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CN111132994A - 在c末端螺旋区中具有半胱氨酸的fc结合蛋白 - Google Patents

在c末端螺旋区中具有半胱氨酸的fc结合蛋白 Download PDF

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CN111132994A CN201880061829.9A CN201880061829A CN111132994A CN 111132994 A CN111132994 A CN 111132994A CN 201880061829 A CN201880061829 A CN 201880061829A CN 111132994 A CN111132994 A CN 111132994A
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Abstract

本发明涉及Fc结合蛋白，其包含一个或多个在C‑端螺旋区中具有半胱氨酸的结构域。本发明还涉及包含本发明的Fc结合蛋白的亲和基质。本发明还涉及这些Fc结合蛋白或亲和基质在免疫球蛋白的亲和纯化中的用途以及使用本发明的Fc结合蛋白的亲和纯化方法。

Description

在C末端螺旋区中具有半胱氨酸的FC结合蛋白
发明领域
本发明涉及包含一个或多个在C-末端螺旋区中具有半胱氨酸的结构域的Fc结合蛋白。本发明还涉及包含本发明的Fc结合蛋白的亲和基质。本发明还涉及这些Fc结合蛋白或亲和基质在免疫球蛋白的亲和纯化中的用途以及使用本发明的Fc结合蛋白的亲和纯化方法。
发明背景
许多生物技术和制药应用要求从含有抗体的样品中去除污染物。捕获和纯化抗体的一种既定方法是使用来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细菌细胞表面蛋白A作为免疫球蛋白的选择性配体的亲和色谱法(参见，例如，由Huse等，J.Biochem.Biophys.Methods 51,2002:217-231综述的)。野生型蛋白A以高亲和力和选择性结合IgG分子的Fc区，并且在高温和宽范围的pH值下稳定。有具改善的性质诸如碱性稳定性的蛋白A的变体可供用于纯化抗体，并且包含蛋白A配体的各种色谱基质是商购可得的。然而，特别地基于野生型蛋白A的色谱基质在暴露于碱性条件后显示出对免疫球蛋白的结合能力的丧失。
本发明面对的技术问题
大多数抗体或含Fc的融合蛋白的大规模生产方法使用蛋白A进行亲和纯化。然而，由于蛋白A在亲和色谱法中应用的局限性，本领域需要提供新型Fc结合蛋白，其具有与免疫球蛋白特异性结合以便促进免疫球蛋白的亲和纯化的改善的性质。为了最大程度地利用包含Fc结合蛋白的色谱基质的价值，期望多次使用亲和配体基质。在色谱循环之间，需要彻底的清洁程序来清除和去除基质上的残留污染物。在该方法中，通常的做法是将具有高浓度的NaOH的碱性溶液施加到亲和配体基质上。野生型蛋白A结构域不能长时间承受这种苛刻的碱性条件，会很快失去对免疫球蛋白的结合能力。因此，在该领域中持续需要获得能够经受碱性条件下的长期处理的新型Fc结合蛋白。
本发明提供了特别适合于免疫球蛋白的亲和纯化但克服了现有技术的不利方面的Fc结合蛋白。特别地，本发明的Fc结合蛋白的一个显著有利方面是它们在高pH下长时期的改善的稳定性而不会降低与高动态结合能力结合的Fc结合能力。另外，新型Fc结合蛋白允许在pH为3.5或更高的条件下从固定至基质的Fc结合蛋白洗脱大于95％的结合的Fc蛋白。
以上概述未必描述了本发明所解决的所有问题。
发明概述
本发明的第一方面是提供适用于亲和纯化的Fc结合蛋白。这通过包含一个或多个Fc结合结构域的Fc结合蛋白来实现，其中对应于SEQ ID NO:2的位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处的至少一个氨基酸是半胱氨酸。优选地，螺旋3中的一个或两个氨基酸是半胱氨酸。在一些实施方案中，Fc结合蛋白包含一个或多个Fc结合结构域，其中至少一个结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成，其中对应于SEQ ID NO:2的位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处的至少一个氨基酸是半胱氨酸。在一些实施方案中，至少一个结构域分别包含SEQ ID NO:3-16的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成，其中对应于SEQ ID NO:3-16的位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处的至少一个氨基酸是半胱氨酸。在一些实施方案中，至少一个结构域分别包含SEQ ID NO:7-8的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成，其中对应于SEQID NO:7-8的位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处的至少一个氨基酸是半胱氨酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:2的位置43、46或47处的一个或两个氨基酸是半胱氨酸，优选为位置43、46或47处的一个氨基酸或位置43和46或43和47处的两个氨基酸。在一些实施方案中，至少一个结构域包含选自SEQ ID NO:17-77、90-99的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。
在第二方面，本发明涉及包含第一方面的Fc结合蛋白的亲和分离基质。
在第三方面，本发明涉及第一方面的Fc结合蛋白或第二方面的亲和分离基质在免疫球蛋白或包含免疫球蛋白的Fc部分的蛋白质的亲和纯化方面的用途。
在第四方面，本发明涉及免疫球蛋白或包含免疫球蛋白的Fc部分的蛋白质的亲和纯化的方法，其包括以下步骤：(a)提供包含免疫球蛋白的液体；(b)提供亲和分离基质，其包含与所述亲和分离基质偶联的第一方面的固定的Fc结合蛋白；(c)使所述液体与所述亲和分离基质接触，其中所述免疫球蛋白与所述固定化的Fc结合蛋白结合；以及(d)从所述基质洗脱所述免疫球蛋白，从而获得含有所述免疫球蛋白的洗脱液。本发明的概述未必描述本发明的所有特征。通过根据随后的详细描述的综述，其他实施例将变得显而易见。
附图说明
图1.在c末端螺旋区域(螺旋3)中具有半胱氨酸的Fc结合结构域的氨基酸序列。第一行中的数字是指Fc结合结构域中的相应氨基酸位置。图1A.SEQ ID NO:2的Fc结合结构域。图1B.螺旋3中具有Cys的Fc结合结构域的实例。
图2.在螺旋3中具有半胱氨酸的Fc结合结构域的固定。图2A.IB14蛋白与Expoxymatrix上的位置43、46、47、50或58处的半胱氨酸的偶联效率。Y轴：蛋白质的偶联量，单位为nmol/ml。图2B.cs14 43C和cs14 46C与Epoxy活化的Sepharose 6B基质的偶联。Y轴：n(蛋白质/ml树脂)，单位为nmol
