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CN111164211A - 用于治疗β-血红蛋白病的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗β-血红蛋白病的组合物和方法 Download PDF

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CN111164211A CN201880058809.6A CN201880058809A CN111164211A CN 111164211 A CN111164211 A CN 111164211A CN 201880058809 A CN201880058809 A CN 201880058809A CN 111164211 A CN111164211 A CN 111164211A
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Abstract

本公开提供了表达载体，其包含至少两个核酸序列，即编码抗‑HPRT RNAi的核酸序列和编码γ‑珠蛋白基因的核酸序列。在一些实施方案中，所述病毒载体为自失活慢病毒载体。在一些实施方案中，γ‑珠蛋白基因用于在遗传上矫正镰状细胞病或β‑地中海贫血或者减轻其症状。

Description

用于治疗β-血红蛋白病的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年4月6日提交的美国临时专利申请号62/653,913的提交日期的权益；2017年8月7日提交的美国临时专利申请号62/541,931的提交日期的权益；和还有2017年7月18日提交的美国临时专利申请号62/533,719的提交日期的权益，这些临时专利申请的公开内容各自在此通过提及而以其整体合并入本文。
公开领域
总体而言，本公开内容涉及分子生物学领域，和特别地涉及载体和由载体转导的宿主细胞。
公开内容的背景
β-血红蛋白病(包括β-地中海贫血和镰状细胞病(SCD))是影响血红蛋白的功能或水平的异质的一组通常遗传的病症。SCD和β-地中海贫血是世界上最常见的单基因病症，每年有大约40万受影响的新生儿。临床表现典型地在出生后几个月在从胎儿血红蛋白(HbF)向成人β-珠蛋白的转换期间出现，并且可以是严重的，具有相当高的发病率和死亡率。同种异体骨髓移植是有疗效的，但局限于具有适当匹配的供者的那些患者。利用患者自身细胞的自体基因疗法是一种有吸引力的治疗选择，
β-地中海贫血是一种以功能性血红蛋白的水平下降为特征的遗传性血液病症。β-地中海贫血由在血红蛋白β亚基(在下文中“HBB基因”)(其被认为以常染色体隐性方式进行遗传)中的突变引起。重型β-地中海贫血(其在临床上被定义为输血依赖性的)由血红蛋白β链的合成降低或不存在引起。该疾病的严重度取决于突变的性质，具有从严重贫血至在临床上无症状的个体变动的可变结局。
已经描述了数百种不同的突变，它们通过对于广泛的过程(包括转录、mRNA剪接/加工、RNA稳定性、翻译和珠蛋白肽稳定性)的效应来影响β-珠蛋白水平。认为低的β-珠蛋白含量允许过量的α-珠蛋白链在红细胞前体中沉淀。进一步认为，α-珠蛋白聚集体引起细胞膜损害并导致早期红细胞前体死亡。在患者中发现的所得的无效红细胞生成，如果严重的话，可能需要频繁的输血。
镰状细胞贫血(“SCA”)产生自在β-珠蛋白基因的外显子1中的单个点突变，其导致在经突变的镰刀状形式的血红蛋白(血红蛋白S(HbS))中在位置6处谷氨酸被缬氨酸替换。除了纯合的血红蛋白S(“HbSS”)外，还存在可以导致SCD的其他基因型。虽然经典的SCA经常被定义为纯合的HbSS，但是纯合的血红蛋白C(“HbSC”)和地中海贫血(“HbS/β0”)是具有基本上相同的疾病表现的常见基因型。HbS在脱氧合后聚合，这导致镰刀形状的红细胞(“RBC”)，其阻塞微脉管系统。SCD在临床上以变化的程度的贫血和发作性血管闭塞危象(其导致多器官损害和早产儿死亡)为特征。除了镰状化外，还存在过度溶血和慢性炎症状态。
SCD患者每年占大约75,000例USA住院治疗，导致4亿7千5百万美元的估计年支出。在世界范围内，SCD在单基因病症的发生率中为第二，仅次于地中海贫血，每年在非洲有超过200,000名出生的儿童具有该疾病。对于SCD来说目前可用的医学管理选项包括血管闭塞危象的支持性管理；长期输血以避免或防止SCD的严重并发症例如中风或急性胸部综合征的复发；以及用羟基脲的胎儿血红蛋白(HbF)诱导。匹配的同种异体造血干细胞(HSC)移植被认为是有疗效的，但是受到匹配的相关供者的可得性限制并且具有潜在的严重并发症。在胎儿生活中，γ-珠蛋白基因(导致HbF；α2γ2)是由β-珠蛋白基因座表达的占优势的基因，并且β-珠蛋白基因表达被阻遏。但是，在出生后，胎儿γ-珠蛋白基因的表达下降至可忽略的水平，同时伴随β-珠蛋白表达的增加。在成年生活中，胎儿γ-珠蛋白转录物被高度沉默，即基因表达被调控以阻止或减少γ-珠蛋白的表达。该表达变化导致降低的HbF，以及HbA(α2β2)的相应增加。已知γ-珠蛋白具有抗镰状化特性，并因此考虑添加该基因用于基因疗法。
由于各种各样的原因，血红蛋白病，尤其是SCD，是用于基因疗法的主要靶标。其高的患病数、重大的发病率和死亡率以及所导致的终生姑息性医疗护理的高费用预示着，治愈性疗法可以极大地改善患者结局并且显著地降低相关的医疗费用。在过去的9年中，已在人临床试验中评价了通过将治疗性β-珠蛋白基因离体慢病毒转移到自体CD34+造血干/祖细胞(HSPC)中的用于β-血红蛋白病的基因疗法。在基因疗法后超过12个月，基于重度骨髓抑制疗法的自体HSC移植在β-地中海贫血患者中导致了输血不依赖或输血体积减少。最近，在具有SSD的青少年中已报道了治愈性应答(参见Thompson等人,“Gene therapy inpatients with transfusion-dependent Beta-Thalassemia,”N Engl J Med.2018年4月19日,378(16):1479-1493，其公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文)。尽管具有有希望的结果，但是在这些试验中的大多数受试者未能取得基因经矫正的自体HSPC的移植物移入的水平或者达到与临床益处相关的该治疗性蛋白质的阈值表达水平。
公开内容的简短概括
用于修饰人干细胞的基因疗法策略有很大希望去治愈许多人类疾病，包括血红蛋白病。认为基因经修饰的干细胞的移植物移入可以通过下述方式来增强：改造其中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(“HPRT”)表达被敲低的干细胞，由此通过赋予对于鸟嘌呤类似物抗代谢物的抗性而使得能够选择经遗传修饰的细胞。
在本公开内容的一个方面中为组合物，其包含将治疗性基因引入到造血干细胞(“HSC”)中的组分，其也同时降低在HSC中HPRT的表达。在一些实施方案中，所述组合物包含第一组分，其被设计成用于实行HPRT表达的降低(例如，被设计成用于敲低HPRT的试剂或者被设计成用于敲除HPRT的试剂)。在一些实施方案中，所述组合物包含第二组分，即编码治疗性基因的核酸。在一些实施方案中，所述组合物包含慢病毒表达载体，其包含编码被设计成用于敲低HPRT基因或者要么用于实行HPRT表达的降低的试剂的第一核酸；和编码所述治疗性基因的第二核酸序列。在一些实施方案中，可以将所述慢病毒表达载体掺入到纳米胶囊内，例如经调整而适应于靶向HSC的纳米胶囊。在一些实施方案中，所述治疗性基因为γ-珠蛋白。
在一些实施方案中，所述第一组分被设计成用于敲低HPRT。在一些实施方案中，所述第一组分为RNAi，例如siRNA、shRNA或miRNA。在一些实施方案中，所述第一组分为靶向未剪接的HPRTmRNA的反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述第一组分被设计成用于敲除HPRT。在一些实施方案中，所述第一组分为融合蛋白，其包含结合内源次黄嘌呤-鸟嘌呤HPRT基因的锌指蛋白和切割结构域，其中所述融合蛋白修饰内源HPRT基因。在一些实施方案中，加载了Cas9的单向导RNA(sgRNA)可以用于靶向在CCR5基因座位(人3号染色体)中的CCR5区域(靶序列，5′-GAGCAAGCTCAGTTTACACC-3′)，以“敲入”Pol-II-驱动的shHPRT，以便实行HPRT的“敲低的表达”(参见例如，SEQ ID NO:61和69)。在一些实施方案中，将被设计成用于敲除HPRT的所述第一组分包含在非病毒递送运载体内。在一些实施方案中，将被设计成用于敲除HPRT的所述第一组分包含在纳米胶囊(例如，经调整而适应于靶向HSC的纳米胶囊)内。在一些实施方案中，所述组合物包含：(i)纳米胶囊，其被配置成用于递送和/或释放被设计成用于敲除HPRT的所述第一组分；和(ii)慢病毒表达载体，其包含所述第二组分，即编码所述治疗性基因的核酸。
在本公开内容的另一个方面中为表达载体，其包含：(i)编码靶向HPRT基因的RNAi、反义寡核苷酸或外显子跳跃试剂的第一核酸序列；和(ii)编码治疗性基因的第二核酸序列。在一些实施方案中，编码RNAi的所述第一核酸编码靶向HPRT的小发夹核糖核酸分子(“shRNA”)。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸具有与SEQID NO:30的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:30的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:30的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:30的序列具有至少97％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有SEQ ID NO:30的序列。
在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQID NO:27-29中的任一个具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:27-29中的任一个具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ IDNO:27-29中的任一个具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:27-29中的任一个具有至少97％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有SEQ ID NO:27的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有SEQ IDNO:28的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有SEQID NO:29的序列。
在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQID NO:31的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:31的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:31的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:31的序列具有至少97％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有SEQ ID NO:31的序列。
在一些实施方案中，编码治疗性基因的所述第二核酸为可以在遗传上矫正镰状细胞病或β-地中海贫血或者减轻其症状(包括严重SCD的症状)的核酸。在其他实施方案中，所述编码治疗性基因的核酸为可以在遗传上矫正免疫缺陷、遗传性疾病、血液疾病(例如，血友病、血红蛋白病症)、神经学疾病和/或溶酶体贮积病或者减轻其症状的核酸。在一些实施方案中，所述载体为慢病毒载体。在一些实施方案中，所述治疗性基因为γ-珠蛋白。在一些实施方案中，编码治疗性基因的所述第二核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，编码治疗性基因的所述第二核酸序列具有与SEQID NO:55的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，编码治疗性基因的所述第二核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，编码治疗性基因的所述第二核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少97％同一性的序列。在一些实施方案中，编码治疗性基因的所述第二核酸序列具有SEQ ID NO:55的序列。
在本公开内容的另一个方面中为慢病毒表达载体，其包含编码抗-HPRT shRNA或内嵌在微小RNA内的抗-HPRT shRNA的第一核酸序列；和编码治疗性基因的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体适合于离体转导HSC。在一些实施方案中，所述慢病毒载体适合于产生可选择的经遗传修饰的细胞，例如HSC。在一些实施方案中，可以将所述经离体转导的HSC施用给有治疗需要的患者，例如用于治疗血红蛋白病，包括β-地中海贫血和镰状细胞病。
在一些实施方案中，所述治疗性基因为γ-珠蛋白基因。在一些实施方案中，编码γ-珠蛋白基因的所述第二核酸序列为包括点突变的杂合γ-珠蛋白基因，所述点突变赋予对于α-珠蛋白链的竞争优势，其中相对于HbS而言偏转四聚体HbF的形成。在一些实施方案中，将编码γ-珠蛋白基因的所述第二核酸序列可操作地连接至β-珠蛋白启动子。在一些实施方案中，编码γ-珠蛋白基因的所述第二核酸序列与SEQ ID NO:55的序列具有至少95％序列同一性。
在一些实施方案中，将所述第一核酸序列可操作地连接至Pol III启动子。在一些实施方案中，所述Pol III启动子为智人(homo sapiens)细胞系HEK-293 7sk RNA启动子(参见例如，SEQ ID NO:32)。在一些实施方案中，所述Pol III启动子为7sk启动子，其相比于SEQ ID NO:32而言在其核酸序列中包括单个突变。在一些实施方案中，所述Pol III启动子为7sk启动子，其相比于SEQ ID NO:32而言在其核酸序列中包括多个突变。在一些实施方案中，所述Pol III启动子为7sk启动子，其相比于SEQ ID NO:32而言在其核酸序列中包括缺失。在一些实施方案中，所述Pol III启动子为7sk启动子，其相比于SEQ ID NO:32而言在其核酸序列中包括突变和缺失两者。在一些实施方案中，将所述第一核酸序列可操作地连接至与SEQ ID NO:32的序列具有至少95％同一性的启动子。在一些实施方案中，将所述第一核酸序列可操作地连接至与SEQ ID NO:33的序列具有至少95％同一性的启动子。在一些实施方案中，将所述第一核酸序列可操作地连接至与SEQ ID NO:33的序列具有至少97％同一性的启动子。在一些实施方案中，将所述第一核酸序列可操作地连接至与SEQ ID NO:33的序列具有至少98％同一性的启动子。在一些实施方案中，将所述第一核酸序列可操作地连接至与SEQ ID NO:33的序列具有至少99％同一性的启动子。在一些实施方案中，将所述第一核酸序列可操作地连接至具有SEQ ID NO:33的启动子。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体进一步包含表达控制序列，其具有在所述第二核酸序列上游的5'长末端重复序列，和在所述编码γ-珠蛋白基因的核酸下游的3'长末端重复序列。
在本公开内容的另一个方面中为载体，其包含：(i)编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列；和(ii)编码治疗性基因的核酸序列。在一些实施方案中，所述治疗性基因用于在遗传上矫正镰状细胞贫血或β-地中海贫血；或者减轻其症状。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:67的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:67的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:67的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:67的序列。
在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:68的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:68的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:68的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:68的序列。
在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:25的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:25的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:25的序列。
在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:26的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:26的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的基于微小RNA的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:26的序列。
在本公开内容的另一个方面中为适合于转导人细胞(例如，HSC)的慢病毒表达载体，其包含可操作地连接至第一启动子(例如，Pol III启动子)的第一核酸序列和可操作地连接至第二启动子(例如，Pol II启动子)的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列编码敲低HPRT或者要么降低HPRT表达的试剂，和其中所述第二核酸序列编码治疗性基因。在一些实施方案中，所述第一核酸序列与SEQ ID NO:30的序列具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，所述第一核酸序列与SEQ ID NO:31的序列具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，所述第一核酸序列具有SEQ ID NO:31的序列。在一些实施方案中，所述第二核酸编码γ-珠蛋白(例如，SEQ ID NO:3或55中的任一个)。在一些实施方案中，所述第二核酸序列与SEQ ID NO:55的序列具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，所述第一启动子为7sk启动子。在一些实施方案中，所述7sk启动子与SEQ ID NO:32的序列具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，所述第二启动子为β-珠蛋白启动子。在一些实施方案中，所述β-珠蛋白启动子与SEQ ID NO:66的序列具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体具有与SEQ ID NO:5-22中的任一个具有至少85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体具有与SEQ ID NO:5-22中的任一个具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体具有与SEQ ID NO:5-22中的任一个具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体具有与SEQ ID NO:5-22中的任一个具有至少96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体具有与SEQ ID NO:5-22中的任一个具有至少97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体具有与SEQ ID NO:5-22中的任一个具有至少98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体具有与SEQ ID NO:5-22中的任一个具有至少99％序列同一性的序列。
在本公开内容的另一个方面中为多核苷酸序列，其包含：(a)编码靶向HPRT的shRNA的序列；(b)编码γ-珠蛋白基因的序列；(c)编码第一启动子的序列，所述第一启动子用于驱动所述编码靶向HPRT的shRNA的序列的表达；(d)编码第二启动子的序列，所述第二启动子用于驱动所述编码γ-珠蛋白基因的序列的表达；(e)编码中央多聚嘌呤束元件的序列；和(f)编码Rev应答元件(SEQ ID NO:56)的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸进一步包含基因座控制区(SEQ ID NO:57)。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ IDNO:5-22中的任一个具有至少85％同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ IDNO:5-22中的任一个具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ IDNO:5-22中的任一个具有至少91％同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ IDNO:5-22中的任一个具有至少92％同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ IDNO:5-22中的任一个具有至少93％同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ IDNO:5-22中的任一个具有至少94％同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ IDNO:5-22中的任一个具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ IDNO:5-22中的任一个具有至少96％同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ IDNO:5-22中的任一个具有至少97％同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ IDNO:5-22中的任一个具有至少98％同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ IDNO:5-22中的任一个具有至少99％同一性。在一些实施方案中，所述第一启动子为pol III启动子。在一些实施方案中，所述第一启动子为7sk启动子。在一些实施方案中，所述7sk启动子与SEQ ID NO:32的序列具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，所述第二启动子为pol II启动子。在一些实施方案中，所述第二启动子为β-珠蛋白启动子。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列包括11,000至12,750个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列包括11,500至12,000个核苷酸。
在本公开内容的另一个方面中为药用组合物，其包含：(a)载体，例如表达载体，其包含(i)编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列；和(ii)编码治疗性基因(例如γ-珠蛋白基因)的核酸序列；和(b)在药学上可接受的载料。在一些实施方案中，将所述药用组合物配制为乳液。在一些实施方案中，将所述药用组合物配制在胶束内。在一些实施方案中，将所述药用组合物包囊在聚合物内。在一些实施方案中，将所述药用组合物包囊在脂质体内。在一些实施方案中，将所述药用组合物包囊在小细胞或纳米胶囊内。
在本公开内容的另一个方面中为用于产生经遗传修饰的细胞的方法，所述方法包括：使细胞与“敲低”HPRT基因的第一试剂和引入治疗性基因以用于表达的第二试剂相接触。在一些实施方案中，通过使所述细胞与包含编码所述第一和第二试剂两者的核酸序列的慢病毒表达载体相接触来对所述细胞进行遗传修饰。在一些实施方案中，所述细胞为HSC。
在本公开内容的另一个方面中为用于产生经遗传修饰的细胞的方法，所述方法包括：使细胞与“敲除”HPRT基因的第一试剂和引入治疗性基因以用于表达的第二试剂相接触。在一些实施方案中，使用非病毒递送运载体以来向所述细胞引入所述第一试剂；和使用慢病毒表达载体来向所述细胞引入所述第二试剂。在一些实施方案中，所述非病毒递送运载体为纳米胶囊。在一些实施方案中，所述细胞为HSC。
在本公开内容的另一个方面中为HSC(例如，CD34+HSC)，其已经用包含治疗性基因和被设计成用于减少HPRT表达(例如，通过HPRT的敲低或敲除)的试剂的表达载体进行了转导。在一些实施方案中，所述经转导的HSC是可以施用给有其治疗需要的受试者的细胞疗法产品。在一些实施方案中，所述治疗性基因为γ-珠蛋白基因。在一些实施方案中，所述γ-珠蛋白基因编码与SEQ ID NO:4的序列具有至少90％序列同一性的肽。
在本公开内容的另一个方面中为HSC，其已经用包含编码杂合γ-珠蛋白基因(例如，SEQ ID NO:3或55)的核酸序列和编码抗-HPRTshRNA(SEQ ID NO:1、2、30或31)的核酸的表达载体进行了转导。在一些实施方案中，所述抗-HPRT shRNA由7sk启动子(例如，SEQ IDNO:32或33)来驱动。在一些实施方案中，将7sk/sh734相对于杂合γ-珠蛋白盒而言以有义或反义方向定向于上游或下游。在一些实施方案中，所述经转导的HSC是可以施用(例如，在包含有在药学上可接受的运载体的药用组合物中)给有其治疗需要的受试者(例如，哺乳动物；人患者)(例如，用于治疗镰状细胞病)的细胞疗法产品。
在本公开内容的另一个方面中为用于在有其治疗需要的患者(例如，人患者)中治疗血红蛋白病的方法，所述方法包括：(a)用慢病毒表达载体转导HSC，其中所述慢病毒表达载体包含编码抗-HPRTshRNA或内嵌在微小RNA内的抗-HPRT shRNA的第一核酸序列；和编码γ-珠蛋白基因的第二核酸序列；和(b)将所述经转导的HSC移植到所述患者内。在一些实施方案中，所述HSC是自体的或同种异体的。在一些实施方案中，所述抗-HPRT shRNA具有SEQID NO:30或31中的任一个的序列。在一些实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸具有SEQ ID NO:55的序列。在一些实施方案中，在移植经转导的HSC施用之前用重度骨髓抑制调理(conditioning)对所述患者进行预治疗(例如，用嘌呤类似物，包括6-硫代鸟嘌呤(“6TG”)；用化学治疗试剂；用辐射；用抗体-药物缀合物，例如在美国专利公开号2017/0360954和2018/0147294以及PCT公开号WO/2017/219025和WO/2017/219029(其公开内容各自通过提及而以其整体合并入本文)中所描述的那些。在一些实施方案中，在移植后在体内选择经转导的HSC(例如，用6TG)。在一些实施方案中，施用氨甲蝶呤(“MTX”)或麦考酚酸(“MPA”)以改善移植经转导的HSC的任何副作用(例如，移植物抗宿主病)。
认为采用经联合的调理和化学选择(例如用嘌呤类似物)的策略，可以取得HPRT-缺陷的、包含γ-珠蛋白基因的造血干细胞的有效且高度的移植物移入，并且认为可以以低的总毒性来完成这样高度的移植物移入。认为与γ-珠蛋白基因的谱系特异性表达相组合的基因经修饰的HSC的增强的移植物移入和化学选择可以导致足够频率的表达所书治疗性γ-珠蛋白转基因的红细胞，从而允许胎儿血红蛋白形成的水平增加以矫正SCD和/或β-地中海贫血。作为安全措施，可以对HPRT-缺陷型细胞进行负选择，例如通过引入MTX或MPA，以抑制在嘌呤从头合成途径中的二氢叶酸还原酶(DHFR)这种酶，如此杀死HPRT缺陷型细胞。
进一步认为，可以通过使用嘌呤类似物(例如，6TG)的制度来在体内选择HPRT-缺陷型HSC以增强移植物移入。还认为经扩展的基因经修饰的HSC可以分化为表达所述治疗性γ-珠蛋白转基因的红细胞。在本文中所描述的基因疗法组合物具有这样的潜力，即不仅矫正SCD和β-地中海贫血，而且还极大地改进关于自体造血干细胞移植的目前的“金标准”。改进可以允许：(i)使用基因经修饰的HSC的门诊患者程序；(ii)少的不利事件(AE)，包括避免与其他临床疗法相关的不育；(iii)低剂量口服施用以用于调理(相比于高剂量IV调理而言)；(iv)基因经修饰的细胞的体内选择；和/或(v)低的与移植和调理有关的程序死亡率。
附图简述
图1A和1B提供了根据本公开内容的某些实施方案的表达载体的示意图。
图2列出了流程图，其图解说明了用经转导的HSC来治疗受试者的方法，包括按照本公开内容的某些实施方案的调理和化学选择的步骤。
图3图解说明了嘌呤补救途径。
图4图解说明了关于合成dTTP的从头路径。
图5图解说明了关于在6TG存在下选择HPRT-缺陷型细胞的过程。
图6提供了TL20c-7SKM1/sh734-rGbGM的载体图谱。
图7提供了TL20c-7SK/sh734-rGbGM的载体图谱。
图8提供了TL20c-r7SKM1/sh734-rGbGM的载体图谱。
图9提供了TL20c-r7SK/sh734-rGbGM的载体图谱。
图10提供了TL20c-rGbGM-7SKM1/sh734的载体图谱。
图11提供了TL20c-rGbGM-7SK/sh734的载体图谱。
图12提供了TL20c-rGbGM-r7SKM1/sh734的载体图谱。
图13提供了TL20c-rGbGM-r7SK/sh734的载体图谱。
图14提供了TL20c-rGbGM的载体图谱。
图15提供了TL20d-7SKM1/sh734-rGbGM的载体图谱。
图16提供了TL20d-7SK/sh734-rGbGM的载体图谱。
图17提供了TL20d-r7SKM1/sh734-rGbGM的载体图谱。
图18提供了TL20d-r7SK/sh734-rGbGM的载体图谱。
图19提供了TL20d-rGbGM的载体图谱。
图20提供了TL20d-rGbGM-7SKM1/sh734的载体图谱。
图21提供了TL20d-GbGM-7SK/sh734的载体图谱。
图22提供了TL20d-rGbGM-r7SKM1/sh734的载体图谱。
图23提供了TL20d-rGbGM-r7SK/sh734的载体图谱。
图24提供了关于用于敲低HPRT的由EF1a驱动的基于微小RNA的shRNA的图解。
图25A和25B图解说明了用在纳米胶囊中递送的sh734,miRNA RNA构建体瞬时转染的K562的6TG选择。将1×105个K562细胞与EF1a-GFP/EF1a-sh734-3G/EF1a-sh211-3G/7sk-sh734纳米胶囊(200ng的DNA)一起温育4小时。在第2天将6TG添加到培养基中至1μM的终浓度。图25A图解说明了在第3天测量的用EF1a-GFP纳米胶囊转染的K562细胞的GFP表达。图25B图解说明了在第5和7天使用TC10所测量的活细胞数目。
图26提供了具有用于敲入到CCR5区域中的同源臂的由EF1a驱动的基于微小RNA的shRNA的图解。
图27A、27B和27C图解说明了关于HPRT的对照K562细胞的FAC染色：未染色的(图27A)、HPRT阳性细胞(图27B)和在CCR5基因座处敲入有EF1a-sh211-3G的K562细胞(图27C)。门显示了HPRT阴性的细胞的频率。图27A显示，大约99.6％的细胞未能表达HPRT。在对照中，100％的未转导的细胞(图27B)对于HPRT表达而言呈阳性染色。
图28图解说明了内嵌在miRNA-3G主链(衍生自天然miRNA 16-2结构的第三代miRNA支架)中的sh734(也可参见SEQ ID NO:26)。
图29图解说明了内嵌在miRNA-3G主链(衍生自天然miRNA16-2结构的第三代miRNA支架)中的sh211(也可参见SEQ ID NO:25)。
图30A图解说明了sh734的二级结构和理论上的主要DICER切割位点(箭头)(也可参见SEQ ID NO:30)。所述二级结构具有大约-30.9kcal/mol的MFE值。
图30B图解说明了经修饰的版本的sh734(sh734.1)(也可参见SEQ ID NO:31)。所述二级结构具有-36.16kcal/mol的MFE值。
图31A图解说明了关于sh211的二级RNA结构和最小自由能(δG)(也可参见SEQ IDNO:28)。
图31B图解说明了关于sh616的二级RNA结构和最小自由能(δG)(也可参见SEQ IDNO:27)。
图32A图解说明了人工miRNA734(111nt)的从头设计。在miRNA 211二级结构中通过箭头指明了5'和3'DROSHA靶位点和5'和3'Dicer切割位点(也可参见SEQ ID NO:23)。
图32B图解说明了人工miRNA211(111nt)的从头设计(也可参见SEQ ID NO:24)。
图33图解说明了Ago-sh734二级结构(模拟人miRNA451结构)(也可参见SEQ IDNO:58)。
图34列出了流程图，其图解说明了关于RNAi设计、启动子和结构的选择、功能测试和安全性评价的四个步骤的过程。在一些实施方案中，使用siRNA设计算法来获得shRNA靶标的候选物。随后，设计并合成具有不同启动子(Pol III或Pol II)和不同shRNA设计(shRNA、第3代miRNA、从头miRNA和dicer非依赖性Ago-shRNA)的不同shRNA表达系统，以用于功能测试和安全性研究。功能测试通过在经转导的细胞系中测量HPRT的敲低和用6-TG进行选择来进行。分析细胞生存力和miRNA表达以用于安全性评价。临床前测试和安全性研究在体外原代细胞(包括造血干细胞和祖细胞)和经建立的细胞系中以及在体内鼠类和非人灵长类模型中进行。
图35图解说明了人7sk启动子突变。图解说明了在7sk启动子中引入到顺式远侧序列增强子(DSE)和近侧序列增强子(PSE)元件(长的、宽的方框)中的突变(箭头)和缺失，相对于TATA盒(高的、细的方框)而言。
图36图解说明了在7sk启动子内的转录结合位点的位置和概率，并且突显了在远侧序列增强子(DSE)中的两个经突变的OCT转录因子结合位点。还显示了关于红细胞谱系转录因子TAL-1和GATA-1的在该启动子内的经预测的结合位点。
图37提供了全长智人次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)，mRNA_NM_000194.2(SEQID NO:59)。在HPRT的编码序列(加有下划线的文本)内以粗体文本突显了关于所描述的siRNA/shRNA的靶序列的位置。
图38图解说明了CRISPR/Cas9基因编辑策略和用于敲低人HPRT基因表达的sgRNA候选物(参见SEQ ID NO:61和69)。
图39列出了杂合γ-珠蛋白序列sGbGM，并且图解说明了以粗体和加有划线的文本显示的与所比对的人内源γ-珠蛋白(参见SEQ ID NO:55)之间的差异。
图40A提供了pTL20c载体的组分的示意性图示。
图40B图解说明了关于pTL20c载体的载体图谱。
图41图解说明了sGbGM慢病毒载体的相关转基因和调控序列。
图42A提供了pTL20c-sGbGM载体的示意性图示。
图42B图解说明了关于pTL20c-sGbGM载体的载体图谱。
图43A提供了TL20c-rGbGM-7SK/sh734载体的示意性图示。
图43B图解说明了关于TL20c-rGbGM-7SK/sh734载体的载体图谱。
图44A图解说明，TL20主链改善了VSVg-假型SIN-慢病毒载体的转导效率。
图44B列出了从sGbGM、pTL20c-sGbGM和TL20c-rGbGM-7SK/sh734载体获得的平均滴度。
图45列出了sGbGM和sGbGM-7SK/sh734载体的载体感染性。
图46图解说明了sGbGM以及在单载体(pTL20c-sGbGM)和双载体(pTL20c-sGbGM-7SK/sh734)之间的等价表达。
图47图解说明了在用TL-20c-rGbGM载体或TL20c-rGbGM-7SK/sh734载体转导的K562细胞中Aγ-珠蛋白转基因的等价表达。
图48图解说明了在红细胞分化期间sh7转基因的表达在K562细胞中是不变化的。
图49A列出了图形，其表明用阴性对照GbGM单载体(TL20c-rGbGM)转导的K562细胞在6TG处理期间没有显示出载体拷贝数的增加。
图49B列出了图形，其表明对照sh7 GFP报告构建体在6TG处理期间显示出载体拷贝数的增加，其与正选择相关联。观察到随时间的载体拷贝数的逐渐下降，尽管在培养物中GFP阳性细胞的百分比得到保持。
图49C提供了图形，其表明了TL20c-rGbGM-7SK/sh734的6TG选择动力学和稳定性。
图49D提供了图形，其显示从TL20c-rGbGM-7SK/sh734载体中去除cHS4 Ins-100绝缘子提供了相比于TL20c-rGbGM-7SK/sh734载体而言相当的6TG选择动力学和稳定性。这表明，去除该绝缘子没有不利地影响表达或者导致在慢病毒构建体中的sh7转基因的沉默。
图49E提供了图形，其表明了TL20c-rGbGM-r7SK/sh734的6TG选择动力学和稳定性。
图49F提供了图形，其表明了TL20c-rGbGM-r7SK/sh734的6TG选择动力学和稳定性。
图49G提供了图形，其表明了TL20c-r7SK/sh734-rGbGM的6TG选择动力学和稳定性。
图49H显示了作为敲低效率的量度的sh734/HPRT比。
图49I图解说明，表达GFP的对照sh7慢病毒载体在6TG处理后14天在sh7基因经修饰的细胞中显示出明显的增加。在6GT处理后，在第21天，用sh7-GFP报告构建体转导的K562培养物为35％GFP+，并且到第42天之前增加至88％GFP+细胞。这些发现暗示，sh7在培养物中以足以维持HPRT阻抑和6TG抗性的水平在经转导的K562细胞中组成性地表达超过3个月，而没有沉默或毒性的迹象。重要的是，在停止6TG选择压力后，所选择的细胞群体保持长期的增殖稳定性超过两个月。
图49J图解说明了用sh734-GFP报告构建体转导的K562细胞的体外选择。为了建立关于LV转导的细胞表达sh734 RNA和赋予6TG抗性的构思的证明，监测在用6TG(300nM)处理14天的培养物中基因经修饰的K562 GFP+细胞的富集。相比于用其中sh734位于GFP下游的载体转导的培养物而言，具有以有义方向在GFP报告盒的任一方向上位于GFP上游的sh734的两个载体显示出明显更快的富集基因经修饰的细胞所需的时间。在K562细胞中，sh734的相对表达水平/％GFP与HPRT的有效敲低和快速的6TG选择相关。
图49K列出了表格，其提供了相应于在图49J中列出的图形的额外数据。
图50图解说明，表达sh7的经TL20c-rGbGM-7SK/sh734转导的K562细胞有效地下调HPRT并且赋予6-TG抗性细胞的长期稳定性。
图51A和51B图解说明，用TL20c-rGbGM-7SK/sh734载体或sh7-GFP单载体报告构建体转导的K562细胞展示出相似的sh7表达水平以及HPRT敲低和6TG选择的动力学。
图52A、52B和52C图解说明了CD34+经扩展的培养物，在6TG选择下，随后为红细胞分化。
图53图解说明了关于多个不同载体的构建体，其中比较性地图解说明了在每一个所述载体的组分之间的差异。
序列表
在本文中所提供的核酸和氨基酸序列通过使用如在37C.F.R.1.822中所定义的关于核苷酸碱基的标准字母缩写和关于氨基酸的三字母代码来显示。序列表以在2018年7月16日创建的名称为“2018-07-16_Calimmune-051WO_ST25.txt”的ASCII文本文件(323KB)进行提交，其通过提及而合并入本文。
详细描述
定义
还应当理解，除非有相反的明确说明，在任何包括多于一个步骤或动作的在本文中所要求保护的方法中，所述方法的步骤或动作的顺序并不必然局限于叙述所述方法的步骤或动作时所采用的顺序。
如在本文中所使用的，单数术语“a”、“an”和“the”包括复数所指事物，除非上下文中另有明确说明。类似地，单词“或”旨在包括“和”，除非上下文中另有明确说明。
如在此在说明书中和在权利要求书中所使用的，短语“至少一个(种)”，在提及一个或多个要素的列表时，应当理解为意指选自在该要素列表中的那些要素中的任一个或多个的至少一个要素，但不必然包括在该要素列表内具体列出的每一个要素中的至少一个并且不排除在该要素列表中的要素的任何组合。该定义还允许，除了在短语“至少一个(种)”所涉及的要素列表内具体标识出的要素之外，可以任选地存在其他要素，不论与那些具体标识出的要素相关还是不相关。因此，作为非限制性的例子，“A和B中的至少一个”(或者等价地，“A或B中的至少一个”，或者等价地，“A和/或B中的至少一个”)，在一个实施方案中，可以是指至少一个(任选地，包括多于一个)A，没有B存在(和任选地，包括除了B之外的其他要素)；在另一个实施方案中，可以是指至少一个(任选地，包括多于一个)B，没有A存在(和任选地，包括除了A之外的其他要素)；在另外一个实施方案中，可以是指至少一个(任选地，包括多于一个)A，和至少一个(任选地，包括多于一个)B(和任选地，包括其他要素)；等等。
术语“包含(comprising)”、“包括(including)”、“具有(having)”等可互换使用并且具有相同的含义。类似地，“包含(comprises)”、“包括(includes)”、“具有(has)”等可互换使用并且具有相同的含义。特别地，所述术语中的每一个被定义为与“包含”的常见美国专利法定义相一致，并因此被解释为开放术语，其意指“至少下列”，和也被解释为不排除另外的特征、限制、方面等。因此，例如，“具有部件a、b和c的装置”意指，所述装置包括至少部件a、b和c。类似地，短语“牵涉步骤a、b和c的方法”意指，所述方法包括至少步骤a、b和c。此外，虽然在本文中可能以特定的顺序概述了步骤和过程，但是专业技术人员将会认识到，按顺序排列的步骤和过程可以变动。
如在此在说明书中和在权利要求书中所使用的，“或”应当被理解为具有与上面所定义的“和/或”相同的含义。例如，当在列表中分开项目时，“或”或者“和/或”应当被解释为是包括性的，即包括许多要素或要素列表中的至少一个(但也包括多于一个)，和任选地，另外的未列出的项目。仅明确指出相反的术语，例如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”，或者当在权利要求书中使用时，“由……组成”，将是指包括许多要素或要素列表中的恰好一个要素。通常，在本文中所使用的术语“或”应当仅被解释为指出排他性的择一选项(即，“一个或另一个而不是两者”)，当前面是具有排他性的术语，例如“(两者中)任一个”、“……中的一个”、“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”时。当在权利要求书中使用时，“基本上由……组成”应当具有在专利法领域中所使用的其普通含义。
如在本文中所使用的，术语“施用”意指向有治疗需要的受试者(例如，人患者)提供组合物、制剂或特定试剂，包括在本文中所描述的那些。
如在本文中所使用的，术语“造血细胞移植物”或“造血细胞移植”是指骨髓移植、外周血干细胞移植、脐静脉血移植或任何其他来源的多能造血干细胞。同样地，术语“干细胞移植物”或“移植物”是指这样的组合物，包含与在药学上可接受的载料相接触(例如，悬浮于在药学上可接受的载料中)的干细胞。此类组合物能够通过导管施用给受试者。
如在本文中所使用的，术语“功能性核酸”是指这样的分子，其具有通过与编码蛋白质的转录物直接相互作用来降低该蛋白质的表达的能力。siRNA分子、核酶和反义核酸是示例性的功能性核酸。
如在本文中所使用的，术语“基因”广义地是指与生物学功能相关联的DNA的任何区段。基因包括序列，包括但不限于编码序列、启动子区、顺式调控序列、作为关于调控蛋白的特异性识别序列的非表达型DNA区段、对于基因表达作出贡献的非表达型DNA区段、被设计成具有所希望的参数的DNA区段或者其组合。
如在本文中所使用的，术语“基因沉默”意在描述基因、转录物和/或多肽产物的下调、敲低、降解、抑制、阻抑、阻遏、阻止或经降低的表达。基因沉默和干扰还描述了阻止mRNA转录物被翻译成多肽。在一些实施方案中，通过降解mRNA转录物或阻断mRNA翻译来阻止、抑制或降低翻译。
如在本文中所使用的，术语“基因表达”是指这样的细胞过程，通过所述过程从DNA序列产生在生物学上有活性的多肽。
如在本文中所使用的，“HPRT”是由HPRT1基因所编码的在嘌呤代谢中所牵涉的酶。HPRT1位于X染色体上，并因此在男性中以单拷贝存在。HPRT1编码转移酶，其通过将5-磷酸核糖基团从5-磷酸核糖-1-焦磷酸转移至嘌呤来催化次黄嘌呤向肌苷一磷酸的转化和鸟嘌呤向鸟苷一磷酸的转化。该酶主要起着从降解的DNA中抢救嘌呤以用于在重新开始的嘌呤合成中进行使用的作用(也可参见图37)。
如在本文中所使用的，术语“慢病毒”是指能够感染正在分裂和非正在分裂的细胞的一类逆转录病毒。慢病毒的几个例子包括：HIV(人免疫缺陷病毒：包括1型HIV和2型HIV)，其是人获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体；髓鞘脱落-呼吸急促病毒，其在绵羊中引起脑炎(髓鞘脱落症)或肺炎(魅敌病)；山羊关节炎-脑炎病毒，其在山羊中引起免疫缺陷、关节炎和脑病；马感染性贫血病毒，其在马中引起自身免疫性溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒(FIV)，其在猫中引起免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，其在牛中引起淋巴结病、淋巴细胞增多和可能地中枢神经系统感染；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，其在近人灵长类中引起免疫缺陷和脑病。
如在本文中所使用的，术语“慢病毒载体”用于表示任何形式的源自慢病毒并被用于通过转导将遗传物质转移到细胞中的核酸。该术语包括慢病毒载体核酸，例如DNA和RNA，这些核酸的经包囊的形式，和在其中包装了病毒载体核酸的病毒颗粒。
如在本文中所使用的，当相关于RNAi对于基因表达的效应进行使用时，术语“敲低”意指，基因表达的水平被抑制，或者被降低至处于当在基本上相同的条件下但在RNAi不存在下检查时通常观察到的水平以下的水平。
如在本文中所使用的，术语“敲入”是指用外源遗传物质(例如，重组核酸)替换内源遗传物质(例如，基因或基因的一部分)。在本文中所使用的术语“敲入”还包括通过引入一个或多个额外拷贝的重组核酸来改变遗传物质，其中替换或不替换内源基因。
如在本文中所使用的，术语“敲除”是指内源基因的表达的部分或完全阻抑。这通常通过删除该基因的一部分或者通过用第二序列替换一部分来完成，但也可以通过对于该基因的其他修饰(例如，终止密码子的引入、关键氨基酸的突变、内含子接点的去除等)来引起。因此，“‘敲除’构建体”是这样的核酸序列，例如DNA构建体，其当被引入到细胞中时，导致由在所述细胞中的内源DNA所编码的多肽或蛋白质的表达的阻抑(部分的或完全的)。在一些实施方案中，“敲除”包括突变，例如点突变、插入、缺失、移码或错义突变。
如在本文中所使用的，术语“小细胞”是指无核形式的细菌细胞，其通过在具有DNA分离的细胞分裂的协调方面的紊乱(在二分裂期间)而产生。小细胞不同于其他小囊泡，后者在某些情况下自发地产生和释放，并且与小细胞相反，不是由于特定的基因重排或附加型基因表达。本公开内容的小细胞是无核形式的大肠杆菌(E.coli)或其他细菌细胞，其通过在具有DNA分离的细胞分裂的协调方面的紊乱(在二分裂期间)而产生。原核生物染色体复制与正常的二分裂相关联，其牵涉细胞中间隔膜形成。在大肠杆菌中，例如，min基因(例如minCD)的突变可以去除在细胞分裂期间在细胞极处隔膜形成的抑制，从而导致产生正常的子细胞和无核的小细胞。参见de Boer等人,1992；Raskin&de Boer,1999；Hu&Lutkenhaus,1999；Harry,2001。小细胞不同于其他小囊泡，后者在某些情况下自发地产生和释放，并且与小细胞相反，不是由于特定的基因重排或附加型基因表达。为了实践本公开内容，所希望的是小细胞具有完整的细胞壁(“完整的小细胞”)。除了min操纵子突变外，在影响隔膜形成的一系列其他基因重排或突变之后也产生无核的小细胞，例如在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中在divIVB1中。参见Reeve和Cornett,1975；Levin等人,1992。在细胞分裂/染色体分离中所牵涉的蛋白质的基因表达水平方面的干扰之后也可以形成小细胞。例如，minE的过表达导致极性分裂和小细胞的产生。类似地，无染色体的小细胞可以产生自在染色体分离方面的缺陷，例如枯草芽孢杆菌中的smc突变(Britton等人,1998)、枯草芽孢杆菌中的spoOJ缺失(Ireton等人,1994)、大肠杆菌中的mukB突变(Hiraga等人，1989)和大肠杆菌中的parC突变(Stewart和D'Ari,1992)。基因产物可以以反式来进行提供。当从高拷贝数质粒中进行过表达时，例如，CafA可以提高细胞分裂率和/或抑制在复制后的染色体分配(Okada等人,1994)，从而导致链接状细胞和无核小细胞的形成(Wachi等人,1989；Okada等人,1993)。小细胞可以从任何具有革兰氏阳性或革兰氏阴性起源的细菌细胞来制备。
如在本文中所使用的，术语“经突变的”是指序列(例如，核苷酸或氨基酸序列)相对于各自序列的天然、野生型、标准或参考版本(即未突变的序列)而言的变化。经突变的基因可以导致经突变的基因产物。经突变的基因产物将会与未突变的基因产物相差一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，导致经突变的基因产物的经突变的基因可以与相应的未突变的核苷酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％或更大的序列同一性。
如在本文中所使用的，术语“可操作地连接”是指在核酸表达控制序列(例如启动子、信号序列、增强子或转录因子结合位点阵列)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中所述表达控制序列影响相应于所述第二序列的核酸的转录和/或翻译，当合适的分子(例如，转录激活蛋白)结合至所述表达控制序列时。
如在本文中所使用的，术语“逆转录病毒”是指具有RNA基因组的病毒，所述RNA基因组通过逆转录病毒的逆转录酶而被逆转录为整合到宿主细胞基因组中的cDNA拷贝。逆转录病毒载体和用于制备逆转录病毒载体的方法是本领域中已知的。简而言之，为了构建逆转录病毒载体，将编码目的基因的核酸代替某些病毒序列插入到病毒基因组中以产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒粒子，构建包含gag、pol和env基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等人,Cell,Vol.33:153-159,1983)。当将包含cDNA的重组质粒与逆转录病毒LTR和包装序列一起引入到该细胞系中时，所述包装序列允许所述重组质粒的RNA转录物被包装到病毒颗粒中，其然后被分泌到培养基中。然后，收集包含重组逆转录病毒的培养基，任选地进行浓缩，并且用于基因转移。
如在本文中所使用的，术语“小发夹RNA”或“shRNA”是指包含反义区、环部分和有义区的RNA分子，其中所述有义区具有与所述反义区进行碱基配对从而形成双链体茎的互补核苷酸。在转录后
如在本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如人、小鼠或灵长类。典型地，所述哺乳动物为人(智人)。
如在本文中所使用的，术语“治疗性基因”是指可以施用给受试者以为了治疗或预防疾病目的的基因。
如在本文中所使用的，术语“转导”是指使用病毒或逆转录病毒载体通过感染而不是转染来递送基因。例如，可以通过感染和原病毒整合来将由逆转录病毒载体(用作用于将核酸引入到细胞中的载体的经修饰的逆转录病毒)所携带的抗-HPRT基因转导到细胞中。因此，“经转导的基因”是已通过慢病毒或载体感染和原病毒整合而被引入到细胞中的基因。病毒载体(例如，“转导载体”)将基因转导到“靶细胞”或宿主细胞中。
如在本文中所使用的，术语“治疗”，关于特定的状况，是指获得所希望的药理学和/或生理学效应。所述效应可以是预防性的，在完全地或部分地防止疾病或其症状方面，和/或可以是治疗性的，在对于疾病和/或可归因于该疾病的不利效应的部分或完全治愈方面。在本文中所使用的“治疗”涵盖任何在受试者中(特别是在人中)的疾病的治疗，并且包括：(a)防止该疾病在可能易患该疾病但还未被诊断为具有该疾病的受试者中出现；(b)抑制该疾病，即阻止其发展；和(c)缓解该疾病，即引起该疾病的消退和/或缓解一个或多个疾病症状。“治疗”也可以包括递送试剂或施用疗法以便提供药理学效应，甚至在疾病或状况不存在下。在一些实施方案中使用术语“治疗”来指施用本公开内容的化合物以缓和宿主中(优选地，哺乳动物受试者中，更优选地，人中)的疾病或病症。因此，术语“治疗”可以包括：防止病症在宿主中出现，特别是当所述宿主易于获得该疾病但还未被诊断为具有该疾病时；抑制该病症；和/或减轻或逆转该病症。在本公开内容的方法旨在预防病症的情况下，应当理解术语“预防”并不要求疾病状态被完全挫败。而是，如在本文中所使用的，术语“预防”是指专业技术人员的这样的能力，即识别对于病症易感的人群，从而使得在疾病开始之前可以发生本公开内容的化合物的施用。该术语并不意指，疾病状态必须完全避免。
