CN111187268A - 作为Snail抑制剂的化合物CYD19或可药用的盐及其制备方法、药物组合物和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有式(I)结构的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或可药用的盐及其制备方法、药物组合物和用途。该化合物在制备用于预防或治疗与Snail表达异常的疾病中药物的应用。特别涉及该化合物在制备抗肿瘤和心血管药物中的应用。药理结果显示，该化合物与Snail蛋白高度亲和，具有良好的体外抗肿瘤细胞增殖作用、促细胞凋亡，抑制肿瘤转移作用。并且该化合物在HCT‑116皮下异种移植瘤裸鼠以及脾注射的体内肝转移模型中均表现出明显的体内抗肿瘤增殖和转移活性，是临床上可用于制备治疗肿瘤的潜在药物。
Description
技术领域
本发明涉及Snail抑制剂或其可药用的及其制备方法、药物组合物和用途，特别涉及一种作为Snail抑制剂的化合物CYD19或可药用的盐及其制备方法、药物组合物和用途。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的重大疾病，具有生长速度快，侵袭浸润能力强，且常有远处转移的特点。肿瘤细胞的异常增殖、凋亡抵抗以及侵袭转移等生物学特性，为肿瘤治疗带来严峻挑战。其中，肿瘤转移更是肿瘤难以治疗的关键因素之一，其最明显的特征是上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的发生。对于肿瘤细胞而言，EMT不仅赋予了肿瘤细胞迁移和入侵的能力，同时诱发了肿瘤细胞的干性特征。因此，深入研究可以多机制，协同有效治疗肿瘤的药物显得尤为重要。
Snail被认为是通过抑制E-cadherin蛋白诱导EMT的主要转录因子，具有高度保守的羧基末端C2H2的锌指结构，羧基末端和多变的氨基末端调节区。其中，Snail的锌指结构能够识别并结合E-cadherin蛋白启动子中E-box(5-CANNTG-3)区域，促进EMT的发生，与肿瘤转移相关。在乳腺癌，结肠癌的病变组织中，Snail的表达水平升高，肿瘤细胞中高表达snail可以抑制野生型p53的表达来对抗细胞凋亡并加速肿瘤细胞的生长。因此，鉴于转录因子在肿瘤细胞恶化进程中的作用，以其为药物靶标，靶向于多种肿瘤相关的信号转导通路从而消除肿瘤的恶性表型及其药物耐受是一种合理的抗肿瘤治疗策略，具有重要的研究价值。
然而，直接靶向Snail蛋白的小分子抑制剂尚未见报道，仅能通过一些间接手段抑制Snail的表达。目前，Park等报道过一类新型天然产物GN25，它主要是能够阻断HCT-116细胞中Snail与p53结合，并以K-Ras依赖方式诱导癌细胞中p53的表达，在A549细胞裸鼠模型体内并未表现出明显的抑制效果，限制了该类化合物的进一步开发。此外，一种不可逆的结合Snail的Co(III)-DNA复合体已经被证实能够选择抑制Snail转录，调控由Heregulinb1(HRG)诱导的MCF-7细胞转移过程，表现出一定的抗肿瘤转移的潜力，但机制研究尚不确定。因此，寻找新的作用机制的Snail抑制剂备受关注。
由于Snail是一种半衰期极短且不稳定的蛋白，在细胞质中，Snail易被蛋白酶体迅速降解，含量极低，Snail进入细胞核，其蛋白稳定性增加，从而发挥转录抑制功能，影响下游靶基因p21，Rb，MMP，caspase等表达，精细调控肿瘤的进程。Snail的蛋白稳定性不仅与细胞定位有关，蛋白翻译后修饰水平强烈影响其稳定性。Snail具有多种翻译后修饰形式，如乙酰化、磷酸化、泛素化等，其丰富的翻译后修饰水平共同调控了Snail的含量。HSU等研究证实，Snail可以与CBP(CREB Binding Protein，组蛋白乙酰基转移酶)/p300相互作用，使Snail蛋白赖氨酸146和赖氨酸187被乙酰化，乙酰化的Snail稳定性增加，泛素化作用减弱，增强下游多种细胞因子CCL2、IL8的转录。因此，阻断Snail与CBP/p300或泛素化连接酶等相关蛋白的相互作用可能是抑制肿瘤进展的有效策略，为肿瘤的治疗提供新的方向。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供作为Snail抑制剂的化合物N-(2-氨基-4-氟苯基)-4-[[[4-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]吡咯并[2，1-f][1，2，4]三嗪-2-基]硫]甲基]苯甲酰胺(以下简称CYD19)或可药用的盐。
