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CN111148847B - 用于改善核酸装载和稳定性的方法 - Google Patents

用于改善核酸装载和稳定性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了使固体支持物与含有泊洛沙姆的试剂接触以改善核酸在固体支持物上的装载的方法。本发明还提供了用于改善核酸在固体支持物上的稳定性的方法，其包括在固体支持物上装载核酸分子之前或之后，使核酸分子与部分双链的寡核苷酸接触以使得核酸分子与所述寡核苷酸杂交。本发明还涉及这两种方法的组合使用。

Description

用于改善核酸装载和稳定性的方法
技术领域
本发明涉及核酸测序领域。具体地，本发明涉及使固体支持物与含有泊洛沙姆的试剂接触以改善核酸在固体支持物上的装载的方法。本发明还涉及用于改善核酸在固体支持物上的稳定性的方法，其包括在固体支持物上装载核酸分子之前或之后，使核酸分子与部分双链的寡核苷酸接触以使得核酸分子与所述寡核苷酸杂交。
背景技术
大规模的基因组序列分析是理解许多不同生物现象的关键步骤。对低成本、高通量的测序和重测序的需要使得对多个核酸靶标进行同时平行分析的新测序方法得以发展。
在各种测序方法中，常常需要将待测序的核酸靶标装载在固体支持物上。然而，在常规的测序方法中，核酸在固体支持物上的装载存在诸多问题，例如装载均匀性差，装载后的核酸稳定性差等。
因此，需要改进的方法来促进核酸在固体支持物上的均匀和稳定装载。
发明内容
本发明涉及用于改善核酸在固体支持物上的附着(即装载或固定)的方法。一般而言，这样的方法包括使这样的固体支持物与含有泊洛沙姆的试剂接触。在一些实施方案中，本发明涉及用于改善核酸在固体支持物上的稳定性的方法，其包括在将核酸装载在固体支持物上之前或之后使核酸分子与部分双链的寡核苷酸接触以使得核酸分子与所述寡核苷酸杂交。在另一些实施方案中，本发明还涉及这两种方法的组合使用。
在作出本发明的过程中，本发明人令人惊讶地发现，利用含有泊洛沙姆的试剂处理固体支持物能够显著地改善核酸(例如DNA纳米球(DNA nanoball，简称DNB))在固体支持物上的装载。特别地，固体支持物上装载核酸(例如DNB)的均匀性得到显著提高，从而例如在随后的核酸分析中，显著改善信噪比(SNR)和FIT值(其指示各碱基区分情况)。
因此，在一个方面，本发明提供了用于改善核酸(例如DNB)在固体支持物上的装载的方法，其包括a)提供其上固定有核酸的固体支持物，和b)使所述固体支持物与含有泊洛沙姆的试剂(例如，水溶液)接触。在一个实施方案中，该方法包括在步骤a)中，在泊洛沙姆的存在下提供其上固定有核酸的固体支持物。
在一个方面，本发明提供了在固体支持物上装载核酸(例如DNA纳米球)的方法，其包括a)提供其上固定有核酸的固体支持物，和b)使所述固体支持物与含有泊洛沙姆的试剂(例如，水溶液)接触。在一个实施方案中，该方法包括在步骤a)中，在泊洛沙姆的存在下提供其上固定有核酸的固体支持物。
如本文所用，在固体支持物上装载核酸意指将核酸分子固定或附着在固体支持物上。这样的固定或附着可以是共价或非共价的方式。
如本文所用的术语“核酸”可以与“核酸分子”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“靶核酸”互换使用，其可以是任何类型的核酸，例如核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或由核苷酸类似物制成的DNA或RNA的类似物。核酸可以是单链的、双链的或含有单链和双链序列两者。核酸分子可以来源于双链DNA(dsDNA)形式(例如，基因组DNA、PCR和扩增产物等)，或者可以来源于如DNA(ssDNA)或RNA的单链形式并且其可以转化为dsDNA形式，并且反之亦然。在一些实施方案中，固定的核酸可以是单分子的形式(可以是天然分子、修饰分子如标记的分子，或包括核苷酸类似物的核酸)、序列的多联体(concatamer)(例如如下文详细描述的核酸纳米球)，等等)，可以被扩增(例如扩增为多联体、扩增为多个具有相同或相似序列的个体分子，等等)，和/或可以是任何其它形式。核酸分子的准确序列可以是已知的或未知的。以下是核酸的示例性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、基因组DNA、基因组DNA片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、核酸文库、重组多核苷酸、合成多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、任何上述序列的核酸探针、引物或扩增拷贝。
核酸可以包括核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸通常含有糖、核碱基和至少一个磷酸基。核苷酸可以是无碱基的(即，缺少核碱基)。核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、修饰的肽核苷酸、修饰磷酸盐糖主链核苷酸及其混合物。核苷酸的实例包括(例如)腺苷一磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、胸苷一磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、胞苷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、鸟苷一磷酸(GMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、尿苷一磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、脱氧腺苷酸(dAMP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸腺嘧啶核苷一磷酸(dTMP)、脱氧胸腺嘧啶核苷二磷酸(dTDP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、去氧胞二磷(dCDP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷一磷酸(dGMP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧尿苷一磷酸(dUMP)、脱氧尿苷二磷酸(dUDP)和脱氧尿苷三磷酸(dUTP)。还可以在本文所述的方法中使用包含修饰的核碱基的核苷酸类似物。无论是具有天然主链还是类似结构，可以包含在多核苷酸中的示例性修饰的核碱基包括(例如)肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫脲嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、15-卤代脲嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤素取代的尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鸟嘌呤、3-去氮腺嘌呤等。如本领域中已知的，某些核苷酸类似物不能引入多核苷酸，例如，核苷酸类似物，如腺苷5′-磷酰硫酸。
在本发明的具体实施方案中使用的核酸分子可以具有任意长度。一般说来，有用的核酸的示例性长度包括(例如)至少约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、1,000、5,000或10,000、100,000个核苷酸或更长。作为另外一种选择或者另外，所述长度可以不长于1,000,000、100,000、10,000、1,000、100个核苷酸或更少。核酸分子的长度还可以包括以上示例性数目之间的所有整数。因此，可以使用本发明所述的方法测序的核酸可以(例如)在短多核苷酸、片段、cDNA、基因和基因组片段的范围内。
在本发明的固体支持物上装载的核酸分子可以为任意数量，例如可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个或者更多个相同或不同的核酸分子。进行测序的核酸分子的数量还可以是例如200、300、400、500、1000、5000、10000、50000、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106或1x107个或更多个相同或不同的核酸分子。进行测序的核酸分子的数量还可以包括以上示例性数目之间的所有整数。
核酸可以从任何来源获得。例如，核酸可以由从一种生物获得的核酸分子制备，或者由从包括一种或多种生物的天然来源获得的核酸分子群制备。核酸分子的来源包括但不限于细胞器、细胞、组织、器官或生物体。可以用作核酸分子来源的细胞可以是原核的(例如细菌)；或真核的，如真菌(例如酵母)、植物、原生动物和其它寄生虫，和动物(包括昆虫、线虫)，和哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、猴、非人类灵长类动物和人类))；或者核酸分子可以来源于病毒。
在一些实施方案中，核酸可以从特定生物来源获得。在一个优选的实施方案中，核酸是从人获得的人核酸，例如，人组织的样品。在另一个优选的实施方案中，核酸是人线粒体核酸。在另一个优选的实施方案中，核酸可以从宏基因组样品获得。在其它实施方案中，核酸可以从不再包含活生物的环境来源获得。
