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CN111172285A - 用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的miRNA组及其应用 - Google Patents

用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的miRNA组及其应用 Download PDF

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CN111172285A CN202010120765.4A CN202010120765A CN111172285A CN 111172285 A CN111172285 A CN 111172285A CN 202010120765 A CN202010120765 A CN 202010120765A CN 111172285 A CN111172285 A CN 111172285A
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Abstract

本发明公开一个与胰腺癌相关的miRNA组，该miRNA组包括如下miRNA：miR‑143、miR‑218、miR‑217、miR‑216a、miR‑205、miR‑145、miR‑195、miR‑193a和miR‑127。该miRNA组可作为胰腺癌的早期检测标志物以及预后生物标志物用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测，对胰腺癌进行早期确诊，以抓住胰腺癌早期诊疗时机；和/或对胰腺癌患者是否有早期转移和耐药的风险进行评估，以便于及时调整用药方案，预防早期转移的发生，提高患者的生存时间。

Description

用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的miRNA组及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一组用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的miRNA组及其应用。
背景技术
胰腺癌作为最具侵袭性的恶性肿瘤之一，是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90％为起源于腺管上皮的导管腺癌。胰腺癌发病率和死亡率近年来明显上升，5年生存率<1％，是预后最差的恶性肿瘤之一。目前胰腺癌患者治疗的主要难点在于缺乏有效的早期分子标志物且易发生早期转移，无法及时确诊胰腺癌的早期发生和发展，延误诊疗的最佳时机，导致患者存活率低。胰腺癌早期的确诊率不高，手术死亡率较高，治愈率很低，在临床化疗中，胰腺癌最主要的问题就是早期转移，而在早期没有有效的手段来确诊，所以开发一种有效的手段来帮助胰腺癌患者确诊是遏制早期转移的重点。目前的诊断和治疗管理失败是导致胰腺癌患者生存率低的主要原因之一，因此，需要新的诊断和预后生物标志物，以便进行早期诊断和靶向治疗。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由18-25个核苷酸组成的小RNA，其不编码蛋白质，而对基因的表达起重要的调控作用。miRNA的序列具有高度的物种保守性，其表达具有独特的时间特异性和空间特异性。现有研究已经证明，miRNA在胚胎发育、组织分化、细胞代谢、信号通路控制等生理过程中发挥巨大的调控作用，特别是部分miRNA被发现具有肿瘤抑制因子或原癌基因的功能，在癌症及其他疾病的诊断和治疗中发挥重要的作用。因此，miRNA作为非编码RNA的代表，是当今分子生物学和表观遗传学研究的热门方向之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一个与胰腺癌相关的miRNA组，并将其作为胰腺癌的早期检测标志物以及预后生物标志物，用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测，对胰腺癌进行早期确诊，以抓住胰腺癌早期诊疗时机；和/或对胰腺癌患者是否有早期转移和耐药的风险进行评估，以及时调整用药方案，预防早期转移的发生，提高患者的生存时间。
根据本发明的第一个方面，提供了一个用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的miRNA组，该miRNA组包括如下miRNA(以下简称该miRNA组中的miRNA为风险miRNA)：miR-143、miR-218、miR-217、miR-216a、miR-205、miR-145、miR-195、miR-193a和miR-127。
发明人通过对临床胰腺癌患者与正常人体内miRNA含量的长期监测分析，发现与正常人相比，部分miRNA在胰腺癌患者体内存在低表达的现象，并通过大量试验发现：通过对上述9种在胰腺癌患者体内特异性低表达的风险miRNA的表达水平与正常人体内风险miRNA的表达水平进行分级定性，可以对胰腺癌的进行早期诊断以及监测胰腺癌早期转移和耐药风险，从而有助于提高胰腺癌患者生存率。基于上述发现，完成本发明。
