CN111166884A - Foxf1基因在制备用于骨质疏松症药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种Foxf1基因在制备用于治疗骨质疏松症药物中的应用，属于生物医学技术领域。本发明利用小鼠和人骨髓间充质干细胞(BMSC)和小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)进行研究，研究数据表明Foxf1沉默通过Wnt/β‑cantenin促进BMSCs成骨。并通过体内实验证实，siFoxf1(沉默Foxf1)尾静脉注射可以减少去卵巢小鼠骨量丢失。因此，siFoxf1在PMOP的治疗中可能发挥重要作用，可以用于制备治疗骨质疏松症，特别是PMOP的药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种Foxf1基因在制备用于治疗骨质疏松症药物中的应用。
背景技术
绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis，PMOP)是绝经后单位体积骨量减少，骨微细结构改变，骨脆性增加，易于发生骨折的代谢性疾病。随着人类进入老龄化社会，PMOP在世界各国发病逐年增高，给社会及家庭造成了沉重的经济负担。目前治疗PMOP的药物仍然有限。治疗PMOP的推荐药物，如双膦酸盐和特立帕肽，存在较为严重的副作用，如恶心、上腹痛、消化不良、胃炎、背痛和关节痛等；特立帕肽每天均需要注射，终身仅可接受一次为期24个月的治疗。因此，研究PMOP的发病机制、寻找其防治靶点成为临床的迫切需求。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种Foxf1基因在制备用于治疗骨质疏松症药物中的应用，以Foxf1基因作为治疗骨质疏松症的新靶点，特别是针对PMOP，以沉默Foxf1通过Wnt/β-cantenin促进BMSCs成骨并防治去卵巢诱导的骨丢失，为骨质疏松症，特别是PMOP的治疗提供新的治疗方式。
Foxf1基因在制备用于治疗骨质疏松症药物中的应用。
Fox转录因子家族在调控细胞分化、发育、新陈代谢和衰老方面发挥着多种作用。发明人利用小鼠和人骨髓间充质干细胞(BMSC)和小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)进行研究，研究数据表明Foxf1沉默通过Wnt/β-cantenin促进BMSCs成骨，并防治去卵巢诱导的骨丢失，本发明通过实验证实，可将Foxf1作为骨质疏松症，特别是PMOP治疗的新靶点。
在其中一个实施例中，所述骨质疏松症为绝经后骨质疏松症。
本发明还公开了沉默Foxf1基因的试剂在制备用于治疗骨质疏松症药物中的应用。
在其中一个实施例中，所述沉默Foxf1基因的试剂包括：Foxf1特异的siRNA。
在其中一个实施例中，所述Foxf1特异的siRNA的正义序列选自：SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列。
在其中一个实施例中，所述Foxf1特异的siRNA的正义序列选自：与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的等同序列，所述等同序列可沉默Foxf1基因。
在其中一个实施例中，所述Foxf1特异的siRNA与所述SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列相似性大于90％。
本发明还公开了一种用于治疗骨质疏松症药物，包括：特异性沉默Foxf1基因的试剂。
在其中一个实施例中，所述Foxf1特异的siRNA的正义序列选自：SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列，与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的等同序列，所述等同序列可沉默Foxf1基因。
在其中一个实施例中，所述药物的给药途径为静脉注射液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明人利用小鼠和人骨髓间充质干细胞(BMSC)和小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)进行研究，研究数据表明Foxf1沉默通过Wnt/β-cantenin促进BMSCs成骨。并通过体内实验证实，siFoxf1尾静脉注射可以减少去卵巢小鼠骨量丢失。因此，siFoxf1(沉默Foxf1)在PMOP的治疗中可能发挥重要作用，可以用于制备治疗骨质疏松症，特别是PMOP的药物。
