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CN111157502A - 一种荧光滴定检测温敏含糖无规聚合物与凝集素相互作用的方法 - Google Patents

一种荧光滴定检测温敏含糖无规聚合物与凝集素相互作用的方法 Download PDF

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CN111157502A CN202010033525.0A CN202010033525A CN111157502A CN 111157502 A CN111157502 A CN 111157502A CN 202010033525 A CN202010033525 A CN 202010033525A CN 111157502 A CN111157502 A CN 111157502A
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Abstract

本发明涉及一种荧光滴定检测温敏含糖无规聚合物与凝集素相互作用的方法。该方法包括：测试激发波长下凝集素蛋白溶液的发射光谱；将凝集素蛋白溶液与温敏含糖无规聚合物溶液混合后孵育，测试混合溶液的荧光强度和单独凝集素FITC‑PNA溶液的荧光强度；将获得的最大荧光光谱强度变化与温敏含糖无规聚合物浓度绘制曲线，并计算结合常数Ka。该方法成本低，测试分析快，操作方便简单，测试性价比高，检测灵敏度高。

Description

一种荧光滴定检测温敏含糖无规聚合物与凝集素相互作用的 方法
技术领域
本发明属于高分子聚合物和生物大分子相互作用的测定方法领域，特别涉及一种荧光滴定检测温敏含糖无规聚合物与凝集素相互作用的方法。
背景技术
糖，作为生物体内不可或缺的组成成分，是自然界中含量最大的生物分子和重要的信息分子，在生物演化中发挥着十分重要的作用，例如作为免疫应答、参与信号传导、细胞-细胞粘附、能量储存和代谢中间体、细胞分化、细胞生长及调控、和糖-蛋白的识别等。而糖的以上这些功能一般统称为生物学功能，而上述这些生物学功能主要是通过糖与蛋白质的相互作用来得到实现的。另外，黄毅等人曾报道糖-蛋白质的相互作用是无数细胞识别过程的基础，这些细胞识别过程除了上述的生物学功能之外，还涉及病菌感染、增殖和受精等。总而言之，对糖-蛋白质之间相互作用的研究，有助于更好的理解许多生物学过程，包括免疫响应、信息传递等在内的多种过程，从而在生命科学中发挥着举足轻重的作用。因此，探讨含糖聚合物与蛋白质的相互作用非常必要。但依据目前糖生物学的研究前沿，糖类的分子识别过程以及识别机理并不完全清楚，因此迫切需要建立一种有效的科学研究方法来量化它们之间的相互作用过程以及识别机理，从而为推动糖生物学领域的发展做出微小贡献。
含糖聚合物，是一种人工合成的侧链上带有糖基的电中性水溶性聚合物，即是一类新的合成高分子，将典型的单糖或者寡糖至于经典的碳碳键聚合物侧链上而构成的一类聚合物。与天然聚合物相比，由于具有良好的生物相容性和生物降解性等优点而受到了众多科学研究者的青睐，因为碳水化合物是天然生物系统中广泛存在的生物分子。一方面，相比于单糖或二糖，不仅可以呈现出较高的选择性用于碳水化合物-受体之间的相互作用，从而为生命系统中的细胞识别过程提供更多的理论指导。另一方面，含糖聚合物因具有优异的生物相容性，慢慢的被科学家作为一种载体，要么通过负载疏水性药物阿霉素(DOX)或者紫杉醇(PTX)，要么通过负载凝集素蛋白，通过有效地抑制癌细胞的迁移速率，从而用于攻克乳腺癌或肝癌等各类疑难杂症。
