)所述杂芳基被至少一个基团Z3取代，其中Z3是-Z4-NZ7Z8，其中Z4是键，Z7是氢或烷基，并且Z8是杂环取代的烷基；或
(c)所述杂芳基被至少一个基团Z3取代，其中Z3是烷基；
Z1、Z2和Z3各自独立地是：
(1)氢或Z6，其中Z6是(i)烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、环烯基烷基、芳基、芳烷基、烷基芳基、环烷基芳基、杂环或杂环烷基；(ii)本身被一个或多个相同或不同的基团(i)取代的基团(i)；或(iii)被一个或多个Z1、Z2和Z3的定义的下述基团(2)至(16)取代的基团(i)或(ii)；
(2)-OH或-OZ6；
(3)-SH或-SZ6；
(4)-C(O)qH、-O(O)qZ6或-O-C(O)qZ6，其中q是1或2；
(5)-SO3H、-S(O)qZ6或S(O)qN(Z9)Z6；
(6)卤素；
(7)氰基；
(8)硝基；
(9)-Z4-NZ7Z8；
(10)-Z4-N(Z9)-Z5-NZ7Z8；
(11)-Z4-N(Z10)-Z5-Z6；
(12)-Z4-N(Z10)-Z5-H；
(13)氧代；
(14)-O-C(O)-Z6；
(15)Z1、Z2和Z3中的任两者可以合在一起成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的原子一起完成3至8员饱和或不饱和环；或
(16)Z1、Z2和Z3中的任两者可以合在一起成为-O-(CH2)r-O-，其中r是1至5，其与它们附连到的原子一起完成4至8员饱和或不饱和环；
Z4和Z5各自独立地是：
(1)单键；
(2)-Z11-S(O)q-Z12-；
(3)-Z11-C(O)-Z12；
(4)-Z11-C(S)-Z12-；
(5)-Z11-O-Z12-；
(6)-Z11-S-Z12-；
(7)-Z11-O-C(O)-Z12；或
(8)-Z11-C(O)-O-Z12-；
Z7、Z8、Z9和Z10：
(1)各自独立地是氢或Z6；
(2)Z7和Z8或Z6和Z10可以合在一起成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的原子一起完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；或
(3)Z7或Z8与Z9一起可以成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的氮原子完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；
Z11和Z12各自独立地是：
(1)单键；
(2)亚烷基；
(3)亚烯基；或
(4)亚炔基。
在某些此类实施方式中，式IIEP的R6可以是Rdas和/或X3(优选)为氧和/或式IIEP的R5可以是本文中所定义的R6。在特定的这些实施方式中，所述SIK3抑制剂可以是(例如达沙替尼的变体是)选自由EP 1169038B9的权利要求2构成的环状化合物的化合物及其盐。这些公开内容仅仅出于这种特定目的通过引用并入本文。
在一个特定方面，本发明还提供了本文中公开的通用(或特定)式或结构中的任一者(例如式I、IIWO或IIEP)的达沙替尼的变体，及其盐(或溶剂化物、盐、络合物、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物和组合)。
在本发明的某些实施方式中，所述SIK3抑制剂可以是达沙替尼的变体(即不是达沙替尼)；即在此类实施方式中，所述SIK3抑制剂是具有通式I(或IIWO或IIEP)的抑制剂，前提是所述SIK3抑制剂不是化合物A8。
式I、IIWO或IIEP的SIK3抑制剂可以遵照WO 00/62778A1的公开内容，尤其是方案A至XI(和/或实施例1至580中的程序)来合成。这些公开内容仅仅出于这种特定目的通过引用并入本文。或者，作为达沙替尼的变体的SIK3抑制剂可以按照本文实施例10中描述的程序来合成。
在某些实施方式中，所述SIK3抑制剂是，并且在某些方面本发明涉及在表A3或表A4中阐述的(环状)化合物(尤其是化合物B3、B2或A6)及其溶剂化物、盐、络合物、立体异构体、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物及其组合。
表A3：本发明的小分子化合物
Figure BPA0000282270360000791
Figure BPA0000282270360000801
表A4：本发明的/式I的其他化合物
Figure BPA0000282270360000802
Figure BPA0000282270360000811
在某些实施方式中，且在某些方面本发明涉及，所述SIK3抑制剂是表A3或表A4中所阐述的化合物及其溶剂化物、盐、络合物、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物和组合，前提是下述一者或多种(优选地全部)：所述SIK3抑制剂或所述化合物不是化合物A9、B8和/或B9。因此，在其他实施方式中，且在某些方面本发明涉及，所述SIK3抑制剂是本文中公开的通用(或特定)式或结构中任一者(例如式I、IIWO)的化合物及其盐(或溶剂化物、盐、络合物、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物和组合)，前提是下述一者或多种(优选地全部)：当在通式式IIWO中X3是氧，n是1，R1是氢，R2是氢，R3是Rdas并且R4或R5之一是氢时，R4或R5中的另一者是R6，其(i)不是2-氯-6-乙氧基苯基和/或(ii)不是3-氯-4-氟苯基。
在其他实施方式中，且在某些方面本发明涉及，所述SIK3抑制剂是本文中公开的通用(或特定)式或结构中任一者(例如式I、IIWO)的化合物及其盐(或溶剂化物、盐、络合物、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物和组合)，前提是下述一者或多种(优选地全部)：当在通式IIWO中n是1，A是氮，B是硫，X3是氧，R1是氢，R2是氢，R4是氢，R3是式Y并且R5是R6时，R6不是2-氯-6-甲基苯基。
在其他实施方式中，且在某些方面本发明涉及，所述SIK3抑制剂是本文中公开的通用(或特定)式或结构中任一者(例如式I、IIWO)的化合物及其盐(或溶剂化物、盐、络合物、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物和组合)，前提是下述一者或多种(优选地全部)：当在通式IIWO中n是1，A是氮，B是硫，X3是氧，R1是氢，R2是氢，R4是氢，R5是R6并且R6是：
(i)在邻位处被-Cl取代的苯基时，则(x)另一个邻位是氢或不是甲基的Zx(如上所定义)(例如Zx是-Cl、-F、-Br、-OMe、-OEt或-CN)，并且优选地所述间位或对位中的至少一者被如上所定义的Zx取代；或(y)另一个邻位是甲基，并且所述邻位或对位中的至少两者被Zx(如上所定义)取代；或(z)R3不是Rdas；或
(ii)在邻位处被甲基取代的苯基时，则(x)另一个邻位是氢或不是-Cl的Zx(如上所定义)(例如Zx是-F、-Br、-Me、-OMe、-OEt或-CN)，并且优选地所述间位或对位中的至少一者被如上所定义的Zx取代；或(y)另一个邻位是-Cl，并且所述间位位或对位中的至少两者被Zx(如上所定义)取代；或(z)R3不是Rdas。
另一方面，本发明涉及一种在受试者(例如需要的受试者)中治疗或预防疾病、障碍或病症(例如增殖性障碍如癌症或肿瘤)的方法，所述方法包括向所述受试者至少一次施用有效量的(i)本文中公开的通用(或特定)式或结构中任一者(例如式I、IIWO或IIEP)的达沙替尼的变体，或(ii)表A3或表A4中所阐述的化合物(特别地化合物是B3、B2或A6)，或(i)或(ii)的盐(或溶剂化物、盐、络合物、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物和组合)，或者包括向所述受试者至少一次施用有效量的如上所述的药物组合物。在相关的其他方面，本发明还涉及(i)本文中公开的通用(或特定)式或结构中任一者(例如式I、IIWO或IIEP)的达沙替尼的变体，或(ii)表A3或表A4中所阐述的化合物，或(i)或(ii)的盐(或溶剂化物、盐、络合物、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物和组合)，其用于药物中，例如用于在受试者(例如需要的受试者)中治疗或预防疾病、障碍或病症(例如增殖性障碍如癌症或肿瘤)。在特定的这些实施方式中，所述化合物是B3、B2或A6。在其他特定的此类实施方式中，所述化合物具有式IIWO，n是1，A是氮，B是硫，X3是氧，R1是氢，R2是氢，R4是氢，R5是R6并且R6是被1、2或3个Zx取代的单环杂芳基，其中至少一个Zx在所述单环芳基或杂芳基的邻位处；其中每个Zx可以独立地是：(i)Zy，其中Zy是C1、C2或C3烷基、烯基或炔基；(ii)-OH或-OZy；(iii)-SH或-SZy；(iv)卤素；或(v)-SO2-Zy或-SO2-N-(Zy)(Zy)。
在本发明的所有方面的另一个特定实施方式中，所述SIK3抑制剂是博舒替尼。
在商品名BOSULIF下销售的博舒替尼(SKI-606)是一种酪氨酸激酶抑制剂，或用于癌症的治疗。博舒替尼(单水合物)的化学名称是4-[(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基-1-哌嗪基)丙氧基]-3-喹啉甲腈水合物(1∶1)。它的化学式是C26H29Cl2N5O3·H2O(单水合物)；它的分子量是548.46(单水合物)，等同于530.46(无水)。博舒替尼(单水合物)具有下述化学结构：
Figure BPA0000282270360000841
在本发明的所有方面的可选特定实施方式中，所述SIK3抑制剂不是博舒替尼。例如，在本发明的所有方面的一个特定的此类实施方式中，所述SIK3抑制剂是博舒替尼的变体，特别是US 6,002,008的权利要求1至20中任一项所要求的或在其权利要求21至29中任一项中所定义的化合物，其公开内容仅仅出于这种特定目的通过引用并入本文。
其他SIK选择性抑制剂的通式(和特定化学结构)已被别人描述，特别是用于不同的指征，例如用于治疗炎性和/或免疫障碍例如炎性肠病和移植物抗宿主疾病(例如WO2013/136070A1、WO 2014/093383A1、WO 2014/140313A1和WO 2016/023014A2)。
在本发明的所有方面的不同特定实施方式中，所述SIK3抑制剂可以是选自下述的一者：
·如WO 2013/136070A1的权利要求5至19和24中的任一项中所定义的化合物，其公开内容仅仅出于这种特定目的通过引用并入本文；
·如WO 2014/093383A1的权利要求1至28中任一项所要求的或权利要求49中所定义的化合物或其可药用盐，其公开内容仅仅出于这种特定目的通过引用并入本文；
·如WO 2014/140313A1的权利要求1至9中任一项所要求的化合物或其立体异构体、互变异构体、消旋体、代谢物、前体药物或前药、盐、水合物、N-氧化物形式或溶剂化物，其公开内容仅仅出于这种特定目的通过引用并入本文；和
·如WO 2016/023014A2的权利要求1至230中的任一项中所定义的化合物或其可药用盐，其公开内容仅仅出于这种特定目的通过引用并入本文。
因此，在其他实施方式中，所述SIK3抑制剂可以是WO 2014/093383A1的通式I、IA或IB内的化合物，或者是WO 2014/093383A1的权利要求1至28中任一项所要求的或权利要求49中所定义的化合物，或其可药用盐。在其他实施方式中，所述SIK3抑制剂可以是WO2016/023014A2的通式I、II或III-A内的化合物，或者是WO 2016/023014A2的权利要求1至230中的任一项中所定义的化合物，或其可药用盐。在特定的这些实施方式中，这种SIK3抑制剂可以是细胞渗透性小分子，其结合到并抑制SIK3、特别是磷酸化SIK3的功能或活性。
药物组合物：
为了在疗法中使用，所述SIK3抑制剂可以被配制成适合于促进向动物或人类施用的药物组合物。术语“组合物”意味着物质的混合物。术语“药物组合物”意味着包括用于制药用途的治疗活性物质(例如SIK3抑制剂)的物质的混合物。
因此，另一方面，本文中提供了一种药物组合物，其包含(本发明的或用于本发明的)SIK3抑制剂和可药用赋形剂、稳定剂或载体。在优选实施方式中，所述药物组合物包含表A3或表A4的SIK3抑制剂。
另一个特定方面，本发明还涉及一种药物组合物，其包含：(i)本文中公开的通用(或特定)式或结构中任一者(式I、IIWO或IIEP)的达沙替尼的变体，或(ii)表A3或表A4中所阐述的化合物(特别是化合物B3、B2或A6)，或(i)或(ii)的盐(或溶剂化物、盐、络合物、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物和组合)，以及可药用赋形剂、稳定剂或载体。
例如，本发明的药物组合物可以包含0.1％至100％(w/w)之间例如约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选地约1％至约20％之间、约10％至50％之间或约40％至90％之间的活性成分(例如SIK3抑制剂)。
当在本文中使用时，短语“可药用”赋形剂、稳定剂或载体打算包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、增溶剂、填充剂、稳定剂、粘合剂、吸收剂、基料、缓冲剂、润滑剂、受控释放介质、稀释剂、乳化剂、保湿剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。此类介质和试剂对药物活性物质的用途在本领域中是公知的。除非任何常规介质或试剂与所述活性化合物不相容，否则都考虑到了其在所述组合物中的使用。增补剂也可并入到所述组合物中。
本发明的(或用于本发明的)药物组合物通常被配制成与它的预定施用途径相容。施用途径的实例包括口服、肠胃外例如鞘内、动脉内、静脉内、真皮内、皮下、口服、透皮(局部)和透粘膜施用。
用于肠胃外、真皮内或皮下施用并包含本发明的(或用于本发明的)化合物(例如SIK3抑制剂)的溶液或悬液可以包括下述组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节渗涨度的试剂，例如氯化钠或右旋糖。pH可以使用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠来调节。所述肠胃外制剂可以被封闭在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂小瓶中。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(在水溶的情况下)或分散系和用于临时制备无菌注射溶液或分散系的无菌粉剂。对于静脉内施用来说，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、
Figure BPA0000282270360000861
EL(以前的Cremophor ELTM；BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述可注射组合物通常应该是无菌的并且具有足够的流动性使得易于注射。它通常应该在制造和储存条件下稳定，并被防腐以对抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合的混合物。适当的流动性可以通过诸如使用包衣例如卵磷脂、在分散系的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的防止可以通过各种不同的抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，在所述组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇和氯化钠将是优选的。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中包括延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生。
无菌可注射溶液可以通过将本发明的(或用于本发明的)化合物(例如SIK3抑制剂)以所需量并入到根据需要含有本文中描述的成分之一或其组合的适合溶剂中，然后过滤除菌来制备。通常，分散系通过将所述活性化合物并入到含有基础分散介质和本文中描述的所需其他成分的无菌介质中来制备。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从先前除菌过滤的溶液产生所述活性成分加上任何其他所需成分的粉剂。
同样包含本发明(或用于本发明)的化合物的口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以被封闭在明胶胶囊中或压缩成片剂。出于口服治疗性施用的目的，所述活性化合物可以与赋形剂合并并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物液可使用流体载体制备以用作漱口剂，其中所述流体载体中的化合物被口服使用和快速漱动，并被吐出或咽下。作为所述组合物的一部分可以包括药物相容的粘合剂和/或辅助材料。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任一下述成分或性质类似的化合物：粘合剂例如微晶体纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖；崩解剂例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或Stertes；助流剂例如胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或柑橘调味剂。
此外，本发明(或用于本发明)的化合物(例如SIK3抑制剂)可以被直肠施用。直肠组合物可以是任何直肠可接受的剂型包括但不限于霜剂、凝胶、乳液、灌肠剂、悬液、栓剂和片剂。一种优选的剂型是具有被设计用于引入到人体的直肠孔中的形状和尺寸的栓剂。栓剂通常在体温下软化、融化或溶解。栓剂赋形剂包括但不限于可可油(可可脂)、甘油化明胶、氢化植物油、各种不同分子量的聚乙二醇的混合物和聚乙二醇的脂肪酸酯。
对于通过吸入施用来说，本发明(或用于本发明)的化合物(例如SIK3抑制剂)通常以气溶胶喷剂的形式，从含有适合的推进剂比如气体如二氧化碳的加压容器或施药器或雾化器递送。
用于本发明的细胞例如免疫细胞(如CAR T细胞)可以被包含到适合于施用到血流中或直接施用到组织或器官中的药物剂型中。适合的格式由专业技术人员(例如医学从业人员)根据标准程序为每个患者、组织和器官确定。适合的可药用载体和它们的配制在本领域中是已知的(参见例如《Remington制药学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)第16版，Osol，A.主编，1980)。这些细胞当形成在药物组合物中时，优选被配制在pH为约6.5至约8.5的溶液中。也可以添加赋形剂以将所述溶液带到等渗，例如4.5％甘露糖醇或0.9％氯化钠，用本领域已知的缓冲溶液例如磷酸钠进行pH缓冲。其他可药用试剂也可用于将所述溶液带到等渗，包括但不限于右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇、多元醇(例如甘露糖醇和山梨糖醇)或其他无机或有机溶质。在一个实施方式中，介质配方定制为保藏所述细胞的同时维持细胞健康和一致性。例如，将包括抗凝剂(ACD-A)的水性溶液、等量的右旋糖(50％)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)等预混物预先混合并等分成一定体积，以通常匹配或近似从组织或器官提取所述细胞时的细胞基质或环境。
系统施用也可以通过透粘膜或透皮方式。对于透粘膜或透皮施用来说，在剂型中使用适合于待穿透的屏障的渗透剂。这些渗透剂在本领域中是公知的，并且例如对于透粘膜施用来说包括去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。透粘膜施用可以通过使用鼻喷剂或栓剂来实现。对于透皮施用来说，所述药物组合物可以被配制成本领域中公知的软膏、药膏、凝胶或霜剂。
在某些实施方式中，所述药物组合物被配制成用于所述本发明(或用于本发明)的化合物(例如SIK3抑制剂)的持续或受控释放。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这些剂型的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。可以商购的材料(包括具有针对病毒抗原的单克隆抗体的靶向被感染细胞的脂质体)也可用作可药用载体。它们可以按照本领域技术人员已知的方法来制备。
特别有利的是将口服、直肠或肠胃外组合物配制成剂量单元形式，以易于施用和剂量的均匀性。当在本文中使用时，剂量单元形式包括适合作为单元剂量用于待治疗受试者的物理上分立的单元；每个单元含有经计算与所需的药物载体相结合产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单元形式的规格由下述因素决定并直接取决于下述因素：活性化合物的独特特征，待实现的具体治疗效果，以及本领域中固有的混合这种活性化合物用于个体治疗的限制。
在某些实施方式中，所述包含SIK3抑制剂的药物组合物采取10至1000mg SIK3抑制剂之间的单位剂量形式。在某些实施方式中，所述包含SIK3抑制剂的药物组合物采取10至200mg SIK3抑制剂之间的单位剂量形式。在某些实施方式中，所述包含ABP的药物组合物采取200至400mg SIK3抑制剂之间的单位剂量形式。在某些实施方式中，所述包含SIK3抑制剂的药物组合物采取400至600mg SIK3抑制剂之间的单位剂量形式。在某些实施方式中，所述包含SIK3抑制剂的药物组合物采取600至800mg SIK3抑制剂之间的单位剂量形式。在某些实施方式中，所述包含SIK3抑制剂的药物组合物采取800至1000mg SIK3抑制剂之间的单位剂量形式。
对于包含SIK3抑制剂的药物组合物来说，示例性的单位剂量形式是片剂、胶囊(例如粉剂、颗粒剂、微片剂或微球粒剂)悬液或作为单次使用的预装载的注射器。在某些实施方式中，提供了药剂盒用于生产单剂施用单元。所述药剂盒可以含有具有干燥的活性成分的第一容器和具有水性剂型的第二容器两者。或者，所述药剂盒可以含有单或多区室预装载的注射器。
这些活性成分的毒性和治疗效能(例如有效性)可以在细胞培养物或实验动物中通过标准制药程序来确定，例如用于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)的制药程序。有毒和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，并且它可以被表示成LD50/ED50的比率。表现出大的治疗指数的活性药剂是优选的。尽管可以使用表现出有毒副作用的化合物，但应该小心地设计用于将这种化合物靶向到患病组织部位的递送系统，以便最小化对未感染细胞的潜在损伤并因此降低副作用。
从细胞培养物测定和动物研究获得的数据可用于配制诸如在人类中使用的活性成分(例如SIK3抑制剂或TNF、TNF的变体或TNFR1或TNFR2的激动剂)的剂量范围。这些活性成分的剂量优选在包括ED50的具有很小或没有毒性的循环浓度范围内。所述剂量可以在这个范围内随着所使用的剂型和使用的施用途径而变。对于在本发明的治疗方法中使用的任何活性成分来说，(治疗)有效剂量一开始可以从细胞培养物分析来估算。可以在动物模型中配制药剂，以获得包括在细胞培养物中所确定的IC50(即获得症状的半最大抑制的活性成分浓度)的循环血浆浓度范围。这种信息可用于更准确地确定诸如用于向人类施用的有用(例如有效)量或剂量。所述药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或施药器中。
在本发明的情形中，所述SIK3抑制剂或药物组合物的有效量，可以是研究人员、科学家、药理学家、药剂师、兽医、医生或其他临床医师正在寻求的引发细胞、组织、系统、身体、动物、个体、患者或人类的生物学、生理学、药理学、治疗或医学响应的量，所述响应是诸如障碍、疾病或病症譬如增殖性障碍如癌症或肿瘤的效应/症状的减轻，或与增殖性障碍有关的细胞譬如肿瘤细胞的杀死或抑制其生长。所述有效量可以通过标准程序包括下文描述的程序来确定。
根据本文提供的治疗的医学用途和方法的所有方面和实施方式，所述将SIK3抑制剂至少一次施用到需要的受试者的有效量通常在每次施用约0.01mg/kg至约100mg/kg之间，例如每次施用约1mg/kg至约10mg/kg之间。在某些实施方式中，所述将SIK3抑制剂至少一次施用到所述受试者的有效量在每次施用约0.01mg/kg至约0.1mg/kg之间、每次施用约0.1mg/kg至约1mg/kg之间、每次施用约1mg/kg至约5mg/kg之间、每次施用约5mg/kg至约10mg/kg之间、每次施用约10mg/kg至约50mg/kg之间或每次施用约50mg/kg至约100mg/kg之间。
对于疾病的预防或治疗来说，SIK3抑制剂(或包含它的药物组合物)的适合剂量将取决于待治疗的疾病类型、所述疾病的严重性和进程、施用所述SIK3抑制剂和/或药物组合物适用于预防还是治疗目的、以前的治疗、患者的临床史、年龄、尺寸/体重和对所述SIK3抑制剂和/或药物组合物的响应，以及主治医生的决定。所述SIK3抑制剂和/或药物组合物被适合地一次或在一系列治疗中施用到所述患者。如果这种SIK3抑制剂和/或药物组合物在一系列治疗中施用，则对于给定治疗过程来说施用的总次数可以由总共约2、3、4、5、6、7、8、9或10次或超过约10次治疗构成。例如，施用可以每天提供一次(或每天2、3或4次)共一周、一个月或甚至几个月。在某些实施方式中，所述治疗过程可以无限期继续。