附图说明
图1为实施例1中OVX小鼠的骨组织，BMSC和BMM中Foxf1的表达水平；
图2为实施例1中Foxf1在成骨分化和破骨分化过程中的变化示意图；
图3为实施例1中Foxf1基因沉默增强BMSCs的成骨作用结果示意图；
图4为实施例1中Foxf1沉默激活Wnt/β-catenin信号通路结果示意图；
图5为实施例1中siFoxf1介导的BMSC的成骨作用被DKK1逆转示意图；
图6为实施例2中siFoxf1防治OVX导致的骨量丢失实验设计及结果示意图；
图7为实施例2中siFoxf1激活β-cantenin通路增加体内骨形成结果示意图；
图8为实施例3中PMOP患者的骨提取物中Foxf1表达升高，且siFoxf1促进人BMSC成骨结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
以下实施例所用原料，如非特别说明，均为市售购得。
以下动物实验得到广州中医药大学第一附属医院伦理委员会的批准(TCMF1-2019030)；
以下实施例中统计分析方法使用SPSS Statistics 19.0版(IBM，美国)进行数据分析。检验正太分布和方差齐性后，两组独立样本比较使用t检验，大于等于三组的独立样本使用方差分析。P值≤0.05表示具有统计学意义。数据表示为平均值±标准差(s.d.)。
实施例1
siFoxf1促进小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化。
一、方法。
1、去卵巢(OVX)进行骨质疏松造模。
为了评估OVX引起的骨质疏松症，将8周大的C57BL/6雌性小鼠麻醉切除双侧卵巢(OVX)，同时设置假手术组(仅去除卵巢周围的脂肪而不切除卵巢)，6周后取材可成功制造骨质疏松模型。
2、细胞培养。
A、小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分离和培养
对8周龄的C57BL/6小鼠的胫骨和股骨进行无菌解剖，并收集骨髓细胞，使用小鼠BMSC培养基(Cyagen Biosciences，中国广州)培养、传代。收获第5至9代的细胞用于随后的实验。
B、小鼠骨髓来源巨噬细胞BMM培养
小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)按常规方法分离得到，在100mm皿中的含有5ng/ml巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(R&D Systems，美国)，1％青霉素和链霉素(Gibco，美国)和10％胎牛血清(Gibco，美国)的α-MEM培养基(Gibco，美国)中生长。
3、RNA提取和qRT-PCR
用TRIzol试剂(Invitrogen)从BMSC和BMM中提取总RNA。使用PrimeScript RTMaster Mix(Perfect Real Time；TaKaRa，日本)将总RNA逆转录为cDNA。使用β-actin作为内参，使用SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)定量转录水平。使用2-ΔΔCt方法定量基因表达水平。所用引物对如下：
表1.引物序列
4、蛋白质印迹
细胞在RIPA裂解液(Beyotime，中国)中裂解，蛋白质通过15％SDS-page(Bio-rad，美国)分离，并转移到PVDF(Millipore，中国上海)上。将膜在脱脂牛奶(5％)中于室温下封闭2h。接着孵育一抗：β-actin(1:500，Cell Signaling Technology，美国)，Foxf1(1：500，Biorbyt，美国)和β-cantenin(1：500；Cell Signaling Technology，美国)。用PBST洗涤3次，每次10分钟后，将膜与相应的二抗(1：3000；Cell Signaling Technology，美国)在室温下孵育2小时。通过化学发光法(Bio-Rad，美国)确定蛋白质水平。使用Image J软件定量条带强度。
5、siRNA介导的沉默和细胞转染