图3.在螺旋33中具有半胱氨酸的Fc结合蛋白的苛性稳定性。图3A.在位置43、46、47、50或58处具有半胱氨酸的IB14的碱性稳定性的分析。Y轴：以百分比表示的Fc结合蛋白IB14和Cys变体的剩余IgG结合活性。灰色柱：0.5M NaOH连续处理6小时后的IgG结合活性。黑色柱：无NaOH的IgG结合活性。图3B.在位置43或46处具有半胱氨酸的cs14的苛性稳定性和DBC 10％。Y轴：DBC 10％(mg/ml)。黑色：DBC 10％(mg/ml)，0h NaOH，浅灰色：DBC 10％(mg/ml)，18h NaOH，深灰色：DBC 10％(mg/ml)，72h NaOH，将Cys变异体与具有C端半胱氨酸(在位置58之后)的cs14和蛋白A进行比较。
图4.显示了与在位置46处无Cys的cs26相比以及与野生型蛋白A结构域C相比cs2646C的0.5M NaOH连续处理6小时、24小时和36小时后的剩余结合能力(％)。X-轴显示了以小时计的0.5M NaOH孵育的时间。
图5.显示了与在位置46处无Cys的cs26相比以及与重组野生型蛋白A相比的cs2646C(单体和二聚体)的动态结合能力(DBC；mg/ml)。
具体实施方式
定义
在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书来限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
优选地，本文使用的术语与“A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)",Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和
Figure BDA0002422685270000041
H.编辑(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010 Basel,Switzerland中提供的定义一致。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及诸如“包括”和“具有”之类的变化形式应理解为暗示包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。
如在本发明的说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文清楚地指出，否则单数形式“一个/种”、“所述”和“该(the)”可互换使用，并且旨在也包括复数形式并且落在每种含义内。而且，如本文中所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个所列项目的任何和所有可能的组合，以及在替代方案(“或”)中解释时缺少组合。如本文中所用，“约”涵盖明确列举的量以及与之±10％的偏差。更优选地，术语“约”涵盖5％的偏差。
在本说明书全文中引用了一些文件(例如：专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书等)。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明不能因为是在先发明而先于这些出版物。本文引用的一些文件的特征是“通过引用并入”。在此类并入的参考文献的定义或教导与本说明书中记载的定义或教导之间发生冲突的情况下，以本说明书的文本为准。
本文所提及的所有序列均在所附序列表中公开，其全部内容和公开内容是本说明书的一部分。
在本发明的说明书中，术语“Fc结合蛋白”或“免疫球蛋白结合蛋白”或“Ig结合蛋白”用于描述能够与免疫球蛋白的Fc区特异性结合的蛋白。Fc结合蛋白包含至少一个“Fc结合结构域”或“免疫球蛋白结合结构域”或“Ig结合结构域”，其特征在于58个氨基酸的三螺旋束，其中螺旋1来自氨基酸残基7-19、螺旋2来自氨基酸残基23-37以及螺旋3来自氨基酸残基40-55。Fc结合结构域可包含缺失，例如在N末端缺失至多6个氨基酸或在C末端缺失至多4个氨基酸，而不会丢失该三螺旋束结构。
本文所理解的“免疫球蛋白”可包括但不限于哺乳动物IgG，例如人IgG1、人IgG2、人IgG4、小鼠IgG、大鼠IgG、山羊IgG、牛IgG、豚鼠IgG、兔IgG、人IgM、人IgA；和包含Fc区的免疫球蛋白片段。由于与Fc区的特异性结合，本发明的“Fc结合蛋白”或“Ig结合蛋白”能够与完整的免疫球蛋白结合，并与包含Fc区的免疫球蛋白片段、包含免疫球蛋白Fc区的融合蛋白以及包含免疫球蛋白Fc区的缀合物结合。尽管本文的本发明Fc结合蛋白表现出与免疫球蛋白的Fc区的特异性结合，但不排除Fc结合蛋白可以另外地以降低的亲和力与其他区域(诸如免疫球蛋白的Fab区)结合。
根据本发明的术语“结合”优选地涉及特异性结合。“特异性结合”意指与和另一非免疫球蛋白靶标的结合相比，Fc结合蛋白或Fc结合结构域与其所特异性针对的免疫球蛋白的结合更强。
术语“结合活性”是指本发明的Fc结合蛋白与免疫球蛋白结合的能力。例如，可在碱处理之前和/或之后测定结合活性。可以测定Fc结合蛋白或与基质偶联的Fc结合蛋白(即固定的结合蛋白)的结合活性。术语“人工的”是指非天然存在的物体，即，该术语是指由人生产或修饰的物体。例如，由人(例如，在实验室中通过基因工程，通过改组方法或通过化学反应等)产生或有意修饰的多肽或多核苷酸序列是人工的。
术语“解离常数”或“KD”定义特异性结合亲和力。如本文中所用，术语“KD”(通常以“mol/L”测量，有时缩写为“M”)旨在指第一蛋白质与第二蛋白质之间的特定相互作用的解离平衡常数。在本发明中，术语KD特别地用于描述Fc结合蛋白与免疫球蛋白之间的结合亲和力。如果本发明的Fc结合蛋白与免疫球蛋白的解离常数KD为至少1μM或更小，或优选为100nM或更小，更优选为50nM或更小，甚至更优选为10nM或更小，则认为其与免疫球蛋白结合。
术语“蛋白质”和“多肽”是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的任何线性分子链，而不是指产物的特定长度。因此，“多肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于替代这些术语中的任何术语或与其互换使用。术语“多肽”还旨在指多肽的翻译后修饰(包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、蛋白水解、通过非天然氨基酸的修饰和本领域公知的类似修饰)的产物。因此，包含两个或更多个蛋白质结构域的Fc结合蛋白也落在术语“蛋白质”或“多肽”的定义内。
术语“碱性稳定的”或“碱性稳定性”或“苛性稳定的”或“苛性稳定性”(在本文中也缩写为“cs”)是指本发明的Fc结合蛋白承受碱性条件而不显著丧失与免疫球蛋白结合的能力的能力。本领域技术人员可通过将Fc结合蛋白与氢氧化钠溶液一起孵育(例如，如实施例中所述)，随后通过本领域技术人员已知的常规实验(例如，通过色谱方法)测试对免疫球蛋白的结合活性，来轻松地测试碱性稳定性。