此外，含糖聚合物是聚合物侧链上带有糖基的一种人工合成的聚合物。根据低临界溶解温度(LCST)，可分为线性(T<LCST)和非线性(T>LCST)糖基聚合物。当温度高于LCST值时，更多的亲水性糖基暴露出来，凝集素的识别能力增强；反之，凝集素的识别能力不显著。目前的研究手段都比较简单，只能表征糖基聚合物与凝集素具有一定的特异性识别能力，但是糖类的分子识别过程并不十分清楚。因此，需要定量化研究葡萄糖功能化的无规聚合物与凝集素之间的识别十分有必要。例如孙衎等人的研究[1-2](孙衎主要研究了双亲水的含糖温敏共聚物(PDEGMA-b-POVAG)，由于其含有大量具有生物功能的糖基，因此可以识别特定的蛋白质ConA，采取的手段主要是通过荧光共聚焦显微镜来观察被异硫氰酸(FITC)标记的ConA 与含糖聚合物胶束的特异性识别作用。结果显示，当温度高于LCST(低临界溶解温度)时，由于更多的糖基暴露出来，导致含糖聚合物与蛋白质Con A的识别能力增强；当温度低于LCST 时，含糖聚合物与蛋白质Con A的识别能力减弱。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种荧光滴定检测温敏含糖无规聚合物与凝集素相互作用的方法，以填补现有技术的空白。
本发明提供一种荧光滴定检测温敏含糖无规聚合物与凝集素相互作用的方法，包括：
(1)将温敏含糖无规聚合物溶于HEPES缓冲溶液，逐级稀释，其中稀释后的温敏含糖无规聚合物溶液浓度为3.125μg/mL-200μg/mL；
(2)将凝集素蛋白FITC-ConA和凝集素蛋白FITC-PNA分别溶于HEPES缓冲溶液中，将得到的FITC-ConA溶液和FITC-PNA溶液稀释，其中稀释后的FITC-ConA溶液和FITC-PNA溶液浓度为0.9-1.1μM；
(3)移取步骤(2)中稀释后的FITC-ConA溶液或FITC-PNA溶液，随后采用多功能酶标仪，记录室温时，激发波长494nm下FITC-ConA溶液或FITC-PNA溶液的发射光谱(目的是为了除去非特异性结合对光谱的影响)；
(4)步骤(3)中FITC-ConA溶液或FITC-PNA溶液中滴加步骤(1)中稀释后的温敏含糖无规聚合物溶液，孵育，每隔28-35min测试一次得到的混合溶液的荧光强度和单独FITC-ConA 溶液或FITC-PNA溶液的荧光强度，至少测试3次；
(5)将在步骤(4)中获得的最大荧光光谱强度变化与温敏含糖无规聚合物浓度绘制曲线，并计算结合常数Ka。
所述步骤(1)中温敏含糖无规聚合物为P(DEGMA-co-OVSGal)-1、P (DEGMA-co-OVSGal)-2、P(DEGMA-co-OVSGal)-3、P(DEGMA-co-OVNGal)-2、P (DEGMA-co-OVZGal)-2、P(DEGMA-co-OVNGlu)-5中的至少一种，以下分别简记为PDS-1、 PDS-2、PDS-3、PDN-2、PDZ-2、PDN-5。上述系列含糖无规聚合物的制备方法参照文献[1] (孙衎等人研究)中的方法。
所述步骤(1)中稀释前温敏含糖无规聚合物溶液的浓度为1-1.5mg/mL。
所述步骤(1)中HEPES缓冲溶液加入微量的Ca2+和Mn2+，为了提高聚合物与凝集素的相互作用的亲和力，HEPES缓冲溶液的配置方法为：分别称取固体HEPES(2.383g，10mM)，NaCl(2.925g，50mM)，CaCl2(0.5549g，5mM)，以及MnCl2(0.8094g，5mM)，随后用少量的超纯水溶解，玻璃棒搅拌待完全溶解后，用浓氨水调节至pH＝7.4。最终在容量瓶中稀释至1000mL，即可得pH＝7.4得HEPES缓冲液。
所述步骤(1)中稀释后的温敏含糖无规聚合物溶液浓度分别为3.125μg/mL、6.250μg/mL、 12.50μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL。
所述步骤(2)中稀释前FITC-ConA溶液和FITC-PNA溶液浓度为0.8-1.2mg/mL。
所述步骤(3)中移取体积为95-105μL。
所述步骤(3)中稀释后的FITC-ConA溶液或FITC-PNA溶液移取至96孔板中。
所述步骤(3)中多功能酶标仪为Molecular Devices SpectraMax M2e多功能酶标仪。
所述步骤(4)中孵育温度为38-45℃。
所述步骤(4)中测试时间共58-62min。