在一些实施方式中，当用于胰腺癌早期诊断时，风险miRNA来自外周血，即可以通过检测受检者外周血样本中风险miRNA的表达水平来对胰腺癌进行早期诊断；当用于胰腺癌预后监测时，miRNA来自外周血和/或肿瘤组织，即可以通过检测胰腺癌患者外周血和/或肿瘤组织样本中风险miRNA的表达水平来监测胰腺癌的预后风险。
根据本发明的第二个方面，提供了检测风险miRNA的表达水平的产品在制备用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的产品中的应用。
在一些实施方式中，检测风险miRNA的表达水平的产品可以为通过下述至少一种方法检测样本中miRNA表达水平的试剂、试剂盒、芯片和/或仪器：Northern-Blotting杂交技术、逆转录PCR技术、逆转录-实时荧光定量PCR技术、原位杂交技术和miRNA芯片技术。
根据本发明的第三个方面，提供了一种用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的试剂盒，包括通过逆转录-实时荧光定量PCR技术检测风险miRNA的表达水平的试剂和/或试剂盒。
在一些实施方式中，上述用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的试剂盒可以包括如下实时荧光定量PCR引物：
针对miR-143的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；
针对miR-218的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；
针对miR-217的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物序列如SEQ ID NO:6所示；
针对miR-216a的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:7所示，下游引物序列如SEQ ID NO:8所示；
针对miR-145的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:9所示，下游引物序列如SEQ ID NO:10所示；
针对miR-205的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:11所示，下游引物序列如SEQ ID NO:12所示；
针对miR-195的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:13所示，下游引物序列如SEQ ID NO:14所示；
针对miR-193a的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:15所示，下游引物序列如SEQ ID NO:16所示；
针对miR-127的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:17所示，下游引物序列如SEQ ID NO:18所示。
在一些实施方式中，用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的试剂盒还可以包括用于提取RNA、进行逆转录和实时荧光定量PCR的试剂/试剂盒；其中，试剂包括Trizol试剂、逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、DNA聚合酶等；进行逆转录的试剂盒可以为现有技术中公开的任一用于进行逆转录的试剂盒，如可以为miRcute增强型miRNAcDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KP211)；进行实时荧光定量PCR的试剂盒可以为现有技术中公开的任一用于进行实时荧光定量PCR的试剂盒，如可以为miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBRGreen)(TIANGEN，FP411)。
根据本发明的第四个方面，提供了一个用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的系统，包括配置模块、存储模块、定量检测模块、输入模块、风险分析模块和输出模块；其中，
配置模块用于配置评估项目和风险分析规则存储至存储模块，评估项目可以选自早期诊断、耐药风险和转移风险中的至少一种；
存储模块配置为存储有正常人的风险miRNA的表达水平；
定量检测模块用于检测受检者的风险miRNA的表达水平；当评估项目为早期诊断或转移风险时，检测受检者外周血中风险miRNA的表达水平，当评估项目为耐药风险时，检测受检者肿瘤组织中风险miRNA的表达水平；
输入模块用于输入定量检测模块检测到的受检者的风险miRNA的表达水平，并输出至风险分析模块；
