CN111157736A - 一种基于化学酶促的人血清o糖基化鉴定方法 - Google Patents
一种基于化学酶促的人血清o糖基化鉴定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111157736A CN111157736A CN201811325625.XA CN201811325625A CN111157736A CN 111157736 A CN111157736 A CN 111157736A CN 201811325625 A CN201811325625 A CN 201811325625A CN 111157736 A CN111157736 A CN 111157736A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- galnac
- galactose
- glycosylation
- peptide
- peptide fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 108010015133 Galactose oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims abstract description 9
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract 7
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 claims abstract 4
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 claims abstract 4
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 claims abstract 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 22
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 11
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 9
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 7
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 4
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 claims description 3
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims 9
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims 9
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 claims 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 2
- LCTORNIWLGOBPB-PHYPRBDBSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol Chemical group N[C@@]1(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LCTORNIWLGOBPB-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims 1
- HXBYBCASAVUYKF-YTQLPXDHSA-N (4r,5s,6s,7r)-4,5,6,7,8-pentahydroxyoctane-2,3-dione Chemical compound CC(=O)C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HXBYBCASAVUYKF-YTQLPXDHSA-N 0.000 claims 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 1
- GMPKIPWJBDOURN-UHFFFAOYSA-N Methoxyamine Chemical compound CON GMPKIPWJBDOURN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 claims 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 claims 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 abstract description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 3
- 108091006033 O-glycosylated proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- HOSGXJWQVBHGLT-UHFFFAOYSA-N 6-hydroxy-3,4-dihydro-1h-quinolin-2-one Chemical group N1C(=O)CCC2=CC(O)=CC=C21 HOSGXJWQVBHGLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 6
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 6
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 5
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 2
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 2