所述步骤(5)中结合常数Ka是使用Steck-Wallack方程通过非线性拟合计算得到。
本发明还提供一种基于上述检测方法的试剂盒。
本发明选择荧光素异硫氰酸酯标记的PNA(FITC-PNA)和ConA(FITC-ConA)作为修饰的凝集素进行结合研究并用于荧光定量分析。通过荧光滴定检测技术测试系列聚合物与凝集素作用后的亲和力大小来比较结合能力的强弱。
本发明涉及定量研究系列含糖无规聚合物与凝集素的相互作用，通过荧光滴定检测技术测定含糖无规聚合物与特定凝集素蛋白识别后亲和力的大小。最终建立了一种适合“温敏含糖无规聚合物与凝集素结合体系”的定量测定亲和力的方法。主要以一系列不同精细结构的温敏含糖无规聚合物为研究模型，探索不同条件下系列聚合物有序结构与蛋白识别的行为规律，从而定量化研究该系列温敏含糖无规聚合物与凝集素特异性识别的亲和力的大小。主要比较了1)当温敏单体与糖酯单体的实际摩尔比增加时，聚合物与凝集素的结合能力的强弱。 2)当聚合物糖基侧链上含碳个数增加时，聚合物与凝集素的结合能力的强弱。3)当不同含糖单体功能化的无规聚合物与凝集素相互作用时，结合能力又是如何变化的。该方法有望为糖生物的进一步发展提供了一定的研究价值。
有益效果
(1)本发明使用多功能酶标仪测定系列无规聚合物与凝集素的相互作用，主要通过测试动力学等参数来更加清晰地说明含糖聚合物与凝集素相互作用的强弱。因此可以不受外界环境温度干扰，并且通过结合时间的变化检测聚合物与凝集素的相互作用是否是时间依赖性的。
(2)本发明所使用的荧光滴定检测技术的基本原理是：含糖聚合物的结合可以让带有荧光标记的凝集素的荧光强度降低，通过做一系列梯度进而检测曲线的浓度依赖性，从而得到亲和力等动力学参数。
(3)与其他生物分析方法相比，本发明成本低，测试分析快，操作方便简单，测试性价比高，检测灵敏度高(可以直接通过非线性拟合计算二者相互作用后的结合常数，从而判断相互作用的机理等)。例如，使用荧光滴定检测方法研究聚合物与凝集素的相互作用时，每对相互作用测试时间为60min，时间较快。而如果采用表面等离子体共振(SPR)的方法，不仅要在SPR池中孵育2h，并在此过程中以55.5°的入射角进行动力学扫描。注入MilliQ超纯水去除剩余的糖聚合物并接着孵育30min。在固定化糖聚合物之前和之后进行角度扫描，以确定糖聚合物层的折射率。表面等离子体共振方法最终测试一个样品需要3h左右，所以，相比较而言，前两种手段分析速度还是比较快的。最重要的是，采用SPR测定相互作用时，固定凝集素的生物芯片价格十分昂贵，重复性也不是很好，而且适用的含糖聚合物与凝集素相互作用的体系较窄。还有，采用等温滴定量热法检测时，如果含糖聚合物与凝集素蛋白之间的亲和力特别大，那么清洗样品池就会特别困难，因此对后续实验的相继展开也是项艰难的挑战。
附图说明
图1是实施例1中糖单体在聚合物中的实际摩尔比增加时，聚合物与凝集素作用的荧光强度图。
图2是实施例1中记录的在室温25℃下，固定FITC-PNA(1μM)浓度下加入不同浓度的糖基聚合物所测发射光谱。
图3是实施例1中聚合物糖基侧链上含碳个数不同时，聚合物与凝集素作用的荧光强度图。
图4是实施例1不同糖基功能化的无规聚合物与凝集素相互作用后得到的荧光强度图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
P(DEGMA-co-OVSGal)的制备：于5mL单口烧瓶中依次加入0.3313g DEGMA、0.1364gOVSGal、9.09mg链转移剂DDATC和0.305mg引发剂ACCN，紧接着加入1mL DMF溶液溶解。用封口膜和保鲜膜密封好后，液氮环境下冷冻-溶解三次，随后再经过三次抽真空-充氮气循环，聚合反应在90℃氮气环境下反应12h。得到的浅黄色油状物用50mL的正己烷反复沉淀三次。最后，采用截留分子量为8000的透析袋(MWCO＝8000)透析48h，冷冻干燥后即得到1：4的P(DEGMA-co-OVSGal)，记为PDS-1。N(OVSGal)∶n(DEGMA) ＝1：6的P(DEGMA-co-OVSGal)和n(OVSGal)∶n(DEGMA)＝1：8的合成方法同上所述，DEGMA分别取0.3561和0.3685g，OVSGal分别取0.9548和0.07502g，记为PDS-2 和PDS-3。
