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CN111153909B - 一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法 - Google Patents

一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法 Download PDF

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CN111153909B CN202010051769.1A CN202010051769A CN111153909B CN 111153909 B CN111153909 B CN 111153909B CN 202010051769 A CN202010051769 A CN 202010051769A CN 111153909 B CN111153909 B CN 111153909B
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Abstract

本发明涉及一种药物提取及纯化技术，具体是提供了一种同时高效分离出粉防己甲素与乙素的技术方法；即利用甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁氰等与目标分子粉防己甲素及乙素合成，再洗脱目标分子得到双模板分子印迹聚合物，再利用该聚合物同时提取粉防己中甲素及乙素，再通过反相色谱柱及制备色谱仪进一步分离粉防己甲素及乙素，所得粉防己甲素及乙素纯度均达到99%以上。

Description

一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法
技术领域
本发明涉及一种天然药物原料药的提取及纯化技术，具体是涉及一种利用双模板分子印迹同时提纯粉防己中汉防己甲素、汉防己乙素的技术。
背景技术
粉防己，又叫汉防己、白木香，为防己科植物石蟾蜍的根。粉防己甲素又名汉防己甲素，别名粉防己碱、汉防己碱，为抗高血压药，临床上主要用于治疗轻、中度高血压，亦可用于高血压危象。粉防己乙素则具有抗炎镇痛、降压、抗肿瘤作用。
随着人们对粉防己和其中有效成分的认识加深，粉防己甲素和粉防己乙素得到越来越多的应用；目前，主要利用溶剂回流或渗漉的方法提取汉防己甲素和汉防己乙素，然后利用柱层析进一步纯化，达到药用纯度；但这种方法需要大量的有机溶剂做流动相，而且有机溶剂回收成本高，而且反相吸附填料对粗浸膏吸附量小、目标成分损耗高，吸附填料重复利用率低，需要经常更换，不经济不环保；且粉防己药材中，化学成分复杂，在汉防己碱类成分的提取物中，常伴随着诸如糖类、鞣质等亲水性较强的植物成分以及其他极性相近的小分子化合物，给汉防己碱类成分的分离纯化增加了难度，分离后的汉防己甲素和汉防己乙素的纯度低，无法满足医药行业（纯度达到99%以上）的要求，限制了汉防己甲素及汉防己乙素的应用。
分子印迹技术是用于识别特定目标分子的技术 , 分子印迹聚合物首先由模板分子与可聚合的功能单体通过静电作用、范德华力、疏水作用和氢键等非共价键或共价键作用形成主客体配合物 ,加入引发剂和交联剂进行聚合反应,制得高分子聚合物,然后利用化学或物理方法除去模板分子；目前单分子印迹作为固相萃取技术，已有相应的技术报道，通过该方法进行提取，目标分子单一，提纯度高。
然而，由于汉防己甲素与乙素具有相似的结构特性，在应用单分子印迹提纯过程中，无法避免的会有相互组分的穿插，导致单分子印迹提纯后依然要进一步提纯，使得提纯步骤更为繁琐，限制了分子印迹在粉防己中提纯甲素及乙素的应用。
为此，发明人提出建立粉防己中甲素及乙素双模板分子印迹聚合物，对甲素及乙素同时富集，可以提取高纯度的甲素及乙素混合物，有效降低其他类似物的干扰，再应用反相柱色谱进一步纯化甲素及乙素，有效避免单独提取过程中两种组分的穿插，提高了收率。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种汉防己甲素与乙素的双模板分子印迹聚合物的制备方法。