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000002013 hydrophilic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- CPQCSJYYDADLCZ-UHFFFAOYSA-N n-methylhydroxylamine Chemical compound CNO CPQCSJYYDADLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 1
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N hydrazine group Chemical group NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229940060155 neuac Drugs 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种粘蛋白型O‑连接糖基化(O‑GalNAc型)检测方法。本发明基于生物酶选择性氧化‑生物正交化学反应相结合的策略，利用半乳糖氧化酶将半乳糖6‑羟基特异性氧化为醛基，并通过酰肼化学实现了糖肽的特异性捕获与释放，并利用基于质谱的检测方法实现了O‑GalNAc糖型高灵敏度分析，可以从50μL的人源血清中检测到59个O‑GalNAc型糖基化修饰序列，对应超过30个O糖化蛋白上。本方法具有检测灵敏度高、富集特异性高等特点，是对现有的内源性O‑GalNAc型糖基化蛋白/肽段分析的重要手段。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质组学研究方向中的O连接糖基化蛋白质组学分 析，具体涉及一种基于化学酶促的方法和液相色谱-质谱联用技术对人 血清中O连接糖基化蛋白质的富集与鉴定，这种化学酶促方法可以实 现对血清中O连接糖基化蛋白质的高特异性富集与高灵敏度鉴定。
背景技术
人血清因其能够反映人体健康水平的能力而长久以来都是基础和 临床研究的焦点(文献1.Maurya,P.；Meleady,P.；Dowling,P.；Clynes, M.Anticancer researchProteomic approaches for serum biomarker discovery in cancer 2007,27,1247-1255.)。为了能够从血清中发现更多 的疾病潜在标志物，科学家们看法了很多基于质谱的新型蛋白质组学 分析方法(文献2.Geyer,P.E.；Kulak,N.A.；Pichler,G.；Holdt,L.M.；Teupser,D.；Mann,M.Cell systems Plasma Proteome Profiling to Assess HumanHealth and Disease 2016,2,185-195.；文献3.Hoffmann,M.；Marx, K.；Reichl,U.；Wuhrer,M.；Rapp,E.Molecular&cellular proteomics: MCP Site-specific O-Glycosylation Analysis of Human Blood Plasma Proteins 2016,15,624-641.)。对于血清中的糖基化蛋白质而言，N连接 糖基化蛋白质由于其较高的丰度而被广泛研究，但是O连接糖基化蛋 白质却由于其较低的丰度和微观不均一性而较少被研究(文献4.Chen, R.,Seebun,D.,Ye,M.,Zou,H.,Figeys,D.,Site-specific characterization of cellmembrane N-glycosylation with integrated hydrophilic interactionchromatography solid phase extraction and LC-MS/MS.Journal of proteomics2014,103,194-203.)。由于异常的O连接糖基化水平与包括 肿瘤在内的很多疾病都有着密切的联系，开发新型高效的血清O糖基 化蛋白质组分析方法是非常必要的。
目前已报道过的血清O糖基化蛋白质组分析方法还比较局限，大 多数方法都采用了凝集素亲和色谱的方法对O连接糖基化蛋白质进行 富集，在利用蛋白酶对O连接糖基化蛋白质进行酶解，最后使用液相 色谱-质谱联用技术对酶解产物进行分离分析。利用上述方法，Darula 及其团队从2mL牛血清中鉴定到可归属到51个蛋白质上的124个O 链接糖基化修饰位点(文献5.Darula,Z.；Medzihradszky,K.F.Molecular &cellular proteomics:MCP Affinity enrichment and characterization of mucin core-1typeglycopeptides from bovine serum 2009,8,2515-2526.)。 最近，该团队又从人血清的至少30个预分级流分中鉴定到27个O糖 基化修饰位点(文献7.Darula,Z.；Sherman,J.；Medzihradszky,K.F.Mol Cell Proteomics How to Dig Deeper？Improved EnrichmentMethods for Mucin Core-1Type Glycopeptides 2012,11.)。随后他们开发了两种凝集素联用的富集方式，并利用这种方法从400uL人血清中鉴定到可归属 到20个蛋白的52个非冗余O连接糖基化修饰位点(文献8.Darula,Z.； Sarnyai,F.；Medzihradszky,K.F.Glycoconjugate journal O-glycosylation sites identified from mucin core-1type glycopeptides from human serum 2016,33,435-445.)。显然这个鉴定效率很低，不能满足大规模筛选疾 病标志物的要求，一种新型的高灵敏度的人血清O连接糖基化分析方法非常急需。