而在PDN-2的制备方法中，其中DEGMA分别取0.3561g，OVNGal分别取0.1029g，链转移剂DDATC和引发剂ACCN的量不变，余下操作同上述一致。
PDZ-2的制备：于5mL单口烧瓶中依次加入0.3561g DEGMA、0.1140g OVNGal、9.09mg链转移剂DDATC和0.305mg引发剂ACCN，紧接着加入1mL DMF溶液溶解。用封口膜和保鲜膜密封好后，液氮环境下冷冻-溶解三次，随后再经过三次抽真空-充氮气循环，聚合反应在90℃氮气环境下反应12h。得到的浅黄色油状物用50mL的正己烷反复沉淀三次。最后，采用截留分子量为8000的透析袋(MWCO＝8000)透析48h，冷冻干燥后即得到n (OVNGal)∶n(DEGMA)＝1：6的P(DEGMA-co-OVNGal)，记为PDZ-2。
P(DEGMA-co-OVNGlu)的制备：以DDATC为链转移剂，ACCN为引发剂。取0.3561gDEGMA、0.1029g OVNGlu、8.08mg DDATC、0.305mg ACCN溶于1.5mL DMF溶液中，经过3次抽真空-充氮气循环，于90℃油浴中反应10h，然后置于液氮中冷却30s。反应产物用正己烷沉淀，透析3d，冷冻干燥后，得到黄色油状物，该油状物为OVNGlu和DEGMA 摩尔比为1：6的温敏型无规聚合物P(DEGMA-co-OVNGlu)，简记为PDN-5。
主要试剂：正己烷购自国药集团化学试剂有限公司；FITC-Con A，FITC-PNA，S-十二烷基-S'-(2-羧基-异丙基)三硫酯(DDATC)，2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(DEGMA)，购自美国西格玛奥德里奇公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，HEPES购于阿拉丁生化科技有限公司(中国上海)。
实施例1
在本研究中，选择荧光素异硫氰酸酯标记的PNA(FITC-PNA)和ConA作为修饰的凝集素进行结合研究并用于荧光定量分析。具体操作步骤如下所示：
将待测样品溶液移入96孔板中，每孔100μL，采用Molecular Devices SpectraMaxM2e多功能酶标仪，首先记录在25℃下494nm激发波长下FITC-PNA溶液(溶剂是HEPES缓冲液)(1μM)在500～560nm的发射光谱，目的是为了除去非特异性结合对光谱的影响。随后在FITC-PNA溶液(100μL，1μM)中逐渐滴加10μL无规聚合物溶液(溶剂：HEPES缓冲液)，40℃孵育混合样品溶液，每隔30min测量一次混合样品的荧光强度F和单独凝集素 FITC-PNA的荧光强度F0，测试结合时间共60min。将在525nm处获得的最大荧光光谱强度与糖聚合物浓度[S]进行重新绘制，并使用Steck-Wallack方程(如公式1)计算结合常数。其中，聚合物样品的浓度分别设定为3.125μg/mL，6.250μg/mL，12.50μg/mL，25.00μg/mL， 50.0μg/mL，100.00μg/mL，200.00μg/mL。通过进一步计算，相应的每个无规聚合物的缔合常数的数值如表格1所示(表1中PDS-1、PDS-2、PDS-3、PDN-2和PDZ-2是与FITC-PNA 凝集素相互作用后的解离常数和结合常数数值，PDN-5是与FITC-ConA凝集素相互作用后的解离常数和结合常数数值，测试方法与上述相同)。
测试出来的数据根据Langmuir等温吸附模型进行非线性模拟，结合常数根据下述公式1 进行计算：
Figure BDA0002365205440000061