本发明的第二目的是提供一种结合上述双模板分子印迹聚合物及反相柱色谱提纯汉防己甲素及乙素的方法。
本发明具体内容如下：
一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法，包含以下步骤：
1）双模板分子印迹聚合物的制备：称取汉防己甲素与乙素，与甲基丙烯酸混合，置于具塞锥形瓶中，以体积比1:1-5的甲苯和乙腈混合溶剂溶解，密封，于震荡器中震荡1-4h，使充分反应；加入二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁氰，充分摇匀，将溶液转入玻璃安培瓶，通氮气5-20min脱氧气；40-60℃恒温水浴反应30-48h；生成的聚合物过滤除去溶剂，冷却至室温，研碎，过50-100目筛；将过筛后的聚合物装柱，用50%-80%乙醇水溶液洗脱模板分子和未反应或者过剩的功能单体，洗脱流速为1-4ml/min,高效液相色谱法检测至无汉防己甲素与乙素；于真空干燥箱中40-60 ℃烘干，18-24h，得双模板分子印迹聚合物；
2）汉防己甲素与乙素的提取：粉防己药材粉碎，以6-10倍体积的70-90%乙醇回流提取3-5次，每次2-5h，合并提取液，滤过，得浸膏，分散于4倍体积水中，过滤，收集滤液，并调节pH为7-9，将滤液与双模板分子印迹聚合物混合，静置2-18h；装柱，用体积比1:1-5的二氯甲烷与甲醇混合溶剂洗脱，按1-4ml/min流速，淋洗固相萃取；直至淋洗液中未有汉防己甲素与乙素检出；
3）汉防己甲素与乙素的收集：以紫外-可见分光光度法检测，收集含有汉防己甲素与乙素的洗脱溶液，回收溶剂；浓缩得汉防己甲素与汉防己乙素粗提取物；
4）汉防己甲素与乙素进一步纯化：将上述收集的粗提取物采用乙醇溶解，应用反相色谱柱进一步纯化，得汉防己甲素与乙素。
其中，步骤1）中汉防己甲素、汉防己乙素、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁氰按摩尔比为1:1：3-5:15-25:10-15。
其中，步骤2）中滤液与双模板分子印迹聚合物按10ml：2-5mg比例混合。
其中，步骤4）反相色谱柱进一步纯化中，所用反相C18填料的量为步骤3）中粗提取物质量的200-300倍。
其中，步骤4）反相色谱柱进一步纯化中，汉防己甲素与乙素粗提取物用20%-30%乙醇溶解。
其中，步骤4）反相色谱柱进一步纯化中，上样体积为柱体积的1%-5%。
其中，步骤4）反相色谱柱进一步纯化中，洗脱程序为20%-30%乙醇洗脱4-8BV，50%-60%乙醇洗脱4-8BV，70%-90%乙醇洗脱4-8BV。
其中，步骤4）反相色谱柱进一步纯化中，洗脱液按照紫外光谱收集。
本发明的优点在于：
1.本发明首创采用双模板分子印迹同时提纯汉防己甲素及乙素，与单模板印迹比，合成聚合物模板的成本并无增加，但能实现双个化合物的提纯，且所制得的双模板分子印迹聚合物可以经淋洗后反复利用，相比于色谱柱的难冲洗、吸附量小、损耗高的特点，经济环保；
2.本公开中涉及的高选择性分子印迹聚合物工艺经过系统研究，包括功能单体、交联剂、引发剂以及致孔剂（甲苯与乙腈混合溶剂）等系统优化；
3.本发明通过双模板分子印迹和反相色谱柱及制备色谱仪的技术结合，使得分离提纯后的汉防己甲素及乙素含量均在99%以上，满足当下医药行业的纯度需求，提升衍生产品的安全性，促进粉防己的发展及应用。
具体实施方式
实施例1：
一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法，包含以下步骤：