所述施用的SIK3抑制剂和/或药物组合物的量取决于多种变量，例如待治疗的疾病或指征的类型和程度，患者的总体健康、年龄、尺寸/体重，所述SIK3抑制剂和/或药物组合物的体内效力，以及施用途径。初始剂量可以被增加到超过上限水平，以便快速获得所需的血液水平或组织水平。或者，初始剂量可以小于最佳值，并且可以在治疗过程中逐渐提高每日剂量。人类剂量可以例如在被设计从相对低的初始剂量例如约0.01mg/kg至约20mg/kg的活性成分来时运行的常规I期剂量递增研究中进行优化。施用频率可以随着多种因素而变，例如施用途径、剂量和正在治疗的疾病。示例性的施用频率是每天一次、每周一次和每两周一次。本发明(或用于本发明)的SIK3抑制剂的配制在本领域普通技术范围之内。在本发明的某些实施方式中，这种SIK3抑制剂被冷冻干燥并在施用时在缓冲盐水中重构。所述SIK3抑制剂和/或药物组合物可能进一步引起待治疗的疾病的复发减少或降低药物抗性的发生率或增加药物抗性发生之前的时间；并且在癌症的情况下，可以引起无进展生存期和/或总生存期的增加。
在本发明情景中治疗(或诊断)的增殖性障碍的特征：
本发明是基于下述出乎意料的发现，即SIK3与抗肿瘤免疫应答的抗性相关，并且本发明人在本文中描述了与增殖性障碍(例如癌症或肿瘤)的治疗相关的各个方面，特别是通过克服与所述增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答的抗性。
可以通过本发明主题内容治疗的障碍优选地特征在于与所述障碍(例如增殖性障碍)有关(譬如受其影响)的一个或多个细胞对宿主生物体的防御应答的抗性，例如与病理表型相关的抗性。具体实例是这些细胞(例如肿瘤或癌症的细胞)对患有所述障碍的受试者/患者具有的一种或多种免疫应答、特别是细胞介导的免疫应答的抗性。
术语“抗性”是指与增殖性障碍有关(譬如其或受其影响)的细胞例如肿瘤或癌细胞对患者自己的免疫应答(例如细胞介导的免疫应答、包括TNF)或对由免疫疗法/免疫治疗诸如过继性T-细胞转移或使用检查点阻断剂的治疗辅助的免疫应答的获得性或天然抗性。因此，在具有所述障碍(例如肿瘤或癌症)的受试者中抗性细胞(例如抗性肿瘤或癌细胞)更可能避开体液和/或细胞免疫防御机制并存活。在本发明的情形中，如果与未治疗的对照相比，与所述增殖性疾病有关的细胞(例如肿瘤或癌的细胞)变得对免疫应答(细胞介导的免疫应答或TNF)更加敏感或易感，换句话说，更可能被所述受试者的免疫应答识别和/或中和(例如通过细胞毒性过程例如凋亡)，则抗性增殖性疾病譬如肿瘤/癌症抗性的治疗将是有效的。
因此，在本发明的特定实施方式中，与所述增殖性障碍有关的细胞可能对细胞介导的免疫应答有抗性；和/或这些细胞可能具有或表现出抗性表型。
在本发明的优选实施方式中，术语“细胞抗性”等是指受试者的细胞(例如肿瘤或癌细胞)对细胞介导的免疫应答譬如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答或TNF暴露的抗性(例如所述肿瘤或肿瘤细胞对靶向肿瘤细胞的CTL或对暴露到TNF无应答或具有降低或受限的应答)。肿瘤细胞当与特异性针对该肿瘤细胞上表达的抗原的CTL接触时或当与TNF接触时，可能显示出降低或受限的应答。降低或受限的应答是降低到90％的细胞毒性T细胞或TNF应答，优选地降低到80％、70％、60％、50％或更优选地降低到40％、30％、20％或甚至更低。在这种情况下，100％是指其中所述CTL或TNF可以杀死样品中受试者的所有与增殖性障碍有关的细胞的状态。受试者的细胞(例如肿瘤细胞)是否对患者的(细胞介导的或TNF)免疫应答有抗性，可以通过将所述受试者的这些细胞(例如自体肿瘤细胞)的样品与(例如自体)T-细胞或(例如重组)TNF相接触，然后对所述(例如)肿瘤细胞的存活/增殖率进行定量，来体外试验。作为可选方案，(细胞介导的)免疫应答的降低通过比较获得所述抗性(例如通过疗法诱导)之前和之后同一癌症的癌症样品或通过与源自于已知对CTL或TNF没有抗性的不同癌症的癌症样品进行比较来确定。另一方面，本发明的治疗包括使与所述增殖性障碍有关的细胞对CTL和/或TNF敏感并因此降低这些细胞的抗性。细胞(例如肿瘤细胞)对CTL和/或TNF的抗性的降低优选为CTL或TNF介导的毒性的显著提高，优选为提高10％，更优选地20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更高，甚至更优选地提高2倍、3倍、4倍、5倍或更多倍。
在特定实施方式中，当患有所述增殖性障碍(例如癌症或肿瘤)的受试者以前已用(免疫)疗法治疗，并且例如尽管使用了这些以前的(免疫)疗法但这些增殖性障碍仍然进展时，所述与增殖性障碍有关的细胞的抗性表型被这些细胞表现出来。因此，在某些实施方式中，所述受试者可以被辨识(表征)为以前已用免疫疗法治疗，并且其肿瘤已经进展，特别是其肿瘤复发、重现或没有反应。例如，适用于本发明的各种不同治疗方法的受试者类别可以是在以前使用癌症免疫疗法的治疗后其肿瘤(或癌症)已经进展(例如已经复发或重现或对以前的治疗没有反应)的受试者。因此，在某些实施方式中，所述以前的免疫疗法包括施用免疫检查点抑制剂，例如以前的免疫疗法包括结合到免疫检查点分子的抗体、非抗体肽或小分子(在每种情况下如别处所描述)(的施用)。在某些实施方式中，这种以前的治疗可以是本文中别处描述的任何免疫疗法，包括过继性免疫细胞转移(例如TCR或CAR T细胞疗法)、抗肿瘤疫苗、结合到免疫检查点分子(如CTLA-4、PD-1或PD-L1)的抗体或非抗体肽或免疫(一致性)检查点分子的小分子配体(在每种情况下如别处所描述)。其他免疫疗法(例如可以是受试者的以前的治疗)可以包括：(x)施用激活STING蛋白的药物，其可以引起所述受试者的先天性免疫系统的刺激。激动STING的药物可以包括环状二核苷酸(CDN)例如化合物Aduro Biotech的ADU-S100这种2’3’-cGAMP的类似物(Fu等，2015；Sci Transl Med 7；283：ra52)；(y)施用A2aR拮抗剂例如SCH58261、SYN115、ZM241365或FSPTP(如Leone等，2015；Comp Struct Biotech J 13：265综述的)；和/或(z)靶向IDO1/TDO和它们的下游效应物，例如施用吲哚胺-2，3-双加氧酶，所述酶正在进行旨在逆转癌症诱导的免疫抑制的临床试验中(如Platten等，2015；Front Immun 5：673综述的)。
在其他(或另外的)实施方式中，所述受试者可能患有肿瘤或癌症，并且在以前的放疗后这种癌症可能已经进展(例如已经复发或重现，或对放疗没有响应)。因此，在其他实施方式中，所述受试者可以被辨识(表征)为具有已经进展、特别是复发、重现或对以前的放疗没有响应的肿瘤。
因此，本发明还包括其中与所述增殖性障碍有关的细胞已经历以前的免疫疗法的实施方式。作为此类实施方式的一个实例，所述受试者可能已接收(譬如由其治疗)以前的免疫疗法(例如本文中别处描述的免疫疗法)，比如通过施用免疫检查点分子(的配体)(譬如施用免疫检查点抑制剂)和/或任何其他的以前免疫疗法比如本文中别处所描述的。
在其他实施方式中，所述受试者可能被辨识(表征)为以前已用抗TNF药剂治疗自体免疫障碍(例如类风湿性关节炎)。具体来说，所述受试者可能正患有在这种使用抗TNF药剂的治疗期间(例如作为其结果)产生的恶性肿瘤。举例来讲，所述受试者可能患有在这种使用抗TNF药剂的治疗期间(例如作为其结果)产生的血液恶性肿瘤，譬如受试者患有医源性免疫缺陷相关的淋巴增殖性疾病。
在某些实施方式中，可以通过本发明的主题内容治疗的障碍是以SIK3的表达为特征的障碍，特别是以与健康受试者或正常细胞中相比，在给定细胞或组织(例如与所述受试者的增殖性疾病相关的细胞或组织)中SIK3(特别是磷酸化SIK3)的这种异常表达，譬如过(或低)表达或表现或活性为特征的障碍。
因此，本发明包括其中与所述增殖性障碍有关的细胞(例如所述肿瘤的细胞)以SIK3的表达和/或活性(特别是这些细胞表达SIK3的mRNA和/或蛋白质和/或对这种SIK3表达和/或活性阳性)为特征的实施方式。在特定的这些实施方式中，通过具有以SIK3的表达和/或活性为特征的与所述增殖性障碍有关的细胞，特别是这些细胞表达SIK3的mRNA和/或蛋白质和/或对这种SIK3表达和/或活性阳性，将所述受试者辨识(譬如表征)--例如适合于本发明的治疗方法。
在其他某些实施方式中，可以通过本发明的主题内容治疗的障碍可以是以一种或多种适用生物标志物为特征的障碍(例如进一步以其为特征的障碍)。
术语“适用生物标志物”意味着由与所述增殖性障碍有关的细胞表达的，本发明人已出乎意料地发现参与SIK3介导的针对免疫应答(例如细胞介导的免疫应答比如TNF)的细胞抗性的基因(以及SIK3)中的任一者(或多者)。这些基因包括(以及SIK3，特别是磷酸化SIK3)：
(a)TNFR1(或TNFR2)，例如TNFR1(或TNFR2)、特别是TNFR1的存在(或量)或表达和/或活性；
(b)LKB1，例如LKB1的存在(或量)或表达和/或活性，特别是LKB1或pLKB1的提高的量或活性；
(c)一种或多种II(例如IIa)类HDAC例如HDAC4，例如这些HDAC的存在(或量)或表达和/或活性，特别是这些HDAC或pHDAC的提高的量或活性，特别是在所述肿瘤的细胞的细胞质中；
(d)NF-κ-B的表达，特别是NF-κ-B的组成性表达；
(e)NF-κ-B，例如NF-κ-B的存在(或量)或表达和/或活性，特别是NF-κ-B或乙酰基化NF-κ-B的提高的量或活性，特别是在所述肿瘤的细胞的核中；和/或
(f)一种或多种抗凋亡基因，例如一种或多种抗凋亡基因、特别是一种或多种此类基因在NF-κ-B的转录控制下的存在(或量)或表达和/或活性。
在本发明的所有方面的某些实施方式中，所述增殖性障碍可以是选自下述的肿瘤：头颈癌，鳞状细胞癌，多发性骨髓瘤，孤立性浆细胞瘤，肾细胞癌，视网膜母细胞瘤，生殖细胞肿瘤，肝母细胞瘤，肝细胞癌，黑素瘤，肾横纹肌样瘤，尤文氏肉瘤，软骨肉瘤，任何血液恶性肿瘤(例如慢性成淋巴细胞性白血病、慢性髓单核细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓系白血病、急性成髓细胞白血病、慢性成髓细胞性白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓系白血病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病、肥大细胞白血病、肥大细胞赘生物、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、蕈样肉芽肿、西扎里综合征、皮肤T-细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴、慢性骨髓增殖性障碍、骨髓纤维化、髓样化生、系统性肥大细胞增多症)和中枢神经系统肿瘤(例如脑癌、成胶质细胞瘤、非成胶质细胞瘤脑癌、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤和脉络丛乳头状瘤)，骨髓增殖性障碍(例如真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化)，软组织肉瘤，甲状腺癌，子宫内膜癌，类癌和肝癌；特别是作为实体肿瘤的上述肿瘤中的一者；或者所述与增殖性障碍有关的细胞是这些肿瘤之一的细胞或源自于它们的细胞。
在特定的这些实施方式中，所述增殖性障碍可以是选自胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、食管癌、肉瘤和结肠直肠癌的肿瘤；或所述与增殖性障碍有关的细胞是这些肿瘤之一的细胞或源自于它们的细胞。
在本发明的治疗方法的其他实施方式中，当在受试者中时，所述SIK3抑制剂的施用、暴露或细胞与其的接触可能与下述一者或多者相关：
·所述受试者中TIL活性的提高；
·所述受试者中TIL存活率的提高；
·所述受试者中TIL数目的增加；
·所述受试者中TNF生产的增加；
·所述受试者中IL10生产的减少；
·抗肿瘤与肿瘤抑制性免疫细胞的比率(例如CD8 T细胞/Treg的比率或Teff/MDSC的比率)的提高；
·所述受试者中肿瘤中TIL的浸润的增加；
·所述受试者中INF-γ生产的增加；
·所述受试者中IL2生产的增加；
·所述受试者中TGF-β生产的减少；
·所述受试者中IL6生产的减少；和/或
·所述受试者中IDO(吲哚胺-吡咯2，3-双加氧酶)的生产的减少。
在本发明的治疗方法的其他实施方式中，当在受试者中时，所述SIK3抑制剂的施用、暴露或细胞与其的接触可能在所述受试者中增强细胞介导的免疫应答；特别地，其中所述增强与上文阐述的特点(a)至(f)中的一者或多者相关。
在本发明的治疗方法的其他实施方式中，当在受试者中时，所述SIK3抑制剂的施用、暴露或细胞与其的接触可能不与下述一者或多者相关：
·一种或多种抗炎性细胞因子、特别是IL-10的生产的增加；和/或
·一种或多种促炎性细胞因子、特别是TNF的生产的减少。
检测/诊断/监测方法：
SIK3可用于诊断目的，以检测、诊断或监测与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关的疾病和/或病症；具体来说，SIK3(特别是磷酸化SIK3)的异常和/或局部表达/活性可以如此使用。在本发明的检测和诊断方法的优选实施方式中，所述疾病、障碍或病症是癌症或肿瘤(例如实体肿瘤)，包括本文中别处描述的一者或多者；更优选为本文中别处描述的障碍中的一者或多者，例如胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、食管癌、肉瘤和结肠直肠癌。
因此，第八方面，设想了将一种或多种其他某些基因(如上所述的与SIK3介导的抗性相关的适用生物标志物)用于确定受试者，例如哺乳动物受试者(譬如人类)，是否具有与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3(例如与所述增殖性障碍有关的细胞的SIK3)的(异常)表达或活性相关的表型(例如相关的疾病、障碍或病症，特别是增殖性障碍例如癌症或肿瘤、包括实体肿瘤)或是否具有发生所述表型的风险的方法中，所述方法包括下述步骤：
·检测来自于所述受试者(例如所述癌或肿瘤细胞的适用生物标志物)的生物样品中的适用生物标志物(如上所述，例如SIK3和/或HDAC4)(的诸如蛋白质或mRNA)
其中所述样品(的譬如癌或肿瘤细胞)中所述适用生物标志物的检测指示了所述受试者中与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的(异常)表达或活性相关的表型(或发生所述表型的风险)。
在这一方面的某些实施方式中，所述适用生物标志物的检测可以包括确定所述样品中SIK3(和特别是磷酸化SIK3)的存在或量或其活性，特别是与所述受试者的肿瘤细胞相关的或所述肿瘤细胞的这种SIK3。在其他(可选的或另外的)实施方式中，所述适用生物标志物的检测可以包括确定如上所述的其他适用生物标志物中的一者或多者的存在或量。
在相关方面中，本发明涉及一种用于确定来自受试者的生物样品中SIK3(和特别是磷酸化SIK3)的存在或量的方法，所述方法包括下述步骤：
·将所述样品与能够结合到SIK3(和特别是磷酸化SIK3)的ABP相接触；并且
·确定所述样品中的SIK3(和特别是磷酸化SIK3)与所述ABP之间的结合。
在某些实施方式中，生物样品(优选地)包含所述受试者的细胞或组织或这些细胞或组织的提取物，特别地这些细胞(通常，或在特定受试者具有或疑似具有增殖性障碍的情况下)是与所述增殖性障碍相关的细胞(例如肿瘤细胞，如实体肿瘤的细胞)。所述肿瘤或其细胞可以是本文中别处描述的肿瘤之一或源自于它们。
在这一方面的特定实施方式中，所述方法还包括下述步骤：
·提供(例如获取)来自于所述受试者的生物样品，特别地这个步骤在所述检测步骤之前进行。
在特定实施方式中，这种检测和/或确定方法可以作为诊断方法来实践，诸如诊断哺乳动物受试者(例如人类受试者或患者)是否具有与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的(异常)表达或活性相关的疾病、障碍或病症，特别是增殖性障碍如癌症或肿瘤(的存在)(或具有发生这种疾病、障碍或病症的风险)，特别是(实体)肿瘤例如具有针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性的(实体)肿瘤的方法。
在这些检测、确定和/或诊断方法的某些实施方式中，所述针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性是针对T细胞介导的免疫应答的细胞抗性，特别是对TNF和/或TNFR1或TNFR2信号传导的杀死效应的细胞抗性。
因此，这些检测和/或诊断方法的特定实施方式还可以包括确定所述样品中TNF的存在或量的步骤，其中所述样品中TNF的存在(或量)指示了所述受试者中与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的(异常)表达或活性相关的表型(或发生所述表型的风险)。在特定的这些实施方式中，所述样品中TNF的量被定量确定。优选地，所述受试者被辨识为具有：(i)在来自于所述受试者的血浆样品中高于约2pg/mL或5pg/mL的TNF血浆浓度；和/或(ii)来自于所述受试者的组织样品中高于约0.5pg/mL或1pg/mL的TNF肿瘤内浓度，指示了所述受试者中与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的表达或活性相关的表型(或所述增殖性障碍或发生所述增殖性障碍的风险)(的存在)。
确定样品中TNF的存在或量的方法在本文中别处描述(特别是使用ELISA测定法例如Quantitkine TNF-α免疫测定法的TNF的定量检测)；TNF的量如果被所述样品中存在的TNF超过，指示了所述受试者中与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的(异常)表达或活性相关的表型。
在某些实施方式中，所述生物样品是从哺乳动物受试者如人类患者获得的生物样品。术语“生物样品”在其最宽泛的意义上使用，并且可以是指从所述受试者(例如人类患者)获得的身体样品。举例来讲，所述生物样品可以包括临床样品，即源自于受试者的样品。这些样品可以包括但不限于：外周体液，其可以含有或可以不含有细胞，诸如血液、尿液、血浆、粘液、胆汁胰液、上清液和血清；组织或细针活检样品；肿瘤活检样品或切片(或其细胞)，以及具有已知诊断、治疗和/或结果史的存档样品。生物样品也可以包括组织切片，例如出于组织学目的获取的冷冻切片。术语“生物样品”也可以涵盖通过加工所述样品衍生的任何材料。衍生的材料可以包括但不限于从所述生物样品分离的细胞(或它们的后代)、从所述样品提取的核酸和/或蛋白质。所述生物样品的加工可以涉及过滤、蒸馏、萃取、扩增、浓缩、固定、干扰性组分的失活、试剂的添加等中的一者或多者。
在某些实施方式中，这些检测、确定和/或诊断方法可以是计算机执行的方法，或者是由计算机辅助或支持的方法。在某些实施方式中，反映出样品中待确定的适用生物标志物(例如SIK3)(或其活性)的存在或量的信息通过至少一个处理器来获得，和/或反映出样品中这种标志物(或其活性)的存在或量的信息通过另一个处理器以用户可读格式提供。所述一个或多个处理器可以耦合到在计算机操作系统的控制下或与计算机操作系统相结合运行的随机存取存储器。所述处理器可以被包括在一个或多个服务器、集群或其他计算机或硬件资源中，或者可以使用基于云的资源来实施。所述操作系统可以是例如LinuxTM操作系统、UnixTM操作系统或其他开源或专有操作系统或平台的发行版。处理器可以与数据存储设备例如存储在硬盘驱动器或驱动器阵列上的数据库进行通信，以访问或存储程序指令或其他数据。处理器可以进一步经由网络接口进行通信，所述网络接口进而可以经由一个或多个网络例如因特网或其他公共或专用网络进行通信，以便可以从客户端或其他设备或服务接收到查询或其他请求。在某些实施方式中，所述检测样品中适用生物标志物(或其活性)的存在或量的计算机执行的方法，作为药剂盒被提供。
这种检测、确定和/或诊断方法可以作为体外(离体)方法来进行，并且可以例如使用本发明的药剂盒(或其组分)来实践。体外方法可以使用、涉及永生化细胞系(例如在动物或人类的身体外复制、培养或无限维持的细胞系)或在永生化细胞系上实践，或者它可以使用、涉及从动物或人类的身体直接或新鲜获得的细胞(例如原代细胞)或使用所述细胞在体外实践(例如作为所谓的“离体方法”来实践)。
在这些检测、确定和/或诊断方法的某些实施方式中，所述生物样品是来自于所述受试者的组织样品，例如来自于所述受试者的肿瘤或癌症的样品。如上所述，这种组织样品可以是所述肿瘤或癌症的活检样品例如针活检样品或肿瘤活检切片或其存档样品。这种组织样品可能包含例如来自于所述肿瘤或癌症的活的、死的或固定的细胞，并且这些细胞可能被怀疑表达(例如异常地或局部地)所述待确定的适用生物标志物。
在某些实施方式中，本发明的确定和/或诊断方法可以譬如在另一个步骤中包括将所述适用生物标志物(如SIK3、特别是磷酸化SIK3)(的诸如蛋白质或mRNA)的检测到的量(或活性)与标准或截止值进行比较，其中大于所述标准或截止值的检测量指示了所述受试者中与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与所述受试者中SIK3的(异常)表达或活性相关的表型(或发生所述表型的风险)。这种标准或截止值可以从对照测定的使用来确定，或者可以从获自研究或具有已知表型的多个样品的一个或多个值预先确定。例如，用于诊断测试的截止值可以通过在受控临床研究的背景中分析从患者获取的样品来确定，并且截止值的确定依赖于所述测试的所需(或得到)的灵敏度和/或特异性。
可用于适用生物标志物(例如SIK3、特别是磷酸化SIK3)(的譬如存在或不存在或量)的检测方法的实例包括免疫测定法，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射免疫测定法(RIA)，它们利用特异性结合到这些适用生物标志物的抗原结合蛋白(“ABP”)比如抗体或其抗原结合片段。
当在本文中使用时，“抗原结合蛋白”(“ABP”)包括特异性结合靶抗原展示的或存在于靶抗原上的一个或多个表位的蛋白质的含义。通常，抗原结合蛋白是抗体(或其片段)，然而本发明也设想了其他形式的抗原结合蛋白。例如，所述ABP可以是源自于小且鲁棒的非免疫球蛋白“支架”的另一种(非抗体)受体蛋白，例如通过使用诸如组合蛋白质设计的方法(Gebauer&Skerra，2009；Curr Opin Chem Biol，13：245)而装备有结合功能的受体蛋白。这种非抗体ABP的具体实例包括：基于蛋白A的Z结构域的亲合体分子(Nygren，2008；FEBS J275：2668)；基于γ-B结晶和/或遍在蛋白的Affilin(Ebersbach等，2007；J Mo Biol，372：172)；基于胱抑素的Affimer(Johnson等，2012；Anal Chem 84：6553)；基于来自于硫化叶菌(Sulfolobus acidcaldarius)的Sac7d的Affitin(Krehenbrink等，2008；J Mol Biol 383：1058)；基于三螺旋卷曲螺旋的Abody(Desmet等，2014；Nature Comms 5：5237)；基于脂钙蛋白的Anticalin(Skerra，2008；FEBS J 275：2677)；基于各种不同膜受体的A结构域的Avimer(Silverman等，2005；Nat Biotechnol 23：1556)；基于锚蛋白重复基序的DARPin(Strumpp等，2008；Drug Discov Today，13：695)；基于Fyn的SH3结构域的Fynomer(Grabulovski等，2007；J Biol Chem 282：3196)；基于各种不同蛋白酶抑制剂的Kunitz结构域的Kunitz结构域肽(Nixon等，Curr opin Drug Discov Devel，9：261)和基于纤连蛋白的第1-个III型结构域的Monobody(Koide&Koide，2007；Methods Mol Biol 352：95)。
当抗原结合蛋白结合到一个抗原(例如适用生物标志物，譬如SIK3、特别是磷酸化SIK3)比它结合到第二抗原更加偏好(例如更加强力或更加广泛)时，它是“特异的”。本文中用于ABP的情形中的术语“特异性结合”(或“特异地结合”等)意味着所述ABP结合到所述待确定的适用生物标志物比结合到其他蛋白质(或其他分子)更加偏好，例如结合到这种SIK3比结合到SIK2和/或SIK1和/或其他激酶中的一者或多者更加偏好。因此，优选地，所述ABP对所述一种抗原(例如SIK3)的结合亲和性与它对其他靶(例如SIK3的旁系同源物例如SIK2和/或SIK1)的亲和性相比为至少2倍、5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍、至少2000倍、至少5000倍、至少10000倍、至少105倍或甚至至少106倍，最优选为至少2倍。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白结合到磷酸化SIK3比结合到未磷酸化SIK3更加偏好。