本发明开发了一种基于化学酶促的方法对占人血清O连接糖基化 水平超过90％的粘蛋白核心1型O连接糖基化修饰进行分析。这种方 法首先利用PNGase F酶将蛋白质酶解肽段的N糖链去除，再利用有机 酸辅助的方法将O连接糖链末端的唾液酸残基释放，将末端半乳糖暴 露出来，再利用半乳糖氧化酶将其侧链的羟基氧化为醛基，从而可以 利用酰肼微球表面的肼基团对O糖基化蛋白质进行富集，最后利用液 相色谱-质谱联用技术对富集的人血清O连接糖基化修饰肽段进行分离 分析。本发明具有富集特异性高、灵敏度高等优点，并且鉴定不受残 余的N连接糖链的干扰，是对目前血清O糖基化分析方法的有效补充。
发明内容
对于O连接糖基化的研究目前还存在很大的发展空间，找到一种 针对O连接糖基化肽段的高特异性富集手段是研究O连接糖基化的重 要步骤。本发明的目的是开发一种基于化学酶促反应的高灵敏度的生 物样品O连接糖基化蛋白质组学的方法，利用的原理是，经过半乳糖 氧化酶的处理，O连接糖基化糖链末端半乳糖残基侧链的羟基被氧化 成醛基，再利用“醛胺反应”通过表面修饰有酰肼基团的微球将O连接 糖基化肽段捕获，从而针对O连接糖基化肽段高特异性的富集与分析。
为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
以经过PNGase F糖苷酶处理的标准蛋白Fetuin和血清蛋白酶解肽 段为底物，利用唾液酸残基酸性条件下高温水解的性质，在三氟乙酸 (TFA)存在的条件下，75℃水浴1小时促使唾液酸残基因发生水解反 应而脱离O连接糖链。脱去唾液酸残基后，O连接糖链的末端半乳糖 被暴露出来，再使用半乳糖氧化酶处理，将末端半乳糖侧链的羟基氧 化成醛基，再使用酰肼微球进行富集(如图1所示)。。
该反应的具体步骤为：
1)蛋白酶解：将蛋白样品溶于带有8M尿素的100mM NH4HCO3溶液(pH＝7.8)中，加入20μL 1M的二硫苏糖醇(DTT) 溶液，60℃水浴反应1小时；恢复至室温后加入7.4mg碘乙酰胺(IAA)，避光室温反应40min；反应结束后，用100mM NH4HCO3溶 液(pH＝7.8)将反应体系中尿素的浓度稀释至终浓度为1M，按照酶： 蛋白＝1:40加入对应消化酶，37℃水浴酶解过夜；过夜反应后再按照酶： 蛋白＝1:40加一次消化酶，37℃水浴6小时；酶解完成后用TFA将反应体系的pH调节在2左右，用Waters Oasis HLB柱子除盐；除盐后冻干 样品，再用10mMNH4HCO3复溶样品，加入4μL PNGase F糖苷酶 (500units/μL)37℃水浴过夜，酶解完成后再使用Waters Oasis HLB 柱子除盐，收集洗脱液浓缩干燥后备用。
2)O连接糖链上唾液酸残基的去除：取相当于10μg蛋白量的O 连接糖基化肽段复溶于100μL超纯水中，涡旋振荡使肽段分散均匀， 再加入1μL TFA，混合均匀后75℃条件下反应1小时，反应完成后将 反应体系浓缩干燥后备用。
3)末端半乳糖侧链的氧化与富集：取相当于10μg蛋白量的已去 除末端唾液酸残基的O连接糖基化肽段，复溶于含有10％DMSO的半 乳糖氧化溶液(25U/mL半乳糖氧化酶,25mM磷酸钠,40U/mL辣根 过氧化物酶,pH＝7.0)中，35℃处理过夜。过夜处理后，用50％醋酸 溶液将反应体系的pH调节为5.0左右，再将反应溶液加入到已经使用 氧化溶液(100mM醋酸按，150mM氯化钠，pH＝5.0)洗涤过的酰肼 微球中，25℃振荡键合过夜。键合完成后，分别用带有8M尿素的50 mM HEPES溶液(pH＝7.8)，80％ACN和1.5M氯化钠洗涤酰肼微球 三次，以洗去非特异性吸附。洗涤完成后，加入洗脱溶液(0.2M甲基 羟氨，0.1M醋酸钠，1.5M氯化钠，pH＝4.5)，25℃振荡洗脱过夜。洗 脱完成后，收集洗脱液，用Waters Oasis HLB柱子除盐，除盐后冻干 样品待用。
4)LC-MS/MS分析及数据处理：取相当于5μg起始蛋白量的O 连接糖基化肽段，复溶于7μL上样液(0.1％FA)中充分分散，经高 速离心后进样。液相色谱-质谱联用系统使用的是Thermo Fisher公司的 Ultimate 3000超高压液相色谱系统和Q-Exactive质谱系统。捕集色谱 柱使用带柱塞内部填充有5μm粒径C18填料的200μm内径毛细管柱， 分析色谱柱使用自制内部填有1.9μm粒径C18填料的150μm内径毛细 管柱。质谱条件：阶梯归一化碰撞能量28％，31％和34％。每张一级 谱按强度排序取前15个离子进行二级碎裂。将质谱产生的*.raw数据 使用Proteome Discoverer软件进行数据库检索，将半胱氨酸烷基化设 置为固定修饰，将甲硫氨酸氧化、天冬酰胺羧基化设置为可变修饰， 将经过富集的O连接糖链作为可变修饰，连接位置为丝氨酸/苏氨酸残 基，假阳性率控制小于1％。
本发明具有以下优点：
1.本发明采用有机酸辅助唾液酸残基水解，使末端半乳糖暴露出 来，使得对O连接糖基化肽段的分析灵敏度更高。
2.本发明使用半乳糖氧化酶对O连接糖链的末端半乳糖进行氧化， 氧化底物特异性高，氧化效率高。
3.本发明使用表面修饰有酰肼基团的微球对经过半乳糖氧化酶处 理的O连接糖基化肽段进行富集，富集特异性高。
4.本发明采用阶梯归一化碰撞能量对O连接糖基化肽段进行质谱 分析，使得肽段离子碎裂更加完全，谱图质量更好，鉴定灵敏度更高。
本发明涉及一种基于化学酶促的方法对生物样品中O连接糖基化 肽段的分析方法。O连接肽段由于其相对丰度低、微观结构复杂而长 久以来难以被富集和鉴定，本发明利用了半乳糖氧化酶可以特异性地 氧化O连接糖链末端半乳糖残基侧链羟基的特点，首先利用有机酸辅 助释放O连接糖链末端的唾液酸残基，使半乳糖残基暴露出来，再利 用半乳糖氧化酶将其氧化，从而可以被酰肼微球捕获，实现了生物样 品中O连接糖基化肽段的高特异性富集和高灵敏度鉴定。同时，在质 谱分析时采用了阶梯能量碎裂的技术，提高了O连接糖基化的鉴定可 信度。本发明在O-GalNAc等糖基化的规模化分析方面具有重要应用潜力。
附图说明
图1使用化学酶促的方法从蛋白酶解液中富集粘蛋白型O糖基 化的流程(
GalNAc；
Gal；
Man；
GlcNAc；◆:NeuAc)。(A) 整个反应的过程。(B)展示了粘蛋白型O糖基化的糖型结构在去唾 液酸前后的变化。(C)共价捕捉和释放之后发生了27Da的质量增加。