1）双模板分子印迹聚合物的制备：称取汉防己甲素与乙素40mmol，与160mmol甲基丙烯酸混合，置于具塞锥形瓶中，以体积比1:1的甲苯和乙腈混合溶剂溶解，密封，于震荡器中震荡4h，使充分反应；加入800mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和480mmol偶氮二异丁氰，充分摇匀，将溶液转入玻璃安培瓶，通氮气20min脱氧气；60℃恒温水浴反应40h；生成的聚合物过滤除去溶剂，冷却至室温，研碎，过100目筛；将过筛后的聚合物装柱，用70%乙醇水溶液洗脱模板分子和未反应或者过剩的功能单体，洗脱流速为3ml/min,高效液相色谱法检测直至无汉防己甲素与乙素；于真空干燥箱中50℃烘干20h，得双模板分子印迹聚合物；
2）汉防己甲素与乙素的提取：粉防己药材粉碎，以8倍体积的80%乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液，滤过，得浸膏，分散于4倍体积水中，过滤，收集滤液，氨水调节pH为8，将滤液与双模板分子印迹聚合物按10ml：2mg比例混合，静置8h；装柱，用体积比1:1的二氯甲烷与甲醇混合溶剂洗脱，按3ml/min流速，淋洗固相萃取；直至淋洗液中未有汉防己甲素与乙素检出；以紫外-可见分光光度法检测，收集洗脱液，浓缩得汉防己甲素与汉防己乙素粗提取物；
3）汉防己甲素与乙素进一步纯化：将上述收集的粗提取物称重，30%乙醇溶解，以粗提取物重量的250倍重C18反相填料装柱，用30%乙醇水溶液平衡柱子，并以5%柱体积平衡液上样，依次使用5BV的30%乙醇、50%乙醇、70%%乙醇洗脱，按照紫外光谱收集合并洗脱液，得汉防己甲素与乙素；利用高效液相色谱测量汉防己甲素与汉防己已素纯度，分别为99.1%和99.3%。
实施例2：
一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法，包含以下步骤：
1）双模板分子印迹聚合物的制备：称取汉防己甲素与乙素40mmol，与120mmol甲基丙烯酸混合，置于具塞锥形瓶中，以体积比1:5的甲苯和乙腈混合溶剂溶解，密封，于震荡器中震荡1h，使充分反应；加入1000mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和600mmol偶氮二异丁氰，充分摇匀，将溶液转入玻璃安培瓶，通氮气5min脱氧气；40℃恒温水浴反应48h；生成的聚合物过滤除去溶剂，冷却至室温，研碎，过50目筛；将过筛后的聚合物装柱，用50%乙醇水溶液洗脱模板分子和未反应或者过剩的功能单体，洗脱流速为1ml/min,高效液相色谱法检测直至无汉防己甲素与乙素；于真空干燥箱中60℃烘干24h，得双模板分子印迹聚合物；
2）汉防己甲素与乙素的提取：粉防己药材粉碎，以6倍体积的70%乙醇回流提取5次，每次5h，合并提取液，滤过，得浸膏，分散于4倍体积水中，过滤，收集滤液，氨水调节pH为7，将滤液与双模板分子印迹聚合物按10ml：5mg比例混合，静置2h；装柱，用体积比1:5的二氯甲烷与甲醇混合溶剂洗脱，按1ml/min流速，淋洗固相萃取；直至淋洗液中未有汉防己甲素与乙素检出；以紫外-可见分光光度法检测，收集洗脱液，浓缩得汉防己甲素与汉防己乙素粗提取物；
3）汉防己甲素与乙素进一步纯化：将上述收集的粗提取物称重，20%乙醇溶解，以粗提取物重量的300倍重C18反相填料装柱，用30%乙醇水溶液平衡柱子，并以1%柱体积平衡液上样，依次使用4BV的20%乙醇、60%乙醇、90%乙醇洗脱，按照紫外光谱收集合并洗脱液，得汉防己甲素与乙素；利用高效液相色谱测量汉防己甲素与汉防己已素纯度，分别为99.2%和99.3%。
实施例3：
一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法，包含以下步骤：
1）双模板分子印迹聚合物的制备：称取汉防己甲素与乙素40mmol，与200mmol甲基丙烯酸混合，置于具塞锥形瓶中，以体积比1:3的甲苯和乙腈混合溶剂溶解，密封，于震荡器中震荡2h，使充分反应；加入600mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和400mmol偶氮二异丁氰，充分摇匀，将溶液转入玻璃安培瓶，通氮气15min脱氧气；50℃恒温水浴反应30h；生成的聚合物过滤除去溶剂，冷却至室温，研碎，过100目筛；将过筛后的聚合物装柱，用80%乙醇水溶液洗脱模板分子和未反应或者过剩的功能单体，洗脱流速为4ml/min,高效液相色谱法检测直至无汉防己甲素与乙素；于真空干燥箱中40℃烘干18h，得双模板分子印迹聚合物；