当在本文中使用时，术语“抗体”可以在最宽泛的意义上被理解为能够结合到它的表位的任何免疫球蛋白(Ig)。抗体本身是一种ABP。全长“抗体”或“免疫球蛋白”通常是约150kDa的异四聚体糖蛋白，由两条一致的轻链和两条一致的重链组成。每条轻链通过一个共价二硫键连接到重链，而在不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫连键的数目可变。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链具有氨基端可变结构域(VH)，后面跟有三个羧基端恒定结构域(CH)。每条轻链具有可变N-端结构域(VL)和单个C-端恒定结构域(CL)。所述VH和VL区可以被进一步细分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，散布有被称为构架区(FR)的更加保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR，其从氨基端到羧基端以下述顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。所述重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。所述抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与细胞或因子、包括免疫系统的各种不同细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。其他形式的抗体包括重链抗体，其是仅由两条重链构成并且缺少抗体中通常存在的两条轻链的抗体。重链抗体包括骆驼科动物例如单峰骆驼、骆驼、美洲驼和羊驼的hcIgG(IgG样)抗体和软骨鱼类(例如鲨鱼)的IgNAR抗体。另外其他形式的抗体包括单域抗体(sdAb，被开发者Ablynx称为纳米抗体)，其是由单一单体可变抗体结构域构成的抗体片段。单域抗体通常从重链抗体产生，但是也可以源自于常规抗体。
抗体在某些实施方式中可以是多克隆抗体，并且在其他实施方式中可以是单克隆抗体。
当在本文中使用时，术语“多克隆抗体”是指一种抗体的混合物，其由于由源自于多个体细胞重组和克隆选择事件的浆细胞生产而在遗传上不同，并且其通常识别同一抗原的不同表位。
当在本文中使用时，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指从氨基酸序列上基本均质的抗体群体获得的抗体。单克隆抗体通常是高度特异的。此外，与通常包括针对抗原的不同决定簇(例如表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种mAb通常针对所述抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外mAb的优点在于它们可以通过细胞培养(杂交瘤、重组细胞等)来合成，不被其他免疫球蛋白污染。在本文中，mAb包括例如嵌合、人源化或人类抗体和抗体片段。
术语“嵌合抗体”是指其轻链和/或重链基因通常通过遗传工程从与不同物种例如小鼠和人类的相应序列一致或同源的免疫球蛋白可变和恒定区构建的抗体。或者，重链基因源自于特定抗体类别或亚类，而所述链的剩余部分源自于相同或不同物种的另一种抗体类别或亚类。例如，典型的治疗性嵌合抗体是由来自于小鼠抗体的可变或抗原结合结构域和来自于人类抗体的恒定或效应结构域组成的杂合蛋白，尽管也可以使用其他哺乳动物物种。
术语“人源化”抗体是指特定的嵌合抗体、免疫球蛋白链或其片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或抗体的其他抗原结合性子序列)，其含有源自于非人类免疫球蛋白的最小序列(但通常仍为其至少一部分)。大多数情况下，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中所述受体抗体的CDR残基被来自于非人类物种的免疫球蛋白(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的具有所需特异性、亲和性和能力的CDR残基代替。照此，所述抗体或其片段的构架序列的至少一部分可以是人类共有构架序列。在某些情况下，需要将人类免疫球蛋白的Fv构架残基用相应的非人类残基代替，以提高特异性或亲和性。此外，人源化抗体可以包含既不在受体抗体中也不在输入的CDR或构架序列中存在的残基。进行这些修饰是为了进一步改善和最大化抗体性能。通常，所述人源化抗体包含基本全部的至少一个、通常至少两个可变结构域，其中全部或基本全部的CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区，并且全部或基本全部的构架区是人类免疫球蛋白共有序列的构架区。所述人源化抗体最佳地还包含免疫球蛋白恒定区、通常为人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。
抗体片段包括“Fab片段”，其由每条重链和轻链的一个恒定结构域和一个可变结构域构成，由相邻的所述轻链的恒定区和所述重链的第一恒定结构域(CH1)联合在一起。它们可以通过蛋白酶消化譬如使用木瓜蛋白酶从常规抗体形成，但类似的Fab片段也可以通过遗传工程来生产。Fab片段包括“Fab-SH”，其是含有至少一个游离巯基的Fab片段。
Fab’片段与Fab片段的区别在于它们在重链的第一恒定结构域的羧基端处含有另外的残基，包括来自于抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’片段包括“Fab’-SH”，其是含有至少一个游离巯基的Fab’片段。
此外，抗体片段包括F(ab‘)2片段，其含有两条轻链和两条在CH1和CH2结构域之间含有一部分恒定区的重链，使得在所述两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链之间的二硫键联合在一起的两个Fab’片段组成。F(ab’)2片段可以通过使用在铰链区下方切割的酶例如胃蛋白酶的蛋白水解切割从常规抗体制备，或通过遗传工程制备。
“Fv”区包含来自于重链和轻链两者的可变区，但缺少恒定区。“单链抗体”或“scFv”是其中重链和轻链可变区已通过柔性连接物相连以形成单一多肽链的Fv分子，所述多肽链形成抗原结合区。
“Fc区”包含两个含有抗体的CH2和CH3结构域的重链片段。所述两个重链片段通过两个或更多个二硫键并通过CH3结构域的疏水相互作用联合在一起。
或者，所述适用生物标志物(例如SIK3、特别是磷酸化SIK3)的存在可以通过检测编码这些适用生物标志物的mRNA或这些mRNA的片段的存在来检测。检测这些mRNA(或片段)的存在的方法可以包括PCR(例如定量RT-PCR)、杂交(例如杂交到Illumina芯片)、核酸测序等。这些方法可以涉及或包含使用结合(例如特异性地)到这些mRNA的一种或多种如上所述的核酸诸如PCR引物或PCR探针或杂交探针的步骤。
对于这些检测、确定或诊断应用来说，通常将所述ABP或核酸用可检测的标记基团标记。通常，标记基团根据用于检测它们的测定法分成各种不同类别：a)同位素标记物，其可以是放射活性或重同位素；b)磁性标记物(例如磁性粒子)；c)氧化还原活性组成部分；d)光学染料；酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素化的基团；和f)被第二报告物识别的预定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、用于第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。适合的标记基团包括但不限于下述标记物：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111ln、125l、131l)，荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系元素荧光体)，酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光基团，生物素基团，或被第二报告物识别的预定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、用于第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。在某些实施方式中，所述标记基团通过各种不同长度的间隔物臂偶联到所述ABP或核酸，以降低潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种不同方法在本领域中是已知的，并且可以使用。例如，可以将所述ABP或核酸用第二报告物(譬如亮氨酸拉链对序列、用于第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)标记。
因此，在检测/诊断方法(或用于它的药剂盒)的特定实施方式中，将用于检测适用生物标志物(如SIK3)的蛋白质或mRNA的工具(如ABP或核酸)标记，譬如偶联到可检测标记物。术语“标记物”或“标记基团”是指任何可检测的标记物，包括本文中描述的那些。
在某些实施方式中，本发明的检测/诊断方法涉及免疫组织化学(IHC)测定法或免疫细胞化学(IC)测定法。术语“ICH”和“ICC”是本领域中认可的，并包括用于依赖于特异性表位-抗体相互作用来定位抗原表达的技术的含义。IHC通常是指使用组织切片，而ICC通常描述使用培养的细胞或细胞悬液。在两种方法中，阳性染色通常使用分子标记物(例如可以是发荧光或发色的标记物)可视化。简单来说，通常将样品固定以保留细胞完整性，然后与阻断试剂进行温育以防止抗体的非特异性结合。随后通常将样品与第一(并且有时第二)抗体温育，并将信号可视化用于显微术分析。
因此，本发明的检测/诊断方法的这些实施方式可以包括制备受试者的IHC或ICC制备物组织或细胞(例如存在于从受试者获得的生物样品中的组织或细胞)的步骤，并且优选地在其中检测到ABP与由所述IHC或ICC制备物的组织或细胞表达的适用生物标志物(例如SIK3、特别是磷酸化SIK3)的结合，指示了：(i)所述受试者中与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关的表型(或发生表型的风险)；和/或(ii)所述受试者患有与SIK3的(异常)表达或活性相关的疾病、病症或障碍或具有发生它们的风险。
在这些IHC/ICC方法中，使用的ABP结合到(优选地特异性结合到)所述适用生物标志物(例如SIK3、特别是磷酸化SIK3)，并且在(可检测地)结合到由验证IHC或ICC制备物的组织或细胞表达的适用生物标志物(例如这种SIK3)之外不结合到(例如不可检测地结合到)其他哺乳动物组织或细胞的验证IHC或ICC制备物。
在某些此类实施方式中，所述验证和/或受试者IHC或ICC制备物是选自下述的制备物：冷冻切片，石蜡切片和树脂切片，在每种情况下为组织和/或细胞的切片；和/或其中包含在所述IHC或ICC制备物中任一者(或两者)中的组织和/或细胞被固定。所述组织和/或细胞或这些IHC或ICC制备物可以通过醇、醛、汞试剂、氧化剂或苦味酸盐来固定。
在一个优选的此类实施方式中，所述验证和/或受试者IHC或ICC制备物是所述组织和/或细胞的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的切片；和/或其中所述验证和/或受试者IHC或ICC制备物经历过抗原修复(AR)。这种AR可以包括蛋白酶诱导的表位修复(PIER)或热诱导的表位修复(HIER)。
在这些方法中使用的ABP优选被验证。例如，验证所述ABP(可检测地)结合到被所述验证IHC或ICC制备物的细胞和/或组织表达的适用生物标志物(例如SIK3、特别是磷酸化SIK3)，但是不(可检测地)结合到不表达所述适用生物标志物(例如SIK3)的对照细胞和/或组织的对照IHC或ICC制备物。优选地，所述对照细胞是对于所述用生物标志物(例如SIK3)来说基因沉默或基因敲除的细胞和/或组织，更优选地，其中所述基因沉默或基因敲除的细胞和/或组织对于这种适用生物标志物来说进行了siRNA或shRNA基因沉默或基因敲除。这种对照细胞可以包含来自于选自PANC1的细胞系的细胞，并且所述不表达这种适用生物标志物(例如SIK3)的对照细胞和/或组织包含所述细胞系的已用选自表A1和A2的SIK3 siRNA或shRNA转染的细胞；和/或所述验证IHC或ICC制备物包含来自于用shSIK3慢病毒载体转导(例如在实施例8中所述)的M579细胞的细胞。
在这些IHC/ICC方法中，所述ABP以低于约50ug/mL、25ug/mL、20ug/mL、15ug/mL、10ug/mL、7.5ug/mL、5ug/mL、2.5ug/mL、1ug/mL、0.5ug/mL、0.2ug/ml或0.1ug/ml、特别是低于约5ug/mL、更特别是低于2.5ug/mL的工作浓度用于所述验证和/或受试者IHC或ICC制备物；优选地，在比所述工作浓度高约2倍、5倍、10倍、20倍或50倍的浓度下，除了(可检测地)结合到由所述IHC制备物的哺乳动物细胞或组织表达的所述适用生物标志物(例如SIK3、特别是磷酸化SIK3)之外，所述ABP不(可检测地)结合到哺乳动物细胞或组织的所述验证免疫组织化学(IHC)制备物，特别是在比所述工作浓度高约2倍的浓度下，更特别是在比所述工作浓度高约5倍的浓度下。
在本发明的检测/诊断方法中，使用的ABP可以是多克隆抗体，并且优选地可以是兔抗体。
第九方面，本发明涉及一种用于确定(或诊断)(例如通过体外和/或离体方法)受试者(例如人类受试者或患者)是否具有与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的(异常)表达或活性相关的疾病、障碍或病症，特别是增殖性障碍(譬如癌症或肿瘤)，例如具有针对细胞介导的免疫应答(譬如T细胞介导的免疫应答)的细胞抗性的增殖性障碍(或是否具有发生它们的风险)的方法，其中所述确定/诊断涉及使用测量生物响应的功能测定法、例如在本文别处描述的测定法做出。举例来讲，一种这样的方法可以包括下述步骤：
●将所述受试者的与所述疾病、障碍或病症有关的细胞(譬如怀疑与其有关的细胞)(如肿瘤细胞)与SIK3抑制剂在存在细胞介导的免疫应答的情况下相接触，所述细胞介导的免疫应答例如：(i)(有效量的)选自下述的免疫细胞：淋巴细胞，T-细胞，CTL和TIL，或(ii)(有效量的)促炎性细胞因子如TNF；并且
●确定针对所述受试者的这些细胞的细胞介导的免疫应答；
其中针对所述受试者的这些细胞的细胞介导的免疫应答(在所述SIK3抑制剂存在下)的增强，指示了所述受试者具有这些疾病、障碍或病症(或具有发生它们的风险)。这些步骤中的一者或多者可以是体外步骤。
在相关方面，本发明涉及一种用于确定(例如通过体外和/或离体方法)与增殖性疾病(例如癌症或肿瘤)有关的细胞对细胞介导的免疫应答的抗性的方法，所述方法包括下述步骤：
●将这些细胞与SIK3抑制剂在存在细胞介导的免疫应答的情况下相接触，所述细胞介导的免疫应答，例如：(i)选自下述的免疫细胞：淋巴细胞，T-细胞，CTL和TIL，或(ii)(有效量的)促炎性细胞因子例如TNF；并且
●确定针对这些细胞的细胞介导的免疫应答；
其中针对这些细胞的细胞介导的免疫应答(在所述SIK3抑制剂存在下)的增强，指示了这些细胞对细胞介导的免疫应答具有抗性。这些步骤中的一者或多者可以是体外步骤。
在某些实施方式中，所述与增殖性障碍有关的细胞被提供为从具有与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的(异常)表达或活性相关的疾病、障碍或病症(或具有发生它们的风险)的受试者(例如人类受试者或患者)获得的生物样品。
所述细胞介导的免疫应答的增强可以通过诸如所述受试者的细胞的细胞毒性的提高、半胱天冬酶8和/或半胱天冬酶9切割的增加、NF-κ-B的表达和/或活性的降低(特别是NF-κ-B或乙酰化NF-κ-B的量或活性的降低，尤其是在肿瘤的细胞核中)和/或一种或多种抗凋亡基因(特别是一种或多种此类基因在NF-κ-B的转录控制下)的表达和/或活性的降低来确定。确定这些生物响应的方法在本文中别处描述，例如包括上文描述的铬释放细胞毒性测定法。
在某些实施方式中，所述受试者的与细胞介导的免疫应答相接触的细胞被提供为来自于所述受试者的生物样品(例如通过获得所述生物样品来提供)，其中所述样品包含所述受试者的细胞(例如所述受试者的肿瘤或癌的细胞)。这种方法的特定实施方式还包括提供来自于所述受试者的生物样品(例如通过获得所述生物样品)的步骤，特别地其中这个步骤在所述接触步骤之前进行。
在相关方面，所述检测、确定和/或诊断方法可以用作一种使用本发明的治疗方法正在治疗或将被治疗的受试者的治疗成功(或成功或风险或缓解的可能性)的监测(或预后)方法。例如：(1)如果来自于所述受试者的样品被确定为含有一种或多种上述适用生物标志物(例如SIK3、特别是磷酸化SIK3)的存在(或指示性量)和/或TNF的存在(或指示性量)，则这指示使用本发明的方法的(将来的)治疗(例如SIK3抑制剂的施用)对于此受试者来说可能是成功的或更可能成功；和/或(2)如果在这种治疗(例如SIK3抑制剂的施用)期间，在来自于所述受试者的样品中确定了一种或多种上述适用生物标志物(例如这种SIK3)(或半胱天冬酶8和/或半胱天冬酶9)或其表达(或活性)的减少(例如低于指示性量)或不存在，则这指示使用本发明的方法的这种治疗(例如SIK3抑制剂的施用)对于此受试者来说是或已经成功，或者如果继续的话更可能成功。
本领域普通技术人员现在将应该容易地认识到可以如何实践或修改本发明的检测、确定和/或诊断方法(及其任何实施方式)，以便将它们用作本发明的监测或预后方法的一部分。
另一方面，本发明涉及一种在受试者例如人类患者中诊断和治疗以SIK3的存在或量为特征和/或以SIK3的(异常)表达或活性为特征的疾病、障碍或病症(例如增殖性障碍如肿瘤或癌症)的方法，所述方法包括：
●进行本发明的检测、确定和/或诊断方法(例如上文描述的)，由此诊断所述受试者是否患有这种疾病、障碍或病症；和
●向所述如此诊断的受试者施用有效量的SIK3抑制剂(和/或包含这种抑制剂的药物组合物)，特别是对所述受试者实践本发明的治疗方法。
这种诊断和治疗方法的施用(或治疗)步骤的其他实施方式在上文中更详细地描述；这种方法的检测\确定或诊断方法步骤的方法的特定实施方式也是如此。特定的此类实施方式包括其中施用到所述受试者的SIK3抑制剂的量与(所述受试者中)TNF的血浆或肿瘤内浓度相关的实施方式，其中在TNF的血浆或肿瘤内浓度更高的情况下，施用到这个受试者的SIK3抑制剂的量(或剂量)更大。
另一方面，本发明涉及一种结合到(优选地特异性结合到)所述适用生物标志物(例如SIK3、特别是磷酸化SIK3，或HDAC4或磷酸化HDAC4)的蛋白的ABP，或一种可以结合到(例如特异性结合到)这种适用生物标志物的mRNA的核酸，它们用于(例如体外和/或离体)诊断，例如(哺乳动物)受试者如人类患者中疾病、障碍或病症的检测(或发生它们的风险的确定)中，特别是与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的(异常)表达或活性相关的疾病、障碍或病症(例如增殖性障碍如肿瘤或癌症)。
因此，这个方面的一个实施方式提供了一种能够结合到或结合到(例如特异性结合到)SIK3(特别是磷酸化SIK3，或HDAC4或磷酸化HDAC4)的ABP在(例如体外和/或离体)诊断中的用途。特别是提供了一种结合到(例如特异性结合到)SIK3(特别是磷酸化SIK3)的ABP(例如单克隆抗体)，其用于在受试者中诊断与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的(异常)表达或活性相关的疾病、障碍或病症(例如癌症)。
所述用于这种检测的ABP或核酸可以是本文中别处描述的任何ABP或核酸。
检测/诊断/监测药剂盒：
第十方面，本文中提供了一种药剂盒，即用于执行本发明的诊断方法或确定方法或检测方法(或监测或预后方法)，例如，用于确定样品(譬如生物样品)中比如样品中的细胞上的适用生物标志物(例如SIK3、特别是磷酸化SIK3，或HDAC4或磷酸化HDAC4)的存在、不存在、量、功能、活性和/或表达的药剂盒。所述药剂盒包含如上所述的ABP和/或核酸以及任选的一种或多种其他组分。
在所述药剂盒的某些实施方式中，其他组分可以包括说明书，其描述了如何使用所述ABP或核酸或药剂盒来检测所述样品中所述适用生物标志物的存在，例如通过检测所述ABP与这些适用生物标志物的蛋白质之间的结合，和/或检测所述核酸与这些适用生物标志物的mRNA之间的结合。这些说明书可以由包含这些说明书的印刷的手册或计算机可读存储器构成，或者可以包含指示以便鉴定、获得和/或使用将与所述药剂盒一起使用的一种或多种其他组分。
在所述药剂盒的其他某些实施方式中，所述其他组分可以包含对所述药剂盒的使用或本发明的检测方法的实践有用的一种或多种其他物品、组分、试剂或其他工具，包括本文中公开的对这些实践有用的任何此类物品、组分、试剂或工具。例如，所述药剂盒还可以包含反应和/或结合缓冲液、标记物、酶底物、第二抗体和对照样品、材料或组成部分等。
在特定的此类实施方式中，所述其他组分可以包括检测所述适用生物标志物(例如SIK3、特别是磷酸化SIK3)的蛋白质的存在，例如检测所述ABP与这种蛋白质之间的结合的工具。
有各种用于指示ABP结合的工具可供使用。例如，可以将荧光团、其他分子探针或酶连接到所述ABP，并且所述ABP的存在可以以各种不同方式观察。用于疾病、障碍或病症的筛查方法可以涉及使用所述药剂盒或仅仅使用所述公开的ABP之一，以及确定ABP结合到样品中所述适用生物标志物(例如SIK3、特别是磷酸化SIK3)的蛋白质的程度。正如本领域技术人员应该认识到的，所述适用生物标志物(如这种SIK3)的蛋白质的高或升高的水平，将导致更大量的ABP结合到所述样品中的它们。因此，ABP结合的程度可用于确定样品中所述适用生物标志物(如这种SIK3)的量。这种适用生物标志物的量高于预定量(例如没有与所述适用生物标志物(如这种SIK3)相关的障碍的人应有的量或范围)的受试者或样品，可以被表征为具有由SIK3、特别是肿瘤细胞中的SIK介导的疾病、障碍或病症(例如由SIK3的(异常)表达、功能、活性和/或稳定性介导的疾病、障碍或病症)。
在某些实施方式中，所述药剂盒还包含下述一者或多者：所述适用生物标志物(例如SIK3、特别是磷酸化SIK3)的蛋白质或mRNA的标准品，用于ABP或核酸结合的阳性和/或阴性对照，用于收集样品的容器，用于检测所述ABP或核酸与所述样品中适用生物标志物的蛋白质或mRNA(在适用时)的结合的材料，以及用于执行所述检测的试剂。
另一方面，本文中提供了如上所述的药剂盒的用途，其用于执行本发明的(例如体外)诊断或检测方法；并且在相关的其他方面，本发明涉及如上所述的药剂盒，其用于本发明的(例如体外和/或离体)确定/诊断方法中。
另一方面，本文中提供了一种药剂盒，其用于确定受试者是否患有与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关并与SIK3的表达或活性相关的疾病、障碍或病症或具有发生它们的风险的诊断方法中；
其中：
●所述诊断方法包括从所述受试者手术获得(例如组织)样品的步骤；并且
●所述药剂盒包含(a)(x)能够特异性结合到适用生物标志物(如上所述，如SIK3或HDAC4)的核酸，或(y)特异性结合到适用生物标志物(如上所述，如SIK3或HDAC的ABP中的任一者；和(b)任选的(i)描述如何使用所述ABP或核酸或药剂盒来检测所述(组织)样品中的SIK3活性的说明书，和/或(ii)对所述药剂盒的使用或所述(组织)样品中SIK3活性的检测有用的一种或多种其他物品、组分、试剂或其他工具。
在这种诊断方法中，“手术”是指可能包含在动物或人类身体上实行的重大干预的步骤，例如获取活检样品，比如实体肿瘤的组织样品。然而，其他不太重大的步骤可以包括血液的获取或采样，例如通过静脉穿刺或皮肤点刺。在某些实施方式中，它不包括通过静脉穿刺或皮肤点刺采样血液或在人类或动物身体上实行的其他不(或不太)重大的诊断方法。
如上所述，本发明的药剂盒可以伴有说明书，包括使用它们来确定例如样品中的肿瘤细胞中所述适用生物标志物(例如SIK3、特别是磷酸化SIK3，或HDAC4或磷酸化HDAC4)的量、活性和/或表达的说明书。
本发明的各个不同的确定(筛查)/诊断方面可用于鉴定(例如辨识)所述疾病、障碍或病症是和/或被确定为是适合于用SIK3抑制剂治疗的疾病、障碍或病症(或具有这种疾病、障碍或病症的受试者被辨识为是适合于用SIK3抑制剂治疗的受试者)。
在本发明的这些诊断方面的特定实施方式中，所述受试者(例如从其获得样品的受试者)以前已用(例如被辨识(表征)为已用)免疫疗法(例如本文中别处所描述的免疫疗法)治疗，并且其肿瘤已经进展，特别是其肿瘤复发、重现或没有反应。在本发明的这些诊断方面的其他特定实施方式中，所述受试者(例如从其获得样品的受试者)以前已用(例如被辨识(表征)为已用)以前的放疗治疗，并且其肿瘤已经进展，特别是其肿瘤复发、重现或没有反应。
在本发明的这些诊断方面的其他特定实施方式中，所述受试者(例如从其获得样品的受试者)以前已用或正在用抗TNF药剂(例如通过所述药剂的施用来辨识(表征))治疗自体免疫障碍(譬如类风湿性关节炎)施用。特别地，所述受试者可能患有在使用抗TNF药剂的这种治疗期间(譬如作为其结果)引起的恶性肿瘤，或可能具有患有这种恶性肿瘤的高风险。例如，所述受试者可能患有在使用抗TNF药剂治疗期间(譬如作为其结果)引起的血液恶性肿瘤，或可能具有患有这种血液恶性肿瘤的高风险，譬如受试者患有医源性免疫缺陷相关的淋巴增殖性疾病或具有患有所述疾病的高风险。
在本发明的这些诊断方面的其他特定实施方式中，所述受试者(例如从其获得样品的受试者)正考虑用抗TNF药剂(例如通过正考虑施用所述药剂来辨识(表征))治疗自体免疫障碍(例如类风湿性关节炎)。施用这种实施方式可用于确定患有自体免疫障碍(例如类风湿性关节炎)并且在使用抗TNF药剂治疗它们的自体免疫疾病期间可能具有发生恶性肿瘤(例如血液恶性肿瘤，比如医源性免疫缺陷相关的淋巴增殖性疾病)的高风险的受试者。
本发明的筛查方法：
在本发明的第十一方面，提供了一种用于鉴定(和/或表征)化合物，例如适合于治疗以针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性为特征和/或以SIK3的(异常)表达或活性为特征的疾病、障碍或病症(例如增殖性障碍)的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
●使第一细胞与所述候选化合物发生接触，其中所述第一细胞表达SIK3(例如SIK3的蛋白质或mRNA)；并且