选用Foxf1特异的siRNA(靶序列为GATCCGGCTAGCGAGTTTA，即SEQ ID NO.4)，该siRNA的正义序列为GAUCCGGCUAGCGAGUUUA，即SEQ ID NO.2，用来沉默Foxf1，并同时设置阴性对照siRNA(siCtrl，购自RiboBio，广州，中国)。使用Lipofectamine RNAimax(Invitrogen，美国)进行siRNA转染。
随后通过定量逆转录PCR(qRT-PCR)，蛋白质印迹(WB)和免疫荧光(IF)验证Foxf1表达。
6、成骨细胞分化测定
将所得BMSCs在成骨诱导培养基(Cyagen Biosciences，中国广州)中培养。每三天更换成骨诱导培养基。成骨诱导7天后，对细胞进行碱性磷酸酶(ALP)染色(碧云天，中国上海)和ALP活性(碧云天，中国上海)测定。成骨诱导14至28天后，通过Von Kossa染色(索莱宝，中国)评估矿物质沉积。
7、ALP染色和活性测定
将细胞在4％多聚甲醛中固定20分钟，并用蒸馏水洗涤3次。接下来，用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒(Beyotime，中国上海)对细胞进行染色。为了测定ALP活性，在96孔板上用ALP活性检测试剂盒(碧云天，中国上海)。通过确定405/650nm处的吸光度来定量ALP活性。
8、Von Kossa染色
通过Von Kossa染色测定钙沉积物。将细胞在4％多聚甲醛中固定20分钟，并用蒸馏水洗涤3次。将细胞在5％硝酸银中孵育，暴露于紫外线30分钟，5％硫酸钠中洗涤后拍照。
9、破骨细胞分化
对于破骨细胞分化，BMMs用M-CSF(5ng/ml)和NF-kB配体的受体激活剂(RANKL，10ng/ml)(R&D Systems，美国)处理4-6天。然后，将细胞固定在4％的多聚甲醛中以进行抗酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)(Sigma，美国)染色。具有至少三个核的TRAP+细胞被认为是破骨细胞。
10、免疫荧光
在共聚焦培养皿中培养细胞以评估Foxf1，Runx2，Col1a1和β-catenin蛋白的表达水平。将细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，用0.3％Triton X-100通透和1％牛血清白蛋白封闭30分钟。然后将细胞与一抗Foxf1(1：500；Biorbyt)，Runx2(1：1600；Cell SignalingTechnology)，Col1a1(1：500；Abcam，Cambridge，UK)孵育。将细胞与荧光偶联的二抗(Beyotime，中国上海)孵育60分钟，并与4'，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)(Beyotime，中国上海)孵育5分钟以染色细胞核。通过共聚焦激光扫描显微镜(Leica，德国)拍照。
11、β-catenin/TCF转录报告基因检测(TOP/FOPflash检测)
为了确定Wnt信号的激活状态，通过转染TOPflash/FOPflash荧光素酶报告质粒(Addgene，美国)来测定β-catenin/TCF转录活性。接种细胞(每孔2×104)并在24孔板中培养12h。将TOPflash(具有3个TCF结合位点的重复)或FOPflash(具有3个TCF突变位点的重复)的质粒转染到细胞中。转染后48小时，使用荧光素酶测定系统测量荧光素酶活性。
二、结果。
1、OVX小鼠的骨组织，BMSC和BMM中Foxf1的表达水平。
结果如图1所示，其中：
图a表示对照组和OVX组小鼠骨组织中Foxf1的mRNA表达量q-RT PCR分析，分析结果显示，与对照组相比，OVX小鼠来源的椎体组织中Foxf1 mRNA的表达水平显着增加。
图b和c分别为对照组和OVX组小鼠骨组织中Foxf1蛋白表达量WB(蛋白质免疫印迹)胶图和表达量分析，结果显示，OVX小鼠来源的椎体组织显示Foxf1蛋白表达水平显着增加。
图d表示对照组和OVX组小鼠BMSCs中Foxf1的mRNA表达量q-RT PCR分析，分析结果显示，OVX小鼠来源的BMSCs显示Foxf1 mRNA表达水平明显增加。
图e和f分别为对照组和OVX组小鼠BMSCs中Foxf1蛋白表达量WB(蛋白质免疫印迹)胶图和表达量分析，结果显示，OVX小鼠来源的BMSCs显示Foxf1蛋白表达水平显着增加。