如本文所用的，术语“装载”、“固定”和“附着”当提及核酸使用时，意指经由共价键或非共价键直接或间接附接至固体支持物。在本公开内容的某些实施方案中，本发明的方法包括经由共价附接将核酸固定在固体支持物上。但是通常地，仅需要的是在期望使用固体支持物的条件下(例如在需要核酸扩增和/或测序的应用中)，核酸保持固定或附接至固体支持物。在某些实施方案中，将核酸固定在固体支持物上可以包括将待用作捕获引物或扩增引物的寡核苷酸固定在固体支持物上，使得3'末端对于酶促延伸是可利用的并且该引物序列的至少一部分能够杂交至互补核酸序列；然后将待固定的核酸杂交至所述寡核苷酸，在这种情况下固定的寡核苷酸或多核苷酸可以为3'-5'方向。在某些实施方案中，将核酸固定在固体支持物上可以包括通过氨基化修饰将核酸结合蛋白质结合在固体支持物上，并通过核酸结合蛋白质捕获核酸分子。可选地，装载可以通过除碱基配对杂交之外的其他方式发生，例如上文描述的共价附接。核酸与固体支持物附接方式的非限制性示例包括核酸杂交、生物素链霉亲和素结合、巯基结合、光活化结合、共价结合、抗体-抗原、经由水凝胶或其他多孔聚合物的物理限制等。用于将核酸固定在固体支持物上的各种示例性方法可参见例如G.Steinberg-Tatman等人,Bioconjugate Chemistry 2006,17,841-848；Xu X.等人Journal of the American Chemical Society 128(2006)9286-9287；美国专利申请US5639603、US 5641658、US2010248991；国际专利申请WO 2001062982、WO 2001012862、WO2007111937、WO 0006770，为了所有目的，特别是为了与制备形成其上固定有核酸的固体支持物有关的全部教导，以上文献均通过引用全文并入本文。在本发明的实施方案中，可以在泊洛沙姆的存在下将核酸固定在固定支持物上。
如本文所使用的，术语“固体支持物”意指核酸可以与其附接的任何不可溶的基底或基质，诸如例如，乳胶珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面、玻璃表面、芯片、传感器、电极和硅晶片。固体支持物的表面可以是任何所需形状，所述形状包括，例如，适合用于特定应用的平面的、球形的或多孔的。例如，固体支持物可以是平面的玻璃表面。
在某些实施方案中，固体支持物可以包括惰性基底或基质，该惰性基底或基质已经例如通过应用中间材料的层或涂层被化学官能化，所述中间材料具有允许共价附接至多核苷酸的反应性基团。中间材料可以经由共价键或非共价键直接或间接附接至固体支持物。作为用于非共价附接至固体支持物的非限制性实例，这类支持物可以包括在惰性基底例如玻璃上的聚丙烯酰胺水凝胶层。在这类实施方案中，多核苷酸(例如待测序的核酸分子)可以直接共价附接至中间层(例如，水凝胶)，但是中间层本身可以非共价附接至其他基底或基质(例如玻璃基底)层。
如本文所用，术语“泊洛沙姆”是指，由侧接两条聚氧乙烯链的聚氧丙烯链形成的嵌段共聚物。泊洛沙姆可以以商品名销售，包括PLURONIC@(BASF),KOLLIPHOR@(BASF),LUTROL@(BASF)和SYNPERONIC@(Croda International)。除非具体指出特定的泊洛沙姆品种，否则提及“泊洛沙姆”可以泛指多种泊洛沙姆品种。
如本文所用的“含有泊洛沙姆的试剂”可以是含有泊洛沙姆的水溶液或其它合适的溶液例如有机溶液，例如乙醇、乙酸乙酯或氯仿溶液。应理解，这样的溶液应不影响泊洛沙姆的性质并且不应对如本文所述的固体支持物、核酸分子、寡核苷酸以及核酸与固体支持物的结合有任何不利的影响。泊洛沙姆在试剂或溶液中的浓度可以是泊洛沙姆常用的任何浓度。在一些实施方案中，泊洛沙姆在试剂或溶液中的浓度可以是约0.01％至约2％，或约0.05％至约1％，或约0.1％至约0.5％，或约0.2％至约0.5％，或约0.3％至约0.5％，或约0.4％至约0.5％(w/v)。在优选的实施方案中，泊洛沙姆在试剂或溶液中的浓度可以是约0.1％，约0.2％，约0.3％，约0.4％，或约0.5％(w/v)。在其他实施方案中，泊洛沙姆在试剂或溶液中的浓度还可以小于约0.01％或大于约2％。在某些实施方案中，含有泊洛沙姆的试剂还含有缓冲剂。合适的缓冲剂是本领域技术人员能够容易确定的。合适的缓冲剂可以包含例如有机盐，以保持约pH 6至pH 9的稳定pH，并且可能还包含一价或二价阳离子或去垢剂，从而从固体支持物除去非特异性结合的分子。示例性的缓冲剂可以包括例如Tris-HCl缓冲液(例如pH 6.5的100mMTris-HCl缓冲液)、SSC缓冲液(例如0.3xSSC/0.1％Tween)、TE缓冲液(例如含有pH 8的10mM Tris-HCl和1mM EDTA的TE缓冲液)以及如本申请实施例中使用的缓冲剂等。
术语“泊洛沙姆”可以涵盖许多不同的化合物，这是因为可以组合使用不同长度的聚氧丙烯和聚氧乙烯链。存在于泊洛沙姆中的聚氧丙烯和聚氧乙烯链的特定组合可以产生特定的化学和/或生物物理特性。在一些实施方案中，泊洛沙姆具有HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的化学式。在一些实施方案中，n(即，聚氧乙烯链长)具有约60至约150的值。在一些实施方案中，m(即，聚氧丙烯链长)具有约25至约60的值。
泊洛沙姆常常通过指明其大约分子量和聚氧乙烯含量百分比的编号系统来描述。这些值可以指泊洛沙姆组合物中的平均值，而非组合物中每个泊洛沙姆分子的绝对值。依据这个系统，头两个数字乘以100可以给出聚氧丙烯嵌段的大约分子量，而第三个数字乘以10可以给出聚氧乙烯嵌段的重量百分比。例如，泊洛沙姆188(CAS No.9003-11-6)可以指上述分子式中n具有约80的值和m具有约27的值的泊洛沙姆。泊洛沙姆237可以指n具有约64的值和m具有约37的值的泊洛沙姆。泊洛沙姆338可以指n具有约141的值和m具有约44的值的泊洛沙姆。泊洛沙姆407可以指n具有约101的值和m具有约56的值的泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆具有约6,000至约18,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，泊洛沙姆188可以指上述分子式中n具有约80的值和m具有约27的值的泊洛沙姆，并且该泊洛沙姆具有约7680至约9510g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，泊洛沙姆188可以指上述分子式中n具有约80的值和m具有约27的值的泊洛沙姆，并且该泊洛沙姆具有约7000至约10000g/mol的平均分子量。
可以依据不同的系统来命名以商品名销售的泊洛沙姆，例如，PLURONIC@。字母可以用于表示物理状态(例如，F表示固体，P表示糊状，或L表示液体)。2个或3个数字可以用于表示化学特性。头一个或头两个数字乘以300来给出聚氧丙烯嵌段的大约分子量，而第三个数字乘以10来给出聚氧乙烯嵌段的重量百分比。例如，PLURONIC@F68(PF68)可以指上述分子式中n具有约80的值和m具有约27的值的固体泊洛沙姆。PLURONIC@F87(PF108)可以指n具有约64的值和m具有约37的值的固体泊洛沙姆。PLURONIC@F108(PF127)可以指n具有约141的值和m具有约44的值的固体泊洛沙姆。PLURONIC@F127可以指n具有约101的值和m具有约56的值的固体泊洛沙姆。
由于泊洛沙姆可以具有各种长度的疏水性(聚氧丙烯)和亲水性(聚氧乙烯)部分，不同的泊洛沙姆可以具有不同的亲水-亲脂平衡值(HLB)。可以通过计算亲水性或亲脂性的化合物的相对比例来确定化合物的HLB，并且HLB值可以用于预测化合物的表面活性剂特性。例如，具有低于10的HLB的化合物预测是水不溶性的，而具有高于10的HLB的化合物预测是水溶性的。可以根据本领域公知的方法来计算泊洛沙姆的HLB，所述方法包括Griffin,W.C.(1954)J.Soc.Cosmet.Chemists 5(4):249-56和Davies,J.T.(1957)Gas/Liquid andLiquid/Liquid Interfaces:Proc.of 2nd Intl.Congress Surface Activity,Butterworths(London):426-38中所述的那些。
在一些实施方案中，可以测量泊洛沙姆的物理和/或化学特性。测量物理和/或化学特性的试验的实例包括，不限于，MALDI-MS、凝胶渗透色谱(Gel PermeationChromatography)、粉末-XRD、准-弹性光散射和固态NMR。
在本发明的各种实施方案中，优选使用亲水性泊洛沙姆处理固体支持物。所述亲水性泊洛沙姆优选是溶解于液体或含水溶液中的固体泊洛沙姆。如本文所用的亲水性泊洛沙姆优选是具有大于或等于10的HLB的泊洛沙姆化合物。
在本发明的实施方案中，优选使用具有20-29的HLB的亲水性泊洛沙姆或其混合物处理固体支持物。
在本发明的其它实施方案中，还可以使用其它亲水性泊洛沙姆处理固体支持物，例如使用具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更高的HLB的亲水性泊洛沙姆或其混合物。
在本发明的实施方案中，优选使用选自PF68、PF108、PF127、其等同物及其混合物的泊洛沙姆处理固体支持物。PF68、PF108或PF127的等同物意指不是以商品名PLURONIC@销售，但与PF68、PF108或PF127的结构相同的泊洛沙姆。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了提高在核酸分析过程中所述固体支持物上的核酸的稳定性的方法。一般而言，在将核酸装载到固体支持物上，并用于下一步的核酸分析时，常常会存在核酸分子不够稳定的问题。例如核酸的装载不稳定，导致核酸分子脱落，或者装载在固体支持物上的核酸分子的结构不稳定，容易受到破坏。在作出本发明的过程中，本发明人令人惊讶地发现，在将核酸(例如DNB)装载在固体支持物上之前或之后，使用本发明的部分双链的寡核苷酸与待分析的核酸(例如DNB)接触并杂交，能够显著地改善核酸(例如DNB)的稳定性，从而例如在随后的核酸分析中，显著减小信号衰减。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了部分双链的寡核苷酸，其包含第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链，其中所述第一寡核苷酸链从5’到3’包含区域A和区域B，以及所述第二寡核苷酸链从5’到3’包含区域A’和区域B’，其中区域A和A’彼此反向互补，并且区域B和B’彼此不互补且各自与预定的靶序列(例如靶核酸中的)互补(因而区域B和B’也被称为靶结合区)，其中所述第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链通过区域A和A’彼此杂交，从而形成所述部分双链的寡核苷酸。在优选的实施方案中，所述区域B和B’分别位于第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链的3’末端。