如在本文中所使用的，术语“载体”是指能够介导另一核酸分子进入(例如，转移、转运等)到细胞中的核酸分子。通常将经转移的核酸连接至载体核酸分子，例如插入到载体核酸分子中。载体可以包含指导自主复制的序列，或者可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。如对于本领域技术人员来说将会是明显的那样，除了介导经转移的核酸的进入的核酸外，病毒载体还可以包含各种病毒组分。许多载体是本领域中已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相联合的多核苷酸、质粒和病毒载体。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)等。
表达载体
在一些实施方案中，本公开内容提供了表达载体(例如，慢病毒表达载体)，其包含至少两个用于表达的核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸序列编码核酸分子(例如，RNA、mRNA)(例如，可以在细胞例如宿主细胞的细胞质中发现的分子)。在一些实施方案中，所述表达载体包含编码被设计成用于敲低HPRT基因或者要么用于实行HPRT表达的降低的试剂的第一核酸序列。在一些实施方案中，所述表达载体包含编码治疗性基因的第二核酸(例如，编码γ-珠蛋白基因或经突变的γ-珠蛋白基因的核酸序列)。
在一些实施方案中，所述表达载体为自失活慢病毒载体。在其他实施方案中，所述表达载体为逆转录病毒载体。通常，将慢病毒基因组组织成5'长末端重复序列(LTR)、gag基因、pol基因、env基因、附属基因(nef、vif、vpr、vpu)和3'LTR。将病毒LTR划分为三个称为U3、R和U5的区域。U3区域包含增强子和启动子元件。U5区域包含多腺苷酸化信号。R(重复)区域将U3和U5区域分开，并且R区域的经转录的序列出现在病毒RNA的5'和3'末端这两者处。参见例如，"RNA Viruses:A Practical Approach"(Alan J.Cann,编辑,OxfordUniversity Press(2000))；O Narayan和Clements(1989)J.Gen.Virology,Vol.70:1617-1639；Fields等人,(1990)Fundamental Virology Raven Press.；Miyoshi H,Blamer U,Takahashi M,Gage F H,Verma I M.(1998)J Virol.,Vol.72(10):8150 7；和美国专利号6,013,516。已经用于感染HSC的慢病毒载体的例子描述在下列的出版物中，其各自在此通过提及而以其整体合并入本文：Evans等人,Hum Gene Ther.,Vol.10:1479-1489,1999；Case等人,Proc Natl Acad SciUSA,Vol.96:2988-2993,1999；Uchida等人,Proc NatlAcad Sci USA,Vol.95:11939-11944,1998；Miyoshi等人,Science,Vol.283:682-686,1999；和Sutton等人,J.Virol.,Vol.72:5781-5788,1998。
在一些实施方案中，所述表达载体为经修饰的慢病毒，并因此能够感染正在分裂和非正在分裂的细胞两者。在一些实施方案中，所述经修饰的慢病毒基因组缺乏关于对于病毒复制来说需要的慢病毒蛋白质的基因，因此防止不希望的复制，例如在靶细胞中的复制。在一些实施方案中，在重组逆转录病毒或慢病毒的产生期间在包装细胞系中以反式提供对于经修饰的基因组的复制来说需要的蛋白质。
在一些实施方案中，所述表达载体包含来自慢病毒的5'和3'长末端重复序列(LTR)的序列。在一些实施方案中，所述载体包含来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的经失活的或自失活性3'LTR。在一些实施方案中，所述LTR序列为HIV LTR序列。
慢病毒表达载体的另外的组分(以及合成和/或产生此类载体的方法)公开在美国专利申请公开号2018/0112220中，其公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文。
用于敲低HPRT基因或降低其表达的试剂
在一些实施方案中，所述编码被设计成用于敲低HPRT基因或者要么用于实行其表达的降低的试剂的核酸序列为RNAi试剂。在一些实施方案中，所述RNAi试剂为shRNA、微小RNA或其杂合体。在其他实施方案中，所述编码被设计成用于敲低HPRT基因或者要么用于实行其表达的降低的试剂的核酸序列为除了RNAi之外的其他试剂，例如反义RNA或反义寡核苷酸。RNAi试剂和非RNAi试剂两者都在本文中进一步进行描述。
RNAi
在一些实施方案中，所述表达载体包含编码RNA干扰(RNAi)试剂的第一核酸序列。RNA干扰是用于通过经过复杂的多步骤酶促过程(例如，牵涉序列特异性双链小干扰RNA(siRNA)的过程)而触发同源转录物降解来进行基因表达的转录后沉默的方法。关于RNAi途径的简化模型基于两个步骤，每个步骤牵涉核酶。在第一个步骤中，通过RNase II酶Dicer和Drosha将触发物RNA(dsRNA或miRNA初级转录物)加工为短的干扰RNA(siRNA)。在第二个步骤中，将siRNA加载到效应子复合物RNA-诱导的沉默复合物(RISC)中。siRNA在RISC装配期间展开，并且单链RNA与mRNA靶标杂交。认为基因沉默是通过RNase H酶Argonaute(Slicer)来进行所靶向的mRNA的核酸降解性降解的结果。如果siRNA/mRNA双链体包含错配，那么mRNA不被切割。更合适地，基因沉默是翻译抑制的结果。
在一些实施方案中，所述RNAi试剂为抑制性或沉默性核酸。如在本文中所使用的，“沉默性核酸”是指任何能够与特异性序列相互作用以抑制基因表达的多核苷酸。沉默性核酸的例子包括RNA双链体(例如，siRNA、shRNA)、锁定核酸(“LNA”)、反义RNA、编码siRNA或shRNA的有义和/或反义序列的DNA多核苷酸、DNA核酶或核酶。专业技术人员将会意识到，基因表达的抑制并不必然需要是从特定的所列举的序列的基因表达，而是可以是例如从由那个特定序列所控制的序列的基因表达。
虽然所述RNAi试剂可以通过表达载体来进行递送和表达，但是也可能的是，所述RNAi试剂可以通过使用合适的纳米胶囊或其他非病毒递送运载体(如在本文中进一步描述的)来直接递送。例如，可以将siRNA或miRNA“包装”在纳米胶囊内并且直接进行递送，如在本文中所记述的那样。
用于构建干扰RNA的方法是本领域中已知的。例如，可以从其中一条链为有义链而另一条链为反义链的两个分开的寡核苷酸装配出干扰RNA，其中所述反义链和有义链是自身互补的(即，每条链包含与在另一条链中的核苷酸序列互补的序列；例如其中所述反义链和有义链形成双链体或双链结构)；所述反义链包含与在靶核酸分子或其部分(即，不希望的基因)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，和所述有义链包含相应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。备选地，可以从单个寡核苷酸装配出干扰RNA，其中自身互补的有义和反义区通过基于核酸或基于非核酸的连接体而相连接。干扰RNA可以为具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸(其具有自身互补的有义和反义区)，其中所述反义区包含与在分开的靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，和所述有义区具有相应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。干扰RNA可以为环状单链多核苷酸，其具有两个或更多个环结构和包含自身互补的有义和反义区的茎，其中所述反义区包含与在靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，和所述有义区具有相应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，并且其中所述环状多核苷酸可以在体内或在体外进行加工以产生能够介导RNA干扰的有活性的siRNA分子。
在一些实施方案中，所述干扰RNA编码区编码具有有义区、反义区和环区的自身互补的RNA分子。当被表达时，这样的RNA分子按希望形成“发夹”结构，并且在本文中被称为“shRNA”。在一些实施方案中，所述环区的长度通常为大约2至大约10个核苷酸(仅作为例子，参见SEQ ID NO:35)。在其他实施方案中，所述环区的长度为大约6至大约9个核苷酸。在一些实施方案中，所述有义区和所述反义区的长度为大约15至大约30个核苷酸。在转录后加工之后，小发夹RNA通过由酶Dicer(其是RNase III家族的成员)介导的切割事件而被转变为siRNA。然后，所述siRNA就能够抑制与其共享同源性的基因的表达。进一步的细节由下列文献进行了描述：Brummelkamp等人,Science 296:550-553(2002)；Lee等人,NatureBiotechnol.,20,500-505(2002)；Miyagishi和Taira,Nature Biotechnol 20:497-500(2002)；Paddison等人,Genes&Dev.16:948-958(2002)；Paul,Nature Biotechnol,20,505-508(2002)；Sui,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99(6),5515-5520(2002)；和Yu等人,Proc NatlAcad Sci USA 99:6047-6052(2002)，其公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文。
shRNA
在一些实施方案中，所述第一核酸序列编码靶向HPRT基因的shRNA。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:30(在本文中称为sh734)的序列具有至少80％同一性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％同一性的序列。在另外其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:30的序列具有至少95％同一性的序列。在进一步的实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:30的序列具有至少97％同一性的序列。在更进一步的实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:30的序列具有至少98％同一性的序列。在更加进一步的实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:30的序列具有至少99％同一性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有SEQ ID NO:30的序列(也可参见图30A)。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:30的核酸序列可以进行修饰。在一些实施方案中，修饰包括：(i)掺入hsa-miR-22环序列(例如，CCUGACCCA)(SEQ ID NO:34)；(ii)添加5'-3'核苷酸间隔子，例如具有两个或三个核苷酸(例如，TA)的间隔子；(iii)5'起始修饰，例如添加一个或多个核苷酸(例如，G)；和/或(iv)在5'和3'处向茎和环添加两个核苷酸(例如，5'A和3'T)。通常，第一代shRNA被加工成小RNA的异质混合物，并且前体转录物的积累已显示出诱导在体内的序列依赖性和非依赖性非特异性脱靶效应这两者。因此，基于目前对于DICER加工和特异性的理解，设计规则为将会优化sh734的结构以及DICER持续加工能力和效率的应用设计。(也可参见Gu,S.,Y.Zhang,L.Jin,Y.Huang,F.Zhang,M.C.Bassik,M.Kampmann和M.A.Kay.2014.Weak base pairing in both seed and 3′regions reduces RNAi off-targets and enhances si/shRNA designs.Nucleic Acids Research 42:12169-12176)。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:30的核酸序列通过下述方式来进行修饰：在5'和3'处向发夹环(SEQ ID NO:35)添加两个核苷酸(例如，分别G和C)，由此将向导链的长度从大约19个核苷酸加长到大约21个核苷酸并用hsa-miR-22环CCUGACCCA(SEQ ID NO:34)替换该环，以提供SEQ ID NO:31的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:31的序列具有至少90％同一性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:31的序列具有至少95％同一性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:31的序列具有至少97％同一性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ ID NO:31的序列具有至少98％同一性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQ IDNO:31的序列具有至少99％同一性的序列。在另外其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:31的序列。认为由SEQ ID NO:31所编码的shRNA取得相比于要么用SEQ ID NO:30而言相似的HPRT的敲低。同样地，认为通过经由表达由SEQ ID NO:31所编码的shRNA来敲低HPRT而致使变得HPRT缺陷的细胞允许通过使用硫代鸟嘌呤类似物(例如，6TG)来进行选择。
在一些实施方案中，在所述载体内存在的RNAi编码核酸分子，例如具有SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核酸分子。在一些实施方案中，在宿主细胞的细胞质中发现所述核酸分子。在一些实施方案中，本公开内容提供了宿主细胞，其包含至少一种选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸分子。
在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQID NO:27(在本文中称为“shHPRT 616”)的序列具有至少80％同一性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:27的序列具有至少90％同一性的序列。在另外其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ IDNO:27的序列具有至少95％同一性的序列。在进一步的实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:27的序列具有至少97％同一性的序列。在更进一步的实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:27的序列具有至少98％同一性的序列。在更加进一步的实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:27的序列具有至少99％同一性的序列。在其他实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:27的序列(也可参见图31B)。
在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的所述第一核酸序列具有与SEQID NO:28(在本文中称为“shHPRT 211”)的序列具有至少80％同一性的序列。在其他实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:28的序列具有至少90％同一性的序列。在另外其他实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:28的序列具有至少95％同一性的序列。在进一步的实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:28的序列具有至少97％同一性的序列。在更进一步的实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ IDNO:28的序列具有至少98％同一性的序列。在更加进一步的实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:28的序列具有至少99％同一性的序列。在其他实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:28的序列(也可参见图31A)。
在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ IDNO:29(在本文中称为“shHPRT 734.1”)的序列具有至少80％同一性的序列(也可参见图30B)。在其他实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:29的序列具有至少90％同一性的序列。在另外其他实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:29的序列具有至少95％同一性的序列。在进一步的实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:29的序列具有至少97％同一性的序列。在更进一步的实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:29的序列具有至少98％同一性的序列。在更加进一步的实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:29的序列具有至少99％同一性的序列。在其他实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:29的序列(也可参见图30B)。
微小RNA
微小RNA(miR)是一组在转录后调控其靶基因的表达的非编码RNA。认为这些单链分子与结合其靶mRNA的3'非翻译区(UTR)的其他蛋白质一起形成miRNA-介导的沉默复合物(miRISC)从而阻止靶mRNA在细胞质中的翻译。
在一些实施方案中，将shRNA序列内嵌到微小RNA二级结构中(“基于微小RNA的shRNA”)。在一些实施方案中，将靶向HPRT的shRNA核酸序列内嵌在微小RNA二级结构内。在一些实施方案中，所述基于微小RNA的shRNA靶向在HPRT内的编码序列以取得HPRT表达的敲低，其被认为与使用靶向HPRT的shRNA是等价的，而没有随之而来的途径饱和和细胞毒性或脱靶效应。在一些实施方案中，所述基于微小RNA的shRNA为从头人工微小RNA shRNA。这样的从头的基于微小RNA的shRNA的产生由下述文献进行了描述：Fang,W.和Bartel,DavidP.The Menu of Features that Define Primary MicroRNAs and Enable De NovoDesign of MicroRNA Genes.Molecular Cell 60,131-145，其公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文。
在一些实施方案中，所述基于微小RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:67的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述基于微小RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:67的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述基于微小RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:67的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述基于微小RNA的shRNA具有SEQ ID NO:67(“miRNA734-Denovo”)的序列(也可参见图32A)。SEQ ID NO:67的RNA形式位于SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，所述基于微小RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:68的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述基于微小RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:68的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述基于微小RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:68的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述基于微小RNA的shRNA具有SEQ ID NO:68(“miRNA211-Denovo”)的序列(也可参见图32B)。SEQ ID NO:68的RNA形式位于SEQ ID NO:24。
在其他实施方案中，所述基于微小RNA的shRNA为经第三代miRNA支架修饰的miRNA16-2(在下文中“miRNA-3G”)(参见例如，图28和29)。此类miRNA-3G分子的合成由下述文献进行了描述：Watanabe,C.,Cuellar,T.L.,和Haley,B.“Quantitative evaluation offirst,second,and third generation hairpin systems reveals the limit ofmammalian vector-based RNAi,”RNA Biology 13,25-33(2016)，其公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文。
在一些实施方案中，所述miRNA-3G具有与SEQ ID NO:25的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述miRNA-3G具有与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述miRNA-3G具有与SEQ ID NO:25的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述miRNA-3G具有SEQ ID NO:25(“miRNA211-3G”)的序列(也可参见图29)。
在一些实施方案中，所述miRNA-3G具有与SEQ ID NO:26的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述miRNA-3G具有与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述miRNA-3G具有与SEQ ID NO:26的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述miRNA-3G具有SEQ ID NO:26(“miRNA734-3G”)的序列(也可参见图28)。
在一些实施方案中，调整sh734 shRNA以适应于模拟具有17-核苷酸碱基对的茎和4-核苷酸的环的miRNA-451(参见SEQ ID NO:60)结构(miR-451调控药物转运蛋白P-糖蛋白)。值得注意的是，该结构不需要通过DICER的加工。认为pre-451mRNA结构被Ago2切割，和随后被poly(A)特异性核糖核酸酶(PARN)切割，从而产生成熟的miRNA-451结构模拟物。关于miRNA-451-样Agosh734序列的二级结构显示在本文中的图33之中(SEQ ID NO:58)。认为Ago-shRNA模拟了内源miR-451的结构，并且可以具有为DICER非依赖性的这一优点。这被认为限制了过客加载的脱靶效应，具有可变的3'-5'核酸外切活性(23-26nt成熟的)(参见Herrera-Carrillo,E.和B.Berkhout.2017.Dicer-independent processing of smallRNA duplexes:mechanistic insights and applications.Nucleic Acids Res.45:10369-10379)。还认为存在使用shRNA的备选的dicer非依赖性加工的优点，包括有效的经降低的单个RNAi-活性的向导的脱靶效应，没有细胞RNAi Dicer机器的饱和，和较短的RNA双链体较不可能触发先天的RIG-I应答。
RNAi的备选方案
作为掺入RNAi的备选方案，在一些实施方案中，所述表达载体可以包含编码结合在信使RNA(mRNA)中的位点的反义寡核苷酸的核酸序列。本公开内容的反义寡核苷酸与编码蛋白质的核酸特异性地杂交并且干扰该蛋白质的转录或翻译。在一些实施方案中，反义寡核苷酸靶向DNA并且干扰其复制和/或转录。在其他实施方案中，反义寡核苷酸与RNA(包括pre-mRNA(即前体mRNA，其是mRNA的未成熟的单链)和mRNA)特异性地杂交。此类反义寡核苷酸可以影响，例如RNA向蛋白质翻译位点的移位、从该RNA的蛋白质翻译、该RNA的剪接从而产生一种或多种mRNA种类和该RNA可能参与或促进的催化活性。这样的干扰的总效应是调节、降低或抑制靶蛋白质表达。
在一些实施方案中，所述表达载体掺入了编码外显子跳跃试剂或外显子跳跃转基因的核酸序列。如在本文中所使用的，短语“外显子跳跃转基因”或“外显子跳跃试剂”是指任何编码可以产生外显子跳跃的反义寡核苷酸的核酸。“外显子跳跃”是指在蛋白质产生期间在pre-mRNA水平上被跳过和去除的外显子。认为反义寡核苷酸可以干扰在外显子内的剪接位点或调控元件。这可以导致经截短的、部分功能性的蛋白质，尽管存在遗传突变。通常，所述反义寡核苷酸可以是突变特异性的，并且与在pre-信使RNA中的突变位点相结合以诱导外显子跳跃。
外显子跳跃转基因编码可以导致外显子跳跃的试剂，并且此类试剂为反义寡核苷酸。所述反义寡核苷酸可以干扰在外显子内的剪接位点或调控元件从而导致经截短的、部分功能性的蛋白质，尽管存在遗传突变。另外，所述反义寡核苷酸可以是突变特异性的，并且与在pre-信使RNA中的突变位点相结合以诱导外显子跳跃。用于外显子跳跃的反义寡核苷酸是本领域中已知的，并且通常被称作AON。此类AON包括核内小RNA(“snRNA”)，其是一类被限制于细胞核内的小RNA分子并且牵涉于剪接或其他RNA加工反应中。反义寡核苷酸的例子、设计它们的方法和相关的产生方法公开在例如美国公开号20150225718、20150152415、20150140639、20150057330、20150045415、20140350076、20140350067和20140329762中，其公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文。
在一些实施方案中，本公开内容的表达载体包含这样的核酸，其编码在HPRT表达期间导致外显子跳跃或者引起HPRT重复突变(例如，在外显子4中的重复突变)的外显子跳跃试剂(参见Baba S等人,Novel mutation in HPRT1 causing a splicing error withmultiple variations.Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.2017年1月2日,36(1):1-6，其公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文)。在一些实施方案中，用于靶向在HPRT的编码区内的序列的经硫代磷酸酯修饰的反义寡核苷酸(参见图38)可以结合mRNA转录物并且抑制功能性蛋白质的翻译。除了其掺入在表达载体内之外，寡核苷酸还可以通过纳米胶囊、小细胞、脂质体或另外的合适的转染运载体来进行递送。例如，按照本公开内容，小细胞可以包含功能性核酸，例如siRNA或shRNA，或者编码可以有效地进行包装以用于体内递送的功能性核酸的表达载体。
在一些实施方案中，HPRT可以通过剪接体反式剪接用经修饰的经突变的序列来替换，从而促进HPRT的敲低。在一些实施方案中，这需要：(1)经突变的编码区以替换在靶RNA中的编码序列，(2)5’或3’剪接位点，和/或(3)结合结构域，即与靶HPRT RNA互补的反义寡核苷酸序列。在一些实施方案中，需要所有三种组分。
治疗性基因
如在本文中所记述的，本公开内容的表达载体(例如，慢病毒表达载体)还可以包含编码治疗性基因(例如，γ-珠蛋白)的第二核酸序列，由此所述治疗性基因可以矫正在靶细胞(例如HSC)中的缺陷。如本领域技术人员将会理解的，术语“治疗性基因”包括基因组序列、cDNA序列和更小的经改造的基因区段，其表达或者可以进行调整而适应于表达蛋白质、多肽、结构域、融合蛋白和突变体(其保持由所述治疗性基因所编码的全长多肽的一些或所有治疗功能)。“在生物学上有功能的等价物”治疗性基因被包括在“治疗性基因”的定义之内。因此，下述的序列将会是作为在生物学上有功能的等价物的序列：所述序列具有大约70％序列同源性至大约99％序列同源性以及可从其衍生出的任何序列同源性范围或量(例如大约70％至大约80％，和更优选地大约85％至大约90％，和更加优选地大约95％至大约99％)的与所述治疗性基因的氨基酸相同或在功能上等价的氨基酸，条件是所述多肽的生物学活性得到保持。
在一些实施方案中，所述治疗性基因矫正单基因病症。在一些实施方案中，所述治疗性基因用于治疗免疫缺陷、遗传性疾病、血液疾病(例如，血友病、血红蛋白病症)、溶酶体贮积病、神经学疾病、血管生成病症或癌症。
在一些实施方案中，所述治疗性基因为编码腺苷脱氨酶这种酶的基因；编码α-1抗胰蛋白酶的基因；编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白的基因；编码半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶这种酶的基因；编码凝血因子(例如，人凝血因子IX)的基因；编码脂蛋白脂肪酶基因的基因；一个或多个编码对于多巴胺合成来说需要的酶的基因；编码胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)的基因；编码白介素-2受体γ亚基(IL-2RG)的基因；编码Gp91phox的基因；编码维-奥综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)蛋白的基因；编码珠蛋白的基因；编码经突变的珠蛋白(例如，具有抗镰状化特性的珠蛋白)的基因；编码经突变的β-珠蛋白的基因；编码γ-珠蛋白的基因；编码抗-CD19抗体的基因；等等。在其他实施方案中，所述治疗性基因选自由下列各项组成的组：珠蛋白基因、鞘磷脂酶基因、α-L-艾杜糖苷酸酶基因、亨廷顿蛋白基因、神经纤维瘤蛋白1基因、MLH1基因、MSH2基因、MSH6基因、PMS2基因、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白基因、氨基己糖苷酶A基因、肌养蛋白基因、FMRl基因、苯丙氨酸羟化酶基因和低密度脂蛋白基因。
治疗性基因的类别的例子包括但不限于：肿瘤阻抑基因，诱导或阻止凋亡的基因，编码酶的基因，编码抗体的基因，编码激素的基因，编码受体的基因，和编码细胞因子、趋化因子或血管生成因子的基因。治疗性基因的具体例子包括但不限于：Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-I、zacl、scFV、ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-I、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15Rα、IL-15、IL-21、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、mda7、FUS1、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、ADP、p53、ABL1、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoATV、ApoE、Rap1A、胞嘧啶脱氨酶、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-I、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-I、zac1、DBCCR-I、rks-3、COX-I、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fins、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、VEGF、FGF、血小板反应蛋白、BAI-I、GDAIF、MCC、41BBL、CD80、CD86或OX40。
治疗性基因的其他例子为肿瘤阻抑基因，其包括但不限于：FUS1、基因26(CACNA2D2)、PL6、LUCA-I(HYAL1)、LUCA-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、基因21(NPRL2)、SEM A3、NF1、NF2和p53。
治疗性基因的另外其他例子为编码酶的基因，所述酶包括但不限于：ACP去饱和酶、ACP羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、PDE8A(cAMP磷酸二酯酶)、ATP酶、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环加氧酶、脱羧酶、糊精酶、酯酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、透明质酸合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、透明质酸酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂加氧酶、裂合酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、支链淀粉酶、重组酶、逆转录酶、拓扑异构酶或木聚糖酶。治疗性基因的进一步例子包括编码下列各项的基因：氨甲酰磷酸合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、胆色素原脱氨酶、凝血因子VIII、凝血因子IX、胱硫醚-β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰-CoA脱氢酶、丙酰-CoA羧化酶、甲基丙二酰-CoA变位酶、戊二酰-CoA脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-蛋白、门克斯病铜转运ATP酶、威尔逊病铜转运ATP酶、胞嘧啶脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、苯丙氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、HSV胸苷激酶或人胸苷激酶。
治疗性基因的进一步例子包括编码激素的基因，所述激素包括但不限于：生长激素、促乳素、胎盘催乳激素、黄体生成激素、促卵泡激素、绒毛膜促性腺激素、促甲状腺激素、瘦蛋白、促肾上腺皮质素、血管紧张素I、血管紧张素II、α-内啡肽、β-促黑素细胞激素、缩胆囊素、内皮缩血管肽I、甘丙肽、抑胃肽、胰高血糖素、胰岛素、促脂解素、后叶激素运载蛋白、促生长素抑制素、降钙素、降钙素基因相关肽、β-降钙素基因相关肽、恶性高钙血症因子、甲状旁腺激素相关蛋白、甲状旁腺激素相关蛋白、胰高血糖素样肽、胰抑制素、胰肽、肽YY、PHM、促胰液素、血管活性肠肽、催产素、血管升压素、加压催产素、脑啡肽酰胺(enkephalinamide)、甲硫孤肽酰胺(metorphinamide)、α-促黑素细胞激素、心房钠尿因子、支链淀粉、淀粉状蛋白P组分、促肾上腺皮质激素释放激素、生长激素释放因子、黄体生成激素释放激素、神经肽Y、K物质、P物质或促甲状腺素释放激素。
γ-珠蛋白基因
在一些实施方案中，所述表达载体包含编码γ-珠蛋白基因的核酸序列(参见图39)。在一些实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少80％同一性的序列。在其他实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少85％同一性的序列。在另外其他实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少90％同一性的序列。在进一步的实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少95％同一性的序列。在更进一步的实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少97％同一性的序列。在更加进一步的实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少98％同一性的序列。在更加进一步的实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少99％同一性的序列。认为编码在多肽中的G16D氨基酸变化的在SEQ ID NO:55的γ-珠蛋白基因中的点突变具有增加的结合α-珠蛋白的亲和力而不改变其功能，由此大大改善了在RBC中HbF形成的效率并导致更加有效的抗镰状化效应，这据信将会矫正SCD表型。γ-珠蛋白基因的外显子1、2和3分别以SEQ ID NO:51、52和53示出。
在一些实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％同一性的序列。在其他实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:3的序列具有至少95％同一性的序列。在另外其他实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:3的序列具有至少97％同一性的序列。在另外其他实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:3的序列具有至少98％同一性的序列。在另外其他实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:3的序列具有至少99％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述表达载体包含编码具有与SEQ ID NO:4的序列具有至少大约80％同一性的氨基酸序列的核酸。在其他实施方案中，所述核酸序列编码与SEQ IDNO:4的序列具有至少大约85％同一性的氨基酸序列。在另外其他实施方案中，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:4的序列具有至少大约90％同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:4的序列具有至少大约95％同一性的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:4的序列具有至少大约97％同一性的氨基酸序列。在更加进一步的实施方案中，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:4的序列具有至少大约98％同一性的氨基酸序列。在更加进一步的实施方案中，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:4的序列具有至少大约99％同一性的氨基酸序列。
γ-珠蛋白基因、其合成和掺入到载体中的方法描述在美国专利公开号2017/0145077中，其公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文。
用于治疗其他疾病的治疗性基因
可以将另外其他治疗性基因掺入到表达载体中，包括下面所描述的那些基因。
腺苷脱氨酶-重症联合免疫缺陷(ADA-SCID)缺陷导致有毒代谢物的积累，所述有毒代谢物破坏免疫系统，从而引起重症联合免疫缺陷(ADA-SCID)，经常被称作“气泡男孩”病。在一些实施方案中，在本文中所描述的表达载体的第二核酸编码人ADA cDNA序列。
重症联合免疫缺陷(SCID-X1)病是SCID的最常见的形式，占世界范围内报告的SCID病例的40-50％。在IL2RG基因中的突变导致共同的γ链(γc)(其是由许多细胞因子受体(包括白介素(IL)-2、4、7、9、15和21受体复合物)(它们在淋巴细胞发育和功能中发挥极其重要的作用)所共享的亚基)的有缺陷的表达。在一些实施方案中，在本文中所描述的表达载体的第二核酸编码人γc cDNA序列。
慢性肉芽肿病(CGD)由在源自吞噬细胞的NADPH氧化酶的亚基(gp91phox、p22phox、p47phox、p40phox或p67phox)中的缺陷引起。在CYBB基因(其编码gp91phox亚基)中的突变对于CGD的X连锁形式(其占大约70％的患者)负有责任。X-连锁CGD以严重的威胁生命的细菌和真菌感染为特征，所述感染是由于受损的由嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞进行的超氧阴离子和其他活性氧中间体的产生。该疾病的另一个方面是影响器官例如肠或肺的无菌的、慢性的肉芽肿性炎症，其主要由增加的促炎细胞因子的产生、延迟的炎性细胞的凋亡和有缺陷的由经激活的嗜中性粒细胞进行的抗炎介体的分泌而引起。差的结局与侵袭性真菌感染、肝脓肿和慢性肉芽肿性炎症的历史相关联。可用的治疗策略包括抗生素长久预防、IFN-γ施用和HCT。在一些实施方案中，在本文中所描述的表达载体的第二核酸编码人亚基cDNA序列。
异染色性脑白质营养不良(MLD)是一种由在芳基硫酸酯酶A(ARSA)基因中的突变引起的罕见的常染色体隐性溶酶体贮积病，其导致在中枢神经系统和外周神经系统中的神经细胞和神经胶质细胞中酶缺乏和未降解的底物脑苷脂3-硫酸(硫脑苷脂)积累。这一硫脑苷脂积累导致渐进的脱髓鞘和神经变性。在一些实施方案中，在本文中所描述的表达载体的第二核酸编码人ARSA cDNA序列。
粘多糖病I(MPS-I)或胡尔勒综合征是由α-L-艾杜糖苷酸酶(IDUA)的缺乏引起的溶酶体贮积病症。该病以糖胺聚糖(GAG)的不适当的贮积为特征，其具有伴随的器官增大和损害、异常量的GAG向尿中的排泄和中断的GAG周转(其尤其影响结缔组织)。临床表现包括骨骼异常、肝脾肿大、精神发育迟缓以及心血管和呼吸系统功能障碍。IDUA缺乏可以导致范围广泛的表型展示，并且MPS I Hurler(MPS IH)代表了在该谱内的最严重的疾病变化形式，其以牵涉多个器官和中枢神经系统的慢性的、渐进的和可致残的疾病过程为特征。如果不进行治疗，该疾病在儿童期是致死的，其中通常在生命的头十年内出现死亡(由于心肺衰竭)。在一些实施方案中，在本文中所描述的表达载体的第二核酸编码人的α-L-艾杜糖苷酸酶(IDUA)的cDNA。
戈谢病是最常见的溶酶体贮积病。它是常染色体隐性溶酶体贮积病，其由对于鞘糖脂降解来说需要的葡糖脑苷脂酶(GBA)的缺乏而引起。临床表现包括肝脾肿大、血小板减少、骨疾病和出血体质(这经常导致去看血液病医生)。基因疗法代表了对于进行酶替换疗法的患者和缺乏合适的骨髓供者的那些患者的治疗备选方案。在一些实施方案中，在本文中所描述的表达载体的第二核酸编码人的GBA基因的cDNA。
溶酶体贮积病(LSD)是以溶酶体的功能障碍为特征的罕见的遗传性代谢病症。LSD包括大约70种在遗传上不同的疾病，具有1:5000活产的集合发生率。例子包括法布里病(α-半乳糖苷酶A缺乏)、庞皮病(α-葡糖苷酶[GAA]缺乏)、亨特综合征(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶[I2S]缺乏)、桑菲利波综合征(对于分解糖胺聚糖硫酸乙酰肝素来说需要的酶之一的缺乏)和克拉伯病(半乳糖脑苷脂酶缺乏)。同样地，遗传性代谢病症是代谢病症的一个原因，并且在当有缺陷的基因引起酶缺乏时出现。认为可以调整本公开内容的表达载体以适应于掺入第二核酸序列，其编码适合于在治疗上面所标识出的状况中的任一个之中使用的基因。
丙酮酸激酶缺乏症(PKD)是一种由在PKLR基因中的突变引起的单基因代谢疾病，其导致具有可变的症状学的溶血性贫血并且在新生儿期期间可以是致死的。PKD隐性遗传性状和其通过同种异体骨髓移植的治愈性治疗为开发基因疗法方法提供了理想的情景。在一些实施方案中，在本文中所描述的表达载体的第二核酸编码人PKLR cDNA。
肾上腺脑白质营养不良(ALD)是一种由在ABCD1基因中的突变引起的罕见的X连锁代谢病症，其导致肾上腺脑白质营养不良蛋白(ALDP)的缺乏和随后的极长链脂肪酸(VLCFA)的积累。VLCFA积累出现在血浆和所有组织类型中，但主要影响肾上腺皮质以及脑和脊髓的白质，从而导致一系列的临床结局。ALD的最严重形式(称为脑ALD(CALD)的炎性脑表型)牵涉髓鞘质(负责思考和肌肉控制的在脑中的神经细胞的保护性鞘)的渐进的破坏。CALD的症状通常出现在儿童期早期，并且如果不进行治疗，就会快速进展，从而在大多数患者中导致神经学功能的严重丧失和最终死亡。在一些实施方案中，在本文中所描述的表达载体的第二核酸编码人肾上腺脑白质营养不良蛋白(ALDP)。
范科尼贫血(FA)是一种遗传性骨髓衰竭综合征。在至少16个DNA修复基因中的1个之中的缺陷导致发育不全和提高的关于恶性肿瘤(尤其是AML和MDS)的风险。另外，增加了关于腺瘤、腺癌和鳞状细胞癌的风险。大多数患者还具有矮小的身材、各种形态学异常和发育障碍。支持性治疗包括定期输注血液产品和生长激素替代(由于在FA患者中的伴随的内分泌病)。供者匹配的情形下HSCT已是唯一的治愈性选项，并因此是对于基因疗法的有吸引力的选项。尽管受影响的基因的异质性，但是多于60％的患者具有在FANCA基因中的突变。在一些实施方案中，在本文中所描述的表达载体的第二核酸编码人FANCA cDNA。
启动子
在一些实施方案中，不同的启动子用于驱动掺入在所公开的表达载体内的核酸序列中的每一个的表达。例如，编码RNAi(例如，抗-HPRT shRNA)的第一核酸序列可以从第一启动子来进行表达，和编码治疗性基因(例如，γ-珠蛋白基因)的第二核酸序列可以从第二启动子来进行表达，其中所述第一和第二启动子是不同的。同样地并且作为另一个例子，编码用于下调HPRT的基于微小RNA的shRNA的第一核酸序列可以从第一启动子来进行表达，和编码治疗性基因(例如，γ-珠蛋白基因)的第二核酸序列可以从第二启动子来进行表达，其中所述第一和第二启动子是不同的。
在一些实施方案中，所述启动子可以是本领域普通技术人员已知的组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，所述启动子包含HIV LTR的至少一部分(例如，TAR)。
合适的启动子的例子包括但不限于RNA聚合酶I(pol I)、聚合酶II(pol II)或聚合酶III(pol III)启动子。“RNA聚合酶III启动子”或“RNA pol III启动子”或“聚合酶III启动子”或“pol III启动子”意指任何这样的无脊椎动物、脊椎动物或哺乳动物(例如，人、鼠类、猪、牛、灵长类、猿猴等)启动子，所述启动子在细胞中在其天然情景下，与RNA聚合酶III相联合或相互作用以转录它的可操作地连接的基因，或者其任何变体(天然的或经改造的)，所述变体将会在所选择的宿主细胞中与RNA聚合酶III相互作用以转录可操作地连接的核酸序列。适合于在本公开内容的表达载体中使用的RNA pol III启动子包括但不限于人U6、小鼠U6和人H1等。
pol II启动子的例子包括但不限于Ef1α、CMV和泛素。其他特异性pol II启动子包括但不限于：锚蛋白启动子(Sabatino DE等人,Proc Natl Acad Sci USA(24):13294-9(2000))、血影蛋白启动子(Gallagher PG等人,J Biol Chem.274(10):6062-73(2000))、转铁蛋白受体启动子(Marziali G等人,Oncogene.21(52):7933-44(2002))、带3/阴离子转运蛋白启动子(Frazar TF等人,Mol Cell Biol(14):4753-63(2003))、带4.1启动子(Harrison PR等人,Exp Cell Res.155(2):321-44(1984))、BcI-Xl启动子(Tian C等人,Blood 15,101(6):2235-42(2003))、EKLF启动子(Xue L等人,Blood.103(11):4078-83(2004).Epub 2004年2月5日)、ADD2启动子(Yenerel MN等人,Exp Hematol.33(7):758-66(2005))、DYRK3启动子(Zhang D等人,Genomics 85(1):117-30(2005))、SOCS启动子(SarnaMK等人,Oncogene 22(21):3221-30(2003))、LAF启动子(To MD等人,Int J Cancer,115(4):568-74(2005))、PSMA启动子(Zeng H等人,J Androl(2):215-21(2005))、PSA启动子(Li HW等人,Biochem Biophys Res Commun 334(4):1287-91(2005))、前列腺碱性蛋白(Probasin)启动子(Zhang J等人,145(1):134-48(2004),Epub 2003年9月18日)、ELAM-I启动子/E-选择蛋白(Walton T等人,Anticancer Res.18(3A):1357-60(1998))、突触蛋白启动子(Thiel G等人,Proc Natl Acad Sci USA.,88(8):3431-5(1988))、维勒布兰德因子启动子(Jahroudi N,Lynch DC.Mol Cell Biol.14(2):999-1008(1994))、FLT1(Nicklin SA等人,Hypertension 38(1):65-70(2001))、Tau启动子(Sadot E等人,J Mol Biol.256(5):805-12(1996))、酪氨酸酶启动子(Lillehammer T等人,Cancer Gene Ther.(2005))、pander启动子(Burkhardt BR等人,Biochim Biophys Acta.(2005))、神经元特异性烯醇化酶启动子(Levy YS等人,J Mol Neurosci.21(2):121-32(2003))、hTERT启动子(Ito H等人,Hum Gene Ther 16(6):685-98(2005))、HRE应答元件(Chadderton N等人,Int JRadiat Oncol Biol Phys.62(1):213-22(2005))、lck启动子(Zhang DJ等人,JImmunol.174(11):6725-31(2005))、MHCII启动子(De Geest BR等人,Blood.101(7):2551-6(2003),Epub 2002年11月21日)和CD11c启动子(Lopez-Rodriguez C等人,J BiolChem.272(46):29120-6(1997))。
在一些实施方案中，驱动被设计成用于敲低HPRT或者要么用于降低其表达的试剂的表达的启动子为RNA pol III启动子。在一些实施方案中，驱动被设计成用于敲低HPRT或者要么用于降低其表达的试剂的表达的启动子为7sk启动子(例如，7SK人7S K RNA启动子)。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有由登录号AY578685所提供的序列(智人细胞系HEK-293 7SK RNA启动子区，完整序列，登录号AY578685)。
在一些实施方案中，相比于7sk启动子而言，所采用的7sk启动子在其核酸序列中包含至少一个突变和/或缺失(参见图35和36)。在其他实施方案中，相比于7sk启动子(登录号AY578685)而言，所述7sk启动子在其核酸序列中包含多个突变和/或缺失。在另外其他实施方案中，所述7sk启动子与SEQ ID NO:32的序列具有95％同一性。在更进一步的实施方案中，所述7sk启动子具有SEQ ID NO:32的序列。认为所述7sk启动子以适度水平表达针对HPRT的shRNA，并且比其他Pol III启动子(例如U6和H1)更有效。认为所述7sk启动子的引入允许在治疗水平上调节针对HPRT的shRNA的表达。
在一些实施方案中，所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:32的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:32的序列具有至少96％同一性的序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:32的序列具有至少97％同一性的序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:32的序列具有至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:32的序列具有至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有在SEQ ID NO:32中所示的序列。
在一些实施方案中，在顺式调控元件中产生在7sk启动子中的功能性突变或缺失以调控由启动子驱动的转基因(包括sh734)的表达水平(参见SEQ ID NO:33)(参见Boyd,D.C.,Turner,P.C.,Watkins,N.J.,Gerster,T.&Murphy,S.Functional Redundancy ofPromoter Elements Ensures Efficient Transcription of the Human 7SK Gene invivo.Journal of Molecular Biology 253,677-690(1995))。将所描述的突变用于建立在由Pol III启动子驱动的sh734表达水平之间的相关性，和用于引入用以经历在6TG疗法存在下的稳定选择的功能性以及长期稳定性和安全性。7sk启动子突变的位置描绘在图35中。在远侧序列增强子(DSE)中的7skM1 Oct结合位点突变以及经预测的TAL-1和GATA-1结合位点显示在图36中。