图g为对照组和OVX组小鼠BMMS中Foxf1的mRNA表达量q-RT PCR分析，图h-i分别为对照组和OVX组小鼠BMMS中Foxf1蛋白表达量WB(蛋白质免疫印迹)胶图和表达量分析，结果显示，与对照组相比，OVX来源的BMMS中Foxf1 mRNA和蛋白表达水平无显着差异。
2、Foxf1在成骨分化过程中下降，在破骨分化无显著变化。
结果如图2所示，其中：
图a表示在成骨分化过程中BMSCs中Foxf1的mRNA表达量随时间变化的q-RT PCR分析，结果显示，成骨分化后Foxf1 mRNA表达明显下降。
图b和c表示在成骨分化过程中BMSCs中Foxf1蛋白表达量WB(蛋白质免疫印迹)胶图和表达量分析，结果显示，成骨分化后Foxf1蛋白表达明显下降。
图d表示在破骨分化过程中BMMs中Foxf1的mRNA表达量随时间变化的q-RT PCR分析，图e-f表示在破骨分化过程中BMMs中Foxf1蛋白表达量WB(蛋白质免疫印迹)胶图和表达量分析，结果显示，OVX来源的BMMS中Foxf1 mRNA和蛋白表达水平无显着差异。
3、Foxf1基因沉默增强BMSCs的成骨作用。
结果如图3所示，其中：
图a和b分别为siFoxf1转染的BMSCs的ALP染色和Von Kossa染色的代表性图像。从图中可以看出，siFoxf1处理后，ALP染色较深，ALP阳性细胞数较多；钙化沉积较多。
图c为siFoxf1转染的骨髓间充质干细胞ALP活性的定量分析。从图中可以看出，siFoxf1处理后ALP活性较高，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
图d为siFoxf1转染的BMSCs中成骨标记Runx2，Alp，Osx，Ocn和Col1a1的mRNA表达量，分析结果表明，siFoxf1处理后显着增加了成骨标记Runx2，Osx，Alp，Ocn和Col1a1的mRNA表达。
图e为siFoxf1转染的BMSCs免疫荧光分析，显示siFoxf1处理后Runx2荧光表达增强(图中比例尺为40μm)，图f为siFoxf1转染的BMSCs中成骨标记Runx2蛋白表达荧光定量分析，分析结果表明，siFoxf1处理促进了Runx2的蛋白表达水平。
图g为siFoxf1转染的BMSCs免疫荧光分析，显示siFoxf1处理后Col1a1荧光表达增强(图中比例尺为40μm)，图h为siFoxf1转染的BMSCs中成骨标记Col1a1蛋白表达荧光定量分析，分析结果表明，siFoxf1处理促进了Col1a1的蛋白表达水平。
4、Foxf1沉默激活了Wnt/β-catenin信号通路。
结果如图4所示，其中：
图a为荧光素酶报告，实验表明，siFoxf1处理显著增加了Topflash的活性，表明激活了Wnt/β-catenin通路。
图b和c表示siFoxf1转染的BMSCs中β-catenin蛋白表达量WB(蛋白质免疫印迹)胶图和表达量分析，结果显示，siFoxf1处理显著促进了β-catenin蛋白的表达水平。
图d为siFoxf1转染的BMSCs免疫荧光分析，显示siFoxf1处理后β-catenin荧光表达增强(图中比例尺为40μm)，图e为siFoxf1转染的BMSCs中β-catenin蛋白表达荧光定量分析，分析结果表明，siFoxf1处理诱导了更多的β-catenin蛋白在细胞核中的积累。
图f为siFoxf1转染的BMSCs中β-catenin，Oct4，Cyclin D1，C-myc和CD44mRNA的mRNA表达量，分析结果表明，siFoxf1处理显著增加了β-catenin，Oct4，Cyclin D1，C-myc和CD44mRNA的表达水平。
5、siFoxf1介导的BMSC的成骨作用被Wnt通路抑制剂DKK1(Dickkopf-1蛋白)逆转。
结果如图5所示，其中：
图a为荧光素酶报告，实验表明，DKK1处理(0.5μg/ml)逆转了siFoxf1处理诱导的Topflash活性增加。
图b和c表示siFoxf1转染的BMSCs中β-catenin蛋白表达量WB(蛋白质免疫印迹)胶图和表达量分析，结果显示，DKK1处理逆转了siFoxf1处理诱导的β-catenin蛋白表达水平的提高。
图d为siFoxf1转染的BMSCs中Runx2和Col1a1的mRNA表达量，分析结果表明，DKK1处理逆转了siFoxf1处理诱导的Runx2和Col1a1 mRNA表达水平的提高。
图e为DKK1处理并转染siFoxf1的BMSC的ALP活性结果，结果显示，siFoxf1处理后ALP染色较深，ALP阳性细胞数较多。