本发明另一目的是提供所述作为Snail抑制剂的化合物CYD19或可药用的盐的制备方法。
本发明另一目的是提供所述作为Snail抑制剂的化合物CYD19或可药用的盐的用途。
本发明最后一个目的是提供一种药物组合物。
技术方案：本发明提供一种具有式(I)结构的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或其可药用的盐，
进一步地，所述具有式(I)结构的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或其可药用的盐的制备方法如下：
将4-[[[4-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]吡咯并[2，1-f][1，2，4]三嗪-2-基]硫]甲基]苯甲酸溶于N，N-二甲基甲酰胺、TBTU和N，N-二异丙基乙胺，常温搅拌后加入对氟邻苯二胺，使用石油醚与乙酸乙酯柱层析，减压蒸干后在乙醚中重结晶，干燥，得到产品CYD19。
所述具有式(I)结构的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或其可药用的盐在制备用于预防或治疗与Snail表达异常有关疾病的药物中的用途。
进一步地，所述与Snail表达异常有关的疾病为肿瘤或心血管疾病。
进一步地，所述肿瘤为结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、白血病或其他治疗抵抗或耐受的肿瘤；所述心血管疾病为动脉粥样硬化。
所述具有式(I)结构的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或其可药用的盐在制备用于抑制肿瘤细胞增殖药物中的用途。
所述具有式(I)结构的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或其可药用的盐在制备用于抑制肿瘤细胞转移中的用途。
一种药物组合物，其含有治疗有效量的如权利要求1所述具有式(I)结构的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或其可药用的盐，及药学上可接受的载体或辅料。
进一步地，在制备化疗增敏剂中的用途。
进一步地，所述化疗增敏剂为增加紫杉醇、顺铂、硼替佐米、氟尿嘧啶、伊立替康的增敏剂。
进一步地，可药用的盐是化合物CYD19与盐酸、氢溴酸、柠檬酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、乙酸、丙酮酸、苯基乙酸或杏仁酸形成的酸加成盐。
本发明的化合物CYD19或其结构类似物在制备肿瘤或心血管疾病药物中的应用，其作用机制主要为：抑制Snail与CBP或其他蛋白的结合；作为细胞增殖抑制剂；促进细胞凋亡；抑制肿瘤转移。
本发明化合物CYD19或其结构类似物可以与其他抗肿瘤药物，例如丝分裂抑制剂(如紫杉醇)，烷化剂(如环磷酰胺或顺铂)，蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米)，代谢拮抗剂(如氟尿嘧啶)、拓扑异构酶抑制剂[伊立替康)等联合应用，发挥协同抗肿瘤作用，提高肿瘤治疗效果。
有益效果：本发明的化合物CYD19与Snail蛋白高度亲和，抑制Snail与CBP/p300相互作用，减弱Snail的乙酰化水平，从而加速Snail的降解，具有显著的体内外抗肿瘤作用。因此，本发明化合物可用于抗肿瘤或心血管药物的制备，具有潜在的应用前景。
附图说明
图1为Biolayer interferometry检测结果图，结果显示化合物CYD19对Snail蛋白高度亲和；
图2为Western Blot检测结果图，结果显示化合物CYD19能降低细胞内Snail蛋白的表达；
图3为Immunoprecipitation检测结果图，结果显示化合物CYD19能抑制Snail与CBP蛋白相互作用；
图4为CCK-8检测结果图，结果显示化合物CYD19对肿瘤细胞有较强的增殖抑制作用；