在一些实施方案中，所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:33的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:33的序列具有至少96％同一性的序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:32的序列具有至少97％同一性的序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:33的序列具有至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:33的序列具有至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有在SEQ ID NO:33中所示的序列。
在一些实施方案中，驱动编码治疗性基因的核酸序列的表达的启动子为H1启动子、U6启动子或突变型7SK启动子。在一些实施方案中，驱动编码γ-珠蛋白的核酸序列的表达的启动子为β-珠蛋白启动子，例如在图1A和1B中所图解说明的。在一些实施方案中，所述β-珠蛋白启动子为野生型人β-珠蛋白启动子。在其他实施方案中，所述β-珠蛋白启动子具有与SEQ ID NO:66的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述β-珠蛋白启动子具有与SEQ ID NO:66的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述β-珠蛋白启动子具有与SEQ ID NO:66的序列具有至少99％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述β-珠蛋白启动子具有SEQ ID NO:66的核酸序列。认为β-珠蛋白启动子是有利的，因为它受制于在红细胞中表达的人β-珠蛋白启动子的正常调控。
在其他实施方案中，所述启动子为组织特异性启动子。可以使用的组织特异性启动子的几个非限制性例子包括lck(参见例如，Garvin等人,Mol.Cell Biol.8:3058-3064(1988)；和Takadera等人,Mol.Cell Biol.9:2173-2180(1989))、肌细胞生成蛋白(Yee等人,Genes and Development 7:1277-1289(1993))和thyl(Gundersen等人,Gene 113:207-214(1992))。
还考虑了，可以使用启动子的组合(例如，UbC和H1启动子)来获得治疗性基因和/或干扰RNA的所希望的表达。在一些实施方案中，所述表达载体包含Pol II启动子和PolIII启动子，例如用于γ-珠蛋白表达的Pol IIβ-珠蛋白启动子和用于敲低HPRT的Pol III7SK启动子。具有组织特异性的启动子是有利的，因为它们可以特异性地指导目的基因和干扰RNA的表达，由此按所希望的那样控制生物学效应。
具有编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸和编码γ-珠蛋白基因的核酸的载体的例 子
下面描述了被设计成用于敲低HPRT和引起γ-珠蛋白表达的慢病毒表达载体的例子。所叙述的表达载体中的任一个适合于转导HSC，例如离体地。
在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体包含：(a)编码靶向HPRT的RNAi的序列；(b)编码γ-珠蛋白基因的序列；(c)编码第一启动子的序列，所述第一启动子用于驱动所述编码靶向HPRT的RNAi的序列的表达；(d)编码第二启动子的序列，所述第二启动子用于驱动所述编码γ-珠蛋白基因的序列的表达；和(e)编码中央多聚嘌呤束(cPPT)的序列；和(f)编码Rev应答元件(RRE)的序列。在一些实施方案中，所述cPPT包含野生型HIV的Vif序列的大约85个碱基对。在一些实施方案中，所述RRE包含野生型HIV的Rev序列的大约26个碱基对、tat序列的大约25个碱基对和Env序列的大约769个碱基对。在一些实施方案中，所述慢病毒载体进一步包含基因座控制区。在一些实施方案中，所述慢病毒载体进一步包含自失活长末端重复序列。SIN LTR的产生通过使3'LTR的U3区失活(优选地通过删除其一部分，例如去除TATA序列)来取得。所述改变在逆转录后被转移至5'LTR，因此消除了在原病毒中的LTR的转录单位，这被认为阻止通过有能力进行复制的病毒的迁移。另外的安全性增强通过下述方式来提供：用异源启动子替换5'LTR的U3区以在病毒颗粒产生期间驱动病毒基因组的转录。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体与SEQ ID NO:5-22中的一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，所述RNAi为shRNA。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:5(TL20c-7skM1/sh734-rGbGM)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:5的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:5的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:5的核酸序列(也可参见图6)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:6(TL20c-7sk/sh734-rGbGM)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:6的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQID NO:6的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:6的核酸序列(也可参见图7)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:7(TL20c-r7skM1/sh734-rGbGM)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:7的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:7的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:7的核酸序列(也可参见图8)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:8(TL20c-r7sk/sh734-rGbGM)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:8的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:8的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:8的核酸序列(也可参见图9)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:9(TL20c-rGbGM-7skM1/sh734)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:9的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:9的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:9的核酸序列(也可参见图10)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:10(TL20c-rGbGM-7sk/sh734)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:10的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:10的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:10的核酸序列(也可参见图11)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:11(TL20c-rGbGM-r7skM1/sh734)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:11的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:11的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:11的核酸序列(也可参见图12)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:12(TL20c-rGbGM-r7sk/sh734)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:12的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:12的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:12的核酸序列(也可参见图13)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:13(TL20c-rGbGM)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:13的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:13的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:13的核酸序列(也可参见图14)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:14(TL20d-7skM1/sh734-rGbGM)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:14的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:14的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:14的核酸序列(也可参见图15)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:15(TL20d-7sk/sh734-rGbGM)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:15的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:15的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:15的核酸序列(也可参见图16)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:16(TL20d-r7skM1/sh734-rGbGM)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:16的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:16的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:16的核酸序列(也可参见图17)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:17(TL20d-r7sk/sh734-rGbGM)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:17的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:17的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:17的核酸序列(也可参见图18)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:18(TL20d-GbGM)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:18的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:18的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:18的核酸序列(也可参见图19)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:19(TL20d-rGbGM-7skM1/sh734)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:19的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:19的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:19的核酸序列(也可参见图20)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:20(TL20d-GbGM-7sk/sh734)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:20的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:20的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:20的核酸序列(也可参见图21)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:21(TL20d-rGbGM-r7skM1/sh734)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:21的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:21的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:21的核酸序列(也可参见图22)。
在一些实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:22(TL20d-rGbGM-r7sk/sh734)的序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，所述载体具有与SEQ IDNO:22的序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。在另外其他实施方案中，所述载体具有与SEQ ID NO:22的序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在进一步的其他实施方案中，所述载体具有SEQ ID NO:22的核酸序列(也可参见图23)。
载体的产生
在一些实施方案中，将表达盒(例如，具有用于表达的特定转基因的表达盒)插入到表达载体(例如，慢病毒表达载体)中，以提供具有至少一个用于表达的转基因的载体。例如，可以按照在美国专利公开号2018/0112233(其公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文)中所描述的方法，将具有用于表达的转基因的表达盒插入到pTL20c载体(SEQ IDNO:47)(图40A和40B)绝缘或pTL20d载体(即PTL20c，但缺乏CHS4绝缘子(SEQ ID NO:49))中。将表达盒插入到pTL20c载体中的例子描述在本文中的实施例1之中。
在将所述表达盒插入到所述表达载体中后，将第二表达盒插入到所述具有至少一个用于表达的转基因的载体中。例如，可以将包含用于敲低HPRT或者要么用于降低其表达的核酸序列的表达盒插入到所述具有至少一个用于表达的转基因的载体中。将包含抗-HPRT shRNA的表达盒插入到所述具有至少一个用于表达的转基因的载体中的例子描述在本文中的实施例1之中。
用于下调HPRT和/或用于引入转基因的试剂的非病毒递送
在一些实施方案中，可以将被设计成用于敲低HPRT基因的试剂(包括包含RNAi的表达构建物)通过纳米胶囊或其他非病毒递送运载体来进行递送。通过该方法来递送此类试剂代表了关于通过表达出的RNAi或来自表达载体的其他试剂来实行HPRT下调的一种备选方案。如本文中进一步所描述的，可能的是通过纳米胶囊来递送反义RNA、被设计成用于外显子跳跃的寡核苷酸或基因编辑机器。
通常，纳米胶囊为囊泡系统，其展示出典型的核-壳结构，在其中有活性的分子被限制于由聚合物膜或包衣所包围的储库或空腔内。在一些实施方案中，典型的纳米胶囊的壳由聚合物膜或包衣制成。在一些实施方案中，所述纳米胶囊源自生物可降解的或生物可侵蚀的聚合物材料。
在一些实施方案中，所述纳米胶囊为可酶促降解的纳米胶囊。在一些实施方案中，所述纳米胶囊由单蛋白质核和薄的通过肽而交联的聚合物壳组成。在一些实施方案中，可以对纳米胶囊进行选择，从而使得它是可特异性地识别的并且能够被蛋白酶切割。在一些实施方案中，所述可切割的交联剂包括作为蛋白酶或另一种酶的底物的肽序列或结构。
合适的纳米胶囊包括在美国专利号9,782,357中所描述的那些；在美国专利申请公开号2017/0354613、2015/0071999和2015/035975中所描述的那些；和在PCT公开号WO2016/085808、WO2017/06380和WO2017/205541中所描述的那些(这些文献的公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文)。其他合适的纳米胶囊、其合成方法和/或包囊方法进一步公开在美国专利公开号2011/0274682(其公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文)中。另外其他用于掺入和递送被设计成用于降低HPRT基因的表达的试剂的合适的纳米胶囊描述在PCT公开号WO2013/138783、WO2013/033717和WO2014/093966(其公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文)中。
在一些实施方案中，调整所述纳米胶囊以适应于在体内靶向特定的细胞类型(例如，T细胞、CD34造血干细胞和祖细胞)。例如，所述纳米胶囊可以包含一种或多种与聚合物纳米胶囊相偶联的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分将所述聚合物纳米胶囊递送至特定的细胞类型，其中所述细胞类型选自包括下列各项的组：免疫细胞、血细胞、心脏细胞、肺细胞、视细胞、肝细胞、肾细胞、脑细胞、中枢神经系统细胞、外周神经系统细胞、癌细胞、被病毒感染的细胞、干细胞、皮肤细胞、肠细胞和/或听细胞。在一些实施方案中，所述靶向部分为抗体。用于此类纳米胶囊的合适的有效载荷包括靶向HPRT的合成寡核苷酸、shRNA、miRNA和Ago-shRNA。在一些实施方案中，所述有效载荷可以在由Pol III或Pol II驱动的启动子盒中进行表达。
在其他实施方案中，可以将用于下调HPRT的试剂配制在生物纳米胶囊内，其是由经遗传改造的微生物产生的纳米大小的胶囊。在一些实施方案中，生物纳米胶囊为源自病毒蛋白质或源自经修饰的病毒蛋白质的颗粒，例如病毒表面抗原颗粒(例如，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)颗粒)。在其他实施方案中，生物纳米胶囊为包含脂质双层膜和源自病毒蛋白质或源自经修饰的病毒蛋白质的颗粒(例如，病毒表面抗原颗粒)的纳米大小的胶囊。此类颗粒可以从真核细胞(例如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞)中纯化出来。胶囊的大小可以从大约10nm至大约500nm变动。在其他实施方案中，胶囊的大小可以从大约20nm至大约250nm变动。在另外其他实施方案中，胶囊的大小可以从大约80nm至大约150nm变动。
在一些实施方案中，提供这样的纳米胶囊制剂，其通过“固定”原始的遗传突变(例如通过采用基因组编辑/改造)以及同时递送和插入编码用于敲低HPRT的机构的转录盒这两者来“矫正”基因。
反义RNA
反义RNA(asRNA)为与在细胞内所转录的信使RNA(mRNA)链互补的单链RNA。并不希望受到任何特定理论的束缚，但认为可以将反义RNA引入到细胞中以抑制互补mRNA的翻译，这通过与它碱基配对来和在物理上阻碍翻译机器来进行。换言之，反义RNA为展示出与特定mRNA的互补关系的单链RNA分子。
反义RNA可以用于进行基因调控和特异性地靶向用于蛋白质合成的mRNA分子。反义RNA可以在物理上与互补mRNA配对并与之结合，因而抑制所述mRNA在翻译机器中进行加工的能力。除了siRNA/shRNA LV递送的构建体之外，经磷代硫酸酯修饰的反义寡核苷酸也可以用于靶向在HPRT mRNA的编码区内的序列(参见图37)。可以通过使用靶向型纳米颗粒来将这些寡核苷酸递送至特定的细胞群体和解剖学位点细胞，如上面所描述的。
外显子跳跃
如在本文中所记述的，外显子跳跃可以用于在HPRT基因内产生缺陷，其导致HPRT缺乏。在一些实施方案中，可以通过纳米胶囊来递送寡核苷酸(包括经修饰的寡核苷酸)，所述寡核苷酸被设计成用于靶向未剪接的HPRT mRNA和介导提早的终止或对于活性来说需要的内含子的跳跃。可以引入HPRT重复突变(例如，在外显子4中的重复突变)(参见Baba S等人,“Novel mutation in HPRT1 causing a splicing error with multiplevariations,”Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.2017年1月2日,36(1):1-6)以引起HPRT蛋白的剪接错误和功能失活。通过剪接体反式剪接用经修饰的经突变的序列替换HPRT是一种潜在的用于敲低HPRT的治疗策略。认为这需要：(1)经突变的编码区以替换在靶RNA中的编码序列，(2)5’或3’剪接位点，和(3)结合结构域，例如与靶RNA互补的反义寡核苷酸序列。
所述寡核苷酸可以在结构上进行修饰，从而使得它们是抗核酸酶的。在一些实施方案中，所述寡核苷酸具有经修饰的主链或非天然的核苷间连接。此类具有经修饰的主链的寡核苷酸包括在主链中保留磷原子的那些寡核苷酸和在主链中不具有磷原子的那些寡核苷酸。在一些实施方案中，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的寡核苷酸也可以被考虑为寡核苷酸。在其他实施方案中，修饰所述寡核苷酸，从而使得核苷酸单元的糖和核苷间连接两者(即主链)被新的基团替换。保持碱基单元以用于与合适的核酸靶化合物相杂交。一种这样的寡聚化合物(已显示出具有优异的杂交特性的寡核苷酸模拟物)被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，用包含酰胺的主链(特别是氨乙基甘氨酸主链)替换寡核苷酸的糖主链。核碱基被保留，并且直接地或间接地与主链的酰胺部分的氮杂氮原子相结合。经修饰的寡核苷酸还可以包含一个或多个经取代的糖部分。寡核苷酸还可以包含核碱基(在本领域中通常被简单称为“碱基”)修饰或取代。某些核碱基对于增加本公开内容的寡聚化合物的结合亲和力来说是特别有用的。这些包括但不限于：5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶，以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示出将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃，并且是目前优选的碱基取代，更加特别地当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰相组合时。
基因编辑技术
本公开内容还提供了用于包含编码蛋白质(例如，在具有β-地中海贫血或镰状细胞病的受试者中缺乏或缺陷的蛋白质)的序列的转基因(供者)的靶向插入的组合物。在某些实施方案中，矫正基因盒向细胞的基因组中的靶向整合是通过使用高度特异性的DNA结合蛋白(例如，兆碱基大范围核酸酶、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas系统)来取得的。整合到所靶向的基因中的基因盒可以被携带在病毒或非病毒载体上和/或可以通过使用一种或多种核酸酶来进行整合。兆碱基大范围核酸酶是天然产生的限制酶的经改造的版本，其典型地具有经扩展的DNA识别序列(例如14-40bp)。ZFN和TALEN是人工融合蛋白，其由与来自FokI限制酶的非特异性核酸酶结构域相融合的经改造的DNA结合结构域组成。可以将锌指和具有定制的特异性的TALE重复结构域连接在一起成为结合经扩展的DNA序列的阵列。
在一些实施方案中，将CRISPR方法(下面所描述的)用于敲除HPRT，与“敲入”策略相组合，以矫正SCD突变或者将内源γ-珠蛋白启动子转换为β-珠蛋白，以便(据信)阻止阻遏并允许在成人细胞中胎儿Hb的组成性表达。
在一些实施方案中，基因编辑方法可以用于敲除HPRT。例如，分离的细胞可以用靶向HPRT的CRISPR/Cas9 RNP进行处理。CRISPR/Cas系统被设计成用于结合在基因组中的目的区域(例如，高度表达的基因、疾病相关基因或安全港基因)中的靶位点，其中所述CRISPR/Cas系统包含CRISPR/Cas核酸酶和经改造的crRNA/tracrRNA(或单向导RNA)。在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas系统识别在HPRT基因中的靶标。用于敲低HPRT的sgRNA候选物显示在图38中。列出了正向和反向点接受突变(point accepted mutation；“PAM”)序列，包括特异性和效率得分以及所靶向的HPRT染色体坐标(其中PAM是指在蛋白质的一级结构中的单个氨基酸被另一单个氨基酸替换)。在一些实施方案中，Cas9蛋白与在RNP(核糖核蛋白)颗粒中的向导RNA相复合。在一些实施方案中，所述颗粒进一步包含用于在被瓦解的HPRT基因座中的靶向插入的单链DNA。
莱-尼综合征是归因于在HPRT基因中的功能性突变的一种罕见的嘌呤代谢遗传病症。导致莱-尼综合征的突变是高度异质的，并且为CRISPR/Cas9以及其他用于T细胞、祖T细胞、HSC和祖细胞的离体基因编辑的基因编辑方法提供了功能靶标(Gasperini,M.,G.M.Findlay,A.McKenna,J.H.Milbank,C.Lee,M.D.Zhang,D.A.Cusanovich,和J.Shendure.2017.CRISPR/Cas9-Mediated Scanning for Regulatory ElementsRequired for HPRT1 Expression via Thousands of Large,Programmed GenomicDeletions.The American Journal of Human Genetics 101:192-205)。已经在HPRT1的外显子4中鉴定出了一个新的突变，其被认为引起异常的剪接和HPRT功能的丧失。在一些实施方案中，天然突变可以用于通过使用基因编辑方法来再现剪接错误(Baba,Shimpei Saito,Takashi Yamada,Yasukazu Takeshita,Eri Nomura,Noriko Yamada,KenichiroWakamatsu,Nobuaki Sasaki,Masayuki.Nucleosides Nucleotides Nucleic AcidsNucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2017,Vol.36(1),第1-6页)。
靶向这些特定细胞类型的纳米胶囊可以提供有效的体内递送。Maeder ML等人,Genome-editing Technologies for Gene and Cell Therapy,Mol Ther.2016Mar,24(3):430-46描述了各种基因编辑技术，包括CRISPR/Cas9核酸酶介导的方法，并且这些公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文。
其他使用某些核酸酶的基因编辑技术描述在美国专利号8,895,264、9,616,090、9,624,498、9,650,648和9,22,105中和在PCT申请号PCT/US12/61896中，这些文献的公开内容各自在此通过提及而以其整体合并入本文。在一些实施方案中，可以使用与在基因组中的HPRT基因中的靶位点相结合的锌指蛋白(ZEP)，其中所述ZFP包含一个或多个经改造的锌指结合结构域。在一些实施方案中，将ZFP作为锌指核酸酶(ZFN)对(其二聚化并且然后切割目的靶基因组区域)进行使用，其中所述ZFN包含一个或多个经改造的锌指结合结构域和核酸酶切割结构域或切割半结构域。“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)为这样的蛋白质或在较大的蛋白质内的结构域，其通过一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA，所述锌指是在结合结构域内的氨基酸序列区域，其结构通过锌离子的配位而稳定化。术语“锌指DNA结合蛋白”通常被缩写为锌指蛋白或ZFP。在一些实施方案中，基因编辑通过使用包含与内源次黄嘌呤鸟嘌呤HPRT基因相结合的锌指蛋白和切割结构域的融合蛋白来进行，其中所述融合蛋白修饰内源HPRT基因。在一些实施方案中，可以将包含ZFP的融合蛋白掺入到纳米胶囊中以进行递送，所述ZFP能够与在HPRT基因座中的目的区域中的靶位点相结合。
在一些实施方案中，可以使用与在基因组中的HPRT基因中的靶位点相结合的TALE蛋白(转录激活因子样效应子)，其中所述TALE包含一个或多个经改造的TALE DNA结合结构域。在一些实施方案中，所述TALE为切割目的靶基因组区域的核酸酶(TALEN)，其中所述TALEN包含一个或多个经改造的TALE DNA结合结构域和核酸酶切割结构域或切割半结构域。ZFN和/或TALEN的切割结构域和切割半结构域可以例如从各种限制性内切核酸酶和/或归巢内切核酸酶来获得。在一些实施方案中，所述切割半结构域源自IIS型限制性内切核酸酶(例如，Fok I)。导致HPRT功能性基因表达丧失的TAL、CRISPR/Cas9基因编辑方法和siRNA敲低方法的敲除效率通过HPRT qPCR来测定。通过使用miRNA211-3g来进行的HPRT表达的敲低显示在图27中。
在其他实施方案中，使用编码靶向HPRT的向导RNA的载体。
在另外其他实施方案中，将TALE与兆碱基大范围核酸酶切割结构域的切割序列特异性相组合的杂合核酸酶构造在本文中被称为“megaTAL”。在一些实施方案中，通过将最小TAL效应子结构域与源自LAGLIDADG归巢内切核酸酶家族的兆碱基大范围核酸酶的N-末端相融合来提供megaTAL。在一些实施方案中，改造megaTAL以敲除HPRT。用于改造合适的megaTAL的方法由“Boissel S,Jarjour J,Astrakhan A等人,megaTALs:A Rare-CleavingNuclease Architecture for Therapeutic Genome Engineering.Nucleic AcidsResearch.2014,42(4):2591-2601”进行了描述，其公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文。
在本文中所描述的核酸酶、编码这些核酸酶的多核苷酸、供者多核苷酸和包含所述蛋白质和/或多核苷酸的组合物可以通过任何合适的方式在体内或离体进行递送。例如，用于递送在本文中所描述的核酸酶的方法描述在例如美国专利号6,453,242、6,503,717、6,534,261、6,599,692、6,607,882、6,689,558、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219和7,163,824中，所有这些文献的公开内容通过提及而以其整体合并入本文。
宿主细胞
本公开内容还提供了包含本公开内容的新型表达载体的宿主细胞。“宿主细胞”或“靶细胞”意指待通过使用本公开内容的方法和表达载体进行转化的细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为其中所述表达载体可以进行表达的哺乳动物细胞。合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于：人细胞、鼠类细胞、非人灵长类细胞(例如，恒河猴细胞)、人祖细胞或干细胞、293细胞、HeLa细胞、D17细胞、MDCK细胞、BHK细胞和Cf2Th细胞。在某些实施方案中，包含本公开内容的表达载体的宿主细胞为造血细胞，例如造血祖细胞/干细胞(例如，CD34-阳性造血祖细胞/干细胞(HPSC))，单核细胞，巨噬细胞，外周血单核细胞，CD4+T淋巴细胞，CD8+T淋巴细胞，或树突细胞。
待用本公开内容的表达载体进行转导的造血细胞(例如，HPSC、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和/或单核细胞/巨噬细胞)可以是同种异体的、自体的或来自匹配的同胞。在一些实施方案中，所述HPSC是CD34-阳性的并且可以从患者的骨髓或外周血中分离。在一些实施方案中，将分离的CD34-阳性HPSC(和/或在本文中所描述的其他造血细胞)用在本文中所描述的表达载体进行转导。
在一些实施方案中，将所述宿主细胞或经转导的宿主细胞与在药学上可接受的载料相组合。在一些实施方案中，将所述宿主细胞或经转导的宿主细胞与PLASMA-LYTE A(例如，用于静脉施用的无菌的、无热原的等渗溶液，其中一升的PLASMA-LYTE A具有140mEq钠、5mEq钾、3mEq镁、98mEq负氯离子、27mEq乙酸根和23mEq葡糖酸根的离子浓度)一起进行配制。在其他实施方案中，将所述宿主细胞或经转导的宿主细胞在PLASMA-LYTE A的溶液中进行配制，所述溶液包含大约8％至大约10％的二甲亚砜(DMSO)。在一些实施方案中，在每mL的包含PLASMA-LYTE A和DMSO的制剂中存在少于大约2×107个宿主细胞/经转导的宿主细胞。
在一些实施方案中，在用根据本公开内容的载体进行转导后，使得所述宿主细胞实质上是HPRT缺陷的，例如具有HPRT表达的至少50％的减少。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含核酸分子，其包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的至少一个。
药用组合物
本公开内容还提供包含一种或多种在本文中所公开的表达载体和/或非病毒递送运载体(例如，纳米胶囊)的组合物，包括药用组合物。在一些实施方案中，所述药用组合物包含有效量的在本文中所描述的表达载体和/或非病毒递送运载体中的至少一种，和在药学上可接受的载料。例如，在某些实施方案中，所述药用组合物包含有效量的表达载体和在药学上可接受的载料。有效量可以由本领域技术人员基于诸如受试者的身材、体重、年龄、健康状况、性别，种族，和病毒滴度的因素来容易地确定。
短语“在药学上可接受的”或“在药理学上可接受的”是指当施用给动物或人时不产生不利的、变应性的或其他不适当的反应的分子实体和组合物。例如，可以将表达载体与在药学上可接受的载料一起进行配制。如在本文中所使用的，“在药学上可接受的载料”包括对于在配制药剂(例如适合于施用给人的药剂)中使用来说可接受的溶剂、缓冲液、溶液、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌试剂、等渗剂和吸收延迟试剂等。用于将化合物与药用载料一起进行配制的方法是本领域中已知的，并且描述在例如Remington's PharmaceuticalScience(第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.1985)；和Goodman&Gillman's:The Pharmacological Basis of Therapeutics(第11版,McGraw-Hill Professional,2005)中，这些文献中每一个的公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文。
在一些实施方案中，所述药用组合物可以包含任何在本文中所公开的表达载体、纳米胶囊或组合物，以允许所施用的沉默核酸达到在大约0.1mg/kg至大约1mg/kg的范围内的浓度的任何浓度。在一些实施方案中，所述药用组合物可以以大约0.1重量％至大约99.9重量％的量包含所述表达载体。适合于包含在任何药用组合物中的在药学上可接受的载料包括水、经缓冲的水、盐水溶液(例如，生理盐水或平衡盐水溶液，例如Hank氏或Earle氏平衡溶液)、甘氨酸、透明质酸等。可以将所述药用组合物配制成用于肠胃外施用，例如静脉内、肌内或皮下施用。用于肠胃外施用的药用组合物可以包含在药学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液以及用于重构为无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载料、溶剂、稀释剂或运载体的例子包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其混合物、植物油(例如，橄榄油)、可注射有机酯(例如，油酸乙酯)。
可以将所述药用组合物配制成用于口服施用。用于口服施用的固体剂型可以包括例如片剂、糖衣丸剂、胶囊、丸剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，所述组合物可以包含至少一种在药学上可接受的载料，例如柠檬酸钠和/或磷酸二钙，和/或充填剂或膨胀剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；湿润剂，例如甘油；崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、硅酸盐和碳酸钠；润湿剂，例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯；吸收剂，例如高岭土和膨润土粘土；和/或润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物。用于口服施用的液体剂型可以包括例如在药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂。液体剂型可以包含惰性稀释剂例如水或其他溶剂、增溶剂和/或乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(例如，棉籽油、玉米油、胚芽油、蓖麻油、橄榄油、芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，以及其混合物。
所述药用组合物可以包含渗透增强剂以增强其递送。渗透增强剂可以包括脂肪酸例如油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、reclineate、一油精、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、1-单癸酸甘油酯、甘油单酯和甘油二酯以及其在生理学上可接受的盐。所述组合物可以进一步包含螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如，水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐、高香草酸盐)。
所述药用组合物可以包含以经包囊的形式的任何在本文中所公开的表达载体。例如，所述表达载体可以用生物可降解的聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酐)来进行包囊，或者可以包囊入脂质体中或分散在微乳液内。脂质体可以为例如lipofectin或lipofectamine。在另一个实施例中，组合物可以包含处于无核细菌小细胞之中或之上的在本文中所公开的表达载体(Giacalone等人,Cell Microbiology 2006,8(10):1624-33)。可以将在本文中所公开的表达载体与纳米颗粒相组合。
试剂盒
在一些实施方案中为试剂盒，其包含在本文中所描述的表达载体或包含表达载体的组合物。所述试剂盒可以包含容器，其中所述容器可以为包含以口服或肠胃外剂型的表达载体或组合物的瓶，每个剂型包含单位剂量的所述表达载体。所述试剂盒可以包含标签等，其指明了按照在本文中所描述的方法来治疗受试者。
在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含另外的活性试剂。所述另外的活性试剂可以容纳在与容纳所述载体或包含所述载体的组合物的容器分开的容器中。例如，在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含一个或多个剂量的嘌呤类似物(例如，6TG)，和任选地，关于按剂量给予所述嘌呤类似物以用于调理和/或化学选择(如在本文中进一步描述的那些步骤)的说明书。在其他实施方案中，所述试剂盒可以包含一个或多个剂量的MTX或MPA，和任选地，关于按剂量给予所述MTX或MPA以进行负选择(如在本文中所描述的)的说明书。
在另外其他实施方案中，所述试剂盒可以包含一种或多种内化免疫毒素或抗体-药物缀合物，例如在美国专利公开号2017/0360954和2018/0147294；和PCT公开号WO/2017/219025和WO/2017/219029中所描述的那些，这些文献的公开内容各自通过提及而以其整体合并入本文。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含选自下列的免疫毒素：假单胞菌外毒素A、deBouganin、白喉毒素、鹅膏蕈毒素例如α-鹅膏毒环肽，皂草毒蛋白、美登素、美登素类化合物、奥瑞斯他汀(auristatin)、蒽环类化合物、加利车霉素、伊立替康、SN-38、倍癌霉素、吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002406837830000661
吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002406837830000662
二聚体、二氢吲哚并苯并二氮杂
Figure BDA0002406837830000671
或二氢吲哚并苯并二氮杂
Figure BDA0002406837830000672
二聚体、蓖麻毒素-A或其变体。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含皂草毒蛋白。
治疗方法
在本文中所公开的方法和组合物是用于修饰蛋白质表达或矫正编码在遗传疾病(例如，镰状细胞病或地中海贫血)中表达的蛋白质的异常基因序列的。在一些实施方案中，将在本公开内容的载体内提供的治疗性基因用于治疗免疫缺陷、遗传性疾病、血液疾病(例如，血友病、血红蛋白病症)、溶酶体贮积病、神经学疾病、血管生成病症或癌症。尽管可以特别地提及镰状细胞贫血或β-地中海贫血的基因治疗，但是本公开内容并不局限于治疗仅这些疾病的方法。如此，在一些实施方案中，所述用于治疗免疫缺陷、遗传性疾病、血液疾病(例如，血友病、血红蛋白病症)、溶酶体贮积病、神经学疾病、血管生成病症或癌症的方法包括：(i)用包含至少两种核酸序列(即编码用于降低HPRT表达的试剂的核酸序列和编码治疗性基因的核酸序列)的载体转导HSC(包括自体HSC、同种异体HSC、同胞匹配HSC等)，和(ii)向哺乳动物受试者施用经转导的HSC。
作为例子，可以施用包含编码γ-珠蛋白基因(例如，在本文中所描述的)的核酸序列的表达载体，以便在遗传上矫正镰状细胞病或β-地中海贫血，或者减轻其症状。在一些实施方案中，可以施用用包含编码γ-珠蛋白基因的核酸序列的表达载体转导的宿主细胞群体以便在遗传上矫正镰状细胞病或β-地中海贫血，或者减轻其症状。认为用编码γ-珠蛋白基因的载体来进行的HSC的遗传矫正将会导致抗镰状化HbF的连续(即持久)产生，由此在受试者的一生中防止或减缓红细胞镰状化。认为该方法比目前可得的疗法有利，包括其对于所有患者(特别是那些不具有匹配的同胞供者的患者)来说的可得性，以及它将会为致终生矫正的一次性治疗这一事实。还认为该方法有利地没有任何免疫副作用，并且如果副作用确实出现，那么可以通过施用MTX或MPA(如在本文中所记述的)来减缓所述副作用。进一步认为，有效的基因疗法方法将会使治疗SCD的方式发生革命性变化，并且改善具有该极具破坏性病症的患者的结局。
如在本文中所记述的，除了治疗性基因外，本公开内容的表达载体还包含被设计成用于减低HPRT表达的试剂(例如，针对HPRT的shRNA以实行HPRT表达的敲低)，并因此提供体内化学选择策略，其利用HPRT在将嘌呤类似物(例如6TG)代谢成骨髓毒性试剂中所发挥的必不可少的作用。因为HPRT-缺乏不损害造血细胞发育或功能，因此可以将其从用于移植的造血细胞中去除。用嘌呤类似物进行的调理和化学选择在本文中进一步讨论。
在治疗镰状细胞病或β-地中海贫血(或者减轻镰状细胞病或β-地中海贫血的症状)的情景下，并且参考图2，受试者的治疗包括：鉴定有其治疗需要的受试者；用本公开内容的表达载体(例如，慢病毒载体)转导HSC(例如，自体HSC、同种异体HSC、同胞匹配HSC)(步骤120)；和将经转导的HSC移植或施用到所述受试者中(步骤140)。在一些实施方案中，所述有其治疗需要的受试者为罹患严重症状性SCD的受试者。
在一些实施方案中，用于治疗血红蛋白病的方法包括：(i)用包含至少两种核酸序列(即编码用于敲低HPRT基因的核酸序列和编码γ-珠蛋白基因的核酸序列)的载体转导HSC，和(ii)向哺乳动物受试者施用经转导的HSC。在一些实施方案中，所述编码shRNA的核酸序列包含SEQ ID NO:30的序列。在一些实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列包含SEQ ID NO:55的序列。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在施用经转导的HSC之前进行重度骨髓抑制调理的步骤(例如，通过使用嘌呤类似物、化学疗法、放射疗法、用一种或多种内化免疫毒素或抗体-药物缀合物进行的治疗或者其任何组合)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在施用经转导的HSC之后通过使用嘌呤类似物(例如，6TG)来进行体内化学选择的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过使用MTX或MPA来进行负选择的步骤，如果副作用(例如，GVHD)出现。
在本公开内容的另一个方面中为用于治疗血红蛋白病的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者(例如，人患者)施用有效量的药用组合物，其中所述药用组合物包含有包含至少两种核酸序列的表达载体和在药学上可接受的载料。在本公开内容的另一个方面中为用于治疗血红蛋白病的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者(例如，人患者)施用有效量的药用组合物，其中所述药用组合物包含用包含至少两种核酸序列的表达载体转导的宿主细胞群体和在药学上可接受的载料。在一些实施方案中，所述表达载体为慢病毒表达载体，其包含编码用于敲低HPRT基因的RNAi的第一核酸；和编码治疗性基因(例如，γ-珠蛋白基因)的第二核酸。在一些实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列包含SEQ ID NO:55的序列。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在施用经转导的HSC之前进行重度骨髓抑制调理的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在施用经转导的HSC之后通过使用6TG来进行体内化学选择的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过使用MTX或MPA来进行负选择的步骤，如果副作用(例如，GVHD)出现。
在本公开内容的另一个方面中为用于治疗严重症状性SCD或者减轻或改善严重症状性SCD的一种或多种症状的方法，所述方法包括：(i)用包含至少两种核酸序列(即编码用于敲低HPRT基因的核酸序列和编码γ-珠蛋白基因的核酸序列)的载体转导HSC，和(ii)向哺乳动物受试者施用经转导的HSC。在一些实施方案中，所述编码shRNA的核酸序列包含SEQID NO:30的序列。在一些实施方案中，所述编码γ-珠蛋白基因的核酸序列包含SEQ ID NO:55的序列。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在施用经转导的HSC之前进行重度骨髓抑制调理的步骤(例如，通过使用嘌呤类似物、化学疗法、放射疗法、用一种或多种内化免疫毒素或抗体-药物缀合物进行的治疗或者其任何组合)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在施用经转导的HSC之后通过使用嘌呤类似物(例如，6TG)来进行体内化学选择的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过使用MTX或MPA来进行负选择的步骤，如果副作用(例如，GVHD)出现。在一些实施方案中，治疗减轻或改善急性胸部综合征、严重疼痛发作、复发性阴茎异常勃起、红细胞同种异体免疫和/或神经学事件中的至少一种。
在一些实施方案中，移植后胎儿血红蛋白超过至少20％；F细胞构成循环红细胞的至少2/3；胎儿血红蛋白/F细胞占在镰状红细胞中的总血红蛋白的至少1/3；并且至少20％的基因经修饰的HSC重新定居于受试者的骨髓。在一些实施方案中，移植后胎儿血红蛋白超过25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。在一些实施方案中，移植后胎儿血红蛋白超过55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，F细胞构成循环红细胞的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，胎儿血红蛋白/F细胞占在镰状红细胞中的总血红蛋白的至少1/3。在一些实施方案中，胎儿血红蛋白/F细胞占在镰状红细胞中的总血红蛋白的至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的基因经修饰的HSC重新定居于受试者的骨髓。
在本发明的另一个方面中为用于治疗免疫缺陷、遗传性疾病、血液疾病(例如，血友病、血红蛋白病症)、溶酶体贮积病、神经学疾病、血管生成病症或癌症的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用有效量的载体，所述载体包含至少两种核酸序列，即编码用于敲低HPRT基因的RNAi的核酸序列和编码治疗性基因的核酸序列。
用嘌呤类似物进行的调理和化学选择
在一些实施方案中，所述治疗方法包括下列额外步骤：(i)在HSC移植之前的调理；和/或(ii)体内化学选择。一个或这两个步骤都可以使用嘌呤类似物。在一些实施方案中，所述嘌呤类似物为6TG。认为经移植物移入的在HPRT活性方面缺陷的包含γ-珠蛋白基因的HSC对于所引入的嘌呤类似物的细胞毒效应是高度抗性的。用调理和化学选择的联合策略，可以以低的总毒性取得HPRT-缺陷的、包含治疗性基因(例如γ-珠蛋白基因)的HSC的有效且高度的移植物移入。认为所得的治疗性基因(例如γ-珠蛋白基因)的表达，与基因经修饰的HSC的增强的移植物移入和化学选择相组合，可以导致足够的蛋白质产生以矫正免疫缺陷、遗传性疾病、血液疾病(例如，血友病、血红蛋白病症)、溶酶体贮积病、神经学疾病、血管生成病症或癌症(和在产生γ-珠蛋白的情况下，足够的胎儿血红蛋白形成以矫正SCD和/或β-地中海贫血)。
6TG是一种具有抗癌和免疫抑制活性两者的嘌呤类似物。硫代鸟嘌呤与次黄嘌呤和鸟嘌呤竞争次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRTase)并且本身被转化为6-硫代鸟苷酸(TGMP)。该核苷酸以治疗剂量达到高的细胞内浓度。TGMP在几个点处干扰鸟嘌呤核苷酸的合成。它通过谷氨酰胺5-磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(对于嘌呤核糖核苷酸的从头途径来说独一无二的第一个酶)的拟反馈抑制来抑制从头嘌呤生物合成。TGMP还通过竞争IMP脱氢酶这种酶来抑制肌苷酸(IMP)向黄苷酸(XMP)的转化。一度觉得TGMP是ATP:GMP磷酸转移酶(鸟苷酸激酶)的重要抑制剂，但最近的结果已显示并非如此。硫代鸟苷酸由代谢鸟嘌呤核苷酸的相同酶进一步转化为二磷酸和三硫酸，硫代鸟苷二磷酸(TGDP)和硫代鸟苷三磷酸(TGTP)(以及其2′-脱氧核糖基类似物)。