图f为用DKK1处理并用siFoxf1转染的BMSC的Von Kossa染色的代表性图像，结果显示，siFoxf1处理后钙化沉积较多。
实施例2
siFoxf1抑制小鼠去卵巢导致的骨量丢失。
一、材料及方法
1、实验动物
动物实验得到广州中医药大学第一附属医院伦理委员会的批准(TCMF1-2019030)。
2、去卵巢(OVX)进行骨质疏松造模
为了评估OVX引起的骨质疏松症，将8周大的C57BL/6雌性小鼠麻醉切除双侧卵巢(OVX)。在OVX手术后第2天开始siRNA尾静脉注射。我们向OVX或假手术小鼠的尾静脉注射siFoxf1(7mg kg-1)，siCtrl(7mg kg-1)或PBS(0.2ml)，持续6周(每组n＝8)。小鼠体内实验中siFoxf1的靶序列是GATCCGGCTAGCGAGTTTA(SEQ ID NO.4)，其siRNA正义序列即SEQ IDNO.2。
3、micro-CT
使用Skyscan 1172Micro-CT成像系统(Skyscan，比利时)以12毫米的空间分辨率(X射线源80kV/100μA)进行扫描。为了评估L4椎骨微结构，在限定的感兴趣区域内计算小梁骨体积分数(BV/TV，％)，骨小梁数(Tb.N，/mm)，骨小梁厚度(Tb.Th，mm)和骨小梁间距(Tb.Sp，mm)。
4、骨组织形态计量学
为了进行组织学分析，在取材前的第8天和第2天将25mg/kg的钙黄绿素腹腔注射。使用未脱钙的骨样品进行硬组织切片评估骨组织形态学。评估的骨组织形态学参数是骨形成率(BFR/BS，d。μm3·μm-2·d-1)，骨矿沉积率(MAR，每天μm)，矿化表面(MS/BS，％)，成骨细胞数(N.Ob/B.Pm，/mm)，破骨细胞数(N.Oc/B.Pm，/mm)和破骨细胞表面(Oc.S/BS，％)。
5、酶联免疫吸附测定(ELISA)
ELISA试剂盒(Fountain Hills，美国)测量ALP和TRAP5b的血清浓度。
二、结果。
1、siFoxf1可以防治OVX导致的骨丢失。
结果如图6所示，其中：
图a为小鼠体内实验设计示意，具体为将8周大的C57BL/6雌性小鼠麻醉切除双侧卵巢(OVX)。在OVX手术后第2天开始siRNA尾静脉注射。向OVX或假手术小鼠的尾静脉注射siFoxf1(7mg kg-1)，siCtrl(7mg kg-1)或PBS(0.2ml)，持续6周(每组n＝8)。6周后进行腰椎和血清取材，分析腰椎micro-CT、骨组织形态学、qCPR、WB、ELISA。小鼠体内实验中siFoxf1的靶序列是GATCCGGCTAGCGAGTTTA(SEQ ID NO.4)。
图b为小鼠腰4椎骨的微CT扫描的代表性图像(比例尺为1.0毫米)，结果显示，siFoxf1处理后骨小梁增粗、间距变小，骨微细结构改善。
图c-l为椎体骨小梁micro-CT骨微细结构和骨组织形态学分析结果，包括BV/TV，Tb.N，Tb.Th，Tb.Sp，骨形成参数(N.Ob/B.Pm，MS/BS，MAR，BFR/BS)和骨吸收参数(N.Oc/B.Pm和Oc.S/BS)，结果显示，siFoxf1处理后BV/TV、Tb.N、Tb.Th增高，Tb.Sp下降，N.Ob/B.Pm、MS/BS、MAR、BFR/BS增高，N.Oc/B.Pm、Oc.S/BS无明显变化。
以上结果表明siFoxf1可以防治OVX导致的骨丢失。
2、siFoxf1激活β-cantenin通路增加体内骨形成。
结果如图7所示，其中：
图a-c分别表示siFoxf1处理后骨组织中Runx2、Col1a1和TRAP的mRNA表达水平，分析结果显示，siFoxf1处理增加了骨组织中Runx2和Col1a1 mRNA的表达水平，但对TRAPmRNA的表达水平没有影响。
图d和e表示siFoxf1处理后血清ALP的ELISA检测结果，ELISA检测结果显示，siFoxf1处理增加了血清ALP的表达水平，而血清TRAP5b的表达水平没有观察到明显的差异。
图f表示siFoxf1处理后的Sham和OVX骨组织中Foxf1表达水平的qRT-PCR分析，结果证实，使用siFoxf1的Sham和OVX骨组织中Foxf1表达水平显着降低。
图g表示siFoxf1处理后，Sham和OVX体内β-catenin mRNA表达水平的qRT-PCR分析，结果显示，siFoxf1增加了体内β-catenin mRNA的表达水平。