在这里，[S]指的是糖基聚合物的浓度，[ΔF]指的是荧光强度与单独凝集素荧光强度F0的增量，[ΔFmax]指的是最大荧光强度与单独凝集素荧光强度F0的增量，Ka指的是聚合物与特异性凝集素间的结合常数。
表1
Figure BDA0002365205440000062
糖基聚合物与凝集素的相互作用主要是通过空间位阻效应和吸附与脱附的动态平衡得以调控和制约。当糖基聚合物链长较短时，空间位阻对聚合物与凝集素的相互作用起决定性作用，此时糖基暴露在胶束表面的机率更大，需要更多的凝集素与聚合物进行识别，识别的能力越强，随着结合时间的增加，吸附和脱附的动态平衡慢慢制约聚合物与凝集素的相互识别。当糖基聚合物链长≧6时，暴露在胶束表面的糖基较少，位阻效应对于相互作用基本上是一个固定的因素，而由结合时间控制的吸附与脱附的动态平衡对聚合物与凝集素的相互识别起决定性作用。
图1在FITC标记的PNA中加入10μL等分试样的(A)PDS-1，(B)PDS-2，(C)PDS-3，ΔF是含有凝集素的溶液在520nm处的最大荧光强度的变化，该溶液通过在总配体浓度[S] 下在494nm处激发而获得，并且F0是凝集素PNA或凝集素ConA的荧光强度。
由图1(A)可知，当糖基聚合物PDS-1与凝集素的结合时间达到30min时，随着PDS-1浓度的逐渐增加，荧光强度先逐渐增加后慢慢趋于平衡，在聚合物与凝集素识别的起始阶段，空间位阻效应对糖-凝集素识别起决定作用；当PDS-1的浓度为100μg/mL时，随着结合时间的不断增加，吸附与脱附之间的动态平衡对糖-凝集素识别起调控作用，识别能力越强，表观吸附速率越大；当糖单体在聚合物中的实际摩尔比不同时，实际含糖量越高，荧光强度越大，识别能力越高。
由图1(A)、图1(B)以及图1(C)可知，对于无规聚合物PDS来说，随着糖单体在聚合物中实际摩尔比的增加，聚合物与凝集素FITC-PNA的结合能力整体呈现增强的趋势，即当两者结合时间为60min时，可以看到缔合常数Ka的值分别为1.20×106M-1、1.35×106M-1和1.39×106M-1。由此可知，当糖单体在聚合物中的实际摩尔比增加时，结合能力呈现“PDS-3＞PDS-2＞PDS-1”的规律。
一般来说，当凝集素被聚合物饱和时，最大荧光强度会逐渐减弱，即当凝集素与含糖聚合物相互作用时，凝集素的荧光探针环境会由疏水性转变为亲水性。在本研究中，当糖聚合物的浓度达到50μg/mL时，凝集素逐渐被糖聚合物饱和，ΔF/F0的变化趋于稳定。随着糖基聚合物浓度的逐渐增加，荧光强度逐渐增加，且在最大荧光光谱下未观察到发射波长的明显变化(以一组数据FITC-PNA+PDS-2为例，在固定FITC-PNA(1μM)浓度下加入不同浓度的糖基聚合物所测发射光谱，如图2所示)。这主要归因于凝集素与糖聚合物相互作用时，凝集素的荧光探针的环境从疏水性转变为相对更亲水的特性。
本发明进一步研究了糖基侧链上不同含碳个数的温敏无规聚合物与凝集素FITC-PNA之间的结合，在FITC标记的PNA中加入10μL等分试样的(A)PDS-2,(B)PDN-2和(C) PDZ-2后重新绘制的荧光发射光谱图(其他条件与上述一样)，结果如图3(A)、图3(B) 和图3(C)所示。
依据表格1得出如下结论：
(1)当糖基聚合物链长较短时，在聚合物与凝集素相互作用的起始阶段，空间位阻效应对聚合物与凝集素的相互作用起决定性作用。随着链长的不断增加，即当糖基聚合物链长增加≧6时，空间位阻对于糖-凝集素的识别基本为一固定因素，此时吸附与脱附之间的动态平衡对相互识别起制约作用。
(2)由图3(A)可知，当糖基聚合物PDS-2与凝集素的结合时间达到30min时，随着PDS-2浓度的逐渐增加，荧光强度先逐渐增加后慢慢减弱，此时空间位阻效应对糖-凝集素识别起决定作用；当PDS-2的浓度为100μg/mL时，随着结合时间的不断增加，吸附与脱附之间的动态平衡对糖-凝集素识别起调控作用，糖基聚合物与特异性凝集素的吸附速率越高，识别能力越强；当糖基聚合物链较短时，空间位阻小，表观吸脱附表现明显，暴露在外侧的糖基较多，与凝集素集合的可能性较大，荧光强度也越大，识别能力也越强。当糖基聚合物链较长时，吸附与脱附不断地进行动态变化，此时由结合时间引起的糖聚合物与特异性凝集素的吸脱附速率对糖-凝集素起制约作用。