在本发明的一些实施方案中，所述区域B和B’可以被设计为与靶核酸中的相同靶序列互补。在其他实施方案中，所述区域B和B’可以被设计为与靶核酸中的不同靶序列互补，或者所述区域B和B’可以被设计为与不同的靶核酸互补。
在本发明的一些实施方案中，所述第一寡核苷酸链还可以包含位于区域A上游的区域C，或所述第二寡核苷酸链还可以包含位于区域A’上游的区域C’。所述区域C或C’可以被设计为当存在第二部分双链的寡核苷酸时，第一部分双链的寡核苷酸的区域C或C’分别与第二部分双链的寡核苷酸的区域C或C’反向互补，以使得第一部分双链的寡核苷酸和第二部分双链的寡核苷酸能够通过各自的区域C或C’彼此杂交。
在优选的实施方案中，所述第一寡核苷酸链还可以包含位于区域A上游的区域C，和所述第二寡核苷酸链还可以包含位于区域A’上游的区域C’，其中区域C和C’彼此不反向互补。所述区域C和C’可以被设计为当存在第二部分双链的寡核苷酸时，第一部分双链的寡核苷酸的区域C和C’的至少之一与第二部分双链的寡核苷酸的区域C和C’的至少之一反向互补，以使得第一部分双链的寡核苷酸和第二部分双链的寡核苷酸能够通过各自的区域C和/或C’彼此杂交。在优选的实施方案中，区域C和C’可以具有相同或不同的序列。
因此，在一些实施方案中，本发明还提供了一组部分双链的寡核苷酸，其包含至少两种如本文所述的部分双链的寡核苷酸，其中每种部分双链的寡核苷酸包含第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链，所述第一寡核苷酸链从5’到3’包含区域C、区域A和区域B，以及所述第二寡核苷酸链从5’到3’包含区域A’和区域B’，其中区域A和A’彼此反向互补，并且区域B和B’彼此不互补且各自与预定的靶序列互补，其中所述第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链通过区域A和A’彼此杂交，从而形成所述部分双链的寡核苷酸，其中至少一种部分双链的寡核苷酸的区域C与至少另一种部分双链的寡核苷酸的区域C反向互补，以使得至少两种部分双链的寡核苷酸能够通过各自的区域C彼此杂交。
在另一些实施方案中，本发明还提供了一组部分双链的寡核苷酸，其包含至少两种如本文所述的部分双链的寡核苷酸，其中每种部分双链的寡核苷酸包含第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链，所述第一寡核苷酸链从5’到3’包含区域C、区域A和区域B，以及所述第二寡核苷酸链从5’到3’包含区域C’、区域A’和区域B’，其中区域A和A’彼此反向互补，并且区域B和B’彼此不互补且各自与预定的靶序列互补，其中所述第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链通过区域A和A’彼此杂交，从而形成所述部分双链的寡核苷酸，其中至少一种部分双链的寡核苷酸的区域C和C’的至少之一与至少另一种部分双链的寡核苷酸的区域C和C’的至少之一反向互补，以使得至少两种部分双链的寡核苷酸能够通过各自的区域C和/或C’彼此杂交。在优选的实施方案中，区域C和C’可以具有相同或不同的序列。
不受理论约束，本发明人令人惊讶地发现，通过使用本发明的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸与靶核酸杂交，能够将多于一个靶核酸通过本发明的部分双链的寡核苷酸间接地关联在一起。这样的性质是有利的，因为例如在靶核酸固定(即，装载)在固体支持物上的情况下，这使得靶核酸能够紧密地结合在固体支持物上，不容易受到核酸分析过程中的外力的作用而导致形态结构遭到破坏。
本发明的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸还尤其适合于与包含多个靶核酸序列的多联体(例如DNA纳米球)一起使用。不受理论的约束，据认为当本发明的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸与包含多个靶核酸序列的多联体杂交时，所述部分双链的寡核苷酸的靶结合区B和B’可分别与单独的靶核酸序列杂交，从而将单独的靶核酸序列通过该部分双链的寡核苷酸间接地关联在一起，使多联体的结构更加稳定，使其结构不易受到破坏。在使用本发明的一组部分双链的寡核苷酸的情况下，因为其中的至少两种部分双链的寡核苷酸可彼此杂交，这使得能够将更多的单独的靶核酸序列通过该至少两种部分双链的寡核苷酸间接地关联在一起，从而进一步稳定多联体的结构，使其结构不易受到破坏。所述多联体中的多个靶核酸序列可以是相同或不同的序列。在优选的实施方案中，所述多联体中的多个靶核酸序列是相同的序列。
在如本文所述的部分双链的寡核苷酸与固定在固体支持物上的核酸分子(例如核酸纳米球，例如DNB)杂交后，如本文所述的部分双链的寡核苷酸还可用作引物用于复制靶核酸。
在本发明的实施方案中，如本文所述的部分双链的寡核苷酸的区域A和A’的序列没有特别限定，只要其不影响区域B和B’与靶序列之间的杂交以及部分双链的寡核苷酸之间通过区域C和/或C’的杂交。区域A和A’的长度没有特别限定，通常为约4个核苷酸到约50个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约45个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约40个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约35个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约30个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约25个核苷酸的长度或约4个核苷酸到约25个核苷酸的长度。在一些实施方案中，区域A和/或A’为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的长度。在优选的实施方案中，区域A和/或A’的长度为约15-30个核苷酸。
如本文所述的部分双链的寡核苷酸的靶结合区B和B’的长度没有特别限定，通常为约4个核苷酸到约70个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约60个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约50个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约40个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约30个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约20个核苷酸的长度或约4个核苷酸到约10个核苷酸的长度。在一些实施方案中，靶结合区B和/或B’为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60或70或更多个核苷酸的长度。适合的长度根据寡核苷酸的用途而有所不同，例如，如本文所述的部分双链的寡核苷酸用作引物时，靶结合区B和/或B’的长度可以是约30-42个核苷酸。在本发明的实施方案中，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链的靶结合区B和B’的长度可以是相同或不同的。在优选的实施方案中，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链的靶结合区B和B’的长度是相同的。
如本文所述的部分双链的寡核苷酸的区域C和C’的长度没有特别限定，通常为约4个核苷酸到约70个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约60个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约50个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约40个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约30个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约20个核苷酸的长度或约4个核苷酸到约10个核苷酸的长度。在一些实施方案中，区域C和/或C’为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60或70或更多个核苷酸的长度。在优选的实施方案中，区域C和/或C’的长度为约20-50个核苷酸。
如本文中所用，术语“引物”指在合适的缓冲液中和在适当的温度下，在合适的条件下(也即，存在4种不同的核苷三磷酸和用于聚合的试剂，如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶时)，能充当核酸模板合成的起始点的多核苷酸。因此，引物包括与靶核酸(模板)杂交的靶结合区域(例如，如本文所述的部分双链的寡核苷酸的靶结合区)。引物一般是寡核苷酸，而且是单链的，然而，引物可指具有双链区段的多核苷酸(例如，如本文所述的部分双链的寡核苷酸)。适于引物的靶结合区域的合适长度取决于引物的预期用途。短的引物分子通常需要较低的温度，以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不必反映核酸模板的确切序列，但是必须是充分互补的，以便与核酸模板杂交。在本文的上下文中，引物通常是指如本文所述的部分双链的寡核苷酸。
如本文中所用，术语“靶核酸”是指待检测或将用作模板用于引发(例如，PCR或随机引发)的核酸。靶核酸可以是单链或双链的，虽然为了本文所述的应用，通常使用已知的方法使双链靶核酸成为单链的。靶核酸可以包括，例如，来自基本上任何天然来源的具有核酸的原核生物的，真核生物的，或病毒的多核苷酸(例如，细胞，组织或生物学液体)。如本领域中惯常使用的，靶核酸还可以包含序列已知的接头序列，以便于对其进行扩增或测序。
如本文所用，核酸“区”或“区域”是任何长度的核苷酸的连续区段。
如本文所用，术语“靶结合区”是指与靶核酸互补的核酸区段。