本发明的Fc结合蛋白以及包含本发明的Fc结合蛋白的基质表现出“增强的”或“改善的”碱性稳定性，这意味着掺入所述Fc结合蛋白的分子和基质在碱性条件下相对于参考蛋白质在长时间段内是稳定的。
如本文中所用，术语“亲本蛋白”或“亲本结构域”中的术语“亲本”是指这样的Fc结合蛋白，其随后被修饰以产生所述亲本蛋白或结构域的变体。所述亲本蛋白质或结构域可以是人工结构域(例如，但不限于SEQ ID NO:78-83)、天然存在的金黄色葡萄球菌蛋白A结构域(例如，对于结构域C而言为SEQ ID NO:84、对于结构域B而言为SEQ ID NO:85)或天然存在的金黄色葡萄球菌蛋白A结构域的变体或工程化形式(例如，对于结构域Z而言为SEQID NO:86)。
如本文中所用，术语“变体”包括与另一个氨基酸序列相异在于至少一个氨基酸取代、缺失或插入的Fc结合蛋白或结构域的氨基酸序列。这些修饰可通过基因工程或通过由人进行的化学合成或化学反应来产生。例如，SEQ ID NO:2 7(cs26A46C)是SEQ ID NO:7(cs26)的变体。
如本文中所用，术语“缀合物”涉及包含与其它物质诸如第二蛋白质或非蛋白质性质的部分化学连接的至少第一蛋白质或基本上由其构成的分子。
术语“修饰”或“氨基酸修饰”是指亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸替换为另一种氨基酸、缺失或插入。基于已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术，熟练的科学家可以轻松构建编码所述氨基酸变体的DNA。
术语“取代”或“氨基酸取代”是指在亲本多肽序列中特定位置的氨基酸替换为另一种氨基酸。例如，取代G46C是指这样的Fc结合蛋白，其中位置46处的甘氨酸被半胱氨酸替换。对于前述示例，46C是指位置46处的半胱氨酸。出于本文的目的，通常用斜杠分隔多个取代。例如，AlI/S11A/K35R/A46C是指包含取代A1I、S11A、K35R和A46C的组合的变体。
术语“缺失”或“氨基酸缺失”是指亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸的去除。
术语“插入”或“氨基酸插入”是指向亲本多肽序列添加氨基酸。
在整个本说明书中，使用图1的氨基酸残基位置编号惯例，并且位置编号被指定为对应于例如SEQ ID NO:1-16中的那些。
术语“氨基酸序列同一性”是指两种或更多种蛋白质的氨基酸序列的同一性(或差异)的定量比较。相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”或“百分比同一性的”或“百分比同一性”定义为在将序列对齐和引入空位(如果需要的话)以实现最大百分比序列同一性后，所述序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。
为了测定序列同一性，将查询蛋白的序列与参考蛋白的序列进行比对。比对方法是本领域公知的。例如，为了测定任意多肽相对于参考氨基酸序列的氨基酸序列同一性的程度，优选地使用SIM局部相似性程序(Xiaoquin Huang和Webb Miller(1991)，Advancesin Applied Mathematics，第12卷：337-357)，其可免费提供(另见：http://www.expasy.org/tools/sim-prot.html)。对于多重比对分析，优选使用ClustalW(Thompson等(1994)Nucleic Acids Res.,22(22):4673-4680)。优选地，在计算序列同一性百分比时，使用SIM Local Locality程序或ClustalW的默认参数。
在本发明中，如果没有另外明确说明，通常相对于未修饰序列的总长度计算序列同一性的程度。
在给定位置与参考氨基酸序列相异的查询序列的每个氨基酸都被算作一个差异。然后使差异的总和与参考序列的长度相关联，以产生一定百分比的非同一性。同一性的定量百分比计算为100减去非同一性的百分比。
如本文中所用，在两个多肽序列的上下文中，短语“百分比同一性的”或“百分比(％)氨基酸序列同一性”或“百分比同一性”是指当比较和比对以获得最大对应性时，如通过使用以下序列比较算法之一或通过目视检查测得的，在一些实施方案中具有至少约80％、在一些实施方案具有至少82％、在一些实施方案中具有至少84％、在一些实施方案中具有至少86％、在一些实施方案中具有至少87％、在一些实施方案中具有至少89.5％、在一些实施方案中具有至少91％、在一些实施方案中具有至少93％、在一些实施方案中具有至少94％、在一些实施方案中具有至少96％、在一些实施方案中具有至少98％以及在一些实施方案中具有100％氨基酸残基同一性的两个或更多个序列或子序列。为了清楚起见，例如具有至少89.5％同一性的序列包括具有高于89.5％同一性的所有序列，例如具有至少91％、至少93％、至少94％、至少96％、至少98％、100％氨基酸同一性的实施方案。
同一性百分比在一些实施方案中存在于至少50个残基、至少52个残基的区域中，在一些实施方案中存在于至少53个残基的区域中，在一些实施方案中存在于至少54个残基的区域中，在一些实施方案中存在于至少55个残基的区域中，在一些实施方案中存在于至少56个残基的区域中，在一些实施方案中存在至少57个残基的区域中，以及在一些实施方案中存在于至少58个残基的区域中。
术语“融合的”是指组分通过肽键直接连接或通过肽接头连接。
术语“融合蛋白”涉及包含与至少第二蛋白质遗传联接的至少第一蛋白质的蛋白质。融合蛋白是通过将两个或更多个最初编码为单独的蛋白质的基因连接起来而产生的。因此，融合蛋白可包括表达为单个线性多肽的相同或不同蛋白质的多聚体。
如本文中所用，术语“接头”以其最广泛的含义指共价连接至少两个其他分子的分子。在本发明的典型实施方案中，“接头”应理解为将Fc结合结构域与至少一个另外的Fc结合结构域连接的部分，即将两个蛋白质结构域彼此连接以产生多聚体的部分。在优选实施方案中，“接头”是肽接头，即连接两个蛋白质结构域的部分是单个氨基酸或包含两个或更多个氨基酸的肽。
术语“色谱法”是指使用流动相和固定相将样品中的一种类型的分子(例如，免疫球蛋白)与其他分子(例如，污染物)分离的分离技术。液体流动相包含分子的混合物，并将这些分子运输穿过或通过固定相(诸如固体基质)。由于流动相中不同分子与固定相的差异相互作用，因此可以分离流动相中的分子。
术语“亲和色谱”是指色谱的一种特定模式，其中与固定相偶联的配体与流动相(样品)中的分子(即免疫球蛋白)相互作用，即该配体对待纯化的该分子具有特定的结合亲和力。如本发明的说明书中所理解的，亲和色谱法涉及将包含免疫球蛋白的样品添加至固定相，该固定相包含色谱配体，诸如本发明的Fc结合蛋白。
术语“固体载体”或“固体基质”可互换用于固定相。
在本文中可互换使用的术语“亲和基质”或“亲和分离基质”或“亲和色谱基质”是指其上连接有亲和配体例如本发明的Fc结合蛋白的基质，例如色谱基质。配体(例如，Fc结合蛋白)能够与待纯化或从混合物中去除的目标分子(例如，如上所定义的免疫球蛋白)特异性结合。
如本文中所用，术语“亲和纯化”是指通过将如上定义的免疫球蛋白与固定在基质上的Fc结合蛋白结合而从液体中纯化如上定义的免疫球蛋白的方法。由此，除去了混合物中除免疫球蛋白外的所有其他成分。在进一步的步骤中，以纯化形式洗脱所述结合的免疫球蛋白。