图h为siFoxf1处理后，Sham和OVX体内Foxf1蛋白和β-catenin蛋白表达量WB(蛋白质免疫印迹)胶图和表达量分析，结果显示，siFoxf1递送降低假手术和去卵巢骨组织中Foxf1蛋白表达水平，增加β-catenin蛋白表达水平。
实施例3
siFoxf1促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。
一、材料及方法。
1、PMOP患者来源的椎体骨样品的制备
所有方案均经广州中医药大学附属第一医院伦理委员会批准(伦理号：ZYYECK[2016]028)。本研究纳入了广州中医药大学第一附属医院脊柱外科的26例脊柱相关手术患者，收集椎体骨样本。我们获得了所有患者的书面知情同意。纳入标准如下：
PMOP组：1)55-80岁女性(平均腰椎BMD T值，T≤-2.5)；2)腰椎椎体成形术或内固定术2周前腰椎发生骨折；3)实验室指标正常；4)未摄入影响骨骼代谢药物(例如皮质类固醇，含铝的抗酸剂和肝素)；5)无影响骨代谢的全身性疾病(如继发性骨质疏松，成骨不全，糖尿病)；6)无肝或肾功能不全。
对照组：1)因腰椎退行性疾病(例如腰椎滑脱和腰椎管狭窄)而接受脊柱外科手术的非绝经后女性；2)无骨质疏松症或其他代谢性疾病。
2、人骨髓间充质干细胞(BMSC)分离和培养
将人BMSC(Cyagen Biosciences，中国广州)在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素和链霉素在37℃的培养箱中培养用于后续实验。
3、siRNA介导的沉默和细胞转染
以Foxf1特异的siRNA(靶序列为GTGTGACCGAAAGGAGTTT，即SEQ ID NO.3)，该siRNA的正义序列为GUGUGACCGAAAGGAGUUU，即SEQ ID NO.1，以及阴性对照siRNA(siCtrl)(RiboBio，广州，中国)，用来沉默Foxf1。使用Lipofectamine RNAimax(Invitrogen，美国)进行siRNA转染。
4、成骨细胞分化测定
将BMSC在成骨诱导培养基(Cyagen Biosciences，中国广州)中培养。每三天更换成骨诱导培养基。成骨诱导14至28天后，通过Von Kossa染色(索莱宝，中国)评估矿物质沉积。
5、ALP染色和活性测定
将细胞在4％多聚甲醛中固定20分钟，并用蒸馏水洗涤3次。接下来，用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒(Beyotime，中国上海)对细胞进行染色。为了测定ALP活性，在96孔板上用ALP活性检测试剂盒(碧云天，中国上海)。通过确定405/650nm处的吸光度来定量ALP活性。
6、RNA提取和qRT-PCR
用TRIzol试剂(Invitrogen)从BMSC和BMM中提取总RNA。使用PrimeScript RTMaster Mix(Perfect Real Time；TaKaRa，日本)将总RNA逆转录为cDNA。使用β-actin作为内参，使用SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)定量转录水平。使用2-ΔΔCt方法定量基因表达水平。
7、蛋白质印迹
细胞在RIPA裂解液(Beyotime，中国)中裂解，蛋白质通过15％SDS-page(Bio-rad，美国)分离，并转移到PVDF(Millipore，中国上海)上。将膜在脱脂牛奶(5％)中于室温下封闭2h。接着孵育一抗：β-actin(1:500，Cell Signaling Technology，美国)，Foxf1(1：500，Biorbyt，美国)和β-cantenin(1：500；Cell Signaling Technology，美国)。用PBST洗涤3次，每次10分钟后，将膜与相应的二抗(1：3000；Cell Signaling Technology，美国)在室温下孵育2小时。通过化学发光法(Bio-Rad，美国)确定蛋白质水平。使用Image J软件定量条带强度。
二、结果。
结果如图8所示，其中：
图a为对照组和PMOP组的BMD分析；分析结果显示，PMOP组骨密度较对照组明显降低
图b和c为PMOP患者来源的骨组织中Runx2和Col1a1 mRNA表达水平，qRT-PCR分析结果显示，在PMOP患者来源的骨组织中Runx2和Col1a1 mRNA表达水平显着降低。
图d和e分别为PMOP患者来源的骨组织中Foxf1 mRNA和蛋白表达水平，qRT-PCR和WB分析结果表明，PMOP患者来源的骨组织中Foxf1 mRNA和蛋白表达水平显着提高。