如本文所用，术语“互补”或“基本互补”是指核苷酸或核酸之间(例如在双链DNA分子两条链之间或者单链核酸上的靶结合区域和靶核酸之间)的杂交或碱基配对或者双链体形成。如果在一个给定位置上一个核酸的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸形成氢键，则这两个核酸被认为在该位置上是彼此互补的。互补核苷酸一般是A和T(或A和U)或者C和G。当在最佳地比对和比较并适当地进行了核苷酸插入或缺失的情况下，一条链的核苷酸与另一条链的至少大约80％、通常至少大约90％到约95％，甚至大约98％到100％配对时，这两个单链RNA或DNA分子被称为基本互补。
如本文所用，术语“杂交”是指互补的核苷酸或核苷酸碱基之间足够的氢键结合，其可以是，例如，Watson-Crick，Hoogsteen或反向的Hoogsteen氢键结合，以使得核酸链之间发生稳定和特异性结合。杂交能力根据严格条件(包括合适的缓冲液浓度和温度，其允许特异性杂交至具有完全或部分互补性区域的靶核酸)确定。因此，不是核酸的所有核苷酸都需要是互补的。此外，当核酸链与靶核酸的所有、部分或重叠区域杂交时，核酸链是“基本互补”的。建立用于设计本发明的寡核苷酸或引物的严格杂交条件的定性和定量考虑事项是本领域已知的，参见，例如，Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology(4thed.，John Wiley&Sons 1999)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)：Nucleic Acid Hybridisation：A Practical Approach(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.，IRL Press 1985)。
如本文所用，术语“Tm”用于本文通常是指让半数的双链核酸分子解离成单链的温度。计算核酸的Tm的公式是本领域公知的。正如标准参考文献指出的，当核酸处于阳离子浓度为0.5M或更低的水溶液中时，可以通过公式Tm＝81.5+16.6(log10[Na+])0.41(％[G+C])-675/n-1.0m简单估计Tm值，(G+C)含量在30％和70％之间，n是碱基数，m是错配碱基对百分比(参见例如，Sambrook J等人(2001),Molecular Cloning,A Laboratory Manual,(3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。其他参考文献包含更复杂的计算方法，这些方法在计算Tm时考虑到结构和序列特性(还可以参见，Anderson and Young(1985),Quantitative Filter Hybridization,Nucleic Acid Hybridization,和Allawiand Santa Lucia(1997),Biochemistry 36:10581-94)。
在本发明的实施方案中，在将靶核酸(例如DNB)装载在固体支持物上之前或之后，使用如本文所述的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸与待分析的核酸(例如DNB)接触并杂交，能够显著地改善核酸(例如DNB)的稳定性，从而例如在随后的核酸分析中，显著减小信号衰减。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于改善核酸在固体支持物上的稳定性的方法，其包括以下步骤：a)提供其上固定有核酸分子的固体支持物；和b)将如本文所述的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸杂交至所述固体支持物上的核酸分子，其中所述部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸分子杂交。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于改善核酸在固体支持物上的稳定性的方法，其包括以下步骤：a)提供核酸分子；b)将如本文所述的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸杂交至所述核酸分子，其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸分子杂交；和c)将所述核酸分子固定在固体支持物上。
在本发明的实施方案中，将如本文所述的部分双链寡核苷酸的靶结合区B和/或B’杂交至靶核酸后，可以以靶核酸为模板，在聚合酶的催化下从该靶结合区B和/或B’的3’端合成互补的核酸链。因此，在一些实施方案中，本发明的方法还可包括，在聚合酶的存在下以固体支持物上的核酸分子为模板从靶结合区B和/或B’的3’端合成互补的核酸链。在其它实施方案中，如本文所述的部分双链的寡核苷酸可以杂交至靶核酸而不用做起始核酸合成的引物。
适用于本文所述的部分双链的寡核苷酸的杂交条件是本领域已知的，参见，例如，Sambrook等人，同上文；Ausubel等人，同上文。也可参见Tijssen，Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology，Vol.24：Hybridization with Nucleic AcidProbes(Elsevier，NY 1993)。杂交通常在严格条件下进行，该严格条件允许互补的核酸链的稳定和特异性结合以及能除去寡核苷酸的非特异性结合的任何洗涤条件。通常，严格杂交发生在低于寡核苷酸的解链温度(Tm)大约5℃到低于Tm大约20℃-25℃的范围内。可以增加或降低严格度，以特异性地结合100％互补的靶核酸，或结合小于100％互补的相关核苷酸序列。在某些方法中，将非常严格的条件设置为等于特定寡核苷酸的Tm。诸如序列的长度和性质(DNA，RNA，碱基组成)，靶核酸的性质(DNA，RNA，碱基组成，存在于溶液中或固定)，以及盐和其它组分(例如，存在或缺乏甲酰胺，葡聚糖硫酸酯和/或聚乙二醇)的浓度等因素被考虑，而且可以改变杂交溶液以产生低、中等或者高严格条件。洗涤条件一般为室温到60℃。
例如，高严格条件可包括，例如，大约45℃在6xNaCl/柠檬酸钠(SSC)中进行的杂交步骤，接着于50℃用2xSSC进行洗涤；或者，可选择地，例如，42℃在5xSSC，20mM NaPO4，pH6.8，50％甲酰胺中进行杂交，接着于42℃用0.2xSSC进行洗涤。这些条件可以根据核苷酸碱基的组成和长度以及使用的环境，或者经验地或根据测定这种变化的公式而改变(参见，例如，Sambrook等人，上文；Ausubel等人，上文)。取决于靶核酸的碱基组成，来源和浓度，可使用其它的严格条件，包括，例如，低严格条件(例如，37-45℃于4-6xSSC/0.1-0.5％w/v SDS中进行2-3小时)，或中等严格条件(例如，45℃于1-4xSSC/0.25-0.5％w/v SDS中进行2-3小时)。
在本发明的一些实施方案中，通过将如本文所述的部分双链的寡核苷酸与含有泊洛沙姆的试剂结合使用可以进一步改善核酸在固体支持物上的装载。优选地，使用亲水性泊洛沙姆，例如，使用具有20-29的HLB的亲水性泊洛沙姆或其混合物，优选地，使用选自PF68、PF108、PF127、其等同物及其混合物的亲水性泊洛沙姆。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于改善核酸在固体支持物上的装载和稳定性的方法，其包括以下步骤：a)提供其上固定有核酸分子的固体支持物；b)使所述固体支持物与含有泊洛沙姆的试剂接触；和c)将如本文所述的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸杂交至所述固体支持物上的核酸分子，其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸分子杂交。在一些实施方案中，该方法包括在步骤a)中，在泊洛沙姆的存在下提供其上固定有核酸分子的固体支持物。在一些实施方案中，步骤c)可在步骤b)之前进行。
在其他实施方案中，本发明提供了用于改善核酸在固体支持物上的装载和稳定性的方法，其包括以下步骤：a)提供核酸分子；b)将如本文所述的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸杂交至所述核酸分子，其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸分子杂交；c)将核酸分子固定在固体支持物上；和d)使所述固体支持物与含有泊洛沙姆的试剂接触。在一些实施方案中，该方法包括在步骤c)中，在泊洛沙姆的存在下将核酸分子固定在固定支持物上。
在优选的实施方案中，在本发明的方法中用于固定在固体支持物上的核酸是核酸纳米球，例如DNA纳米球(DNB)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于改善核酸纳米球在固体支持物上的稳定性的方法，其包括：a)提供其上固定有核酸纳米球的固体支持物；和b)将如本文所述的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸杂交至所述固体支持物上的核酸纳米球，其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸纳米球杂交。在优选的实施方案中，所述核酸纳米球中的每个核酸拷贝包含与所述部分双链的寡核苷酸的靶结合区B和/或B’互补的区域。
在一个实施方案中，本发明提供了用于改善核酸纳米球在固体支持物上的稳定性的方法，其包括以下步骤：a)提供核酸纳米球；b)将如本文所述的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸杂交至所述核酸纳米球，其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸纳米球杂交；和c)将核酸纳米球固定在固体支持物上。在优选的实施方案中，所述核酸纳米球中的每个核酸拷贝包含与所述部分双链的寡核苷酸的靶结合区B和/或B’互补的区域。