●确定所述第一细胞中所述SIK3(特别是磷酸化SIK3)(的例如蛋白质或mRNA)的表达、活性(例如激酶活性)、功能和/或稳定性，
其中与不接触所述候选化合物的所述第一细胞相比，在接触所述候选化合物的所述第一细胞中所述SIK3(的例如蛋白质或mRNA)的表达、活性(例如激酶活性)、功能和/或稳定性的降低，指示了所述候选化合物是适合于治疗所述疾病、障碍或病症的化合物。
在本发明的相关方面，提供了一种用于鉴定(和/或表征)化合物，例如适合于治疗以针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性为特征和/或以SIK3的(异常)表达或活性为特征的疾病、障碍或病症(例如增殖性障碍)的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
●使第一细胞与所述候选化合物和细胞介导的免疫应答(的组分)发生接触，其中所述第一细胞表达SIK3(例如SIK3的蛋白质或mRNA)；并且
●确定所述细胞介导的免疫应答对所述第一细胞的细胞毒性
其中与所述细胞介导的免疫应答对不接触所述候选化合物的所述第一细胞的细胞毒性相比，所述细胞介导的免疫应答对接触所述候选化合物的所述第一细胞的细胞毒性的提高，指示了所述候选化合物是适合于治疗所述疾病、障碍或病症的化合物。
在本发明的这些筛查方面的某些实施方式中，所述第一细胞中所述SIK3(的例如蛋白质或mRNA)的活性可以直接确定(例如通过SIK3蛋白的抗体检测或通过SIK3 mRNA的PCR)，或者可以通过确定所述第一细胞中、特别是所述第一细胞的细胞质中磷酸化HDAC4的存在或量来确定。例如，这种第一细胞的细胞质中磷酸化HDAC4的减少将指示这种细胞中SIK3活性的降低。
在这些方面的某些实施方式中，所述方法还包括提供(例如获得)所述第一细胞和/或候选化合物和/或细胞介导的免疫应答(的组分)的步骤，特别地其中每个这些步骤在所述接触步骤之前进行。
通常，这些方面的方法将是体外(或离体)方法；也就是说，所述方法通常是不在人类或动物身体上实行的方法。例如，这些方法的一个或多个步骤可以是体外步骤。此外，通常实行这些方法是为了鉴定适合的候选化合物以备进一步药物开发的目的。也就是说，在典型(但不是所有)的实施方式中，这些方法的实行(特别是如果是离体方法)不是为了确定(例如诊断)化合物是否是用于特定人类或动物的治疗的候选物。
SIK3(特别是磷酸化SIK3)的表达、活性、功能和/或稳定性的降低(或提高)或细胞毒性的提高(或降低)优选地参考对照方法来鉴定。在一个实例中，所述对照方法可以是在不存在任何候选化合物或使用对这种表达、功能、活性和/或稳定性具有已知效应的化合物(例如阳性或阴性对照)实践的方法，和/或在不存在细胞介导的免疫应答(的一种或多种组分)的情况下实践的方法。
在所述筛查方法的某些实施方式中，所述细胞介导的免疫应答(的组分)是第二细胞，其是能够免疫识别所述第一细胞的细胞毒性免疫细胞，例如细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)。因此，这种实施方式的接触步骤包括使第一细胞与所述候选化合物和第二细胞发生接触，其中所述第一细胞表达SIK3(例如SIK3的蛋白质或mRNA)，并且所述第二细胞是能够免疫识别所述第一细胞的细胞毒性免疫细胞，例如细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)。
在所述筛查方法的相关但可选实施方式中，所述细胞介导的免疫应答(的组分)是以前含有免疫刺激的免疫细胞例如细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)的无细胞培养基。这些免疫细胞可以通过所述第一细胞的样品和/或通过多克隆刺激物例如CD3-CD28珠子刺激来刺激。因此，这些实施方式的接触步骤包括使第一细胞与所述候选化合物和无细胞培养基发生接触，其中所述第一细胞表达SIK3(例如SIK3的蛋白质或mRNA)，并且所述无细胞培养基以前含有免疫刺激的免疫细胞譬如细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，如能够免疫识别所述第一细胞的免疫细胞。
在所述筛查方法的其他相关但可选实施方式中，所述细胞介导的免疫应答(的组分)是促炎性细胞因子，例如TNF。因此，这种实施方式的接触步骤包括使第一细胞与所述候选化合物和促炎性细胞因子相接触，其中所述第一细胞表达SIK3(例如SIK3的蛋白质或mRNA)。
在特定的这些实施方式中，所述促炎性细胞因子是TNF(例如rHuTNF)，其任选地以约0.01ng/mL至约1000ng/mL之间的浓度与所述第一细胞发生接触。例如，可以使所述TNF以约0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10、50、100或500ng/mL、特别是约5至50ng/mL或50至200ng/mLTNF之间的浓度与所述第一细胞发生接触。
所述第一细胞优选为与增殖性障碍(例如肿瘤)有关的细胞，例如源自于肿瘤的细胞。所述肿瘤或其细胞可以是本文中别处描述的肿瘤之一或源自于它的细胞。
在所述筛查方法的某些实施方式中，所述第一细胞表达SIK的突变体形式，譬如SIK3的突变体形式和/或SIK2的突变体形式和/或SIK1的突变体形式。例如，由Darling等，2016(Biochem DOI：10.1042/BCJ20160646)所描述的敲入SIK突变体，可以被所述第一细胞表达。在所述筛查方法的某些实施方式中，所述第一细胞表达shRNA或包含siRNA，它们抑制SIK(例如SIK3、SIK2和/或SIK1)的表达或活性。这些shRNA或siRNA序列的实例在本文中别处描述。重组或修饰的第一细胞的使用可以帮助所述候选化合物的表征，特别是在它的与SIK2和/或SIK1相比对SIK3的特异性(或选择性)方面。
在所述筛查方法中使用的候选化合物可以选自多肽、肽、糖蛋白、肽模拟物、抗体或抗体样分子(例如胞内抗体)；核酸例如DNA或RNA，诸如反义DNA或RNA、核酶、RNA或DNA适体、siRNA、shRNA等，包括其变体或衍生物例如肽核酸(PNA)；用于靶向基因编辑的遗传构建物，例如CRISPR/Cas9构建物和/或指导RNA/DNA(gRNA/gDNA)和/或tracrRNA；糖类，例如多糖或寡糖等，包括其变体或衍生物；脂类例如脂肪酸等，包括其变体或衍生物；或小有机分子，包括但不限于小分子配体或细胞渗透性小分子。
在特定实施方式中，所述候选化合物是小分子，例如在本文中别处所描述的。
在其他特定实施方式中，所述候选化合物是SIK3抑制剂，例如本文中别处所描述的。例如，在某些此类实施方式中，所述候选化合物相比于抑制IK2和/或SIK1，更加偏好抑制SIK3，特别地，例如，所述候选化合物相比于抑制所述第二细胞中的SIK2(和/或SIK3)更加偏好抑制所述第一细胞中的SIK3。
在某些实施方式中，这种抑制SIK3的候选化合物可以在其被包括在本发明的筛查方法中之前已被鉴定(或表征)为SIK3抑制剂(例如SIK3特异性抑制剂，如SIK3选择性抑制剂)。例如，作为预先步骤，可以对候选化合物进行SIK3(和/或SIK2或SIK1)生物化学测定，譬如由Promega、ProQuinase或ThermoFisher所提供的，以鉴定或表征所述候选化合物是SIK3抑制剂(例如SIK3特异性抑制剂，如SIK3选择性抑制剂)。
鉴于上述情况，应该认识到，本发明还涉及以下编号的项目：
项目1.一种在受试者中通过抑制SIK3来治疗增殖性障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3抑制剂。
项目2.一种在受试者中通过使与增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感来治疗所述增殖性障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3抑制剂。
项目3.一种在受试者中通过抑制SIK3和使与增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感来治疗所述增殖性障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3抑制剂。
项目4.项目1至3中任一项所述的方法，其中所述增殖性障碍是肿瘤，特别是实体肿瘤。
项目5.项目2或3所述的方法，其中所述细胞介导的免疫应答由分泌促炎性细胞因子的细胞、特别是淋巴细胞、优选为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)来介导。
项目6.项目2、3和5中任一项所述的方法，其中所述细胞介导的免疫应答诱导与所述增殖性障碍有关的细胞的杀死。
项目7.项目2、3、5和6中任一项所述的方法，其中所述细胞介导的免疫应答涉及至少一种免疫细胞效应分子，特别是可由免疫细胞分泌或由免疫细胞分泌的效应分子。
项目8.项目7所述的方法，其中所述效应分子是促炎性细胞因子，特别是肿瘤坏死因子(TNF)。
项目9.项目1至8中任一项所述的方法，其中所述SIK3抑制剂被施用到所述受试者以使与所述增殖性障碍有关的细胞对由TNF诱导的杀死敏感。
项目10.项目1至9中任一项所述的方法，其中所述SIK3抑制剂被施用到所述受试者以使与所述增殖性障碍有关的细胞对由肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)信号传导介导的凋亡敏感。
项目11.项目1至10中任一项所述的方法，其中所述SIK3抑制剂被施用到所述受试者，以在不存在所述细胞介导的免疫应答的情况下引起对与所述增殖性障碍有关的细胞的细胞毒性的量降低。
项目12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述SIK3抑制剂的施用与所述增殖性障碍有关的细胞中NF-κB活性的减损相关，特别是通过增强或增加NF-κB易位到所述与增殖性障碍有关的细胞的核外。
项目13.一种使与增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感的方法，所述方法包括将所述与增殖性障碍有关的细胞暴露于SIK3抑制剂。
项目14.一种用于杀死与增殖性障碍有关的细胞的方法，所述方法包括将所述与增殖性障碍有关的细胞暴露于：(i)TNF、TNF变体和/或TNFR1信号传导的激动剂；和(ii)SIK3抑制剂。
项目15.项目1或14所述的方法，其中所述效应由抑制SIK3来介导。
项目16.项目1至15中任一项所述的方法，其中所述与增殖性障碍有关的细胞中的SIK3被抑制。
项目17.项目1至16中任一项所述的方法，其中免疫细胞中的SIK2以比SIK3更低的程度被抑制。
项目18.项目1至17中任一项所述的方法，其中免疫细胞中的SIK1以比SIK3更低的程度被抑制。
项目19.项目1至18中任一项所述的方法，其中所述效应不与一种或多种抗炎性细胞因子的生产提高相关，和/或不与一种或多种促炎性细胞因子的生产降低相关。
项目20.项目1至19中任一项所述的方法，其中使与所述增殖性障碍有关的细胞经受活化的TNFR2信号传导。
项目21.项目1至20中任一项所述的方法，其中将与所述增殖性障碍有关的细胞暴露于TNF、TNF变体和/或TNFR2信号传导的激动剂。
项目22.项目1至21中任一项所述的方法，其中所述受试者具有高于约2pg/mL的TNF血浆浓度。
项目23.项目1至22中任一项所述的方法，其中所述增殖性障碍是实体肿瘤，其在所述受试者中具有高于0.5pg/mL的TNF肿瘤内浓度。
项目24.一种在受试者中治疗增殖性障碍的方法，所述方法包括将所述受试者中与所述增殖性障碍有关的细胞暴露于：(i)TNF、TNF变体和/或TNFR1信号传导的激动剂；和(ii)SIK3抑制剂。
项目25.项目24所述的方法，其中所述效应通过抑制SIK3和/或通过使所述与增殖性障碍有关的细胞对TNFR1或TNFR2信号传导的细胞毒性效应敏感来介导。
项目26.项目24或25所述的方法，其中所述SIK3抑制剂被施用到所述受试者。
项目27.项目24至26中任一项所述的方法，其中所述TNF、TNF变体或TNFR1信号传导的激动剂被施用到所述受试者。
项目28.项目24至27中任一项所述的方法，其中TNF以约5至500ug/m2/天之间、特别是约20至200ug/m2/天之间的剂量施用到所述受试者。
项目29.项目24至27中任一项所述的方法，其中所述TNF变体是TNF的具有更高细胞毒性活性和更低系统性毒性的变体形式。
项目30.项目24至26中任一项所述的方法，其中将能够引起或引起所述与增殖性障碍有关的细胞暴露到所述TNF、TNF变体或TNFR1信号传导的激动剂的药剂施用到所述受试者。
项目31.项目30所述的方法，其中所述药剂是能够引起或引起所述与增殖性障碍有关的细胞暴露到所述TNF、TNF变体或TNFR1信号传导的激动剂的病毒。
项目32.项目30所述的方法，其中所述药剂是免疫细胞，特别是其中所述免疫细胞作为过继细胞转移的一部分被施用。
项目33.项目24至26中任一项所述的方法，其中所述与增殖性障碍有关的细胞向TNF的暴露由提高所述受试者的血浆中和/或这些细胞的环境中TNF的量的药物、治疗或其他程序引起。
项目34.项目33所述的方法，其中所述药物、治疗或其他程序包含癌症免疫疗法和/或放疗。
项目35.一种在正用TNF治疗增殖性障碍的受试者中提高这种治疗的治疗指数的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3的抑制剂。
项目36.一种使患有增殖性障碍的受试者对包括向所述受试者施用TNF的疗法敏感的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3的抑制剂。
项目37.一种在正用抗TNF药剂治疗的受试者中降低血液增殖性障碍的风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用SIK3的抑制剂。
项目38.项目1至37中任一项所述的方法，其中所述SIK3抑制剂是SIK3特异性抑制剂。
项目39.项目1至38中任一项所述的方法，其中所述SIK3抑制剂抑制SIK3比它抑制SIK2更加有效。
项目40.项目1至39中任一项所述的方法，其中所述SIK3抑制剂选自多肽、肽、糖蛋白、肽模拟物、抗体或抗体样分子(例如胞内抗体)；核酸例如DNA或RNA，例如反义DNA或RNA、核酶、RNA或DNA适体、siRNA、shRNA等，包括其变体或衍生物例如肽核酸(PNA)；用于靶向基因编辑的遗传构建物，例如CRISPR/Cas9构建物和/或指导RNA/DNA(gRNA/gDNA)和/或tracrRNA；异双功能化合物(例如PROTAC或HyT分子)；糖类例如多糖或寡糖等，包括其变体或衍生物；脂质例如脂肪酸等，包括其变体或衍生物；或小有机分子，包括但不限于小分子配体或细胞渗透性小分子。
项目41.项目1至40中任一项所述的方法，其中所述SIK3抑制剂是抑制性核酸。
项目42.项目1至40中任一项所述的方法，其中所述SIK3抑制剂是小分子，特别是小分子配体或细胞渗透性小分子。
项目43.项目1至40中任一项所述的方法，其中所述SIK3抑制剂是达沙替尼或其变体。
项目44.项目1至40中任一项所述的方法，其中所述SIK3抑制剂是下式I的环状化合物及其盐
Figure BPA0000282270360001231
其中：
Q是：
(1)5员杂芳基环；
(2)6员杂芳基环；或
(3)芳基环；
其任选地被一个或多个基团R1取代；
Z是：
(1)单键；
(2)-R16C＝CH-；或
(3)-(CH2)m-，其中m是1至2；
X1和X2各自是氢或合在一起形成＝O或＝S；
R1是：
(1)氢或R6，
其中R6是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、环烯基烷基、芳基、芳烷基、杂环，或杂环烷基，其各自是未取代的或者被Z1、Z2和一个或多个(优选地一个或两个)基团Z3取代；
(2)-OH或-OR6；
(3)-SH或-SR6；
(4)-C(O)2H、-C(O)qR6或-O-C(O)qR6，其中q是1或2；
(5)-SO3H或-S(O)qR6；
(6)卤素；
(7)氰基；
(8)硝基；
(9)-Z4-NR7R8；
(10)-Z4-N(R9)-Z5-NR10R11；
(11)-Z4-N(R12)-Z5-R6；
(12)-P(O)(OR6)2；
R2和R3各自独立地是：
(1)氢或R6；
(2)-Z4-R6；或
(3)-Z13-NR7R8；
R4和R5：
(1)各自独立地是氢或R6；
(2)-Z4-N(R9)-Z5-NR10R11；
(3)-N(R9)Z4R6；或
(4)与它们附连到的氮原子一起完成未取代的或被Z1、Z2和Z3取代的3至8员饱和或不饱和杂环，所述杂环可以任选地稠合有本身未取代的或被Z1、Z2和Z3取代的苯环；
R7、R8、R9、R10、R11和R12：
(1)各自独立地是氢或R6；
(2)R7和R8可以合在一起成为亚烷基、亚烯基或杂烷基，其与它们附连到的氮原子完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；或
(3)R9、R10和R11中的任两者可以合在一起成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的氮原子完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；
R13是：
(1)氰基；
(2)硝基；
(3)-NH2；
(4)-NHO烷基；
(5)-OH；
(6)-NHO芳基；
(7)-NHCOO烷基；
(8)-NHCOO芳基；
(9)-NHSO2烷基；
(10)-NHSO2芳基；
(11)芳基；
(12)杂芳基；
(13)-O烷基；或
(14)-O芳基；
R14是：
(1)-NO2；
(2)-COO烷基；或
(3)-COO芳基；
R15是：
(1)氢；
(2)烷基；
(3)芳基；
(4)芳基烷基；或
(5)环烷基；
Z1、Z2和Z3各自独立地是：
(1)氢或Z6，其中Z6是(i)烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、环烯基烷基、芳基、芳烷基、烷基芳基、环烷基芳基、杂环或杂环烷基；(ii)本身被一个或多个相同或不同的基团(i)取代的基团(i)；或(iii)被一个或多个Z1、Z2和Z3的定义的下述基团(2)至(16)取代的基团(i)或(ii)；
(2)-OH或-OZ6；
(3)-SH或-SZ6；
(4)-C(O)qH、-C(O)qZ6或-O-C(O)qZ6；
(5)-SO3H、-S(O)qZ6或S(O)qN(Z9)Z6；
(6)卤素；
(7)氰基；
(8)硝基；
(9)-Z4-NZ7Z8；
(10)-Z4-N(Z9)-Z5-NZ7Z8；
(11)-Z4-N(Z10)-Z5-Z6；
(12)-Z4-N(Z10)-Z5-H；
(13)氧代；
(14)-O-C(O)-Z6；
(15)Z1、Z2和Z3中的任两者可以合在一起成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的原子一起完成3至8员饱和或不饱和环；或
(16)Z1、Z2和Z3中的任两者可以合在一起成为-O-(CH2)r-O-，其中r是1至5，其与它们附连到的原子一起完成4至8员饱和或不饱和环；
Z4和Z5各自独立地是：
(1)单键；
(2)-Z11-S(O)q-Z12-；
(3)-Z11-C(O)-Z12；
(4)-Z11-C(S)-Z12-；
(5)-Z11-O-Z12-；
(6)-Z11-S-Z12-；
(7)-Z11-O-C(O)-Z12；或
(8)-Z11-C(O)-O-Z12-；
Z7、Z8、Z9和Z10：
(1)各自独立地是氢或Z6；
(2)Z7和Z8或Z6和Z10可以合在一起成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的原子一起完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；或
(3)Z7或Z8与Z9一起可以成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的氮原子完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；
Z11和Z12各自独立地是：
(1)单键；
(2)亚烷基；
(3)亚烯基；或
(4)亚炔基；并且
Z13是：
(1)单键；
(2)-Z11-S(O)q-Z12-；
(3)-Z11-C(O)-Z12；
(4)-Z11-C(S)-Z12-；
(5)-Z11-O-Z12-；
(6)-Z11-S-Z12-；
(7)-Z11-O-C(O)-Z12-；
(8)-Z11-C(O)-O-Z12-；
(9)-C(NR13)-；
(10)-C(CHR14)-；或
(11)-C(C(R14)2)-。
项目45.项目44所述的方法，其中这些SIK3抑制剂是达沙替尼的变体。
项目46.项目1至40中任一项所述的方法，其中所述SIK3抑制剂选自：
Figure BPA0000282270360001281
及其溶剂化物、盐、络合物、立体异构体、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物及其组合。
项目47.项目1至46中任一项所述的方法，其中与所述增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答有抗性。
项目48.项目1至47中任一项所述的方法，其中与所述增殖性障碍有关的细胞已经历以前的免疫疗法，特别是所述受试者已通过施用免疫检查点分子进行以前的免疫疗法。
项目49.项目1至48中任一项所述的方法，其中与所述增殖性障碍有关的细胞的特征在于SIK3的表达和/或活性，特别是这种细胞表达SIK3的mRNA和/或蛋白质，和/或对这种SIK3表达和/或活性阳性。
项目50.项目1至49中任一项所述的方法，其中所述增殖性障碍是选自下述的肿瘤：胰腺癌，乳腺癌，黑素瘤，卵巢癌，食管癌，肉瘤和结肠直肠癌；或与所述增殖性障碍有关的细胞是这些肿瘤之一的细胞或源自于它的细胞。
项目51.一种确定受试者是否具有与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的表达或活性相关的表型或具有发生所述表型的风险的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)检测来自于所述受试者的生物样品中的适用生物标志物；
其中所述样品中所述适用生物标志物的检测指示了所述受试者中的与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的表达或活性相关的表型或发生所述表型的风险；并且
其中所述适用生物标志物是选自下述的一者：
·SIK3，特别是SIK3、优选为磷酸化SIK3的存在(或量)或表达和/或活性；
·TNFR1，特别是TNFR1的存在(或量)或表达和/或活性；和
·LKB1，特别是LKB1、优选为磷酸化LKB1的存在(或量)或表达和/或活性。
项目52.根据项目51所述的方法，其中所述适用生物标志物的检测包括确定所述样品中SIK3、特别是磷酸化SIK3的存在或量或其活性。
项目53.根据项目51或52所述的方法，其还包括确定所述样品中TNF的存在或量的步骤，其中所述样品中TNF的存在或量指示了所述受试者中与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的表达或活性相关的表型或发生所述表型的风险。
项目54.一种确定受试者是否患有与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的表达或活性相关的疾病、障碍或病症或具有发生所述疾病、障碍或病症的风险的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)将所述受试者的与所述疾病、障碍或病症有关的细胞与SIK3抑制剂在细胞介导的免疫应答存在下进行接触，所述细胞介导的免疫应答是(i)选自淋巴细胞、T-细胞、CTL和TIL的免疫细胞；或(ii)促炎性细胞因子，特别是TNF；并且
(b)确定针对所述受试者的这些细胞的细胞介导的免疫应答，
其中针对所述受试者的这些细胞的细胞介导的免疫应答的增强指示所述受试者患有此类疾病、障碍或病症或具有发生此类疾病、障碍或病症的风险。
项目55.一种能够特异性结合到SIK3的抗原结合蛋白(ABP)在哺乳动物受试者中的疾病、障碍或病症、特别是与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的表达或活性相关的疾病、障碍或病症的体外诊断中的用途。
项目56.根据项目55所述的用途，其中所述ABP能够特异性结合到磷酸化SIK3。
项目57.一种药剂盒，其包含：(a)ABP或能够特异性结合到SIK3的核酸；和(b)任选的(i)描述如何使用所述ABP或核酸或药剂盒来检测所述样品中的SIK3的说明书；和/或(ii)对所述药剂盒的使用或所述样品中SIK3的检测有用的一种或多种其他物品、组分、试剂或其他工具。
项目58.根据项目57所述的药剂盒，其包含能够特异性结合到磷酸化SIK3的ABP。
项目59.一种鉴定和/或表征适用于治疗以针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性为特征和/或以SIK3的表达或活性为特征的疾病、障碍或病症的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)使表达SIK3的第一细胞与(i)候选化合物或(ii)所述候选化合物和细胞介导的免疫应答发生接触；并且
(b)确定(i)所述第一细胞中SIK3(特别是磷酸化SIK3)的(例如蛋白质或mRNA的)表达、活性、功能和/或稳定性；和/或(ii)所述细胞介导的免疫应答针对所述第一细胞的细胞毒性，
