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CN111164102A - 用亚硒酸防止细胞培养收获物中的二硫键还原的方法 - Google Patents

用亚硒酸防止细胞培养收获物中的二硫键还原的方法 Download PDF

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CN111164102A
CN111164102A CN201880064558.2A CN201880064558A CN111164102A CN 111164102 A CN111164102 A CN 111164102A CN 201880064558 A CN201880064558 A CN 201880064558A CN 111164102 A CN111164102 A CN 111164102A
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Bayer Healthcare LLC
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Abstract

本公开内容涉及用于防止重组宿主细胞中表达的多肽中二硫键还原的方法，其包括在发酵后将亚硒酸和/或其盐或衍生物添加到重组宿主细胞的收获物溶液，其中多肽中的二硫键保持非还原的。

Description

用亚硒酸防止细胞培养收获物中的二硫键还原的方法
发明背景
生物制药业使用细胞培养产生多种治疗性蛋白质。多种细胞类型(包括原核生物和真核生物两者)可以用于表达重组治疗性蛋白质。生物制药业严重依赖于哺乳动物细胞，这是由于它们具有产生正确折叠且翻译后修饰的蛋白质的能力。制造治疗性蛋白质通常通过在生物反应器中培养细胞开始。监测各种营养物和工艺参数，以确保最佳的细胞生长和蛋白质生产。治疗性蛋白质通常是分泌的，因此收获蛋白质的第一步是除去细胞。在生物反应器中以及细胞除去期间，细胞可能裂解，释放可改变或降解重组蛋白的成分。例如，收获物中的酶和其他成分可以还原二硫键。由于完整的二硫键对于维持蛋白质的结构和功能是至关重要的，因此，防止二硫键还原的方法引起了极大的兴趣。
发明概述
实施方案提供了用于防止重组宿主细胞中表达的多肽中的二硫键还原的方法，该方法包括在发酵后将亚硒酸(selenite)、其盐和/或衍生物添加到重组宿主细胞的收获物溶液，其中所述多肽中的所述二硫键保持非还原的。
附图简述
本领域技术人员将理解，以下描述的附图是仅用于说明目的。附图无意以任何方式限制本教导或权利要求书的范围。
图1显示了使用项目1收获物(表达IgG2的CHOK1-SV细胞)和不同浓度的亚硒酸钠(pH 7.0)进行的二硫化物还原测定法。
图2显示了使用项目2收获物(表达IgG1的CHO-M细胞)和不同浓度的亚硒酸钠(pH7.0)进行的二硫化物还原测定法。
图3显示了使用TFPI收获物和细胞的最小程度裂解进行的第一实验的结果。
图4显示了使用TFPI收获物和完全裂解的细胞进行的第二实验的结果。
发明详述
本公开提供了与防止多肽的二硫键还原相关的方法。
定义
只要适当，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。若以下列出的任何定义与任何其他文件(包括通过引用并入本文的任何文件)中该词的用法相冲突，则应当始终以下文列出的定义为准以解释本说明书及其相关权利要求书，除非明确意图相反的意义(例如，在最初使用术语的文件中)。除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。除非另有说明或者在使用“一个/种或多个/种”明显不合适的情况下，本文中使用“一个/种”表示“一个/种或多个/种”。“包含”或“包括”的使用是可互换的，并且不是限制性的。例如，术语“包括”应表示“包括但不限于”。
如本文所用，术语“TFPI”是指其由细胞天然表达并存在于血浆中的形式的TFPI的任何变体、同等型和/或物种同源物。
如本文所用，术语“TFPI”是指如本文所用的TFPI的活化形式，“抗体”是指完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。该术语包括通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程自然发生或形成的全长免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)，或保留特异性结合活性的免疫球蛋白分子的免疫活性部分，如抗体片段。无论结构如何，抗体片段与由全长抗体识别的相同抗原结合。例如，抗TFPI单克隆抗体片段结合TFPI的表位。抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。