在一个实施方案中，本发明提供了用于改善核酸纳米球在固体支持物上的装载和稳定性的方法，其包括以下步骤：a)提供其上固定有核酸纳米球的固体支持物；b)使所述固体支持物与含有泊洛沙姆的试剂接触；和c)将如本文所述的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸杂交至所述固体支持物上的核酸纳米球，其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸纳米球杂交。在一些实施方案中，该方法包括在步骤a)中，在泊洛沙姆的存在下提供其上固定有核酸纳米球的固体支持物。在一些实施方案中，步骤c)可在步骤b)之前进行。在优选的实施方案中，所述核酸纳米球中的每个核酸拷贝包含与所述部分双链的寡核苷酸的靶结合区B和/或B’互补的区域。
在一个实施方案中，本发明提供了用于改善核酸纳米球在固体支持物上的装载和稳定性的方法，其包括以下步骤：a)提供核酸纳米球；b)将如本文所述的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸杂交至所述核酸纳米球，其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸纳米球杂交；c)将核酸纳米球固定在固体支持物上；和d)使所述固体支持物与含有泊洛沙姆的试剂接触。在一些实施方案中，该方法包括在步骤c)中，在泊洛沙姆的存在下将核酸纳米球固定在固定支持物上。在优选的实施方案中，所述核酸纳米球中的每个核酸拷贝包含与所述部分双链的寡核苷酸的靶结合区B和/或B’互补的区域。
如本文所用的术语“纳米球”一般表示大分子或复合体，其具有紧凑的，例如内径范围典型地在大约1nm与大约1000nm之间，优选地大约50nm与大约500nm之间的(近似)球形形状。
如本文所用的术语“核酸纳米球”通常是包含多拷贝的靶核酸分子的多联体。这些核酸拷贝典型地一个接一个地布置在核苷酸的连续线型链中，但是本发明的核酸纳米球还可以利用本文描述的方法由任何核酸分子制成。该串联重复结构连同DNA的单链性质引起纳米球折叠(folding)配置。一般而言，核酸纳米球中的多拷贝的靶核酸分子各自包含序列已知的接头序列，以便于对其进行扩增或测序。各靶核酸分子的接头序列通常是相同的，但也可以不同。核酸纳米球通常包括DNA纳米球，在本文中也称为DNB(DNA nanoball)。
核酸纳米球可以使用例如滚环复制(RCR)来产生。RCR过程曾被用于制备多个连续拷贝的M13基因组(Blanco等人,(1989)J Biol Chem264:8935-8940)。在这种方法中，核酸经线性多联体化复制。本领域技术人员可以在许多参考文献中找到关于选择RCR反应的条件和试剂的指南，包括美国专利US5,426,180、US5,854,033、US6,143,495和US5,871,921，为了所有目的，特别是为了与利用RCR或其他方法制备核酸纳米球有关的全部教导，这些文献均通过引用全文并入本文。
通常，RCR反应组分包括单链DNA环、能够与DNA环退火的一或多种引物、具有链置换活性以延伸与DNA环退火的引物的3’末端的DNA聚合酶、核苷三磷酸和常规的聚合酶反应缓冲液。在允许引物退火到DNA环上的条件下将这些成分合并。通过DNA聚合酶延伸这些引物，以形成DNA环互补链的多联体。
形成本发明的DNB的方法在公开的专利申请WO2007120208、WO2006073504、WO2007133831和US2007099208,以及美国专利申请US60/992,485、US61/026,337、US61/035,914、US61/061,134、US61/116,193、US61/102,586、US12/265,593、US12/266,385、US11/938,096、US11/981,804、US11/981,797、US11/981,793、US11/981,767、US11/981,761、US11/981,730(2007年10月31日提交)、US11/981,685、US11/981,661、US11/981,607、US11/981,605、US11/927,388、US11/927,356、US11/679,124、US11/541,225、US10/547,214、US11/451,692和US11/451,691中有描述，为了所有目的，特别是为了与形成DNB有关的全部教导，这些文献的全部内容均通过引用全文并入本文。
核酸纳米球可以装载在如本文所述的固体支持物的表面上。纳米球可以通过任何合适的方法附着到固体支持物的表面，这样的方法的非限制性示例包括核酸杂交、生物素链霉亲和素结合、巯基结合、光活化结合、共价结合、抗体-抗原、经由水凝胶或其他多孔聚合物的物理限制等，或它们的组合。在一些情况下，纳米球可以用核酸酶(例如，DNA核酸酶)消化，以便从纳米球产生较小的纳米球或片段。
将核酸纳米球装载在固体支持物上的方法在公开的专利申请WO2007120208、WO2006073504、WO2007133831和US2007099208,以及美国专利申请US60/992,485、US61/026,337、US61/035,914、US61/061,134、US61/116,193、US61/102,586、US12/265,593、US12/266,385、US11/938,096、US11/981,804、US11/981,797、US11/981,793、US11/981,767、US11/981,761、US11/981,730、US11/981,685、US11/981,661、US11/981,607、US11/981,605、US11/927,388、US11/927,356、US11/679,124、US11/541,225、US10/547,214、US11/451,692和US11/451,691中有描述，为了所有目的，特别是为了与形成装载有核酸纳米球的固体支持物有关的全部教导，这些文献全部通过引用并入本文。
在一些实施方案中，使用具有两维斑点阵列的图案化基底制备装载DNB的固体支持物。将所述斑点活化以捕获并容纳DNB，而DNB不留在斑点之间的区域。总体而言，斑点上的DNB会排斥其它DNB，导致每个斑点只有一个DNB。DNB在固体支持物上的占有率一般超过90％，但是可在50％至100％占有率之间变动。
在其它实施方案中，图案化的表面使用标准硅加工技术制得。相比未图案化的阵列，这种图案化阵列可产生更高密度的DNB，从而产生具有更少像素的每碱基读数、更快的反应过程以及提高的试剂使用效率。在又一实施方案中，图案化基底为25mm×75mm(1”×3”)标准的显微镜载片，每一载片能够容纳约10亿个可结合DNB的独立斑点。应当理解的是，本发明包括更高密度的载片。在这些实施方案中，由于DNB设置在表面上，然后附着于活化斑点，因此高密度DNB阵列基本由溶液中的DNB“自组装”，避免了制备传统图案化低聚阵列或DNA阵列的最昂贵的方面之一。
某些实施方案中，固体支持物表面可能带有反应性官能团，所述反应性官能团与多核苷酸分子上的互补官能团反应形成共价键，例如采用与附着cDNA到微阵列上所用的技术相同的方式进行，例如参见Smirnov等人(2004),Genes,Chromosomes&Cancer,4 0:72-77和Beaucage(2001),Current Medicinal Chemistry,8:1213_1244，这两份文献通过引用并入本文。DNB还可以有效地附着到疏水性表面，例如带有低浓度的各种反应官能团(例如-OH基团)的干净的玻璃表面。经由多核苷酸分子和表面上的反应性官能团之间形成的共价键的附着在本文中又称为“化学附着”。
在其他实施方案中，多核苷酸分子可以吸附到表面上。在这种实施方式中，多核苷酸通过与表面的非特异性相互作用，或者通过诸如氢键、范德华力等的非共价相互作用被固定。
附着可能还包括不同严格度的清洗步骤以便除去来自前面的制备步骤的没有完全附着的单个分子或其他试剂，这些单个分子或试剂的存在是不需要的或者它们非特异性地结合在表面。
有许多种支持物可以利用来与DNB形成随机阵列，例如，如上文所述的固体支持物。一方面，支持物是具有表面的刚性固体，优选基本上是平面区域，这样待询问的单分子处于同一平面。后一种特性允许通过例如检测光学进行有效的信号收集。另一方面，所述支持物包含珠子，这种情况中珠子表面含有可以用来固定多核苷酸分子的反应性官能团或捕获探针。
再一方面，本发明的固体支持物是无孔的，特别是当单分子随机阵列是通过杂交反应进行分析需要小体积时。合适的固体支持物材料包括诸如玻璃、聚丙烯酰胺涂层的玻璃、陶瓷、硅石、硅、石英、各种塑料等材料。一方面，平面区域的面积可以在0.5到4cm2的范围内。一方面，固体支持物是玻璃或石英，例如具有均匀硅烷化表面的显微镜载片。这可以使用常规试验方案来实现，例如酸处理后浸泡在80℃的3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、N，N-二异丙基乙胺和无水二甲苯(8：1：24v/v)溶液中，形成环氧硅烷化的表面(例如Beattie等人(1995),Molecular Biotechnology,4:213)。例如通过在施加到表面前，给捕获寡核苷酸提供3’或5’三乙二醇磷酰间隔臂(参见以上引用的Beattie等人)，这样的表面很容易经过处理被捕获寡核苷酸末端附着。将表面官能化和进一步制备以用于本发明的其他实施方式在例如美国专利申请US60/992,485、US61/026,337、US 61/035,914、US61/061,134、US61/116,193、US61/102,586、US12/265,593、US12/266,385、US11/938,096、US11/981,804、US11/981,797、US 11/981,793、US11/981,767、US11/981,761、US11/981,730、US11/981,685、US11/981,661、US11/981,607、US11/981,605、US11/927,388、US11/927,356、US11/679,124、US11/541,225、US10/547,214、US11/451,692和UD11/451,691中有描述，为了所有目的，特别是为了与制备形成核酸阵列的固体支持物有关的全部教导以及与形成核酸阵列、尤其是DNB阵列有关的全部教导，以上文献均通过引用全文并入本文。
在本发明中涉及图案化基底的实施方案中，可以利用光刻法、电子束光刻、纳米压印光刻和纳米印刷在多种表面上产生这类图案，例如参见Pirrung等人的美国专利US5,143,854，Fodor等人的美国专利US5,774,305，Guo,(2004)Journal of PhysicsD：AppliedPhysics,37:R123-141，这些文献通过引用并入本文。