如本领域技术人员将会意识到的，鉴于在本公开内容的载体中包含被设计成用于降低HPRT表达的试剂，例如用于敲低HPRT的RNAi试剂，所得的经转导的HSC是HPRT-缺陷的或实质上HPRT-缺陷的。如此，可以通过施用一个或多个剂量的6TG来选择性地耗竭表达HPRT的那些HSC，即HPRT野生型细胞。在一些实施方案中，可以施用6TG用于HPRT-野生型受者的重度骨髓抑制调理和供者细胞的体内化学选择这两者。因此，认为该策略允许在体内选择基因经修饰的细胞，即允许在体内选择包含γ-珠蛋白的基因经修饰的细胞。
参考图2，在一些实施方案中，在从供者收集HSC(步骤110)后，用根据本公开内容的载体转导所述HSC(步骤120)。所得的HSC是HPRT-缺陷的，并且表达治疗性基因，例如γ-珠蛋白基因。并行地，待接受HSC的患者首先用重度骨髓抑制调理步骤进行治疗(步骤130)。在调理后，将经转导的HSC移植或施用给所述患者(步骤140)。然后，可以通过使用6TG在体内选择包含治疗性基因(例如，γ-珠蛋白基因)的HSC(步骤150)，如在本文中所讨论的。
重度骨髓抑制调理可以通过使用高剂量调理辐射、化学疗法和/或用嘌呤类似物(例如，6TG)进行的治疗来取得。在一些实施方案中，在用调理制度的治疗后大约24小时至大约96小时，施用HSC。在其他实施方案中，在用调理制度的治疗后大约24小时至大约72小时，用HSC移植物治疗所述患者。在另外其他实施方案中，在用调理制度的治疗后大约24小时至大约48小时，用HSC移植物治疗所述患者。在一些实施方案中，所述HSC移植物包含大约2×106个细胞/kg至大约15×106个细胞/kg(患者体重)。在一些实施方案中，所述HSC移植物包含最少2×106个/kg，目标为大于6×106个细胞/kg。在一些实施方案中，用在本文中所描述的慢病毒载体转导至少10％的所施用的细胞。在一些实施方案中，用在本文中所描述的慢病毒载体转导至少20％的所施用的细胞。在一些实施方案中，用在本文中所描述的慢病毒载体转导至少30％的所施用的细胞。在一些实施方案中，用在本文中所描述的慢病毒载体转导至少40％的所施用的细胞。在一些实施方案中，用在本文中所描述的慢病毒载体转导至少50％的所施用的细胞。
在一些实施方案中，通过使用6TG的低剂量规程来在体内选择包含治疗性基因的、HPRT-缺陷的HSC，6TG被认为对于造血外组织具有最小的不利效应。在一些实施方案中，在将HSC引入到患者中后，向患者提供从大约0.2mg/kg/天至大约0.6mg/kg/天变动的用于体内化学选择的6TG的剂量。在一些实施方案中，所述剂量从大约0.3mg/kg/天至大约1mg/kg/天变动。在一些实施方案中，所述剂量为直至大约2mg/kg/天。
在一些实施方案中，每剂所施用的6TG的量基于患者的HPRT酶活性的测定。本领域普通技术人员将会意识到，可以向具有较高水平的HPRT酶活性的那些患者提供具有较低量的6TG的剂量。HPRT的水平越高，6TG转化为毒性代谢物就越多。因此，就会需要施用越低的剂量来取得相同的目标。
在施行6TG调理之前进行的TPMT基因型和/或TPMT酶活性的测量可以鉴定具有低的TPMT酶活性或没有TPMT酶活性的个体。如此，在其他实施方案中，所施用的6TG的量基于硫代嘌呤S-甲基转移酶(TPMT)水平或TPMT基因型。
在一些实施方案中，以具有从由下列各项组成的组中选择的周期的规程向患者一周一至三次施用用于体内化学选择的6TG的剂量：(i)每周；(ii)每隔一周；(iii)一周的治疗，随后为二、三或四周的休息；(iv)两周的治疗，随后为一、二、三或四周的休息；(v)三周的治疗，随后为一、二、三、四或五周的休息；(vi)四周的治疗，随后为一、二、三、四或五周的休息；(vii)五周的治疗，随后为一、二、三、四或五周的休息；和(viii)每月。
在一些实施方案中，在从1周至大约4周变动的施用期内向患者施用大约3至大约10个剂量的6TG。在一些实施方案中，在14天的时期内向患者施用4或5个剂量的6TG。
用MTX或MPA进行的负选择
另外，可以通过使用氨甲蝶呤(MTX)以抑制在嘌呤从头合成途径中的二氢叶酸还原酶(DHFR)这种酶来对HPRT-缺陷的细胞进行负选择。这已经被开发为用于在观察到意料不到的不利效应的情况下消除基因经修饰的HSC的安全程序。如此，并且参考图2，如果任何不利的副作用出现，那么患者可以用MTX或麦考酚酸(MPA)来进行治疗(步骤160)。不利的副作用包括例如，异常的血细胞计数/克隆扩充(其表明在特定细胞克隆中的插入诱变)或细胞因子风暴。
认为MTX或MPA竞争性地抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)(其为一种参与四氢叶酸(THF)合成的酶)。DHFR催化二氢叶酸向有活性的四氢叶酸的转化。叶酸对于胸苷这种核苷(其是DNA合成所需要的)的从头合成来说是所需要的。此外，叶酸对于嘌呤和嘧啶碱基生物合成来说也是必不可少的，因此合成将会被抑制。因此，MTX或MPA抑制DNA、RNA、胸苷酸和蛋白质的合成。MTX或MPA通过抑制DHFR而阻断从头途径。在HPRT-/-细胞中，不存在功能性的补救或从头途径，从而导致没有嘌呤合成，并因此细胞死亡。然而，HPRT野生型细胞具有功能性的补救途径，其嘌呤合成发生，并且细胞存活。
鉴于根据本公开内容所产生的经修饰的HSC的敏感性，MTX或MPA可以用于选择性地消除HPRT-缺陷的细胞。在一些实施方案中，所述MTX或MPA以单剂量进行施用。在一些实施方案中，施用多个剂量的所述MTX或MPA。
在一些实施方案中，所施用的MTX的量从大约2mg/m2/输注至大约100mg/m2/输注变动。在一些实施方案中，所施用的MTX的量从大约2mg/m2/输注至大约90mg/m2/输注变动。在一些实施方案中，所施用的MTX的量从大约2mg/m2/输注至大约80mg/m2/输注变动。在一些实施方案中，所施用的MTX的量从大约2mg/m2/输注至大约70mg/m2/输注变动。在一些实施方案中，所施用的MTX的量从大约2mg/m2/输注至大约60mg/m2/输注变动。在一些实施方案中，所施用的MTX的量从大约2mg/m2/输注至大约50mg/m2/输注变动。在一些实施方案中，所施用的MTX的量从大约2mg/m2/输注至大约40mg/m2/输注变动。在一些实施方案中，所施用的MTX的量从大约2mg/m2/输注至大约30mg/m2/输注变动。在一些实施方案中，所施用的MTX的量从大约2mg/m2/输注至大约20mg/m2/输注变动。在一些实施方案中，所施用的MTX的量从大约2mg/m2/输注至大约10mg/m2/输注变动。在一些实施方案中，所施用的MTX的量从大约2mg/m2/输注至大约8mg/m2/输注变动。在其他实施方案中，所施用的MTX的量从大约2.5mg/m2/输注至大约7.5mg/m2/输注变动。在另外其他实施方案中，所施用的MTX的量为大约5mg/m2/输注。在更进一步的实施方案中，所施用的MTX的量为大约7.5mg/m2/输注。
在一些实施方案中，进行2至6次输注，并且所述输注可以每次包含相同的剂量或不同的剂量(例如，逐步升高的剂量、逐步降低的剂量等)。在一些实施方案中，所述施用可以每周一次或每两个月一次进行。
在一些实施方案中，以大约500mg/天至大约1500mg/天的量按剂量给予MPA。在一些实施方案中，以单次推注施用MPA的剂量。在一些实施方案中，将MPA的剂量划分为多个独个剂量，总共为大约500mg/天至大约1500mg/天。
在一些实施方案中，MTX或MPA的类似物或衍生物可以替代MTX或MPA。MTX的衍生物描述在美国专利号5,958,928和PCT公开号WO/2007/098089中，这些文献的公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文。
联合疗法
羟基脲(一种骨髓抑制试剂)被认为提高患者中的HbF水平和血红蛋白水平。目前的证据暗示，羟基脲的几个潜在作用机制可能对于具有SCD的患者是有关的，其一起不仅导致HbF诱导而且导致额外的益处。认为羟基脲是一种强有力的核糖核苷酸还原酶(RR)抑制剂，其减少细胞内脱氧核苷三磷酸池并且作为S-期特异性试剂起作用，其中具有DNA合成的抑制和最终的细胞的细胞毒性。羟基脲直接抑制RR M2亚基，但当去除羟基脲时，出现有活性的酶的自发再生。由于这个原因，羟基脲对于RR的体内效应可预测地是瞬时的，这是由于在哺乳动物系统中羟基脲的快速吸收、代谢和排泄而导致的。假定在SCD中以每日一次进行按剂量给药，那么羟基脲引起祖红细胞的间歇性细胞毒性阻抑和细胞应激信号传导，其然后影响红细胞生成动力学和生理学并且导致祖红细胞的募集，其中具有增加的HbF水平。羟基脲的一个显著属性是下述观察结果：治疗对于具有SCD的患者具有多种潜在益处。除了HbF诱导外，羟基脲的细胞毒效应也降低嗜中性粒细胞、网织红细胞的骨髓产生，并且还不降低血小板(其是炎症的重要介体)的产生。羟基脲治疗的另外益处包括对于循环红细胞的有益效应。
在本公开内容的另一个方面中为联合疗法，由此在将经转导的HSC(上面所描述的)施用或移植到有其治疗需要的患者中之前、期间或之后施用羟基脲。在一些实施方案中，可以在施用或移植经转导的HSC之后，根据需要，例如在疼痛危象期间、在急性胸部综合征开始时、在严重或症状性贫血(Hb<7g/dL)开始时等，施用羟基脲。在一些实施方案中，以从大约10mg/kg/天至大约15mg/kg/天变动的剂量施用羟基脲，并且以每单次日剂量给予。在一些实施方案中，可以随时间升高或降低羟基脲的剂量。
实施例
实施例1–TL20c-rGbGM-7SK/sh734载体的产生
pTL20c载体(SEQ ID NO:47)(参见图40)包含以相对于病毒转录物而言相反的方向插入到3’LTR中的鸡超敏感位点4绝缘子(cHS4)(SEQ ID NO:49)的400bp扩展核心元件。cHS4绝缘子包含由核心CTCF结合位点介导的增强子阻断活性和由VEZF1结合位点介导的屏障活性两者。关于pTL20c载体的另外的细节(包括其主链(SEQ ID NO:48))、由此产生生产细胞系或收获病毒滴度的方法描述在美国专利公开号2018/0112233(其公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文)中。
将400bp cHS4绝缘子以相反方向放置在LTR内，并且与去除了残留的nef序列的46bp缺失相组合，后者被认为降低了来自慢病毒LTR3的多腺苷酸化连读的频率。另外，将兔β-珠蛋白多腺苷酸化信号插入在3’LTR的下游以便为载体转录物提供较强的多腺苷酸化信号并且减少转录连读。
在图41中图解说明了具有相关的转基因和调控序列的sGbGM慢病毒载体–γ-珠蛋白sSIN慢病毒载体-sGbGM(SEQ ID NO:50)。外显子1、2和3分别在SEQ ID NO:41、52和53中示出。所述HIV慢病毒载体为自失活(SIN)设计。用CMV增强子/启动子替换5’LTR的U3区(HIV增强子/启动子)。3’LTR的U3区包含启动子增强子的400bp缺失以允许SIN设计，从而使得它在整合到宿主细胞中后不包含病毒转录元件。在3’LTR的下游，插入牛生长激素poly A信号以增强载体多腺苷酸化。除了包装区外，所述载体还携带大约gag基因的350bp，env的540bp，包括剪接受体和rev应答元件，随后为在5’LTR下游的pol基因的中央多嘌呤束的150bp。所述转基因表达盒由3.2Kb的超敏感位点2、3和4(通过PCR源自基因组)以及经修饰的β-珠蛋白/γ-珠蛋白杂合基因组成。该杂合珠蛋白基因通过使用PCR和位点定向诱变来进一步进行修饰，以将所有密码子变为γ-珠蛋白密码子。
pTL20c-sGbGM载体(图42)通过将sGbGM经修饰的β-珠蛋白/γ-珠蛋白杂合基因表达盒(SEQ ID NO:50)(图41)在MluI和NotI位点之间插入到慢病毒pTL20c载体(图40)中来构建。所述转基因表达盒的序列由3.2Kb的超敏感位点2、3和4以及经修饰的β-珠蛋白/γ-珠蛋白杂合基因组成。将β-珠蛋白启动子和经修饰的β-珠蛋白/γ-珠蛋白杂合基因以相对于病毒RNA转录物而言相反的方向插入到SIN慢病毒主链中。
TL20c-rGbGM-7SK/sh734载体(图43)通过将短发夹RNA(shRNA734)表达盒(SEQ IDNO:54)在HpaI和NotI位点之间插入到慢病毒pTL20c-sGbGM载体(参见图42)中来构建。所述短发夹RNA(shRNA734)表达盒的序列包含人7sk RNA Pol III启动子(SEQ ID NO:32)和短发夹RNA(shRNA734)基因(SEQ ID NO:30)。
实施例2–TL20c-rGbGM-7SK/sh734载体的临床前测试
概况
pTL20c-rGbGM-7SK/sh734双治疗性慢病毒载体构建体通过使用在K562细胞中的功能筛选(其比较转基因相对于彼此的位置和方向对于转基因表达的影响)和体外6-TG选择来进行鉴定。在6TG培养物中所选择的经pTL20c-rGbGM-7SK/sh734转导的K562细胞显示出γA-珠蛋白转基因的长期稳定性和表达，其被标准化至与未用6TG进行处理的用亲本GbGM慢病毒载体或CAL-H转导的细胞等价的VCN。这些发现表明，由不同启动子驱动的sh734和矫正sGbGM基因的功能性表达是互相排斥的，并且sGbGM的调控是谱系依赖性的。通过使用人红细胞分化的体外模型，我们显示了用CAL-H慢病毒载体转导的CD34+HSC在经扩展的培养物中组成性地表达sh734，以对于敲低HPRT表达和赋予基因经修饰的细胞的选择来说足够的水平，如通过在平均载体拷贝数(VCN)的增加和在第14天时经转导的细胞的频率所测定的。当然后将经6TG选择的培养物转移至红细胞分化培养条件时，γA-珠蛋白转基因以谱系特异性方式进行表达，从而建立了关于在经转导的人CD34+HSPC中转基因表达的顺次和协调调控的构思的证明。在本文中所描述的结果支持了临床试验以评价使用6TG的体内扩增实验方案，其用于增加对于取得关于镰状细胞病的治愈性的总HbF的水平和F细胞的百分比来说需要的经CAL-H转导的CD34+HSC的长期移植物移入潜力。
迄今为止关于用于地中海贫血和镰状细胞病的自体基因疗法的经验已暗示，用12mg/kg的白消安剂量的亚重度骨髓抑制调理的水平可能不足以取得足够的对于治愈疾病来说必需的供者嵌合状态，尽管估计具有30％基因经修饰的细胞的基因移植物移入的混合嵌合状态可能是治愈性的。一种用于避开较低移植物移入效率的方法是应用体内扩增策略。由于自体CD34+HSPC的转导效率可以从10％至60％变化，并且更加小部分的这些细胞是长期重新定居性HSC/MPP干细胞，因而在大多数情况下，经转导的干细胞剂量是不够最佳的。较低的效率反映在载体拷贝数(VCN)中，所述载体拷贝数是在输注后在造血细胞谱系中看到的。在大多数情况下，平均VCN显著地低于1/细胞。
基因疗法的目标是用其自体移植体向有其治疗需要的受试者提供镰状细胞HSC的一次性离体矫正，并且避开免疫学后果，例如移植物排斥和移植物抗宿主病(其与同种异体移植体相关联)。
材料与方法
在MEL细胞中的HbF感染滴度
以1至10的MOI用CAL-H和sh7/GFP载体的系列稀释通过旋转接种(spinoculation)来转导MEL细胞，并且将其以有限稀释进行铺板。
24-48小时测定％GFP阳性细胞。
扩展并且诱导分化3-4天，用10mM氯高铁血红素和3mM HMBA。
通过流式细胞术来测量成红血细胞分化，和通过膜联蛋白/7AAD染色来测量生存力/凋亡。
提取RNA。通过RT-PCR来测量sh7和γ-珠蛋白表达和VCN。
绘制倍增图：在经转导的细胞中的γ-珠蛋白mRNA和γ-珠蛋白mRNA/VCN，相对于经模拟品转导的细胞。
经CAL-H转导的K562细胞的6TG选择和长期稳定性。
用于测量转导效率、VCN、sh7和γ-珠蛋白表达、生存力和分化的测定法
1)在第7天以2个稀释倍数用6种不同的载体转导K562细胞(每种条件1×105个细胞)。
2)在第3天将所述细胞重新接种到具有额外的4mL新鲜RPMI培养基的6-孔平板中。
3)在第0天(MY)，关于13个样品(包括对照K562)，将两个细胞粒状沉淀(每个有1×106个细胞)冷冻下来以用于DNA和RNA分析。分析GbG和sh734的拷贝数。
4)将对照K562、6个以稀释倍数32进行转导的样品和6个以稀释倍数1进行转导的样品的2×105个细胞分别重新接种在没有或者具有300nM的6-硫代鸟嘌呤的具有4mL RPMI的6-孔平板中。6个以稀释倍数1进行转导的样品的2.5×106个细胞通过以1:3的比例混合经转导的和未转导的细胞来制备。对于这6个样品，将两个细胞粒状沉淀(每个有1×106个细胞)冷冻下来以用于DNA和RNA分析。每3-4天更新培养基。用TL20cw-7SK/sh734-GFP(以256和8的稀释倍数)转导的K562将会被包括作为阳性对照。
5)在第7/14/21或甚至28天(MY)，关于13个样品(包括对照K562)，将两个细胞粒状沉淀(每个有1×106个细胞)冷冻下来以用于DNA和RNA分析。分析GbG和sh734的拷贝数。在第21/28天的样品是任选的，如果所有样品的拷贝数高于关于第14天的期望值的95％。
6)在第14/21天，将12个处于6-TG选择下的样品的1×105个细胞接种到具有1mLRPMI而没有6-TG的12-孔平板中。3天后运行膜联蛋白V和7-AAD测定法。使用经喜树碱处理的细胞和用TL20cw-7SK/sh734-GFP(稀释倍数1)转导的细胞作为阳性对照。
目标
鉴于高水平的红细胞类特异性胎儿血红蛋白(γ-珠蛋白)表达在SCD和β-地中海贫血中可以是治愈性的，我们评估了基因转移效率(VCN)、珠蛋白基因表达、红细胞分化和总RBC Hb产生。使用K562人红细胞白血病细胞系作为红细胞体外分化的模型以提供关于下列的证据：(1)由于红细胞分化，经转移的γ-珠蛋白基因被正确地表达和调控(在未分化的状态下无表达，而在分化后有丰富的表达)；(2)针对HPRT的sh734不显著地改变γ-珠蛋白的表达；和(3)针对HPRT的sh734的表达没有显著地受到红细胞分化影响(在未分化的状态下具有高水平表达，而在分化后具有相似或较低的表达)。
对于sh734功能性/6TG选择的另外目标：
测定sh734±γ-珠蛋白是否具有相当的功能；
测定sh734±红细胞分化是否具有相当的功能；
测定经sh734转导的细胞的选择和长期稳定性；和
测定sh734是否不影响细胞生存力或载体稳定性。
体外表征
已经确定，TL20c LV主链显著地增强亲本sGbGM慢病毒载体的滴度，如在图44A、44B和45中所图解说明的。用表达sGbGM的单载体和双治疗性CAL-H载体获得了相当的滴度，这暗示转基因的表达不影响滴度(其作为HbF阳性细胞的百分比来测量)或血红蛋白化(hemoglobinization)/细胞(其通过经标准化的MFI来测量)(数据未显示)。重要的是，在TL20c主链中包括400bp cHS4绝缘子序列对于病毒滴度没有不利影响。
参考图44A，通过GPRG细胞的由CaPO4介导的瞬时转染来产生载体上清液(参见美国专利公开号2018/0112233)并将其贮存于-80℃。在1个冷冻-解冻循环后对所有载体进行滴定。滴度(TU/mL)＝(HbF-阳性细胞/100)的％×稀释倍数×细胞数目/体积(mL)。总之，TL20慢病毒载体主链显著地改善了VSVg假型SIN-慢病毒载体的转导效率。
关于图45，通过GPRG细胞的CaPO4转染来产生载体储备物，并且通过TFF系统浓缩700倍。在MEL细胞上测定载体滴度。通过特异于HIV-1p24衣壳蛋白的酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定载体颗粒浓度。将所获得的值用于计算平均载体感染性(引入单位[TU]/ngp24)。相比较而言，TL20c-rGbGM-7SK/sh734载体提供了相比于sGbGM而言更高的载体感染性。
相比于包含sh734的构建体而言，γ-珠蛋白基于sGbGM的构建体的等价的表达和 调控
由于sh7表达的水平与在人K562红细胞白血病细胞系中的6TG选择非常相关，因而使用这些细胞模型来提供关于下列的证据：(1)由于红细胞分化，经转移的γ-珠蛋白基因被正确地表达和调控(即在未分化的状态下无表达，而在分化后有丰富的表达)；(2)sh734不显著地改变γ-珠蛋白的表达；和(3)sh734的表达没有显著地受到红细胞分化影响(在未分化的状态下具有高水平表达，而在分化后具有相似或较低的表达)。由于K562细胞组成性地表达人胎儿珠蛋白并且不表达成人β-珠蛋白，因而这被认为是一种用于验证特异性γ-珠蛋白转基因引物和探针的特异性的良好系统。
如在图46中所图解说明的，在sGbGM(SSIN)单载体和目前所公开的双治疗性TL20c-rGbGM-7SK/sh734载体构建体之间存在等价的sGbGM表达。在以标准的诱导实验方案用10μM氯高铁血红素和3mM HMBA处理细胞之前，用LV VCM的五个两倍稀释物(1:8-1:128)转导MEL细胞3天。未转导的MEL细胞和并行的、经转导的、未诱导的培养物充当阴性对照。在第7天通过用流式细胞术测量Hu-HbF阳性细胞的％来测定感染性病毒滴度HbF。从细胞粒状沉淀中提取RNA，并且通过RT-PCR来测定γ-珠蛋白表达，其标准化至持家基因b2M的表达。对于每种载体，将标准化至感染性病毒滴度HbF的γ-珠蛋白的相对表达(15-25％)绘图。所标绘出的值表示来自3个分开的实验的所有生物学复现。在不同的LV转导的细胞之间不存在在sGbGM表达方面的显著差异。单向ANOVA，p＝0.137；和Tukeys多重比较检验，p>0.05。
如在图47中所显示的，相比于在经TL20c-rGbGM-7SK/sh734转导的细胞中的7.9倍增加而言，在经TL20c-rGbGM转导的K562细胞中存在在Aγ-珠蛋白mRNA水平的表达方面的12倍增加。处于p<0.05的t检验不是显著的。另外，所有特异性对照都未显示出我们的转基因特异性γ-珠蛋白引物与内源胎儿Hb的交叉反应性。
更特别地，用TL20c GbGM或CAL-H转导K562细胞并且传代39天。收获细胞，并且以标准的红细胞分化诱导实验方案在包含10μM氯高铁血红素和3mM HMBA的培养基中培养3-4天。通过RT-PCR来测量sGbGM的相对表达并且标准化至VCN以比较治疗。相比于在经CAL-H转导的细胞中的7.9倍而言，在经TL20crGbGM转导的K562细胞中存在在Aγ-珠蛋白mRNA水平的表达方面的12倍增加。(t检验，p<0.05不是显著的)。在经模拟品转导的细胞(未诱导的或经诱导的)中未检测到GbGM表达，并且在用单载体rsh7-GFP转导的K562细胞(未诱导的或经诱导的)中未检测到GbGM表达。
在红细胞分化期间存在很少至不存在sh734启动子的反式激活
申请人已显示，sh734转基因的表达在红细胞分化期间在K562细胞中保持不变(参见图48)。更特别地，用TL20c GbGM或CAL-H转导K562细胞并且传代39天。收获细胞，并且以标准的红细胞分化诱导实验方案在包含10μM氯高铁血红素和3mM HMBA的培养基中培养3至4天。通过RT-PCR相对于RNU38B来测定sh734的表达并且标准化至VCN以比较治疗。使用t-检验来测定在组之间的在sh7表达方面的差异是否达到显著。在p<0.05下，未发现显著差异。对照sh7GFP的经诱导的和未诱导的培养物，p＝0.69；CAL-H，p＝0.226；和未诱导的CAL-H对rsh7-GFP，p＝0.227。在模拟品和阴性对照TL20c-rGbGM组中未检测到sh734表达。
在K562细胞中TL20 SIN LV载体的功能筛选
TL20c-rGbGM-7SK/sh734双治疗性慢病毒载体构建体通过使用在K562细胞中的功能筛选(其比较转基因相对于彼此的位置和方向对于转基因表达的影响)和体外6-TG选择来进行鉴定。其他双转基因慢病毒载体(参见例如SEQ ID NO:5至22)通过使用具有在GbGM盒的上游或下游并且以正向或反向方向进行放置的sh734的TL20c慢病毒载体主链来构建。所测试的具有cHS4 Ins-400绝缘子的TL20自失活慢病毒载体包括：TL20c-rGbGM-7SK/sh734(图11)、TL20c-rGbGM-r7SK/sh734(图13)、TL20c-7SK/sh734-rGbGM(图7)和TL20c-r7SK/sh734-rGbGM(图9)。所测试的其他载体包括：没有cHS4 Ins-400绝缘子的TL20d-rGbGM-7SK/sh734(图21)、对照sh7报告构建体、TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP和TL20c-rGbGM。
用sh734转导K562细胞21天，在这之后开始6TG处理14天(阴影区)。参考图49A至49G，每两周从基因组DNA中测定载体拷贝数(VCN)，通过多重RU5 qPCR和从标准曲线的绝对定量，其中使用慢病毒载体(基于HIV-1的LTR R-U5)靶标和人脱脂载脂蛋白B(ApoB)参考序列。每个数据点表示三个分开的转导的平均值±SD(一式三份的生物学重复)。
在6TG培养物中所选择的经TL20c-rGbGM-7SK/sh734双治疗性慢病毒载体转导的K562细胞显示出γ-珠蛋白转基因的长期稳定性和表达，其被标准化至与未用6TG进行处理的用亲本GbGm LV载体转导的细胞或经CAL-H转导的细胞等价的VCN。这些发现表明，分别由分开的Pol III和Pol II启动子驱动的sh734和矫正sGbGM基因的功能性表达是互相排斥的，并且sGbGM的调控是谱系依赖性的。
在该实验中，在6TG处理后仅追踪了经TL20c-rGbGM-r7SK/sh734、TL20c-7SK/sh734-rGbGM和TL20c-r7SK/sh734-rGbGM慢病毒载体转导的K562细胞两周。令人感兴趣的是，所测试的所有双构建体载体(无论转基因的位置或方向如何)均在6TG治疗期间显示出相似的选择动力学，这暗示经转导的细胞组成性地表达维持HPRT敲低的sh7阈值水平从而允许选择。我们用双转基因自失活慢病毒载体也观察到了剂量-应答效应，其中经6TG处理的培养物的VCN与sh7表达和用于转导K562细胞的病毒稀释度强烈相关(数据未显示)。所测试的所有载体均显示出相似的在诱导后的γ-珠蛋白表达水平(相对表达GbGM/b2M)和生存力(<0.5％膜联蛋白V和7-AAD双阳性细胞)(数据未显示)。TL20c-rGbGM-7SK/sh734 LV载体经证明在sh7的高水平表达、稳固的6TG选择动力学和稳定性方面是最有效的。这些发现与在两个先前的实验中所发现的结果相一致。
参考图50，用TL20c-rGbGM-7SK/sh734或TL20c GbGM转导K562细胞21天，在这之后开始6TG处理。分离RNA并且进行qRT-PCRT以测定相对于RNU38B而言并且标准化至VCN(相对表达/VCN)的sh734的拷贝数。在诱导后每两周测定sh734和HPRT的相对表达水平。该图形图解说明了标绘在左边Y-轴上的sh734和标绘在右边Y-轴上的相关于经模拟品转导的细胞而言并且标准化至VCN的HPRT敲低的百分比(HPRT/模拟品×100)。
用sh7-GFP单载体报告构建体或CAL-H转导K562细胞21天，在这之后开始6TG。分离RNA，并且进行qRT-PCRT以测定相对于RNU38B而言并且标准化至VCN(相对表达/VCN)的sh734的拷贝数。图51A和51B图解说明了标绘在右边Y轴上的标准化至VCN的相对于经模拟品转导的细胞而言的HPRT敲低的百分比(HPRT/模拟品×100)。总之，用CAL-H或sh7-GFP单载体报告构建体转导的K562细胞展示出相似的sh734表达水平以及HPRT敲低和6TG选择的动力学。的确，6TG处理导致在表达sh734的细胞中HPRT水平的显著下落(小于未处理的细胞的10％)。在选择后14天，在经诱导的培养物中HPRT水平变得不可检测。在培养3个月后，经6TG选择的K562细胞继续生长并且表达sh734(数据未显示)。这些发现暗示，一旦建立了抗性，经sh734诱导的细胞继续存在并且存在很少的在K562细胞中沉默的迹象。在第21天，用sh7-GFP报告构建体转导的K562培养物是35％GFP+的，并且在6TG处理后第42天之前增加至88％GFP+细胞。参考图49H，TL20c-rGbGM-7SK/sh734 LV和TL20d-rGbGM-7SK/sh734 LV载体在2周6TG处理期间(第35天)显示出快速的选择，相比于所测试的其他构建体而言。
解冻CD34+细胞，并且通过在0.1mL的补充有SCF/Flit-3/TPO/IL-3的SFEM II培养基中过夜培养2×104个细胞来进行预刺激。在polybrene(6μg/ml)存在下通过旋转接种(2500rpm和1.5小时)以MOI＝20用Cal-H载体感染经预刺激的细胞。从离心机中取出细胞并放回到培养箱中4小时，在这之后交换至补充有StemSpanTM CD34+扩展补充物(100X)和UM171(67nM)/SR1(750nM)的SFEM培养基。将细胞在37℃和5％CO2下温育4天。从第4天开始，向CD34+细胞添加10mM的6-TG储备溶液至200nM的最终浓度。每3-4天更新具有或没有6TG的新鲜的扩展培养基。(参见图52A)。在第14天，对于在6-TG存在下或在6-TG不存在下培养的经Cal-H转导的细胞进行VCN测定法。在第15天，洗涤CD34+细胞并且接种在红细胞扩展培养基例如补充有红细胞扩展补充物的SFEM II培养基中。在第2和4天添加新鲜的红细胞扩展培养基。从第21天开始，每3天添加红细胞培养基(补充有10U/mL的EPO的SFEM II培养基)。在第28天，流式测定法显示60-80％的未转导的和经转导的细胞是CD235a+的(参见图52B)，并且HbF细胞内染色显示在6-TG选择下34.3％的经Cal-H转导的细胞是HbF+的，相比于在6-TG不存在下的15.8％而言(参见图52C)。
该实验提供了关于在原始CD34+HSPC中CAL-H转基因表达的功能性调控的构思的证明。在经CALH修饰的CD34+HSPC中sh7和GbGm表达的功能性调控通过在6TG选择后平均VCN的增加和在体外红细胞分化和成熟后HbF细胞的％的>2倍增加而显示出来。
结论
TL20c-rGbGM-7SK/sh734双治疗性LV构建体通过使用在K562细胞中的功能筛选(其比较转基因相对于彼此的位置和方向对于转基因表达、长期稳定性和功能的影响)和体外6-TG选择来进行鉴定。当以反向方向插入到具有400bp cHS4绝缘子的TL20c LV主链中时，感染滴度HbF和sGbGM盒的表达得到改善。在双治疗性TL20c-rGbGM-7SK/sh734载体表达中观察到高水平的sh734表达和红细胞谱系指导的基因表达，这暗示了转基因的互相排斥的表达和在珠蛋白基因调控元件与Pol III启动子之间的最小相互作用。进一步地，用6TG进行选择的经TL20c-rGbGM-7SK/sh734转导的K562培养物继续表达sh734并保持功能超过3个月，并且可以被诱导以朝着红细胞类细胞分化并上调γ-珠蛋白转基因的表达大约8倍。由于转基因沉默和变异性高度依赖于载体主链和细胞类型，因而关于TL20c-rGbGM-7SK/sh734在CD34+HSPC中是否如它在K562细胞模型中所做的那样好地表现进行了研究。用TL20c-rGbGM-7SK/sh734慢病毒转导CD34+HSC，然后在补充有UM171和SR1的培养基中培养细胞以保留更原始的HSC而不在用6TG进行处理的经扩展的培养物中分化。在2周后，将经6TG选择的CD34 HSC培养物转移至红细胞分化培养基中另外2周，并且通过流式细胞术来测量HbF阳性细胞的百分比。经6TG选择的培养物显示出HbF阳性细胞的2倍增加，这暗示用TL20c-rGbGM-7SK/sh734慢病毒载体转导的原始HSC可以经历体外选择并且以谱系特异性控制方式表达γ-珠蛋白。
实施例3–用于敲低HPRT的聚合酶II(Pol-II)-依赖性shRNA的设计及其用于6-TG 选择的应用
众所周知，一些聚合酶III-依赖性短发夹RNA具有过表达问题并且可以诱导急性细胞毒性。一些pol III启动子，例如U6，可以导致短发夹RNA的高得多的表达(参见MolTher.2006年10月,14(4):494-504，其暗示使用由pol II启动子驱动的shRNA以解决任何毒性问题；其公开内容在此通过提及而以其整体合并入本文)。这是一个重要的担心，当考虑使用RNA干扰(RNAi)作为潜在的治疗方法时，尤其是在干细胞基因疗法中。在此，使用聚合酶II作为备选的启动子来表达微小RNA以便实行HPRT表达的敲低。使用CRISPR/Cas9基因编辑方法，并且使用具有靶向CCR5的单向导RNA的Cas9(Cas9 RNP)，与编码由HPRT Pol II驱动的shRNA的单链DNA寡核苷酸供者(ssODN)一起，来使得CCR5基因座能够被功能性HPRTmiRNA有效替换。证明了将由Pol II驱动的shHPRT敲入到CCR5区域中以敲低HPRT和在6TG下选择具有发夹微小RNA表达基因的细胞系的能力。对于sh211和sh734的敲入，在K562细胞中未观察到明显的细胞毒性。
设计了两种类型的用于敲低HPRT的基于微小RNA的shRNA(表1)。一种类型是人工微小RNA shRNA的从头设计(参见Fang,W.&Bartel,David P.The Menu of Features thatDefine Primary MicroRNAs and Enable De Novo Design of MicroRNAGenes.Molecular Cell 60,131-145)。为该设计采用了两种候选物，包括miRNA734(111nt)(SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:67)和miRNA211(111nt)(SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:68)。另一种类型的基于微小RNA的shRNA基于经第三代miRNA支架修饰的miRNA 16-2(miRNA-3G)(参见Watanabe,C.,Cuellar,T.L.&Haley,B.Quantitative evaluation of first,second,and third generation hairpin systems reveals the limit of mammalianvector-based RNAi.RNA Biology 13,25-33(2016))。采用了两种进一步的候选物，包括sh734和sh211，各自内嵌在miRNA 3-G(165nt)中(分别为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:25)。
为了证明其生物学功能，将具有SEQ ID NO:23、24、25和26的shRNA中的每一个(各自独个地)与pol II启动子，即与EF1a(SEQ ID NO:64)和与SV40 polyA(SEQ ID NO:65)相组合，并且合成相应的DNA盒以提供在表2中所示的SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38和SEQ ID NO:39(参见图24)。用掺入了上面所提及的shRNA DNA盒中的每一个的纳米胶囊瞬时转染K562细胞，所述shRNA DNA盒在6-TG选择下掺入到那些细胞中。用shRNA转染的细胞显示出对于6-TG选择的抗性，如至少在图25A和25B中所证明的。认为用所有shRNADNA盒转染的细胞在6-TG处理下具有比对照组更高的存活细胞数目。
为了调查shRNA的长期稳定性，我们还使用CRISPR技术来将表达shRNA的盒敲入到CCR5区域中以敲低HPRT(参见图26)，并且在6-TG下选择具有发夹微小RNA表达基因的细胞系(也可参见表3，SEQ ID NO:40、41和42；和也可参见SEQ ID NO:62和63)。在三周的6-TG选择后，HPRT染色显示，具有由Pol II驱动的sh211-3G的敲入的K562细胞具有相比于对照(即，未转导的细胞)(99％)而言显著更低的HPRT水平(12％)(图27A、27B和27C)。
表1:用于敲低HPRT的由Pol II驱动的基于微小RNA的shRNA
Figure BDA0002406837830000891
表2:用于敲低HPRT的由EF1a驱动的基于微小RNA的shRNA的序列
Figure BDA0002406837830000892
Figure BDA0002406837830000901
表3:具有用于敲入到CCR5区域中的同源臂的由EF1a驱动的基于微小RNA的shRNA的序列
Figure BDA0002406837830000911
Figure BDA0002406837830000921
实施例4–造血干细胞移植之前的调理
造血干细胞移植(HSCT)被广泛用于治疗血液学恶性肿瘤，并且还为具有血红蛋白病、先天性免疫缺陷和其他状况(包括感染性疾病例如HIV/AIDS)的患者提供治愈性疗法。但是，HSCT治愈该宽范围的非恶性疾病的能力严重地未充分利用。在这些各种各样的状况中使用同种异体HSCT的障碍主要涉及威胁生命的移植物抗宿主病(GVHD)、由于调理的细胞毒效应而引起的急性并发症(例如，粘膜炎和感染)和起因于调理的基因毒性效应的长期的不可逆的并发症(例如，不育)的频率。使用在遗传上经矫正的细胞的自体HSCT将会避免GVHD的风险，但是调理的基因毒性仍然是开发该方法的重大屏障。
用于改善调理的安全性的一个有希望的途径是使用药物，例如抗体，其特异性地靶向HSC和在骨髓小生境中的其他造血细胞并且被认为放过非造血细胞。为此目的，可以使用某些靶向限制于造血细胞的CD45受体或更HSC特异性的CD117(c-Kit)的内化免疫毒素(也称为抗体-药物缀合物或ADC)(参见例如，美国专利公开号2017/0360954和2018/0147294；和PCT公开号WO/2017/219025和WO/2017/219029，其公开内容各自通过提及而以其整体合并入本文)。在一些实施方案中，所述免疫毒素选自下列：假单胞菌外毒素A、deBouganin、白喉毒素、鹅膏蕈毒素例如α-鹅膏毒环肽，皂草毒蛋白、美登素、美登素类化合物、奥瑞斯他汀、蒽环类化合物、加利车霉素、伊立替康、SN-38、倍癌霉素、吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002406837830000935
吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002406837830000932
二聚体、二氢吲哚并苯并二氮杂
Figure BDA0002406837830000933
或二氢吲哚并苯并二氮杂
Figure BDA0002406837830000934
二聚体、蓖麻毒素-A或其变体。在一些实施方案中，所述免疫毒素为皂草毒蛋白，一种使蛋白质合成停止的催化性N-糖苷酶核糖体失活蛋白。与其他蓖麻毒素家族成员不同，它被认为缺乏通常的细胞进入结构域并且是无毒性的，除非与靶向性抗体或能够进行由受体介导的内化的配体相缀合。
在临床前测试中，单剂量的免疫毒素，CD45-SAP(与靶向CD45的抗体相缀合的皂草毒蛋白)，使得有效的(>90％)供者细胞的移植物移入和镰状细胞贫血小鼠模型的完全矫正成为可能。与辐射相反，CD45-SAP完全避免了中性白细胞减少症和贫血，放过了骨髓和胸腺小生境，从而使得T和B细胞能够快速恢复，保留了抗真菌免疫性，和具有最小的总毒性。用单剂量的CD117-SAP进行治疗的人源化NSG小鼠在单次施用ADC后在骨髓中具有大于90％的HSPC的耗竭。这些无基因毒性的调理方法可以在治疗非恶性血液疾病中提供关于目前的用于HSCT的调理制度的有吸引力的备选方案。这些靶向调理试剂的经改善的安全性可以将治愈性骨髓移植体的使用扩展至无法耐受目前的调理方法的患者和扩展到其中骨髓移植体目前被认为过于危险的患者中。
在本公开内容的情景下，对患者进行调理以去除在骨髓中的现有的干细胞和患病的细胞，并且防止新来的干细胞的排斥。该过程目前使用最初为了治疗癌症而开发的毒性试剂，和将会以非特异性方式杀死细胞的程序例如辐射。为了对抗该严苛的程序，申请人已开发了这样一种程序，通过该程序用强度降低的调理(例如，白消安或美法仑–两者都是非特异性烷基化抗癌试剂)与随后的基因经修饰的细胞的输注后选择的组合来治疗患者，目的是作为门诊患者程序来提供HSCT，其中具有大幅减少的与调理有关的不利事件。尽管如此，一定水平的非特异性化学疗法对于在骨髓中为基因经修饰的细胞群体腾出空间来说是必需的。
作为关于使用白消安或美法仑的强度降低的调理的备选方案，可以使用抗体-药物缀合物(上面所描述的)作为备选的调理方法，其允许在接受基因疗法之前在患者中进行非基因毒性的骨髓调理，根据在本文中所描述的方法。特别地，给镰状细胞病或β-地中海贫血患者输注抗-CD45-SAP或抗-CD117/c-kit-SAP(或者这两种抗体的组合)以在骨髓中“腾出空间”，随后为输注经修饰的HSC，根据在本文中所描述的方法。然后，用6TG的输注后按剂量给药可以增加基因经修饰的细胞的嵌合状态以矫正所述疾病。认为这可能可以以最小的对于患者的总毒性或不利事件来进行。
另外的实施方案
在本公开内容的另一个方面中为载体，其包含：(i)编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列；和(ii)编码治疗性基因的核酸序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:30的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:30的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:30的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:30的序列。在一些实施方案中，所述编码治疗性基因的核酸序列具有与SEQ IDNO:55的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码治疗性基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码治疗性基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码治疗性基因的核酸序列具有SEQ ID NO:55的序列。在一些实施方案中，将所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列可操作地连接至Pol III启动子。在一些实施方案中，所述Pol III启动子为7sk，或具有至少一个突变或缺失的7sk启动子。在一些实施方案中，将所述编码治疗性基因的核酸序列可操作地连接至Pol II启动子。在一些实施方案中，将所述编码治疗性基因的核酸序列可操作地连接至β-珠蛋白启动子。在一些实施方案中，所述载体进一步包含表达控制序列，其具有在所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸上游的5'长末端重复序列，和在所述编码γ-珠蛋白基因的核酸下游的3'长末端重复序列。
在本公开内容的另一个方面中为载体，其包含与SEQ ID NO:30的序列具有至少90％同一性的第一核酸序列和与SEQ ID NO:55的序列具有至少90％同一性的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述载体为慢病毒载体。
在本公开内容的另一个方面中为载体，其包含与SEQ ID NO:30的序列具有至少95％同一性的第一核酸序列和与SEQ ID NO:55的序列具有至少95％同一性的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述载体为慢病毒载体。
在本公开内容的另一个方面中为载体，其包含与SEQ ID NO:30的序列具有至少96％同一性的第一核酸序列和与SEQ ID NO:55的序列具有至少96％同一性的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述载体为慢病毒载体。
在本公开内容的另一个方面中为载体，其包含与SEQ ID NO:30的序列具有至少97％同一性的第一核酸序列和与SEQ ID NO:55的序列具有至少97％同一性的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述载体为慢病毒载体。
在本公开内容的另一个方面中为载体，其包含与SEQ ID NO:30的序列具有至少98％同一性的第一核酸序列和与SEQ ID NO:55的序列具有至少98％同一性的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述载体为慢病毒载体。
在本公开内容的另一个方面中为载体，其包含与SEQ ID NO:30的序列具有至少99％同一性的第一核酸序列和与SEQ ID NO:55的序列具有至少99％同一性的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述载体为慢病毒载体。
在本公开内容的另一个方面中为载体，其包含具有SEQ ID NO:30的第一核酸序列和具有SEQ ID NO:55的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述载体为慢病毒载体。
在本公开内容的另一个方面中为组合物，其包含载体，所述载体包含：(i)编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列；和(ii)编码治疗性基因的核酸序列。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含在药学上可接受的载料。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:30的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:30的序列。在一些实施方案中，所述编码治疗性基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码治疗性基因的核酸序列具有SEQ ID NO:55的序列。在一些实施方案中，将所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列可操作地连接至Pol III启动子。在一些实施方案中，将所述编码治疗性基因的核酸序列可操作地连接至β-珠蛋白启动子。在一些实施方案中，将所述组合物配制为乳液。在一些实施方案中，将所述组合物配制在胶束内。在一些实施方案中，将所述组合物包囊在聚合物内。在一些实施方案中，将所述组合物包囊在脂质体内。在一些实施方案中，将所述组合物包囊在小细胞或纳米胶囊内。
在本公开内容的另一个方面中为细胞，其包含载体，所述载体包含：(i)编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列；和(ii)编码治疗性基因的核酸序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:30的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:30的序列。在一些实施方案中，所述编码治疗性基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码治疗性基因的核酸序列具有SEQID NO:55的序列。在一些实施方案中，将所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列可操作地连接至Pol III启动子。在一些实施方案中，将所述编码治疗性基因的核酸序列可操作地连接至β-珠蛋白启动子。
在本公开内容的另一个方面中为由载体转导的细胞，所述载体包含：(i)编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列；和(ii)编码治疗性基因的核酸序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:30的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:30的序列。在一些实施方案中，所述编码治疗性基因的核酸序列具有与SEQ ID NO:55的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码治疗性基因的核酸序列具有SEQID NO:55的序列。在一些实施方案中，将所述编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列可操作地连接至Pol III启动子。在一些实施方案中，将所述编码治疗性基因的核酸序列可操作地连接至β-珠蛋白启动子。在一些实施方案中，所述细胞为HSC。
在本公开内容的另一个方面中为与SEQ ID NO:5的序列具有至少90％同一性的多核苷酸。
在本公开内容的另一个方面中为包含大约11200个核苷酸至大约12300个核苷酸的重组质粒，其中所述质粒包含与SEQ ID NO:30的序列具有至少95％同一性的第一核酸序列，和与SEQ ID NO:55的序列具有至少95％同一性的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述质粒包含大约11600个核苷酸至大约12200个核苷酸。在一些实施方案中，所述质粒包含大约11600个核苷酸至大约11700个核苷酸。在一些实施方案中，所述质粒包含大约12000个核苷酸至大约12100个核苷酸。
在本公开内容的另一个方面中为慢病毒载体，其包含：(a)包含用于整合到靶细胞基因组中的必需慢病毒序列的慢病毒主链；(b)与SEQ ID NO:30的序列具有至少95％同一性的第一核酸序列；(c)与SEQ ID NO:55的序列具有至少95％同一性的第二核酸序列；(d)调控所述第一核酸的表达的第一表达控制元件；和(e)调控所述第二核酸的表达的第二表达控制元件。
在本公开内容的另一个方面中为慢病毒表达载体，其包含与SEQ ID NO:23-31中的任一个具有至少95％同一性的第一核酸序列，和具有SEQ ID NO:55的第二核酸序列。
在本公开内容的另一个方面中为经修饰的sh734 shRNA，其具有下列各项中的至少一项：(i)掺入hsa-miR-22环序列；(ii)添加3'-5'间隔子；(iii)5'起始修饰；和/或(iv)在5'和3'处向茎和环添加两个核苷酸。
在本公开内容的另一个方面中为用于将治疗性基因和干扰RNA(靶向HPRT的干扰RNA)两者共递送到细胞中的方法。在一些实施方案中，所述治疗性基因编码用于治疗免疫缺陷、遗传性疾病、血液疾病(例如，血友病、血红蛋白病症)、溶酶体贮积病、神经学疾病、血管生成病症或癌症的基因。
在本公开内容的另一个方面中为载体，其包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的RNAi；和可操作地连接至第二核酸序列的第二表达控制序列，所述第二核酸序列编码γ-珠蛋白基因。在一些实施方案中，所述RNAi为shRNA。在一些实施方案中，所述shRNA包含SEQ ID NO:35的发夹环序列。在一些实施方案中，所述shRNA与SEQ ID NO:30的序列具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，所述shRNA具有SEQ ID NO:30的序列。在一些实施方案中，所述shRNA与选自由SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29组成的组的核酸序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述shRNA与选自由SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68组成的组的核酸序列具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，所述shRNA与选自由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27组成的组的核酸序列具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，所述shRNA与SEQ IDNO:59的序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述第一表达控制序列为Pol III启动子。在一些实施方案中，所述Pol III启动子为7sk。在一些实施方案中，所述7sk启动子与SEQ ID NO:32的序列具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有SEQ ID NO:32的序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有SEQ ID NO:33的序列。在一些实施方案中，编码γ-珠蛋白基因的所述第二核酸与SEQ ID NO:55的序列具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，编码γ-珠蛋白基因的所述第二核酸具有SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，所述第二表达控制序列为pol II启动子。在一些实施方案中，所述polII启动子为β-珠蛋白启动子。在一些实施方案中，所述β-珠蛋白启动子与SEQ ID NO:66的序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述第一核酸编码具有SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的核酸分子。在一些实施方案中，所述第二核酸编码具有SEQ ID NO:3的核酸分子。在一些实施方案中，所述第二核酸编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述载体为自失活慢病毒载体。在一些实施方案中，所述载体与SEQ ID NO:5至22中的任一个具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，所述载体编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和编码具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸分子。
在本公开内容的另一个方面中为分离的宿主细胞，其包含上面所提及的载体。
在本说明书中所提及和/或在申请数据页中所列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物通过提及而以其整体合并入本文。可以修改实施方案的方面，如果需要采用各种专利、申请和出版物的构思以提供更加进一步的实施方案。
尽管已经通过参考许多举例说明性的实施方案而描述了本公开内容，但是应当理解，可以由本领域技术人员想出众多其他的修改和实施方案，其将会落在本公开内容的原理的精神和范围之内。更具体而言，在前述公开内容、附图和所附权利要求书的范围内在主题组合布置的组成部分和/或布置中合理的变化和修改是可能的，而不背离本公开内容的精神。除了在组成部分和/或布置中的变化和修改外，备选用途对于本领域技术人员来说也是明显的。
序列表
<110> CALIMMUNE, INC.
BARTLETT, Jeffrey S.