本发明的实施方案
现在将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确指出相反的情况，否则可将以下定义的每个方面与任何其他一个或多个方面组合。特别地，可将指示为优选或有利的任何特征与指示为优选或有利的任何其他一个或多个特征组合。
在第一方面，本发明涉及Fc结合蛋白，其中Fc结合蛋白包含一个或多个结构域，其中对应于SEQ ID NO:2的位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处的至少一个氨基酸是半胱氨酸，优选其中选自对应于SEQ ID NO:2的位置40、42、43、46、47、49、50、51、53和54的组的一个氨基酸是半胱氨酸。在第一方面的一个实施方案中，对应于SEQ ID NO:2的位置43处的氨基酸、位置46处的氨基酸、位置47处的氨基酸、位置50处的氨基酸、位置51处的氨基酸或位置53处的氨基酸是半胱氨酸。在第一方面，Fc蛋白包含一个或多个结构域，其中至少一个结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或具有至少80％、至少81％、至少82％、至少84％、至少86％、至少87％、至少89.5％、至少91％、至少93％、至少94％、至少96％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成，其中对应于SEQ ID NO:2的位置40、42、43、46、47、50、51、53或54处的至少一个氨基酸是半胱氨酸。优选地，在SEQ ID NO:2-86、90-99的螺旋3或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列中存在不超过2个半胱氨酸残基。
本发明的Fc结合结构域应理解为通常具有58个氨基酸的三螺旋束，其中螺旋1来自氨基酸残基7-19、螺旋2来自氨基酸残基23-37以及螺旋3来自氨基酸残基40-55。Fc结合是由螺旋1和螺旋2介导的。在螺旋3中具有半胱氨酸的Fc结合蛋白的令人惊讶的有利方面是，它们可在长时间段内赋予碱性稳定性而不会损害Fc结合特性，并且具有与基质的高效定点偶联，从而提供了高结合力。在0.5M NaOH中孵育至少6小时直至至少72小时后，本发明的Fc结合蛋白的结合能力降低了不到20％。此特性对于使用高NaOH浓度的碱性溶液进行清洁程序以除去基质上的污染物(例如使得可使用基质数次)的色谱方法非常重要。另外，除了具有高的苛性稳定性以外，在螺旋3中具有Cys的Fc结合蛋白还显示出高偶联效率。例如，在例如位置46处具有Cys的变体的动态结合能力优于重组蛋白A(参见图5)。
在螺旋3中具有半胱氨酸的优选Fc结合蛋白。一些实施方案涉及具有选自SEQ IDNO:1-86、90-99的氨基酸的序列。一些实施方案涉及与选自SEQ ID NO:1-86、90-99的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少84％、至少86％、至少87％、至少89.5％、至少91％、至少93％、至少94.5％、至少96％、至少98％或100％的序列同一性的氨基酸序列，条件是它们在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处具有至少一个半胱氨酸。具有与选自SEQ ID NO:1-86、90-99的氨基酸序列具有至少89.5％同一性、并且在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处，优选在位置43或/和46处，更优选在位置46处具有至少一个半胱氨酸的序列的实施方案是优选的。在螺旋3中具有一个或两个半胱氨酸的Fc结合蛋白的实施方案是优选的。
本发明的Fc结合蛋白的氨基酸序列可能包含另外的修饰，诸如插入、缺失或另外的取代。在一些实施方案中，Fc结合结构域具有1个、2个、3个、4个、5个或6个另外的取代。在一些实施方案中，Fc结合结构域在其N端的前4个氨基酸内具有1、2、3或4个氨基酸的缺失和/或在C端具有1或2个氨基酸的缺失。在一些实施方案中，Fc结合结构域在N端处，例如在位置1、2和4处或位置1、2和3处具有缺失。在一些实施方案中，Fc结合结构域在C端，例如在位置57和/或58处具有缺失(如所显示的，例如但不限于SEQ ID NO:33-34)。一些实施方案涉及与上述SEQ ID NO(例如但不限于SEQ ID NO:1-86、90-99)中任一氨基酸序列具有至少89.5％的序列同一性的氨基酸序列。在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处具有至少一个Cys，优选一个Cys的Fc结合结构域的实例包括例如但不限于图1中所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7(cs26)及变体。在一些实施方案中，Fc结合蛋白包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列(其适合于在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处用半胱氨酸进行修饰)的一个或多个结构域。例如，与SEQ ID NO:7具有至少89.5％同一性的氨基酸序列包括但不限于cs24(SEQ ID NO:8)。在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处具有Cys的cs26变体的实例包括例如但不限于SEQ ID NO:26-39、90-99。
SEQ ID NO:8(cs24)及变体。在一些实施方案中，Fc结合蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列(其适合于在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处用半胱氨酸进行修饰)的一个或多个结构域。例如，与SEQ ID NO:8具有至少89.5％同一性的氨基酸序列包括但不限于cs26(SEQ ID NO:7)。在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处具有Cys的cs24的变体的实例包括例如但不限于SEQ ID NO:26-39、90-99。
SEQ ID NO:3(cs14)及变体。在一些实施方案中，Fc结合蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列(其适合于在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处用半胱氨酸进行修饰)的一个或多个结构域。例如，与SEQ ID NO:3具有至少89.5％同一性的氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:10(cs25)、SEQ ID NOs:11(cs47h3)、SEQ ID NO:12(cs47h4)、SEQ ID NO:13(cs74h1)和SEQ ID NO:14(cs74h2)。在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处具有Cys的cs14的变体的实例包括例如但不限于SEQ ID NO:17-20、40-52、64、65、70、71、74-76。