风险分析模块用于响应于接收到的受检者的风险miRNA的表达水平，获取评估项目、风险分析规则和正常人的风险miRNA的表达水平进行分析处理，生成风险评分输出至输出模块。
通过本发明提供的系统，可以对受检者体内的风险miRNA的表达水平进行分级定性，获取风险评分结果，从而可以根据风险评分结果直观地获知受检者相应评估项目的风险大小，有助于胰腺癌的早期诊断以及胰腺癌转移风险和耐药风险的早期预警。
在一些实施方式中，风险分析模块可以包括计算单元和分析单元，其中，
计算单元用于计算受检者的风险miRNA的表达水平与正常人对应的风险miRNA的表达水平的比值输出至分析单元；
分析单元用于根据比值、评估项目和风险分析规则统计输出风险评分至输出模块。
在一些实施方式中，当评估项目为早期诊断时，风险分析规则配置为：受检者miR-143、miR-218、miR-217、miR-216a、miR-205、miR-145、miR-195、miR-193a和miR-127共9种miRNA的表达水平中，当受检者任意miRNA的表达水平与正常人对应的miRNA的表达水平的比值均大于或等于0.8时，风险评分为0分；当比值小于0.8的miRNA的个数为1～3个时，风险评分为3分；当比值小于0.8的miRNA的个数为4～6个时，风险评分为6分；当比值小于0.8的miRNA的个数大于或等于7个时，风险评分为9分；
当评估项目为耐药风险时，风险分析规则配置为：受检者miR-143、miR-218、miR-217、miR-216a、miR-205、miR-145、miR-195、miR-193a和miR-127共9种miRNA的表达水平中，与正常人对应的miRNA的表达水平的比值小于0.8的miRNA的个数大于6个时，风险评分为9分；当比值小于0.8的miRNA的个数小于或等于6个且miR-143、miR-218、miR-217的比值均小于0.8时，风险评分为7分；当比值小于0.8的miRNA的个数小于或等于6个、miR-143、miR-218、miR-217中任意一个miRNA的比值大于或等于0.8且miR-216a、miR-205、miR-145的比值均小于0.8时，风险评分为5分；当比值小于0.8的miRNA的个数小于或等于6个、miR-143、miR-218、miR-217中任意一个miRNA的比值大于或等于0.8、miR-216a、miR-205、miR-145中任意一个miRNA的比值大于或等于0.8且miR-195、miR-193a、miR-127的比值均小于0.8时，风险评分为3分，否则为0分；
当评估项目为转移风险时，风险分析规则配置为：受检者miR-143、miR-218、miR-217、miR-216a、miR-205、miR-145、miR-195、miR-193a和miR-127共9种miRNA的表达水平中，当miR-143、miR-218、miR-217的比值均小于0.8时，风险评分为9分；miR-143、miR-218、miR-217中任意一个miRNA的比值大于或等于0.8且miR-216a、miR-205、miR-145的比值均小于0.8时，风险评分为6分；miR-143、miR-218、miR-217中任意一个miRNA的比值大于或等于0.8、miR-216a、miR-205、miR-145中任意一个miRNA的比值大于或等于0.8且miR-195、miR-193a、miR-127的比值均小于0.8时，风险评分为3分，否则为0分。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供了一组在胰腺癌患者体内特异性低表达的风险miRNA，并依据该组风险miRNA制备试剂盒和建立检测分析评估系统，用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测，为胰腺癌患者的早期诊断和预后监测提供有效的检测手段。通过取受检者外周血或肿瘤组织，检测风险miRNA的表达水平，并将受检者体内风险miRNA的表达水平与正常人体内风险miRNA的表达水平进行分级定性，可对受检者进行胰腺癌的早期诊断，以及分析胰腺癌患者的耐药风险和早期转移风险，可对胰腺癌患者的病情进行诊断并进行病程的监控，方便及时作出最有效的用药方法，同时为用药后无进一步病程进展的患者提供长期的监测，防止早期转移的发生，及时用药，防止不良反应的发生，降低无效化疗率或提前止损低效率化疗，提高胰腺癌患者的生存率。
附图说明
图1为本发明一实施方式的用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的系统的框架结构图；
图2表示本发明胰腺癌早期诊断对应的风险分析规则；
图3表示本发明胰腺癌耐药风险对应的风险分析规则；
图4表示本发明胰腺癌转移风险对应的风险分析规则；
图5表示实施例1所述的回顾性临床研究中文献检索筛选流程。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或参照制造厂商所建议的条件；实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