YAN, Ming
AHLERS, Jeffrey Donal
SYMONDS, Geoffrey
<120> 用于治疗β-血红蛋白病的组合物和方法
<130> Calimmune-051WO
<150> US 62/653,913
<151> 2018-04-06
<150> US 62/541,931
<151> 2017-08-07
<150> US 62/533,719
<151> 2017-07-18
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 靶向HPRT基因的shRNA
<400> 1
aggatatgcc cttgactatt tgtccgacat agtcaagggc atatcc 46
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 靶向HPRT基因的shRNA
<400> 2
tcctatacgg gaactgataa acaggctgta tcagttcccg tatagg 46
<210> 3
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: sGbGm A γ-珠蛋白翻译序列
<400> 3
atgggtcatt tcacagagga ggacaaggct actatcacaa gcctgtggga caaggtgaat 60
gtggaagatg ctggaggaga aaccctggga aggctcctgg ttgtctaccc atggacccag 120
aggttctttg acagctttgg caacctgtcc tctgcctctg ccatcatggg caaccccaaa 180
gtcaaggcac atggcaagaa ggtgctgact tccttgggag atgccataaa gcacctggat 240
gatctcaagg gcacctttgc ccagctgagt gaactgcact gtgacaagct gcatgtggat 300
cctgagaact tcaagctcct gggcaacgtg ctggtcaccg tgctggccat tcactttggc 360
aaagaattca cccctgaggt gcaggcttcc tggcagaaga tggtgactgc agtggccagt 420
gccctgtcct ccagatacca ctga 444
<210> 4
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: sGbGM HGB1氨基酸序列
<400> 4
Met Gly His Phe Thr Glu Glu Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Leu Trp
1 5 10 15
Asp Lys Val Asn Val Glu Asp Ala Gly Gly Glu Thr Leu Gly Arg Leu
20 25 30
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Asp Ser Phe Gly Asn
35 40 45
Leu Ser Ser Ala Ser Ala Ile Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His
50 55 60
Gly Lys Lys Val Leu Thr Ser Leu Gly Asp Ala Ile Lys His Leu Asp
65 70 75 80
Asp Leu Lys Gly Thr Phe Ala Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys
85 90 95
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Val Leu Val
100 105 110
Thr Val Leu Ala Ile His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Glu Val Gln
115 120 125
Ala Ser Trp Gln Lys Met Val Thr Ala Val Ala Ser Ala Leu Ser Ser
130 135 140
Arg Tyr His
145
<210> 5
<211> 12088
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TL20c-7SKM1/sh734-rGbGM
<400> 5
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 720
ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatact ggcctgttag 900
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500
tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2340
cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga agcggccgct cgacgtgcag 2400
tcgggctact gccccaccca tagtaccggc attctggata gtgtcaaaac agccggaaat 2460
caagtccgtt tatctcaaac tttagcattt tgggaataaa tgatatttgc tatgctggtt 2520
aaattagatt ttagttaaat ttcctgctga agctctagta cgataagtaa cttgacctaa 2580
gtgtaaagtt gagatttcct tcaggtttat atagcttgtg cgccgcctgg gtacctcagg 2640
atatgccctt gactatttgt ccgacatagt caagggcata tcctttttta cgcgtgggga 2700
tcctctagag tcgagctcgc gaggatcatc accggtgcta gccggagcca gaagcaccat 2760
aagggacatg ataagggagc cagcagacct ctgatctctt cctgaatgct aatcttaaac 2820
atcctgagga agaatgggac ttccatttgg ggtgggccta tgatagggta ataagacagt 2880
agtgaatatc aagctacaaa aagccccctt tcaaattctt ctcagtccta acttttcata 2940
ctaagcccag tccttccaaa gcagactgtg aaagagtgat agttccggga gactagcacc 3000
ggctagccga gcttggaaca ctttcccttc attaagaacc atccttgcta ctcagctgca 3060
atcaatccag cccccaggtc ttcactgaac cttttcccat ctcttccaaa acatctgttt 3120
ctgagaagtc ctgtcctata gaggtctttc ttcccaccgg atttctccta caccatttac 3180
tcccacttgc agaactcccg tgtacaagtg tctttactgc ttttatttgc tcaacaaaat 3240
gcacatctca tataaaaata aatgaggagc atgcacacac cacaaacaca aacaggcatg 3300
cagaaataca catacacact tccctcaata taaacccttt gtggctcata tatttaaaaa 3360
gatgtaaaaa aaagagctga agaaaatcat gtgtgatctc tcagcagaat agatttatta 3420
tttgtattgc ttgcagaata aagcctatcc ttgaaagctc tgaatcatgg gcaagaggct 3480
cagtggtatc tggaggacag ggcactggcc actgcagtca ccatcttctg ccaggaagcc 3540
tgcacctcag gggtgaattc tttgccaaag tgaatggcca gcacggtgac cagcacgttg 3600
cccaggagct gtgggaggaa gataagaggt atgaacatga ttagcaaaag ggcctagctt 3660
ggactcagaa taatccagcc ttatcccaac cataaaataa aagcagaatg gtagctggat 3720
tgtagctgct attagcaata tgaaacctct tacatcagtt acaatttata tgcagaaata 3780
tttatatgca gaaatattgc tattgcctta acccagaaat tatcactgtt attctttaga 3840
atggtgcaaa gaggcatgat acattgtatc attattgccc tgaaagaaag agattaggga 3900
aagtattaga aataagataa acaaaaaagt atattaaaag aagaaagcat tttttaaaat 3960
tacaaatgca aaattaccct gatttggtca atatgtgtac cctgttactt ctccccttcc 4020
tatgacatga acttaaccat agaaaagaag gggaaagaaa acatcaaggg tcccatagac 4080
tcaccttgaa gttctcagga tccacatgca gcttgtcaca gtgcagttca ctcagctggg 4140
caaaggtgcc cttgagatca tccaggtgct ttatggcatc tcccaaggaa gtcagcacct 4200
tcttgccatg tgccttgact ttggggttgc ccatgatggc agaggcagag gacaggttgc 4260
caaagctgtc aaagaacctc tgggtccatg ggtagacaac caggagcctg tgagattgac 4320
aagaacagtt tgacagtcag aaggtgccac aaatcctgag aagcaacctg gacttttgcc 4380
aggcacaggg tccttccttc cctcccttgt cctggtcacc agagcctacc ttcccagggt 4440
ttctcctcca gcatcttcca cattcacctt gtcccacagg cttgtgatag tagccttgtc 4500
ctcctctgtg aaatgaccca tggtgtctgt ttgaggttgc tagtgaacac agttgtgtca 4560
gaagcaaatg taagcaatag atggctctgc cctgactttt atgcccagcc ctggctcctg 4620
ccctccctgc tcctgggagt agattggcca accctagggt gtggctccac agggtgaggt 4680
ctaagtgatg acagccgtac ctgtccttgg ctcttctggc actggcttag gagttggact 4740
tcaaaccctc agccctccct ctaagatata tctcttggcc ccataccatc agtacaaatt 4800
gctactaaaa acatcctcct ttgcaagtgt atttacgacg gtatcgatgt atgtgagcat 4860
gtgtcctcta acagcacagg ccttttgcca cctagctgtc caggggtgcc ttaaaatggc 4920
aaacaaggtt tgttttcttt tcctgttttc atgccttcct cttccatatc cttgtttcat 4980
attaatacat gtgtatagat cctaaaaatc tatacacatg tattaataaa gcctgattct 5040
gccgcttcta ggtatagagg ccacctgcaa gataaatatt tgattcacaa taactaatca 5100
ttctatggca attgataaca acaaatatat atatatatat atatatacgt atatgtgtat 5160
atatatatat atattcagga aataatatat tctagaatat gtcacattct gtctcaggca 5220
tccattttct ttatgatgcc gtttgaggtg gagttttagt caggtggtca gcttctcctt 5280
ttttttgcca tctgccctgt aagcatcctg ctggggaccc agataggagt catcactcta 5340
ggctgagaac atctgggcac acaccctaag cctcagcatg actcatcatg actcagcatt 5400
gctgtgcttg agccagaagg tttgcttaga aggttacaca gaaccagaag gcgggggtgg 5460
ggcactgacc ccgacagggg cctggccaga actgctcatg cttggactat gggaggtcac 5520
taatggagac acacagaaat gtaacaggaa ctaagggaat tccggtgccc tgcttaggag 5580
cttaatcttt aatgaaagct aagctttcat taaaaaaagt ctaaccagct gcattcgact 5640
ttgactgcag cagctggtta gaaggttcta ctggaggagg gtcccagccc attgctaaat 5700
taacatcagg ctctgagact ggcagtatat ctctaacagt ggttgatgct atcttctgga 5760
acttgcctgc tacattgaga ccactgaccc atacatagga agcccatagc tctgtcctga 5820
actgttaggc cactggtcca gagagtgtgc atctcctttg atcctcataa taaccctatg 5880
agatagacac aattattact cttactttat agatgatgat cctgaaaaca taggagtcaa 5940
ggcacttgcc cctagctggg ggtatagggg agcagtccca tgtagtagta gaatgaaaaa 6000
tgctgctatg ctgtgcctcc cccacctttc ccatgtctgc cctctactca tggtctatct 6060
ctcctggctc ctgggagtca tggactccac ccagcaccac caacctgacc taaccaccta 6120
tctgagcctg ccagcctata acccatctgg gccctgatag ctggtggcca gccctgaccc 6180
caccccaccc tccctggaac ctctgataga cacatctggc acaccagctc gcaaagtcac 6240
cgtgagggtc ttgtgtttgc tgagtcaaaa ttccttgaaa tccaagtcct tagagactcc 6300
tgctcccaaa tttacagtca tagacttctt catggctgtc tcctttatcc acagaatgat 6360
tcctttgctt cattgcccca tccatctgat cctcctcatc agtgcagcac agggcccatg 6420
agcagtagct gcagagtctc acataggtct ggcactgcct ctgacatgtc cgaccttagg 6480
caaatgcttg actcttctga gctcggatcc cttgagctca ggaggtcaag gctgcagtga 6540
gacatgatct tgccactgca ctccagcctg gacagcagag tgaaaccttg cctcacgaaa 6600
cagaatacaa aaacaaacaa acaaaaaact gctccgcaat gcgcttcctt gatgctctac 6660
cacataggtc tgggtacttt gtacacatta tctcattgct gttcataatt gttagattaa 6720
ttttgtaata ttgatattat tcctagaaag ctgaggcctc aagatgataa cttttatttt 6780
ctggacttgt aatagctttc tcttgtattc accatgttgt aactttctta gagtagtaac 6840
aatataaagt tattgtgagt ttttgcaaac acagcaaaca caacgaccca tatagacatt 6900
gatgtgaaat tgtctattgt caatttatgg gaaaacaagt atgtactttt tctactaagc 6960
cattgaaaca ggaataacag aacaagattg aaagaataca ttttccgaaa ttacttgagt 7020
attatacaaa gacaagcacg tggacctggg aggagggtta ttgtccatga ctggtgtgtg 7080
gagacaaatg caggtttata atagatggga tggcatctag cgcaatgact ttgccatcac 7140
ttttagagag ctcttggggg ccccagtaca caagagggga cgcagggtat atgtagacat 7200
ctcattcttt ttcttagtgt gagaataaga atagccatga cctgagttta tagacaatga 7260
gcccttttct ctctcccact cagcagctat gagatggctt gccctgcctc tctactaggc 7320
tgactcactc caaggcccag caatgggcag ggctctgtca gggctttgat agcactatct 7380
gcagagccag ggccgagaag gggtggactc cagagactct ccctcccatt cccgagcagg 7440
gtttgcttat ttatgcattt aaatgatata tttattttaa aagaaataac aggagactgc 7500
ccagccctgg ctgtgacatg gaaactatgt agaatatttt gggttccatt tttttttcct 7560
tctttcagtt agaggaaaag gggctcactg cacatacact agacagaaag tcaggagctt 7620
tgaatccaag cctgatcatt tccatgtcat actgagaaag tccccaccct tctctgagcc 7680
tcagtttctc tttttataag taggagtctg gagtaaatga tttccaatgg ctctcatttc 7740
aatacaaaat ttccgtttat taaatgcatg agcttccgtt actccaagac tgagaaggaa 7800
attgaacctg agactcattg actggcaaga tgtccccaga ggctctcatt cagcaataaa 7860
attctcacct tcacccaggc ccactagtgt cagatttgca tgcgttaacg cggccgcatc 7920
gatgccgtag tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt 7980
ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc aaagaagaca agatccctgc 8040
aggcattcaa ggccaggctg gatgtggctc tgggcagcct gggctgctgg ttgatgaccc 8100
tgcacatagc agggggttgg atctggatga gcactgtgct cctttgcaac ccaggccgtt 8160
ctatgattct gtcattctaa atctctcttt cagcctaaag ctttttcccc gtatcccccc 8220
aggtgtctgc aggctcaaag agcagcgaga agcgttcaga ggaaagcgat cccgtgccac 8280
cttccccgtg cccgggctgt ccccgcacgc tgccggctcg gggatgcggg gggagcgccg 8340
gaccggagcg gagccccggg cggctcgctg ctgcccccta gcgggggagg gacgtaatta 8400
catccctggg ggctttgggg gggggctgtc cccgtgagct ccccagatct gctttttgcc 8460
tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg 8520
aacccactgc ttaagcctca ataaagcttc agctgctcga gctagcagat ctttttccct 8580
ctgccaaaaa ttatggggac atcatgaagc cccttgagca tctgacttct ggctaataaa 8640
ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga 8700
catatgggag ggcaaatcat ttaaaacatc agaatgagta tttggtttag agtttggcaa 8760
catatgccca tatgctggct gccatgaaca aaggttggct ataaagaggt catcagtata 8820
tgaaacagcc ccctgctgtc cattccttat tccatagaaa agccttgact tgaggttaga 8880
ttttttttat attttgtttt gtgttatttt tttctttaac atccctaaaa ttttccttac 8940
atgttttact agccagattt ttcctcctct cctgactact cccagtcata gctgtccctc 9000
ttctcttatg gagatccctc gacctgcagc ccaagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 9060
tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 9120
aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 9180
ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagcgga tccgcatctc aattagtcag 9240
caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc 9300
attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg 9360
cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa 9420
agctgtcgac tgcagaggcc tgcatgcaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 9480
tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg 9540
taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 9600
cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 9660
gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 9720
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 9780
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 9840
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 9900
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 9960
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 10020
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 10080
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 10140
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 10200
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 10260
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 10320
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 10380
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 10440
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 10500
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 10560
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 10620
tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 10680
atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 10740
tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 10800
aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 10860
catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 10920
gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 10980
ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 11040
aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 11100
atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 11160
cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 11220
gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 11280
agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 11340
gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 11400
caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 11460
ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 11520
tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 11580
aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat 11640
catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg 11700
tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta 11760
agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg 11820
gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg 11880
tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag 11940
gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc 12000
gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg 12060
acgttgtaaa acgacggcca gtgaattc 12088
<210> 6
<211> 12091
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TL20c-7SK/sh734-rGbGM
<400> 6
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 720
ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatact ggcctgttag 900
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500
tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2340
cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga agcggccgca tcgacgtgca 2400
gtatttagca tgccccaccc atctgcaagg cattctggat agtgtcaaaa cagccggaaa 2460
tcaagtccgt ttatctcaaa ctttagcatt ttgggaataa atgatatttg ctatgctggt 2520
taaattagat tttagttaaa tttcctgctg aagctctagt acgataagta acttgaccta 2580
agtgtaaagt tgagatttcc ttcaggttta tatagcttgt gcgccgcctg ggtacctcag 2640
gatatgccct tgactatttg tccgacatag tcaagggcat atcctttttt gtacgcgtgg 2700
ggatcctcta gagtcgagct cgcgaggatc atcaccggtg ctagccggag ccagaagcac 2760
cataagggac atgataaggg agccagcaga cctctgatct cttcctgaat gctaatctta 2820
aacatcctga ggaagaatgg gacttccatt tggggtgggc ctatgatagg gtaataagac 2880
agtagtgaat atcaagctac aaaaagcccc ctttcaaatt cttctcagtc ctaacttttc 2940
atactaagcc cagtccttcc aaagcagact gtgaaagagt gatagttccg ggagactagc 3000
accggctagc cgagcttgga acactttccc ttcattaaga accatccttg ctactcagct 3060
gcaatcaatc cagcccccag gtcttcactg aaccttttcc catctcttcc aaaacatctg 3120
tttctgagaa gtcctgtcct atagaggtct ttcttcccac cggatttctc ctacaccatt 3180
tactcccact tgcagaactc ccgtgtacaa gtgtctttac tgcttttatt tgctcaacaa 3240
aatgcacatc tcatataaaa ataaatgagg agcatgcaca caccacaaac acaaacaggc 3300
atgcagaaat acacatacac acttccctca atataaaccc tttgtggctc atatatttaa 3360
aaagatgtaa aaaaaagagc tgaagaaaat catgtgtgat ctctcagcag aatagattta 3420
ttatttgtat tgcttgcaga ataaagccta tccttgaaag ctctgaatca tgggcaagag 3480
gctcagtggt atctggagga cagggcactg gccactgcag tcaccatctt ctgccaggaa 3540
gcctgcacct caggggtgaa ttctttgcca aagtgaatgg ccagcacggt gaccagcacg 3600
ttgcccagga gctgtgggag gaagataaga ggtatgaaca tgattagcaa aagggcctag 3660
cttggactca gaataatcca gccttatccc aaccataaaa taaaagcaga atggtagctg 3720
gattgtagct gctattagca atatgaaacc tcttacatca gttacaattt atatgcagaa 3780
atatttatat gcagaaatat tgctattgcc ttaacccaga aattatcact gttattcttt 3840
agaatggtgc aaagaggcat gatacattgt atcattattg ccctgaaaga aagagattag 3900
ggaaagtatt agaaataaga taaacaaaaa agtatattaa aagaagaaag cattttttaa 3960
aattacaaat gcaaaattac cctgatttgg tcaatatgtg taccctgtta cttctcccct 4020
tcctatgaca tgaacttaac catagaaaag aaggggaaag aaaacatcaa gggtcccata 4080
gactcacctt gaagttctca ggatccacat gcagcttgtc acagtgcagt tcactcagct 4140
gggcaaaggt gcccttgaga tcatccaggt gctttatggc atctcccaag gaagtcagca 4200
ccttcttgcc atgtgccttg actttggggt tgcccatgat ggcagaggca gaggacaggt 4260
tgccaaagct gtcaaagaac ctctgggtcc atgggtagac aaccaggagc ctgtgagatt 4320
gacaagaaca gtttgacagt cagaaggtgc cacaaatcct gagaagcaac ctggactttt 4380
gccaggcaca gggtccttcc ttccctccct tgtcctggtc accagagcct accttcccag 4440
ggtttctcct ccagcatctt ccacattcac cttgtcccac aggcttgtga tagtagcctt 4500
gtcctcctct gtgaaatgac ccatggtgtc tgtttgaggt tgctagtgaa cacagttgtg 4560
tcagaagcaa atgtaagcaa tagatggctc tgccctgact tttatgccca gccctggctc 4620
ctgccctccc tgctcctggg agtagattgg ccaaccctag ggtgtggctc cacagggtga 4680
ggtctaagtg atgacagccg tacctgtcct tggctcttct ggcactggct taggagttgg 4740
acttcaaacc ctcagccctc cctctaagat atatctcttg gccccatacc atcagtacaa 4800
attgctacta aaaacatcct cctttgcaag tgtatttacg acggtatcga tgtatgtgag 4860
catgtgtcct ctaacagcac aggccttttg ccacctagct gtccaggggt gccttaaaat 4920
ggcaaacaag gtttgttttc ttttcctgtt ttcatgcctt cctcttccat atccttgttt 4980
catattaata catgtgtata gatcctaaaa atctatacac atgtattaat aaagcctgat 5040
tctgccgctt ctaggtatag aggccacctg caagataaat atttgattca caataactaa 5100
tcattctatg gcaattgata acaacaaata tatatatata tatatatata cgtatatgtg 5160
tatatatata tatatattca ggaaataata tattctagaa tatgtcacat tctgtctcag 5220
gcatccattt tctttatgat gccgtttgag gtggagtttt agtcaggtgg tcagcttctc 5280
cttttttttg ccatctgccc tgtaagcatc ctgctgggga cccagatagg agtcatcact 5340
ctaggctgag aacatctggg cacacaccct aagcctcagc atgactcatc atgactcagc 5400
attgctgtgc ttgagccaga aggtttgctt agaaggttac acagaaccag aaggcggggg 5460
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cactaatgga gacacacaga aatgtaacag gaactaaggg aattccggtg ccctgcttag 5580
gagcttaatc tttaatgaaa gctaagcttt cattaaaaaa agtctaacca gctgcattcg 5640
actttgactg cagcagctgg ttagaaggtt ctactggagg agggtcccag cccattgcta 5700
aattaacatc aggctctgag actggcagta tatctctaac agtggttgat gctatcttct 5760
ggaacttgcc tgctacattg agaccactga cccatacata ggaagcccat agctctgtcc 5820
tgaactgtta ggccactggt ccagagagtg tgcatctcct ttgatcctca taataaccct 5880
atgagataga cacaattatt actcttactt tatagatgat gatcctgaaa acataggagt 5940
caaggcactt gcccctagct gggggtatag gggagcagtc ccatgtagta gtagaatgaa 6000
aaatgctgct atgctgtgcc tcccccacct ttcccatgtc tgccctctac tcatggtcta 6060
tctctcctgg ctcctgggag tcatggactc cacccagcac caccaacctg acctaaccac 6120
ctatctgagc ctgccagcct ataacccatc tgggccctga tagctggtgg ccagccctga 6180
ccccacccca ccctccctgg aacctctgat agacacatct ggcacaccag ctcgcaaagt 6240
caccgtgagg gtcttgtgtt tgctgagtca aaattccttg aaatccaagt ccttagagac 6300
tcctgctccc aaatttacag tcatagactt cttcatggct gtctccttta tccacagaat 6360
gattcctttg cttcattgcc ccatccatct gatcctcctc atcagtgcag cacagggccc 6420
atgagcagta gctgcagagt ctcacatagg tctggcactg cctctgacat gtccgacctt 6480
aggcaaatgc ttgactcttc tgagctcgga tcccttgagc tcaggaggtc aaggctgcag 6540
tgagacatga tcttgccact gcactccagc ctggacagca gagtgaaacc ttgcctcacg 6600
aaacagaata caaaaacaaa caaacaaaaa actgctccgc aatgcgcttc cttgatgctc 6660
taccacatag gtctgggtac tttgtacaca ttatctcatt gctgttcata attgttagat 6720
taattttgta atattgatat tattcctaga aagctgaggc ctcaagatga taacttttat 6780
tttctggact tgtaatagct ttctcttgta ttcaccatgt tgtaactttc ttagagtagt 6840
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attgatgtga aattgtctat tgtcaattta tgggaaaaca agtatgtact ttttctacta 6960
agccattgaa acaggaataa cagaacaaga ttgaaagaat acattttccg aaattacttg 7020
agtattatac aaagacaagc acgtggacct gggaggaggg ttattgtcca tgactggtgt 7080
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catctcattc tttttcttag tgtgagaata agaatagcca tgacctgagt ttatagacaa 7260
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ggctgactca ctccaaggcc cagcaatggg cagggctctg tcagggcttt gatagcacta 7380
tctgcagagc cagggccgag aaggggtgga ctccagagac tctccctccc attcccgagc 7440
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tgcccagccc tggctgtgac atggaaacta tgtagaatat tttgggttcc attttttttt 7560
ccttctttca gttagaggaa aaggggctca ctgcacatac actagacaga aagtcaggag 7620
ctttgaatcc aagcctgatc atttccatgt catactgaga aagtccccac ccttctctga 7680
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ttcaatacaa aatttccgtt tattaaatgc atgagcttcc gttactccaa gactgagaag 7800
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aaaattctca ccttcaccca ggcccactag tgtcagattt gcatgcgtta acgcggccgc 7920
atcgatgccg tagtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac 7980
tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaaagaag acaagatccc 8040
tgcaggcatt caaggccagg ctggatgtgg ctctgggcag cctgggctgc tggttgatga 8100
ccctgcacat agcagggggt tggatctgga tgagcactgt gctcctttgc aacccaggcc 8160
gttctatgat tctgtcattc taaatctctc tttcagccta aagctttttc cccgtatccc 8220
cccaggtgtc tgcaggctca aagagcagcg agaagcgttc agaggaaagc gatcccgtgc 8280
caccttcccc gtgcccgggc tgtccccgca cgctgccggc tcggggatgc ggggggagcg 8340
ccggaccgga gcggagcccc gggcggctcg ctgctgcccc ctagcggggg agggacgtaa 8400
ttacatccct gggggctttg ggggggggct gtccccgtga gctccccaga tctgcttttt 8460
gcctgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta 8520
gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttcagctgct cgagctagca gatctttttc 8580
cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact tctggctaat 8640
aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc tcactcggaa 8700
ggacatatgg gagggcaaat catttaaaac atcagaatga gtatttggtt tagagtttgg 8760
caacatatgc ccatatgctg gctgccatga acaaaggttg gctataaaga ggtcatcagt 8820
atatgaaaca gccccctgct gtccattcct tattccatag aaaagccttg acttgaggtt 8880
agattttttt tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta aaattttcct 8940
tacatgtttt actagccaga tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc 9000
ctcttctctt atggagatcc ctcgacctgc agcccaagct tggcgtaatc atggtcatag 9060
ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 9120
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tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc ggatccgcat ctcaattagt 9240
cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg 9300
cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct 9360
cggcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca 9420
aaaagctgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg taatcatggt catagctgtt 9480
tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 9540
gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 9600
gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 9660
ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 9720
ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 9780
cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 9840
gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 9900
tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 9960
ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 10020
atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 10080
gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 10140
tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 10200
cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 10260
cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 10320
tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 10380
cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 10440
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 10500
gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 10560
gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 10620
gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 10680
ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 10740
atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 10800
agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 10860
ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 10920
tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 10980
ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 11040
caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 11100
gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 11160
atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 11220
accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 11280
aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 11340
gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 11400
tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 11460
aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 11520
ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 11580
aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat 11640
tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt 11700
cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct 11760
gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg 11820
tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg 11880
gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt 11940
caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct 12000
ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc 12060
acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt c 12091
<210> 7
<211> 12088
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TL20c-r7SKM1/sh734-rGbGM
<400> 7
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
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ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatact ggcctgttag 900
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500
tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
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caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
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caagctatat aaacctgaag gaaatctcaa ctttacactt aggtcaagtt acttatcgta 2520
ctagagcttc agcaggaaat ttaactaaaa tctaatttaa ccagcatagc aaatatcatt 2580
tattcccaaa atgctaaagt ttgagataaa cggacttgat ttccggctgt tttgacacta 2640
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atcaatccag cccccaggtc ttcactgaac cttttcccat ctcttccaaa acatctgttt 3120
ctgagaagtc ctgtcctata gaggtctttc ttcccaccgg atttctccta caccatttac 3180
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gcacatctca tataaaaata aatgaggagc atgcacacac cacaaacaca aacaggcatg 3300
cagaaataca catacacact tccctcaata taaacccttt gtggctcata tatttaaaaa 3360
gatgtaaaaa aaagagctga agaaaatcat gtgtgatctc tcagcagaat agatttatta 3420
tttgtattgc ttgcagaata aagcctatcc ttgaaagctc tgaatcatgg gcaagaggct 3480
cagtggtatc tggaggacag ggcactggcc actgcagtca ccatcttctg ccaggaagcc 3540
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cccaggagct gtgggaggaa gataagaggt atgaacatga ttagcaaaag ggcctagctt 3660
ggactcagaa taatccagcc ttatcccaac cataaaataa aagcagaatg gtagctggat 3720
tgtagctgct attagcaata tgaaacctct tacatcagtt acaatttata tgcagaaata 3780
tttatatgca gaaatattgc tattgcctta acccagaaat tatcactgtt attctttaga 3840
atggtgcaaa gaggcatgat acattgtatc attattgccc tgaaagaaag agattaggga 3900
aagtattaga aataagataa acaaaaaagt atattaaaag aagaaagcat tttttaaaat 3960
tacaaatgca aaattaccct gatttggtca atatgtgtac cctgttactt ctccccttcc 4020
tatgacatga acttaaccat agaaaagaag gggaaagaaa acatcaaggg tcccatagac 4080
tcaccttgaa gttctcagga tccacatgca gcttgtcaca gtgcagttca ctcagctggg 4140
caaaggtgcc cttgagatca tccaggtgct ttatggcatc tcccaaggaa gtcagcacct 4200
tcttgccatg tgccttgact ttggggttgc ccatgatggc agaggcagag gacaggttgc 4260
caaagctgtc aaagaacctc tgggtccatg ggtagacaac caggagcctg tgagattgac 4320
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aggcacaggg tccttccttc cctcccttgt cctggtcacc agagcctacc ttcccagggt 4440
ttctcctcca gcatcttcca cattcacctt gtcccacagg cttgtgatag tagccttgtc 4500
ctcctctgtg aaatgaccca tggtgtctgt ttgaggttgc tagtgaacac agttgtgtca 4560
gaagcaaatg taagcaatag atggctctgc cctgactttt atgcccagcc ctggctcctg 4620
ccctccctgc tcctgggagt agattggcca accctagggt gtggctccac agggtgaggt 4680
ctaagtgatg acagccgtac ctgtccttgg ctcttctggc actggcttag gagttggact 4740
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gctactaaaa acatcctcct ttgcaagtgt atttacgacg gtatcgatgt atgtgagcat 4860
gtgtcctcta acagcacagg ccttttgcca cctagctgtc caggggtgcc ttaaaatggc 4920
aaacaaggtt tgttttcttt tcctgttttc atgccttcct cttccatatc cttgtttcat 4980
attaatacat gtgtatagat cctaaaaatc tatacacatg tattaataaa gcctgattct 5040
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ttctatggca attgataaca acaaatatat atatatatat atatatacgt atatgtgtat 5160
atatatatat atattcagga aataatatat tctagaatat gtcacattct gtctcaggca 5220
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cacataggtc tgggtacttt gtacacatta tctcattgct gttcataatt gttagattaa 6720
ttttgtaata ttgatattat tcctagaaag ctgaggcctc aagatgataa cttttatttt 6780
ctggacttgt aatagctttc tcttgtattc accatgttgt aactttctta gagtagtaac 6840
aatataaagt tattgtgagt ttttgcaaac acagcaaaca caacgaccca tatagacatt 6900
gatgtgaaat tgtctattgt caatttatgg gaaaacaagt atgtactttt tctactaagc 6960
cattgaaaca ggaataacag aacaagattg aaagaataca ttttccgaaa ttacttgagt 7020
attatacaaa gacaagcacg tggacctggg aggagggtta ttgtccatga ctggtgtgtg 7080
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ctcattcttt ttcttagtgt gagaataaga atagccatga cctgagttta tagacaatga 7260
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tgactcactc caaggcccag caatgggcag ggctctgtca gggctttgat agcactatct 7380
gcagagccag ggccgagaag gggtggactc cagagactct ccctcccatt cccgagcagg 7440
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ccagccctgg ctgtgacatg gaaactatgt agaatatttt gggttccatt tttttttcct 7560
tctttcagtt agaggaaaag gggctcactg cacatacact agacagaaag tcaggagctt 7620
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aatacaaaat ttccgtttat taaatgcatg agcttccgtt actccaagac tgagaaggaa 7800
attgaacctg agactcattg actggcaaga tgtccccaga ggctctcatt cagcaataaa 7860
attctcacct tcacccaggc ccactagtgt cagatttgca tgcgttaacg cggccgcatc 7920
gatgccgtag tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt 7980
ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc aaagaagaca agatccctgc 8040
aggcattcaa ggccaggctg gatgtggctc tgggcagcct gggctgctgg ttgatgaccc 8100
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ctatgattct gtcattctaa atctctcttt cagcctaaag ctttttcccc gtatcccccc 8220
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cttccccgtg cccgggctgt ccccgcacgc tgccggctcg gggatgcggg gggagcgccg 8340
gaccggagcg gagccccggg cggctcgctg ctgcccccta gcgggggagg gacgtaatta 8400
catccctggg ggctttgggg gggggctgtc cccgtgagct ccccagatct gctttttgcc 8460
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ctgccaaaaa ttatggggac atcatgaagc cccttgagca tctgacttct ggctaataaa 8640
ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga 8700
catatgggag ggcaaatcat ttaaaacatc agaatgagta tttggtttag agtttggcaa 8760
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ttttttttat attttgtttt gtgttatttt tttctttaac atccctaaaa ttttccttac 8940
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ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 9780
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 9840
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 9900
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 9960
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 10020
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 10080
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 10140
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 10200
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 10260
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tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 10800
aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 10860
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ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2340
cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga acgcgtgggg atcctctaga 2400
gtcgagctcg cgaggatcat caccggtgct agccggagcc agaagcacca taagggacat 2460
gataagggag ccagcagacc tctgatctct tcctgaatgc taatcttaaa catcctgagg 2520
aagaatggga cttccatttg gggtgggcct atgatagggt aataagacag tagtgaatat 2580
caagctacaa aaagccccct ttcaaattct tctcagtcct aacttttcat actaagccca 2640
gtccttccaa agcagactgt gaaagagtga tagttccggg agactagcac cggctagccg 2700
agcttggaac actttccctt cattaagaac catccttgct actcagctgc aatcaatcca 2760
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cctgtcctat agaggtcttt cttcccaccg gatttctcct acaccattta ctcccacttg 2880
cagaactccc gtgtacaagt gtctttactg cttttatttg ctcaacaaaa tgcacatctc 2940
atataaaaat aaatgaggag catgcacaca ccacaaacac aaacaggcat gcagaaatac 3000
acatacacac ttccctcaat ataaaccctt tgtggctcat atatttaaaa agatgtaaaa 3060
aaaagagctg aagaaaatca tgtgtgatct ctcagcagaa tagatttatt atttgtattg 3120
cttgcagaat aaagcctatc cttgaaagct ctgaatcatg ggcaagaggc tcagtggtat 3180
ctggaggaca gggcactggc cactgcagtc accatcttct gccaggaagc ctgcacctca 3240
ggggtgaatt ctttgccaaa gtgaatggcc agcacggtga ccagcacgtt gcccaggagc 3300
tgtgggagga agataagagg tatgaacatg attagcaaaa gggcctagct tggactcaga 3360
ataatccagc cttatcccaa ccataaaata aaagcagaat ggtagctgga ttgtagctgc 3420
tattagcaat atgaaacctc ttacatcagt tacaatttat atgcagaaat atttatatgc 3480
agaaatattg ctattgcctt aacccagaaa ttatcactgt tattctttag aatggtgcaa 3540
agaggcatga tacattgtat cattattgcc ctgaaagaaa gagattaggg aaagtattag 3600
aaataagata aacaaaaaag tatattaaaa gaagaaagca ttttttaaaa ttacaaatgc 3660
aaaattaccc tgatttggtc aatatgtgta ccctgttact tctccccttc ctatgacatg 3720
aacttaacca tagaaaagaa ggggaaagaa aacatcaagg gtcccataga ctcaccttga 3780
agttctcagg atccacatgc agcttgtcac agtgcagttc actcagctgg gcaaaggtgc 3840
ccttgagatc atccaggtgc tttatggcat ctcccaagga agtcagcacc ttcttgccat 3900
gtgccttgac tttggggttg cccatgatgg cagaggcaga ggacaggttg ccaaagctgt 3960
caaagaacct ctgggtccat gggtagacaa ccaggagcct gtgagattga caagaacagt 4020
ttgacagtca gaaggtgcca caaatcctga gaagcaacct ggacttttgc caggcacagg 4080
gtccttcctt ccctcccttg tcctggtcac cagagcctac cttcccaggg tttctcctcc 4140
agcatcttcc acattcacct tgtcccacag gcttgtgata gtagccttgt cctcctctgt 4200
gaaatgaccc atggtgtctg tttgaggttg ctagtgaaca cagttgtgtc agaagcaaat 4260
gtaagcaata gatggctctg ccctgacttt tatgcccagc cctggctcct gccctccctg 4320
ctcctgggag tagattggcc aaccctaggg tgtggctcca cagggtgagg tctaagtgat 4380
gacagccgta cctgtccttg gctcttctgg cactggctta ggagttggac ttcaaaccct 4440
cagccctccc tctaagatat atctcttggc cccataccat cagtacaaat tgctactaaa 4500
aacatcctcc tttgcaagtg tatttacgac ggtatcgatg tatgtgagca tgtgtcctct 4560
aacagcacag gccttttgcc acctagctgt ccaggggtgc cttaaaatgg caaacaaggt 4620
ttgttttctt ttcctgtttt catgccttcc tcttccatat ccttgtttca tattaataca 4680
tgtgtataga tcctaaaaat ctatacacat gtattaataa agcctgattc tgccgcttct 4740
aggtatagag gccacctgca agataaatat ttgattcaca ataactaatc attctatggc 4800
aattgataac aacaaatata tatatatata tatatatacg tatatgtgta tatatatata 4860
tatattcagg aaataatata ttctagaata tgtcacattc tgtctcaggc atccattttc 4920
tttatgatgc cgtttgaggt ggagttttag tcaggtggtc agcttctcct tttttttgcc 4980
atctgccctg taagcatcct gctggggacc cagataggag tcatcactct aggctgagaa 5040
catctgggca cacaccctaa gcctcagcat gactcatcat gactcagcat tgctgtgctt 5100
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cacacagaaa tgtaacagga actaagggaa ttccggtgcc ctgcttagga gcttaatctt 5280
taatgaaagc taagctttca ttaaaaaaag tctaaccagc tgcattcgac tttgactgca 5340
gcagctggtt agaaggttct actggaggag ggtcccagcc cattgctaaa ttaacatcag 5400
gctctgagac tggcagtata tctctaacag tggttgatgc tatcttctgg aacttgcctg 5460
ctacattgag accactgacc catacatagg aagcccatag ctctgtcctg aactgttagg 5520
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caattattac tcttacttta tagatgatga tcctgaaaac ataggagtca aggcacttgc 5640
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gctgtgcctc ccccaccttt cccatgtctg ccctctactc atggtctatc tctcctggct 5760
cctgggagtc atggactcca cccagcacca ccaacctgac ctaaccacct atctgagcct 5820
gccagcctat aacccatctg ggccctgata gctggtggcc agccctgacc ccaccccacc 5880
ctccctggaa cctctgatag acacatctgg cacaccagct cgcaaagtca ccgtgagggt 5940
cttgtgtttg ctgagtcaaa attccttgaa atccaagtcc ttagagactc ctgctcccaa 6000
atttacagtc atagacttct tcatggctgt ctcctttatc cacagaatga ttcctttgct 6060
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aaaacaaaca aacaaaaaac tgctccgcaa tgcgcttcct tgatgctcta ccacataggt 6360
ctgggtactt tgtacacatt atctcattgc tgttcataat tgttagatta attttgtaat 6420
attgatatta ttcctagaaa gctgaggcct caagatgata acttttattt tctggacttg 6480
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gcaggtttat aatagatggg atggcatcta gcgcaatgac tttgccatca cttttagaga 6840
gctcttgggg gccccagtac acaagagggg acgcagggta tatgtagaca tctcattctt 6900
tttcttagtg tgagaataag aatagccatg acctgagttt atagacaatg agcccttttc 6960
tctctcccac tcagcagcta tgagatggct tgccctgcct ctctactagg ctgactcact 7020
ccaaggccca gcaatgggca gggctctgtc agggctttga tagcactatc tgcagagcca 7080
gggccgagaa ggggtggact ccagagactc tccctcccat tcccgagcag ggtttgctta 7140
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gctgtgacat ggaaactatg tagaatattt tgggttccat ttttttttcc ttctttcagt 7260
tagaggaaaa ggggctcact gcacatacac tagacagaaa gtcaggagct ttgaatccaa 7320
gcctgatcat ttccatgtca tactgagaaa gtccccaccc ttctctgagc ctcagtttct 7380
ctttttataa gtaggagtct ggagtaaatg atttccaatg gctctcattt caatacaaaa 7440
tttccgttta ttaaatgcat gagcttccgt tactccaaga ctgagaagga aattgaacct 7500
gagactcatt gactggcaag atgtccccag aggctctcat tcagcaataa aattctcacc 7560
ttcacccagg cccactagtg tcagatttgc atgcgttcgc gttcgacgtg cagtcgggct 7620
actgccccac ccatagtacc ggcattctgg atagtgtcaa aacagccgga aatcaagtcc 7680
gtttatctca aactttagca ttttgggaat aaatgatatt tgctatgctg gttaaattag 7740
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gttgagattt ccttcaggtt tatatagctt gtgcgccgcc tgggtacctc aggatatgcc 7860
cttgactatt tgtccgacat agtcaagggc atatcctttt ttgcggccgc atcgatgccg 7920
tagtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag 7980
aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaaagaag acaagatccc tgcaggcatt 8040
caaggccagg ctggatgtgg ctctgggcag cctgggctgc tggttgatga ccctgcacat 8100
agcagggggt tggatctgga tgagcactgt gctcctttgc aacccaggcc gttctatgat 8160
tctgtcattc taaatctctc tttcagccta aagctttttc cccgtatccc cccaggtgtc 8220
tgcaggctca aagagcagcg agaagcgttc agaggaaagc gatcccgtgc caccttcccc 8280
gtgcccgggc tgtccccgca cgctgccggc tcggggatgc ggggggagcg ccggaccgga 8340
gcggagcccc gggcggctcg ctgctgcccc ctagcggggg agggacgtaa ttacatccct 8400
gggggctttg ggggggggct gtccccgtga gctccccaga tctgcttttt gcctgtactg 8460
ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 8520
tgcttaagcc tcaataaagc ttcagctgct cgagctagca gatctttttc cctctgccaa 8580
aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact tctggctaat aaaggaaatt 8640
tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc tcactcggaa ggacatatgg 8700
gagggcaaat catttaaaac atcagaatga gtatttggtt tagagtttgg caacatatgc 8760
ccatatgctg gctgccatga acaaaggttg gctataaaga ggtcatcagt atatgaaaca 8820
gccccctgct gtccattcct tattccatag aaaagccttg acttgaggtt agattttttt 8880
tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta aaattttcct tacatgtttt 8940
actagccaga tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt 9000
atggagatcc ctcgacctgc agcccaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 9060
tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 9120
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gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga 9360
gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagctgtc 9420
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ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 9720
cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 9780
ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 9840
aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 9900
cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 9960
cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 10020
gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 10080
tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 10140
cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 10200
ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 10260
gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc 10320
gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 10380
accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 10440
ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 10500
tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 10560
aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 10620
taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 10680
gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 10740
agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 10800
cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 10860
tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 10920
gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 10980
agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 11040
gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 11100
atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 11160
gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 11220
tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 11280
atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 11340
agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 11400
gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 11460
cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 11520
tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 11580
ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca 11640
ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac 11700
ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat 11760
gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg 11820
cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 11880
ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc 11940
aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg 12000
ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt 12060
aaaacgacgg ccagtgaatt c 12081
<210> 10
<211> 12084
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TL20c-rGbGM-7SK/sh734
<400> 10
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 720
ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatact ggcctgttag 900
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
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tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
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gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
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caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
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gtcgagctcg cgaggatcat caccggtgct agccggagcc agaagcacca taagggacat 2460
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caagctacaa aaagccccct ttcaaattct tctcagtcct aacttttcat actaagccca 2640
gtccttccaa agcagactgt gaaagagtga tagttccggg agactagcac cggctagccg 2700
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gcccccaggt cttcactgaa ccttttccca tctcttccaa aacatctgtt tctgagaagt 2820
cctgtcctat agaggtcttt cttcccaccg gatttctcct acaccattta ctcccacttg 2880
cagaactccc gtgtacaagt gtctttactg cttttatttg ctcaacaaaa tgcacatctc 2940
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tattagcaat atgaaacctc ttacatcagt tacaatttat atgcagaaat atttatatgc 3480
agaaatattg ctattgcctt aacccagaaa ttatcactgt tattctttag aatggtgcaa 3540
agaggcatga tacattgtat cattattgcc ctgaaagaaa gagattaggg aaagtattag 3600
aaataagata aacaaaaaag tatattaaaa gaagaaagca ttttttaaaa ttacaaatgc 3660
aaaattaccc tgatttggtc aatatgtgta ccctgttact tctccccttc ctatgacatg 3720
aacttaacca tagaaaagaa ggggaaagaa aacatcaagg gtcccataga ctcaccttga 3780
agttctcagg atccacatgc agcttgtcac agtgcagttc actcagctgg gcaaaggtgc 3840
ccttgagatc atccaggtgc tttatggcat ctcccaagga agtcagcacc ttcttgccat 3900
gtgccttgac tttggggttg cccatgatgg cagaggcaga ggacaggttg ccaaagctgt 3960
caaagaacct ctgggtccat gggtagacaa ccaggagcct gtgagattga caagaacagt 4020
ttgacagtca gaaggtgcca caaatcctga gaagcaacct ggacttttgc caggcacagg 4080
gtccttcctt ccctcccttg tcctggtcac cagagcctac cttcccaggg tttctcctcc 4140
agcatcttcc acattcacct tgtcccacag gcttgtgata gtagccttgt cctcctctgt 4200
gaaatgaccc atggtgtctg tttgaggttg ctagtgaaca cagttgtgtc agaagcaaat 4260
gtaagcaata gatggctctg ccctgacttt tatgcccagc cctggctcct gccctccctg 4320
ctcctgggag tagattggcc aaccctaggg tgtggctcca cagggtgagg tctaagtgat 4380
gacagccgta cctgtccttg gctcttctgg cactggctta ggagttggac ttcaaaccct 4440
cagccctccc tctaagatat atctcttggc cccataccat cagtacaaat tgctactaaa 4500
aacatcctcc tttgcaagtg tatttacgac ggtatcgatg tatgtgagca tgtgtcctct 4560
aacagcacag gccttttgcc acctagctgt ccaggggtgc cttaaaatgg caaacaaggt 4620
ttgttttctt ttcctgtttt catgccttcc tcttccatat ccttgtttca tattaataca 4680
tgtgtataga tcctaaaaat ctatacacat gtattaataa agcctgattc tgccgcttct 4740
aggtatagag gccacctgca agataaatat ttgattcaca ataactaatc attctatggc 4800
aattgataac aacaaatata tatatatata tatatatacg tatatgtgta tatatatata 4860
tatattcagg aaataatata ttctagaata tgtcacattc tgtctcaggc atccattttc 4920
tttatgatgc cgtttgaggt ggagttttag tcaggtggtc agcttctcct tttttttgcc 4980
atctgccctg taagcatcct gctggggacc cagataggag tcatcactct aggctgagaa 5040
catctgggca cacaccctaa gcctcagcat gactcatcat gactcagcat tgctgtgctt 5100
gagccagaag gtttgcttag aaggttacac agaaccagaa ggcgggggtg gggcactgac 5160
cccgacaggg gcctggccag aactgctcat gcttggacta tgggaggtca ctaatggaga 5220
cacacagaaa tgtaacagga actaagggaa ttccggtgcc ctgcttagga gcttaatctt 5280
taatgaaagc taagctttca ttaaaaaaag tctaaccagc tgcattcgac tttgactgca 5340
gcagctggtt agaaggttct actggaggag ggtcccagcc cattgctaaa ttaacatcag 5400
gctctgagac tggcagtata tctctaacag tggttgatgc tatcttctgg aacttgcctg 5460
ctacattgag accactgacc catacatagg aagcccatag ctctgtcctg aactgttagg 5520
ccactggtcc agagagtgtg catctccttt gatcctcata ataaccctat gagatagaca 5580
caattattac tcttacttta tagatgatga tcctgaaaac ataggagtca aggcacttgc 5640
ccctagctgg gggtataggg gagcagtccc atgtagtagt agaatgaaaa atgctgctat 5700
gctgtgcctc ccccaccttt cccatgtctg ccctctactc atggtctatc tctcctggct 5760
cctgggagtc atggactcca cccagcacca ccaacctgac ctaaccacct atctgagcct 5820
gccagcctat aacccatctg ggccctgata gctggtggcc agccctgacc ccaccccacc 5880
ctccctggaa cctctgatag acacatctgg cacaccagct cgcaaagtca ccgtgagggt 5940
cttgtgtttg ctgagtcaaa attccttgaa atccaagtcc ttagagactc ctgctcccaa 6000
atttacagtc atagacttct tcatggctgt ctcctttatc cacagaatga ttcctttgct 6060
tcattgcccc atccatctga tcctcctcat cagtgcagca cagggcccat gagcagtagc 6120
tgcagagtct cacataggtc tggcactgcc tctgacatgt ccgaccttag gcaaatgctt 6180
gactcttctg agctcggatc ccttgagctc aggaggtcaa ggctgcagtg agacatgatc 6240
ttgccactgc actccagcct ggacagcaga gtgaaacctt gcctcacgaa acagaataca 6300
aaaacaaaca aacaaaaaac tgctccgcaa tgcgcttcct tgatgctcta ccacataggt 6360