(3)随着糖基侧链上含碳个数的增加，凝集素的识别能力是逐渐降低的，具体地来说表现在结合常数依次为：1.35×106M-1(PDS-2)、9.42×105M-1(PDN-2)和6.12×105M-1(PDZ-2)，即结合能力呈现“PDS-2＞PDN-2＞PDZ-2”的趋势。可以认为糖基聚合物糖单体中碳氢链越短，糖基暴露在聚合物胶束的表面上的几率越大，从而更有利于碳水化合物结合蛋白，提高特异性凝集素捕获深层口袋中的碳水化合物配体的可能性。
(4)对于每一组含糖聚合物与凝集素的相互结合来说，随着结合时间的延长，亲和力呈现不断增加的趋势，即聚合物与凝集素的结合常数表现出时间依赖性的特点。对于糖基侧链上含碳个数不同时，随着糖基聚合物链长不断增加，凝集素被糖基聚合物识别达到饱和所需的浓度越小。具体地讲，当结合时间为60min时，PDS-2与FITC-PNA结合的饱和浓度为150 μg/mL，而PDN-2和PDZ-2分别与FITC-PNA结合的饱和浓度为100μg/mL和50μg/mL。
此外，为了研究不同含糖单体对无规聚合物与凝集素相互作用亲和力的影响程度。本发明将含半乳糖基无规聚合物与含葡萄糖基无规聚合物分别与凝集素FITC-PNA和FITC-ConA 进行荧光滴定检测(其他条件与上述相同)，即固定聚合物中糖基侧链的含碳个数不变，考察聚合物体系中的糖基类型，图4(A)在FITC标记的PNA中加入10μL等分试样的PDN-2 后重新绘制的荧光发射光谱图；图4(B)在FITC标记的ConA中加入10μL等分试样的PDN-5 后重新绘制的荧光发射光谱图。依据图4和表格1，可得结论如下：
(1)当固定糖基聚合物的链长不变，考察糖基的类型。此时，制约糖-凝集素识别的因素不在是空间位阻效应，而是由结合时间引起的特异性蛋白和糖基聚合物的吸脱附的速率。当结合时间较短时，吸附速率远大于脱附速率，荧光强度较小，识别能力较弱。当结合时间由30min慢慢增加至60min时，荧光强度逐渐增大，识别能力逐渐增强，特异性蛋白和糖基聚合物间的吸脱附动态平衡对糖-凝集素的识别起主要的调控作用。
(2)PDN-2和PDN-5分别与FITC-PNA的特异性识别呈现时间依赖性的特点。结合时间越长，凝集素被糖基聚合物识别达到饱和所需的浓度越高，相互识别的结合常数也越大，意味着结合能力也越强。
(3)PDN-2和PDN-5的Ka分别为9.42×105M-1和2.21×106M-1。由此可得：含葡萄糖基的无规聚合物要比含半乳糖基的无规聚合物与凝集素的结合能力要强。
当特异性的糖基选择性进入蛋白质的结合位点上时，糖环上羟基的空间取向和蛋白质结合位点上的空间位置能够恰好契合，即糖环上的-OH能够与蛋白质上结合位点的-OH、氧原子以及-NH基团等官能团之间形成多重氢键，此时羰基聚合物就会与荧光标定的凝集素发生结合，从而糖-蛋白也可以进行特异性识别了。说明糖和蛋白质的相互作用主要是通过氢键作用以及空穴匹配进行驱动的。另外，由于糖是一类多羟基的高极性复杂分子，糖环上的羟基的空间排列会在表面形成疏水微区，糖类的疏水微区会与蛋白上结合位点的疏水微区通过疏水作用也会产生一定的结合力，从而促进糖-蛋白的特异性识别。
此外，糖基聚合物与凝集素的相互作用还可通过空间位阻效应和结合时间引起的吸脱附的动态平衡得以调控和制约。当糖基聚合物链长较短时，在聚合物与凝集素相互作用的起始阶段，空间位阻对聚合物与凝集素的相互作用起决定性作用，空间位阻小，此时糖基暴露在胶束表面的机率更大，需要更多的凝集素与聚合物进行识别，识别的能力越强。随着结合时间的增加，糖基聚合物与特异性凝集素吸脱附的动态平衡慢慢制约聚合物与凝集素的相互识别。当糖基聚合物链长≧6时，暴露在胶束表面的糖基较少，位阻效应对于相互作用基本上是一个固定的因素，而由结合时间控制的吸附与脱附的动态平衡对聚合物与凝集素的相互识别起决定性作用。
对比例1