其中：(i)与不接触所述候选化合物的所述第一细胞相比，接触所述候选化合物的所述第一细胞中所述SIK3的降低的表达、活性、功能和/或稳定性，和/或(ii)与所述细胞介导的免疫应答针对不接触所述候选化合物的所述第一细胞的细胞毒性相比，所述细胞介导的免疫应答针对接触所述候选化合物的所述第一细胞的提高的细胞毒性，指示了所述候选化合物是适用于治疗以针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性为特征和/或以SIK3的表达或活性为特征的疾病、障碍或病症的化合物。
项目60.根据项目59所述的方法，其中所述SIK3的表达、活性、功能和/或稳定性的降低和/或所述细胞毒性的提高，通过参考选自下述的对照方法来鉴定：在不存在任何候选化合物的情况下实践的方法，或使用对这种表达、功能、活性和/或稳定性具有已知作用的化合物、特别是阳性或阴性对照实践的方法，和/或在不存在细胞介导的免疫应答的情况下实践的方法。
项目61.根据项目59或60所述的方法，其中所述细胞介导的免疫应答是促炎性细胞因子，特别是TNF。
项目62.根据项目59至61中任一项所述的方法，其中所述第一细胞是与增殖性障碍、特别是肿瘤有关的细胞。
此外，还应该认识到，本发明还涉及下述另外的编号项目：
项目A1.一种SIK3抑制剂，其用于在受试者中通过抑制SIK3和使与增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感来治疗所述增殖性障碍，所述治疗包括向所述受试者施用所述SIK3抑制剂。
项目A2.项目A1的用途的SIK3抑制剂，其中：(i)所述细胞介导的免疫应答由分泌促炎性细胞因子的细胞、特别是淋巴细胞、优选为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)来介导，和/或(ii)其中所述细胞介导的免疫应答涉及至少一种免疫细胞效应分子，其是促炎性细胞因子，特别是肿瘤坏死因子(TNF)。
项目A3.项目A1或A2的用途的SIK3抑制剂，其中：(i)所述受试者具有高于约2pg/mL的TNF血浆浓度；和/或(ii)所述增殖性障碍是实体肿瘤，其在所述受试者中具有高于0.5pg/mL的TNF肿瘤内浓度。
项目A4.一种用于在受试者中治疗增殖性障碍的SIK3抑制剂，所述治疗包括将所述受试者中的与所述增殖性障碍有关的细胞暴露到：(i)TNF、TNF变体和/或TNFR1信号传导的激动剂；和(ii)SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂被施用到所述受试者。
项目A5.项目A4的用途的SIK3抑制剂，其中：(i)所述TNF、TNF变体或TNFR1信号传导的激动剂被施用到所述受试者；(ii)将能够引起或引起所述与增殖性障碍有关的细胞向所述TNF、TNF变体或TNFR1信号传导的激动剂的暴露的药剂施用到所述受试者；或(iii)所述与增殖性障碍有关的细胞向TNF的暴露由提高所述受试者的血浆中和/或这种细胞的环境中TNF的量的药物、治疗或其他程序引起。
项目A6.一种SIK3抑制剂，其用于在正用抗TNF药剂治疗的受试者中降低血液增殖性障碍的风险的治疗中，所述治疗包括向所述受试者施用SIK3的抑制剂。
项目A7.项目A1至A6中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂抑制SIK3比它抑制SIK2更加有效。
项目A8.项目A1至A7中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂是：(i)抑制性核酸；或(ii)小分子，特别是小分子配体或细胞渗透性小分子。
项目A9.项目A1至A8中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂是下式I的环状化合物及其盐
Figure BPA0000282270360001331
其中：
Q是：
(1)5员杂芳基环；
(2)6员杂芳基环；或
(3)芳基环；
其任选地被一个或多个基团R1取代；
Z是：
(1)单键；
(2)-R16C＝CH-；或
(3)-(CH2)m-，其中m是1至2；
X1和X2各自是氢或合在一起形成＝O或＝S；
R1是：
(1)氢或R6，
其中R6是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、环烯基烷基、芳基、芳烷基、杂环，或杂环烷基，其各自是未取代的或者被Z1、Z2和一个或多个(优选地一个或两个)基团Z3取代；
(2)-OH或-OR6；
(3)-SH或-SR6；
(4)-C(O)2H、-C(O)qR6或-O-C(O)qR6，其中q是1或2；
(5)-SO3H或-S(O)qR6；
(6)卤素；
(7)氰基；
(8)硝基；
(9)-Z4-NR7R8；
(10)-Z4-N(R9)-Z5-NR10R11；
(11)-Z4-N(R12)-Z5-R6；
(12)-P(O)(OR6)2；
R2和R3各自独立地是：
(1)氢或R6；
(2)-Z4-R6；或
(3)-Z13-NR7R8；
R4和R5：
(1)各自独立地是氢或R6；
(2)-Z4-N(R9)-Z5-NR10R11；
(3)-N(R9)Z4R6；或
(4)与它们附连到的氮原子一起完成未取代的或被Z1、Z2和Z3取代的3至8员饱和或不饱和杂环，所述杂环可以任选地稠合有本身未取代的或被Z1、Z2和Z3取代的苯环；
R7、R8、R9、R10、R11和R12：
(1)各自独立地是氢或R6；
(2)R7和R8可以合在一起成为亚烷基、亚烯基或杂烷基，其与它们附连到的氮原子完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；或
(3)R9、R10和R11中的任两者可以合在一起成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的氮原子完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；
R13是：
(1)氰基；
(2)硝基；
(3)-NH2；
(4)-NHO烷基；
(5)-OH；
(6)-NHO芳基；
(7)-NHCOO烷基；
(8)-NHCOO芳基；
(9)-NHSO2烷基；
(10)-NHSO2芳基；
(11)芳基；
(12)杂芳基；
(13)-O烷基；或
(14)-O芳基；
R14是：
(1)-NO2；
(2)-COO烷基；或
(3)-COO芳基；
R15是：
(1)氢；
(2)烷基；
(3)芳基；
(4)芳基烷基；或
(5)环烷基；
Z1、Z2和Z3各自独立地是：
(1)氢或Z6，其中Z6是(i)烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、环烯基烷基、芳基、芳烷基、烷基芳基、环烷基芳基、杂环或杂环烷基；(ii)本身被一个或多个相同或不同的基团(i)取代的基团(i)；或(iii)被一个或多个Z1、Z2和Z3的定义的下述基团(2)至(16)取代的基团(i)或(ii)；
(2)-OH或-OZ6；
(3)-SH或-SZ6；
(4)-C(O)qH、-C(O)qZ6或-O-C(O)qZ6；
(5)-SO3H、-S(O)qZ6或S(O)qN(Z9)Z6；
(6)卤素；
(7)氰基；
(8)硝基；
(9)-Z4-NZ7Z8；
(10)-Z4-N(Z9)-Z5-NZ7Z8；
(11)-Z4-N(Z10)-Z5-Z6；
(12)-Z4-N(Z10)-Z5-H；
(13)氧代；
(14)-O-C(O)-Z6；
(15)Z1、Z2和Z3中的任两者可以合在一起成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的原子一起完成3至8员饱和或不饱和环；或
(16)Z1、Z2和Z3中的任两者可以合在一起成为-O-(CH2)r-O-，其中r是1至5，其与它们附连到的原子一起完成4至8员饱和或不饱和环；
Z4和Z5各自独立地是：
(1)单键；
(2)-Z11-S(O)q-Z12-；
(3)-Z11-C(O)-Z12；
(4)-Z11-C(S)-Z12-；
(5)-Z11-O-Z12-；
(6)-Z11-S-Z12-；
(7)-Z11-O-C(O)-Z12；或
(8)-Z11-C(O)-O-Z12-；
Z7、Z8、Z9和Z10：
(1)各自独立地是氢或Z6；
(2)Z7和Z8或Z6和Z10可以合在一起成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的原子一起完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；或
(3)Z7或Z8与Z9一起可以成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的氮原子完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；
Z11和Z12各自独立地是：
(1)单键；
(2)亚烷基；
(3)亚烯基；或
(4)亚炔基；并且
Z13是：
(1)单键；
(2)-Z11-S(O)q-Z12-；
(3)-Z11-C(O)-Z12；
(4)-Z11-C(S)-Z12-；
(5)-Z11-O-Z12-；
(6)-Z11-S-Z12-；
(7)-Z11-O-C(O)-Z12-；
(8)-Z11-C(O)-O-Z12-；
(9)-C(NR13)-；
(10)-C(CHR14)-；或
(11)-C(C(R14)2)-；
其中所述式I的环状化合物具有下式II：
Figure BPA0000282270360001371
其中
n是1或2；
A选自碳和氮；
B选自氮、氧和硫；
X3是氧或硫；并且
R1、R2、R3、R4和R5如上所定义；并且
其中式II的R2是氢，并且式II的R3是Rx，其中Rx具有下式X：
Figure BPA0000282270360001381
其中式X的Z1、Z2和Z3如上所定义。
项目A10.项目A1至A9中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂选自：
Figure BPA0000282270360001382
及其溶剂化物、盐、络合物、立体异构体、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物及其组合。
项目A11.项目A1至A5和A7至A10中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中与所述增殖性障碍有关的细胞：(i)对细胞介导的免疫应答有抗性；和/或(ii)已经历以前的免疫疗法，特别是所述受试者已通过施用免疫检查点分子进行了以前的免疫疗法。
项目A12.项目A1至A5和A7至A11中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中与所述增殖性障碍有关的细胞的特征在于SIK3的表达和/或活性，特别地这些细胞表达SIK3的mRNA和/或蛋白质和/或对这种SIK3表达和/或活性阳性。
项目A13.一种确定受试者是否患有与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关的增殖性障碍例如肿瘤，或是否具有发生所述增殖性障碍例如肿瘤，的风险的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)检测来自于所述受试者的生物样品中的适用生物标志物；
其中所述样品中所述适用生物标志物的检测指示了所述受试者中与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的表达或活性相关的表型或发生所述表型的风险；并且
其中所述适用生物标志物是选自下述的一者：
·SIK3，特别是SIK3、优选为磷酸化SIK3的存在(或量)或表达和/或活性；
·TNFR1，特别是TNFR1的存在(或量)或表达和/或活性；和
·LKB1，特别是LKB1、优选为磷酸化LKB1的存在(或量)或表达和/或活性。
项目A14.根据项目A13所述的方法，其还包括确定来自于所述受试者的生物样品中TNF的存在或量的步骤，其中所述样品中TNF的存在或量指示了所述受试者中与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的表达或活性相关的表型或发生所述表型的风险。
项目A15.一种鉴定和/或表征适用于治疗以针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性为特征的疾病、障碍或病症的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)使表达SIK3的第一细胞与(i)候选化合物或(ii)所述候选化合物和细胞介导的免疫应答发生接触；并且
(b)确定(i)所述第一细胞中SIK3(特别是磷酸化SIK3)的(例如蛋白质或mRNA的)表达、活性、功能和/或稳定性；和/或(ii)所述细胞介导的免疫应答针对所述第一细胞的细胞毒性，
其中：(i)与不接触所述候选化合物的所述第一细胞相比，接触所述候选化合物的所述第一细胞中所述SIK3的降低的表达、活性、功能和/或稳定性，和/或(ii)与所述细胞介导的免疫应答针对不接触所述候选化合物的所述第一细胞的细胞毒性相比，所述细胞介导的免疫应答针对接触所述候选化合物的所述第一细胞的提高的细胞毒性，指示了所述候选化合物是适用于治疗以针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性为特征和/或以SIK3的表达或活性为特征的疾病、障碍或病症的化合物。
项目A16.根据项目A15所述的方法，其中所述细胞介导的免疫应答是：(i)促炎性细胞因子，特别是TNF；或(ii)第二细胞，其是能够免疫识别所述第一细胞的细胞毒性免疫细胞，特别是CTL。
项目A17.项目A1至A5或A7至A12中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述增殖性障碍是肿瘤，特别是实体肿瘤。
当在本文中使用时，术语“本发明的”、“依据本发明”、“根据本发明”及类似意指本文中描述和/或要求权利的本发明的所有方面和实施方式。
当在本文中使用时，术语“包含”应该被解释为涵盖“包括”和“由……组成”两者，依据本发明，这两个含义都是特意的，因而各自公开的实施方式。在本文中使用时，“和/或”应该被当作具体公开了两个指定的特点或组分中的每一者与或不与另一者相伴。例如，“A和/或B”应该被当作具体公开了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一者，如同每一者在本文中被单个地阐述。在本发明的情形中，术语“约”和“大约”表示本领域技术人员理解的仍确保所讨论的特点的技术效果的精度间隔。所述术语通常指示偏离所指明的数值±20％、±15％、±10％和例如±5％。正如普通技术人员将会认识到的，对于给定技术效果来说这种具体的数值偏差将取决于所述技术效果的本质。例如，天然或生物学技术效果与人造或工程化技术效果相比通常可能具有更大的这种偏差。当在指称单数形式时使用不定冠词或定冠词时，除非另有具体陈述，否则这包括该名词的复数。
应当理解，根据本文中包含的教导，将本发明的教导应用于特定问题或环境以及将本发明的变化形式或附加特点包括在内(例如其他方面和实施方式)，将在本领域普通技术人员的能力范围之内。
除非上下文另有指示，否则上文阐述的特点的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方式，并且同等地适用于所描述的所有方面和实施方式。
本文中引用的所有参考文献、专利和出版物整体通过引用并入本文。
现在将通过实施例并参考本文中阐述的描述、附图和表格来说明本发明的某些方面和实施方式。本发明的方法、用途和其他方面的这些实施例仅仅是代表性的，并且不应被视为将本发明的范围限制到仅仅这些代表性实施例。
所述实施例显示：
实施例1：增殖性疾病的细胞中的SIK3活性介导对免疫应答的抗性
本发明人在本文中描述了他们出人意料的发现，即SIK3是与肿瘤细胞对细胞介导的免疫应答抗性有关的基因。SIK3的这种作用由本发明人使用高通量筛选方法，为了鉴定与肿瘤对T细胞攻击的抗性有关的新基因而首次鉴定到，所述方法从Khandelwal等，2015(MBO Mol Med 7：450)开发并描述的筛选方法改编和扩充而来。简单来说，使用siRNA文库，在HLA-A2.1+表达萤光素酶的PANC1细胞(ANC1-luc)这种胰腺腺癌(PDAC)肿瘤细胞系中将2514个基因各自沉默。然后将各基因siRNA转染的PANC1-luc肿瘤细胞与从HLA-A2.1+PDAC来源的肿瘤浸润淋巴细胞培养物(TIL#1)磁纯化的CD8+T细胞共培养。siRNA介导的基因沉默对肿瘤细胞的TIL介导的杀死的影响，使用基于萤光素酶的细胞毒性测定法来测量(细胞毒性设置)。为了排除其沉默固有地影响细胞生存力的那些基因，进行了不添加TIL#1的补充筛选(生存力设置)。假阳性基因进一步使用不依赖于萤光素酶的生存力筛选来排除。
本发明是基于肿瘤细胞的SIK3的抑制决定了在与细胞介导的免疫应答共培养后肿瘤细胞存活率的降低这一显著的影响。在使用以萤光素酶为基础的杀死测定法的基于PANC1-luc的T细胞介导的细胞毒性测定法中，SIK3被表A1中阐述的SIK3 siRNA序列(Dharmacon/GE Healthcare)的抑制，导致在与TIL#1或存活蛋白特异性T细胞克隆共培养后肿瘤细胞存活率的急剧降低(图2)。出人意料的是，SIK3被siRNA的减损与PD1-L1的siRNA剥夺(对于siRNA序列，参见表A1)相比引起肿瘤杀死的更强烈的增加。在不存在T细胞的情况下，SIK3沉默对肿瘤细胞的影响取决于所使用的具体siRNA序列，其中s1、s2和s3显示出细胞生存力的轻微降低，而合并的siRNA适度提高细胞存活率。为了可靠地解释SIK3的固有生存力影响，进行了WST-1存活性测定(即在T细胞不存在的情况下)，并且在用几种SIK3特异性siRNA转染后没有在PANC-1细胞中观察到显著影响(参见实施例3和图8E)。
所述PANC1-luc细胞系如下构建：PANC-1细胞从美国典型细胞培养物保藏中心(ATCC)获得。使用TransIT-LT1(Mirus)作为转染试剂将肿瘤细胞用pEGFP-Luc质粒(由DrRudolfHaase善意提供，LMU Munich)转染。转染的细胞用1mg/mL G418/遗传霉素选择，并在选择后14天使用BD FACSARIA II细胞分拣仪分拣EGFP+细胞。HLA-A0201限制的存活蛋白95-104(克隆SK-1)特异性CTL克隆按照描述从健康供体的PBMC产生(Brackertz等，2011)。对于这些实验来说，将PANC-1-luc细胞用单一(s#)或合并的(合并物)靶向SIK3的siRNA序列转染，并将乱序siRNA用作对照(siCtrl)，然后通过如下简述的方法暴露到T细胞：在白色96孔板(Perkin Elmer)中，使用0.1uL RNAiMax作为转染试剂将PANC-1-Luc细胞用25nMsiRNA在37℃和5％CO2下反向转染72h。随后，以所需的效应细胞(T细胞)与靶细胞(肿瘤)比例(E∶T)向转染的PANC-1-Luc细胞添加TIL、存活蛋白特异性T细胞或培养基(在适用于实验时)，并在37℃和5％CO2下温育24h。在共培养后，除去上清液，并将剩余的PANC-1-Luc细胞用萤光素酶细胞裂解试剂(水中的0.3％Triton-X)裂解10min。在裂解后，添加萤光素酶测定缓冲液，并立即使用TECAN-Spark微孔板读板器测量萤光素酶强度。
PANC-1细胞表达SIK3，并且3个不交叠的SIK3特异性siRNA(或siRNA合并物)与乱序对照siRNA相比各自在mRNA水平上诱导高效的SIK3沉默(图3A)。使用抗SIK3 Ab(Abcam，目录号：ab88495)和作为第二抗体的抗兔IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc2004)，Western印迹分析在蛋白质水平上确认了使用相同的SIK3个体和合并的siRNA的SIK3的沉默(图3B)。此外，观察到的细胞毒性效应是对SIK3沉默特异的，并且不来自于SIK基因家族的其他成员的沉默(图3C)。正如可以从这些实验的分开的读出(图3D)观察到的，在T细胞的存在下SIK3的沉默实质性提高了细胞毒性，不影响肿瘤细胞生存力(无T细胞)；SIK1沉默在任一设置中均不影响生存力，而SIK2剥夺本身损害肿瘤细胞生存力，并且T细胞的添加不协同增加肿瘤细胞死亡。
当不存在SIK3沉默时，即使在高的E∶T比例下，肿瘤浸润性淋巴细胞显示出对肿瘤细胞的弱的细胞毒性活性。然而，SIK3下调一致且急剧地增加TIL介导的肿瘤细胞杀死(图4A)。这些数据证实了在广范围的E∶T比例下观察到了依赖于SIK3的中靶基因沉默的T细胞介导的细胞毒性的提高。出人意料的是，SIK3减损与CEACAM6被siRNA的剥夺(表A1)相比引起裂解的更强烈增加。这些数据从使用例如在Khandelwal等(2015)中描述的测定法的标准的铬重释放测定法产生，其被进行以直接测量PANC-1细胞在与TIL#2共培养后的特异性裂解。Western印迹分析证实了CEACAM6以及PD-L1被PANC-1细胞表达，并且它们的表达可以通过用基因特异性siRNA序列转染来沉默(图4B)。CEACAM6和PD-L1使用下述抗体来检测：抗CEACAM6抗体(Abcam，目录号：ab98109)和作为第二抗体的抗兔IgG-HRP(Santa CruzBiotechnology，目录号：sc2004)；抗PD-L1抗体(R&D system；目录号130021)和第二抗体抗小鼠IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology；目录号sc2005)。
数据信息：图2和3A示出了3个独立实验的累积数据，图3B、3C、3D和4示出了至少2个独立实验的代表性数据。误差条表示平均值+/-SEM，并且P-值使用双尾student′s t-检验来计算：*p＜0.05，**p＜0.01。
实施例2：SIK3抑制使来自于各种不同癌症类型的肿瘤细胞对细胞介导的免疫应答的抗肿瘤效应敏感。
本发明人能够证实，令人意外的是，不仅仅在实施例1中使用的胰腺细胞系中，在其他肿瘤类型中SIK3也在对免疫应答的抗性的介导中发挥作用；在乳腺(MCF-7)和结肠直肠(SW480)癌细胞系中SIK3的沉默和随后分别用存活蛋白特异性T细胞或TIL#1的激惹，在两种肿瘤类型中引起肿瘤细胞死亡的显著增加(图5A和5B)，正如通过实时活细胞显微术(Incucye Zoom-Essen Bioscience)所测量的。
此外，在使用表达萤光素酶的M579细胞(M579-A2-luc)的原发黑素瘤共培养模型中，观察到SIK3沉默增强TIL介导的细胞毒性(图6A)，而SIK3的过表达抑制HLA-A2.1+匹配的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL209)的细胞毒性潜力(图6B)。肿瘤浸润性淋巴细胞209微量培养物从黑素瘤患者的腹股沟淋巴结，如Dudley等，2010(Clin Cancer Res 16：6122-3)中所述进行扩增。M579-A2-luc、PANC1-luc和MCF7-luc细胞如Khandelwal等，2015中所述来产生。
数据信息：图6B示出了3个独立实验的累积数据，图5A、5B和6A示出了至少2个独立实验的代表性数据。误差条表示平均值+/-SEM，并且P-值使用双尾student′s t-检验来计算：*p＜0.05，**p＜0.01。
实施例3：SIK3通过肿瘤细胞固有的机制介导肿瘤细胞对免疫应答的抗性。
本发明人做出了出人意料的发现，即SIK3似乎不是通过调控T细胞活性或功能来调控对抗肿瘤T细胞应答的抗性，而是涉及肿瘤抗性的固有机制。肿瘤细胞中SIK3的沉默不增加T细胞中的IFN-γ、颗粒酶B或穿孔蛋白生产(数据未示出)。然而，仅仅添加来自于以前通过暴露于肿瘤细胞而被活化的T细胞的(无T细胞)调制培养基，就足以在SIK3沉默的肿瘤细胞中降低细胞存活率(正如使用上述PANC-1-luc细胞的基于萤光素酶的杀死测定法所测量的)(图8A)，而来自于未刺激的T细胞的(未调制的)培养基在SIK3 siRNA转染后不改变肿瘤细胞存活率(图8B)。当将所述肿瘤细胞暴露到来自于以前通过CD3/CD28珠子活化的培养的多克隆T细胞的调制培养基时，这种效应甚至更加显著(图8C)。简单来说，将100,000个TIL培养并用人类激活剂CD3/CD28 Dynabeads(Invitrogen)按照制造商的流程活化24h。这种效应使用独立的存活性测定法(WST-1)来证实，所述测定法重演了在SIK3剥夺并用多克隆活化T细胞的上清液刺激后肿瘤细胞生存力的降低(图8D)，甚至比PD-L1沉默更低，后者在不存在T细胞的情况下没有观察到生存力的降低(图8E)。WST-1细胞增殖试剂按照制造商(Roche)的流程使用。数据信息：图8A、8B、8D和8E示出了至少2个独立实验的代表性数据。图8C示出了3个独立实验的累积数据。误差条显示平均值+/-SEM。P-值使用双尾student′s t-检验来计算：*p＜0.05，**p＜0.01。
实施例4：SIK3活性决定TNF处理的肿瘤细胞的命运。
本发明人还做出了出乎意料的发现，即TNF在由这种肿瘤细胞的先天性抗性介导的细胞介导的免疫应答中发挥关键作用。TNF中和抗体(Abcam，目录号：ab8348)的滴定引起急剧的、并且在较高抗TNF抗体浓度下完全的，从细胞死亡的解救(图9A)。在乱序(对照)siRNA转染的肿瘤细胞中，与同型对照相比，相同的处理不改变细胞生存力(数据未示出)。来自于CD3-CD28珠子刺激的T细胞的上清液与抗TRAIL和抗FASL中和抗体的温育(按照(A))，在SIK3温育后不引起细胞毒性的降低，这不同于与抗TNF中和抗体的温育(图9C)。
事实上，SIK3抑制引起肿瘤细胞对TNF的细胞毒性效应的急剧敏化。PANC-1-luc细胞暴露于重组人类TNF(rHuTNF；R&D Systems)，不仅在用SIK3 siRNA而且在用乱序对照(siCtrl)转染的肿瘤细胞中引起TNF的效应的引人注目的变化，即使在低浓度的rHuTNF下(图10A)，并且这种效应具有非常快的启动(图10B)。