一方面，图案化基底的表面是通过光刻法制造的。将商购的光学平面的石英基底旋涂上100-500nm厚的光刻胶层。然后将光刻胶层烧到石英基底上。利用步进器，将带有待激活的区域图案的光网(reticle)图像投射到光刻胶层表面。曝光后，给光刻胶层显影，除去投射图案中暴露在UV源下的区域。这是通过等离子体蚀刻(一种能够产生非常细微的细节的干式显影技术)实现的。然后将基底烘烤来强化剩下的光刻胶层。烘烤后，石英晶片即可以进行官能化。然后将晶片经过3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷气相沉积。通过改变单体的浓度和基底的曝光时间，可以严格控制氨基官能化单体的密度。只有已暴露于等离子蚀刻处理的石英区域可以与所述单体反应并捕获单体。然后再次烘烤基底以将单层的氨基官能化单体烤到暴露的石英上。烘烤后，可以用丙酮除去剩下的光刻胶。因为光刻胶和硅烷的附着化学特性的不同，所以基底上氨基硅烷官能化的面积在丙酮清洗过程中保持完整。这些区域可以通过与溶于吡啶和N-N-二甲基甲酰胺的溶液中的P-亚苯基二异硫氰酸盐反应而将这些区域进一步官能化。然后基底能够与胺修饰的寡核苷酸反应。可选地，可以用5’-羧基-改性剂-C10连接分子(Glen Research)制备寡核苷酸。这项技术允许寡核苷酸直接附着到胺修饰过的支持物上，从而避免另外的官能化步骤。
在另一方面，图案化基底的表面是通过纳米压印光刻法(NIL)制造的。为了制备DNA阵列，给石英基底旋涂一层光刻胶层，通常被称为转移层。然后在转移层上施加第二类光刻胶，通常称为压印层。然后主压印工具在压印层上留下压痕。然后通过等离子体蚀刻减小压印层的总厚度，直至压印层较低的区域碰到转移层。因为转移层比压印层较难除去，因此其基本不受影响。然后通过加热使压印层和转移层硬化。然后将基底放入等离子体蚀刻仪，直至压印层较低的区域碰到石英。然后通过如上描述的气相沉积将基底衍生化。
在另一方面，图案化基底的表面是通过纳米印刷术制造的。这个过程利用光、压印或电子束刻印术产生主模具，它是打印头上需要的特征图样的阴图像。打印头通常是由软的柔性聚合物(例如聚二甲基硅氧烷(PDMS))制成的。属性不同的这种材料或者材料层旋涂到石英基底上。然后在受控的温度和压力条件下，用模具将特征图样浮雕到光刻胶材料的表层。然后对打印头进行基于等离子体的蚀刻过程以便改善打印头的长宽比，并消除由于被加浮雕的材料随时间松弛而造成的打印头的变形。随机阵列基底是利用纳米印刷术通过在均质衍生化表面上留下胺修饰的寡核苷酸图样制造的。这些寡核苷酸将作为RCR产物的捕获探针。纳米印刷术的一个可能的优势是能够将不同捕获探针的交织图样印刷到随机阵列支持物上。这可以用多个打印头通过接连印刷来实现，其中每个打印头带有不同图样，所有图样配合在一起形成最终的带结构的支持物图样。这类方法允许在随机阵列中对DNA元件进行一些定位编码。例如，含有特异序列的对照多联体可以以规则的间隔结合在随机阵列上。
在又一方面，利用打印头或压印主机(imprint-master)制备亚微米大小的捕获寡核苷酸斑点的高密度阵列，其中所述打印头或压印主机是由一束或多束大约10,000到1亿包含轴芯和被覆材料的光纤制备的。通过光纤的拉丝和熔接产生独特的材料，该材料含有大约50-1000nm的轴芯，被类似大小或者小或大2-5倍大小的被覆材料隔开。通过被覆材料的差异蚀刻(溶解)获得含有非常大量纳米级的小杆(posts)的纳米打印头。这种打印头可以用于放置寡核苷酸或者其他生物(蛋白质、寡肽、DNA、适配子)或化学化合物，例如带有各种活性基团的硅烷。在一种实施方式中，玻璃纤维工具被用作带有图样的支持物来存放寡核苷酸或其他生物或化学化合物。这种情况中，只有通过蚀刻产生的小杆可以与待存放的材料接触。可以利用平切的熔接纤维束来引导光穿过轴芯，只允许光诱发的化学过程发生在轴芯头表面，因此不需要进行蚀刻。两种情况中，同一支持物然后可以作为给寡核苷酸或其他反应物贴标签使用的荧光标记成像的光导/收集装置。该装置提供具有大数值孔径(可能>1)的大视野。可以利用实施活性材料或寡核苷酸的存放的印记或印刷工具将2到100个不同的寡核苷酸印刷为交织的式样。这个过程需要将打印头精确地定位在大约50-500nm。这种类型的寡核苷酸阵列可以用于附着2到100个不同的DNA群体，例如不同的源DNA。它们还可以通过利用DNA特异性锚定子或标签，用于平行读取亚光分辨率光点。可以通过DNA特异性标签(例如针对16种DNA的16种特异锚定子)获取信息，通过5-6种颜色的组合，利用16个连接循环或者一个连接循环和16个解码循环来读取2个碱基。如果每个片段只需有限的信息(例如，少量循环)，则这种制备阵列的方式是有效的，因此每个循环可以提供更多信息或者每个表面可以做更多循环。
如上文所述，在本发明的一个实施方案中，DNB可设置或“装载”于图案化表面上以形成高密度DNB阵列。
根据一个实施方案，将DNB制剂装载至流式载片中，如Drmanac等人,Science 327:78-81,2010中所述。简言之，通过将DNB吸移至载片上来装载载片。例如，比结合位点多2至3倍的DNB可被吸移至载片上。将装载后的载片在23℃孵育2小时，冲洗以中和pH并除去未结合的DNB。
根据以上描述的方法制备的DNB在鉴定靶核酸的序列方面带来了优势，因为DNB通常含有衔接子(意指序列已知的寡核苷酸，含有关于衔接子的DNB的具体描述可参见例如国际专利申请WO2013066975)，其提供了已知序列点，当与使用测序引物的方法组合时，可以容易地测定序列。此外，DNB避免了依赖于单一分子测序系统所使用的单一荧光团检测的花费和问题，因为多拷贝靶序列存在于单一DNB中。
根据本发明的DNB的使用方法包括给靶核酸测序和探测靶核酸中的特异序列(例如，探测特异靶序列(例如，特异基因)和/或鉴定和/或探测SNP)。文中描述的方法还可以用于检测核酸重排和拷贝数变化。核酸定量，例如数字化基因表达(即，分析样品中存在的整个转录子组-全部mRNA)，和检测样品中特异序列或序列组的数量，也可以利用本文描述的方法来实现。尽管文中的大部分讨论是针对鉴定DNB的序列，但可以理解包含衔接子的其他非多联体核酸构建体也可以用于本文描述的实施方式中。
经过本发明的上述方法处理的固体支持物可用于多种应用，例如用于核酸测序。这样的固体支持物还可用于与多种生物化学分析相关联，包括，例如，核酸杂交、酶促反应(例如，使用内切酶(包括限制性内切酶)，外切酶，激酶，磷酸酶，连接酶等)、核酸合成、核酸扩增(例如，通过聚合酶链式反应，滚环复制，全基因组扩增，多重置换扩增等进行)，以及使用附着于固体支持物的核酸的本领域已知的生物化学分析的任何其它形式。
在其他实施方案中，本发明还提供了如本文所述的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸用于改善核酸(特别是核酸纳米球)在固体支持物上的稳定性的用途。优选地，在将核酸装载在固体支持物上之前或之后使如本文所述的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸杂交至固体支持物上的核酸，其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸杂交。
在其他实施方案中，本发明还提供了泊洛沙姆用于改善核酸在固体支持物上的装载的用途，其包括在泊洛沙姆的存在下将核酸固定在固定支持物上和/或在将核酸装载在固体支持物上之后使所述固体支持物与含有泊洛沙姆的试剂接触。
在其他实施方案中，本发明还提供了一种固体支持物，所述固体支持物上固定有核酸分子，并且所述核酸分子与如本文所述的部分双链的寡核苷酸或一组部分双链的寡核苷酸杂交，其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸分子杂交。在优选的实施方案中，所述核酸分子是核酸纳米球，例如DNB。
如本文所述的改善核酸装载和稳定性的方法可以有多种应用，包括但不限于用于核酸分析，例如核酸测序、核酸杂交试验或酶辅助的核酸试验。本发明的方法可以用于与多种生物化学分析相关联，包括，例如，核酸杂交、酶促反应(例如，使用内切酶(包括限制性内切酶)，外切酶，激酶，磷酸酶，连接酶等)、核酸合成、核酸扩增(例如，通过聚合酶链式反应，滚环复制，全基因组扩增，多重置换扩增等进行)，以及使用附着于固体支持物的核酸的本领域已知的生物化学分析的任何其它形式。
因此，在其他实施方案中，本发明还提供了核酸分析的方法，其包括：a)根据本文所述的改善核酸在固体支持物上的装载的方法获得其上固定有核酸分子的固体支持物，和b)分析所述固体支持物上的核酸分子。核酸分析包括，但不限于，核酸测序、核酸杂交试验或酶辅助的核酸试验。在优选的实施方案中，所述核酸分子是核酸纳米球，例如DNB。
附图说明
图1显示使用常规装载DNB的芯片测序第一个碱基的信号热图。
图2显示使用改善装载DNB的芯片测序第一个碱基的信号热图。
图3显示使用装载DNB的芯片测序15个碱基后信号值(Rho)下降的比较。
图4显示使用改善装载DNB的芯片测序第一个碱基的信号热图。
图5显示使用TritonX-100对DNB装载的影响。
图6显示使用X-接头寡核苷酸对DNB装载的影响。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：DNB的常规装载
根据制造商的说明书，采用MGIEasyTM DNA文库制备试剂盒(深圳华大智造科技有限公司)以大肠杆菌标准菌株为原料提取DNA制备用于测序的文库。参考BGISEQ-500DNB制备加载试剂盒(深圳华大智造科技有限公司，货号85-05531-00)，将制备好的DNB加载到测序芯片上。
如Drmanacetal.,Science 327:78-81,2010中所述将DNB吸附至光蚀刻的表面修饰的芯片上。具体地，将DNB用DNB加载缓冲液Ⅰ(DNB Load BufferⅠ)稀释到5ng/ul，然后与DNB上样缓冲液Ⅱ(DNB Load BufferⅡ)按照3:1比例混合，加入到置有芯片的试剂槽中，室温下孵育60-90min。所用DLBⅠ(DNB Load BufferⅠ)及DLBⅡ(DNB Load BufferⅡ)参照BGISEQ-500DNB制备加载试剂盒(深圳华大智造科技有限公司，货号85-05531-00)。