术语抗体的“抗原结合部分”内所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含两个通过铰链区处的二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH域组成的Fv片段，(v)由VH域组成的dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；(vii)迷你抗体(minibodies)、双抗体(diaboidies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)和κ体(kappa bodies)(参见例如Ill et al.,Protein Eng 1997；10:949-57)；(viii)骆驼IgG；和(ix)IgNAR。此外，尽管Fv片段的两个域VL和VH由不同的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接，所述合成接头使它们能够作为一条蛋白链制备，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.(1988)Science 242:423-426；和Huston et al(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也意图包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式分析片段的效用。
此外，考虑到抗原结合片段可以包含在抗体模拟物中。如本文所用，术语“抗体模拟物”或“模拟物”是指表现出与抗体相似的结合但为较小替代抗体或非抗体蛋白质的蛋白质。此类抗体模拟物可以包含在支架中。术语“支架”是指用于工程化改造具有定制功能和特征的新产品的多肽平台。
如本文所用，术语“抗TFPI抗体”是指特异性结合及其肝素相关复合物的表位的抗体。当体内结合TFPI的表位时，本文公开的抗TFPI抗体增强血液凝结级联的一个或多个方面。
如本文所用，术语“抑制结合”和“阻断结合”(例如，指抑制/阻断TFPI底物与TFPI的结合)可互换使用，并且涵盖蛋白质与其底物的部分和完全抑制或阻断两者，例如抑制或阻断至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。如本文所用，“约”是指所指示的数值的+/-10％。
就对TFPI底物与TFPI的结合的抑制和/或阻断而言，术语抑制和阻断还包括与不与抗TFPI抗体接触的TFPI相比，当与抗TFPI抗体接触时，TFPI与生理底物的结合亲和力的任何可测量的降低，例如，将TFPI与其底物的相互作用阻断至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的显示单一结合特异性的抗体。人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)。
如本文所用，“分离的抗体”意指基本上不含其他生物分子的抗体，所述其他生物分子包括具有不同抗原特异性的抗体(例如，结合TFPI的分离的抗体基本上不含结合TFPI外的抗原的抗体)。在一些实施方案中，分离的抗体以干重计为至少约75％、约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约99.9％或约100％纯的。在一些实施方案中，可以通过诸如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析的方法来测量纯度。然而，结合人TFPI的表位、同等型或变体的分离的抗体可以与例如来自其他物种的其他相关抗原(例如，TFPI物种同源物)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用，“特异性结合”是指抗体与预定抗原的结合。通常，表现出“特异性结合”的抗体以至少约10-5M-1的亲和力结合抗原，并以比其对无关抗原(例如BSA，酪蛋白)的结合亲和力高，例如大至少两倍的亲和力结合该抗原。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异性的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。如本文所用，术语“最小程度结合”是指不结合规定抗原和/或表现出对规定抗原的低亲和力的抗体。通常，对抗原具有最小程度结合的抗体以低于约102M-1的亲和力结合该抗原，并且不以比其结合无关抗原更高的亲和力结合预定抗原。
如本文所用，抗体(例如IgG抗体)的术语“高亲和力”指至少约10-7M，在至少一个实施方案中至少约10-8M，在一些实施方案中，至少约109M-1、1010M-1、1011M-1或更大，例如高达1013M-1或更大的结合亲和力。然而，“高亲和力”结合对于其他抗体同种型可以有所不同。例如，IgM同种型的“高亲和力”结合指至少约107M-1的结合亲和力。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。