图1示意性地显示了根据本发明的一种实施方式的用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的系统，包括配置模块100、存储模块200、定量检测模块300、输入模块400、风险分析模块500和输出模块600。
定量检测模块300用于检测受检者的风险miRNA的表达水平。其中，风险miRNA包括：miR-143、miR-218、miR-217、miR-216a、miR-205、miR-145、miR-195、miR-193a和miR-127。定量检测模块300具体可以实现为检测风险miRNA的表达水平的产品，如，可以为通过下述至少一种方法检测样本中风险miRNA表达水平的试剂、试剂盒、芯片和/或仪器：Northern-Blotting杂交技术、逆转录PCR技术、逆转录-实时荧光定量PCR技术、原位杂交技术和miRNA芯片技术。
本实施例中，定量检测模块300优选具体实现为通过逆转录-实时荧光定量PCR技术检测样本中风险miRNA表达水平的试剂盒。其中，试剂盒主要包括风险miRNA的实时荧光定量PCR引物和内参has-U6的实时荧光定量PCR引物(见表1)。通过逆转录-实时荧光定量PCR技术检测样本中风险miRNA表达水平的过程中，还需要用到的其他成分，如用于提取RNA的试剂、用于进行逆转录的试剂和用于进行实时荧光定量PCR的试剂等，可以由本发明试剂盒提供，也可以由试剂盒的使用者从其他商业途径获取。其中，RNA的提取方法可以为Trizol法，试剂主要包括Trizol试剂、氯仿、异丙醇、乙醇等；用于进行逆转录的试剂的具体成分可以参考现有技术中公开的任一用于进行逆转录的试剂盒中的试剂；用于进行实时荧光定量PCR的试剂的成分可以参考现有技术中公开的任一用于进行实时荧光定量PCR的试剂盒中的试剂。
本实施例中，定量检测模块300检测样本中风险miRNA表达水平的方法优选包括如下步骤：
(1)样本中RNA的提取：
当样本为外周血时，
a、取50～250μL外周血全血，加入10倍体积的Trizol试剂(Invitrogen，UK；Trizol试剂主要成分为异硫氰酸胍)，充分吹打混匀，室温静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
b、根据Trizol试剂的使用量，每1mL的Trizol试剂加入200μL的氯仿，静置3min，然后在12000g，4℃条件下离心15min；
c、取上层水相转移至EP(eppendorf)管中，加500μL的异丙醇，上下颠倒混匀10s，室温静置10min，在12000g，4℃条件下离心10min，弃上清；
d、加入1mL的75％乙醇，上下颠倒混匀10s，在12000g，4℃条件下离心10min，弃上清；
e、室温下干燥5-10min(未充分干燥，充分干燥不好溶解)，加入50μL的RNase-free-water充分溶解RNA；
f、分光光度计测OD值，测定总RNA浓度。
当样本为肿瘤组织时，
A、将组织称重，加1mL Trizol试剂，混匀，冰上放置裂解5min；
B、根据Trizol试剂的使用量，每1mL的Trizol试剂加入200μL的氯仿，剧烈摇匀，使其呈乳浊液，静置5min；
C、在12000g，4℃条件下离心5min；
D、小心吸取上清至另一EP管，加入等体积的预冷至4℃的异丙醇，混匀；
E、在12000g，4℃条件下离心15min；
F、弃上清，加1mL75％乙醇，洗涤沉淀，在8000g，4℃条件下离心8min；
G、吸净上清，晾干乙醇，加RNase-free-water充分溶解RNA；
H、分光光度计测OD值，测定总RNA浓度。
(2)逆转录合成cDNA：取1μgRNA使用“miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒”(TIANGEN，KP211)逆转录合成cDNA；
(3)荧光定量PCR(qPCR)扩增cDNA：取逆转录合成的cDNA使用“miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)”(TIANGEN，FP411)进行荧光定量PCR，以has-U6作为检测的内参物，以10μL作为qPCR扩增的反应体系。荧光定量PCR结果以内参的循环数作为对照，计算2-△△Ct，再进行统计学分析。引物序列如下表1所示。
表1荧光定量PCR引物
Figure BDA0002392909730000071
Figure BDA0002392909730000081
存储模块200配置为存储有正常人的风险miRNA的表达水平。其中，正常人的风险miRNA的表达水平主要是通过以正常人外周血为样本，提取RNA、逆转录合成cDNA后，利用上述表1的引物、以has-U6作为内参对风险miRNA进行定量获得，具体如表2所示。
表2正常人的风险miRNA的表达水平
风险miRNA 相对表达量
miR-143 6.2-6.5
miR-218 6.5-8
miR-217 6.2-6.8
miR-216a 1.9-2.4
miR-145 1.8-1.6
miR-205 1.5-1.8
miR-195 0.8-1.2
miR-193a 0.75-1.2
miR-127 0.8-1.2