图2亲水作用色谱法(A,C,E)和化学酶促方法(B,D,F)对于标 肽：IgG酶解液(未经PNGase F处理)：BSA酶解液＝1：2：10的富集 效果(A和B)；对于标肽：IgG酶解液(经过PNGase F处理)：BSA 酶解液＝1：2：10的富集效果(C和D)；对于标肽：BSA酶解液＝1： 10的富集效果(E和F)。标肽经过富集后的分子量为1240.79Da，用 红色星星标注。
图3展示了鉴定到的肽段HTSVQTTSSGSGPFTDVR的注释谱图， 可以看到其中含有报告离子204.0866Da和393.1497Da。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明 限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
微量体系中低丰度肽段分析方法用于人血清蛋白质组学分析：
(1)取人血清溶解在含有8M Urea和50mM HEPES的缓冲溶液 中，加入终浓度为20mM DTT，37℃水浴中反应2h，然后加入终浓度 为40mM的IAA，25℃避光反应40min；
(2)步骤(1)结束后得到的样品，用浓度为50mM HEPES的水 溶液将Urea浓度稀释至1M，然后加入与蛋白质质量比为1/20的胰蛋 白酶Trypsin，37℃水浴中酶解20h，得到肽段溶液；
(3)步骤(2)结束后得到的样品用TFA将其pH值调整至2左 右，按照蛋白质与填料质量比为1/15选择对应的C18固相萃取柱出去 溶液中的小分子，得到肽段洗脱液冷冻干燥；
(4)步骤(3)得到的肽段复溶于50mM磷酸钠溶液(pH＝7.5) 中，加入与肽段质量比为500Units/mg的PNGase F，然后置于37℃水 浴中酶切12h；
(5)步骤(4)得到的去N糖基化肽段溶液用TFA将pH调节到 2左右，按照肽段与填料质量比为1/15用C18固相萃取住除去溶液中的 小分子，得到肽段溶液冷冻干燥；
(6)将步骤(5)得到的O连接糖基化肽段复溶于100μL 1％ TFA水溶液中，在恒温摇床上75℃涡旋震荡1h，反应完成后将样品 进行冷冻干燥；
(7)将步骤(6)得到的肽段复溶于含有10％DMSO的半乳糖氧 化溶液(25U/mL半乳糖氧化酶,25mM磷酸钠,40U/mL辣根过氧化 物酶,pH＝7.0)中，35℃处理过夜；
(8)将步骤(7)的反应体系用50％醋酸溶液将反应体系的pH 调节为5.0左右，再将反应溶液加入到已经使用氧化溶液(100mM醋 酸按，150mM氯化钠，pH＝5.0)洗涤过的酰肼微球中，25℃振荡键合 过夜；
(9)将步骤(8)得到的反应体系分别用带有8M尿素的50mM HEPES溶液(pH＝7.8)，80％ACN和1.5M氯化钠洗涤酰肼微球三次， 以洗去非特异性吸附。洗涤完成后，加入洗脱溶液(0.2M甲基羟氨， 0.1M醋酸钠，1.5M氯化钠，pH＝4.5)，25℃振荡洗脱过夜。洗脱完成 后，收集洗脱液，用Waters Oasis HLB柱子除盐，除盐后冻干样品；
(10)将步骤(9)得到的肽段进行液相色谱-质谱联用分析并进 行数据处理，具体步骤如下：液相色谱-质谱联用系统使用的是Thermo Fisher公司的Ultimate 3000超高压液相色谱系统和Q-Exactive质谱系 统。捕集色谱柱使用带柱塞内部填充有5μm粒径C18填料的200μm内 径毛细管柱，分析色谱柱使用自制内部填有1.9μm粒径C18填料的150 μm内径毛细管柱。质谱条件：阶梯归一化碰撞能量28％，31％和34％。 每张一级谱按强度排序取前15个离子进行二级碎裂。将质谱产生的 *.raw数据使用Proteome Discoverer软件进行数据库检索，将半胱氨酸 烷基化设置为固定修饰，将甲硫氨酸氧化、天冬酰胺羧基化设置为可变修饰，将经过富集的O连接糖链作为可变修饰，连接位置为丝氨酸/ 苏氨酸残基，假阳性率控制小于1％。
综上所述，本发明为一种高效鉴定不同样本中O连接糖基化肽段 的新方法，将多个酶促反应与化学方法释放唾液酸的反应联用，可以 大幅度提高O连接糖基化肽段的富集特异性与鉴定灵敏度和可信度。 该方法可以使用的范围广，所需操作简单，可以针对不同种类的样品 进行O糖基化蛋白质组学的分析。
Claims (9)
1.一种基于化学酶促的人血清O糖基化鉴定方法，是一种粘蛋白型O-连接糖基化(O-GalNAc型)检测方法，其特征在于：利用糖氧化酶将末端糖单元特异性氧化，并利用酰肼化学方法进行O-连接糖基化捕获-释放，实现O-GalNAc型糖基化的特异性富集和检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：O-GalNAc型糖蛋白/肽段的富集，利用半乳糖氧化酶将末端半乳糖侧链的羟基氧化为醛基，并通过醛基与胺基之间的化学反应进行糖肽/蛋白质的捕获。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：O-GalNAc型糖蛋白/肽段富集氧化前处理过程，利用在酸性条件(pH＝2)下利用高温使得糖链末端唾液酸残基发生水解从而释放糖肽末端的唾液酸残基，将半乳糖/乙酰半乳糖暴露到O-连接糖链末端，以便后续的氧化和富集。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：O-GalNAc型糖蛋白/肽段富集氧化过程，利用半乳糖氧化酶处理过夜，将6-末端半乳糖/乙酰半乳糖侧链的醇羟基特异性氧化为醛基。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：O-GalNAc型糖蛋白/肽段富集，利用酰肼化学策略，使用表面修饰有酰肼基团的微球通过胺基与醛基之间的化学反应，实现醛基氧化的半乳糖/乙酰半乳糖修饰肽段的捕获；利用O-甲基羟胺将半乳糖/乙酰半乳糖修饰肽段的释放，进而实现了O-GalNAc型糖蛋白/肽段的特异性富集。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：O-GalNAc型糖蛋白/肽段质谱检测，对富集的O-GalNAc型糖基化肽段样品进行质谱碎裂，并使用阶梯能量进行碎裂，提高糖链和肽段骨架序列的碎裂效率，进而提高O连接糖基化肽段的鉴定可信度。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于：O-GalNAc型糖蛋白/肽段检测谱图解析，在唾液酸残基被释放并经过酰肼富集之后，其候选检索糖型结构数目减少，其搜库检索空间和随机匹配的错误率显著降低，可以进行直接搜库检索，其可变修饰包O糖基化修饰包括丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)上分别增加230.0903Da、212.0797Da、392.1431Da和374.1325Da，并设置相应的中性丢失，提高O连接糖基化肽段的鉴定效率。