图5为Annexin V-PI染色检测结果图，结果显示CYD19具有促进肿瘤细胞凋亡作用；
图6为Transwell检测结果图，结果显示CYD19可以抑制肿瘤细胞转移作用；
图7为CCK-8检测结果图，结果显示CYD19可以增强紫杉醇的化疗敏感性；
图8为化合物CYD19在裸鼠体内模型的抗肿瘤效果图；
图9为HE染色检测CYD19对裸鼠体内器官的影响结果图；
图10为CYD19的抗肿瘤作用机制示意图。
具体实施方式
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：本实施例的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或其可药用的盐的制备方法，制备步骤如下：
将4-[[[4-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]吡咯并[2，1-f][1，2，4]三嗪-2-基]硫]甲基]苯甲酸完全溶于N，N-二甲基甲酰胺，再加入TBTU和N，N-二异丙基乙胺，常温搅拌后再加入对氟邻苯二胺，继续常温搅拌后，反应液减压蒸干，得到蒸干物，将蒸干物和硅胶混合物加入乙酸乙酯溶剂中，然后在温度40℃～50℃的条件下蒸干得到蒸干物，把蒸干物加到硅胶柱上层，再使用石油醚与乙酸乙酯进行洗脱，收集的洗脱液进行减压蒸干，并在乙醚中在室温条件下进行重结晶，将分离的结晶物干燥，得到N-(2-氨基-4-氟苯基)-4-[[[4-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]吡咯并[2，1-f][1，2，4]三嗪-2-基]硫]甲基]苯甲酰胺。
实施例2：Biolayer interferometry检测化合物CYD19对Snail蛋白亲和力。
将重组Snail蛋白溶解在PBS，置于100uL tube管中。将EZ-Link NHS-生物素与Snail重组蛋白在室温下孵育60分钟(蛋白质与生物素的摩尔比为1∶3)。脱盐用于去除过量的生物素。将生物素化的蛋白质固定在Super Streptavidin生物传感器上进行进一步测量。将空白重组蛋白作为对照。不同浓度(0.5、0.25、0.125、0.063、0.031μM)的CYD19作为非特异性用对照。使用Octet red 96仪器(ForteBio)测定CYD19与Snail-蛋白的结合，记录光的偏离强度，使用1∶1结合模型计算结合和解离速率。结果显示，CYD19与Snail蛋白具有较高的亲和力(Kd＝180nM)，图1。
实施例3：WesternBlot检测CYD19对Snail蛋白表达的影响。
将细胞接种在六孔板中，待细胞贴壁12-24h后，给予不同浓度CYD19(25，50，75，100nM)处理24、48小时，提取蛋白并测定浓度后，根据蛋白分子量的大小，制备不用浓度梯度的10％SDS聚丙烯酰胺凝胶，90V浓缩胶，120V分离胶电泳，2.5-3h。通过全湿转膜转移方法进行转膜，并根据尺寸切割适当尺寸的滤纸和硝酸纤维素膜，胶在负极上，薄膜在正极上，恒定电流250mA，转膜时间根据所需蛋白Kd数进行调整。将转入蛋白的硝酸纤维膜浸入丽春红染色5分钟后用蒸馏水冲洗，观察蛋白条带位置并裁剪标记蛋白，用PBST洗去丽春红染液。在室温下用5％脱脂奶粉(PBST配制)封闭1h，加入制备的一抗，4℃摇床孵育过夜。弃一抗，PBST清洗3次，5min/次，加入对应一抗的二抗，室温孵育1h，反应结束后，弃去二抗，PBST清洗3次，PBS清洗1次，5min/次，加入ECL反应液以暗室中曝光。结果显示，CYD19可以剂量依赖性方式抑制人乳腺癌(BrCa)原代细胞，乳腺癌细胞和结直肠癌细胞系中Snail蛋白表达(图2)。
实施例4：Immunoprecipitation检测CYD19对Snail与CBP蛋白相互作用的影响。