2）汉防己甲素与乙素的提取：粉防己药材粉碎，以10倍体积的90%乙醇回流提取4次，每次3h，合并提取液，滤过，得浸膏，分散于4倍体积水中，过滤，收集滤液，氨水调节pH为9，将滤液与双模板分子印迹聚合物按10ml：3mg比例混合，静置18h；装柱，用体积比1:3的二氯甲烷与甲醇混合溶剂洗脱，按4ml/min流速，淋洗固相萃取；直至淋洗液中未有汉防己甲素与乙素检出；以紫外-可见分光光度法检测，收集洗脱液，浓缩得汉防己甲素与汉防己乙素粗提取物；
3）汉防己甲素与乙素进一步纯化：将上述收集的粗提取物称重，30%乙醇溶解，以粗提取物重量的200倍重C18反相填料装柱，用30%乙醇水溶液平衡柱子，并以3%柱体积平衡液上样，依次使用8BV的30%乙醇、55%乙醇、80%乙醇洗脱，按照紫外光谱收集合并洗脱液，得汉防己甲素与乙素；利用高效液相色谱测量汉防己甲素与汉防己已素纯度，分别为99.3%和99.1%。
对比例1：
一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法，包含以下步骤：
1）双模板分子印迹聚合物的制备：称取汉防己甲素与乙素40mmol，与160mmol甲基丙烯酸混合，置于具塞锥形瓶中，以体积比1:1的甲苯和乙腈混合溶剂溶解，密封，于震荡器中震荡4h，使充分反应；加入800mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和480mmol偶氮二异丁氰，充分摇匀，将溶液转入玻璃安培瓶，通氮气20min脱氧气；60℃恒温水浴反应40h；生成的聚合物过滤除去溶剂，冷却至室温，研碎，过100目筛；将过筛后的聚合物装柱，用70%乙醇水溶液洗脱模板分子和未反应或者过剩的功能单体，洗脱流速为3ml/min,高效液相色谱法检测直至无汉防己甲素与乙素；于真空干燥箱中50℃烘干20h，得双模板分子印迹聚合物；
2）汉防己甲素与乙素的提取：粉防己药材粉碎，以8倍体积的80%乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液，滤过，得浸膏，分散于4倍体积水中，过滤，收集滤液，氨水调节pH为8，将滤液与双模板分子印迹聚合物按10ml：2mg比例混合，静置8h；装柱，用体积比1:1的二氯甲烷与甲醇混合溶剂洗脱，按3ml/min流速，淋洗固相萃取；直至淋洗液中未有汉防己甲素与乙素检出；以紫外-可见分光光度法检测，收集洗脱液，浓缩得汉防己甲素与汉防己乙素粗提取物；
3）利用高效液相色谱法分别测量富集物中的，汉防己甲素与汉防己乙素的纯度分别为37%和29%。
对比例2：
一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法，包含以下步骤：
1）双模板分子印迹聚合物的制备：称取汉防己甲素与乙素40mmol，与110mmol甲基丙烯酸混合，置于具塞锥形瓶中，以体积比1:1的甲苯和乙腈混合溶剂溶解，密封，于震荡器中震荡4h，使充分反应；加入590mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和610mmol偶氮二异丁氰，充分摇匀，将溶液转入玻璃安培瓶，通氮气20min脱氧气；60℃恒温水浴反应40h；生成的聚合物过滤除去溶剂，冷却至室温，研碎，过100目筛；将过筛后的聚合物装柱，用70%乙醇水溶液洗脱模板分子和未反应或者过剩的功能单体，洗脱流速为3ml/min,高效液相色谱法检测直至无汉防己甲素与乙素；于真空干燥箱中50℃烘干20h，得双模板分子印迹聚合物；其他同实施例1；利用高效液相色谱法分别测量富集物中的，汉防己甲素与汉防己乙素的含量分别为17%和12%。
对比例3：
一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法，包含以下步骤：