图f和g分别为PMOP患者Runx2和Col1a1 mRNA的表达水平随着BMD水平的变化关系，相关分析结果表明，PMOP患者Runx2和Col1a1 mRNA的表达水平随着BMD水平的降低而降低。
图h为PMOP患者中Foxf1 mRNA的表达水平随着BMD水平的变化关系，相关分析结果表明，PMOP患者中Foxf1 mRNA的表达水平随着BMD水平的降低而增加。
图i和j分别为Foxf1表达水平与PMOP患者骨组织中Runx2和Col1a1 mRNA水平的变化关系，相关分析结果表明，Foxf1表达水平与PMOP患者骨组织中Runx2和Col1a1 mRNA水平的降低呈负相关。
图k为用siFoxf1处理的人BMSC的Von Kossa染色的代表性图像，结果显示，siFoxf1处理后，钙化沉积增多。
图l为siFoxf1转染的人骨髓间充质干细胞ALP活性的定量分析，结果显示，siFoxf1处理后，ALP染色较深，ALP阳性细胞数增多。
图m为siFoxf1处理的人BMSC中Foxf1、Runx2和Col1a1 mRNA表达水平，qRT-PCR分析结果表明，siFoxf1处理可显着降低Foxf1 mRNA表达水平，并提高Runx2和Col1a1 mRNA表达水平。
上述结果说明，siFoxf1可以促进小鼠BMSC成骨分化，并且PMOP患者椎体骨中Foxf1表达升高，Foxf1与BMD、Runx2、cola1A1呈负相关。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<120> Foxf1基因在制备用于骨质疏松症药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gugugaccga aaggaguuu 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gauccggcua gcgaguuua 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgtgaccga aaggagttt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatccggcta gcgagttta 19
Claims (10)
1.Foxf1基因在制备用于治疗骨质疏松症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨质疏松症为绝经后骨质疏松症。
3.沉默Foxf1基因的试剂在制备用于治疗骨质疏松症药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述沉默Foxf1基因的试剂包括：Foxf1特异的siRNA。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述Foxf1特异的siRNA的正义序列选自：SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述Foxf1特异的siRNA的正义序列选自：与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的等同序列，所述等同序列可沉默Foxf1基因。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述Foxf1特异的siRNA与所述SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示序列相似性大于90％。
8.一种用于治疗骨质疏松症药物，其特征在于，包括：特异性沉默Foxf1基因的试剂。
9.根据权利要求8所述的用于治疗骨质疏松症药物，其特征在于，所述Foxf1特异的siRNA的靶序列选自：SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列，与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的等同序列，所述等同序列可沉默Foxf1基因。
10.根据权利要求8所述的用于治疗骨质疏松症药物，其特征在于，所述药物的给药途径为静脉注射液。
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