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：末端糖单元是指O-GalNAc型糖蛋白/肽段上修饰的糖链的最外侧单糖单元，原料中的部分蛋白质属于O-GalNAc型糖蛋白，这些糖蛋白均包含末端糖单元。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：该策略的研究对象是哺乳动物的组织或细胞中内源性的O连接糖基化分析，其采用的化学反应试剂均为常用试剂，反应条件温和，副反应效率低，能够显著提高糖肽的检测灵敏度，可用于多种生物样本的O连接糖基化蛋白质组分析。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811325625.XA CN111157736A (zh) | 2018-11-08 | 2018-11-08 | 一种基于化学酶促的人血清o糖基化鉴定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811325625.XA CN111157736A (zh) | 2018-11-08 | 2018-11-08 | 一种基于化学酶促的人血清o糖基化鉴定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111157736A true CN111157736A (zh) | 2020-05-15 |
Family
ID=70555556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811325625.XA Pending CN111157736A (zh) | 2018-11-08 | 2018-11-08 | 一种基于化学酶促的人血清o糖基化鉴定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111157736A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113466354A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-10-01 | 复旦大学 | N-糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量方法 |
| CN114252629A (zh) * | 2021-11-25 | 2022-03-29 | 苏州大学 | 一种基于固相糖蛋白富集和Tn糖肽酶切的分析方法和应用 |
| CN114354778A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-04-15 | 苏州大学 | 一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法 |
| CN116271977A (zh) * | 2022-12-13 | 2023-06-23 | 南京林业大学 | 一种糖基固相萃取填料及在富集纯化昆虫来源抗菌肽中的应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005016115A2 (en) * | 2003-01-23 | 2005-02-24 | Montana State University | Biosensors utilizing dendrimer-immobilized ligands and their use thereof |
| CN1681844A (zh) * | 2002-09-11 | 2005-10-12 | 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 | Has化的多肽,特别是has化的促红细胞生成素 |
| CN101080238A (zh) * | 2003-05-09 | 2007-11-28 | 尼奥斯技术有限公司 | 人生长激素糖基化突变体的制备方法和组合物 |
| CN101137396A (zh) * | 2005-03-11 | 2008-03-05 | 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 | 由无活性初始材料制备生物活性糖蛋白 |
| WO2010007214A1 (en) * | 2008-07-16 | 2010-01-21 | Suomen Punainen Risti, Veripalvelu | Enzymatical modif ication of cell glycosylation using serum albumin and divalent cations |
| CN105467050A (zh) * | 2014-09-11 | 2016-04-06 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种用于o糖基化肽段及其完整糖链的鉴定方法 |
| CN105987945A (zh) * | 2015-02-05 | 2016-10-05 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种定量糖蛋白上n-连唾液酸化糖链占有率的方法及其在肝癌标志物筛选中的应用 |
-
2018
- 2018-11-08 CN CN201811325625.XA patent/CN111157736A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1681844A (zh) * | 2002-09-11 | 2005-10-12 | 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 | Has化的多肽,特别是has化的促红细胞生成素 |