数据信息：图9B、9C、10A和10B示出了至少2个独立实验的代表性数据。图9A示出了3个独立实验的累积数据。误差条显示平均值+/-SEM。P-值使用双尾student′s t-检验来计算：*p＜0.05，**p＜0.01。
实施例5：通过TNF受体1的TNF信号传导介导SIK3抗性机制。
本发明人通过FACS分析证实了PANC-1细胞表达TNF受体1(TNFR1)(图11A)。然而，尽管在对照细胞系TIL412上可以检测到TNF受体2(TNFR2)(图11B)，但它不能在PANC-1上检测到(图11C)。因此，本发明人提出TNFR1是与观察到的SIK3/TNF介导的效应有关的关键信号传导途径。肿瘤浸润性淋巴细胞412的微量培养物按照Dudley等，2010(Clin Cancer Res16：6122-31)中所述，从黑素瘤患者的腹股沟淋巴结扩增。
事实上，SIK3剥夺的肿瘤细胞在TNF刺激后的TNFR1阻断，与同种型抗体对照相比废除了TNF诱导的细胞毒性(图11D)；尽管在siCtrl转染的PANC-1细胞中TNFR1阻断与同种型抗体对照相比不显著改变肿瘤细胞存活率(数据未示出)。
实施例6：在TNF暴露和SIK3抑制后，肿瘤细胞中凋亡相关基因被上调。
本发明人使用检测PANC-1细胞的总裂解液中的凋亡活化标志物的Luminex测定法，证实了SIK3/TNF介导的肿瘤细胞的细胞毒性通过半胱天冬酶和其他促凋亡基因来介导。在SIK3剥夺后，在rHuTNF处理后的肿瘤细胞中检测到半胱天冬酶8和9两者的切割的增加(图12A和12B)。此外，SIK3剥夺的细胞也显示出磷酸化c-Jun N-端蛋白激酶(pJNK)水平的提高(图12C)。
实施例7：由TNF刺激和SIK3抑制触发的肿瘤细胞的凋亡由通过HDAC4控制的NF-KB活化所掌控。
组蛋白脱乙酰酶4(HDAC4)被描述为SIK3的靶，并且SIK3将HDCA4磷酸化，导致HDAC4从核穿梭到细胞质(Walkinshaw等，2013，J Biol Chem 288：9345)。事实上，PANC-1细胞中SIK3和HDAC4两者的siRNA沉默与仅用SIK3特异性siRNA转染的肿瘤细胞相比显示出细胞毒性的降低，而单独的HDAC4剥夺与乱序对照siRNA(siCtrl)转染相比不显著改变肿瘤细胞生存力(图13A)。在不存在rHuTNF的情况下，siSIK3和siHDAC4 siRNA的共转染对肿瘤细胞生存力不显示出重要影响(数据未示出)。
尽管已显示在巨噬细胞中核HDAC4与NF-KB p65亚基物理相互作用，导致NF-KB脱乙酰化和反式激活的降低(Luan等，2014，Cell Metab 19：1058)，但本发明人做出了出乎意料的发现，即肿瘤细胞中的siRNA SIK3沉默在rHuTNF刺激后导致NF-KB活化的急剧减损(图13B)。此外，SIK3过表达引起NF-KB核易位的增加，正如通过转染的PANC-1细胞的核裂解物的ELISA检测到的(图13C)。
为了证实NF-KB转录控制参与SIK3/TNF介导的细胞毒性机制，在SIK3或乱序对照siRNA转染和rHuTNF或细胞培养基处理后，在PANC-1细胞中进行RNA-seq分析。肿瘤细胞中的SIK3减损在不存在TNF刺激的情况下实质性改变基因特征(图14)。然而，正如预期的：(i)SIK3剥夺的细胞在rHuTNF处理4h后，显示出NF-KB靶基因转录的减损；和(ii)在使用SIK3siRNA但不是乱序对照siRNA的那些实验中，发现SIK3 mRNA的量被剥夺；同时，有趣的是，mRNA SIK1和/或SIK2的量未被剥夺，而是显示出一定增加(数据未示出)。
实施例8：对过继性T细胞转移的肿瘤抗性可以通过体内SIK3抑制来克服
本发明人在体内模型中证实了SIK3的抑制可用于克服黑素瘤细胞对抗肿瘤免疫应答的抗性。在原代细胞系中使用SIK3特异性shRNA(shSIK3)或对照非靶向shRNA序列(shCtrl)进行SIK3的稳定沉默。所述靶向SIK3的shRNA序列阐述在表A2中，并且所述转导的细胞系简单来说如下产生：将表达shRNA靶向SIK3 mRNA或对照shRNA(Sigma-Aldrich)的慢病毒转导粒子用于转导。将5x104个PANC-1-Luc细胞接种在6孔板中的DMEM 10％FCS 1％P/S中。24h后，使用感染复数(MOI)＝2添加慢病毒粒子。从转导起48h，使用0.4μg/ml嘌呤霉素将细胞置于正选择下。首先，将所述shSIK3或shCtrl转导的肿瘤细胞与HLA-A2.1+匹配的TIL209共培养，使用体外实时活细胞显微术监测T细胞介导的杀死的程度。与shCtrl相比，TIL209对shSIK3剥夺的肿瘤细胞显示出更高的杀死效能(图15A)。其次，将所述shSIK3和shCtrl转导的肿瘤细胞分别皮下注射到NSG免疫缺陷小鼠的左胁和右胁中(图16A)，并且每周一次i.v.进行TIL209的过继细胞转移或PBS注射(图16B的计划图)。与shCtrl转导的细胞相比，TIL209处理在SIK3减损的肿瘤细胞中引起肿瘤生长的迟滞(图16C)。与体外数据相一致(图15)，在PBS处理的小鼠中，在shCtrl和shSIK3之间没有观察到肿瘤生长动力学的差异。
合在一起，这些结果将SIK3指定为新的潜在的免疫治疗性靶，其阻断使肿瘤细胞对TNF造成的免疫细胞攻击敏感，正如在图16D中图示的。
实施例9：SIK3被小分子SIK3抑制剂的抑制引起肿瘤细胞对细胞介导的免疫应答的抗肿瘤效应的敏感性提高
本发明人证实了在PANC-1细胞中SIK3被小分子SIK3抑制剂的抑制，可以在肿瘤细胞中重现使用siRNA介导的SIK3沉默时观察到的免疫刺激效应。如上所述，HG-9-91-01(Clark等，2012，PNAS 109：16986)、博舒替尼和达沙替尼除了其他靶之外，还都抑制SIK3。PANC-1肿瘤细胞在用这些化合物独立地处理后显示出对TIL和/或TNF介导的肿瘤裂解的敏感性的显著提高，正如由Luc-CTL测定法中细胞毒性与生存力的比率所指示的(图7A和7B)。
为了证明使用小分子SIK抑制剂时观察到的免疫刺激效应特异性针对SIK3，本发明人在存在(100ng/mL)和不存在TNF的情况下用滴定剂量的达沙替尼处理SIK3阳性(对照siRNA处理的)和SIK3阴性(SIK3 siRNA处理的)PANC-1肿瘤细胞两者，并使用萤光素酶测定法测量肿瘤细胞毒性。在不存在TNF处理的情况下，SIK3阳性和SIK3阴性细胞两者对所述药物剂量具有极大抗性(图7C)。然而，在添加TNF后，SIK3阳性细胞显示出引人注目的生长刺激，其在提高达沙替尼的剂量后变得对肿瘤裂解易感。在SIK3阴性肿瘤细胞中，TNF处理显示出显著的肿瘤裂解，并且有趣的是，在这些细胞中不能观察到对达沙替尼的进一步响应。这些数据表明，达沙替尼的免疫刺激效应通过SIK3的抑制来发生，原因是SIK3阴性肿瘤对这种药物无响应(图7C)。
由于使用SIK抑制剂例如达沙替尼(或博舒替尼)观察到的免疫刺激效应也可能由抑制SIK3之外的其他SIK家族成员引起，因此研究了三种SIK家族成员中的每一者在使肿瘤对免疫介导的细胞毒性敏感中的作用。首先，在PANC-1-luc和M579-A2-luc肿瘤细胞中所有三种SIK家族成员显示出以不同水平表达，正如通过qPCR评估的(图7D)。然而，在添加TIL(TIL#1)或Flu抗原特异性T细胞(如Trivedi等，2016，Bio-Protocol 6：e1847所述来产生)，PANC-1-luc细胞中的SIK1或SIK2的沉默未能诱导任何T-细胞介导的肿瘤裂解；而在SIK-3沉默并添加T细胞后，观察到肿瘤裂解的显著增加(对于TIL来说图3C，对于Flu抗原特异性T细胞来说图7E)。在M579-A2-luc细胞中，与SIK3沉默相反，SIK1和SIK2的沉默对T细胞介导的肿瘤被Flu特异性T细胞的裂解没有贡献(图7F)。有趣的是，在PANC-1-luc和M579-A2-luc肿瘤细胞两者中，SIK1的沉默本身降低肿瘤细胞生存力，而SIK2沉默提高肿瘤细胞存活率，至少在M579-A2-luc细胞中。合在一起，这证明了在所述三种家族成员中，只有肿瘤细胞中的SIK3参与介导对所述T细胞的抗性。
为了进一步强化这种观察，将SIK1和SIK2沉默的M579-A2-luc肿瘤细胞在TNF(100ng/mL)存在下用达沙替尼处理，以观察它们是否仍对所述药物响应。正如上文已经提到的，在这些肿瘤细胞本身(无TNF)中SIK1的沉默抑制肿瘤生长，而SIK2沉默刺激肿瘤生长，正像在Luc CTL测定法中所观察到的(图7F)。在用TNF处理这些细胞后，所述两种细胞类型仍对滴定剂量的达沙替尼有响应，与对照siRNA处理的细胞相似(比较响应曲线的斜率)，超过它们对生存力的效应(图7G)。这被发现与SIK3阴性肿瘤细胞相反，正如在上图中所示(图7C)。这强调了在TNF存在下达沙替尼的免疫刺激效应通过抑制SIK3而不是SIK1或SIK2来组织。
实施例10：通式I的小分子化合物的合成
通式I的化合物按照下述程序来合成。
通用合成方案：
Figure BPA0000282270360001501
通用方法和材料：
MPLC纯化使用Biotage Isolera Four系统，使用KP-Sil柱筒以及工业级溶剂即二氯甲烷和甲醇来进行。
1H NMR波谱在Bruker AVIII 300MHz或Bruker DPX 400MHz波谱仪上记录，并以ppm为单位报告，将溶剂共振用作内标[CDCl3在7.26ppm处，DMSO-d6在2.50ppm处]。峰被报告为(s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰或未解析的，bs＝宽峰信号，耦合常数以Hz为单位，积分)。
反相HPLC在Shimadzu HPLC系统上使用下述系统来进行[溶剂A：乙腈，溶剂B：0.1％甲酸水溶液]。甲酸作为HPLC级使用。所有分离在环境温度下进行。对分析型RP-HPLC分析[Interchim：Uptisphere Strategy
Figure BPA0000282270360001511
5μm，100x 4.6mm]来说，流速为1.5ml min-1。度制备型RP-HPLC分析[Interchim：Uptisphere Strategy
Figure BPA0000282270360001512
5μm，100x 21.2mm]来说，流速为20ml min-1。
中间体(III)和(IV)的合成：
2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酸乙酯(III)：
Figure BPA0000282270360001513
在0℃和惰性气氛下，向4，6-二氯-2-甲基嘧啶I(5g，30.7mmol)和2-氨基噻唑-5-甲酸乙酯II(5.28g，30.7mmol)在DMF(105ml)中的溶液分部添加氢化钠(2.70g，67.5mmol)，并将所述反应混合物在0℃搅拌3h。过量的NaH通过添加氯化铵饱和溶液来淬灭，并将所述反应混合物倾倒在水(2000ml)上，在室温搅拌1h。将获得的沉淀物过滤出来并空气干燥，得到作为浅黄色固体的2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酸乙酯III(8g，26.8mmol，87％得率)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.34-1.51(t，3H)，2.75(s，3H)，4.41(q，J＝7.1Hz，2H)，6.73(s，1H)，8.14(s，1H)。LCMS：m/z＝297.1[M-H]-。
2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酸(IV)：
Figure BPA0000282270360001514
在室温下向2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酸乙酯III(8g，26.8mmol)在甲醇(65ml)和水(25ml)中的悬液添加氢氧化钠(8.57g，214mmol)，并将所述混合物在室温搅拌16h。LCMS分析显示起始原料完全转化成产物。将所述反应混合物浓缩以除去甲醇，然后使用6M盐酸水溶液将其酸化。将获得的沉淀物过滤出来并用水洗涤，空气干燥，得到作为米黄色粉末的2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酸IV(5.5g，20.32mmol，76％得率)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ2.57(s，3H)，6.93(s，1H)，8.04(s，1H)，12.46(bs.1H)。LCMS：m/z＝269.0[M-H]-。
通用程序A：
Figure BPA0000282270360001521
在25℃下，向2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酸IV(1.0当量)和苯胺(1.1当量)的混合物添加作为在乙酸乙酯中的50％溶液的T3P(1.2当量)和N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(2.0当量)。将反应混合物在100℃搅拌16h。在冷却至室温后，将所述反应混合物倾倒在水(200ml)中并搅拌最少30min。将得到的沉淀物过滤出来，用水洗涤[5x]，空气干燥，得到作为浅棕色至深棕色粉末的相应的酰胺，其不需进一步纯化直接用于下一步骤中。所有物质通过LCMS分析(ESI)来确认。
通用程序B：
Figure BPA0000282270360001522
在25℃下向氯代嘧啶衍生物V(1.0当量)在正丁醇(2ml)中的悬液添加2-(哌嗪-1-基)乙-1-醇(5.0当量)和N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(0.4当量)。将试管密封并在微波条件(Biotage Initiator+)下在120℃辐照30min。在冷却至室温后，将所述反应混合物倾倒在水(200ml)中并搅拌最少30min。将得到的沉淀物过滤出来，用水洗涤[5x]，空气干燥，得到最终产物VI。如果纯度低于95％，则将所述物质通过MPLC(SiO2，DCM，10％氨化甲醇)或通过制备反相HPLC进行纯化。所有物质通过LCMS分析(ESI)来确认。
遵照通用程序A和B获得在表A3中示出的通式I的化合物。这些化合物如下文表1中所阐述的进行表征。
表1：本发明的小分子的合成
Figure BPA0000282270360001531
Figure BPA0000282270360001541
实施例11：SIK3的小分子抑制剂的生物活性和其他特征。
使用用于SIK1、SIK2或SIK3活性的生物化学测定法(由ProQinase，FreiburgGermany提供的自由选择激酶测定法)，确定表1中合成的化合物针对SIK1、SIK2和SIK3中每一者的指示性IC50，并示出在表2A中。
表2A：本发明的小分子的生物活性
Figure BPA0000282270360001551
****＝＜0.1uM；***＝＞0.1uM；**＝＞0.5uM；*＝＞1.0uM。
简单来说，将放射性测量的蛋白激酶测定法(
Figure BPA0000282270360001552
活性测定法)用于测量所述三种蛋白激酶的激酶活性。所有激酶测定在来自于PerkinElmer(Boston，MA，USA)的96孔FlashPlatesTM中，在50ul反应体积中进行。反应混合物以下述顺序在四个步骤中移取：
●20ul测定缓冲液(标准缓冲液)
●5ul ATP溶液(在水中)
●5ul测试化合物(在10％DMSO)中
●20ul酶/底物混合物
所述用于所有蛋白激酶的测定法含有70mM HEPES-NaOH pH7.5，3mM MgCl2，3mMMnCl2，3uM原钒酸钠，1.2mM DTT，50μg/ml PEG20000，ATP(可变的浓度，对应于相应激酶的表观ATP-Km，参见表2B)，[γ-33P]-ATP(每孔约3.5x 10^5cpm)，蛋白激酶(可变的量，参见表2B)和底物(可变的量，参见表2B)。
下述酶和底物的量被用于每个孔：
表2B：用于所述测试蛋白激酶的测定法参数
Figure BPA0000282270360001561
*酶测定法最高摩尔浓度，暗示了排他性地含有100％活性酶的酶制备物
将所述反应混合物在30℃温育60分钟。所述反应用50ul 2％(v/v)H3PO4终止，将板中的溶液吸出并用200ul 0.9％(w/v)NaCl清洗两次。33Pi的掺入使用微孔板闪烁计数器(Microβ，Wallac)确定。所有测定法使用BeckmanCoulter/SAGIANTM Core System来进行。
实施例12：可以使肿瘤细胞对TNF的细胞毒性效应敏感的SIK3的其他小分子抑制剂的发现和/或表征。
按照WO 2000/62778A1中描述的适用方案，合成了小分子SIK3抑制剂达沙替尼的变体，例如由本文的结构式描述的变体。使用生物化学筛查，例如由ThermoScientific提供的SelectScreen、由ProQinase提供的自由选择激酶测定法或由Reaction Biology Inc提供的Kinase HotSpot来确认SIK3抑制。对SIK3的特异性/选择性(特别是与SIK1和/或SIK2相比)，使用生物化学激酶情况分析(例如ThermoScientific的SelectScreen、由ProQinase提供的自由选择激酶测定法和/或DiscoverX的KINOMEScan)来评估。也合成了变体或其他SIK3抑制剂(例如HG-9-91-01和YKL-05-099)，例如由本文中的结构式所描述的那些，并且将这些变体在用于SIK3(和其他激酶例如Abl和/或Bcr-Abl)抑制效能的生物化学测定法中类似地进行测试。
在细胞测定法中，那些被鉴定/表征为SIK3抑制剂的变体(例如达沙替尼)(特别是那些被鉴定或表征为SIK3特异性选择性抑制剂的变体)被测试它们使增殖性疾病的细胞对细胞介导的免疫应答敏感(特别是使肿瘤细胞对TNF的细胞毒性效应敏感)的效能。例如，将这些SIK3抑制剂在与图7所描述的类似的测定法中进行测试。可以将这些SIK3抑制剂在SIK3(和/或SIK1/SIK2)过表达和/或siRNA沉默背景中进行测试，以进一步表征对SIK3的体内SIK特异性/选择性，和/或这种抑制在肿瘤细胞内而不是免疫细胞内介导。
将特别有效和/或具有有利PK性质的小分子SIK3抑制剂在用于克服肿瘤抗性的体外模型例如实施例1中描述的鼠类黑素瘤模型中进行测试。
实施例13：通式I的其他小分子化合物的合成和表征
除了下文所描述的之外，遵照实施例10的通用程序A和B来获得表A4中示出的通式I/本发明的化合物。
对于化合物B5、B6和B7来说，使用下述修改的程序B’来代替实施例10的通用程序B：
通用程序B’：
Figure BPA0000282270360001571
在25℃下，向氯代嘧啶衍生物V(1.0当量)在正丁醇(2ml)中的悬液添加胺HNR1R2(5.0当量)和N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(0.4当量)。将试管密封并在微波条件(BiotageInitiator+)下在120℃辐照30min。在冷却至室温后，将所述反应混合物倾倒在水(200ml)中并搅拌最少30min。将得到的沉淀物过滤出来，用水洗涤[5x]，空气干燥，得到最终产物VI。如果纯度低于95％，则将所述物质通过MPLC(SiO2，DCM，10％氨化甲醇)或通过制备反相HPLC进行纯化。所有物质通过LCMS分析(ESI)来确认。
对于化合物B3来说，使用下述修改的程序A’来代替实施例10的通用程序A：
通用程序A’：
Figure BPA0000282270360001581
在25℃下，向2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酸IV(1.0当量)和苯胺/杂芳基胺(1.1当量)的混合物添加作为在乙酸乙酯中的50％溶液的T3P(1.2当量)和N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(2.0当量)。将反应混合物在100℃搅拌16h。在冷却至室温后，将所述反应混合物倾倒在水(200ml)中并搅拌最少30min。将得到的沉淀物过滤出来，用水洗涤[5x]，空气干燥，得到作为浅棕色至深棕色粉末的相应的酰胺，其不需进一步纯化直接用于下一步骤中。所有物质通过LCMS分析(ESI)来确认。
并且使用下述修改的程序B”来代替实施例10的通用程序B：
通用程序B”：
Figure BPA0000282270360001582
在25℃下，向氯代嘧啶衍生物V(1.0当量)在正丁醇(2ml)中的悬液添加胺HNR1R2(5.0当量)和N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(0.4当量)。将试管密封并在微波条件(BiotageInitiator+)下在120℃辐照30min。在冷却至室温后，将所述反应混合物倾倒在水(200ml)中并搅拌最少30min。将得到的沉淀物过滤出来，用水洗涤[5x]，空气干燥，得到最终产物VI。如果纯度低于95％，则将所述物质通过MPLC(SiO2，DCM，10％氨化甲醇)或通过制备反相HPLC进行纯化。所有物质通过LCMS分析(ESI)来确认。
表A4中示出的化合物如下文表3中所阐述的进行表征。
表3：式I/本发明的其他小分子的合成
Figure BPA0000282270360001591
Figure BPA0000282270360001601
使用如上所述用于SIK1、SIK2或SIK3活性的生物化学测定法，确定表3中合成的化合物针对SIK1、SIK2和SIK3中每一者以及针对ABL1和SRC的指示性IC50(由ProQinase，Freiburg Germany提供的自由选择激酶测定法)，并示出在表4中。
表4：式I/本发明的其他小分子的生物活性
Figure BPA0000282270360001602
Figure BPA0000282270360001611
****＝＜0.1uM；***＝＞0.1uM；**＝＞0.5uM；*＝＞1.0uM；～＝＞5.0uM；ND＝未确定
简单来说，将放射性测量的蛋白激酶测定法(
Figure BPA0000282270360001612
活性测定法)用于测量所述五种蛋白激酶的激酶活性。所有激酶测定在来自于PerkinElmer(Boston，MA，USA)的96孔FlashPlatesTM中，在50ul反应体积中进行。反应混合物以下述顺序在四个步骤中移取：
●25ul测定缓冲液(标准缓冲液/[γ-33P]-ATP)
●10ul ATP溶液(在水中)
●5ul测试化合物(在10％DMSO)中
●20ul酶/底物混合物
所述用于所有蛋白激酶的测定法含有70mM HEPES-NaOH pH7.5，3mM MgCl2，3mMMnCl2，3uM原钒酸钠，1.2mM DTT，ATP(可变的浓度，对应于相应激酶的表观ATP-Km，参见表5)，[γ-33P]-ATP(每孔约8x 10^5cpm)，蛋白激酶(可变的量，参见表5)和底物(可变的量，参见表5)。
下述酶和底物的量被用于每个孔：
表5：用于所述测试蛋白激酶的测定法参数
Figure BPA0000282270360001613
*酶测定法最高摩尔浓度，暗示了排他性地含有100％活性酶的酶制备物
将所述反应混合物在30℃温育60分钟。所述反应用50ul 2％(v/v)H3PO4终止，将板中的溶液吸出并用200ul 0.9％(w/v)NaCl清洗两次。33Pi的掺入使用微孔板闪烁计数器(Microβ，Wallac)确定。所有测定法使用BeckmanCoulter/SAGIANTM Core System来进行。
实施例14：SIK家族超过相关激酶的抑制对于实现抗肿瘤免疫肿瘤学效果来说是关键的。
本发明人能够证实，本发明的抑制剂的肿瘤免疫肿瘤学效果由SIK家族成员、特别是SIK3介导。使用实施例9中描述的基于萤光素酶的肿瘤细胞生存力读出数据(例如用于图7G的)，在TNF(10ng/mL)和浓度在约10至100nM之间的泛SIK和ABL1&SRC抑制剂(化合物B1)存在下(圆圈)，与在单独的抑制剂存在下(正方形)相比，肿瘤细胞显示出提高的细胞毒性(图17A)。然而，相反，作为高效ABL1&SRC抑制剂但对SIK家族成员(特别是SIK3)具有低抑制活性的化合物B8与TNF的组合(圆圈)，与单独的抑制剂(正方形)相比，在这种浓度范围下未能表现出M579A2细胞的细胞毒性(图17B)。事实上，与TNF相组合的化合物B4(圆圈)与单独的抑制剂(正方形)相比，在这种浓度范围下也未能表现出M579A2细胞的细胞毒性(图17C)，尽管化合物B4不仅是ABL1&SRC的高效抑制剂，而且也是SIK1和SIK2的强力抑制剂，但仅仅是SIK3的弱抑制剂。
合在一起，这些数据表明SIK家族成员、特别是SIK3而不是其他激酶ABL1或SRC，是抗肿瘤免疫肿瘤学效果的介导物。
实施例15：SIK1和SIK2但不是SIK3选择性化合物未能显示出抗肿瘤免疫肿瘤学效果
由本发明人进行的SIK家族成员特异性/选择性化合物的进一步分析提供了更多证据，表明SIK3的抑制对于式I的化合物实现抗肿瘤免疫肿瘤学效果来说是关键的，特别是在实施例14中示出的约20至100nM之间的浓度范围内。在实施例9中描述的M579-A2-luc测定法中，在这种浓度下，肿瘤细胞存活率(提高的RLU)仍然不受下述任一者影响：(a)与10ng/mL TNF相组合的化合物A11，所述化合物A11是强力SIK1和SIK2抑制剂，但是弱的SIK3抑制剂；或(b)与10ng/mL TNF相组合的化合物A6，所述化合物A6是强力SIK2抑制剂，但是弱的SIK3和弱的SIK1抑制剂。
这些数据与实施例14中示出的数据合在一起，进一步表明在SIK家族成员中，这些化合物的抗肿瘤免疫肿瘤学效果由SIK3抑制而不是SIK1或SIK2抑制来介导。