SEQ ID NO:4(cs27)及变体。在一些实施方案中，Fc结合蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列(其适合于在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处用半胱氨酸进行修饰)的一个或多个结构域。在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处具有Cys的cs27变体的实例包括但不限于SEQ ID NO:21-25。
SEQ ID NO:5(cs20)及变体。在一些实施方案中，Fc结合蛋白包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列(其适合于在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处用半胱氨酸进行修饰)的一个或多个结构域。例如，与SEQ ID NO:5具有至少89.5％同一性的氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:9(cs17)。在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处具有Cys的cs20的变体的实例包括例如但不限于SEQ ID NO:53-57。
SEQ ID NO:6(cs42)及其变体。在一些实施方案中，Fc结合蛋白包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列(其适合于在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处用半胱氨酸进行修饰)的一个或多个结构域。例如，与SEQ ID NO:16具有至少89.5％同一性的氨基酸序列包括但不限于cs28(在位置4处不同)或cs41(SEQ IDNO:15)。在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处具有Cys的cs42的变体的实例包括例如但不限于SEQ ID NO:58-63。
SEQ ID NO:16(cs43)及变体。在一些实施方案中，Fc结合蛋白包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列(其适合于在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处用半胱氨酸进行修饰)的一个或多个结构域。例如，与SEQ ID NO:16具有至少89.5％同一性的氨基酸序列包括但不限于cs44(在位置44处不同)、cs31(在位置25和54处不同)或cs45(在位置25和26处不同)。在位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处具有Cys的cs43的变体的实例包括但不限于SEQ ID NO:66-69、72。
Fc结合蛋白的序列；优选的氨基酸位置。
令人惊讶地，如说明书附图和实施例中所示，与在螺旋3中无半胱氨酸的结构域相比，Fc结合结构域的螺旋3中的半胱氨酸增加了Fc结合结构域的碱性稳定性，并且改善了Fc结合蛋白与基质的位点特异性偶联，其提高了能力。
在一些实施方案中，所述Fc结合结构域在位置1处包含异亮氨酸。优选地，Fc结合结构域的位置1处的氨基酸不是苏氨酸(T)。优选地，位置1的氨基酸是异亮氨酸(I)或丙氨酸(A)。或者，可缺失位置1。在一些实施方案中，所述Fc结合结构域在位置11处包含丙氨酸(A)、谷氨酸(E)或异亮氨酸(I)。优选地，位置11处的氨基酸不是天冬酰胺(N)或赖氨酸(K)。优选地，位置11的氨基酸是丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)或脯氨酸(P)，更优选为A、I或E，最优选为A。或者，位置11处的氨基酸是丝氨酸(S)。在一些实施方案中，所述Fc结合结构域在位置35处包含精氨酸(R)或异亮氨酸(I)。优选地，位置35处的氨基酸不是脯氨酸(P)、天冬酰胺(N)、甘氨酸(G)、色氨酸(W)、丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)或甲硫氨酸(M)。在一些实施方案中，所述Fc结合结构域在位置42处包含亮氨酸(L)。优选地，位置12处的氨基酸不是酪氨酸(Y)。在一些实施方案中，除了40C、42C、43C、46C、47C、49C、50C、51C、53C或54C以外，Fc结合结构域还包含选自1I、11A、11S、35R和42L的氨基酸位置中的2个、3个或4个氨基酸位置。在一些实施方案中，位置1I、3A、6D、9Q、10Q、12A、13F、14Y、15E、16I、17L、18H、19L、20P、21N、22L、23T、24E、26Q、27R、28N、29A、30F、31I、32Q、33S、34L、36D、37D、38P、39S、41S、42L、45L、48A、52N、55Q、56A、57P的至少90％在本发明的Fc结合结构域中是相同的。优选地，位置2是A或D，位置4是K或Q，位置5是H或F，位置7是K或E，位置8是D、A或E，位置11是A、S、I或E，位置25是D或E，位置35是R或I，位置40是V、T、Q或C，位置42是L或C，位置43是E、S或C，位置44是I、V或L，位置46是C、A或G，位置47是E或C，位置49是K、Q或C，位置50是K或C，位置51是L或C，位置53是D或E或C，位置54是A、S或C，位置58是P或K。
本发明的Fc结合蛋白包含下述的一个或多个Fc结合结构域，其中所述Fc结合结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。氨基酸序列SEQ ID NO:2是以下氨基酸序列：IX2AX4X5DX7X8QQX11AFYEILHLPNLTEX25QRNAFIQSLX35DDPSX40SLX43X44LX46X47AX49X50X51NX5 3X54QAPX58，其中位置1处的氨基酸选自I或被缺失，位置2(X2)处的氨基酸选自A或D或被缺失，位置3处的氨基酸选自A或被缺失，位置4(X4)处的氨基酸选自K或Q或被缺失，位置5(X5)处的氨基酸选自H或F，位置7(X7)处的氨基酸为选自K或E，位置8(X8)处的氨基酸选自D、A或E，位置11(X11)处的氨基酸选自A、S、I或E，位置25(X25)处的氨基酸选自D或E，位置35(X35)处的氨基酸选自R或I，位置40(X40)处的氨基酸选自Q、T、V或C，位置42(X42)的氨基酸选自L或C，位置43(X43)处的氨基酸选自E、S或C，位置44(X44)处的氨基酸选自I、L或V，位置46(X46)处的氨基酸选自G、A或C，位置47(X47)处的氨基酸选自E或C，位置49(X49)处的氨基酸为选自K或Q或C，位置50(X50)处的氨基酸为K或C，位置51(X51)处的氨基酸为L或C，位置53(X53)处的氨基酸选自D、E或C，位置54(X54)处的氨基酸选自A或S或C，位置57处的氨基酸选自P或被缺失，位置58(X58)处的氨基酸选自P或K或被缺失。本发明的Fc结合蛋白在以下位置中的一个或两个位置处具有半胱氨酸：40、42、43、46、47、49、50、51、53或54。本发明的Fc结合结构域的选定实例包括例如但不限于SEQ ID NO:17-73、90-99。