实际应用过程中，关于正常人的风险miRNA的具体表达水平，使用者可以自行以正常人外周血为样本，提取RNA、逆转录合成cDNA后，利用上述表1的引物、以has-U6作为内参对风险miRNA进行定量获得；其中，获取正常人的风险miRNA的具体表达水平的过程中，若测得的具体数值小于表2所示范围的下限，则取表2所示范围的下限作为该风险miRNA的具体表达水平，若高于所示范围的上限，则将该样本剔除。
输入模块400用于输入定量检测模块300检测到的受检者的风险miRNA的表达水平，并输出至风险分析模块500。输入模块400具体可以实现为现有技术中的键盘、扫描仪、手写板等输入设备。
配置模块100用于配置评估项目和评估项目对应的风险分析规则存储至存储模块200。其中，评估项目可以为早期诊断、耐药风险或转移风险。
根据发明人的前瞻性临床研究结果(详见实施例2)，结合通过以“pancreaticcancer、pancreatic ductal adenocarcinoma、miRNA、microRNA、miR”等为关键词进行文献检索收集的临床资料进行回顾性临床研究的结果(回顾性临床研究中文献检索筛选的具体过程见图5)，分析了各个风险miRNA表达水平与胰腺癌患者临床病理特征及预后的关系，最终制定了利用风险miRNA对胰腺癌进行早期诊断、耐药风险评估和转移风险评估的风险分析规则。同时，为了避免假阳性和假阴性的发生，根据前瞻性临床研究和回顾性临床研究的数据，以及依据统计过程中的错误发现率(false discovery rate，FDR)以及P值对风险miRNA的危险级别进行分级，FDR是主要是衡量一次检验假阳性率的指标，而P值主要用于衡量一次错误发生的指标，分级标准及结果如表3所示。其中，风险miRNA的危险级别由A到C依次下降。
表3风险miRNA的分级标准
级别 miRNA 分级标准
A miR-218、miR-143、miR-217 FDR<25％、P<0.001
B miR-216a、miR-205、miR-145 FDR<30％、P<0.01
C miR-127、miR-195、miR-193a P<0.05
本发明中，评估项目对应的风险分析规则具体如下：
如图2所示，当评估项目为早期诊断时，其对应的风险分析规则为：
受检者9种风险miRNA的表达水平中，
当受检者任意风险miRNA的表达水平与正常人对应的风险miRNA的表达水平的比值均大于或等于0.8时，风险评分为0分；
当比值小于0.8的风险miRNA的个数为1～3个时，风险评分为3分；
当比值小于0.8的风险miRNA的个数为4～6个时，风险评分为6分；
当比值小于0.8的风险miRNA的个数大于或等于7个时，风险评分为9分。
如图3所示，当评估项目为耐药风险时，其对应性的风险分析规则为：
受检者9种风险miRNA的表达水平中，
与正常人对应的风险miRNA的表达水平的比值小于0.8的风险miRNA的个数大于6个时，风险评分为9分；
当比值小于0.8的风险miRNA的个数小于或等于6个且A组风险miRNA的比值均小于0.8时，风险评分为7分；
当比值小于0.8的风险miRNA的个数小于或等于6个、A组风险miRNA中任意一个风险miRNA的比值大于或等于0.8且B组风险miRNA的比值均小于0.8时，风险评分为5分；
当比值小于0.8的风险miRNA的个数小于或等于6个、A组风险miRNA中任意一个风险miRNA的比值大于或等于0.8、B组风险miRNA中任意一个风险miRNA的比值大于或等于0.8且C组风险miRNA的比值均小于0.8时，风险评分为3分；
当比值小于0.8的风险miRNA的个数小于或等于6个且A组、B组、C组中均分别存在任意一个或两个风险miRNA的表达水平与正常人对应的风险miRNA的表达水平的比值大于或等于0.8时，风险评分为0分。
如图4所示，当评估项目为转移风险时，其对应性的风险分析规则为：
受检者9种风险miRNA的表达水平中，
当A组风险miRNA的比值均小于0.8时，风险评分为9分；
A组风险miRNA中任意一个风险miRNA的比值大于或等于0.8且B组风险miRNA的比值均小于0.8时，风险评分为6分；
A组风险miRNA中任意一个风险miRNA的比值大于或等于0.8、B组风险miRNA中任意一个风险miRNA的比值大于或等于0.8且C组风险miRNA的比值均小于0.8时，风险评分为3分；否则，风险评分为0分。
风险分析模块500用于响应于接收到的受检者的风险miRNA的表达水平，获取评估项目、风险分析规则和正常人的风险miRNA的表达水平进行分析处理，生成风险评分输出至输出模块600。本实施例中，风险分析模块500优选包括计算单元501和分析单元502。
计算单元501用于计算受检者的风险miRNA的表达水平与正常人对应的风险miRNA的表达水平的比值输出至分析单元502。
分析单元502用于根据比值、评估项目和风险分析规则统计输出风险评分至输出模块600。
本实施例用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的系统的工作流程包括如下步骤：
S1、配置评估项目和评估项目对应的风险分析规则存储至存储模块200；其中，评估项目可以选自早期诊断、耐药风险或转移风险中的一种或多种，评估项目对应的风险分析规则参照前文所述。