序列显示出：
SEQ ID NO.1(SIK3同工型1；UniProt标识符：Q9Y2K2-1，2017年3月15日的条目版本138)：
Figure BPA0000282270360001631
Figure BPA0000282270360001641
SEQ ID NO.2(SIK3同工型2；UniProt标识符：Q9Y2K2-2，2017年3月15日的条目版本138)：
Figure BPA0000282270360001642
SEQ ID NO.3(SIK3同工型3；UniProt标识符：Q9Y2K2-3，2017年3月15日的条目版本138)：
Figure BPA0000282270360001643
Figure BPA0000282270360001651
SEQ ID NO.4(SIK3同工型4；UniProt标识符：Q9Y2K2-4，2017年3月15日的条目版本138)：
Figure BPA0000282270360001652
Figure BPA0000282270360001661
SEQ ID NO.5(SIK1；UniProt标识符：P57059-1)：
Figure BPA0000282270360001662
Figure BPA0000282270360001671
SEQ ID NO.6(SIK2；UniProt标识符：Q9H0K1-1)：
Figure BPA0000282270360001672
SEQ ID NO.7(SIK3 siRNA s1)：
Figure BPA0000282270360001673
SEQ ID NO.8(SIK3 siRNA s2)：
Figure BPA0000282270360001681
SEQ ID NO.9(SIK3 siRNA s3)：
Figure BPA0000282270360001682
SEQ ID NO.10(SIK3 siRNA s4)：
Figure BPA0000282270360001683
SEQ ID NO.11(SIK3 shRNA shSIK3)：
Figure BPA0000282270360001684
SEQ ID NO.12(对照shRNA shCtrl)：
Figure BPA0000282270360001685
SEQ ID NO.13(SIK3经典序列/同工型1；UniProt标识符：Q9Y2K2-5，2018年3月28日的条目版本144)：
Figure BPA0000282270360001686
Figure BPA0000282270360001691
SEQ ID NO.14(SIK3同工型2；UniProt标识符：Q9Y2K2-6，2018年3月28日的条目版本144)：
Figure BPA0000282270360001692
Figure BPA0000282270360001701
SEQ ID NO.15(SIK3同工型3；UniProt标识符：Q9Y2K2-7，2018年3月28日的条目版本144)：
Figure BPA0000282270360001702
SEQ ID NO.16(SIK3同工型4；UniProt标识符：Q9Y2K2-8，2018年3月28日的条目版本144)：
Figure BPA0000282270360001711
Figure IPA0000282270300000011
Figure IPA0000282270300000021
Figure IPA0000282270300000031
Figure IPA0000282270300000041
Figure IPA0000282270300000051
Figure IPA0000282270300000061
Figure IPA0000282270300000071
Figure IPA0000282270300000081
Figure IPA0000282270300000091
Figure IPA0000282270300000101
Figure IPA0000282270300000111
Figure IPA0000282270300000121
Figure IPA0000282270300000131
Figure IPA0000282270300000141
Figure IPA0000282270300000151
Figure IPA0000282270300000161
Figure IPA0000282270300000171
Figure IPA0000282270300000181
Figure IPA0000282270300000191
Figure IPA0000282270300000201
Figure IPA0000282270300000211
Figure IPA0000282270300000221
Figure IPA0000282270300000231
Figure IPA0000282270300000241
Figure IPA0000282270300000251
Figure IPA0000282270300000261
Figure IPA0000282270300000271
Figure IPA0000282270300000281
Figure IPA0000282270300000291
Figure IPA0000282270300000301
Figure IPA0000282270300000311
Figure IPA0000282270300000321
Figure IPA0000282270300000331
Figure IPA0000282270300000341
Figure IPA0000282270300000351
Figure IPA0000282270300000361
Figure IPA0000282270300000371
Figure IPA0000282270300000381
Figure IPA0000282270300000391
Figure IPA0000282270300000401
Figure IPA0000282270300000411
Figure IPA0000282270300000421
Figure IPA0000282270300000431
Figure IPA0000282270300000441
Figure IPA0000282270300000451
Figure IPA0000282270300000461
Figure IPA0000282270300000471
Figure IPA0000282270300000481
Figure IPA0000282270300000491
Figure IPA0000282270300000501
Figure IPA0000282270300000511
Figure IPA0000282270300000521
Figure IPA0000282270300000531
Figure IPA0000282270300000541
Figure IPA0000282270300000551
Figure IPA0000282270300000561
Figure IPA0000282270300000571
Figure IPA0000282270300000581
Figure IPA0000282270300000591
Figure IPA0000282270300000601
Figure IPA0000282270300000611
Figure IPA0000282270300000621
Figure IPA0000282270300000631

Claims (60)

1.一种SIK3抑制剂，其用途在于治疗受试者的增殖性障碍，其中所述治疗涉及抑制SIK3并使与所述增殖性障碍有关的细胞对细胞介导的免疫应答敏感，所述治疗包括向所述受试者施用所述SIK3抑制剂。
2.权利要求1的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂以有效降低SIK3、优选为与所述增殖性障碍有关的细胞中的SIK3的活性的治疗有效量进行施用。
3.权利要求1或2的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂以不有效降低ABL1和/或SRC激酶、优选为与所述增殖性障碍有关的细胞中的ABL1和/或SRC激酶的活性的治疗有效量进行施用。
4.权利要求1至3中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述治疗包括所述细胞介导的免疫应答诱导与所述增殖性障碍有关的细胞的杀死。
5.权利要求1至4中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂被施用到所述受试者，以使与所述增殖性障碍有关的细胞对TNF诱导的杀死敏感。
6.权利要求1至5中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述治疗通过抑制SIK3来介导，并且其中所述治疗不通过抑制Abl和/或SRC激酶来介导。
7.权利要求1至6中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述治疗包括抑制与所述增殖性障碍有关的细胞中的SIK3，优选地其中所述SIK3的活性被降低；并且其中所述治疗包括不抑制与所述增殖性障碍有关的细胞中的ABL和/或SRC，优选地其中所述ABL1和/或SRC的活性不被降低。
8.权利要求1至7中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中将与所述增殖性障碍有关的细胞暴露于TNF和/或TNFR1信号传导的激动剂。
9.权利要求1至8中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中：(x)所述受试者的特征在于TNF的血浆浓度大于约5pg/mL；和/或(y)所述增殖性障碍是实体肿瘤，其特征在于在所述受试者中TNF的肿瘤内浓度大于约1pg/mL。
10.一种SIK3抑制剂，其用途在于治疗受试者的增殖性障碍，所述治疗包括将所述受试者中与所述增殖性障碍有关的细胞暴露于：(i)TNF和/或TNFR1信号传导的激动剂；和(ii)所述SIK3抑制剂。
11.权利要求10的用途的SIK3抑制剂，其中所述受试者中与所述增殖性障碍有关的细胞暴露到的TNF的量被提高。
12.权利要求10或11的用途的SIK3抑制剂，其中：(i)将TNF或TNFR1信号传导的激动剂施用到所述受试者；(ii)将能够引起或引起与所述增殖性障碍有关的细胞暴露到TNF或TNFR1信号传导的激动剂的药剂施用到所述受试者；或(iii)通过提高所述受试者的血浆中和/或与所述增殖性障碍有关的细胞的环境中TNF的量的药物、治疗或其他程序，引起此类细胞暴露于TNF。
13.权利要求10至12中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述治疗包括将所述SIK3抑制剂施用到所述受试者。
14.权利要求10至13中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述治疗包括将所述SIK3抑制剂以有效抑制SIK3、特别是与所述增殖性障碍有关的细胞中的SIK3的治疗有效量施用到所述受试者。
15.权利要求10至14中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述治疗包括将所述SIK3抑制剂以不有效抑制ABL和/或SRC、特别是与所述增殖性障碍有关的细胞中的ABL和/或SRC的治疗有效量施用到所述受试者。
16.权利要求10至15中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述治疗包括将TNF或所述TNFR1信号传导的激动剂施用到所述受试者。
17.权利要求10至15中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述治疗包括将能够引起或引起与所述增殖性障碍有关的细胞暴露到TNF或TNFR1信号传导的激动剂的药剂施用到所述受试者。
18.权利要求10至15中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中与所述增殖性障碍有关的细胞向TNF的暴露由提高所述受试者的血浆中和/或这类细胞的环境中TNF的量的药物、治疗或其他程序引起。
19.权利要求18的用途的SIK3抑制剂，其中所述药物、治疗或其他程序包含癌症免疫疗法和/或放疗。
20.权利要求1至19中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述受试者的特征在于具有以SIK3的表达和/或活性为特征的与所述增殖性障碍有关的细胞，具体来说此类细胞表达SIK3的mRNA和/或蛋白，和/或对这种SIK3表达和/或活性阳性。
21.权利要求1至20中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述增殖性障碍是肿瘤，特别是实体肿瘤。
22.权利要求21的用途的SIK3抑制剂，其中所述受试者的特征在于以前已用免疫疗法治疗过，并且其肿瘤已经进展，特别是其肿瘤复发、重现或没有反应。
23.权利要求21或22的用途的SIK3抑制剂，其中所述受试者的特征在于具有进展、特别是复发、重现或对先前的放疗没有反应的肿瘤。
24.一种SIK3抑制剂，其用途在于治疗以在正用抗TNF药剂治疗的受试者中降低发生作为继发性障碍的血液增殖性障碍的风险，所述治疗包括向所述受试者施用所述SIK3抑制剂。
25.权利要求24的用途的SIK3抑制剂，其中所述受试者患有自体免疫障碍和/或所述受试者正用所述抗TNF药剂治疗自体免疫障碍，优选为选自类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、斑块型银屑病和克罗恩病的自体免疫障碍，最优选为类风湿性关节炎。
26.权利要求1至25中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂是SIK3特异性抑制剂。
27.权利要求1至26中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂比抑制ABL1和/或SRC激酶更强力地抑制SIK3，并且其中所述SIK3抑制剂比抑制SIK2更强力地抑制SIK3。
28.权利要求1至27中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂是抑制性核酸。
29.权利要求1至27中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂是小分子，特别是小分子配体或细胞渗透性小分子。
30.权利要求1至27中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂是下式I的环状化合物及其盐、前体药物、溶剂化物和立体异构体：
Figure FDA0002414605410000041
其中：
Q是：
(1)5员杂芳基环；
(2)6员杂芳基环；或
(3)芳基环；
其任选地被一个或多个基团R1取代；
Z是：
(1)单键；
(2)-R16C＝CH-；或
(3)-(CH2)m-，其中m是1至2；
X1和X2各自是氢或合在一起形成＝O或＝S；
R1是：
(1)氢或R6，
其中R6是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、环烯基烷基、芳基、芳烷基、杂环,或杂环烷基，其各自是未取代的或者被Z1、Z2和一个或多个(优选地一个或两个)基团Z3取代；
(2)-OH或-OR6；
(3)-SH或-SR6；
(4)-C(O)2H、-C(O)qR6或-O-C(O)qR6，其中q是1或2；
(5)-SO3H或-S(O)qR6；
(6)卤素；
(7)氰基；
(8)硝基；
(9)-Z4-NR7R8；
(10)-Z4-N(R9)-Z5-NR10R11；
(11)-Z4-N(R12)-Z5-R6；
(12)-P(O)(OR6)2；
R2和R3各自独立地是：
(1)氢或R6；
(2)-Z4-R6；或
(3)-Z13-NR7R8；
R4和R5：
(1)各自独立地是氢或R6；
(2)-Z4-N(R9)-Z5-NR10R11；
(3)-N(R9)Z4R6；或
(4)与它们附连到的氮原子一起完成未取代的或被Z1、Z2和Z3取代的3至8员饱和或不饱和杂环，所述杂环可以任选地稠合有本身未取代的或被Z1、Z2和Z3取代的苯环；
R7、R8、R9、R10、R11和R12：
(1)各自独立地是氢或R6；
(2)R7和R8可以合在一起成为亚烷基、亚烯基或杂烷基，其与它们附连到的氮原子完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；或
(3)R9、R10和R11中的任两者可以合在一起成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的氮原子完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；
R13是：
(1)氰基；
(2)硝基；
(3)-NH2；
(4)-NHO烷基；
(5)-OH；
(6)-NHO芳基；
(7)-NHCOO烷基；
(8)-NHCOO芳基；
(9)-NHSO2烷基；
(10)-NHSO2芳基；
(11)芳基；
(12)杂芳基；
(13)-O烷基；或
(14)-O芳基；
R14是：
(1)-NO2；
(2)-COO烷基；或
(3)-COO芳基；
R15是：
(1)氢；
(2)烷基；
(3)芳基；
(4)芳基烷基；或
(5)环烷基；
Z1、Z2和Z3各自独立地是：
(1)氢或Z6，其中Z6是(i)烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、环烯基烷基、芳基、芳烷基、烷基芳基、环烷基芳基、杂环或杂环烷基；(ii)本身被一个或多个相同或不同的基团(i)取代的基团(i)；或(iii)被一个或多个Z1、Z2和Z3的定义的下述基团(2)至(16)取代的基团(i)或(ii)；
(2)-OH或-OZ6；
(3)-SH或-SZ6；
(4)-C(O)qH、-C(O)qZ6或-O-C(O)qZ6；
(5)-SO3H、-S(O)qZ6或S(O)qN(Z9)Z6；
(6)卤素；
(7)氰基；
(8)硝基；
(9)-Z4-NZ7Z8；
(10)-Z4-N(Z9)-Z5-NZ7Z8；
(11)-Z4-N(Z10)-Z5-Z6；
(12)-Z4-N(Z10)-Z5-H；
(13)氧代；
(14)-O-C(O)-Z6；
(15)Z1、Z2和Z3中的任两者可以合在一起成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的原子一起完成3至8员饱和或不饱和环；或
(16)Z1、Z2和Z3中的任两者可以合在一起成为-O-(CH2)r-O-，其中r是1至5，其与它们附连到的原子一起完成4至8员饱和或不饱和环；
Z4和Z5各自独立地是：
(1)单键；
(2)-Z11-S(O)q-Z12-；
(3)-Z11-C(O)-Z12；
(4)-Z11-C(S)-Z12-；
(5)-Z11-O-Z12-；
(6)-Z11-S-Z12-；
(7)-Z11-O-C(O)-Z12；或
(8)-Z11-C(O)-O-Z12-；
Z7、Z8、Z9和Z10：
(1)各自独立地是氢或Z6；
(2)Z7和Z8或Z6和Z10可以合在一起成为亚烷基或亚烯基,其与它们附连到的原子一起完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；或
(3)Z7或Z8与Z9一起可以成为亚烷基或亚烯基，其与它们附连到的氮原子完成3至8员饱和或不饱和环，所述环是未取代的或被Z1、Z2和Z3取代；
Z11和Z12各自独立地是：
(1)单键；
(2)亚烷基；
(3)亚烯基；或
(4)亚炔基；并且
Z13是：
(1)单键；
(2)-Z11-S(O)q-Z12-；
(3)-Z11-C(O)-Z12；
(4)-Z11-C(S)-Z12-；
(5)-Z11-O-Z12-；
(6)-Z11-S-Z12-；
(7)-Z11-O-C(O)-Z12-；
(8)-Z11-C(O)-O-Z12-；
(9)-C(NR13)-；
(10)-C(CHR14)-；或
(11)-C(C(R14)2)-。
其中：
Q是噻唑；
Z是单键；
R1是氢；
X1和X2合在一起形成＝O；
R2是氢；
R3是-Z4-R6，其中Z4是单键，并且R6是未取代的或被Z1、Z2和一个、两个或更多个基团Z3取代的芳基或杂芳基；并且
R4是氢，
其中，所述式I的环状化合物具有下式II：
Figure FDA0002414605410000091
其中
n是1；
A是氮；
B是硫；
X3是氧；
R1是氢；
R2是氢；
R4是氢；并且
R3是Rx，其中Rx具有下式X：
Figure FDA0002414605410000092
其中式X的Z1、Z2和Z3如上所定义。
31.权利要求30的用途的SIK3抑制剂，其中在式X中：
Z1是甲基；
Z2是-Z4-NZ7Z8、-Z4-N(Z9)-Z5-NZ7Z8或Z4-N(Z10)-Z5-H；其中Z4和Z5至Z10如本文中所定义，特别地其中Z4是单键；并且
Z3是氢。
32.权利要求30或31的用途的SIK3抑制剂，其中：式X中的Z2是选自下述的取代基：
Figure FDA0002414605410000101
33.权利要求30至32中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中式II的R4是氢并且式II的R5是R6，其中R6是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、环烯基烷基、芳基、芳烷基、杂环、杂芳基或杂环烷基，其各自是未取代的或被Z1、Z2和一个、两个或更多个基团Z3取代，其中Z1、Z2和Z3如上所定义；优选地其中R6是芳基、芳烷基、杂环或杂环烷基，其各自是未取代的或被Z1、Z2和一个、两个或更多个基团Z3取代，其中Z1、Z2和Z3如上所定义。
34.权利要求33的用途的SIK3抑制剂，其中R6是芳基或杂芳基，其各自是未取代的或被Z1、Z2和一个、两个或更多个基团Z3取代，其中Z1、Z2和Z3如上所定义；并且其中R6是被一个、两个或三个Zx取代的单环芳基或杂芳基，并且至少一个Zx在所述单环芳基或杂芳基上的邻位处；其中每个Zx可以独立地是：(i)Zy，其中Zy是C1、C2或C3烷基、烯基或炔基；(ii)–OH或-OZy；(iii)–SH或–SZy；(iv)卤素；或(v)–SO2-Zy或–SO2-N-(Zy)(Zy)。
35.权利要求34的用途的SIK3抑制剂，其中R6是任选地被一个、两个或三个Zx取代的苯基；特别地其中一个Zx在所述苯基的邻位处取代；和/或特别地其中每个Zx独立地选自-Cl、-F、-Br、-Me、-OMe、-OEt和-CN(优选地选自-Cl、-F、-Me和-Br)。
36.权利要求34的用途的SIK3抑制剂，其中所述R6是单环杂芳基。
37.权利要求36的用途的SIK3抑制剂，其中所述单环杂芳基R6是吡啶基，优选为吡啶-2-基，或更优选为吡啶-3-基，其中所述单环杂芳基任选地被一个、两个或三个Zx取代；特别地其中一个Zx在所述吡啶基的邻位处取代；和/或特别地其中每个Zx独立地选自-Cl、-F、-Br、-Me、-OMe、-OEt和-CN(优选地选自-Cl、-F、-Me和-Br)。
38.权利要求30至35中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中当在通式II中n是1，A是氮，B是硫，X3是氧，R1是氢，R2是氢，R4是氢，R5是R6并且R6是：
·在邻位处被-Cl取代的苯基时，则(x)另一个邻位是氢或不是甲基的Zx，特别地是-Cl、-F、-Br、-OMe、-OEt或-CN的Zx，并且所述间位或对位中的至少一者被如上所定义的Zx取代；或(y)另一个邻位是甲基，并且所述间位或对位中的至少两者被Zx取代；或(z)R3不是式Y；或
·在邻位处被甲基取代的苯基时，则(x)另一个邻位是氢或不是-Cl的Zx，特别地是-F、-Br、-Me、-OMe、-OEt或-CN的Zx，并且所述间位或对位中的至少一者被如上所定义的Zx取代；或(y)另一个邻位是-Cl，并且所述间位或对位中的至少两者被Zx取代；或(z)R3不是式Y。
39.权利要求1至27中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂是选自下述的环状化合物：
Figure FDA0002414605410000111
及其溶剂化物、盐、络合物、立体异构体、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物及其组合。
40.权利要求1至27中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂是环状化合物：
Figure FDA0002414605410000121
及其溶剂化物、盐、络合物、立体异构体、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物及其组合。
41.权利要求1至27中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂是环状化合物：
Figure FDA0002414605410000122
及其溶剂化物、盐、络合物、立体异构体、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物及其组合。
42.权利要求1至27中任一项的用途的SIK3抑制剂，其中所述SIK3抑制剂是环状化合物：
Figure FDA0002414605410000123