ctgggtactt tgtacacatt atctcattgc tgttcataat tgttagatta attttgtaat 6420
attgatatta ttcctagaaa gctgaggcct caagatgata acttttattt tctggacttg 6480
taatagcttt ctcttgtatt caccatgttg taactttctt agagtagtaa caatataaag 6540
ttattgtgag tttttgcaaa cacagcaaac acaacgaccc atatagacat tgatgtgaaa 6600
ttgtctattg tcaatttatg ggaaaacaag tatgtacttt ttctactaag ccattgaaac 6660
aggaataaca gaacaagatt gaaagaatac attttccgaa attacttgag tattatacaa 6720
agacaagcac gtggacctgg gaggagggtt attgtccatg actggtgtgt ggagacaaat 6780
gcaggtttat aatagatggg atggcatcta gcgcaatgac tttgccatca cttttagaga 6840
gctcttgggg gccccagtac acaagagggg acgcagggta tatgtagaca tctcattctt 6900
tttcttagtg tgagaataag aatagccatg acctgagttt atagacaatg agcccttttc 6960
tctctcccac tcagcagcta tgagatggct tgccctgcct ctctactagg ctgactcact 7020
ccaaggccca gcaatgggca gggctctgtc agggctttga tagcactatc tgcagagcca 7080
gggccgagaa ggggtggact ccagagactc tccctcccat tcccgagcag ggtttgctta 7140
tttatgcatt taaatgatat atttatttta aaagaaataa caggagactg cccagccctg 7200
gctgtgacat ggaaactatg tagaatattt tgggttccat ttttttttcc ttctttcagt 7260
tagaggaaaa ggggctcact gcacatacac tagacagaaa gtcaggagct ttgaatccaa 7320
gcctgatcat ttccatgtca tactgagaaa gtccccaccc ttctctgagc ctcagtttct 7380
ctttttataa gtaggagtct ggagtaaatg atttccaatg gctctcattt caatacaaaa 7440
tttccgttta ttaaatgcat gagcttccgt tactccaaga ctgagaagga aattgaacct 7500
gagactcatt gactggcaag atgtccccag aggctctcat tcagcaataa aattctcacc 7560
ttcacccagg cccactagtg tcagatttgc atgcgttcgc gtatcgacgt gcagtattta 7620
gcatgcccca cccatctgca aggcattctg gatagtgtca aaacagccgg aaatcaagtc 7680
cgtttatctc aaactttagc attttgggaa taaatgatat ttgctatgct ggttaaatta 7740
gattttagtt aaatttcctg ctgaagctct agtacgataa gtaacttgac ctaagtgtaa 7800
agttgagatt tccttcaggt ttatatagct tgtgcgccgc ctgggtacct caggatatgc 7860
ccttgactat ttgtccgaca tagtcaaggg catatccttt tttgtgcggc cgcatcgatg 7920
ccgtagtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc cactttttaa 7980
aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaaag aagacaagat ccctgcaggc 8040
attcaaggcc aggctggatg tggctctggg cagcctgggc tgctggttga tgaccctgca 8100
catagcaggg ggttggatct ggatgagcac tgtgctcctt tgcaacccag gccgttctat 8160
gattctgtca ttctaaatct ctctttcagc ctaaagcttt ttccccgtat ccccccaggt 8220
gtctgcaggc tcaaagagca gcgagaagcg ttcagaggaa agcgatcccg tgccaccttc 8280
cccgtgcccg ggctgtcccc gcacgctgcc ggctcgggga tgcgggggga gcgccggacc 8340
ggagcggagc cccgggcggc tcgctgctgc cccctagcgg gggagggacg taattacatc 8400
cctgggggct ttgggggggg gctgtccccg tgagctcccc agatctgctt tttgcctgta 8460
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cactgcttaa gcctcaataa agcttcagct gctcgagcta gcagatcttt ttccctctgc 8580
caaaaattat ggggacatca tgaagcccct tgagcatctg acttctggct aataaaggaa 8640
atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg gaaggacata 8700
tgggagggca aatcatttaa aacatcagaa tgagtatttg gtttagagtt tggcaacata 8760
tgcccatatg ctggctgcca tgaacaaagg ttggctataa agaggtcatc agtatatgaa 8820
acagccccct gctgtccatt ccttattcca tagaaaagcc ttgacttgag gttagatttt 8880
ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc tttaacatcc ctaaaatttt ccttacatgt 8940
tttactagcc agatttttcc tcctctcctg actactccca gtcatagctg tccctcttct 9000
cttatggaga tccctcgacc tgcagcccaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 9060
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 9120
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catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc 9300
tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc 9360
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gtcgactgca gaggcctgca tgcaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 9480
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ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 9660
ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 9720
gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 9780
tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 9840
aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 9900
aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 9960
ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 10020
tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 10080
agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 10140
gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 10200
tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 10260
acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 10320
tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 10380
caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 10440
aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 10500
aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 10560
ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 10620
agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 10680
atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 10740
cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 10800
aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 10860
cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 10920
aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 10980
ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 11040
gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 11100
ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 11160
tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 11220
tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 11280
ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 11340
tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 11400
agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 11460
acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 11520
ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 11580
gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg 11640
acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat 11700
gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 11760
gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 11820
tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 11880
ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg 11940
cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa 12000
gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt 12060
tgtaaaacga cggccagtga attc 12084
<210> 11
<211> 12081
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TL20c-rGbGM-r7SKM1/sh734
<400> 11
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 720
ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatact ggcctgttag 900
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500
tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2340
cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga acgcgtgggg atcctctaga 2400
gtcgagctcg cgaggatcat caccggtgct agccggagcc agaagcacca taagggacat 2460
gataagggag ccagcagacc tctgatctct tcctgaatgc taatcttaaa catcctgagg 2520
aagaatggga cttccatttg gggtgggcct atgatagggt aataagacag tagtgaatat 2580
caagctacaa aaagccccct ttcaaattct tctcagtcct aacttttcat actaagccca 2640
gtccttccaa agcagactgt gaaagagtga tagttccggg agactagcac cggctagccg 2700
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atataaaaat aaatgaggag catgcacaca ccacaaacac aaacaggcat gcagaaatac 3000
acatacacac ttccctcaat ataaaccctt tgtggctcat atatttaaaa agatgtaaaa 3060
aaaagagctg aagaaaatca tgtgtgatct ctcagcagaa tagatttatt atttgtattg 3120
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ataatccagc cttatcccaa ccataaaata aaagcagaat ggtagctgga ttgtagctgc 3420
tattagcaat atgaaacctc ttacatcagt tacaatttat atgcagaaat atttatatgc 3480
agaaatattg ctattgcctt aacccagaaa ttatcactgt tattctttag aatggtgcaa 3540
agaggcatga tacattgtat cattattgcc ctgaaagaaa gagattaggg aaagtattag 3600
aaataagata aacaaaaaag tatattaaaa gaagaaagca ttttttaaaa ttacaaatgc 3660
aaaattaccc tgatttggtc aatatgtgta ccctgttact tctccccttc ctatgacatg 3720
aacttaacca tagaaaagaa ggggaaagaa aacatcaagg gtcccataga ctcaccttga 3780
agttctcagg atccacatgc agcttgtcac agtgcagttc actcagctgg gcaaaggtgc 3840
ccttgagatc atccaggtgc tttatggcat ctcccaagga agtcagcacc ttcttgccat 3900
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caaagaacct ctgggtccat gggtagacaa ccaggagcct gtgagattga caagaacagt 4020
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gtccttcctt ccctcccttg tcctggtcac cagagcctac cttcccaggg tttctcctcc 4140
agcatcttcc acattcacct tgtcccacag gcttgtgata gtagccttgt cctcctctgt 4200
gaaatgaccc atggtgtctg tttgaggttg ctagtgaaca cagttgtgtc agaagcaaat 4260
gtaagcaata gatggctctg ccctgacttt tatgcccagc cctggctcct gccctccctg 4320
ctcctgggag tagattggcc aaccctaggg tgtggctcca cagggtgagg tctaagtgat 4380
gacagccgta cctgtccttg gctcttctgg cactggctta ggagttggac ttcaaaccct 4440
cagccctccc tctaagatat atctcttggc cccataccat cagtacaaat tgctactaaa 4500
aacatcctcc tttgcaagtg tatttacgac ggtatcgatg tatgtgagca tgtgtcctct 4560
aacagcacag gccttttgcc acctagctgt ccaggggtgc cttaaaatgg caaacaaggt 4620
ttgttttctt ttcctgtttt catgccttcc tcttccatat ccttgtttca tattaataca 4680
tgtgtataga tcctaaaaat ctatacacat gtattaataa agcctgattc tgccgcttct 4740
aggtatagag gccacctgca agataaatat ttgattcaca ataactaatc attctatggc 4800
aattgataac aacaaatata tatatatata tatatatacg tatatgtgta tatatatata 4860
tatattcagg aaataatata ttctagaata tgtcacattc tgtctcaggc atccattttc 4920
tttatgatgc cgtttgaggt ggagttttag tcaggtggtc agcttctcct tttttttgcc 4980
atctgccctg taagcatcct gctggggacc cagataggag tcatcactct aggctgagaa 5040
catctgggca cacaccctaa gcctcagcat gactcatcat gactcagcat tgctgtgctt 5100
gagccagaag gtttgcttag aaggttacac agaaccagaa ggcgggggtg gggcactgac 5160
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gctctgagac tggcagtata tctctaacag tggttgatgc tatcttctgg aacttgcctg 5460
ctacattgag accactgacc catacatagg aagcccatag ctctgtcctg aactgttagg 5520
ccactggtcc agagagtgtg catctccttt gatcctcata ataaccctat gagatagaca 5580
caattattac tcttacttta tagatgatga tcctgaaaac ataggagtca aggcacttgc 5640
ccctagctgg gggtataggg gagcagtccc atgtagtagt agaatgaaaa atgctgctat 5700
gctgtgcctc ccccaccttt cccatgtctg ccctctactc atggtctatc tctcctggct 5760
cctgggagtc atggactcca cccagcacca ccaacctgac ctaaccacct atctgagcct 5820
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ctccctggaa cctctgatag acacatctgg cacaccagct cgcaaagtca ccgtgagggt 5940
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atttacagtc atagacttct tcatggctgt ctcctttatc cacagaatga ttcctttgct 6060
tcattgcccc atccatctga tcctcctcat cagtgcagca cagggcccat gagcagtagc 6120
tgcagagtct cacataggtc tggcactgcc tctgacatgt ccgaccttag gcaaatgctt 6180
gactcttctg agctcggatc ccttgagctc aggaggtcaa ggctgcagtg agacatgatc 6240
ttgccactgc actccagcct ggacagcaga gtgaaacctt gcctcacgaa acagaataca 6300
aaaacaaaca aacaaaaaac tgctccgcaa tgcgcttcct tgatgctcta ccacataggt 6360
ctgggtactt tgtacacatt atctcattgc tgttcataat tgttagatta attttgtaat 6420
attgatatta ttcctagaaa gctgaggcct caagatgata acttttattt tctggacttg 6480
taatagcttt ctcttgtatt caccatgttg taactttctt agagtagtaa caatataaag 6540
ttattgtgag tttttgcaaa cacagcaaac acaacgaccc atatagacat tgatgtgaaa 6600
ttgtctattg tcaatttatg ggaaaacaag tatgtacttt ttctactaag ccattgaaac 6660
aggaataaca gaacaagatt gaaagaatac attttccgaa attacttgag tattatacaa 6720
agacaagcac gtggacctgg gaggagggtt attgtccatg actggtgtgt ggagacaaat 6780
gcaggtttat aatagatggg atggcatcta gcgcaatgac tttgccatca cttttagaga 6840
gctcttgggg gccccagtac acaagagggg acgcagggta tatgtagaca tctcattctt 6900
tttcttagtg tgagaataag aatagccatg acctgagttt atagacaatg agcccttttc 6960
tctctcccac tcagcagcta tgagatggct tgccctgcct ctctactagg ctgactcact 7020
ccaaggccca gcaatgggca gggctctgtc agggctttga tagcactatc tgcagagcca 7080
gggccgagaa ggggtggact ccagagactc tccctcccat tcccgagcag ggtttgctta 7140
tttatgcatt taaatgatat atttatttta aaagaaataa caggagactg cccagccctg 7200
gctgtgacat ggaaactatg tagaatattt tgggttccat ttttttttcc ttctttcagt 7260
tagaggaaaa ggggctcact gcacatacac tagacagaaa gtcaggagct ttgaatccaa 7320
gcctgatcat ttccatgtca tactgagaaa gtccccaccc ttctctgagc ctcagtttct 7380
ctttttataa gtaggagtct ggagtaaatg atttccaatg gctctcattt caatacaaaa 7440
tttccgttta ttaaatgcat gagcttccgt tactccaaga ctgagaagga aattgaacct 7500
gagactcatt gactggcaag atgtccccag aggctctcat tcagcaataa aattctcacc 7560
ttcacccagg cccactagtg tcagatttgc atgcgttcgc gtaaaaaagg atatgccctt 7620
gactatgtcg gacaaatagt caagggcata tcctgaggta cccaggcggc gcacaagcta 7680
tataaacctg aaggaaatct caactttaca cttaggtcaa gttacttatc gtactagagc 7740
ttcagcagga aatttaacta aaatctaatt taaccagcat agcaaatatc atttattccc 7800
aaaatgctaa agtttgagat aaacggactt gatttccggc tgttttgaca ctatccagaa 7860
tgccggtact atgggtgggg cagtagcccg actgcacgtc gagcggccgc atcgatgccg 7920
tagtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag 7980
aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaaagaag acaagatccc tgcaggcatt 8040
caaggccagg ctggatgtgg ctctgggcag cctgggctgc tggttgatga ccctgcacat 8100
agcagggggt tggatctgga tgagcactgt gctcctttgc aacccaggcc gttctatgat 8160
tctgtcattc taaatctctc tttcagccta aagctttttc cccgtatccc cccaggtgtc 8220
tgcaggctca aagagcagcg agaagcgttc agaggaaagc gatcccgtgc caccttcccc 8280
gtgcccgggc tgtccccgca cgctgccggc tcggggatgc ggggggagcg ccggaccgga 8340
gcggagcccc gggcggctcg ctgctgcccc ctagcggggg agggacgtaa ttacatccct 8400
gggggctttg ggggggggct gtccccgtga gctccccaga tctgcttttt gcctgtactg 8460
ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 8520
tgcttaagcc tcaataaagc ttcagctgct cgagctagca gatctttttc cctctgccaa 8580
aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact tctggctaat aaaggaaatt 8640
tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc tcactcggaa ggacatatgg 8700
gagggcaaat catttaaaac atcagaatga gtatttggtt tagagtttgg caacatatgc 8760
ccatatgctg gctgccatga acaaaggttg gctataaaga ggtcatcagt atatgaaaca 8820
gccccctgct gtccattcct tattccatag aaaagccttg acttgaggtt agattttttt 8880
tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta aaattttcct tacatgtttt 8940
actagccaga tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt 9000
atggagatcc ctcgacctgc agcccaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 9060
tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 9120
aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 9180
ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc ggatccgcat ctcaattagt cagcaaccat 9240
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gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga 9360
gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagctgtc 9420
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tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 9600
cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 9660
ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 9720
cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 9780
ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 9840
aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 9900
cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 9960
cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 10020
gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 10080
tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 10140
cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 10200
ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 10260
gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc 10320
gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 10380
accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 10440
ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 10500
tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 10560
aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 10620
taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 10680
gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 10740
agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 10800
cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 10860
tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 10920
gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 10980
agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 11040
gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 11100
atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 11160
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tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 11280
atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 11340
agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 11400
gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 11460
cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 11520
tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 11580
ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca 11640
ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac 11700
ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat 11760
gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg 11820
cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 11880
ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc 11940
aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg 12000
ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt 12060
aaaacgacgg ccagtgaatt c 12081
<210> 12
<211> 12084
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TL20c-rGbGM-r7SK/sh734
<400> 12
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 720
ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatact ggcctgttag 900
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500
tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2340
cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga acgcgtgggg atcctctaga 2400
gtcgagctcg cgaggatcat caccggtgct agccggagcc agaagcacca taagggacat 2460
gataagggag ccagcagacc tctgatctct tcctgaatgc taatcttaaa catcctgagg 2520
aagaatggga cttccatttg gggtgggcct atgatagggt aataagacag tagtgaatat 2580
caagctacaa aaagccccct ttcaaattct tctcagtcct aacttttcat actaagccca 2640
gtccttccaa agcagactgt gaaagagtga tagttccggg agactagcac cggctagccg 2700
agcttggaac actttccctt cattaagaac catccttgct actcagctgc aatcaatcca 2760
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cctgtcctat agaggtcttt cttcccaccg gatttctcct acaccattta ctcccacttg 2880
cagaactccc gtgtacaagt gtctttactg cttttatttg ctcaacaaaa tgcacatctc 2940
atataaaaat aaatgaggag catgcacaca ccacaaacac aaacaggcat gcagaaatac 3000
acatacacac ttccctcaat ataaaccctt tgtggctcat atatttaaaa agatgtaaaa 3060
aaaagagctg aagaaaatca tgtgtgatct ctcagcagaa tagatttatt atttgtattg 3120
cttgcagaat aaagcctatc cttgaaagct ctgaatcatg ggcaagaggc tcagtggtat 3180
ctggaggaca gggcactggc cactgcagtc accatcttct gccaggaagc ctgcacctca 3240
ggggtgaatt ctttgccaaa gtgaatggcc agcacggtga ccagcacgtt gcccaggagc 3300
tgtgggagga agataagagg tatgaacatg attagcaaaa gggcctagct tggactcaga 3360
ataatccagc cttatcccaa ccataaaata aaagcagaat ggtagctgga ttgtagctgc 3420
tattagcaat atgaaacctc ttacatcagt tacaatttat atgcagaaat atttatatgc 3480
agaaatattg ctattgcctt aacccagaaa ttatcactgt tattctttag aatggtgcaa 3540
agaggcatga tacattgtat cattattgcc ctgaaagaaa gagattaggg aaagtattag 3600
aaataagata aacaaaaaag tatattaaaa gaagaaagca ttttttaaaa ttacaaatgc 3660
aaaattaccc tgatttggtc aatatgtgta ccctgttact tctccccttc ctatgacatg 3720
aacttaacca tagaaaagaa ggggaaagaa aacatcaagg gtcccataga ctcaccttga 3780
agttctcagg atccacatgc agcttgtcac agtgcagttc actcagctgg gcaaaggtgc 3840
ccttgagatc atccaggtgc tttatggcat ctcccaagga agtcagcacc ttcttgccat 3900
gtgccttgac tttggggttg cccatgatgg cagaggcaga ggacaggttg ccaaagctgt 3960
caaagaacct ctgggtccat gggtagacaa ccaggagcct gtgagattga caagaacagt 4020
ttgacagtca gaaggtgcca caaatcctga gaagcaacct ggacttttgc caggcacagg 4080
gtccttcctt ccctcccttg tcctggtcac cagagcctac cttcccaggg tttctcctcc 4140
agcatcttcc acattcacct tgtcccacag gcttgtgata gtagccttgt cctcctctgt 4200
gaaatgaccc atggtgtctg tttgaggttg ctagtgaaca cagttgtgtc agaagcaaat 4260
gtaagcaata gatggctctg ccctgacttt tatgcccagc cctggctcct gccctccctg 4320
ctcctgggag tagattggcc aaccctaggg tgtggctcca cagggtgagg tctaagtgat 4380
gacagccgta cctgtccttg gctcttctgg cactggctta ggagttggac ttcaaaccct 4440
cagccctccc tctaagatat atctcttggc cccataccat cagtacaaat tgctactaaa 4500
aacatcctcc tttgcaagtg tatttacgac ggtatcgatg tatgtgagca tgtgtcctct 4560
aacagcacag gccttttgcc acctagctgt ccaggggtgc cttaaaatgg caaacaaggt 4620
ttgttttctt ttcctgtttt catgccttcc tcttccatat ccttgtttca tattaataca 4680
tgtgtataga tcctaaaaat ctatacacat gtattaataa agcctgattc tgccgcttct 4740
aggtatagag gccacctgca agataaatat ttgattcaca ataactaatc attctatggc 4800
aattgataac aacaaatata tatatatata tatatatacg tatatgtgta tatatatata 4860
tatattcagg aaataatata ttctagaata tgtcacattc tgtctcaggc atccattttc 4920
tttatgatgc cgtttgaggt ggagttttag tcaggtggtc agcttctcct tttttttgcc 4980
atctgccctg taagcatcct gctggggacc cagataggag tcatcactct aggctgagaa 5040
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cacacagaaa tgtaacagga actaagggaa ttccggtgcc ctgcttagga gcttaatctt 5280
taatgaaagc taagctttca ttaaaaaaag tctaaccagc tgcattcgac tttgactgca 5340
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gctctgagac tggcagtata tctctaacag tggttgatgc tatcttctgg aacttgcctg 5460
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caattattac tcttacttta tagatgatga tcctgaaaac ataggagtca aggcacttgc 5640
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ctccctggaa cctctgatag acacatctgg cacaccagct cgcaaagtca ccgtgagggt 5940
cttgtgtttg ctgagtcaaa attccttgaa atccaagtcc ttagagactc ctgctcccaa 6000
atttacagtc atagacttct tcatggctgt ctcctttatc cacagaatga ttcctttgct 6060
tcattgcccc atccatctga tcctcctcat cagtgcagca cagggcccat gagcagtagc 6120
tgcagagtct cacataggtc tggcactgcc tctgacatgt ccgaccttag gcaaatgctt 6180
gactcttctg agctcggatc ccttgagctc aggaggtcaa ggctgcagtg agacatgatc 6240
ttgccactgc actccagcct ggacagcaga gtgaaacctt gcctcacgaa acagaataca 6300
aaaacaaaca aacaaaaaac tgctccgcaa tgcgcttcct tgatgctcta ccacataggt 6360
ctgggtactt tgtacacatt atctcattgc tgttcataat tgttagatta attttgtaat 6420
attgatatta ttcctagaaa gctgaggcct caagatgata acttttattt tctggacttg 6480
taatagcttt ctcttgtatt caccatgttg taactttctt agagtagtaa caatataaag 6540
ttattgtgag tttttgcaaa cacagcaaac acaacgaccc atatagacat tgatgtgaaa 6600
ttgtctattg tcaatttatg ggaaaacaag tatgtacttt ttctactaag ccattgaaac 6660
aggaataaca gaacaagatt gaaagaatac attttccgaa attacttgag tattatacaa 6720
agacaagcac gtggacctgg gaggagggtt attgtccatg actggtgtgt ggagacaaat 6780
gcaggtttat aatagatggg atggcatcta gcgcaatgac tttgccatca cttttagaga 6840
gctcttgggg gccccagtac acaagagggg acgcagggta tatgtagaca tctcattctt 6900
tttcttagtg tgagaataag aatagccatg acctgagttt atagacaatg agcccttttc 6960
tctctcccac tcagcagcta tgagatggct tgccctgcct ctctactagg ctgactcact 7020
ccaaggccca gcaatgggca gggctctgtc agggctttga tagcactatc tgcagagcca 7080
gggccgagaa ggggtggact ccagagactc tccctcccat tcccgagcag ggtttgctta 7140
tttatgcatt taaatgatat atttatttta aaagaaataa caggagactg cccagccctg 7200
gctgtgacat ggaaactatg tagaatattt tgggttccat ttttttttcc ttctttcagt 7260
tagaggaaaa ggggctcact gcacatacac tagacagaaa gtcaggagct ttgaatccaa 7320
gcctgatcat ttccatgtca tactgagaaa gtccccaccc ttctctgagc ctcagtttct 7380
ctttttataa gtaggagtct ggagtaaatg atttccaatg gctctcattt caatacaaaa 7440
tttccgttta ttaaatgcat gagcttccgt tactccaaga ctgagaagga aattgaacct 7500
gagactcatt gactggcaag atgtccccag aggctctcat tcagcaataa aattctcacc 7560
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ttgactatgt cggacaaata gtcaagggca tatcctgagg tacccaggcg gcgcacaagc 7680
tatataaacc tgaaggaaat ctcaacttta cacttaggtc aagttactta tcgtactaga 7740
gcttcagcag gaaatttaac taaaatctaa tttaaccagc atagcaaata tcatttattc 7800
ccaaaatgct aaagtttgag ataaacggac ttgatttccg gctgttttga cactatccag 7860
aatgccttgc agatgggtgg ggcatgctaa atactgcacg tcgatgcggc cgcatcgatg 7920
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cccgtgcccg ggctgtcccc gcacgctgcc ggctcgggga tgcgggggga gcgccggacc 8340
ggagcggagc cccgggcggc tcgctgctgc cccctagcgg gggagggacg taattacatc 8400
cctgggggct ttgggggggg gctgtccccg tgagctcccc agatctgctt tttgcctgta 8460
ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc 8520
cactgcttaa gcctcaataa agcttcagct gctcgagcta gcagatcttt ttccctctgc 8580
caaaaattat ggggacatca tgaagcccct tgagcatctg acttctggct aataaaggaa 8640
atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg gaaggacata 8700
tgggagggca aatcatttaa aacatcagaa tgagtatttg gtttagagtt tggcaacata 8760
tgcccatatg ctggctgcca tgaacaaagg ttggctataa agaggtcatc agtatatgaa 8820
acagccccct gctgtccatt ccttattcca tagaaaagcc ttgacttgag gttagatttt 8880
ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc tttaacatcc ctaaaatttt ccttacatgt 8940
tttactagcc agatttttcc tcctctcctg actactccca gtcatagctg tccctcttct 9000
cttatggaga tccctcgacc tgcagcccaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 9060
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 9120
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ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agcggatccg catctcaatt agtcagcaac 9240
catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc 9300
tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc 9360
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gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 9600
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gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 9780
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aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 9960
ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 10020
tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 10080
agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 10140
gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 10200
tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 10260
acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 10320
tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 10380
caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 10440
aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 10500
aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 10560
ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 10620
agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 10680
atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 10740
cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 10800
aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 10860
cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 10920
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ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 11040
gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 11100
ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 11160
tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 11220
tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 11280
ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 11340
tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 11400
agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 11460
acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 11520
ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 11580
gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg 11640
acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat 11700
gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 11760
gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 11820
tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 11880
ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg 11940
cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa 12000
gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt 12060
tgtaaaacga cggccagtga attc 12084
<210> 13
<211> 11779
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TL20c-rGbGM
<400> 13
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
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acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
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ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
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tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
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tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
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ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
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cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga acgcgtgggg atcctctaga 2400
gtcgagctcg cgaggatcat caccggtgct agccggagcc agaagcacca taagggacat 2460
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aagaatggga cttccatttg gggtgggcct atgatagggt aataagacag tagtgaatat 2580
caagctacaa aaagccccct ttcaaattct tctcagtcct aacttttcat actaagccca 2640
gtccttccaa agcagactgt gaaagagtga tagttccggg agactagcac cggctagccg 2700
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cctgtcctat agaggtcttt cttcccaccg gatttctcct acaccattta ctcccacttg 2880
cagaactccc gtgtacaagt gtctttactg cttttatttg ctcaacaaaa tgcacatctc 2940
atataaaaat aaatgaggag catgcacaca ccacaaacac aaacaggcat gcagaaatac 3000
acatacacac ttccctcaat ataaaccctt tgtggctcat atatttaaaa agatgtaaaa 3060
aaaagagctg aagaaaatca tgtgtgatct ctcagcagaa tagatttatt atttgtattg 3120
cttgcagaat aaagcctatc cttgaaagct ctgaatcatg ggcaagaggc tcagtggtat 3180
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ggggtgaatt ctttgccaaa gtgaatggcc agcacggtga ccagcacgtt gcccaggagc 3300
tgtgggagga agataagagg tatgaacatg attagcaaaa gggcctagct tggactcaga 3360
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tattagcaat atgaaacctc ttacatcagt tacaatttat atgcagaaat atttatatgc 3480
agaaatattg ctattgcctt aacccagaaa ttatcactgt tattctttag aatggtgcaa 3540
agaggcatga tacattgtat cattattgcc ctgaaagaaa gagattaggg aaagtattag 3600
aaataagata aacaaaaaag tatattaaaa gaagaaagca ttttttaaaa ttacaaatgc 3660
aaaattaccc tgatttggtc aatatgtgta ccctgttact tctccccttc ctatgacatg 3720
aacttaacca tagaaaagaa ggggaaagaa aacatcaagg gtcccataga ctcaccttga 3780
agttctcagg atccacatgc agcttgtcac agtgcagttc actcagctgg gcaaaggtgc 3840
ccttgagatc atccaggtgc tttatggcat ctcccaagga agtcagcacc ttcttgccat 3900
gtgccttgac tttggggttg cccatgatgg cagaggcaga ggacaggttg ccaaagctgt 3960
caaagaacct ctgggtccat gggtagacaa ccaggagcct gtgagattga caagaacagt 4020
ttgacagtca gaaggtgcca caaatcctga gaagcaacct ggacttttgc caggcacagg 4080
gtccttcctt ccctcccttg tcctggtcac cagagcctac cttcccaggg tttctcctcc 4140
agcatcttcc acattcacct tgtcccacag gcttgtgata gtagccttgt cctcctctgt 4200
gaaatgaccc atggtgtctg tttgaggttg ctagtgaaca cagttgtgtc agaagcaaat 4260
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ctcctgggag tagattggcc aaccctaggg tgtggctcca cagggtgagg tctaagtgat 4380
gacagccgta cctgtccttg gctcttctgg cactggctta ggagttggac ttcaaaccct 4440
cagccctccc tctaagatat atctcttggc cccataccat cagtacaaat tgctactaaa 4500
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ttgttttctt ttcctgtttt catgccttcc tcttccatat ccttgtttca tattaataca 4680
tgtgtataga tcctaaaaat ctatacacat gtattaataa agcctgattc tgccgcttct 4740
aggtatagag gccacctgca agataaatat ttgattcaca ataactaatc attctatggc 4800
aattgataac aacaaatata tatatatata tatatatacg tatatgtgta tatatatata 4860
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tttatgatgc cgtttgaggt ggagttttag tcaggtggtc agcttctcct tttttttgcc 4980
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cacacagaaa tgtaacagga actaagggaa ttccggtgcc ctgcttagga gcttaatctt 5280
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gcagctggtt agaaggttct actggaggag ggtcccagcc cattgctaaa ttaacatcag 5400
gctctgagac tggcagtata tctctaacag tggttgatgc tatcttctgg aacttgcctg 5460
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ccactggtcc agagagtgtg catctccttt gatcctcata ataaccctat gagatagaca 5580
caattattac tcttacttta tagatgatga tcctgaaaac ataggagtca aggcacttgc 5640
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atttacagtc atagacttct tcatggctgt ctcctttatc cacagaatga ttcctttgct 6060
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ctgggtactt tgtacacatt atctcattgc tgttcataat tgttagatta attttgtaat 6420
attgatatta ttcctagaaa gctgaggcct caagatgata acttttattt tctggacttg 6480
taatagcttt ctcttgtatt caccatgttg taactttctt agagtagtaa caatataaag 6540
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ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg acatatggga 8400
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gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 9480
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 9540
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 9600
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 9660
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aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500
tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2340
cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga agcggccgca tcgacgtgca 2400
gtatttagca tgccccaccc atctgcaagg cattctggat agtgtcaaaa cagccggaaa 2460
tcaagtccgt ttatctcaaa ctttagcatt ttgggaataa atgatatttg ctatgctggt 2520
taaattagat tttagttaaa tttcctgctg aagctctagt acgataagta acttgaccta 2580
agtgtaaagt tgagatttcc ttcaggttta tatagcttgt gcgccgcctg ggtacctcag 2640
gatatgccct tgactatttg tccgacatag tcaagggcat atcctttttt gtacgcgtgg 2700
ggatcctcta gagtcgagct cgcgaggatc atcaccggtg ctagccggag ccagaagcac 2760
cataagggac atgataaggg agccagcaga cctctgatct cttcctgaat gctaatctta 2820
aacatcctga ggaagaatgg gacttccatt tggggtgggc ctatgatagg gtaataagac 2880
agtagtgaat atcaagctac aaaaagcccc ctttcaaatt cttctcagtc ctaacttttc 2940
atactaagcc cagtccttcc aaagcagact gtgaaagagt gatagttccg ggagactagc 3000
accggctagc cgagcttgga acactttccc ttcattaaga accatccttg ctactcagct 3060
gcaatcaatc cagcccccag gtcttcactg aaccttttcc catctcttcc aaaacatctg 3120
tttctgagaa gtcctgtcct atagaggtct ttcttcccac cggatttctc ctacaccatt 3180
tactcccact tgcagaactc ccgtgtacaa gtgtctttac tgcttttatt tgctcaacaa 3240
aatgcacatc tcatataaaa ataaatgagg agcatgcaca caccacaaac acaaacaggc 3300
atgcagaaat acacatacac acttccctca atataaaccc tttgtggctc atatatttaa 3360
aaagatgtaa aaaaaagagc tgaagaaaat catgtgtgat ctctcagcag aatagattta 3420
ttatttgtat tgcttgcaga ataaagccta tccttgaaag ctctgaatca tgggcaagag 3480
gctcagtggt atctggagga cagggcactg gccactgcag tcaccatctt ctgccaggaa 3540
gcctgcacct caggggtgaa ttctttgcca aagtgaatgg ccagcacggt gaccagcacg 3600
ttgcccagga gctgtgggag gaagataaga ggtatgaaca tgattagcaa aagggcctag 3660
cttggactca gaataatcca gccttatccc aaccataaaa taaaagcaga atggtagctg 3720
gattgtagct gctattagca atatgaaacc tcttacatca gttacaattt atatgcagaa 3780
atatttatat gcagaaatat tgctattgcc ttaacccaga aattatcact gttattcttt 3840
agaatggtgc aaagaggcat gatacattgt atcattattg ccctgaaaga aagagattag 3900
ggaaagtatt agaaataaga taaacaaaaa agtatattaa aagaagaaag cattttttaa 3960
aattacaaat gcaaaattac cctgatttgg tcaatatgtg taccctgtta cttctcccct 4020
tcctatgaca tgaacttaac catagaaaag aaggggaaag aaaacatcaa gggtcccata 4080
gactcacctt gaagttctca ggatccacat gcagcttgtc acagtgcagt tcactcagct 4140
gggcaaaggt gcccttgaga tcatccaggt gctttatggc atctcccaag gaagtcagca 4200
ccttcttgcc atgtgccttg actttggggt tgcccatgat ggcagaggca gaggacaggt 4260
tgccaaagct gtcaaagaac ctctgggtcc atgggtagac aaccaggagc ctgtgagatt 4320
gacaagaaca gtttgacagt cagaaggtgc cacaaatcct gagaagcaac ctggactttt 4380
gccaggcaca gggtccttcc ttccctccct tgtcctggtc accagagcct accttcccag 4440
ggtttctcct ccagcatctt ccacattcac cttgtcccac aggcttgtga tagtagcctt 4500
gtcctcctct gtgaaatgac ccatggtgtc tgtttgaggt tgctagtgaa cacagttgtg 4560
tcagaagcaa atgtaagcaa tagatggctc tgccctgact tttatgccca gccctggctc 4620
ctgccctccc tgctcctggg agtagattgg ccaaccctag ggtgtggctc cacagggtga 4680
ggtctaagtg atgacagccg tacctgtcct tggctcttct ggcactggct taggagttgg 4740
acttcaaacc ctcagccctc cctctaagat atatctcttg gccccatacc atcagtacaa 4800
attgctacta aaaacatcct cctttgcaag tgtatttacg acggtatcga tgtatgtgag 4860
catgtgtcct ctaacagcac aggccttttg ccacctagct gtccaggggt gccttaaaat 4920
ggcaaacaag gtttgttttc ttttcctgtt ttcatgcctt cctcttccat atccttgttt 4980
catattaata catgtgtata gatcctaaaa atctatacac atgtattaat aaagcctgat 5040
tctgccgctt ctaggtatag aggccacctg caagataaat atttgattca caataactaa 5100
tcattctatg gcaattgata acaacaaata tatatatata tatatatata cgtatatgtg 5160
tatatatata tatatattca ggaaataata tattctagaa tatgtcacat tctgtctcag 5220
gcatccattt tctttatgat gccgtttgag gtggagtttt agtcaggtgg tcagcttctc 5280
cttttttttg ccatctgccc tgtaagcatc ctgctgggga cccagatagg agtcatcact 5340
ctaggctgag aacatctggg cacacaccct aagcctcagc atgactcatc atgactcagc 5400
attgctgtgc ttgagccaga aggtttgctt agaaggttac acagaaccag aaggcggggg 5460
tggggcactg accccgacag gggcctggcc agaactgctc atgcttggac tatgggaggt 5520
cactaatgga gacacacaga aatgtaacag gaactaaggg aattccggtg ccctgcttag 5580
gagcttaatc tttaatgaaa gctaagcttt cattaaaaaa agtctaacca gctgcattcg 5640
actttgactg cagcagctgg ttagaaggtt ctactggagg agggtcccag cccattgcta 5700
aattaacatc aggctctgag actggcagta tatctctaac agtggttgat gctatcttct 5760
ggaacttgcc tgctacattg agaccactga cccatacata ggaagcccat agctctgtcc 5820
tgaactgtta ggccactggt ccagagagtg tgcatctcct ttgatcctca taataaccct 5880
atgagataga cacaattatt actcttactt tatagatgat gatcctgaaa acataggagt 5940
caaggcactt gcccctagct gggggtatag gggagcagtc ccatgtagta gtagaatgaa 6000
aaatgctgct atgctgtgcc tcccccacct ttcccatgtc tgccctctac tcatggtcta 6060
tctctcctgg ctcctgggag tcatggactc cacccagcac caccaacctg acctaaccac 6120
ctatctgagc ctgccagcct ataacccatc tgggccctga tagctggtgg ccagccctga 6180
ccccacccca ccctccctgg aacctctgat agacacatct ggcacaccag ctcgcaaagt 6240
caccgtgagg gtcttgtgtt tgctgagtca aaattccttg aaatccaagt ccttagagac 6300
tcctgctccc aaatttacag tcatagactt cttcatggct gtctccttta tccacagaat 6360
gattcctttg cttcattgcc ccatccatct gatcctcctc atcagtgcag cacagggccc 6420
atgagcagta gctgcagagt ctcacatagg tctggcactg cctctgacat gtccgacctt 6480
aggcaaatgc ttgactcttc tgagctcgga tcccttgagc tcaggaggtc aaggctgcag 6540
tgagacatga tcttgccact gcactccagc ctggacagca gagtgaaacc ttgcctcacg 6600
aaacagaata caaaaacaaa caaacaaaaa actgctccgc aatgcgcttc cttgatgctc 6660
taccacatag gtctgggtac tttgtacaca ttatctcatt gctgttcata attgttagat 6720
taattttgta atattgatat tattcctaga aagctgaggc ctcaagatga taacttttat 6780
tttctggact tgtaatagct ttctcttgta ttcaccatgt tgtaactttc ttagagtagt 6840
aacaatataa agttattgtg agtttttgca aacacagcaa acacaacgac ccatatagac 6900
attgatgtga aattgtctat tgtcaattta tgggaaaaca agtatgtact ttttctacta 6960
agccattgaa acaggaataa cagaacaaga ttgaaagaat acattttccg aaattacttg 7020
agtattatac aaagacaagc acgtggacct gggaggaggg ttattgtcca tgactggtgt 7080
gtggagacaa atgcaggttt ataatagatg ggatggcatc tagcgcaatg actttgccat 7140
cacttttaga gagctcttgg gggccccagt acacaagagg ggacgcaggg tatatgtaga 7200
catctcattc tttttcttag tgtgagaata agaatagcca tgacctgagt ttatagacaa 7260
tgagcccttt tctctctccc actcagcagc tatgagatgg cttgccctgc ctctctacta 7320
ggctgactca ctccaaggcc cagcaatggg cagggctctg tcagggcttt gatagcacta 7380
tctgcagagc cagggccgag aaggggtgga ctccagagac tctccctccc attcccgagc 7440
agggtttgct tatttatgca tttaaatgat atatttattt taaaagaaat aacaggagac 7500
tgcccagccc tggctgtgac atggaaacta tgtagaatat tttgggttcc attttttttt 7560
ccttctttca gttagaggaa aaggggctca ctgcacatac actagacaga aagtcaggag 7620
ctttgaatcc aagcctgatc atttccatgt catactgaga aagtccccac ccttctctga 7680
gcctcagttt ctctttttat aagtaggagt ctggagtaaa tgatttccaa tggctctcat 7740
ttcaatacaa aatttccgtt tattaaatgc atgagcttcc gttactccaa gactgagaag 7800
gaaattgaac ctgagactca ttgactggca agatgtcccc agaggctctc attcagcaat 7860
aaaattctca ccttcaccca ggcccactag tgtcagattt gcatgcgtta acgcggccgc 7920
atcgatgccg tagtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac 7980
tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaaagaag acaagataga 8040
tctgcttttt gcctgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc 8100
tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttcagctgct cgagctagca 8160
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 8220
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 8280
tcactcggaa ggacatatgg gagggcaaat catttaaaac atcagaatga gtatttggtt 8340
tagagtttgg caacatatgc ccatatgctg gctgccatga acaaaggttg gctataaaga 8400
ggtcatcagt atatgaaaca gccccctgct gtccattcct tattccatag aaaagccttg 8460
acttgaggtt agattttttt tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta 8520
aaattttcct tacatgtttt actagccaga tttttcctcc tctcctgact actcccagtc 8580
atagctgtcc ctcttctctt atggagatcc ctcgacctgc agcccaagct tggcgtaatc 8640
atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 8700
agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 8760
tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc ggatccgcat 8820
ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg 8880
cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc 8940
gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta 9000
ggcttttgca aaaagctgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg taatcatggt 9060
catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg 9120
gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt 9180
tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 9240
gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 9300
actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 9360
tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 9420
aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 9480
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 9540
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 9600
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 9660
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 9720
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 9780
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 9840
ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 9900
gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 9960
gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 10020
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 10080
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 10140
tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 10200
agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 10260
gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 10320
agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 10380
cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 10440
ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 10500
cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt 10560
cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 10620
ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 10680
tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 10740
catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 10800
gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata 10860
gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 10920
tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 10980
catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 11040
aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 11100
attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 11160
aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 11220
aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 11280
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 11340
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 11400
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 11460
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 11520
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 11580
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 11640
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt c 11681
<210> 16
<211> 11678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TL20d-r7SKM1/sh734-rGbGM
<400> 16
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 720
ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatact ggcctgttag 900
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500
tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
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tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
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cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga agcggccgca aaaaaggata 2400
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ctagagcttc agcaggaaat ttaactaaaa tctaatttaa ccagcatagc aaatatcatt 2580
tattcccaaa atgctaaagt ttgagataaa cggacttgat ttccggctgt tttgacacta 2640
tccagaatgc cggtactatg ggtggggcag tagcccgact gcacgtcgaa cgcgtgggga 2700
tcctctagag tcgagctcgc gaggatcatc accggtgcta gccggagcca gaagcaccat 2760
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cagaaataca catacacact tccctcaata taaacccttt gtggctcata tatttaaaaa 3360
gatgtaaaaa aaagagctga agaaaatcat gtgtgatctc tcagcagaat agatttatta 3420
tttgtattgc ttgcagaata aagcctatcc ttgaaagctc tgaatcatgg gcaagaggct 3480
cagtggtatc tggaggacag ggcactggcc actgcagtca ccatcttctg ccaggaagcc 3540
tgcacctcag gggtgaattc tttgccaaag tgaatggcca gcacggtgac cagcacgttg 3600
cccaggagct gtgggaggaa gataagaggt atgaacatga ttagcaaaag ggcctagctt 3660
ggactcagaa taatccagcc ttatcccaac cataaaataa aagcagaatg gtagctggat 3720
tgtagctgct attagcaata tgaaacctct tacatcagtt acaatttata tgcagaaata 3780
tttatatgca gaaatattgc tattgcctta acccagaaat tatcactgtt attctttaga 3840
atggtgcaaa gaggcatgat acattgtatc attattgccc tgaaagaaag agattaggga 3900
aagtattaga aataagataa acaaaaaagt atattaaaag aagaaagcat tttttaaaat 3960
tacaaatgca aaattaccct gatttggtca atatgtgtac cctgttactt ctccccttcc 4020
tatgacatga acttaaccat agaaaagaag gggaaagaaa acatcaaggg tcccatagac 4080
tcaccttgaa gttctcagga tccacatgca gcttgtcaca gtgcagttca ctcagctggg 4140
caaaggtgcc cttgagatca tccaggtgct ttatggcatc tcccaaggaa gtcagcacct 4200
tcttgccatg tgccttgact ttggggttgc ccatgatggc agaggcagag gacaggttgc 4260
caaagctgtc aaagaacctc tgggtccatg ggtagacaac caggagcctg tgagattgac 4320
aagaacagtt tgacagtcag aaggtgccac aaatcctgag aagcaacctg gacttttgcc 4380
aggcacaggg tccttccttc cctcccttgt cctggtcacc agagcctacc ttcccagggt 4440
ttctcctcca gcatcttcca cattcacctt gtcccacagg cttgtgatag tagccttgtc 4500
ctcctctgtg aaatgaccca tggtgtctgt ttgaggttgc tagtgaacac agttgtgtca 4560
gaagcaaatg taagcaatag atggctctgc cctgactttt atgcccagcc ctggctcctg 4620
ccctccctgc tcctgggagt agattggcca accctagggt gtggctccac agggtgaggt 4680
ctaagtgatg acagccgtac ctgtccttgg ctcttctggc actggcttag gagttggact 4740
tcaaaccctc agccctccct ctaagatata tctcttggcc ccataccatc agtacaaatt 4800
gctactaaaa acatcctcct ttgcaagtgt atttacgacg gtatcgatgt atgtgagcat 4860
gtgtcctcta acagcacagg ccttttgcca cctagctgtc caggggtgcc ttaaaatggc 4920
aaacaaggtt tgttttcttt tcctgttttc atgccttcct cttccatatc cttgtttcat 4980
attaatacat gtgtatagat cctaaaaatc tatacacatg tattaataaa gcctgattct 5040
gccgcttcta ggtatagagg ccacctgcaa gataaatatt tgattcacaa taactaatca 5100
ttctatggca attgataaca acaaatatat atatatatat atatatacgt atatgtgtat 5160