S2、由定量检测模块300检测受检者外周血和/或肿瘤组织样本的风险miRNA的表达水平；
S3、通过输入模块400获取定量检测模块300检测到的风险miRNA的表达水平输出至风险分析模块500；
S4、风险分析模块500响应于接收到的受检者的风险miRNA的表达水平，获取存储模块200中的评估项目、风险分析规则和正常人的风险miRNA的表达水平进行分析处理，生成风险评分输出至输出模块600。
其中，上述工作流程中，还可以包括如下步骤：检测和配置正常人的风险miRNA存储至存储模块。
本发明中，早期诊断的风险评分越高，表明受检者患胰腺癌的风险越高，提示可采取早期用药；耐药风险评分越高，表明胰腺癌患者耐药风险越高，提示要注意监测和改善治疗方案；转移风险评分越高，表明胰腺癌患者发生转移的概率很大，要注意长期监测，抓住转移前的治疗时机，及时调整用药方法，防止早期转移的发生，提高患者的生存时间。
本发明系统有利于胰腺癌的早期诊断，以及分析受检者的耐药风险和胰腺癌早期转移风险，方便医生及时作出最有效的用药方法，同时为用药后无进一步病程进展的病人提供长期的监测，防止早期转移的发生，及时用药，有效治疗，提高胰腺癌患者的生存率。
在优选实施例中，除定量检测模块300和输入模块400外，本发明的用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的系统的其他模块可以通过程序模块进行实现，并将其部署在服务器或存储在电子装置中，该程序模块包括有用于实现上述功能的程序指令，这样就可以利用服务器的处理器或电子装置中的处理器对程序指令进行执行，从而实现利用自动化系统实现风险分析监测的目的。
实施例2
22例胰腺癌患者血液和癌组织及相应癌旁组织取自于2016年7月至2018年7月于无锡市第三人民医院普外科行胰腺癌根治性切除患者，均知情同意并签署书面书。其中女性10例，男性12例，年龄40-73岁，中位年龄为55岁。标本于离体半小时内以DEPC水冲洗表面污物血渍后予锋利刀片迅速切取胰腺癌及癌旁组织(距癌组织大于3cm)各5块，剔除可能附着的血管、神经和结缔组块。所有病例术前均未经化疗、放疗或免疫治疗，术后理检查由2名病理医师共同诊断，且石蜡病理均为胰腺癌。组织标本离体后立即放入液氮转-80℃冰箱保存备用。术后对患者进行随访，主要采用电话咨询方式对患者进行随访，随访起点为手术日期，截止日期为2019年7月31日。随访内容为患者定期复查结果，是否复发或远处转移，并记录患者最后随访时间或死亡时间。
利用本发明用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的系统对22例胰腺癌患者血液和癌组织样本中miR-143、miR-218、miR-217、miR-216a、miR-205、miR-145、miR-195、miR-193a和miR-127的表达水平进行检测，分析和获取患者的胰腺癌早期诊断、耐药风险和转移风险的风险评分。
将通过本发明系统测得早期诊断的风险评分大于等于6分的患者例数与临床实际上被诊断为胰腺癌的患者例数进行比较、将通过本发明系统测得转移诊断的风险评分大于等于6分的患者例数与临床实际上发生转移的患者例数进行比较、通过本发明系统测得耐药诊断的风险评分大于等于7分的患者例数与临床实际上发生耐药的患者例数进行比较，以评价本发明系统评估结果的临床有效性，结果如表4所示。
表4本发明系统的临床有效性
Figure BDA0002392909730000111
Figure BDA0002392909730000121
其中，早期诊断评估中，临床实际确诊的患者例数为22例，经本发明系统测得的风险评分不小于6分的患者共18例，其中，风险评分为6分的12例，风险评分为9分的6例；
转移风险评估中，22例胰腺癌患者临床实际发生转移的患者例数为14例，14例患者中，经本发明系统测得的早期转移风险评分不小于6分的患者共9例，其中，风险评分为6分的4例，9分的5例；
耐药风险评估中，22例胰腺癌患者临床实际发生转移的患者例数为15例，15例患者中，经本发明系统测得的早期转移风险评分不小于7分的患者共11例，其中，风险评分为7分的8例，9分的3例。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学附属医院
<120> 用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的miRNA组及其应用
<130> 2020
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
acactccagc tgggtactgc tca 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ctcaactggt gcgtggagtc ggc 23
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gcgcttgtgc ttgatctaa 19
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gcagggtccg aggt 14