取10cm培养皿中的HCT-116细胞，放在冰上，加入500μl含有蛋白酶抑制剂的IP裂解缓冲液重悬细胞，转移至1.5ml Eppendorf管，混匀并在冰上孵育30min，超声破碎细胞，4度离心20min收集上清，置于冰上备用。离心过程中，取若干1.5ml Eppendorf管，每管加入20μl ProteinA/G beads，并用500μl不含蛋白酶抑制剂的IP裂解液，重悬beads，将收集的蛋白上清中加入清洗完的beads中，封口膜封闭管口，4度轮转仪孵育0.5小时，4度2000g，离心2分钟，收集上清液，测量蛋白浓度，取部分作为Input(一般为10％)，加入等体积的5倍上样缓冲液，100度煮10分钟，稍稍离心，-20℃备用。剩余蛋白上清液分成2管，管A为1/4，管B为3/4，用若干微升含蛋白酶抑制剂IP裂解缓冲液调平体积至500微升。管A中加入1微升IgG，管B中加入2微升(目的蛋白)抗体，封口膜封闭管口，4度轮转仪上孵育过夜。第二日，稍稍离心(将样品离心至管底)，每管加入30微升漂洗过的beads(条件同前)，在4℃条件下继续轮转2小时，4度2000g，离心2分钟，收集beads，加入1ml不含蛋白酶抑制剂的IP裂解液缓冲液漂洗，4度轮转仪上孵育5min，离心，收集beads，以上漂洗步骤重复8次。收集beads，加入若干微升2×上样缓冲液，100℃孵育20min，离心，-20℃备用，进行常规Western blot过程。结果显示，CYD19处理HCT-116不影响CBP/p300的表达，但显著降低内源Snail的蛋白表达水平。在用CYD19处理后，HCT-116细胞Snail IP组中，CBP/p300水平显著降低，表明CYD19强烈抑制了Snail与CBP/p300结合(图3)。
实施例5：CCK-8检测CYD19对肿瘤细胞的增殖抑制作用。
将正常生长的肿瘤细胞计数，制备细胞悬液，接种到96孔板，每孔约100μl细胞悬液。待细胞贴壁后，加入不同的浓度的CYD19(6.25，12.5，25，50，100，300，1250，5000nM)处理一定时间(n＝6)，加入10μl CCK8，培养1-4h。利用酶标仪测定相应的吸光度，计算药物的细胞存活率：存活率(％)：存活率(％)＝(加药组细胞平均吸光度-空白培养基平均吸光度值)/(对照组细胞平均吸光度-空白培养基平均吸光度值)×100％。结果显示，化合物CYD19对RKO，HCT-116，PyMT等肿瘤细胞增殖抑制明显，IC50值均小于100nM，较强，化合物对SW620，DLD1，MDA-MB-231，SUM159也具有一定的增殖抑制作用(图4)。
实施例6：Annexin V-PI染色检测CYD19对肿瘤细胞的促凋亡作用。
将CYD19(25，50，75nM)处理后的细胞，用PBS洗涤2遍，随后用不含EDTA的胰酶消化后，加入适量培养基终止消化。200g，4度离心3分种收集细胞。用预冷的PBS洗涤细胞，300g，4度离心5分钟，收集细胞。加入100ul 1x Binding Buffer重悬细胞，加入5μl Annexin V-FTIC和5μl PI Staining Solution，轻轻混匀。避光、室温反应10min。加入400μl×1Binding Buffer，轻轻混匀。样品用流式细胞仪检测。结果显示，CYD19处理后，HCT-116，RKO分别以剂量依赖性方式诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用(图5)。
实施例7：Transwell检测显示CYD19可以抑制肿瘤细胞转移作用。
将HCT-116和PyMT细胞分散在无血清的培养液中，取细胞悬液100-200μl加入至Transwell小室，下室加入1ml完全培养基。常规培养48h，取出小室，用PBS清洗，并在甲醇固定10min，再用PBS冲净，0.05％结晶紫染色1min，用水洗净小室，棉棒擦去多余的细胞，洗净晾干后拍照。结果显示，CYD19可以剂量依赖性地减少HCT-116细胞，PyMT细胞等肿瘤细胞的迁移，具有较强的抑制肿瘤细胞转移的能力(图6)。
实施例8：CCK-8检测CYD19与紫杉醇联用对肿瘤细胞的增殖抑制作用。
正常消化HCT-116和PyMT细胞，制备细胞悬液，接种到96孔板，每孔约100μl细胞悬液。待细胞贴壁后，加入20nM的CYD19和紫杉醇(0.5，1，2，4nM)处理48h(n＝6)，加入10μlCCK8，培养1-4h。利用酶标仪测定相应的吸光度，计算药物的细胞存活率。结果显示，CYD19在20nM的条件下，紫杉醇在较低浓度(2nM)就表现出明显的肿瘤增殖抑制，证实化合物和紫杉醇联用可以明显提高紫杉醇的敏感性(图7)。
实施例9：化合物CYD19在裸鼠体内模型的抗肿瘤效果。