“互补决定区”或“CDR”是指抗体分子的重链可变区或轻链可变区内的三个高变区之一，其形成与结合的抗原的三维结构互补的N端抗原结合表面。从重链或轻链的N端开始，这些互补决定区分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”[Wu TT,Kabat EA,Bilofsky H,ProcNatl Acad Sci U S A.1975 Dec；72(12):5107和Wu TT,Kabat EA,J Exp Med.1970 Aug1；132(2):211]。CDR参与抗原-抗体结合，并且CDR3包含对抗原-抗体结合特异性的独特区域。因此，抗原结合位点可以包含六个CDR，其包含来自重链和轻链V区中每个的CDR区。术语“表位”是指与抗体特异性结合或相互作用的抗原区或区域，在一些实施方案中，其指示抗原与抗体物理接触的位置。相反，术语“互补位”是指抗体上与抗原特异性结合的区或区域。若相应抗体的结合是相互排斥的，即一种抗体的结合排除另一种抗体的同时结合，则认为以竞争结合为特征的表位是重叠的。若抗原能够同时容纳这两种相应抗体的结合，则认为表位是分开的(独特的)。
如本文所用，术语“竞争性抗体”是指与如本文所述的针对TFPI的抗体结合大致、基本上或实质上相同、或甚至相同的表位的抗体。“竞争性抗体”包括具有重叠表位特异性的抗体。因此，竞争性抗体能够与本文所述的抗体有效竞争与TFPI的结合。在一些实施方案中，竞争性抗体可以与本文所述的抗体结合相同的表位。或者，竞争性抗体与本文所述的抗体具有相同的表位特异性。
如本文所用，“保守取代”是指涉及将一个或多个氨基酸替换为具有相似的生化特性的氨基酸且不导致多肽的生物学或生化功能丧失的多肽修饰。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的取代。已经在本领域中定义具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
本公开的抗体可以具有一个或多个保守氨基酸取代，但保留抗原结合活性。
对于核酸和多肽，术语“实质同源性”指示当最佳比对和比较时，两个核酸或两个多肽或其指定的序列在至少约80％的核苷酸或氨基酸，通常至少约85％，在一些实施方案中约90％、91％、92％、93％、94％或95％，在至少一个实施方案中至少约96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％或99.5％的核苷酸或氨基酸中在适当的核苷酸或氨基酸插入/缺失的情况下是相同的。或者，当区段将在选择性杂交条件下与链的互补物杂交时，存在核酸的实质性同源性。还包括与本文所述的特定核酸序列和氨基酸序列具有实质性同源性的核酸序列和多肽序列。两个序列之间的同一性百分比是该序列共享的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同位置数/位置总数x 100)，考虑缺口的数目和每个缺口的长度，它们需要被引入以实现两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成，例如但不限于VectorNTITM的AlignXTM模块(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)。对于AlignXTM，多重比对的默认参数为：缺口开放罚分：10；缺口延伸罚分：0.05；空位分离罚分范围：8；比对延迟的同一性％：40。(更多细节参见http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEACommunities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html)。
可以使用CLUSTALW计算机程序(Thompson et al.,Nucleic Acids Research,1994,2(22):4673-4680)确定另一种用于确定查询序列(本公开内容的序列)和主题序列之间最佳匹配的方法，也称为全局序列比对，所述CLUSTALW计算机程序基于Higgins等人(Computer Applications in the Biosciences(CABIOS),1992,8(2):189-191)的算法。在序列比对中，查询序列和主题序列都是DNA序列。所述全局序列比对的结果以同一性百分比计。可用于DNA序列的CLUSTALW比对以通过成对比对计算同一性百分比的参数为：矩阵＝IUB，k元组＝1，顶部对角线数目＝5，缺口罚分＝3，缺口开放罚分＝10，缺口延伸处罚＝0.1。对于多重比对，可以使用以下CLUSTALW参数：缺口开放罚分＝10，缺口延伸参数＝0.05；缺口分离罚分范围＝8；比对延迟的同一性％＝40。