Fc结合蛋白的c端区域中的半胱氨酸引起的高碱性稳定性。在一些实施方案中，如实施例和说明书附图中所示，在螺旋3中具有半胱氨酸的Fc结合蛋白提供了令人惊奇地特别好的Fc结合蛋白的碱性稳定性。最令人惊讶和出乎意料的是，即使在碱处理数小时后，在螺旋3中具有半胱氨酸的Fc结合蛋白也能够与Ig结合。通过比较在0.5M NaOH中至少6小时孵育后Ig结合活性的损失来测定Fc结合蛋白的碱性稳定性(参见图3)。例如，在与0.5MNaOH长时间(例如36小时)孵育后，cs26 46C的结合能力仍然比野生型结构域C高至少20％(见图4)。
与免疫球蛋白的亲和力。本发明的所有Fc结合蛋白以优选低于500nM或低于100nM，甚至更优选10nM或更小的解离常数KD结合免疫球蛋白。用于测定Fc结合蛋白或结构域的结合亲和力，即用于测定解离常数KD的方法是本领域普通技术人员已知的，并且可选自例如本领域已知的以下方法：基于表面等离子体共振(SPR)的技术、生物层干涉法(BLI)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、等温滴定量热(ITC)、分析超速离心、放射免疫测定(RIA或IRMA)和增强的化学发光(ECL)。实施例中进一步描述了一些方法。通常，在20℃、25℃或30℃下测定解离常数KD。如果没有另外特别说明，则通过表面等离子体共振在22℃+/-3℃下测定本文所述的KD值。在第一方面的一个实施方案中，Fc结合蛋白与人IgG1的解离常数KD在0.1nM与100nM之间，优选在0.1nM与50nM之间的范围内。
多聚体。在本发明的一个实施方案中，Fc结合蛋白包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个，优选2个、3个、4个、5个或6个彼此连接的Fc结合结构域，即Fc结合蛋白可以是例如单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体。多聚体可包含两个、三个、四个或甚至更多个结合结构域。
本发明的多聚体是通常通过技术人员熟知的重组DNA技术人工产生的融合蛋白。
在一些实施方案中，多聚体是同源多聚体，例如Fc结合蛋白的所有Fc结合结构域的氨基酸序列是相同的。
多聚体可包含两个或更多个Fc结合结构域，其中所述Fc结合结构域优选包含如上所述的序列或基本上由所述序列组成，条件是它们在螺旋3中具有至少一个半胱氨酸。
例如，将SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:22用于产生本文实施例1中所述的同源多聚体融合构建体，参见例如SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:25。
在一些实施方案中，多聚体是异源多聚体，例如至少一个碱性稳定的Fc结合结构域具有与免疫球蛋白结合蛋白内的另外的Fc结合结构域不同的氨基酸序列。
接头。在第一方面的一些实施方案中，所述一个或多个Fc结合结构域彼此直接连接。在其他实施方案中，所述一个或多个Fc结合结构域通过一个或多个接头彼此连接。在这些典型的实施方案中优选的是肽接头。这意味着肽接头是连接第一Fc结合结构域与第二Fc结合结构域的氨基酸序列。肽接头通过结构域的C末端与N末端之间的肽键与第一Fc结合结构域和第二Fc结合结构域连接，从而产生单条线性多肽链。接头的长度和组成可以在至少一个至多达约30个氨基酸之间变化。更具体地，肽接头具有1至30个氨基酸的长度；例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个氨基酸。优选地，肽接头的氨基酸序列对苛性条件和蛋白酶是稳定的。接头不应使Fc结合蛋白中的结构域的构象失去稳定。众所周知的是包含小氨基酸诸如甘氨酸和丝氨酸或由其组成的接头。接头可以是富含甘氨酸的(例如，接头中超过50％的残基可以是甘氨酸残基)。还优选的是包含其他氨基酸的接头。本发明的其他实施方案包括由丙氨酸、脯氨酸和丝氨酸组成的接头。用于蛋白质融合的其他接头是本领域已知的并且可以使用所述接头。在一些实施方案中，Fc结合蛋白的多聚体包含连接Fc结合结构域的一个或多个接头，其中所述接头是相同的或不同的。
与固体载体的缀合。在本发明的一些实施方案中，将Fc结合蛋白与固体载体缀合。Fc结合结构域的螺旋3中的半胱氨酸包含用于Fc结合蛋白与固体载体的位点特异性共价偶联的连接位点。位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处的至少一个半胱氨酸使得能够与固相的反应基团或固相与蛋白质之间的接头(例如选自N-羟基琥珀酰亚胺、碘乙酰胺、马来酰亚胺、环氧基或烯烃基)发生特定的化学反应。
在本发明的一些实施方案中，Fc结合蛋白还可在N-末端和/或C-末端处包含另外的氨基酸残基，例如在N-末端和/或C-末端处具有或不具有标签的另外的序列。
亲和分离基质。在另一个方面，本发明涉及亲和分离基质，其包含第一方面的Fc结合蛋白。
在第二方面的优选实施方案中，亲和分离基质是固体载体。亲和分离基质包含至少一种本发明的Fc结合蛋白。
亲和基质可用于免疫球蛋白的分离，并且即使在清洁过程中施加的强碱性条件下也应保持Ig结合特性。此类基质的清洁对于长期重复使用基质是必需的。
用于亲和层析的固体载体基质是本领域已知的，包括但不限于例如琼脂糖和稳定化的琼脂糖衍生物(例如Sepharose 6B,PraestoTMPure；
Figure BDA0002422685270000191
rPROTEIN ASepharose Fast Flow、
Figure BDA0002422685270000192
等等)、纤维素或纤维素衍生物、可控孔玻璃(例如
Figure BDA0002422685270000193
vA树脂)、整料(monolith)(例如
Figure BDA0002422685270000194
整料)、二氧化硅、氧化锆(例如CM氧化锆或
Figure BDA0002422685270000195
)、氧化钛或合成聚合物(例如聚苯乙烯诸如Poros 50A或
Figure BDA0002422685270000196
A树脂、聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚羟基烷基丙烯酸酯、聚羟基烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等)和各种组成的水凝胶。在某些实施方案中，载体包括聚羟基聚合物，诸如多糖。适用于载体的多糖的实例包括但不限于琼脂、琼脂糖、葡聚糖、淀粉、纤维素、支链淀粉等，以及它们的稳定变体。