装载后，参照以下步骤进行芯片的装载后处理。具体地，不要移动芯片，在同一个试剂槽中进行同时进液与排液，排液速度尽可能慢，速率为小于62μl/s，新加入试剂的体积为前一种试剂体积的2-3倍。按以下步骤进行操作。所用试剂参照BGISEQ-500DNB制备加载试剂盒中的样品加载试剂板(Post Load Plate)V3.0(深圳华大智造科技有限公司，货号85-05531-00)。
a)排出DLB的同时进液DNB Rinse Buffer(DRB)，约2min，
b)排出DRB的同时进液DNB Crash Buffer(DCB)，约5min,
c)排出DCB的同时进液Read Buffer(REB)，约2min,
d)排出REB的同时进液Protein Wash Buffer(PWB)，约8min,
e)排出PWB的同时进液DNB Crash Buffer(DCB)，约5min,
f)排出DCB的同时进液Read Buffer(REB)，约2min，并重复此步骤一次，
g)以同样速度，排空试剂槽内的REB,芯片仍不要移动，
h)缓慢加入测序引物(5’-CAA CTC CTT GGC TCA CAG AAC GAC ATG GCT ACG ATCCGA CTT-3’)(水溶液，2ml)，室温下温育20min，
i)将处理后的芯片置于洗涤试剂2中备用。洗涤试剂2来源于BGISEQ-500测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)，其是用于在聚合反应后洗涤芯片的洗涤试剂，
j)测序一个碱基，由BGISEQ-500测序仪(深圳华大智造科技有限公司)自带的程序分析信噪比(SNR)和各碱基分辨情况(FIT)。如图1所示，测序第一个碱基(碱基A)的SNR值为10，FIT值为0.89，
具体的测序步骤如下：将芯片浸泡在聚合反应试剂中约1min，移出芯片，随后浸泡在洗涤试剂2中约1min，移出芯片，随后浸泡在保护试剂中约1min，移出芯片，对其进行20-30min的拍照以检测代表一个碱基的身份信息的荧光信号。所使用的试剂均来自BGISEQ-500测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)，各步骤的温度等反应条件以及拍照程序均参照试剂盒的说明书以及BGISEQ-500测序平台的标准程序进行。
实施例2：泊洛沙姆PF68改善DNB装载
采用与实施例1相同的程序装载DNB，不同的是将0.2％的PF68加入到用于在装载后处理芯片的试剂(DRB,PWB,DCB,REB)中。
具体地，将DNB用DNB加载缓冲液Ⅰ(DNB Load BufferⅠ)稀释到5ng/ul，在与DNB上样缓冲液Ⅱ(DNB Load BufferⅡ)按照3:1比例混合，加入到置有芯片的试剂槽中，室温下孵育60-90min。
装载后，不要移动芯片，在同一个试剂槽中进行同时进液与排液，排液速度尽可能慢，速率为小于62μl/s，新加入试剂的体积为前一种试剂体积的2-3倍。按以下步骤进行操作。
a)排出DLB的同时进液DRB，约2min，
b)排出DRB的同时进液DCB，约5min,
c)排出DCB的同时进液REB，约2min,
d)排出REB的同时进液PWB，约8min,
e)排出PWB的同时进液DCB，约5min,
f)排出DCB的同时进液REB，约2min，并重复此步骤一次，
g)以同样速度，排空试剂槽内的REB,芯片仍不要移动，
h)缓慢加入测序引物(5’-CAA CTC CTT GGC TCA CAG AAC GAC ATG GCT ACG ATCCGA CTT-3’)，室温下温育20min，
i)将处理后的芯片置于洗涤试剂2中备用，
j)如实施例1所述测序一个碱基，由BGISEQ-500测序仪(深圳华大智造科技有限公司)自带的程序分析信噪比(SNR)和各碱基分辨情况(FIT)。如图2所示，测序第一个碱基(碱基A)的SNR值为12，FIT值为0.93。这样的结果显示PF68的加入改善了DNB的装载。
此外，还利用测序仪自带的程序分析了测序第1个碱基到测序第15个碱基的信号强度变化。测序多个碱基的具体的步骤如下：将芯片浸泡在聚合反应试剂中约1min，移出芯片，随后浸泡在洗涤试剂2中约1min，移出芯片，随后浸泡在保护试剂中约1min，移出芯片，对其进行20-30min的拍照以检测代表一个碱基的身份信息的荧光信号，随后将芯片浸泡在再生试剂中约1min，移出芯片，随后浸泡在洗涤试剂1中约1min，移出芯片；随后对芯片重复前述的操作步骤以进行下一个碱基的测序。所使用的试剂均来自BGISEQ-500测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)，各步骤的温度等反应条件以及拍照程序均参照试剂盒的说明书以及BGISEQ-500测序平台的标准程序进行。经过55℃高温反应，DNB状态变差，信号降低了60％，尤其是芯片上端。
结果如图3所示，测序第15个碱基的信号值(Rho)相对于测序第1个碱基的信号值降低了约60％。尤其是在芯片的上端(图3右侧)，信号值受到显著的影响。
此外，还利用BGISEQ-500测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)，将芯片加载到BGISEQ-500测序仪(深圳华大智造科技有限公司)中完成了一个碱基的测序，类似地，表明PF68的加入改善了DNB的装载(结果未显示)。
实施例3：泊洛沙姆PF127改善DNB装载
采用与实施例1相同的程序装载DNB，不同的是将0.5％的PF127加入到用于在装载后处理芯片的试剂(DRB,PWB,DCB,REB)中。
具体地，将DNB用DNB加载缓冲液Ⅰ(DNB Load BufferⅠ)稀释到5ng/ul，在与DNB上样缓冲液Ⅱ(DNB Load BufferⅡ)按照3:1比例混合，加入到置有芯片的试剂槽中，室温下孵育60-90min。
装载后，不要移动芯片，在同一个试剂槽中进行同时进液与排液，排液速度尽可能慢，速率为小于62μl/s，新加入试剂的体积为前一种试剂体积的2-3倍。按以下步骤进行操作。
a)排出DLB的同时进液DRB，约2min，
b)排出DRB的同时进液DCB，约5min,
c)排出DCB的同时进液REB，约2min,
d)排出REB的同时进液PWB，约8min,
e)排出PWB的同时进液DCB，约5min,
f)排出DCB的同时进液REB，约2min，并重复此步骤一次，
g)以同样速度，排空试剂槽内的REB,芯片仍不要移动，
h)缓慢加入测序引物(5’-CAA CTC CTT GGC TCA CAG AAC GAC ATG GCT ACG ATCCGA CTT-3’)，室温下温育20min，
i)将处理后的芯片置于洗涤试剂2中备用，
j)如实施例1所述测序一个碱基，由BGISEQ-500测序仪(深圳华大智造科技有限公司)自带的程序分析信噪比(SNR)和各碱基分辨情况(FIT)。如图4所示，测序第一个碱基(碱基A)的SNR值为12，FIT值为0.94。这样的结果显示PF127的加入改善了DNB的装载，并且与PF68的结果相似。
此外，还利用BGISEQ-500测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)，将芯片加载到BGI-SEQ500测序仪(深圳华大智造科技有限公司)中完成了一个碱基的测序，类似地，表明PF127的加入改善了DNB的装载(结果未显示)。
实施例4：TritonX-100对DNB装载的影响
采用与实施例1相同的程序装载DNB，不同的是将0.1％的TritonX-100加入到用于在装载后处理芯片的试剂(DRB,DCB,PWB,REB)中。
具体地，将DNB用DNB加载缓冲液Ⅰ(DNB Load BufferⅠ)稀释到5ng/ul，在与DNB上样缓冲液Ⅱ(DNB Load BufferⅡ)按照3:1比例混合，加入到置有芯片的试剂槽中，室温下孵育60-90min。
装载后，不要移动芯片，在同一个试剂槽中进行同时进液与排液，排液速度尽可能慢，速率为小于62μl/s，新加入试剂的体积为前一种试剂体积的2-3倍。按以下步骤进行操作。
a)排出DLB的同时进液DRB，约2min，
b)排出DRB的同时进液DCB，约5min,
c)排出DCB的同时进液REB，约2min,
d)排出REB的同时进液PWB，约8min,
e)排出PWB的同时进液DCB，约5min,
f)排出DCB的同时进液REB，约2min，并重复此步骤一次，
g)以同样速度，排空试剂槽内的REB,芯片仍不要移动，
h)缓慢加入测序引物(5’-CAA CTC CTT GGC TCA CAG AAC GAC ATG GCT ACG ATCCGA CTT-3’)，室温下温育20min，
i)将处理后的芯片置于洗涤试剂2中备用，
j)如实施例1所述测序一个碱基，由BGISEQ-500测序仪(深圳华大智造科技有限公司)自带的程序分析信噪比(SNR)和失效时间(FIT)。如图5所示，测序第一个碱基(碱基A)的SNR值为6，FIT值为0.7。这表明TritonX-100的加入不仅没有改善DNB的装载，反而使得DNB的装载效果变差，在芯片上的DNB不均匀现象也比较明显。这样的结果证明，泊洛沙姆改善DNB装载的作用是独特的。
实施例5：X-接头寡核苷酸改善DNB稳定性
采用与实施例1相同的程序装载DNB，不同的是使用2种部分双链的寡核苷酸取代测序引物，即寡核苷酸1和寡核苷酸2。
寡核苷酸1和寡核苷酸2各自通过序列相同的两条寡核苷酸链在常温条件下混合和杂交而形成。
寡核苷酸1的两条寡核苷酸链的序列为：
5-GCCGTGCCACTGCGTGCGTCGACGGATGCGGCGGTCTCATGAGACCGCCGCAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3。
寡核苷酸2的两条寡核苷酸链的序列为：
5-CATCCGTCGACGCACGCAGTGGCACGGCGGCACGTACTAGTACGTGCCCAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3。
寡核苷酸1和寡核苷酸2可以以1:1的浓度比在常温条件下混合和杂交，从而形成图7所示的结构。
具体地，将DNB用DNB加载缓冲液Ⅰ(DNB Load BufferⅠ)稀释到5ng/ul，在与DNB上样缓冲液Ⅱ(DNB Load BufferⅡ)按照3:1比例混合，加入到置有芯片的试剂槽中，室温下孵育60-90min。
装载后，不要移动芯片，在同一个试剂槽中进行同时进液与排液，排液速度尽可能慢，速率为小于62μl/s，新加入试剂的体积为前一种试剂体积的2-3倍。按以下步骤进行操作。DRB,PWB,DCB,REB中均添加有0.2％的PF68。