核酸可以在完整细胞中，在细胞裂解物中或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当从天然环境中通常与之结合的其他细胞组分中纯化出来时，核酸是“分离的”或“呈基本纯的”。为了分离核酸，可以使用诸如以下各项的标准技术：碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析。
如本文所用，术语“约”是指所提供的单位值的+/-10％。
如本文所用，术语“基本上”是指表现出感兴趣的特征或特性的整体或近似程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，由于许多影响生物学、化学成分和材料的测试、生产和贮存的变量，且由于用于测试、生产和贮存生物和化学成分和材料的仪器和设备的固有错误，生物学和化学现象很少(若有的话)获得或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性缺乏。
实施例1-材料
使用标准制造程序生产细胞培养液。简言之，将表达抗体的CHO细胞在摇瓶中培养，直到达到足以接种2L或5L玻璃搅拌釜生物反应器的细胞数目。接种后，控制溶解氧、pH、温度和搅拌速率，并分析每日样品以确保准确性。接种后2天开始连续添加浓缩的营养给料，并根据需要添加葡萄糖溶液以提供足够的营养物。接种后14天收获细胞培养液。除非另有说明，所有试剂均获自Sigma Aldrich。MabSelect Sure树脂获自GE Healthcare LifeSciences。
实施例2小规模还原测定法
将收获的细胞培养液放入装有氮气的手套袋(Atmosbag，Sigma)中。将40mL的收获物倒入冰上的50mL锥形管中，并且冷却20分钟。然后，将收获物以功率3在冰上超声处理(Sonic Dismembrator 100型,Fisher Scientific)60秒。此设置导致约99％的细胞裂解。将锥形管紧紧封闭，从袋中取出，并以4000x g离心15分钟。然后，将管放回袋中，并用氮气再次吹扫。将裂解的细胞上清液用0.45um无菌滤器(Milipore)过滤并转移到96深孔板中。将裂解的细胞上清液在室温在不暴露于氧气的情况下温育。在每个时间点，将200uL样品用17.4uL 250mM NEM淬灭以对所有游离硫醇加帽。在4℃贮存经淬灭的样品直至纯化和/或分析。为了测试抑制剂，在温育开始时将3M亚硒酸钠的储备溶液(pH 7.0)添加到裂解的细胞上清液中，以达到范围为0至190mM的浓度。添加抑制剂后，在0、24和48小时采集样品并淬灭。
实施例3-批次蛋白A纯化
使用MabSelect Sure亲和树脂从收获的细胞培养液中纯化抗体。平衡缓冲剂是50mM Tris，50mM NaCl，pH 7.0。洗涤缓冲剂是50mM乙酸钠，1M NaCl，pH 5.2。洗脱缓冲剂是50mM乙酸钠，pH 3.7，并且中和缓冲剂是1M Tris，pH 8.0。在96孔过滤板中，将20uL树脂浆体(平衡缓冲剂中的50％v/v)与170uL经淬灭的收获的细胞培养液合并。将板温育30分钟，然后离心，96孔板在下面以捕获流通物，该流通物被弃去。所有离心步骤均以4000x g进行10分钟。用120uL洗涤缓冲剂洗涤树脂，离心，然后用120uL平衡缓冲剂洗涤并再次离心。在两个洗涤步骤之后，将50uL洗脱缓冲剂添加到过滤板并温育3分钟。准备具有28uL中和缓冲剂的干净的96孔板，并且用于收集洗脱液。通过上下吸液混合抗体溶液，然后保存在-70℃直至分析。
实施例4-测径器测定法
使用Caliper LabChip GX II获得毛细管电泳测量。根据制造商的说明进行样品制备。使用LabChip GX软件生成数字凝胶样图像。
通过在无氧环境中完全裂解收获的细胞培养液来研究还原。这使细胞内还原性成分的释放最大化，使氧干扰最小化，并防止氧对二硫化物的再氧化。这允许可能在“最坏情况”或大多数还原条件下测试还原抑制剂。通过从裂解的细胞液中纯化抗体并使用非还原毛细管电泳对其进行分析，随时间监测抗体二硫化物还原，所述非还原毛细管电泳基于大小分离蛋白质并能够检测链间二硫键断裂。
为了测试亚硒酸防止二硫化物还原的有效性，将各种浓度的亚硒酸钠添加到项目1(表达IgG2的CHOK1-SV细胞)和项目2(表达IgG2的CHOK1-SV细胞)的厌氧裂解细胞培养收获物中，并且图1和图2中显示了结果。防止还原达24小时的亚硒酸的最小浓度为0.2-0.3mM(对于项目1)和0.8-1.6mM(对于项目2)。为了防止项目2还原，需要更高的亚硒酸浓度。这可以是由于IgG1分子比IgG2分子更易于还原或者两种细胞系中还原酶的表达差异。该测定法测量在大多数还原条件下所需要的抑制剂浓度(所有细胞内还原性成分得到释放且未引入氧气)。较低的浓度可以足以防止在更现实的澄清收获条件下还原。较高浓度的亚硒酸也是有效的。