及其溶剂化物、盐、络合物、立体异构体、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物及其组合；优选地其中这些SIK3抑制剂比SIK3更强力地抑制SIK2并且比SIK1更强力地抑制SIK3。
43.如权利要求36中所述的环状化合物，及其溶剂化物、盐、络合物、立体异构体、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物及其组合。
44.如权利要求42中所述的环状化合物，及其溶剂化物、盐、络合物、立体异构体、多晶型物、晶体形式、消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、同位素标记形式、前体药物及其组合。
45.一种确定受试者是否患有与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关的增殖性障碍例如肿瘤或是否具有发生所述增殖性障碍例如肿瘤的风险的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)检测来自于所述受试者的生物样品中的适用生物标志物；
其中所述样品中所述适用生物标志物的检测指示了所述受试者中的所述增殖性障碍或发生所述增殖性障碍的风险；并且
其中所述适用生物标志物是选自下述的一者或多者：
·SIK3，特别是SIK3、优选为磷酸化SIK3的存在(或量)或表达和/或活性；
·HDAC4，特别是磷酸化HDAC4、优选为所述样品中包含的细胞的细胞质中的磷酸化HDAC4的存在(或量)或表达和/或活性；
·TNFR1，特别是TNFR1的存在(或量)或表达和/或活性；和
·LKB1，特别是LKB1、优选为磷酸化LKB1的存在(或量)或表达和/或活性。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述适用生物标志物的检测包括确定所述样品中、特别是包含在所述样品中的细胞的细胞质中磷酸化HDAC4的存在或量或其活性。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其还包括确定所述样品中TNF的存在或量的步骤，其中所述样品中TNF的存在或量指示了所述受试者中与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关和/或与SIK3的表达或活性相关的增殖性障碍或发生所述增殖性障碍的风险；并且其中：(i)在来自于所述受试者的血浆样品中TNF的血浆浓度大于约5pg/mL；和/或(ii)在来自于所述受试者的组织样品中TNF的肿瘤内浓度大于约1pg/mL，指示了所述受试者中与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关的增殖性障碍或发生所述增殖性障碍的风险。
48.一种确定受试者是否患有与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关并且与SIK3的表达或活性相关的疾病、障碍或病症或具有发生所述疾病、障碍或病症的风险的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)将所述受试者的怀疑与所述疾病、障碍或病症有关的细胞与SIK3抑制剂在细胞介导的免疫应答存在下进行接触，所述细胞介导的免疫应答是(i)选自淋巴细胞、T-细胞、CTL和TIL的免疫细胞；或(ii)促炎性细胞因子，特别是TNF；并且
(b)确定针对所述受试者的这些细胞的细胞介导的免疫应答，
其中针对所述受试者的这些细胞的细胞介导的免疫应答的增强指示所述受试者患有此类疾病、障碍或病症或具有发生此类疾病、障碍或病症的风险。
49.一种能够特异性结合到SIK3或HDAC4的抗原结合蛋白(ABP)在受试者中增殖性疾病、障碍或病症的体外诊断中的用途，其中所述增殖性疾病、障碍或病症与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关，并且与SIK3的表达或活性相关。
50.根据权利要求49所述的用途，其中所述ABP能够特异性结合到磷酸化SIK3。
51.根据权利要求49所述的用途，其中所述ABP能够特异性结合到磷酸化HDAC4。
52.一种药剂盒在受试者中增殖性疾病、障碍或病症的体外诊断中的用途，其中所述增殖性疾病、障碍或病症与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关并且与SIK3的表达或活性相关，其中所述药剂盒包含：(a)(x)能够特异性结合到SIK3或HDAC4的核酸，或(y)特异性结合到SIK3或HDAC4的ABP；和(b)任选的(i)描述如何使用所述ABP或核酸或药剂盒来检测从受试者获得的样品中的SIK3活性的说明书；和/或(ii)对所述药剂盒的使用或所述样品中SIK3活性的检测有用的一种或多种其他物品、组分、试剂或其他工具。
53.一种在诊断方法中使用的药剂盒，所述诊断方法用于确定受试者是否患有与针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性相关并且与SIK3的表达或活性相关的疾病、障碍或病症或具有发生所述疾病、障碍或病症的风险；
其中：
·所述诊断方法包括通过手术从所述受试者获得样品的步骤；并且
·所述药剂盒包含：(a)(x)能够特异性结合到SIK3或HDAC4的核酸，或(y)特异性结合到SIK3或HDAC4的ABP；和(b)任选的(i)描述如何使用所述ABP或核酸或药剂盒来检测所述样品中的SIK3活性的说明书；和/或(ii)对所述药剂盒的使用或所述样品中SIK3活性的检测有用的一种或多种其他物品、组分、试剂或其他工具。
54.权利要求45至48中任一项所述的方法、权利要求49至52中任一项所述的用途或权利要求53所述的药剂盒，其中所述疾病、障碍或病症适合于和/或被确定为适合于用SIK3抑制剂治疗，或所述受试者的特征在于适合于用SIK3抑制剂治疗。
55.权利要求45至48或54中任一项所述的方法、权利要求49至52或54中任一项所述的用途或权利要求53或54所述的药剂盒，其中所述受试者的特征在于以前已用免疫疗法治疗过，并且其肿瘤已经进展，特别是其肿瘤复发、重现或没有反应。
56.权利要求45至48、54或55中任一项所述的方法、权利要求49至52、54或55中任一项所述的用途或权利要求53至55中任一项的用途的药剂盒，其中所述受试者的特征在于以前已用放疗治疗过，并且其肿瘤已经进展，特别是其肿瘤复发、重现或没有反应。
57.一种鉴定和/或表征适用于治疗以针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性为特征并且以SIK3的表达或活性为特征的疾病、障碍或病症的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)使表达SIK3的第一细胞与(i)候选化合物或(ii)候选化合物和细胞介导的免疫应答发生接触；并且
(b)确定(i)所述第一细胞中SIK3(特别是磷酸化SIK3)的(例如蛋白质或mRNA)的表达、活性、功能和/或稳定性；和/或(ii)所述细胞介导的免疫应答针对所述第一细胞的细胞毒性，
其中：(i)与不接触所述候选化合物的所述第一细胞相比，接触所述候选化合物的所述第一细胞中所述SIK3的降低的表达、活性、功能和/或稳定性，和/或(ii)与所述细胞介导的免疫应答针对不接触所述候选化合物的所述第一细胞的细胞毒性相比，所述细胞介导的免疫应答针对接触所述候选化合物的所述第一细胞的提高的细胞毒性，指示了所述候选化合物是适用于治疗以针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性为特征并且以SIK3的表达或活性为特征的疾病、障碍或病症的化合物。
58.一种鉴定和/或表征适用于治疗以针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性为特征的疾病、障碍或病症的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)使表达SIK3的第一细胞与所述候选化合物发生接触；并且
(b)确定：
(i)所述第一细胞中SIK3、特别是磷酸化SIK3的蛋白质或mRNA的表达、活性、功能和/或稳定性；和
(ii)细胞介导的免疫应答针对所述第一细胞的细胞毒性，
其中：
(i)与不接触所述候选化合物的所述第一细胞相比，接触所述候选化合物的所述第一细胞中所述SIK3的降低的表达、活性、功能和/或稳定性；和
(ii)与所述细胞介导的免疫应答针对不接触所述候选化合物的所述第一细胞的细胞毒性相比，所述细胞介导的免疫应答针对接触所述候选化合物的所述第一细胞的提高的细胞毒性；
指示了所述候选化合物是适用于治疗以针对细胞介导的免疫应答的细胞抗性为特征和/或以SIK3的表达或活性为特征的疾病、障碍或病症的化合物；并且
其中所述细胞介导的免疫应答是：(x)促炎性细胞因子，特别是TNF；或(y)第二细胞，其是免疫识别所述第一细胞的细胞毒性免疫细胞，特别是CTL。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述细胞介导的免疫应答是促炎性细胞因子，特别是TNF。
60.根据权利要求58或59所述的方法，其中所述第一细胞是与增殖性障碍、特别是肿瘤有关的细胞。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021243904A1 (zh) * 2020-06-03 2021-12-09 广州康立明生物科技股份有限公司 一种基因标志物组合及其应用
CN114159568A (zh) * 2020-09-11 2022-03-11 北京原基华毅生物科技有限公司 Sik抑制剂在制备用于预防和/或治疗睡眠障碍的药物中的应用
CN114948860A (zh) * 2022-05-06 2022-08-30 东南大学 一种超分子水凝胶纳米材料、凝胶因子及其制法和应用

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12139480B2 (en) 2018-04-20 2024-11-12 Iomx Therapeutics Ag 5-thiazolecarboxamide kinase inhibitor and uses thereof
EP3643713B1 (en) * 2018-10-23 2025-07-30 iOmx Therapeutics AG Heterocyclic kinase inhibitors and uses thereof
KR102256804B1 (ko) * 2019-02-26 2021-05-26 한국화학연구원 N-페닐-2-(피리미딘-4-일아미노)티아졸-5-카복사미드 유도체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 이를 유효성분으로 함유하는 미백 소재 조성물
CN110396543A (zh) * 2019-04-30 2019-11-01 广州普世利华科技有限公司 一种肿瘤相关基因突变位点筛查方法
CN112409349A (zh) * 2019-08-20 2021-02-26 湖南华纳大药厂股份有限公司 激酶抑制剂及其制备、药物组合物和用途
CN112402422A (zh) * 2019-08-20 2021-02-26 湖南华纳大药厂股份有限公司 氟取代的2-氨基噻唑-5-芳香族甲酰胺的用途
EP3901151A1 (en) * 2020-04-21 2021-10-27 iOmx Therapeutics AG Halogenated-heteroaryl and other heterocyclic kinase inhibitors, and uses thereof
AU2021262482A1 (en) 2020-04-28 2023-01-05 Iomx Therapeutics Ag Bicyclic kinase inhibitors and uses thereof
WO2022197317A1 (en) * 2021-03-19 2022-09-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for treatment of ovarian and breast cancer
KR20240115232A (ko) * 2021-10-19 2024-07-25 아이오엠엑스 테라퓨틱스 아게 Sik3 억제제 및 이의 중간체를 제조하기 위한 합성 반응식 및 과정
KR20230084416A (ko) * 2021-12-03 2023-06-13 연세대학교 산학협력단 Wnk3 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역관문 억제용 조성물
EP4257609A1 (en) 2022-04-08 2023-10-11 iOmx Therapeutics AG Combination therapies based on pd-1 inhibitors and sik3 inhibitors
EP4257132A1 (en) 2022-04-08 2023-10-11 iOmx Therapeutics AG Sik3 inhibitors for treating diseases resistant to death receptor signalling
AU2023260858A1 (en) 2022-04-29 2024-11-21 Incozen Therapeutics Pvt. Ltd. A dual selective pi3k delta and gamma inhibitors and/or a salt-inducible kinase 3 inhibitor for treating solid tumors
CN116813608B (zh) * 2023-06-08 2024-03-22 英矽智能科技(上海)有限公司 噻唑类化合物及其应用
WO2025157389A1 (en) 2024-01-22 2025-07-31 Iomx Therapeutics Ag Combinations of halogenated heterocyclic kinase inhibitors and vegfr inhibitors
WO2025229127A1 (en) 2024-04-30 2025-11-06 Iomx Therapeutics Ag A halogenated-heteroaryl kinase inhibitor for treating soft tissue sarcoma and vascular tumors
EP4643861A1 (en) 2024-04-30 2025-11-05 iOmx Therapeutics AG A halogenated-heteroaryl kinase inhbitor for treating soft tissue sarcoma and vascular tumors

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6002008A (en) * 1997-04-03 1999-12-14 American Cyanamid Company Substituted 3-cyano quinolines
CN1764454A (zh) * 2003-03-24 2006-04-26 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 蛋白酪氨酸激酶的环状抑制剂
US20140302172A1 (en) * 2011-08-16 2014-10-09 Evotec (München) Gmbh Markers for susceptibility to an inhibitor of an src-family kinase
US20160081989A1 (en) * 2012-12-14 2016-03-24 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted 1 H-Pyrrolo [2, 3-b] pyridine and 1 H-Pyrazolo [3, 4-b] pyridine Derivatives as Salt Inducible Kinase 2 (SIK2) Inhibitors

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2391550T3 (es) 1999-04-15 2012-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Inhibidores cíclicos de la proteína tirosina quinasa
US7491725B2 (en) 2004-02-06 2009-02-17 Bristol-Myers Squibb Company Process for preparing 2-aminothiazole-5-aromatic carboxamides as kinase inhibitors
US9180105B2 (en) 2010-03-08 2015-11-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research CDC7 kinase inhibitors and uses thereof
US8907053B2 (en) 2010-06-25 2014-12-09 Aurigene Discovery Technologies Limited Immunosuppression modulating compounds
GB201204384D0 (en) 2012-03-13 2012-04-25 Univ Dundee Anti-flammatory agents
BR112014029417B1 (pt) 2012-05-25 2023-03-07 Cellectis Método ex vivo para a preparação de células t para imunoterapia
EA201591794A1 (ru) 2013-03-15 2015-12-30 Онкодизайн С.А. Макроциклические ингибиторы соль-индуцируемых киназ
DK3309248T3 (da) 2013-05-29 2021-08-02 Cellectis Fremgangsmåde til manipulering af T-celler til immunterapi under anvendelse af et RNA-guidet CAS-nuklease-system
WO2015006492A1 (en) 2013-07-09 2015-01-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Kinase inhibitors for the treatment of disease
US10448578B2 (en) 2014-07-21 2019-10-22 The Penn State Research Foundation Selective automated blossom thinning
WO2016014551A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Macrocyclic kinase inhibitors and uses thereof
CA2954186A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Imidazolyl kinase inhibitors and uses thereof
CA2955082A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Uses of salt-inducible kinase (sik) inhibitors
GB201504314D0 (en) 2015-03-13 2015-04-29 Univ Dundee Small molecules
AU2016252038B2 (en) 2015-04-20 2021-08-12 Effector Therapeutics, Inc. Inhibitors of immune checkpoint modulators for use in treating cancer and infections
WO2017042944A1 (ja) 2015-09-10 2017-03-16 国立大学法人山梨大学 フィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の治療薬又は治療方法
PT3436079T (pt) 2016-04-01 2021-10-06 Kite Pharma Inc Recetores de antigénios quiméricos e de células t e métodos de uso

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6002008A (en) * 1997-04-03 1999-12-14 American Cyanamid Company Substituted 3-cyano quinolines
CN1764454A (zh) * 2003-03-24 2006-04-26 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 蛋白酪氨酸激酶的环状抑制剂
US20140302172A1 (en) * 2011-08-16 2014-10-09 Evotec (München) Gmbh Markers for susceptibility to an inhibitor of an src-family kinase
US20160081989A1 (en) * 2012-12-14 2016-03-24 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted 1 H-Pyrrolo [2, 3-b] pyridine and 1 H-Pyrazolo [3, 4-b] pyridine Derivatives as Salt Inducible Kinase 2 (SIK2) Inhibitors

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAROENFUPRASERT ET AL.: "Identification of salt-inducible kinase 3 as a novel tumor antigen associated with tumorigenesis of ovarian cancer", 《ONCOGENE》 *
CHEN ET AL.: "Salt-inducible kinase 3 is a novel mitotic regulator and a target for enhancing antimitotic therapeutic-mediated cell death", 《CELL DEATH DIS》 *
THOMAS ET AL.: "Small-molecule screening identifies inhibition of salt-inducible kinases as a therapeutic strategy to enhance immunoregulatory functions of dendritic cells", 《PROC NATL ACAD SCI US A》 *
缪建华主编: "《恶性肿瘤相关治疗临床应用解析》", 30 May 2016, 东南大学出版社 *
郑杰编著: "《肿瘤的细胞和分子生物学》", 31 January 2011, 上海科学技术出版社 *
陈宝安主编: "《恶性肿瘤多药耐药的逆转》", 30 November 2013, 东南大学出版社 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021243904A1 (zh) * 2020-06-03 2021-12-09 广州康立明生物科技股份有限公司 一种基因标志物组合及其应用
CN114159568A (zh) * 2020-09-11 2022-03-11 北京原基华毅生物科技有限公司 Sik抑制剂在制备用于预防和/或治疗睡眠障碍的药物中的应用
CN114948860A (zh) * 2022-05-06 2022-08-30 东南大学 一种超分子水凝胶纳米材料、凝胶因子及其制法和应用

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Publication number Publication date
SG11201909656YA (en) 2019-11-28
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US20250340886A1 (en) 2025-11-06
IL270040A (zh) 2019-12-31
US12338440B2 (en) 2025-06-24
US20210040486A1 (en) 2021-02-11
WO2018193084A8 (en) 2018-11-15
EP3391907B1 (en) 2020-01-01

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