HCT-116裸鼠皮下移植瘤模型：取对数生长期的HCT-116细胞，重悬于Matrigel中(1×107/100μl)。在6周左右的雌性裸鼠背部接种0.1ml细胞悬浮液。随后，用游标卡尺测量肿瘤大小，当肿瘤生长至100mm3时，将动物随机分为三组：溶媒组、低剂量CYD19(15mg/kg)组和高剂量CYD19(30mg/kg)组，每组6只裸鼠，每天进行腹腔注射，给予相应的剂量。每2天量取肿瘤直径，14天后处死小鼠，并计算相对肿瘤增殖率，取内脏和肿瘤组织进行后续分析。
GFP标记的HCT-116脾注射的裸鼠肝转移模型：制备处于对数生长期的GFP标记的HCT-116细胞，并在无菌条件下制备重悬于Matrigel中的1×107个/100μl细胞悬液，在6-8周内，对雌性裸鼠进行左肋下手术，将0.1ml细胞悬浮液注射到裸鼠的脾脏中，缝合后将小鼠随机分为2组：溶媒组和CYD19(30mg/kg)组，每天进行腹腔注射，给予溶媒和CYD19药物，并记录体重，21天后处死裸鼠并取肝脏分析。
结果显示，在皮下移植瘤模型中，与溶媒组相比，CYD19组裸鼠的肿瘤体积明显降低，CYD19(30mg/kg，50mg/kg)组的抑瘤率为65％，72％(图8A)，具有优异的体内抗肿瘤生长效果。并且，在裸鼠的转移模型中，CYD19组中GFP荧光减弱，肝结节数明显减少，证实了CYD19能够抑制裸鼠体内肿瘤发生转移(图8B)。因此，化合物CYD19可以有效抑制肿瘤生长和转移，是潜在的抗肿瘤药物。
实施例10：HE染色检测CYD19对裸鼠体内主要器官的影响。
取小鼠心、肝、脾、肺、肾等重要器官浸泡入4％多聚甲醛中固定24小时，并用石蜡包埋，切成5μm切片，用于常规HE染色，给药组和溶媒对照组均未观察到明显的组织学病变，说明裸鼠对化合物的耐受性较好，化合物的毒性较低。(图9)。
Claims (10)
1.具有式(I)结构的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或其可药用的盐：
2.权利要求1所述具有式(I)结构的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或其可药用的盐的制备方法，其特征在于：
将4-[[[4-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]吡咯并[2，1-f][1，2，4]三嗪-2-基]硫]甲基]苯甲酸溶于N，N-二甲基甲酰胺、TBTU和N，N-二异丙基乙胺，常温搅拌后加入对氟邻苯二胺，使用石油醚与乙酸乙酯柱层析，减压蒸干后在乙醚中重结晶，干燥，得到产品CYD19。
3.权利要求1所述具有式(I)结构的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或其可药用的盐在制备用于预防或治疗与Snail表达异常有关疾病的药物中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述与Snail表达异常有关的疾病为肿瘤或心血管疾病。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、白血病或其他治疗抵抗或耐受的肿瘤；所述心血管疾病为动脉粥样硬化。
6.权利要求1所述具有式(I)结构的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或其可药用的盐在制备用于抑制肿瘤细胞增殖药物中的用途。
7.权利要求1所述具有式(I)结构的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或其可药用的盐在制备用于促进肿瘤细胞凋亡中的用途。
8.权利要求1所述具有式(I)结构的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或其可药用的盐在制备用于抑制肿瘤细胞转移中的用途。
9.一种药物组合物，其含有治疗有效量的如权利要求1所述具有式(I)结构的作为Snail抑制剂的化合物CYD19或其可药用的盐，及药学上可接受的载体或辅料。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于：在制备化疗增敏剂中的用途，所述化疗增敏剂为增加紫杉醇、顺铂、硼替佐米、氟尿嘧啶、伊立替康的增敏剂。
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