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
acactccagc tgggtctccc aacccttg 28
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ctcaactggt gtcgggagtc ggcaat 26
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
tttggagata gttccattta gat 23
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
attcaccgac aaatagata 19
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
actagtgctg ctagagttga ataa 24
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
aacttctaca gaagaaggaa tgg 23
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gaattcctta tctgggtggc tgttttg 27
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
ggtaccgcgg tgctttttcc aatctgc 27
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
ggaattccat gtccttcggc agagac 26
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
cggatccgtc acatcctggt tgcgtc 26
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
gctgcctacc catacagtca 20
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
ttacccttca ctatttggtc ctt 23
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
agatatgctg aacctagtc 19
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
cagcgtcaaa tggagctaga g 21
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (9)

1.用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的miRNA组，所述miRNA组包括如下miRNA：miR-143、miR-218、miR-217、miR-216a、miR-205、miR-145、miR-195、miR-193a和miR-127。
2.根据权利要求1所述的miRNA组，其中，当用于胰腺癌早期诊断时，所述miRNA来自外周血；当用于胰腺癌预后监测时，所述miRNA来自外周血和/或肿瘤组织。
3.检测权利要求1或2所述的miRNA组中的miRNA的表达水平的产品在制备用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述检测权利要求1或2所述的miRNA组中的miRNA的表达水平的产品为通过下述至少一种方法检测样本中miRNA表达水平的试剂、试剂盒、芯片和/或仪器：Northern-Blotting杂交技术、逆转录PCR技术、逆转录-实时荧光定量PCR技术、原位杂交技术和miRNA芯片技术。
5.用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的试剂盒，包括通过逆转录-实时荧光定量PCR技术检测权利要求1或2所述的miRNA组中的miRNA的表达水平的试剂和/或试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，包括如下实时荧光定量PCR引物：
针对miR-143的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；
针对miR-218的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；
针对miR-217的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物序列如SEQ ID NO:6所示；
针对miR-216a的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:7所示，下游引物序列如SEQ ID NO:8所示；
针对miR-145的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:9所示，下游引物序列如SEQ ID NO:10所示；