明显地，发现通过将亚硒酸钠添加到收获的细胞培养液(HCCF)中来防止抗体二硫化物的还原。亚硒酸是硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶(两种可有助于抗体还原的胞内酶)的底物。这两种酶都需要NADPH来还原二硫化物。亚硒酸可以起到诱饵底物作用。因此，从理论上讲，酶会还原亚硒酸并减少NADPH的供应，然后可以发生抗体还原。
实施例5：实验实验1：
使用深度滤器澄清TFPI细胞培养收获物。将亚硒酸钠的浓缩溶液添加到所得的无细胞收获物中，以达到0、150和500uM的浓度(见图3)。然后，将收获物在氮气下(以防止氧气抑制)保持24小时。氮气保持后，纯化抗体并使用毛细管电泳分析二硫化物还原。500uM亚硒酸而非150uM亚硒酸防止还原。
实验2：
使用超声仪在氮气下裂解TFPI细胞培养收获物。除去细胞碎片，然后添加亚硒酸钠的浓缩溶液以使亚硒酸的浓度达到0至500uM之间(见图4)。将样品在氮气下存储48小时。然后纯化抗体，并使用毛细管电泳分析二硫化物还原。300uM的亚硒酸而非200uM的亚硒酸完全防止还原。因此，在这些收获条件下，需要浓度在200至300uM之间。实验之间的主要区别(测试的亚硒酸浓度外)：实验1使用TFPI收获物进行，该收获物使用深层滤器澄清，并保持24小时。在此澄清过程中，应发生最小程度细胞裂解。实验2用TFPI收获物进行，其中所有细胞都被完全裂解，释放可有助于还原的所有内部组分，并保持48小时。这是抗体还原的最坏情况。在这种最坏的情况下，亚硒酸仍能有效防止还原。
实施方案提供了各种亚硒酸溶液的可能应用。例如，亚硒酸溶液可以包含亚硒酸钠、亚硒酸钾等。它应当在哺乳动物细胞、细菌，酵母等中产生的蛋白质的情况下起作用。它应当在具有二硫键的任何蛋白质，而不仅仅是抗体的情况下起作用。亚硒酸改进防止还原的现有技术(添加金属，添加谷胱甘肽，空气/02喷射等)，因为它不需要专门的设备并且不太可能影响产物稳定性。添加金属以防止还原可以通过诱导蛋白质沉淀(Li,Osborne etal.2012)，氧化(Li,Nguyen et al.1995；Masaraw et al.2009)和/或裂解(Rustandi andWang 2001,Yan and Boyd 2011)负面影响抗体稳定性。用空气或氧气喷射收获物可以增加气液界面处的蛋白质变性和/或聚集(Wiesbauer et al.2013；Rudik et al.2012)。此外，收获物喷射需要专门的收获罐。一旦被收获物中的组分还原，氧化的谷胱甘肽就具有还原二硫键或氧化剂的潜力。
尽管已经参考具体实施方案和实施例描述了本实施方案，但是应当理解，可以在不脱离所附权利要求书的真实精神和范围的情况下进行各种修改和改变并且可以替换等同方案。因此，说明书和实施例应当以说明性的而非限制性的意义考虑。此外，本文引用的所有文章、书籍、专利申请和专利的公开内容通过引用以其整体并入本文。

Claims (16)

1.用于防止重组宿主细胞中表达的多肽中二硫键还原的方法，其包括在发酵后将亚硒酸添加到所述重组宿主细胞的收获物溶液，其中所述多肽中的所述二硫键保持非还原的。
2.权利要求1的方法，其中所述多肽包括抗体。
3.权利要求1的方法，其中所述多肽包括抗体的生物学功能片段。
4.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞包括真核细胞。
5.权利要求4的方法，其中所述真核细胞包括哺乳动物细胞。
6.权利要求5的方法，其中所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
7.权利要求1的方法，其中以0.01-100毫摩尔的范围将亚硒酸添加到所述收获物溶液。
8.权利要求1的方法，其中以0.1-10毫摩尔的范围将亚硒酸添加到所述收获物溶液。
9.权利要求1的方法，其中所述亚硒酸包括选自下组的亚硒酸盐：亚硒酸钙、亚硒酸钠和亚硒酸钾。
10.如权利要求1所述的方法，其进一步包含IgG抗体。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述IgG抗体包括IgG2。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述IgG抗体包括IgG1。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述IgG抗体包括IgG4。
14.权利要求1-3的方法，其进一步包括从收获的细胞培养液(HCCF)中回收所述多肽。
15.权利要求1-3的方法，其进一步包括从收获的细胞培养液(HCCF)中纯化所述多肽。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述亚硒酸是：
(a)呈五水合物形式或无水形式；
(b)以0.01-100毫摩尔之间的浓度添加；
(c)以0.1-10毫摩尔之间的浓度添加；
(d)以0.1-4毫摩尔之间的浓度添加；或
(e)以所述收获前或收获的培养液中所述亚硒酸浓度的至少约两倍的浓度添加。
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