atatatatat atattcagga aataatatat tctagaatat gtcacattct gtctcaggca 5220
tccattttct ttatgatgcc gtttgaggtg gagttttagt caggtggtca gcttctcctt 5280
ttttttgcca tctgccctgt aagcatcctg ctggggaccc agataggagt catcactcta 5340
ggctgagaac atctgggcac acaccctaag cctcagcatg actcatcatg actcagcatt 5400
gctgtgcttg agccagaagg tttgcttaga aggttacaca gaaccagaag gcgggggtgg 5460
ggcactgacc ccgacagggg cctggccaga actgctcatg cttggactat gggaggtcac 5520
taatggagac acacagaaat gtaacaggaa ctaagggaat tccggtgccc tgcttaggag 5580
cttaatcttt aatgaaagct aagctttcat taaaaaaagt ctaaccagct gcattcgact 5640
ttgactgcag cagctggtta gaaggttcta ctggaggagg gtcccagccc attgctaaat 5700
taacatcagg ctctgagact ggcagtatat ctctaacagt ggttgatgct atcttctgga 5760
acttgcctgc tacattgaga ccactgaccc atacatagga agcccatagc tctgtcctga 5820
actgttaggc cactggtcca gagagtgtgc atctcctttg atcctcataa taaccctatg 5880
agatagacac aattattact cttactttat agatgatgat cctgaaaaca taggagtcaa 5940
ggcacttgcc cctagctggg ggtatagggg agcagtccca tgtagtagta gaatgaaaaa 6000
tgctgctatg ctgtgcctcc cccacctttc ccatgtctgc cctctactca tggtctatct 6060
ctcctggctc ctgggagtca tggactccac ccagcaccac caacctgacc taaccaccta 6120
tctgagcctg ccagcctata acccatctgg gccctgatag ctggtggcca gccctgaccc 6180
caccccaccc tccctggaac ctctgataga cacatctggc acaccagctc gcaaagtcac 6240
cgtgagggtc ttgtgtttgc tgagtcaaaa ttccttgaaa tccaagtcct tagagactcc 6300
tgctcccaaa tttacagtca tagacttctt catggctgtc tcctttatcc acagaatgat 6360
tcctttgctt cattgcccca tccatctgat cctcctcatc agtgcagcac agggcccatg 6420
agcagtagct gcagagtctc acataggtct ggcactgcct ctgacatgtc cgaccttagg 6480
caaatgcttg actcttctga gctcggatcc cttgagctca ggaggtcaag gctgcagtga 6540
gacatgatct tgccactgca ctccagcctg gacagcagag tgaaaccttg cctcacgaaa 6600
cagaatacaa aaacaaacaa acaaaaaact gctccgcaat gcgcttcctt gatgctctac 6660
cacataggtc tgggtacttt gtacacatta tctcattgct gttcataatt gttagattaa 6720
ttttgtaata ttgatattat tcctagaaag ctgaggcctc aagatgataa cttttatttt 6780
ctggacttgt aatagctttc tcttgtattc accatgttgt aactttctta gagtagtaac 6840
aatataaagt tattgtgagt ttttgcaaac acagcaaaca caacgaccca tatagacatt 6900
gatgtgaaat tgtctattgt caatttatgg gaaaacaagt atgtactttt tctactaagc 6960
cattgaaaca ggaataacag aacaagattg aaagaataca ttttccgaaa ttacttgagt 7020
attatacaaa gacaagcacg tggacctggg aggagggtta ttgtccatga ctggtgtgtg 7080
gagacaaatg caggtttata atagatggga tggcatctag cgcaatgact ttgccatcac 7140
ttttagagag ctcttggggg ccccagtaca caagagggga cgcagggtat atgtagacat 7200
ctcattcttt ttcttagtgt gagaataaga atagccatga cctgagttta tagacaatga 7260
gcccttttct ctctcccact cagcagctat gagatggctt gccctgcctc tctactaggc 7320
tgactcactc caaggcccag caatgggcag ggctctgtca gggctttgat agcactatct 7380
gcagagccag ggccgagaag gggtggactc cagagactct ccctcccatt cccgagcagg 7440
gtttgcttat ttatgcattt aaatgatata tttattttaa aagaaataac aggagactgc 7500
ccagccctgg ctgtgacatg gaaactatgt agaatatttt gggttccatt tttttttcct 7560
tctttcagtt agaggaaaag gggctcactg cacatacact agacagaaag tcaggagctt 7620
tgaatccaag cctgatcatt tccatgtcat actgagaaag tccccaccct tctctgagcc 7680
tcagtttctc tttttataag taggagtctg gagtaaatga tttccaatgg ctctcatttc 7740
aatacaaaat ttccgtttat taaatgcatg agcttccgtt actccaagac tgagaaggaa 7800
attgaacctg agactcattg actggcaaga tgtccccaga ggctctcatt cagcaataaa 7860
attctcacct tcacccaggc ccactagtgt cagatttgca tgcgttaacg cggccgcatc 7920
gatgccgtag tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt 7980
ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc aaagaagaca agatagatct 8040
gctttttgcc tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg 8100
ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttc agctgctcga gctagcagat 8160
ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac atcatgaagc cccttgagca tctgacttct 8220
ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca 8280
ctcggaagga catatgggag ggcaaatcat ttaaaacatc agaatgagta tttggtttag 8340
agtttggcaa catatgccca tatgctggct gccatgaaca aaggttggct ataaagaggt 8400
catcagtata tgaaacagcc ccctgctgtc cattccttat tccatagaaa agccttgact 8460
tgaggttaga ttttttttat attttgtttt gtgttatttt tttctttaac atccctaaaa 8520
ttttccttac atgttttact agccagattt ttcctcctct cctgactact cccagtcata 8580
gctgtccctc ttctcttatg gagatccctc gacctgcagc ccaagcttgg cgtaatcatg 8640
gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 8700
cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 8760
gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagcgga tccgcatctc 8820
aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc 8880
agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag 8940
gccgcctcgg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc 9000
ttttgcaaaa agctgtcgac tgcagaggcc tgcatgcaag cttggcgtaa tcatggtcat 9060
agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa 9120
gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc 9180
gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 9240
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 9300
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 9360
ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 9420
aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 9480
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 9540
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 9600
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 9660
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 9720
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 9780
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 9840
atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa 9900
cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 9960
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 10020
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 10080
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 10140
tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 10200
aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 10260
tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 10320
gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 10380
atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 10440
tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 10500
ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 10560
ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 10620
tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 10680
ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 10740
ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 10800
tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 10860
gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 10920
taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 10980
cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 11040
agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 11100
gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 11160
ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa 11220
ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg 11280
cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag 11340
cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg 11400
gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc 11460
atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt 11520
cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 11580
gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt 11640
cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattc 11678
<210> 17
<211> 11681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TL20d-r7SK/sh734-rGbGM
<400> 17
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 720
ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatact ggcctgttag 900
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500
tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2340
cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga agcggccgca caaaaaagga 2400
tatgcccttg actatgtcgg acaaatagtc aagggcatat cctgaggtac ccaggcggcg 2460
cacaagctat ataaacctga aggaaatctc aactttacac ttaggtcaag ttacttatcg 2520
tactagagct tcagcaggaa atttaactaa aatctaattt aaccagcata gcaaatatca 2580
tttattccca aaatgctaaa gtttgagata aacggacttg atttccggct gttttgacac 2640
tatccagaat gccttgcaga tgggtggggc atgctaaata ctgcacgtcg atacgcgtgg 2700
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aacatcctga ggaagaatgg gacttccatt tggggtgggc ctatgatagg gtaataagac 2880
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atactaagcc cagtccttcc aaagcagact gtgaaagagt gatagttccg ggagactagc 3000
accggctagc cgagcttgga acactttccc ttcattaaga accatccttg ctactcagct 3060
gcaatcaatc cagcccccag gtcttcactg aaccttttcc catctcttcc aaaacatctg 3120
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tactcccact tgcagaactc ccgtgtacaa gtgtctttac tgcttttatt tgctcaacaa 3240
aatgcacatc tcatataaaa ataaatgagg agcatgcaca caccacaaac acaaacaggc 3300
atgcagaaat acacatacac acttccctca atataaaccc tttgtggctc atatatttaa 3360
aaagatgtaa aaaaaagagc tgaagaaaat catgtgtgat ctctcagcag aatagattta 3420
ttatttgtat tgcttgcaga ataaagccta tccttgaaag ctctgaatca tgggcaagag 3480
gctcagtggt atctggagga cagggcactg gccactgcag tcaccatctt ctgccaggaa 3540
gcctgcacct caggggtgaa ttctttgcca aagtgaatgg ccagcacggt gaccagcacg 3600
ttgcccagga gctgtgggag gaagataaga ggtatgaaca tgattagcaa aagggcctag 3660
cttggactca gaataatcca gccttatccc aaccataaaa taaaagcaga atggtagctg 3720
gattgtagct gctattagca atatgaaacc tcttacatca gttacaattt atatgcagaa 3780
atatttatat gcagaaatat tgctattgcc ttaacccaga aattatcact gttattcttt 3840
agaatggtgc aaagaggcat gatacattgt atcattattg ccctgaaaga aagagattag 3900
ggaaagtatt agaaataaga taaacaaaaa agtatattaa aagaagaaag cattttttaa 3960
aattacaaat gcaaaattac cctgatttgg tcaatatgtg taccctgtta cttctcccct 4020
tcctatgaca tgaacttaac catagaaaag aaggggaaag aaaacatcaa gggtcccata 4080
gactcacctt gaagttctca ggatccacat gcagcttgtc acagtgcagt tcactcagct 4140
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ctaggctgag aacatctggg cacacaccct aagcctcagc atgactcatc atgactcagc 5400
attgctgtgc ttgagccaga aggtttgctt agaaggttac acagaaccag aaggcggggg 5460
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caaggcactt gcccctagct gggggtatag gggagcagtc ccatgtagta gtagaatgaa 6000
aaatgctgct atgctgtgcc tcccccacct ttcccatgtc tgccctctac tcatggtcta 6060
tctctcctgg ctcctgggag tcatggactc cacccagcac caccaacctg acctaaccac 6120
ctatctgagc ctgccagcct ataacccatc tgggccctga tagctggtgg ccagccctga 6180
ccccacccca ccctccctgg aacctctgat agacacatct ggcacaccag ctcgcaaagt 6240
caccgtgagg gtcttgtgtt tgctgagtca aaattccttg aaatccaagt ccttagagac 6300
tcctgctccc aaatttacag tcatagactt cttcatggct gtctccttta tccacagaat 6360
gattcctttg cttcattgcc ccatccatct gatcctcctc atcagtgcag cacagggccc 6420
atgagcagta gctgcagagt ctcacatagg tctggcactg cctctgacat gtccgacctt 6480
aggcaaatgc ttgactcttc tgagctcgga tcccttgagc tcaggaggtc aaggctgcag 6540
tgagacatga tcttgccact gcactccagc ctggacagca gagtgaaacc ttgcctcacg 6600
aaacagaata caaaaacaaa caaacaaaaa actgctccgc aatgcgcttc cttgatgctc 6660
taccacatag gtctgggtac tttgtacaca ttatctcatt gctgttcata attgttagat 6720
taattttgta atattgatat tattcctaga aagctgaggc ctcaagatga taacttttat 6780
tttctggact tgtaatagct ttctcttgta ttcaccatgt tgtaactttc ttagagtagt 6840
aacaatataa agttattgtg agtttttgca aacacagcaa acacaacgac ccatatagac 6900
attgatgtga aattgtctat tgtcaattta tgggaaaaca agtatgtact ttttctacta 6960
agccattgaa acaggaataa cagaacaaga ttgaaagaat acattttccg aaattacttg 7020
agtattatac aaagacaagc acgtggacct gggaggaggg ttattgtcca tgactggtgt 7080
gtggagacaa atgcaggttt ataatagatg ggatggcatc tagcgcaatg actttgccat 7140
cacttttaga gagctcttgg gggccccagt acacaagagg ggacgcaggg tatatgtaga 7200
catctcattc tttttcttag tgtgagaata agaatagcca tgacctgagt ttatagacaa 7260
tgagcccttt tctctctccc actcagcagc tatgagatgg cttgccctgc ctctctacta 7320
ggctgactca ctccaaggcc cagcaatggg cagggctctg tcagggcttt gatagcacta 7380
tctgcagagc cagggccgag aaggggtgga ctccagagac tctccctccc attcccgagc 7440
agggtttgct tatttatgca tttaaatgat atatttattt taaaagaaat aacaggagac 7500
tgcccagccc tggctgtgac atggaaacta tgtagaatat tttgggttcc attttttttt 7560
ccttctttca gttagaggaa aaggggctca ctgcacatac actagacaga aagtcaggag 7620
ctttgaatcc aagcctgatc atttccatgt catactgaga aagtccccac ccttctctga 7680
gcctcagttt ctctttttat aagtaggagt ctggagtaaa tgatttccaa tggctctcat 7740
ttcaatacaa aatttccgtt tattaaatgc atgagcttcc gttactccaa gactgagaag 7800
gaaattgaac ctgagactca ttgactggca agatgtcccc agaggctctc attcagcaat 7860
aaaattctca ccttcaccca ggcccactag tgtcagattt gcatgcgtta acgcggccgc 7920
atcgatgccg tagtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac 7980
tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaaagaag acaagataga 8040
tctgcttttt gcctgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc 8100
tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttcagctgct cgagctagca 8160
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 8220
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 8280
tcactcggaa ggacatatgg gagggcaaat catttaaaac atcagaatga gtatttggtt 8340
tagagtttgg caacatatgc ccatatgctg gctgccatga acaaaggttg gctataaaga 8400
ggtcatcagt atatgaaaca gccccctgct gtccattcct tattccatag aaaagccttg 8460
acttgaggtt agattttttt tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta 8520
aaattttcct tacatgtttt actagccaga tttttcctcc tctcctgact actcccagtc 8580
atagctgtcc ctcttctctt atggagatcc ctcgacctgc agcccaagct tggcgtaatc 8640
atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 8700
agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 8760
tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc ggatccgcat 8820
ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg 8880
cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc 8940
gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta 9000
ggcttttgca aaaagctgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg taatcatggt 9060
catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg 9120
gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt 9180
tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 9240
gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 9300
actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 9360
tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 9420
aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 9480
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 9540
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 9600
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 9660
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 9720
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 9780
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 9840
ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 9900
gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 9960
gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 10020
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 10080
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 10140
tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 10200
agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 10260
gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 10320
agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 10380
cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 10440
ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 10500
cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt 10560
cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 10620
ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 10680
tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 10740
catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 10800
gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata 10860
gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 10920
tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 10980
catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 11040
aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 11100
attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 11160
aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 11220
aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 11280
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 11340
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 11400
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 11460
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 11520
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 11580
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 11640
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt c 11681
<210> 18
<211> 11369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TL20d-GbGM
<400> 18
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 720
ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatact ggcctgttag 900
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500
tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2340
cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga acgcgtgggg atcctctaga 2400
gtcgagctcg cgaggatcat caccggtgct agccggagcc agaagcacca taagggacat 2460
gataagggag ccagcagacc tctgatctct tcctgaatgc taatcttaaa catcctgagg 2520
aagaatggga cttccatttg gggtgggcct atgatagggt aataagacag tagtgaatat 2580
caagctacaa aaagccccct ttcaaattct tctcagtcct aacttttcat actaagccca 2640
gtccttccaa agcagactgt gaaagagtga tagttccggg agactagcac cggctagccg 2700
agcttggaac actttccctt cattaagaac catccttgct actcagctgc aatcaatcca 2760
gcccccaggt cttcactgaa ccttttccca tctcttccaa aacatctgtt tctgagaagt 2820
cctgtcctat agaggtcttt cttcccaccg gatttctcct acaccattta ctcccacttg 2880
cagaactccc gtgtacaagt gtctttactg cttttatttg ctcaacaaaa tgcacatctc 2940
atataaaaat aaatgaggag catgcacaca ccacaaacac aaacaggcat gcagaaatac 3000
acatacacac ttccctcaat ataaaccctt tgtggctcat atatttaaaa agatgtaaaa 3060
aaaagagctg aagaaaatca tgtgtgatct ctcagcagaa tagatttatt atttgtattg 3120
cttgcagaat aaagcctatc cttgaaagct ctgaatcatg ggcaagaggc tcagtggtat 3180
ctggaggaca gggcactggc cactgcagtc accatcttct gccaggaagc ctgcacctca 3240
ggggtgaatt ctttgccaaa gtgaatggcc agcacggtga ccagcacgtt gcccaggagc 3300
tgtgggagga agataagagg tatgaacatg attagcaaaa gggcctagct tggactcaga 3360
ataatccagc cttatcccaa ccataaaata aaagcagaat ggtagctgga ttgtagctgc 3420
tattagcaat atgaaacctc ttacatcagt tacaatttat atgcagaaat atttatatgc 3480
agaaatattg ctattgcctt aacccagaaa ttatcactgt tattctttag aatggtgcaa 3540
agaggcatga tacattgtat cattattgcc ctgaaagaaa gagattaggg aaagtattag 3600
aaataagata aacaaaaaag tatattaaaa gaagaaagca ttttttaaaa ttacaaatgc 3660
aaaattaccc tgatttggtc aatatgtgta ccctgttact tctccccttc ctatgacatg 3720
aacttaacca tagaaaagaa ggggaaagaa aacatcaagg gtcccataga ctcaccttga 3780
agttctcagg atccacatgc agcttgtcac agtgcagttc actcagctgg gcaaaggtgc 3840
ccttgagatc atccaggtgc tttatggcat ctcccaagga agtcagcacc ttcttgccat 3900
gtgccttgac tttggggttg cccatgatgg cagaggcaga ggacaggttg ccaaagctgt 3960
caaagaacct ctgggtccat gggtagacaa ccaggagcct gtgagattga caagaacagt 4020
ttgacagtca gaaggtgcca caaatcctga gaagcaacct ggacttttgc caggcacagg 4080
gtccttcctt ccctcccttg tcctggtcac cagagcctac cttcccaggg tttctcctcc 4140
agcatcttcc acattcacct tgtcccacag gcttgtgata gtagccttgt cctcctctgt 4200
gaaatgaccc atggtgtctg tttgaggttg ctagtgaaca cagttgtgtc agaagcaaat 4260
gtaagcaata gatggctctg ccctgacttt tatgcccagc cctggctcct gccctccctg 4320
ctcctgggag tagattggcc aaccctaggg tgtggctcca cagggtgagg tctaagtgat 4380
gacagccgta cctgtccttg gctcttctgg cactggctta ggagttggac ttcaaaccct 4440
cagccctccc tctaagatat atctcttggc cccataccat cagtacaaat tgctactaaa 4500
aacatcctcc tttgcaagtg tatttacgac ggtatcgatg tatgtgagca tgtgtcctct 4560
aacagcacag gccttttgcc acctagctgt ccaggggtgc cttaaaatgg caaacaaggt 4620
ttgttttctt ttcctgtttt catgccttcc tcttccatat ccttgtttca tattaataca 4680
tgtgtataga tcctaaaaat ctatacacat gtattaataa agcctgattc tgccgcttct 4740
aggtatagag gccacctgca agataaatat ttgattcaca ataactaatc attctatggc 4800
aattgataac aacaaatata tatatatata tatatatacg tatatgtgta tatatatata 4860
tatattcagg aaataatata ttctagaata tgtcacattc tgtctcaggc atccattttc 4920
tttatgatgc cgtttgaggt ggagttttag tcaggtggtc agcttctcct tttttttgcc 4980
atctgccctg taagcatcct gctggggacc cagataggag tcatcactct aggctgagaa 5040
catctgggca cacaccctaa gcctcagcat gactcatcat gactcagcat tgctgtgctt 5100
gagccagaag gtttgcttag aaggttacac agaaccagaa ggcgggggtg gggcactgac 5160
cccgacaggg gcctggccag aactgctcat gcttggacta tgggaggtca ctaatggaga 5220
cacacagaaa tgtaacagga actaagggaa ttccggtgcc ctgcttagga gcttaatctt 5280
taatgaaagc taagctttca ttaaaaaaag tctaaccagc tgcattcgac tttgactgca 5340
gcagctggtt agaaggttct actggaggag ggtcccagcc cattgctaaa ttaacatcag 5400
gctctgagac tggcagtata tctctaacag tggttgatgc tatcttctgg aacttgcctg 5460
ctacattgag accactgacc catacatagg aagcccatag ctctgtcctg aactgttagg 5520
ccactggtcc agagagtgtg catctccttt gatcctcata ataaccctat gagatagaca 5580
caattattac tcttacttta tagatgatga tcctgaaaac ataggagtca aggcacttgc 5640
ccctagctgg gggtataggg gagcagtccc atgtagtagt agaatgaaaa atgctgctat 5700
gctgtgcctc ccccaccttt cccatgtctg ccctctactc atggtctatc tctcctggct 5760
cctgggagtc atggactcca cccagcacca ccaacctgac ctaaccacct atctgagcct 5820
gccagcctat aacccatctg ggccctgata gctggtggcc agccctgacc ccaccccacc 5880
ctccctggaa cctctgatag acacatctgg cacaccagct cgcaaagtca ccgtgagggt 5940
cttgtgtttg ctgagtcaaa attccttgaa atccaagtcc ttagagactc ctgctcccaa 6000
atttacagtc atagacttct tcatggctgt ctcctttatc cacagaatga ttcctttgct 6060
tcattgcccc atccatctga tcctcctcat cagtgcagca cagggcccat gagcagtagc 6120
tgcagagtct cacataggtc tggcactgcc tctgacatgt ccgaccttag gcaaatgctt 6180
gactcttctg agctcggatc ccttgagctc aggaggtcaa ggctgcagtg agacatgatc 6240
ttgccactgc actccagcct ggacagcaga gtgaaacctt gcctcacgaa acagaataca 6300
aaaacaaaca aacaaaaaac tgctccgcaa tgcgcttcct tgatgctcta ccacataggt 6360
ctgggtactt tgtacacatt atctcattgc tgttcataat tgttagatta attttgtaat 6420
attgatatta ttcctagaaa gctgaggcct caagatgata acttttattt tctggacttg 6480
taatagcttt ctcttgtatt caccatgttg taactttctt agagtagtaa caatataaag 6540
ttattgtgag tttttgcaaa cacagcaaac acaacgaccc atatagacat tgatgtgaaa 6600
ttgtctattg tcaatttatg ggaaaacaag tatgtacttt ttctactaag ccattgaaac 6660
aggaataaca gaacaagatt gaaagaatac attttccgaa attacttgag tattatacaa 6720
agacaagcac gtggacctgg gaggagggtt attgtccatg actggtgtgt ggagacaaat 6780
gcaggtttat aatagatggg atggcatcta gcgcaatgac tttgccatca cttttagaga 6840
gctcttgggg gccccagtac acaagagggg acgcagggta tatgtagaca tctcattctt 6900
tttcttagtg tgagaataag aatagccatg acctgagttt atagacaatg agcccttttc 6960
tctctcccac tcagcagcta tgagatggct tgccctgcct ctctactagg ctgactcact 7020
ccaaggccca gcaatgggca gggctctgtc agggctttga tagcactatc tgcagagcca 7080
gggccgagaa ggggtggact ccagagactc tccctcccat tcccgagcag ggtttgctta 7140
tttatgcatt taaatgatat atttatttta aaagaaataa caggagactg cccagccctg 7200
gctgtgacat ggaaactatg tagaatattt tgggttccat ttttttttcc ttctttcagt 7260
tagaggaaaa ggggctcact gcacatacac tagacagaaa gtcaggagct ttgaatccaa 7320
gcctgatcat ttccatgtca tactgagaaa gtccccaccc ttctctgagc ctcagtttct 7380
ctttttataa gtaggagtct ggagtaaatg atttccaatg gctctcattt caatacaaaa 7440
tttccgttta ttaaatgcat gagcttccgt tactccaaga ctgagaagga aattgaacct 7500
gagactcatt gactggcaag atgtccccag aggctctcat tcagcaataa aattctcacc 7560
ttcacccagg cccactagtg tcagatttgc atgcgttaac gcggccgcat cgatgccgta 7620
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gaacccactg cttaagcctc aataaagctt cagctgctcg agctagcaga tctttttccc 7860
tctgccaaaa attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc tggctaataa 7920
aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg 7980
acatatggga gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta gagtttggca 8040
acatatgccc atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg tcatcagtat 8100
atgaaacagc cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac ttgaggttag 8160
atttttttta tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa attttcctta 8220
catgttttac tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat agctgtccct 8280
cttctcttat ggagatccct cgacctgcag cccaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct 8340
gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 8400
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gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc 8580
cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg 8640
gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa 8700
aagctgtcga ctgcagaggc ctgcatgcaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 8760
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 8820
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 8880
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 8940
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 9000
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 9060
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 9120
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 9180
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 9240
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 9300
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 9360
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 9420
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 9480
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 9540
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 9600
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 9660
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 9720
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 9780
acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 9840
tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 9900
ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 9960
catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 10020
ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 10080
caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 10140
ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 10200
tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 10260
cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 10320
aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 10380
tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 10440
gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 10500
cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 10560
aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 10620
tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 10680
tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 10740
gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 10800
atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 10860
taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta 10920
tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg 10980
gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt 11040
aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc 11100
ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt 11160
gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat tcgccattca 11220
ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 11280
cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 11340
gacgttgtaa aacgacggcc agtgaattc 11369
<210> 19
<211> 11671
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TL20d-rGbGM-7SKM1/sh734
<400> 19
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
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ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
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cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500
tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
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ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
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cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga acgcgtgggg atcctctaga 2400
gtcgagctcg cgaggatcat caccggtgct agccggagcc agaagcacca taagggacat 2460
gataagggag ccagcagacc tctgatctct tcctgaatgc taatcttaaa catcctgagg 2520
aagaatggga cttccatttg gggtgggcct atgatagggt aataagacag tagtgaatat 2580
caagctacaa aaagccccct ttcaaattct tctcagtcct aacttttcat actaagccca 2640
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ggggtgaatt ctttgccaaa gtgaatggcc agcacggtga ccagcacgtt gcccaggagc 3300
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ataatccagc cttatcccaa ccataaaata aaagcagaat ggtagctgga ttgtagctgc 3420
tattagcaat atgaaacctc ttacatcagt tacaatttat atgcagaaat atttatatgc 3480
agaaatattg ctattgcctt aacccagaaa ttatcactgt tattctttag aatggtgcaa 3540
agaggcatga tacattgtat cattattgcc ctgaaagaaa gagattaggg aaagtattag 3600
aaataagata aacaaaaaag tatattaaaa gaagaaagca ttttttaaaa ttacaaatgc 3660
aaaattaccc tgatttggtc aatatgtgta ccctgttact tctccccttc ctatgacatg 3720
aacttaacca tagaaaagaa ggggaaagaa aacatcaagg gtcccataga ctcaccttga 3780
agttctcagg atccacatgc agcttgtcac agtgcagttc actcagctgg gcaaaggtgc 3840
ccttgagatc atccaggtgc tttatggcat ctcccaagga agtcagcacc ttcttgccat 3900
gtgccttgac tttggggttg cccatgatgg cagaggcaga ggacaggttg ccaaagctgt 3960
caaagaacct ctgggtccat gggtagacaa ccaggagcct gtgagattga caagaacagt 4020
ttgacagtca gaaggtgcca caaatcctga gaagcaacct ggacttttgc caggcacagg 4080
gtccttcctt ccctcccttg tcctggtcac cagagcctac cttcccaggg tttctcctcc 4140
agcatcttcc acattcacct tgtcccacag gcttgtgata gtagccttgt cctcctctgt 4200
gaaatgaccc atggtgtctg tttgaggttg ctagtgaaca cagttgtgtc agaagcaaat 4260
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cagccctccc tctaagatat atctcttggc cccataccat cagtacaaat tgctactaaa 4500
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ttgttttctt ttcctgtttt catgccttcc tcttccatat ccttgtttca tattaataca 4680
tgtgtataga tcctaaaaat ctatacacat gtattaataa agcctgattc tgccgcttct 4740
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aattgataac aacaaatata tatatatata tatatatacg tatatgtgta tatatatata 4860
tatattcagg aaataatata ttctagaata tgtcacattc tgtctcaggc atccattttc 4920
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ccactggtcc agagagtgtg catctccttt gatcctcata ataaccctat gagatagaca 5580
caattattac tcttacttta tagatgatga tcctgaaaac ataggagtca aggcacttgc 5640
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ttgtctattg tcaatttatg ggaaaacaag tatgtacttt ttctactaag ccattgaaac 6660
aggaataaca gaacaagatt gaaagaatac attttccgaa attacttgag tattatacaa 6720
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gcctgatcat ttccatgtca tactgagaaa gtccccaccc ttctctgagc ctcagtttct 7380
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tttccgttta ttaaatgcat gagcttccgt tactccaaga ctgagaagga aattgaacct 7500
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tagtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag 7980
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gcctgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta 8100
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caacatatgc ccatatgctg gctgccatga acaaaggttg gctataaaga ggtcatcagt 8400
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ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 8760
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc ggatccgcat ctcaattagt 8820
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gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 9480
tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 9540
ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 9600
atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 9660
gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 9720
tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 9780
cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 9840
cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 9900
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cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 10080
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gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 10200
gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 10260
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gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt 11520
caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct 11580
ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc 11640
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<211> 11674
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TL20d-rGbGM-r7SKM1/sh734
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tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2340
cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga acgcgtgggg atcctctaga 2400
gtcgagctcg cgaggatcat caccggtgct agccggagcc agaagcacca taagggacat 2460
gataagggag ccagcagacc tctgatctct tcctgaatgc taatcttaaa catcctgagg 2520
aagaatggga cttccatttg gggtgggcct atgatagggt aataagacag tagtgaatat 2580
caagctacaa aaagccccct ttcaaattct tctcagtcct aacttttcat actaagccca 2640
gtccttccaa agcagactgt gaaagagtga tagttccggg agactagcac cggctagccg 2700
agcttggaac actttccctt cattaagaac catccttgct actcagctgc aatcaatcca 2760
gcccccaggt cttcactgaa ccttttccca tctcttccaa aacatctgtt tctgagaagt 2820
cctgtcctat agaggtcttt cttcccaccg gatttctcct acaccattta ctcccacttg 2880
cagaactccc gtgtacaagt gtctttactg cttttatttg ctcaacaaaa tgcacatctc 2940
atataaaaat aaatgaggag catgcacaca ccacaaacac aaacaggcat gcagaaatac 3000
acatacacac ttccctcaat ataaaccctt tgtggctcat atatttaaaa agatgtaaaa 3060
aaaagagctg aagaaaatca tgtgtgatct ctcagcagaa tagatttatt atttgtattg 3120
cttgcagaat aaagcctatc cttgaaagct ctgaatcatg ggcaagaggc tcagtggtat 3180
ctggaggaca gggcactggc cactgcagtc accatcttct gccaggaagc ctgcacctca 3240
ggggtgaatt ctttgccaaa gtgaatggcc agcacggtga ccagcacgtt gcccaggagc 3300
tgtgggagga agataagagg tatgaacatg attagcaaaa gggcctagct tggactcaga 3360
ataatccagc cttatcccaa ccataaaata aaagcagaat ggtagctgga ttgtagctgc 3420
tattagcaat atgaaacctc ttacatcagt tacaatttat atgcagaaat atttatatgc 3480
agaaatattg ctattgcctt aacccagaaa ttatcactgt tattctttag aatggtgcaa 3540
agaggcatga tacattgtat cattattgcc ctgaaagaaa gagattaggg aaagtattag 3600
aaataagata aacaaaaaag tatattaaaa gaagaaagca ttttttaaaa ttacaaatgc 3660
aaaattaccc tgatttggtc aatatgtgta ccctgttact tctccccttc ctatgacatg 3720
aacttaacca tagaaaagaa ggggaaagaa aacatcaagg gtcccataga ctcaccttga 3780
agttctcagg atccacatgc agcttgtcac agtgcagttc actcagctgg gcaaaggtgc 3840
ccttgagatc atccaggtgc tttatggcat ctcccaagga agtcagcacc ttcttgccat 3900
gtgccttgac tttggggttg cccatgatgg cagaggcaga ggacaggttg ccaaagctgt 3960
caaagaacct ctgggtccat gggtagacaa ccaggagcct gtgagattga caagaacagt 4020
ttgacagtca gaaggtgcca caaatcctga gaagcaacct ggacttttgc caggcacagg 4080
gtccttcctt ccctcccttg tcctggtcac cagagcctac cttcccaggg tttctcctcc 4140
agcatcttcc acattcacct tgtcccacag gcttgtgata gtagccttgt cctcctctgt 4200
gaaatgaccc atggtgtctg tttgaggttg ctagtgaaca cagttgtgtc agaagcaaat 4260
gtaagcaata gatggctctg ccctgacttt tatgcccagc cctggctcct gccctccctg 4320
ctcctgggag tagattggcc aaccctaggg tgtggctcca cagggtgagg tctaagtgat 4380
gacagccgta cctgtccttg gctcttctgg cactggctta ggagttggac ttcaaaccct 4440
cagccctccc tctaagatat atctcttggc cccataccat cagtacaaat tgctactaaa 4500
aacatcctcc tttgcaagtg tatttacgac ggtatcgatg tatgtgagca tgtgtcctct 4560
aacagcacag gccttttgcc acctagctgt ccaggggtgc cttaaaatgg caaacaaggt 4620
ttgttttctt ttcctgtttt catgccttcc tcttccatat ccttgtttca tattaataca 4680
tgtgtataga tcctaaaaat ctatacacat gtattaataa agcctgattc tgccgcttct 4740
aggtatagag gccacctgca agataaatat ttgattcaca ataactaatc attctatggc 4800
aattgataac aacaaatata tatatatata tatatatacg tatatgtgta tatatatata 4860
tatattcagg aaataatata ttctagaata tgtcacattc tgtctcaggc atccattttc 4920
tttatgatgc cgtttgaggt ggagttttag tcaggtggtc agcttctcct tttttttgcc 4980
atctgccctg taagcatcct gctggggacc cagataggag tcatcactct aggctgagaa 5040
catctgggca cacaccctaa gcctcagcat gactcatcat gactcagcat tgctgtgctt 5100
gagccagaag gtttgcttag aaggttacac agaaccagaa ggcgggggtg gggcactgac 5160
cccgacaggg gcctggccag aactgctcat gcttggacta tgggaggtca ctaatggaga 5220
cacacagaaa tgtaacagga actaagggaa ttccggtgcc ctgcttagga gcttaatctt 5280
taatgaaagc taagctttca ttaaaaaaag tctaaccagc tgcattcgac tttgactgca 5340
gcagctggtt agaaggttct actggaggag ggtcccagcc cattgctaaa ttaacatcag 5400
gctctgagac tggcagtata tctctaacag tggttgatgc tatcttctgg aacttgcctg 5460
ctacattgag accactgacc catacatagg aagcccatag ctctgtcctg aactgttagg 5520
ccactggtcc agagagtgtg catctccttt gatcctcata ataaccctat gagatagaca 5580
caattattac tcttacttta tagatgatga tcctgaaaac ataggagtca aggcacttgc 5640
ccctagctgg gggtataggg gagcagtccc atgtagtagt agaatgaaaa atgctgctat 5700
gctgtgcctc ccccaccttt cccatgtctg ccctctactc atggtctatc tctcctggct 5760
cctgggagtc atggactcca cccagcacca ccaacctgac ctaaccacct atctgagcct 5820
gccagcctat aacccatctg ggccctgata gctggtggcc agccctgacc ccaccccacc 5880
ctccctggaa cctctgatag acacatctgg cacaccagct cgcaaagtca ccgtgagggt 5940
cttgtgtttg ctgagtcaaa attccttgaa atccaagtcc ttagagactc ctgctcccaa 6000
atttacagtc atagacttct tcatggctgt ctcctttatc cacagaatga ttcctttgct 6060
tcattgcccc atccatctga tcctcctcat cagtgcagca cagggcccat gagcagtagc 6120
tgcagagtct cacataggtc tggcactgcc tctgacatgt ccgaccttag gcaaatgctt 6180
gactcttctg agctcggatc ccttgagctc aggaggtcaa ggctgcagtg agacatgatc 6240
ttgccactgc actccagcct ggacagcaga gtgaaacctt gcctcacgaa acagaataca 6300
aaaacaaaca aacaaaaaac tgctccgcaa tgcgcttcct tgatgctcta ccacataggt 6360
ctgggtactt tgtacacatt atctcattgc tgttcataat tgttagatta attttgtaat 6420
attgatatta ttcctagaaa gctgaggcct caagatgata acttttattt tctggacttg 6480
taatagcttt ctcttgtatt caccatgttg taactttctt agagtagtaa caatataaag 6540
ttattgtgag tttttgcaaa cacagcaaac acaacgaccc atatagacat tgatgtgaaa 6600
ttgtctattg tcaatttatg ggaaaacaag tatgtacttt ttctactaag ccattgaaac 6660
aggaataaca gaacaagatt gaaagaatac attttccgaa attacttgag tattatacaa 6720
agacaagcac gtggacctgg gaggagggtt attgtccatg actggtgtgt ggagacaaat 6780
gcaggtttat aatagatggg atggcatcta gcgcaatgac tttgccatca cttttagaga 6840
gctcttgggg gccccagtac acaagagggg acgcagggta tatgtagaca tctcattctt 6900
tttcttagtg tgagaataag aatagccatg acctgagttt atagacaatg agcccttttc 6960
tctctcccac tcagcagcta tgagatggct tgccctgcct ctctactagg ctgactcact 7020
ccaaggccca gcaatgggca gggctctgtc agggctttga tagcactatc tgcagagcca 7080
gggccgagaa ggggtggact ccagagactc tccctcccat tcccgagcag ggtttgctta 7140
tttatgcatt taaatgatat atttatttta aaagaaataa caggagactg cccagccctg 7200
gctgtgacat ggaaactatg tagaatattt tgggttccat ttttttttcc ttctttcagt 7260
tagaggaaaa ggggctcact gcacatacac tagacagaaa gtcaggagct ttgaatccaa 7320
gcctgatcat ttccatgtca tactgagaaa gtccccaccc ttctctgagc ctcagtttct 7380
ctttttataa gtaggagtct ggagtaaatg atttccaatg gctctcattt caatacaaaa 7440
tttccgttta ttaaatgcat gagcttccgt tactccaaga ctgagaagga aattgaacct 7500
gagactcatt gactggcaag atgtccccag aggctctcat tcagcaataa aattctcacc 7560
ttcacccagg cccactagtg tcagatttgc atgcgttcgc gtaaaaaagg atatgccctt 7620
gactatgtcg gacaaatagt caagggcata tcctgaggta cccaggcggc gcacaagcta 7680
tataaacctg aaggaaatct caactttaca cttaggtcaa gttacttatc gtactagagc 7740
ttcagcagga aatttaacta aaatctaatt taaccagcat agcaaatatc atttattccc 7800
aaaatgctaa agtttgagat aaacggactt gatttccggc tgttttgaca ctatccagaa 7860
tgccggtact atgggtgggg cagtagcccg actgcacgtc gagcggccgc atcgatgccg 7920
tagtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag 7980
aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaaagaag acaagataga tctgcttttt 8040
gcctgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta 8100
gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttcagctgct cgagctagca gatctttttc 8160
cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact tctggctaat 8220
aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc tcactcggaa 8280
ggacatatgg gagggcaaat catttaaaac atcagaatga gtatttggtt tagagtttgg 8340
caacatatgc ccatatgctg gctgccatga acaaaggttg gctataaaga ggtcatcagt 8400
atatgaaaca gccccctgct gtccattcct tattccatag aaaagccttg acttgaggtt 8460
agattttttt tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta aaattttcct 8520
tacatgtttt actagccaga tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc 8580
ctcttctctt atggagatcc ctcgacctgc agcccaagct tggcgtaatc atggtcatag 8640
ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 8700
ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 8760
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc ggatccgcat ctcaattagt 8820
cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg 8880
cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct 8940
cggcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca 9000
aaaagctgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg taatcatggt catagctgtt 9060
tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 9120
gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 9180
gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 9240
ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 9300
ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 9360
cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 9420
gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 9480
tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 9540
ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 9600
atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 9660
gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 9720
tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 9780
cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 9840
cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 9900
tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 9960
cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 10020
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 10080
gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 10140
gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 10200
gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 10260
ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 10320
atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 10380
agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 10440
ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 10500
tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 10560
ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 10620
caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 10680
gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 10740
atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 10800
accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 10860
aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 10920
gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 10980
tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 11040
aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 11100
ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 11160
aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat 11220
tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt 11280
cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct 11340
gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg 11400
tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg 11460
gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt 11520
caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct 11580
ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc 11640
acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt c 11671
<210> 22
<211> 11674
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TL20d-rGbGM-r7SK/sh734
<400> 22
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 720
ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatact ggcctgttag 900
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500
tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
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cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga acgcgtgggg atcctctaga 2400
gtcgagctcg cgaggatcat caccggtgct agccggagcc agaagcacca taagggacat 2460
gataagggag ccagcagacc tctgatctct tcctgaatgc taatcttaaa catcctgagg 2520
aagaatggga cttccatttg gggtgggcct atgatagggt aataagacag tagtgaatat 2580
caagctacaa aaagccccct ttcaaattct tctcagtcct aacttttcat actaagccca 2640
gtccttccaa agcagactgt gaaagagtga tagttccggg agactagcac cggctagccg 2700
agcttggaac actttccctt cattaagaac catccttgct actcagctgc aatcaatcca 2760
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cctgtcctat agaggtcttt cttcccaccg gatttctcct acaccattta ctcccacttg 2880
cagaactccc gtgtacaagt gtctttactg cttttatttg ctcaacaaaa tgcacatctc 2940
atataaaaat aaatgaggag catgcacaca ccacaaacac aaacaggcat gcagaaatac 3000
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aaaagagctg aagaaaatca tgtgtgatct ctcagcagaa tagatttatt atttgtattg 3120
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tgtgggagga agataagagg tatgaacatg attagcaaaa gggcctagct tggactcaga 3360
ataatccagc cttatcccaa ccataaaata aaagcagaat ggtagctgga ttgtagctgc 3420
tattagcaat atgaaacctc ttacatcagt tacaatttat atgcagaaat atttatatgc 3480
agaaatattg ctattgcctt aacccagaaa ttatcactgt tattctttag aatggtgcaa 3540
agaggcatga tacattgtat cattattgcc ctgaaagaaa gagattaggg aaagtattag 3600
aaataagata aacaaaaaag tatattaaaa gaagaaagca ttttttaaaa ttacaaatgc 3660
aaaattaccc tgatttggtc aatatgtgta ccctgttact tctccccttc ctatgacatg 3720
aacttaacca tagaaaagaa ggggaaagaa aacatcaagg gtcccataga ctcaccttga 3780
agttctcagg atccacatgc agcttgtcac agtgcagttc actcagctgg gcaaaggtgc 3840
ccttgagatc atccaggtgc tttatggcat ctcccaagga agtcagcacc ttcttgccat 3900
gtgccttgac tttggggttg cccatgatgg cagaggcaga ggacaggttg ccaaagctgt 3960
caaagaacct ctgggtccat gggtagacaa ccaggagcct gtgagattga caagaacagt 4020
ttgacagtca gaaggtgcca caaatcctga gaagcaacct ggacttttgc caggcacagg 4080
gtccttcctt ccctcccttg tcctggtcac cagagcctac cttcccaggg tttctcctcc 4140
agcatcttcc acattcacct tgtcccacag gcttgtgata gtagccttgt cctcctctgt 4200
gaaatgaccc atggtgtctg tttgaggttg ctagtgaaca cagttgtgtc agaagcaaat 4260
gtaagcaata gatggctctg ccctgacttt tatgcccagc cctggctcct gccctccctg 4320
ctcctgggag tagattggcc aaccctaggg tgtggctcca cagggtgagg tctaagtgat 4380
gacagccgta cctgtccttg gctcttctgg cactggctta ggagttggac ttcaaaccct 4440
cagccctccc tctaagatat atctcttggc cccataccat cagtacaaat tgctactaaa 4500
aacatcctcc tttgcaagtg tatttacgac ggtatcgatg tatgtgagca tgtgtcctct 4560
aacagcacag gccttttgcc acctagctgt ccaggggtgc cttaaaatgg caaacaaggt 4620
ttgttttctt ttcctgtttt catgccttcc tcttccatat ccttgtttca tattaataca 4680
tgtgtataga tcctaaaaat ctatacacat gtattaataa agcctgattc tgccgcttct 4740
aggtatagag gccacctgca agataaatat ttgattcaca ataactaatc attctatggc 4800
aattgataac aacaaatata tatatatata tatatatacg tatatgtgta tatatatata 4860
tatattcagg aaataatata ttctagaata tgtcacattc tgtctcaggc atccattttc 4920
tttatgatgc cgtttgaggt ggagttttag tcaggtggtc agcttctcct tttttttgcc 4980
atctgccctg taagcatcct gctggggacc cagataggag tcatcactct aggctgagaa 5040