a)排出DLB的同时进液DRB，约2min，
b)排出DRB的同时进液DCB，约5min,
c)排出DCB的同时进液REB，约2min,
d)排出REB的同时进液PWB，约8min,
e)排出PWB的同时进液DCB，约5min,
f)排出DCB的同时进液REB，约2min，并重复此步骤一次，
g)以同样速度，排空试剂槽内的REB,芯片仍不要移动，
h)按浓度比为1:1缓慢加入X-接头寡核苷酸1和寡核苷酸2，室温下温育20min，
i)将处理后的芯片置于洗涤试剂2中备用，
j)如实施例1所述测序一个碱基，由BGI-SEQ500测序仪(深圳华大智造科技有限公司)自带的程序分析信噪比(SNR)和各碱基分辨情况(FIT)。如图6所示，测序第一个碱基(碱基A)的SNR值为12，FIT值为0.94。进一步，利用测序仪自带的程序分析了测序第1个碱基到测序第15个碱基的信号强度变化。结果如图6所示，测序第15个碱基的信号值(Rho)相对于测序第1个碱基的信号值降低了约24％，并且在整个芯片上，尤其是在芯片上端(图6右侧)，信号值没有受到显著的影响。这样的结果显示，X-接头寡核苷酸的使用显著提高了DNB装载的牢固性，并且DNB在测序过程中的稳定性得到了显著改善。
此外，还利用BGISEQ-500测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)，将芯片加载到BGI-SEQ500测序仪(深圳华大智造科技有限公司)中完成了15个碱基的测序，类似地，表明X-接头寡核苷酸的使用改善了DNB的稳定性(结果未显示)。

Claims (27)

1.一种用于改善核酸纳米球在固体支持物上的装载的方法，其包括a)提供其上固定有核酸纳米球的固体支持物，和b)使所述固体支持物与含有泊洛沙姆的试剂接触。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述核酸纳米球是DNA纳米球。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤a)中，在泊洛沙姆的存在下提供其上固定有核酸纳米球的固体支持物。
4.一组部分双链的寡核苷酸，其包含至少两种部分双链的寡核苷酸，其中每种部分双链的寡核苷酸包含第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链，所述第一寡核苷酸链从5’到3’包含区域C、区域A和区域B，以及所述第二寡核苷酸链从5’到3’包含区域A’和区域B’，任选地，所述第二寡核苷酸链还包含位于区域A’上游的区域C’；其中区域A和A’彼此反向互补，并且区域B和B’彼此不互补且各自与预定的靶序列互补，其中所述第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链通过区域A和A’彼此杂交，从而形成所述部分双链的寡核苷酸，
其中至少一种部分双链的寡核苷酸的区域C与至少另一种部分双链的寡核苷酸的区域C反向互补，以使得至少两种部分双链的寡核苷酸能够通过各自的区域C彼此杂交。
5.权利要求4所述的一组部分双链的寡核苷酸，其中，所述区域C或C’可以被设计为当存在第二部分双链的寡核苷酸时，第一部分双链的寡核苷酸的区域C或C’分别与第二部分双链的寡核苷酸的区域C或C’反向互补，以使得第一部分双链的寡核苷酸和第二部分双链的寡核苷酸能够通过各自的区域C或C’彼此杂交，或者
所述区域C和C’可以被设计为当存在第二部分双链的寡核苷酸时，第一部分双链的寡核苷酸的区域C和C’的至少之一与第二部分双链的寡核苷酸的区域C和C’的至少之一反向互补，以使得第一部分双链的寡核苷酸和第二部分双链的寡核苷酸能够通过各自的区域C和/或C’彼此杂交。
6.权利要求4或5所述的一组部分双链的寡核苷酸，其中，所述第一寡核苷酸链从5’到3’包含区域C、区域A和区域B，以及所述第二寡核苷酸链从5’到3’包含区域C’、区域A’和区域B’，其中区域A和A’彼此反向互补，并且区域B和B’彼此不互补且各自与预定的靶序列互补，其中所述第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链通过区域A和A’彼此杂交，从而形成所述部分双链的寡核苷酸，其中至少一种部分双链的寡核苷酸的区域C和C’的至少之一与至少另一种部分双链的寡核苷酸的区域C和C’的至少之一反向互补，以使得至少两种部分双链的寡核苷酸能够通过各自的区域C和/或C’彼此杂交。
7.权利要求4-6所述的一组部分双链的寡核苷酸，其具有选自下列的一项或多项特征：
(1)区域C和C’可以具有相同或不同的序列；
(2)所述区域B和B’被设计为与相同靶序列互补，或者所述区域B和B’被设计为与不同靶序列互补；
(3)所述区域A和A’的长度为15-30个核苷酸；
(4)所述区域B和B’的长度为30-42个核苷酸；
(5)所述区域C和C’的长度为20-50个核苷酸。
8.一种用于改善核酸在固体支持物上的稳定性的方法，其包括以下步骤：a)提供其上固定有核酸分子的固体支持物；和b)将或权利要求4-7任一项所述的一组部分双链的寡核苷酸杂交至所述固体支持物上的核酸分子，其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸分子杂交。
9.一种用于改善核酸在固体支持物上的稳定性的方法，其包括以下步骤：a)提供核酸分子；b)将权利要求4-7任一项所述的一组部分双链的寡核苷酸杂交至所述核酸分子，
其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸分子杂交；和c)将所述核酸分子固定在固体支持物上。
10.权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：a)提供其上固定有核酸分子的固体支持物；b)使所述固体支持物与含有泊洛沙姆的试剂接触；和c)将一种部分双链的寡核苷酸或权利要求4-7任一项所述的一组部分双链的寡核苷酸杂交至所述固体支持物上的核酸分子，
其中，所述部分双链的寡核苷酸包含第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链，所述第一寡核苷酸链从5’到3’包含区域C、区域A和区域B，以及所述第二寡核苷酸链从5’到3’包含区域A’和区域B’，任选地，所述第二寡核苷酸链还包含位于区域A’上游的区域C’；其中区域A和A’彼此反向互补，并且区域B和B’彼此不互补且各自与预定的靶序列互补，其中所述第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链通过区域A和A’彼此杂交，从而形成所述部分双链的寡核苷酸，
其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸分子杂交。
11.权利要求10所述的方法，在步骤a)中，在泊洛沙姆的存在下提供其上固定有核酸分子的固体支持物。
12.权利要求10所述的方法，步骤c)可在步骤b)之前进行。
13.权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：a)提供核酸分子；
b)将一种部分双链的寡核苷酸或权利要求4-7任一项所述的一组部分双链的寡核苷酸杂交至所述核酸分子，
其中，所述部分双链的寡核苷酸包含第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链，所述第一寡核苷酸链从5’到3’包含区域C、区域A和区域B，以及所述第二寡核苷酸链从5’到3’包含区域A’和区域B’，任选地，所述第二寡核苷酸链还包含位于区域A’上游的区域C’；其中区域A和A’彼此反向互补，并且区域B和B’彼此不互补且各自与预定的靶序列互补，其中所述第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链通过区域A和A’彼此杂交，从而形成所述部分双链的寡核苷酸，
其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸分子杂交；
c)将核酸分子固定在固体支持物上；和d)使所述固体支持物与含有泊洛沙姆的试剂接触。
14.权利要求13所述的方法，在步骤c)中，在泊洛沙姆的存在下将核酸固定在固定支持物上。
15.权利要求8-14任一项所述的方法，其中，所述核酸是核酸纳米球。
16.权利要求8-14任一项所述的方法，其中，所述核酸是DNA纳米球。
17.权利要求1-3，10-14中任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一项或多项特征：
(1)所述泊洛沙姆是亲水性泊洛沙姆；
(2)所述亲水性泊洛沙姆是HLB 20-29的亲水性泊洛沙姆或其混合物；
(3)所述亲水性泊洛沙姆选自PF68、PF108、PF127、其等同物及其混合物。
18.权利要求1-3，10-14中任一项的方法，其包括使所述固体支持物与含有0.01％-2％(w/v)的泊洛沙姆的试剂接触。
19.权利要求18所述的方法，其中，使所述固体支持物与含有0.2％-0.5％(w/v)的泊洛沙姆的试剂接触。
20.权利要求4-7任一项所述的一组部分双链的寡核苷酸用于改善核酸在固体支持物上的稳定性的用途，其包括在将核酸装载在固体支持物上之前或之后使权利要求4-7任一项所述的一组部分双链的寡核苷酸杂交至所述核酸，其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸杂交。
21.权利要求20所述的用途，其中，所述核酸是核酸纳米球。
22.一种固体支持物，所述固体支持物上固定有核酸分子，并且所述核酸分子与权利要求4-7任一项所述的一组部分双链的寡核苷酸杂交，其中部分双链的寡核苷酸通过区域B和/或B’与核酸分子杂交。
23.权利要求22所述的固体支持物，其中，所述核酸是核酸纳米球。
24.权利要求22或23所述的固体支持物，其中，所述核酸纳米球是DNA纳米球。
25.一种核酸分析的方法，其包括：
a)根据权利要求1-3，8-19中任一项的方法获得其上固定有核酸纳米球的固体支持物，和
b)分析所述固体支持物上的核酸纳米球。
26.权利要求25所述的方法，其中，核酸分析包括核酸测序、核酸杂交试验或酶辅助的核酸试验。
27.权利要求25或26所述的方法，其中，所述核酸纳米球是DNA纳米球。
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