1）双模板分子印迹聚合物的制备：称取汉防己甲素与乙素40mmol，与210mmol甲基丙烯酸混合，置于具塞锥形瓶中，以体积比1:1的甲苯和乙腈混合溶剂溶解，密封，于震荡器中震荡4h，使充分反应；加入1100mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和390mmol偶氮二异丁氰，充分摇匀，将溶液转入玻璃安培瓶，通氮气20min脱氧气；60℃恒温水浴反应40h；生成的聚合物过滤除去溶剂，冷却至室温，研碎，过100目筛；将过筛后的聚合物装柱，用70%乙醇水溶液洗脱模板分子和未反应或者过剩的功能单体，洗脱流速为3ml/min,高效液相色谱法检测直至无汉防己甲素与乙素；于真空干燥箱中50℃烘干20h，得双模板分子印迹聚合物；其他同实施例1；利用高效液相色谱法分别测量富集物中的，汉防己甲素与汉防己乙素的含量分别为7%和9%。
对比例4：
一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法，包含以下步骤：
1）双模板分子印迹聚合物的制备：称取汉防己甲素与乙素40mmol，与160mmol甲基丙烯酸混合，置于具塞锥形瓶中，以体积比1:1的甲苯和乙腈混合溶剂溶解，密封，于震荡器中震荡4h，使充分反应；加入800mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和480mmol偶氮二异丁氰，充分摇匀，将溶液转入玻璃安培瓶，通氮气20min脱氧气；60℃恒温水浴反应40h；生成的聚合物过滤除去溶剂，冷却至室温，研碎，过100目筛；将过筛后的聚合物装柱，用70%乙醇水溶液洗脱模板分子和未反应或者过剩的功能单体，洗脱流速为3ml/min,高效液相色谱法检测直至无汉防己甲素与乙素；于真空干燥箱中50℃烘干20h，得双模板分子印迹聚合物；
2）汉防己甲素与乙素的提取：粉防己药材粉碎，以8倍体积的80%乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液，滤过，得浸膏，分散于4倍体积水中，过滤，收集滤液，盐酸调节pH为4，将滤液与双模板分子印迹聚合物按10ml：2mg比例混合，静置8h；装柱，用体积比1:1的二氯甲烷与甲醇混合溶剂洗脱，按3ml/min流速，淋洗固相萃取；直至淋洗液中未有汉防己甲素与乙素检出；以紫外-可见分光光度法检测，收集洗脱液，浓缩得汉防己甲素与汉防己乙素粗提取物；
3）汉防己甲素与乙素进一步纯化：将上述收集的粗提取物称重，30%乙醇溶解，以粗提取物重量的250倍重C18反相填料装柱，用30%乙醇水溶液平衡柱子，并以5%柱体积平衡液上样，依次使用5BV的30%乙醇、50%乙醇、70%%乙醇洗脱，按照紫外光谱收集合并洗脱液，得汉防己甲素与乙素；利用高效液相色谱测量汉防己甲素与汉防己已素纯度，分别为69.1%和69.3%。
对比例5：
一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法，包含以下步骤：
1）双模板分子印迹聚合物的制备：称取汉防己甲素与乙素40mmol，与160mmol甲基丙烯酸混合，置于具塞锥形瓶中，以体积比1:1的甲苯和乙腈混合溶剂溶解，密封，于震荡器中震荡4h，使充分反应；加入800mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和480mmol偶氮二异丁氰，充分摇匀，将溶液转入玻璃安培瓶，通氮气20min脱氧气；60℃恒温水浴反应40h；生成的聚合物过滤除去溶剂，冷却至室温，研碎，过100目筛；将过筛后的聚合物装柱，用70%乙醇水溶液洗脱模板分子和未反应或者过剩的功能单体，洗脱流速为3ml/min,高效液相色谱法检测直至无汉防己甲素与乙素；于真空干燥箱中50℃烘干20h，得双模板分子印迹聚合物；