catctgggca cacaccctaa gcctcagcat gactcatcat gactcagcat tgctgtgctt 5100
gagccagaag gtttgcttag aaggttacac agaaccagaa ggcgggggtg gggcactgac 5160
cccgacaggg gcctggccag aactgctcat gcttggacta tgggaggtca ctaatggaga 5220
cacacagaaa tgtaacagga actaagggaa ttccggtgcc ctgcttagga gcttaatctt 5280
taatgaaagc taagctttca ttaaaaaaag tctaaccagc tgcattcgac tttgactgca 5340
gcagctggtt agaaggttct actggaggag ggtcccagcc cattgctaaa ttaacatcag 5400
gctctgagac tggcagtata tctctaacag tggttgatgc tatcttctgg aacttgcctg 5460
ctacattgag accactgacc catacatagg aagcccatag ctctgtcctg aactgttagg 5520
ccactggtcc agagagtgtg catctccttt gatcctcata ataaccctat gagatagaca 5580
caattattac tcttacttta tagatgatga tcctgaaaac ataggagtca aggcacttgc 5640
ccctagctgg gggtataggg gagcagtccc atgtagtagt agaatgaaaa atgctgctat 5700
gctgtgcctc ccccaccttt cccatgtctg ccctctactc atggtctatc tctcctggct 5760
cctgggagtc atggactcca cccagcacca ccaacctgac ctaaccacct atctgagcct 5820
gccagcctat aacccatctg ggccctgata gctggtggcc agccctgacc ccaccccacc 5880
ctccctggaa cctctgatag acacatctgg cacaccagct cgcaaagtca ccgtgagggt 5940
cttgtgtttg ctgagtcaaa attccttgaa atccaagtcc ttagagactc ctgctcccaa 6000
atttacagtc atagacttct tcatggctgt ctcctttatc cacagaatga ttcctttgct 6060
tcattgcccc atccatctga tcctcctcat cagtgcagca cagggcccat gagcagtagc 6120
tgcagagtct cacataggtc tggcactgcc tctgacatgt ccgaccttag gcaaatgctt 6180
gactcttctg agctcggatc ccttgagctc aggaggtcaa ggctgcagtg agacatgatc 6240
ttgccactgc actccagcct ggacagcaga gtgaaacctt gcctcacgaa acagaataca 6300
aaaacaaaca aacaaaaaac tgctccgcaa tgcgcttcct tgatgctcta ccacataggt 6360
ctgggtactt tgtacacatt atctcattgc tgttcataat tgttagatta attttgtaat 6420
attgatatta ttcctagaaa gctgaggcct caagatgata acttttattt tctggacttg 6480
taatagcttt ctcttgtatt caccatgttg taactttctt agagtagtaa caatataaag 6540
ttattgtgag tttttgcaaa cacagcaaac acaacgaccc atatagacat tgatgtgaaa 6600
ttgtctattg tcaatttatg ggaaaacaag tatgtacttt ttctactaag ccattgaaac 6660
aggaataaca gaacaagatt gaaagaatac attttccgaa attacttgag tattatacaa 6720
agacaagcac gtggacctgg gaggagggtt attgtccatg actggtgtgt ggagacaaat 6780
gcaggtttat aatagatggg atggcatcta gcgcaatgac tttgccatca cttttagaga 6840
gctcttgggg gccccagtac acaagagggg acgcagggta tatgtagaca tctcattctt 6900
tttcttagtg tgagaataag aatagccatg acctgagttt atagacaatg agcccttttc 6960
tctctcccac tcagcagcta tgagatggct tgccctgcct ctctactagg ctgactcact 7020
ccaaggccca gcaatgggca gggctctgtc agggctttga tagcactatc tgcagagcca 7080
gggccgagaa ggggtggact ccagagactc tccctcccat tcccgagcag ggtttgctta 7140
tttatgcatt taaatgatat atttatttta aaagaaataa caggagactg cccagccctg 7200
gctgtgacat ggaaactatg tagaatattt tgggttccat ttttttttcc ttctttcagt 7260
tagaggaaaa ggggctcact gcacatacac tagacagaaa gtcaggagct ttgaatccaa 7320
gcctgatcat ttccatgtca tactgagaaa gtccccaccc ttctctgagc ctcagtttct 7380
ctttttataa gtaggagtct ggagtaaatg atttccaatg gctctcattt caatacaaaa 7440
tttccgttta ttaaatgcat gagcttccgt tactccaaga ctgagaagga aattgaacct 7500
gagactcatt gactggcaag atgtccccag aggctctcat tcagcaataa aattctcacc 7560
ttcacccagg cccactagtg tcagatttgc atgcgttcgc gtacaaaaaa ggatatgccc 7620
ttgactatgt cggacaaata gtcaagggca tatcctgagg tacccaggcg gcgcacaagc 7680
tatataaacc tgaaggaaat ctcaacttta cacttaggtc aagttactta tcgtactaga 7740
gcttcagcag gaaatttaac taaaatctaa tttaaccagc atagcaaata tcatttattc 7800
ccaaaatgct aaagtttgag ataaacggac ttgatttccg gctgttttga cactatccag 7860
aatgccttgc agatgggtgg ggcatgctaa atactgcacg tcgatgcggc cgcatcgatg 7920
ccgtagtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc cactttttaa 7980
aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaaag aagacaagat agatctgctt 8040
tttgcctgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa 8100
ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttcagct gctcgagcta gcagatcttt 8160
ttccctctgc caaaaattat ggggacatca tgaagcccct tgagcatctg acttctggct 8220
aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg 8280
gaaggacata tgggagggca aatcatttaa aacatcagaa tgagtatttg gtttagagtt 8340
tggcaacata tgcccatatg ctggctgcca tgaacaaagg ttggctataa agaggtcatc 8400
agtatatgaa acagccccct gctgtccatt ccttattcca tagaaaagcc ttgacttgag 8460
gttagatttt ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc tttaacatcc ctaaaatttt 8520
ccttacatgt tttactagcc agatttttcc tcctctcctg actactccca gtcatagctg 8580
tccctcttct cttatggaga tccctcgacc tgcagcccaa gcttggcgta atcatggtca 8640
tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 8700
agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 8760
cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agcggatccg catctcaatt 8820
agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt 8880
ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg 8940
cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt 9000
gcaaaaagct gtcgactgca gaggcctgca tgcaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct 9060
gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 9120
aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 9180
actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 9240
cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 9300
gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 9360
atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 9420
caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 9480
gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 9540
ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 9600
cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 9660
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 9720
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 9780
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 9840
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 9900
atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 9960
atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 10020
gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 10080
gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 10140
ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 10200
ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 10260
tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 10320
accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 10380
atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 10440
cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 10500
tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 10560
tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 10620
gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 10680
agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 10740
aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 10800
gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 10860
tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 10920
gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 10980
tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 11040
aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 11100
catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 11160
acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat 11220
tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg 11280
tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg 11340
tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg 11400
gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat 11460
gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc 11520
attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca 11580
gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca 11640
gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attc 11674
<210> 23
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: miRNA734 de novo (RNA形式)
<400> 23
acccguacau auuuuugugu agcucuaguu uauagucaag ggcauauccu uguguuuuuu 60
uugaaggaua ugcccuugac uauaaacuag cgcuacacuu uuucgucuug u 111
<210> 24
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: miRNA211 de novo (RNA形式)
<400> 24
acccguacau auuuuugugu agcucuaguu auaaaucaag gucauaaccu uguguuuuuu 60
uugaagguua ugaccuugau uuauaacuag cgcuacacuu uuucgucuug u 111
<210> 25
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: miRNA211-3G
<400> 25
ccggatcaac gccctaggtt tatgtttgga tgaactgaca tacgcgtatc cgtcttttaa 60
atcaaggtca taaccgtagt gaaatatata ttaaacaggt tatgaccttg atttaaaata 120
cggtaacgcg gaattcgcaa ctattttatc aattttttgc gtcgac 166
<210> 26
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: miRNA734-3G
<400> 26
ccggatcaac gccctaggtt tatgtttgga tgaactgaca tacgcgtatc cgtcttatag 60
tcaagggcat atcctgtagt gaaatatata ttaaacaagg atatgccctt gactataata 120
cggtaacgcg gaattcgcaa ctattttatc aattttttgc gtcgac 166
<210> 27
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: shHPRT 616
<400> 27
gcaggcagta taatccaaat acctgaccca tatttggatt atactgcctg cttttt 56
<210> 28
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: shHPRT 211
<400> 28
ggttatgacc ttgatttata cctgacccat attaaatcaa ggtcataacc ttttt 55
<210> 29
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: shHPRT 734.1
<400> 29
gggatatgcc cttgactaat acctgaccca tattagtcaa gggcatatcc cttttt 56
<210> 30
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: shHPRT 734
<400> 30
aggatatgcc cttgactatt tgtccgacat agtcaagggc atatcctttt tt 52
<210> 31
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 经修饰的sh734
<400> 31
aggauaugcc cuugacuaug cccugaccca gcauagucaa gggcauaucc u 51
<210> 32
<211> 248
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> 智人细胞系HEK-293 7SK RNA启动子区
<400> 32
tcgacgtgca gtatttagca tgccccaccc atctgcaagg cattctggat agtgtcaaaa 60
cagccggaaa tcaagtccgt ttatctcaaa ctttagcatt ttgggaataa atgatatttg 120
ctatgctggt taaattagat tttagttaaa tttcctgctg aagctctagt acgataagta 180
acttgaccta agtgtaaagt tgagatttcc ttcaggttta tatagcttgt gcgccgcctg 240
ggtacctc 248
<210> 33
<211> 248
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 智人细胞系HEK-293 7SK RNA启动子区，具有突变1
<400> 33
tcgacgtgca gtcgggctac tgccccaccc atagtaccgg cattctggat agtgtcaaaa 60
cagccggaaa tcaagtccgt ttatctcaaa ctttagcatt ttgggaataa atgatatttg 120
ctatgctggt taaattagat tttagttaaa tttcctgctg aagctctagt acgataagta 180
acttgaccta agtgtaaagt tgagatttcc ttcaggttta tatagcttgt gcgccgcctg 240
ggtacctc 248
<210> 34
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hsa-miR-22环序列
<400> 34
ccugaccca 9
<210> 35
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: sh734的发夹环序列 (5至3)
<400> 35
ttgtccgac 9
<210> 36
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: EF1a-miRNA734-Denovo-SV40 polyA
<400> 36
ggatatcggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa 60
gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg 120
ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat 180
aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggat 240
gacccgtaca tatttttgtg tagctctagt tataaatcaa ggtcataacc ttgtgttttt 300
tttgaaggtt atgaccttga tttataacta gcgctacact ttttcgtctt gttagaactt 360
gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 420
agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 480
tct 483
<210> 37
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: EF1a-miRNA211-Denovo-SV40 polyA
<400> 37
ggatatcggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa 60
gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg 120
ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat 180
aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggat 240
gacccgtaca tatttttgtg tagctctagt ttatagtcaa gggcatatcc ttgtgttttt 300
tttgaaggat atgcccttga ctataaacta gcgctacact ttttcgtctt gttagaactt 360
gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 420
agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 480
tct 483
<210> 38
<211> 537
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: EF1a-miRNA734-3G-SV40 polyA
<400> 38
ggatatcggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa 60
gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg 120
ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat 180
aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggat 240
gccggatcaa cgccctaggt ttatgtttgg atgaactgac atacgcgtat ccgtcttata 300
gtcaagggca tatccagtag tgaaatatat attaaactgg atatgccctt gactataata 360
cggtaacgcg gaattcgcaa ctattttatc aattttttgc gtcgactaga acttgtttat 420
tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt 480
tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatct 537
<210> 39
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: EF1a-miRNA211-3G-SV40 polyA
<400> 39
ggatatcggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa 60
gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg 120
ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat 180
aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggcc 240
ggatcaacgc cctaggttta tgtttggatg aactgacata cgcgtatccg tctataaatc 300
aaggtcataa cctgtagtga aatatatatt aaacaaggtt atgaccttga tttattacgg 360
taacgcggaa ttcgcaacta ttttatcaat tttttgcgtc gacccggatc aacgccctag 420
gtttatgttt ggatgaactg acatacgcgt atccgtctat aaatcaaggt cataacctgt 480
agtgaaatat atattaaaca aggttatgac cttgatttat tacggtaacg cggaattcgc 540
aactatttta tcaatttttt gcgtcgacaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 600
ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 660
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatct 696
<210> 40
<211> 809
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 左臂150-EF1a-miRNA734-Denovo-SV40 polyA-右臂150
<400> 40
gcttcttctc tggaatcttc ttcatcatcc tcctgacaat cgataggtac ctggctgtcg 60
tccatgctgt gtttgcttta aaagccagga cggtcacctt tggggtggtg acaagtgtga 120
tcacttgggt ggtggctgtg tttgcgtctc aagcttttcg aagcggccgc ggatatcggc 180
tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga 240
ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat 300
gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta 360
gtcgccgtga acgttctttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggat gacccgtaca 420
tatttttgtg tagctctagt tataaatcaa ggtcataacc ttgtgttttt tttgaaggtt 480
atgaccttga tttataacta gcgctacact ttttcgtctt gttagaactt gtttattgca 540
gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 600
tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tctacgcgtc 660
caggaatcat ctttaccaga tctcaaaaag aaggtcttca ttacacctgc agctctcatt 720
ttccatacag tcagtatcaa ttctggaaga atttccagac attaaagata gtcatcttgg 780
ggctggtcct gccgctgctt gtcatggtc 809
<210> 41
<211> 809
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: miRNA211-Denovo
<400> 41
gcttcttctc tggaatcttc ttcatcatcc tcctgacaat cgataggtac ctggctgtcg 60
tccatgctgt gtttgcttta aaagccagga cggtcacctt tggggtggtg acaagtgtga 120
tcacttgggt ggtggctgtg tttgcgtctc aagcttttcg aagcggccgc ggatatcggc 180
tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga 240
ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat 300
gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta 360
gtcgccgtga acgttctttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggat gacccgtaca 420
tatttttgtg tagctctagt ttatagtcaa gggcatatcc ttgtgttttt tttgaaggat 480
atgcccttga ctataaacta gcgctacact ttttcgtctt gttagaactt gtttattgca 540
gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 600
tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tctacgcgtc 660
caggaatcat ctttaccaga tctcaaaaag aaggtcttca ttacacctgc agctctcatt 720
ttccatacag tcagtatcaa ttctggaaga atttccagac attaaagata gtcatcttgg 780
ggctggtcct gccgctgctt gtcatggtc 809
<210> 42
<211> 863
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: miRNA734-3G
<400> 42
gcttcttctc tggaatcttc ttcatcatcc tcctgacaat cgataggtac ctggctgtcg 60
tccatgctgt gtttgcttta aaagccagga cggtcacctt tggggtggtg acaagtgtga 120
tcacttgggt ggtggctgtg tttgcgtctc aagcttttcg aagcggccgc ggatatcggc 180
tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga 240
ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat 300
gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta 360
gtcgccgtga acgttctttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggat gccggatcaa 420
cgccctaggt ttatgtttgg atgaactgac atacgcgtat ccgtcttata gtcaagggca 480
tatccagtag tgaaatatat attaaactgg atatgccctt gactataata cggtaacgcg 540
gaattcgcaa ctattttatc aattttttgc gtcgactaga acttgtttat tgcagcttat 600
aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg 660
cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatctacg cgtccaggaa 720
tcatctttac cagatctcaa aaagaaggtc ttcattacac ctgcagctct cattttccat 780
acagtcagta tcaattctgg aagaatttcc agacattaaa gatagtcatc ttggggctgg 840
tcctgccgct gcttgtcatg gtc 863
<210> 43
<211> 1022
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: miRNA211-3G
<400> 43
gcttcttctc tggaatcttc ttcatcatcc tcctgacaat cgataggtac ctggctgtcg 60
tccatgctgt gtttgcttta aaagccagga cggtcacctt tggggtggtg acaagtgtga 120
tcacttgggt ggtggctgtg tttgcgtctc aagcttttcg aagcggccgc ggatatcggc 180
tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga 240
ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat 300
gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta 360
gtcgccgtga acgttctttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggcc ggatcaacgc 420
cctaggttta tgtttggatg aactgacata cgcgtatccg tctataaatc aaggtcataa 480
cctgtagtga aatatatatt aaacaaggtt atgaccttga tttattacgg taacgcggaa 540
ttcgcaacta ttttatcaat tttttgcgtc gacccggatc aacgccctag gtttatgttt 600
ggatgaactg acatacgcgt atccgtctat aaatcaaggt cataacctgt agtgaaatat 660
atattaaaca aggttatgac cttgatttat tacggtaacg cggaattcgc aactatttta 720
tcaatttttt gcgtcgacaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 780
agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 840
aaactcatca atgtatctta tcatctacgc gtccaggaat catctttacc agatctcaaa 900
aagaaggtct tcattacacc tgcagctctc attttccata cagtcagtat caattctgga 960
agaatttcca gacattaaag atagtcatct tggggctggt cctgccgctg cttgtcatgg 1020
tc 1022
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: GbGM F 5-3
<400> 44
tgacttcctt gggagatgcc 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: GbGM R 5-3
<400> 45
caaagtgaat ggccagcacg 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 探针 5- 3
<400> 46
agctcctggg caacgtgctg 20
<210> 47
<211> 6565
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: PTL20c
<400> 47
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 720
ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatact ggcctgttag 900
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500
tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2340
cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga acgcgtgcgg ccgcatcgat 2400
gccgtagtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta 2460
aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaaa gaagacaaga tccctgcagg 2520
cattcaaggc caggctggat gtggctctgg gcagcctggg ctgctggttg atgaccctgc 2580
acatagcagg gggttggatc tggatgagca ctgtgctcct ttgcaaccca ggccgttcta 2640
tgattctgtc attctaaatc tctctttcag cctaaagctt tttccccgta tccccccagg 2700
tgtctgcagg ctcaaagagc agcgagaagc gttcagagga aagcgatccc gtgccacctt 2760
ccccgtgccc gggctgtccc cgcacgctgc cggctcgggg atgcgggggg agcgccggac 2820
cggagcggag ccccgggcgg ctcgctgctg ccccctagcg ggggagggac gtaattacat 2880
ccctgggggc tttggggggg ggctgtcccc gtgagctccc cagatctgct ttttgcctgt 2940
actgggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac 3000
ccactgctta agcctcaata aagcttcagc tgctcgagct agcagatctt tttccctctg 3060
ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga 3120
aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat 3180
atgggagggc aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat 3240
atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag gttggctata aagaggtcat cagtatatga 3300
aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc cttgacttga ggttagattt 3360
tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt tccttacatg 3420
ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc agtcatagct gtccctcttc 3480
tcttatggag atccctcgac ctgcagccca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 3540
cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 3600
tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 3660
cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagcggatcc gcatctcaat tagtcagcaa 3720
ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt 3780
ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct 3840
ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc 3900
tgtcgactgc agaggcctgc atgcaagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 3960
gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 4020
agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 4080
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 4140
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 4200
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 4260
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 4320
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 4380
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 4440
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 4500
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 4560
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 4620
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 4680
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 4740
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 4800
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 4860
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 4920
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 4980
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 5040
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 5100
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 5160
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 5220
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 5280
aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 5340
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 5400
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 5460
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 5520
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 5580
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 5640
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 5700
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 5760
gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 5820
atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 5880
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 5940
gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 6000
gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 6060
ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 6120
gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga 6180
tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc 6240
ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg 6300
ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga 6360
aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct 6420
gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 6480
agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 6540
ttgtaaaacg acggccagtg aattc 6565
<210> 48
<211> 3901
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 包含400bp cHS4绝缘子的PTL20c主链
<400> 48
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 720
ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatact ggcctgttag 900
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500
tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2340
cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga acgcgtgcgg ccgcatcgat 2400
gccgtagtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta 2460
aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaaa gaagacaaga tccctgcagg 2520
cattcaaggc caggctggat gtggctctgg gcagcctggg ctgctggttg atgaccctgc 2580
acatagcagg gggttggatc tggatgagca ctgtgctcct ttgcaaccca ggccgttcta 2640
tgattctgtc attctaaatc tctctttcag cctaaagctt tttccccgta tccccccagg 2700
tgtctgcagg ctcaaagagc agcgagaagc gttcagagga aagcgatccc gtgccacctt 2760
ccccgtgccc gggctgtccc cgcacgctgc cggctcgggg atgcgggggg agcgccggac 2820
cggagcggag ccccgggcgg ctcgctgctg ccccctagcg ggggagggac gtaattacat 2880
ccctgggggc tttggggggg ggctgtcccc gtgagctccc cagatctgct ttttgcctgt 2940
actgggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac 3000
ccactgctta agcctcaata aagcttcagc tgctcgagct agcagatctt tttccctctg 3060
ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga 3120
aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat 3180
atgggagggc aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat 3240
atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag gttggctata aagaggtcat cagtatatga 3300
aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc cttgacttga ggttagattt 3360
tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt tccttacatg 3420
ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc agtcatagct gtccctcttc 3480
tcttatggag atccctcgac ctgcagccca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 3540
cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 3600
tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 3660
cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagcggatcc gcatctcaat tagtcagcaa 3720
ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt 3780
ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct 3840
ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc 3900
t 3901
<210> 49
<211> 412
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: cHS4绝缘子
<400> 49
atccctgcag gcattcaagg ccaggctgga tgtggctctg ggcagcctgg gctgctggtt 60
gatgaccctg cacatagcag ggggttggat ctggatgagc actgtgctcc tttgcaaccc 120
aggccgttct atgattctgt cattctaaat ctctctttca gcctaaagct ttttccccgt 180
atccccccag gtgtctgcag gctcaaagag cagcgagaag cgttcagagg aaagcgatcc 240
cgtgccacct tccccgtgcc cgggctgtcc ccgcacgctg ccggctcggg gatgcggggg 300
gagcgccgga ccggagcgga gccccgggcg gctcgctgct gccccctagc gggggaggga 360
cgtaattaca tccctggggg ctttgggggg gggctgtccc cgtgagctcc cc 412
<210> 50
<211> 5221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: sGbGM载体盒
<400> 50
ggagccagaa gcaccataag ggacatgggg atcctctaga gtcgagctcg cgaggatcat 60
caccggtgct agccgataag ggagccagca gacctctgat ctcttcctga atgctaatct 120
taaacatcct gaggaagaat gggacttcca tttggggtgg gcctatgata gggtaataag 180
acagtagtga atatcaagct acaaaaagcc ccctttcaaa ttcttctcag tcctaacttt 240
tcatactaag cccagtcctt ccaaagcaga ctgtgaaaga gtgatagttc cgggagacta 300
gcaccggcta gccgagcttg gaacactttc ccttcattaa gaaccatcct tgctactcag 360
ctgcaatcaa tccagccccc aggtcttcac tgaacctttt cccatctctt ccaaaacatc 420
tgtttctgag aagtcctgtc ctatagaggt ctttcttccc accggatttc tcctacacca 480
tttactccca cttgcagaac tcccgtgtac aagtgtcttt actgctttta tttgctcaac 540
aaaatgcaca tctcatataa aaataaatga ggagcatgca cacaccacaa acacaaacag 600
gcatgcagaa atacacatac acacttccct caatataaac cctttgtggc tcatatattt 660
aaaaagatgt aaaaaaaaga gctgaagaaa atcatgtgtg atctctcagc agaatagatt 720
tattatttgt attgcttgca gaataaagcc tatccttgaa agctctgaat catgggcaag 780
aggctcagtg gtatctggag gacagggcac tggccactgc agtcaccatc ttctgccagg 840
aagcctgcac ctcaggggtg aattctttgc caaagtgaat ggccagcacg gtgaccagca 900
cgttgcccag gagctgtggg aggaagataa gaggtatgaa catgattagc aaaagggcct 960
agcttggact cagaataatc cagccttatc ccaaccataa aataaaagca gaatggtagc 1020
tggattgtag ctgctattag caatatgaaa cctcttacat cagttacaat ttatatgcag 1080
aaatatttat atgcagaaat attgctattg ccttaaccca gaaattatca ctgttattct 1140
ttagaatggt gcaaagaggc atgatacatt gtatcattat tgccctgaaa gaaagagatt 1200
agggaaagta ttagaaataa gataaacaaa aaagtatatt aaaagaagaa agcatttttt 1260
aaaattacaa atgcaaaatt accctgattt ggtcaatatg tgtaccctgt tacttctccc 1320
cttcctatga catgaactta accatagaaa agaaggggaa agaaaacatc aagggtccca 1380
tagactcacc ttgaagttct caggatccac atgcagcttg tcacagtgca gttcactcag 1440
ctgggcaaag gtgcccttga gatcatccag gtgctttatg gcatctccca aggaagtcag 1500
caccttcttg ccatgtgcct tgactttggg gttgcccatg atggcagagg cagaggacag 1560
gttgccaaag ctgtcaaaga acctctgggt ccatgggtag acaaccagga gcctgtgaga 1620
ttgacaagaa cagtttgaca gtcagaaggt gccacaaatc ctgagaagca acctggactt 1680
ttgccaggca cagggtcctt ccttccctcc cttgtcctgg tcaccagagc ctaccttccc 1740
agggtttctc ctccagcatc ttccacattc accttgtccc acaggcttgt gatagtagcc 1800
ttgtcctcct ctgtgaaatg acccatggtg tctgtttgag gttgctagtg aacacagttg 1860
tgtcagaagc aaatgtaagc aatagatggc tctgccctga cttttatgcc cagccctggc 1920
tcctgccctc cctgctcctg ggagtagatt ggccaaccct agggtgtggc tccacagggt 1980
gaggtctaag tgatgacagc cgtacctgtc cttggctctt ctggcactgg cttaggagtt 2040
ggacttcaaa ccctcagccc tccctctaag atatatctct tggccccata ccatcagtac 2100
aaattgctac taaaaacatc ctcctttgca agtgtattta cgacggtatc gatgtatgtg 2160
agcatgtgtc ctctaacagc acaggccttt tgccacctag ctgtccaggg gtgccttaaa 2220
atggcaaaca aggtttgttt tcttttcctg ttttcatgcc ttcctcttcc atatccttgt 2280
ttcatattaa tacatgtgta tagatcctaa aaatctatac acatgtatta ataaagcctg 2340
attctgccgc ttctaggtat agaggccacc tgcaagataa atatttgatt cacaataact 2400
aatcattcta tggcaattga taacaacaaa tatatatata tatatatata tacgtatatg 2460
tgtatatata tatatatata tatatattca ggaaataata tattctagaa tatgtcacat 2520
tctgtctcag gcatccattt tctttatgat gccgtttgag gtggagtttt agtcaggtgg 2580
tcagcttctc cttttttttg ccatctgccc tgtaagcatc ctgctgggga cccagatagg 2640
agtcatcact ctaggctgag aacatctggg cacacaccct aagcctcagc atgactcatc 2700
atgactcagc attgctgtgc ttgagccaga aggtttgctt agaaggttac acagaaccag 2760
aaggcggggg tggggcactg accccgacag gggcctggcc agaactgctc atgcttggac 2820
tatgggaggt cactaatgga gacacacaga aatgtaacag gaactaaggg aattccggtg 2880
ccctgcttag gagcttaatc tttaatgaaa gctaagcttt cattaaaaaa agtctaacca 2940
gctgcattcg actttgactg cagcagctgg ttagaaggtt ctactggagg agggtcccag 3000
cccattgcta aattaacatc aggctctgag actggcagta tatctctaac agtggttgat 3060
gctatcttct ggaacttgcc tgctacattg agaccactga cccatacata ggaagcccat 3120
agctctgtcc tgaactgtta ggccactggt ccagagagtg tgcatctcct ttgatcctca 3180
taataaccct atgagataga cacaattatt actcttactt tatagatgat gatcctgaaa 3240
acataggagt caaggcactt gcccctagct gggggtatag gggagcagtc ccatgtagta 3300
gtagaatgaa aaatgctgct atgctgtgcc tcccccacct ttcccatgtc tgccctctac 3360
tcatggtcta tctctcctgg ctcctgggag tcatggactc cacccagcac caccaacctg 3420
acctaaccac ctatctgagc ctgccagcct ataacccatc tgggccctga tagctggtgg 3480
ccagccctga ccccacccca ccctccctgg aacctctgat agacacatct ggcacaccag 3540
ctcgcaaagt caccgtgagg gtcttgtgtt tgctgagtca aaattccttg aaatccaagt 3600
ccttagagac tcctgctccc aaatttacag tcatagactt cttcatggct gtctccttta 3660
tccacagaat gattcctttg cttcattgcc ccatccatct gatcctcctc atcagtgcag 3720
cacagggccc atgagcagta gctgcagagt ctcacatagg tctggcactg cctctgacat 3780
gtccgacctt aggcaaatgc ttgactcttc tgagctcgga tcccttgagc tcaggaggtc 3840
aaggctgcag tgagacatga tcttgccact gcactccagc ctggacagca gagtgaaacc 3900
ttgcctcacg aaacagaata caaaaacaaa caaacaaaaa actgctccgc aatgcgcttc 3960
cttgatgctc taccacatag gtctgggtac tttgtacaca ttatctcatt gctgttcata 4020
attgttagat taattttgta atattgatat tattcctaga aagctgaggc ctcaagatga 4080
taacttttat tttctggact tgtaatagct ttctcttgta ttcaccatgt tgtaactttc 4140
ttagagtagt aacaatataa agttattgtg agtttttgca aacacagcaa acacaacgac 4200
ccatatagac attgatgtga aattgtctat tgtcaattta tgggaaaaca agtatgtact 4260
ttttctacta agccattgaa acaggaataa cagaacaaga ttgaaagaat acattttccg 4320
aaattacttg agtattatac aaagacaagc acgtggacct gggaggaggg ttattgtcca 4380
tgactggtgt gtggagacaa atgcaggttt ataatagatg ggatggcatc tagcgcaatg 4440
actttgccat cacttttaga gagctcttgg gggccccagt acacaagagg ggacgcaggg 4500
tatatgtaga catctcattc tttttcttag tgtgagaata agaatagcca tgacctgagt 4560
ttatagacaa tgagcccttt tctctctccc actcagcagc tatgagatgg cttgccctgc 4620
ctctctacta ggctgactca ctccaaggcc cagcaatggg cagggctctg tcagggcttt 4680
gatagcacta tctgcagagc cagggccgag aaggggtgga ctccagagac tctccctccc 4740
attcccgagc agggtttgct tatttatgca tttaaatgat atatttattt taaaagaaat 4800
aacaggagac tgcccagccc tggctgtgac atggaaacta tgtagaatat tttgggttcc 4860
attttttttt ccttctttca gttagaggaa aaggggctca ctgcacatac actagacaga 4920
aagtcaggag ctttgaatcc aagcctgatc atttccatgt catactgaga aagtccccac 4980
ccttctctga gcctcagttt ctctttttat aagtaggagt ctggagtaaa tgatttccaa 5040
tggctctcat ttcaatacaa aatttccgtt tattaaatgc atgagcttct gttactccaa 5100
gactgagaag gaaattgaac ctgagactca ttgactggca agatgtcccc agaggctctc 5160
attcagcaat aaaattctca ccttcaccca ggcccactga gtgtcagatt tgcatgcgga 5220
t 5221
<210> 51
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 外显子1 (HBG17101-7152; sGbGm反向链1735-1834)
<400> 51
cttcccaggg tttctcctcc agcatcttcc acattcacct tgtcccacag gcttgtgata 60
gtagccttgt cctcctctgt gaaatgaccc atggtgtctg 100
<210> 52
<211> 223
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 外显子2 (HBG17323-7545; sGbGm反向链1612-1320)
<400> 52
cttgaagttc tcaggatcca catgcagctt gtcacagtgc agttcactca gctgggcaaa 60
ggtgcccttg agatcatcca ggtgctttat ggcatctccc aaggaagtca gcaccttctt 120
gccatgtgcc ttgactttgg ggttgcccat gatggcagag gcagaggaca ggttgccaaa 180
gctgtcaaag aacctctggg tccatgggta gacaaccagg agc 223
<210> 53
<211> 216
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 外显子3 (HBG1 8412-8627; sGbGm反向链698-913)
<400> 53
gtgatctctc agcagaatag atttattatt tgtattgctt gcagaataaa gcctatcctt 60
gaaagctctg aatcatgggc aagaggctca gtggtatctg gaggacaggg cactggccac 120
tgcagtcacc atcttctgcc aggaagcctg cacctcaggg gtgaattctt tgccaaagtg 180
aatggccagc acggtgacca gcacgttgcc caggag 216
<210> 54
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 7SK-sh734序列盒
<400> 54
atcgacgtgc agtatttagc atgccccacc catctgcaag gcattctgga tagtgtcaaa 60
acagccggaa atcaagtccg tttatctcaa actttagcat tttgggaata aatgatattt 120
gctatgctgg ttaaattaga ttttagttaa atttcctgct gaagctctag tacgataagt 180
aacttgacct aagtgtaaag ttgagatttc cttcaggttt atatagcttg tgcgccgcct 240
gggtacctca ggatatgccc ttgactattt gtccgacata gtcaagggca tatccttttt 300
tgt 303
<210> 55
<211> 539
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: sGbGm A γ-珠蛋白 5-3 互补链
<400> 55
cagacaccat gggtcatttc acagaggagg acaaggctac tatcacaagc ctgtgggaca 60
aggtgaatgt ggaagatgct ggaggagaaa ccctgggaag gctcctggtt gtctacccat 120
ggacccagag gttctttgac agctttggca acctgtcctc tgcctctgcc atcatgggca 180
accccaaagt caaggcacat ggcaagaagg tgctgacttc cttgggagat gccataaagc 240
acctggatga tctcaagggc acctttgccc agctgagtga actgcactgt gacaagctgc 300
atgtggatcc tgagaacttc aagctcctgg gcaacgtgct ggtcaccgtg ctggccattc 360
actttggcaa agaattcacc cctgaggtgc aggcttcctg gcagaagatg gtgactgcag 420
tggccagtgc cctgtcctcc agataccact gagcctcttg cccatgattc agagctttca 480
aggataggct ttattctgca agcaatacaa ataataaatc tattctgctg agagatcac 539
<210> 56
<211> 769
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: REV应答元件 (RRE)
<400> 56
aggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat 60
tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag 120
agcagtggga ataggagctt tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg 180
cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca 240
gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg 300
gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca 360
gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa 420
tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg 480
ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa 540
ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa 600
ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg 660
cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg 720
atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggaccg 769
<210> 57
<211> 3055
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 基因座控制区
<400> 57
gtatgtgagc atgtgtcctc taacagcaca ggccttttgc cacctagctg tccaggggtg 60
ccttaaaatg gcaaacaagg tttgttttct tttcctgttt tcatgccttc ctcttccata 120
tccttgtttc atattaatac atgtgtatag atcctaaaaa tctatacaca tgtattaata 180
aagcctgatt ctgccgcttc taggtataga ggccacctgc aagataaata tttgattcac 240
aataactaat cattctatgg caattgataa caacaaatat atatatatat atatatatac 300
gtatatgtgt atatatatat atatattcag gaaataatat attctagaat atgtcacatt 360
ctgtctcagg catccatttt ctttatgatg ccgtttgagg tggagtttta gtcaggtggt 420
cagcttctcc ttttttttgc catctgccct gtaagcatcc tgctggggac ccagatagga 480
gtcatcactc taggctgaga acatctgggc acacacccta agcctcagca tgactcatca 540
tgactcagca ttgctgtgct tgagccagaa ggtttgctta gaaggttaca cagaaccaga 600
aggcgggggt ggggcactga ccccgacagg ggcctggcca gaactgctca tgcttggact 660
atgggaggtc actaatggag acacacagaa atgtaacagg aactaaggga attccggtgc 720
cctgcttagg agcttaatct ttaatgaaag ctaagctttc attaaaaaaa gtctaaccag 780
ctgcattcga ctttgactgc agcagctggt tagaaggttc tactggagga gggtcccagc 840
ccattgctaa attaacatca ggctctgaga ctggcagtat atctctaaca gtggttgatg 900
ctatcttctg gaacttgcct gctacattga gaccactgac ccatacatag gaagcccata 960
gctctgtcct gaactgttag gccactggtc cagagagtgt gcatctcctt tgatcctcat 1020
aataacccta tgagatagac acaattatta ctcttacttt atagatgatg atcctgaaaa 1080
cataggagtc aaggcacttg cccctagctg ggggtatagg ggagcagtcc catgtagtag 1140
tagaatgaaa aatgctgcta tgctgtgcct cccccacctt tcccatgtct gccctctact 1200
catggtctat ctctcctggc tcctgggagt catggactcc acccagcacc accaacctga 1260
cctaaccacc tatctgagcc tgccagccta taacccatct gggccctgat agctggtggc 1320
cagccctgac cccaccccac cctccctgga acctctgata gacacatctg gcacaccagc 1380
tcgcaaagtc accgtgaggg tcttgtgttt gctgagtcaa aattccttga aatccaagtc 1440
cttagagact cctgctccca aatttacagt catagacttc ttcatggctg tctcctttat 1500
ccacagaatg attcctttgc ttcattgccc catccatctg atcctcctca tcagtgcagc 1560
acagggccca tgagcagtag ctgcagagtc tcacataggt ctggcactgc ctctgacatg 1620
tccgacctta ggcaaatgct tgactcttct gagctcggat cccttgagct caggaggtca 1680
aggctgcagt gagacatgat cttgccactg cactccagcc tggacagcag agtgaaacct 1740
tgcctcacga aacagaatac aaaaacaaac aaacaaaaaa ctgctccgca atgcgcttcc 1800
ttgatgctct accacatagg tctgggtact ttgtacacat tatctcattg ctgttcataa 1860
ttgttagatt aattttgtaa tattgatatt attcctagaa agctgaggcc tcaagatgat 1920
aacttttatt ttctggactt gtaatagctt tctcttgtat tcaccatgtt gtaactttct 1980
tagagtagta acaatataaa gttattgtga gtttttgcaa acacagcaaa cacaacgacc 2040
catatagaca ttgatgtgaa attgtctatt gtcaatttat gggaaaacaa gtatgtactt 2100
tttctactaa gccattgaaa caggaataac agaacaagat tgaaagaata cattttccga 2160
aattacttga gtattataca aagacaagca cgtggacctg ggaggagggt tattgtccat 2220
gactggtgtg tggagacaaa tgcaggttta taatagatgg gatggcatct agcgcaatga 2280
ctttgccatc acttttagag agctcttggg ggccccagta cacaagaggg gacgcagggt 2340
atatgtagac atctcattct ttttcttagt gtgagaataa gaatagccat gacctgagtt 2400
tatagacaat gagccctttt ctctctccca ctcagcagct atgagatggc ttgccctgcc 2460
tctctactag gctgactcac tccaaggccc agcaatgggc agggctctgt cagggctttg 2520
atagcactat ctgcagagcc agggccgaga aggggtggac tccagagact ctccctccca 2580
ttcccgagca gggtttgctt atttatgcat ttaaatgata tatttatttt aaaagaaata 2640
acaggagact gcccagccct ggctgtgaca tggaaactat gtagaatatt ttgggttcca 2700
tttttttttc cttctttcag ttagaggaaa aggggctcac tgcacataca ctagacagaa 2760
agtcaggagc tttgaatcca agcctgatca tttccatgtc atactgagaa agtccccacc 2820
cttctctgag cctcagtttc tctttttata agtaggagtc tggagtaaat gatttccaat 2880
ggctctcatt tcaatacaaa atttccgttt attaaatgca tgagcttccg ttactccaag 2940
actgagaagg aaattgaacc tgagactcat tgactggcaa gatgtcccca gaggctctca 3000
ttcagcaata aaattctcac cttcacccag gcccactagt gtcagatttg catgc 3055
<210> 58
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: Agosh 734 5-3
<400> 58
atagtcaagg gcatatcctc aagaaggata tgcccttgac tac 43
<210> 59
<211> 1435
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 智人次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1 (HPRT1), mRNA
<400> 59
ggcggggcct gcttctcctc agcttcaggc ggctgcgacg agccctcagg cgaacctctc 60
ggctttcccg cgcggcgccg cctcttgctg cgcctccgcc tcctcctctg ctccgccacc 120
ggcttcctcc tcctgagcag tcagcccgcg cgccggccgg ctccgttatg gcgacccgca 180
gccctggcgt cgtgattagt gatgatgaac caggttatga ccttgattta ttttgcatac 240
ctaatcatta tgctgaggat ttggaaaggg tgtttattcc tcatggacta attatggaca 300
ggactgaacg tcttgctcga gatgtgatga aggagatggg aggccatcac attgtagccc 360
tctgtgtgct caaggggggc tataaattct ttgctgacct gctggattac atcaaagcac 420
tgaatagaaa tagtgataga tccattccta tgactgtaga ttttatcaga ctgaagagct 480
attgtaatga ccagtcaaca ggggacataa aagtaattgg tggagatgat ctctcaactt 540
taactggaaa gaatgtcttg attgtggaag atataattga cactggcaaa acaatgcaga 600
ctttgctttc cttggtcagg cagtataatc caaagatggt caaggtcgca agcttgctgg 660
tgaaaaggac cccacgaagt gttggatata agccagactt tgttggattt gaaattccag 720
acaagtttgt tgtaggatat gcccttgact ataatgaata cttcagggat ttgaatcatg 780
tttgtgtcat tagtgaaact ggaaaagcaa aatacaaagc ctaagatgag agttcaagtt 840
gagtttggaa acatctggag tcctattgac atcgccagta aaattatcaa tgttctagtt 900
ctgtggccat ctgcttagta gagctttttg catgtatctt ctaagaattt tatctgtttt 960
gtactttaga aatgtcagtt gctgcattcc taaactgttt atttgcacta tgagcctata 1020
gactatcagt tccctttggg cggattgttg tttaacttgt aaatgaaaaa attctcttaa 1080
accacagcac tattgagtga aacattgaac tcatatctgt aagaaataaa gagaagatat 1140
attagttttt taattggtat tttaattttt atatatgcag gaaagaatag aagtgattga 1200
atattgttaa ttataccacc gtgtgttaga aaagtaagaa gcagtcaatt ttcacatcaa 1260
agacagcatc taagaagttt tgttctgtcc tggaattatt ttagtagtgt ttcagtaatg 1320
ttgactgtat tttccaactt gttcaaatta ttaccagtga atctttgtca gcagttccct 1380
tttaaatgca aatcaataaa ttcccaaaaa tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1435
<210> 60
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: miRNA 451发夹序列
<400> 60
aaaccgttac cattactgag tttagtaatg gtaatggttc tc 42
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 用于敲低人HPRT的sgRNA候选物
<400> 61
gttatggcga cccgcagccc tgg 23
<210> 62
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 来自靶CCR5基因区域的左同源臂
<400> 62
gcttcttctc tggaatcttc ttcatcatcc tcctgacaat cgataggtac ctggctgtcg 60
tccatgctgt gtttgcttta aaagccagga cggtcacctt tggggtggtg acaagtgtga 120
tcacttgggt ggtggctgtg tttgcgtctc aagcttttcg aagcggccgc ggatatcggc 180
tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tc 212
<210> 63
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 来自靶CCR5基因区域的左同源臂
<400> 63
aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat 60
catctacgcg tccaggaatc atctttacca gatctcaaaa agaaggtctt cattacacct 120
gcagctctca ttttccatac agtcagtatc aattctggaa gaatttccag acattaaaga 180
tagtcatctt ggggctggtc ctgccgctgc ttgtcatggt c 221
<210> 64
<211> 238
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: EF1a启动子
<400> 64
ggatatcggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa 60
gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg 120
ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat 180
aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacagg 238
<210> 65
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: SV40启动子
<400> 65
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
tatcatct 128
<210> 66
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: β-珠蛋白启动子
<400> 66
ggtgtctgtt tgaggttgct agtgaacaca gttgtgtcag aagcaaatgt aagcaataga 60
tggctctgcc ctgactttta tgcccag 87
<210> 67
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: miRNA734 de novo (DNA形式)
<400> 67
acccgtacat atttttgtgt agctctagtt tatagtcaag ggcatatcct tgtgtttttt 60
ttgaaggata tgcccttgac tataaactag cgctacactt tttcgtcttg t 111
<210> 68
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: miRNA211 de novo (DNA形式)
<400> 68
acccgtacat atttttgtgt agctctagtt ataaatcaag gtcataacct tgtgtttttt 60
ttgaaggtta tgaccttgat ttataactag cgctacactt tttcgtcttg t 111
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 用于敲低人HPRT的sgRNA候选物
<400> 69
gcgggtcgcc ataacggagc cgg 23

Claims (54)

1.载体，其包含：可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的RNAi；和可操作地连接至第二核酸序列的第二表达控制序列，所述第二核酸序列编码γ-珠蛋白基因。
2.权利要求1的载体，其中所述RNAi为shRNA。
3.权利要求2的载体，其中所述shRNA包含SEQ ID NO:35的发夹环序列。
4.权利要求2的载体，其中所述shRNA与SEQ ID NO:30的序列具有至少95％序列同一性。
5.权利要求4的载体，其中所述shRNA具有SEQ ID NO:30的序列。
6.权利要求2的载体，其中所述shRNA与从由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ IDNO:29组成的组中选择的核酸序列具有至少95％序列同一性。
7.权利要求2的载体，其中所述shRNA与从由SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68组成的组中选择的核酸序列具有至少95％序列同一性。
8.权利要求2的载体，其中所述shRNA与从由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27组成的组中选择的核酸序列具有至少95％序列同一性。
9.权利要求2的载体，其中所述shRNA与SEQ ID NO:59的序列具有至少95％序列同一性。
10.前述权利要求中任一项的载体，其中所述第一表达控制序列为PolIII启动子。
11.权利要求10的载体，其中所述PolIII启动子为7sk。
12.权利要求11的载体，其中所述7sk启动子与SEQ ID NO:32的序列具有至少95％序列同一性。
13.权利要求12的载体，其中所述7sk启动子具有SEQ ID NO:32的序列。
14.权利要求11的载体，其中所述7sk启动子具有SEQ ID NO:33的序列。
15.前述权利要求中任一项的载体，其中编码所述γ-珠蛋白基因的所述第二核酸与SEQ ID NO:55的序列具有至少95％序列同一性。
16.前述权利要求中任一项的载体，其中编码所述γ-珠蛋白基因的所述第二核酸具有SEQ ID NO:55。
17.前述权利要求中任一项的载体，其中所述第二表达控制序列为polII启动子。
18.权利要求17的载体，其中所述polII启动子为β-珠蛋白启动子。
19.权利要求18的载体，其中所述β-珠蛋白启动子与SEQ ID NO:66的序列具有至少95％同一性。
20.前述权利要求中任一项的载体，其中所述第一核酸编码具有SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的核酸分子。
21.前述权利要求中任一项的载体，其中所述第二核酸编码具有SEQ ID NO:3的核酸分子。
22.前述权利要求中任一项的载体，其中所述第二核酸编码与SEQ ID NO:4的序列具有至少95％同一性的多肽。
23.前述权利要求中任一项的载体，其中所述载体为自失活慢病毒载体。
24.前述权利要求中任一项的载体，其进一步包含cSH4绝缘子。
25.权利要求1的载体，其与SEQ ID NO:5至22中的任一个具有至少95％序列同一性。
26.权利要求1的载体，其中所述第二核酸序列编码与SEQ ID NO:4的序列具有至少98％同一性的多肽；并且所述第一核酸序列编码与SEQ ID NO:1的序列或其互补序列具有至少98％同一性的核酸分子。
27.药用组合物，其包含权利要求1至26中任一项的载体和在药学上可接受的载料。
28.分离的细胞，其包含权利要求1至26中任一项的载体。
29.用根据权利要求1至26中任一项的载体进行转导的宿主细胞，其中所述宿主细胞实质上是HPRT缺陷的。
30.权利要求29的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达所述γ-珠蛋白基因。
31.权利要求29的宿主细胞，其中将所述宿主细胞与在药学上可接受的载料一起进行配制。
32.权利要求29至31中任一项的宿主细胞，其用于在治疗镰状细胞病中进行使用或者用于减轻镰状细胞病的症状。
33.用于选择经转导的细胞的方法，所述方法包括：用根据权利要求1至26中任一项的载体转导细胞群体；和通过用嘌呤类似物选择经转导的细胞来富集经转导的细胞的群体。
34.权利要求33的方法，其中所述嘌呤类似物选自由6TG和6-巯基嘌呤组成的组。
35.权利要求33的方法，其中所述经转导的细胞为HSC。
36.权利要求33的方法，其中所述HSC为同种异体HSC。
37.权利要求33的方法，其中所述HSC为自体HSC。
38.权利要求33的方法，其中所述HSC为同胞匹配HSC。
39.通过用慢病毒表达载体转导造血干细胞而制备出的宿主细胞，所述慢病毒表达载体包含编码抗-HPRT shRNA的第一核酸序列和编码γ-珠蛋白基因的第二核酸序列。
40.权利要求39的宿主细胞，其中所述慢病毒表达载体具有与SEQ ID NO:5至22中的任一个具有至少95％同一性的序列。
41.药用组合物，其包含权利要求39和40中任一项的宿主细胞和在药学上可接受的载料。
42.宿主细胞，其包含：(i)具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸分子；和(ii)具有SEQ ID NO:3的核酸分子。
43.用于治疗镰状细胞病的方法，所述方法包括向有其治疗需要的患者施用权利要求29、30、39和40中任一项的宿主细胞。
44.用于减轻镰状细胞病的症状的方法，所述方法包括向有其治疗需要的患者施用权利要求29、30、39和40中任一项的宿主细胞。
45.用于减轻严重镰状细胞病的症状的方法，所述方法包括向有其治疗需要的患者施用权利要求29、30、39和40中任一项的宿主细胞。
46.用于治疗血红蛋白病的方法，所述方法包括向有其治疗需要的患者施用权利要求29、30、39和40中任一项的宿主细胞。
47.用于治疗β-地中海贫血的方法，所述方法包括向有其治疗需要的患者施用权利要求29、30、39和40中任一项的宿主细胞。
48.用于在人患者中治疗镰状细胞病或者减轻镰状细胞病的至少一种症状的方法，所述方法包括：(a)用慢病毒表达载体转导造血细胞，其中所述慢病毒表达载体包含编码抗-HPRT shRNA的第一核酸序列和编码γ-珠蛋白基因的第二核酸序列；和(b)将经转导的造血细胞引入到人患者中。
49.权利要求48的方法，所述方法进一步包括在引入经转导的造血细胞之前对所述患者进行调理，其中所述调理包括施用化学疗法、放射疗法或者采用一种或多种抗体-药物缀合物的治疗。
50.权利要求48的方法，其中所述治疗进一步包括在移植之后施用一个或多个剂量的羟基脲。
51.用于增加胎儿血红蛋白水平的方法，所述方法包括向有其治疗需要的患者施用权利要求29、30、39和40中任一项的宿主细胞。
52.宿主细胞，其是HPRT缺陷的并且其表达具有SEQ ID NO:4的多肽，其中所述宿主细胞通过用权利要求1至26中任一项的载体转导HSC来制备。
53.宿主细胞，其包含：(i)具有SEQ ID NO:3的核酸分子或具有SEQ ID NO:4的多肽中的至少一种；和(ii)具有SEQ ID NO:1的核酸分子或具有SEQ ID NO:2的核酸分子中的至少一种。
54.权利要求53的宿主细胞，其中所述宿主细胞通过使HSC与权利要求1至26中任一项的载体相接触来制备。
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