| WO2005016115A2 (en) * | 2003-01-23 | 2005-02-24 | Montana State University | Biosensors utilizing dendrimer-immobilized ligands and their use thereof |
| CN101080238A (zh) * | 2003-05-09 | 2007-11-28 | 尼奥斯技术有限公司 | 人生长激素糖基化突变体的制备方法和组合物 |
| CN101137396A (zh) * | 2005-03-11 | 2008-03-05 | 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 | 由无活性初始材料制备生物活性糖蛋白 |
| WO2010007214A1 (en) * | 2008-07-16 | 2010-01-21 | Suomen Punainen Risti, Veripalvelu | Enzymatical modif ication of cell glycosylation using serum albumin and divalent cations |
| CN105467050A (zh) * | 2014-09-11 | 2016-04-06 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种用于o糖基化肽段及其完整糖链的鉴定方法 |
| CN105987945A (zh) * | 2015-02-05 | 2016-10-05 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种定量糖蛋白上n-连唾液酸化糖链占有率的方法及其在肝癌标志物筛选中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| LIU, MQ ET AL.: "pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification", 《NAT COMMUN》 * |
| XIN Y ET AL.: "Highly Efficient Identification of O-GalNAc Glycosylation by an Acid-Assisted Glycoform Simplification Approach", 《PROTEOMICS》 * |
| XIN YOU 等: "Chemoenzymatic Approach for the Proteomics Analysis of Mucin-Type Core-1 O-Glycosylation in Human Serum", 《ANAL CHEM》 * |
| ZHENG J ET AL.: "Specific Identification of Glycoproteins Bearing the Tn Antigen in Human Cells", 《ANGEWANDTE CHEMIE》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113466354A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-10-01 | 复旦大学 | N-糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量方法 |
| CN113466354B (zh) * | 2021-06-02 | 2022-05-20 | 复旦大学 | N-糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量方法 |
| CN114252629A (zh) * | 2021-11-25 | 2022-03-29 | 苏州大学 | 一种基于固相糖蛋白富集和Tn糖肽酶切的分析方法和应用 |
| WO2023093133A1 (zh) * | 2021-11-25 | 2023-06-01 | 苏州大学 | 一种基于固相糖蛋白富集和Tn糖肽酶切的分析方法和应用 |
| CN114252629B (zh) * | 2021-11-25 | 2023-08-11 | 苏州大学 | 一种基于固相糖蛋白富集和Tn糖肽酶切的分析方法 |
| CN114354778A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-04-15 | 苏州大学 | 一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法 |
| CN114354778B (zh) * | 2021-12-08 | 2024-02-23 | 苏州大学 | 一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法 |
| CN116271977A (zh) * | 2022-12-13 | 2023-06-23 | 南京林业大学 | 一种糖基固相萃取填料及在富集纯化昆虫来源抗菌肽中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhu et al. | Glycoprotein enrichment analytical techniques: advantages and disadvantages | |
| Alley Jr et al. | Chip-based reversed-phase liquid chromatography− mass spectrometry of permethylated N-linked glycans: a potential methodology for cancer-biomarker discovery | |
| Temporini et al. | Pronase-immobilized enzyme Reactor: An approach for automation in glycoprotein analysis by LC/LC− ESI/MS n | |
| Nwosu et al. | Simultaneous and extensive site-specific N-and O-glycosylation analysis in protein mixtures | |