2）汉防己甲素与乙素的提取：粉防己药材粉碎，以8倍体积的80%乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液，滤过，得浸膏，分散于4倍体积水中，过滤，收集滤液，氨水调节pH为8，将滤液与双模板分子印迹聚合物按10ml：2mg比例混合，静置8h；装柱，用95%乙醇淋洗固相萃取，淋洗固相萃取；直至淋洗液中未有汉防己甲素与乙素检出；以紫外-可见分光光度法检测，收集洗脱液，浓缩得汉防己甲素与汉防己乙素粗提取物；
3）汉防己甲素与乙素进一步纯化：将上述收集的粗提取物称重，30%乙醇溶解，以粗提取物重量的250倍重C18反相填料装柱，用30%乙醇水溶液平衡柱子，并以5%柱体积平衡液上样，依次使用5BV的30%乙醇、50%乙醇、70%%乙醇洗脱，按照紫外光谱收集合并洗脱液，得汉防己甲素与乙素；利用高效液相色谱测量汉防己甲素与汉防己已素纯度，分别为79.1%和79.1%。

Claims (5)

1.一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法，其特征在于：包含以下步骤：
1）双模板分子印迹聚合物的制备：称取汉防己甲素与乙素，与甲基丙烯酸混合，置于具塞锥形瓶中，以体积比1:1-5的甲苯和乙腈混合溶剂溶解，密封，于震荡器中震荡1-4h，使充分反应；加入二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁氰，充分摇匀，将溶液转入玻璃安培瓶，通氮气5-20min脱氧气；40-60℃恒温水浴反应30-48h；生成的聚合物过滤除去溶剂，冷却至室温，研碎，过50-100目筛；将过筛后的聚合物装柱，用50%-80%乙醇水溶液洗脱模板分子和未反应或者过剩的功能单体，洗脱流速为1-4ml/min,高效液相色谱法检测直至无汉防己甲素与乙素；于真空干燥箱中40-60℃烘干18-24h，得双模板分子印迹聚合物；
2）汉防己甲素与乙素的提取：粉防己药材粉碎，以6-10倍体积的70-90%乙醇回流提取3-5次，每次2-5h，合并提取液，滤过，得浸膏，分散于4倍体积水中，过滤，收集滤液，并调节pH为7-9，将滤液与双模板分子印迹聚合物混合，静置2-18h；装柱，用体积比1:1-5的二氯甲烷与甲醇混合溶剂洗脱，按1-4ml/min流速，淋洗固相萃取；直至淋洗液中未有汉防己甲素与乙素检出；
3）汉防己甲素与乙素的收集：以紫外-可见分光光度法检测，收集含有汉防己甲素与乙素的洗脱溶液，回收溶剂；浓缩得汉防己甲素与汉防己乙素粗提取物；
4）汉防己甲素与乙素进一步纯化：将上述收集的粗提取物用20%-30%乙醇溶解，应用反相色谱柱进一步纯化，得汉防己甲素与乙素；
所述步骤1）中汉防己甲素、汉防己乙素、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁氰按摩尔比为1:1：3-5:15-25:10-15；
所述步骤4）反相色谱柱进一步纯化中，所用反相C18填料的量为步骤3）中粗提取质量的200-300倍。
2.根据权利要求1所述的一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法，其特征在于：所述步骤2）中滤液与双模板分子印迹聚合物按10ml：2-5mg比例混合。
3.根据权利要求1所述的一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法，其特征在于：所述步骤4）反相色谱柱进一步纯化中，上样体积为柱体积的1%-5%。
4.根据权利要求1所述的一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法，其特征在于：所述步骤4）反相色谱柱进一步纯化中，洗脱程序为20%-30%乙醇洗脱4-8BV，50%-60%乙醇洗脱4-8BV，70%-90%乙醇洗脱4-8BV。
5.根据权利要求1所述的一种粉防己中甲、乙素双模板分子印迹提纯方法，其特征在于：所述步骤4）反相色谱柱进一步纯化中，洗脱液按照紫外光谱收集。
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