针对miR-205的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:11所示，下游引物序列如SEQ ID NO:12所示；
针对miR-195的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:13所示，下游引物序列如SEQ ID NO:14所示；
针对miR-193a的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:15所示，下游引物序列如SEQ ID NO:16所示；
针对miR-127的实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如SEQ ID NO:17所示，下游引物序列如SEQ ID NO:18所示。
7.用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的系统，包括配置模块、存储模块、定量检测模块、输入模块、风险分析模块和输出模块；其中，
配置模块用于配置评估项目和风险分析规则存储至存储模块，所述评估项目选自早期诊断、耐药风险和转移风险中的至少一种；
存储模块配置为存储有正常人的权利要求1所述的miRNA组中的miRNA的表达水平；
定量检测模块用于检测受检者的权利要求1所述的miRNA组中的miRNA的表达水平；当评估项目为早期诊断或转移风险时，检测受检者外周血中miRNA的表达水平；当评估项目为耐药风险时，检测受检者肿瘤组织中miRNA的表达水平；
输入模块用于输入所述定量检测模块检测到的受检者的miRNA的表达水平，并输出至风险分析模块；
风险分析模块用于响应于接收到的受检者的miRNA的表达水平，获取评估项目、风险分析规则和正常人的权利要求1所述的miRNA组中的miRNA的表达水平进行分析处理，生成风险评分输出至输出模块。
8.根据权利要求7所述的系统，其中，所述风险分析模块包括计算单元和分析单元，其中，
计算单元用于计算受检者的miRNA的表达水平与正常人对应的miRNA的表达水平的比值输出至分析单元；
分析单元用于根据所述比值、评估项目和风险分析规则统计输出风险评分至输出模块。
9.根据权利要求7或8所述的系统，其中，
当评估项目为早期诊断时，风险分析规则配置为：受检者miR-143、miR-218、miR-217、miR-216a、miR-205、miR-145、miR-195、miR-193a和miR-127共9种miRNA的表达水平中，当受检者任意miRNA的表达水平与正常人对应的miRNA的表达水平的比值均大于或等于0.8时，风险评分为0分；当比值小于0.8的miRNA的个数为1～3个时，风险评分为3分；当比值小于0.8的miRNA的个数为4～6个时，风险评分为6分；当比值小于0.8的miRNA的个数大于或等于7个时，风险评分为9分；
当评估项目为耐药风险时，风险分析规则配置为：受检者miR-143、miR-218、miR-217、miR-216a、miR-205、miR-145、miR-195、miR-193a和miR-127共9种miRNA的表达水平中，与正常人对应的miRNA的表达水平的比值小于0.8的miRNA的个数大于6个时，风险评分为9分；当比值小于0.8的miRNA的个数小于或等于6个且miR-143、miR-218、miR-217的比值均小于0.8时，风险评分为7分；当比值小于0.8的miRNA的个数小于或等于6个、miR-143、miR-218、miR-217中任意一个miRNA的比值大于或等于0.8且miR-216a、miR-205、miR-145的比值均小于0.8时，风险评分为5分；当比值小于0.8的miRNA的个数小于或等于6个、miR-143、miR-218、miR-217中任意一个miRNA的比值大于或等于0.8、miR-216a、miR-205、miR-145中任意一个miRNA的比值大于或等于0.8且miR-195、miR-193a、miR-127的比值均小于0.8时，风险评分为3分，否则为0分；
当评估项目为转移风险时，风险分析规则配置为：受检者miR-143、miR-218、miR-217、miR-216a、miR-205、miR-145、miR-195、miR-193a和miR-127共9种miRNA的表达水平中，当miR-143、miR-218、miR-217的比值均小于0.8时，风险评分为9分；miR-143、miR-218、miR-217中任意一个miRNA的比值大于或等于0.8且miR-216a、miR-205、miR-145的比值均小于0.8时，风险评分为6分；miR-143、miR-218、miR-217中任意一个miRNA的比值大于或等于0.8、miR-216a、miR-205、miR-145中任意一个miRNA的比值大于或等于0.8且miR-195、miR-193a、miR-127的比值均小于0.8时，风险评分为3分，否则为0分。
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