| CN111157736A (zh) | 一种基于化学酶促的人血清o糖基化鉴定方法 | |
| Ji et al. | Efficient enrichment of glycopeptides using metal–organic frameworks by hydrophilic interaction chromatography | |
| Perchepied et al. | Development of Immobilized Enzyme Reactors for the characterization of the glycosylation heterogeneity of a protein | |
| Lopez-Ferrer et al. | Sample treatment for protein identification by mass spectrometry-based techniques | |
| Xu et al. | Boronic acid-functionalized detonation nanodiamond for specific enrichment of glycopeptides in glycoproteome analysis | |
| Jmeian et al. | Fast and efficient online release of N-glycans from glycoproteins facilitating liquid chromatography–tandem mass spectrometry glycomic profiling | |
| Naka et al. | Analysis of total N-glycans in cell membrane fractions of cancer cells using a combination of serotonin affinity chromatography and normal phase chromatography | |
| EP2892908A1 (en) | Solid phase glycan and glycopeptide analysis and microfluidic chip for glycomic extraction, analysis and methods for using same | |
| Kubota et al. | Analysis of glycopeptides using lectin affinity chromatography with MALDI-TOF mass spectrometry | |
| EP2305692A1 (en) | Method for releasing and labelling O-glycans | |
| CN111381043B (zh) | 一种适合质谱检测的样本前处理组合物、样本前处理方法及应用 | |
| Molnarova et al. | Liquid chromatography and capillary electrophoresis in glycomic and glycoproteomic analysis | |
| Wouters et al. | A cyclic-olefin-copolymer microfluidic immobilized-enzyme reactor for rapid digestion of proteins from dried blood spots | |
| WO2013192530A2 (en) | Methods and reagents for glycoproteomics | |
| Lazar et al. | Recent advances in the MS analysis of glycoproteins: Theoretical considerations | |
| Jiang et al. | Technologies and methods for sample pretreatment in efficient proteome and peptidome analysis | |
| Yang et al. | Improved online LC-MS/MS identification of O-glycosites by EThcD fragmentation, chemoenzymatic reaction, and SPE enrichment | |
| Snovida et al. | A simple cellulose column procedure for selective enrichment of glycopeptides and characterization by nano LC coupled with electron-transfer and high-energy collisional-dissociation tandem mass spectrometry | |
| Olajos et al. | Sample preparation for the analysis of complex carbohydrates by multicapillary gel electrophoresis with light-emitting diode induced fluorescence detection | |
| Wang et al. | Integrated mass spectrometry–based analysis of plasma glycoproteins and their glycan modifications | |
| An et al. | An unbiased approach for analysis of protein glycosylation and application to influenza vaccine hemagglutinin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200515 |