固体载体基质的形式可属于任何合适的公知类型。用于偶联本发明的Fc结合蛋白的此类固体载体基质可包括例如以下之一：柱子、毛细管、颗粒、膜、过滤器、整料、纤维、垫、凝胶、载玻片、平板、盒或通常用于色谱并且是本领域技术人员已知的任何其他形式。
在一个实施方案中，基质由基本上球形的颗粒(也称为珠粒，例如琼脂糖(Sepharose)或琼脂糖(Agarose)珠粒)组成。合适的粒度可在5-500μm，诸如10-100μm，诸如20-80μm，诸如40-70μm的直径范围内。颗粒形式的基质可用作填充床或呈悬浮形式(包括膨胀床)。
在替代实施方案中，固体载体基质是膜，例如水凝胶膜。在一些实施方案中，亲和纯化涉及作为第一方面的Fc结合蛋白所共价结合的基质的膜。所述固体载体也可以是柱体内的膜的形式。
在一些实施方案中，亲和纯化涉及包含共价结合了第一方面的Fc结合蛋白的固相载体基质的色谱柱。
可通过常规偶联技术将本发明的Fc结合蛋白连接至合适的固体载体基质。将蛋白质配体固定至固体载体的方法是本领域公知的，并且可由本领域技术人员使用标准技术和设备容易地来进行实施。
Fc结合蛋白的用途。在第三方面，本发明涉及第一方面的Fc结合蛋白或第二方面的亲和基质在免疫球蛋白或其变体的亲和纯化方面的用途，即本发明的Fc结合蛋白用于亲和色谱。在一些实施方案中，将本发明的Fc结合蛋白固定在如本发明的第二方面中所述的固体载体上。
免疫球蛋白的亲和纯化的方法。在第四方面，本发明涉及免疫球蛋白的亲和纯化的方法，该方法包括：(a)提供含有免疫球蛋白的液体；(b)提供包含与所述亲和分离基质偶联的第一方面的固定的Fc结合蛋白的亲和分离基质；(c)使所述液体与所述亲和分离基质接触，其中所述免疫球蛋白与所述固定的Fc结合蛋白结合；以及(d)从所述基质洗脱所述免疫球蛋白，从而获得含有所述免疫球蛋白的洗脱液。在一些实施方案中，亲和纯化的方法还可包括在足以从亲和分离基质中除去与其非特异性结合的一些或所有分子的条件下，在步骤(c)与(d)之间进行的一个或多个洗涤步骤。非特异性结合意指不参与本公开主题的至少一个结合结构域与免疫球蛋白之间的相互作用的任何结合。
适用于所公开的用途和方法的亲和分离基质是根据上述实施方案并且为本领域技术人员已知的那些基质。
在第四方面的一些实施方案中，通过改变pH和/或改变盐浓度来实现在步骤(d)中从基质洗脱免疫球蛋白。可使用任何合适的溶液，例如通过pH值为5或更低的溶液(参见实施例9中的表3)，或pH值为11或更高的溶液。
在一些实施方案中，添加用于亲和基质的高效清洁和消毒的另一步骤(f)，优选地通过使用例如pH值为13-14的碱性液体。在某些实施例中，清洁液包含0.1-1.0M NaOH或KOH，优选0.25-0.5M NaOH或KOH。由于本发明的Fc结合蛋白的高碱性稳定性，这种强碱性溶液可用于清洁目的。
在一些实施方案中，亲和基质由于步骤(a)至(e)的重复而可以重复使用至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，至少50次，至少60次，至少70次，至少80次，至少90次或至少100次，任选地(a)至(f)可以重复至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，至少50次，至少60次，至少70次，至少80次，至少90次或至少100次。
通常，用于进行亲和纯化方法的合适条件是本领域技术人员公知的。在一些实施方案中，包括所公开的Fc结合结构域的所公开的亲和纯化的用途或方法在大于或等于3.5(例如，约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0或约6.5)的pH值下可提供至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的含Fc蛋白质的洗脱。
核酸分子。在第五方面，本发明涉及编码以上公开的任何实施方案的Fc结合蛋白的核酸分子，优选分离的核酸分子。在一个实施方案中，本发明涉及包含所述核酸分子的载体。载体意指可用于将蛋白质编码信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。在一个实施方案中，载体是表达载体。
在第六方面，本发明涉及包含如上所述的核酸或载体的表达系统，例如原核宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)，或真核宿主，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，或哺乳动物细胞(诸如CHO细胞)。
产生Fc结合蛋白的方法。在第七方面，本发明涉及用于产生本发明的Fc结合蛋白的方法，其包括一个或多个以下步骤：(a)在适合表达所述结合蛋白的条件下培养第六方面的宿主细胞以便获得所述Fc结合蛋白；以及(b)任选地分离所述Fc结合蛋白。适合培养原核或真核宿主的合适条件是本领域技术人员公知的。
本发明的Fc结合分子可通过许多常规的和公知的技术(诸如普通的有机合成策略、固相辅助合成技术或通过商购可得的自动化合成仪)中的任一种来制备。在另一方面，它们还可通过单独的或与常规合成技术组合的常规重组技术来制备。
本发明的一个实施方案涉及制备如上所述的根据本发明的Fc结合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备编码如上定义的Fc结合蛋白的核酸；b)将所述核酸引入表达载体；(c)将所述表达载体引入宿主细胞；(d)培养宿主细胞；(e)使宿主细胞经受表达Fc结合蛋白的培养条件，从而(e)产生如上所述的Fc结合蛋白；任选地(f)分离步骤(e)中产生的蛋白质；以及(g)任选地将所述蛋白质缀合于如上所述的固体基质。
在本发明的另外一个实施方案中，通过无细胞的体外转录/翻译进行Fc结合蛋白的产生。
实施例
提供以下实施例以进一步说明本发明。然而，本发明不限于此，并且以下实施例仅基于以上描述显示了本发明的实用性。
实施例1.与Fc结合的人工嵌合蛋白的生成
Fc结合蛋白最初是通过天然存在的蛋白A结构域(E、B、D、A、C、Z)的改组过程生成的。更具体地，如本文所理解的改组过程是从一组不同的已知氨基酸序列开始得到人工氨基酸序列的组装过程。改组过程包括以下步骤：a)提供五个天然存在的蛋白A结构域E，B，D，A和C以及蛋白A变体结构域Z的序列；b)所述序列的比对；c)进行计算机统计片段化以鉴定重组的子序列，然后d)组装各种片段的新的人工序列以产生嵌合产物，即新型人工氨基酸序列。步骤c)中生成的片段具有任何长度，例如如果片段化的亲本序列的长度为n，则片段的长度为1至n-1。
相对于起始氨基酸序列维持嵌合产物中氨基酸的相对位置。位置Q9、Q10、A12、F13、Y14、L17、P20、L22、Q26、R27、F30、I31、Q32、S33、L34、D36、D37、P38、S39、S41、L45、E47、A48、K50、L51、Q55、A56、P57中的至少90％在例如IB14、IB27、IB24、IB26、IB28、IB20(SEQ IDNOs:78-83)的人工嵌合氨基酸序列(SEQ ID NO:78-83)与天然存在的蛋白A结构域或蛋白A结构域变体之间是相同的。嵌合结构域和天然存在的蛋白A结构域或蛋白A结构域变体的特征是58个氨基酸的三螺旋束，其中螺旋1来自氨基酸残基7-19，螺旋2来自氨基酸残基23-37以及螺旋3来自氨基酸残基40-55。例如，人工Fc结合结构域IB14、IB26和IB27的总体氨基酸序列是人工的，因为其与任何天然存在的蛋白A结构域或结构域Z的总体氨基酸序列具有不超过85％同一性。在生成最初的人工Fc结合蛋白之后，在一些情况下，通过氨基酸序列的位点特异性随机化进一步修饰蛋白质，以进一步修改生物化学性质。通过单个氨基酸残基的位点饱和诱变引入另外的修饰。