孙衎主要研究了双亲水的含糖温敏共聚物(PDEGMA-b-POVAG)，由于其含有大量具有生物功能的糖基，因此可以识别特定的蛋白质Con A，采取的手段主要是通过荧光共聚焦显微镜来观察被异硫氰酸(FITC)标记的Con A与含糖聚合物胶束的特异性识别作用。结果显示，当温度高于LCST(低临界溶解温度)时，由于更多的糖基暴露出来，导致含糖聚合物与蛋白质 ConA的识别能力增强；当温度低于LCST时，含糖聚合物与蛋白质ConA的识别能力减弱。具体方法是：使用四个激发波长(405，488，555，634nm)通道的激光共聚焦扫描显微镜来观察含糖温敏共聚物胶束对于蛋白质的识别。实验中所用的ConA是被FITC标记的，被缩写为 FITC-Con A。在测试之前，将含糖温敏共聚物与FITC-ConA分别使用HEPES缓冲液配置成7mg/mL和0.5mg/mL的溶液，然后将这两种溶液在暗室中等体积混合并在25℃环境中保温2h。最后，在波长为488nm的激发光条件下观察识别凝集素后的聚合物胶束的形态。与本发明相比，该方法更能直观的看到识别后的聚合物胶束的形态，而无法判断当聚合物的浓度达到多少时被凝集素蛋白所饱和以及系列无规聚合物与凝集素相互作用后的行为规律和强弱程度。
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Claims (8)

1.一种荧光滴定检测温敏含糖无规聚合物与凝集素相互作用的方法，包括：
(1)将温敏含糖无规聚合物溶于HEPES缓冲溶液，逐级稀释，其中稀释后的温敏含糖无规聚合物溶液浓度为3.125μg/mL-200μg/mL；
(2)将凝集素蛋白FITC-ConA和凝集素蛋白FITC-PNA分别溶于HEPES缓冲溶液中，将得到的FITC-ConA溶液和FITC-PNA溶液稀释，其中稀释后的FITC-ConA溶液和FITC-PNA溶液浓度为0.9-1.1μM；
(3)移取步骤(2)中稀释后的FITC-ConA溶液或FITC-PNA溶液，随后采用多功能酶标仪，记录室温时，激发波长494nm下FITC-ConA溶液或FITC-PNA溶液的发射光谱；
(4)步骤(3)中FITC-ConA溶液或FITC-PNA溶液中滴加步骤(1)中稀释后的温敏含糖无规聚合物溶液，孵育，每隔28-35min测试一次得到的混合溶液的荧光强度和单独FITC-ConA溶液或FITC-PNA溶液的荧光强度，至少测试3次；
(5)将在步骤(4)中获得的最大荧光光谱强度变化与温敏含糖无规聚合物浓度绘制曲线，并计算结合常数Ka。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中温敏含糖无规聚合物为P(DEGMA-co-OVSGal)-1、P(DEGMA-co-OVSGal)-2、P(DEGMA-co-OVSGal)-3、P(DEGMA-co-OVNGal)-2、P(DEGMA-co-OVZGal)-2、P(DEGMA-co-OVNGlu)-5中的至少一种。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中稀释前温敏含糖无规聚合物溶液的浓度为1-1.5mg/mL。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(3)中移取体积为95-105μL。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(4)中孵育温度为38-45℃。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(4)中测试时间共58-62min。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(5)中结合常数Ka是使用Steck-Wallack方程通过非线性拟合计算得到。
8.一种基于权利要求1所述方法的试剂盒。
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