使用技术人员已知的标准方法合成人工Fc结合蛋白的基因，并将其克隆到大肠杆菌表达载体中。将DNA测序用于验证插入片段的正确序列。
为了生成多聚体Fc结合蛋白，将2或3个相同的Fc结合结构域进行遗传融合。
为了特异性纯化，任选地将strep标签(WSHPQFEK；SEQ ID NO:89)添加至Fc结合蛋白的C-末端。
实施例2.生成变体的诱变
对于定点诱变，按照制造商的说明使用
Figure BDA0002422685270000231
定点诱变试剂盒(NEB；目录号E0554S)。用分别编码每个特定取代的寡核苷酸和含有模板的质粒进行PCR。连接产物并通过电穿孔将其转化到大肠杆菌XL2-blue细胞(Stratagene)中。分离单个菌落，并将DNA测序用于含有插入物的克隆以验证正确的序列。
通过GeneArtTMStringsTM合成(Thermo Fisher Scientific)生成了数个点突变的组合。Strings DNA片段对应于纯化的PCR产物，并被克隆到pET28a载体的衍生物中。通过电穿孔将连接产物转化到大肠杆菌XL2-blue细胞中。通过PCR筛选单个菌落，以鉴定含有正确大小的插入物的构建体。将DNA测序用于验证正确的序列。例如，图1中显示了一些带有点突变的变体。
实施例3.Fc结合蛋白的表达
用编码Fc结合蛋白的表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞。将细胞铺板在选择性琼脂平板(卡那霉素)上，并在37℃下孵育过夜。从单个菌落中将预培养物接种到100ml2xYT培养基中，并在37℃下以160rpm在常规定轨振荡器中，在装有150μg/ml卡那霉素且无乳糖和消泡剂的带有挡板的1L埃伦迈厄烧瓶中培养16小时。OD600读数应在6-12的范围内。在补充有150μg/ml卡那霉素的1L厚壁锥形瓶中，在400ml超富培养基(改良的H15培养基：2％的葡萄糖、5％的酵母提取物、0.89％的甘油、0.76％的乳糖、250mM MOPS、202mM TRIS、pH 7.4，消泡剂SE15)中以0.5的经调整的起始OD600从先前的过夜培养物接种主培养物。将培养物转移到共振声学混合器(resonant acoustic mixer)(RAMbio)中，并在37℃下以20xg孵育。通过Oxy-泵塞帮助充气。通过代谢葡萄糖并随后允许乳糖进入细胞来诱导重组蛋白表达。在预定的时间点测量OD600，取出调整至5/OD600的样品，沉淀并于-20℃下冷冻。使细胞生长过夜约24小时达到约45-60的最终OD600。为了收集生物质，将细胞在20℃下以16000xg离心10分钟。对沉淀进行称重(湿重)，并测量上清液的pH。在处理之前，将细胞在-20℃下储存。
实施例4：Fc结合蛋白的表达和溶解性的SDS-PAGE分析
将在发酵过程中采集的样品重悬于300μl提取缓冲液(补充有0.2mg/ml溶菌酶、0.5x BugBuster、7.5mM MgSO4、40U Benzonase的PBS)中，并通过在热混合器中在700rpm、室温下搅拌15分钟来增溶。通过离心(16000xg，2分钟，室温)将可溶性蛋白与不溶蛋白分离。取出上清液(可溶级分)，将沉淀(不溶性级分)重悬于等量的尿素缓冲液(8M尿素、0.2MTris、2mM EDTA，pH 8.5)中。从可溶性和不溶性级分中获取50μl，然后加入12μl 5x样品缓冲液和5μl 0.5M DTT。将样品在95℃下煮沸5分钟。最后，将8μl样品施加到NuPageNovex 4-12％Bis-Tris SDS凝胶上，将该凝胶按照制造商的建议运行，并用考马斯染色。在选定的时间段内，在最佳条件下发现了所有Fc结合蛋白的高水平表达(数据未显示)。根据SDS-PAGE，所有表达的Fc结合蛋白可溶至95％以上。
实施例5：Fc结合蛋白的纯化
Fc结合蛋白在具有C末端StrepTagII(WSHPQFEK)的大肠杆菌可溶级分中表达。通过两个冷冻/融化循环裂解细胞，并按照制造商的说明(IBA,Goettingen,Germany)，使用Strep-
Figure BDA0002422685270000251
-树脂进行纯化步骤。为了避免形成二硫化物，在缓冲液中补充了1mMDTT。
或者，Fc结合蛋白在具有C末端StrepTagII的大肠杆菌可溶性级分中表达。将细胞重悬于细胞破碎缓冲液中，并通过恒定的细胞破碎系统(Unit F8B,Holly Farm BusinessPark)在1kbar下裂解，进行两个循环。按照制造商的说明，使用
Figure BDA0002422685270000252
系统(GeHealthcare)，利用Strep-Tactin-树脂(IBA,Goettingen,Germany)和另外的凝胶过滤(Superdex 75 16/60；GE Healthcare)进行纯化步骤。为避免二硫化物形成，用1mM DTT补充用于Strep-Tactin纯化的缓冲液，并将柠檬酸盐缓冲液(20mM Citrat，150mM NaCl，pH6.0)用作凝胶过滤的运行缓冲液。
实施例6.Fc结合蛋白以高亲和力(如通过ELISA测定的)结合IgG
使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定Fc结合蛋白对IgG1或IgG2或IgG4的亲和力。将含有IgG1或IgG2或IgG4的抗体(例如对于IgG1而言西妥昔单抗、对于IgG2而言帕尼单抗或对于IgG4而言那他珠单抗)固定在96孔Nunc MaxiSorb ELISA板(2μg/ml)上。在4℃下孵育16小时后，将孔用PBST(PBS+0.1％Tween 20)洗涤3次，并用PBS中的3％BSA封闭孔(在室温下2小时)。阴性对照仅用BSA封闭。封闭后，将孔用PBST洗涤3次，并在室温下与Fc结合蛋白(在PBST中)孵育1小时。孵育后，将孔用PBST洗涤3次，随后在室温下与Strep-Tactin-HRP(1:10000)(IBA,Goettingen,Germany)一起孵育1小时。之后，将孔用PBST洗涤3次，并用PBS洗涤3次。通过添加TMB-Plus底物来使辣根过氧化物酶的活性可视化。30分钟后，通过添加0.2M M H2SO4终止反应，并在450nm下测量吸光度。例如，如通过ELISA所测定的，人IgG1的KD为4.9nM(对于IB14)、3.4nM(对于Z结构域)、3.1nM(对于结构域B)以及2.8nM(对于结构域C)。
实施例7.Fc结合蛋白以高亲和力(如通过表面等离子体共振实验测定的)结合IgG
用SPR运行缓冲液平衡CM5传感器芯片(GE Healthcare)。通过使EDC和NHS的混合物通过以产生反应性酯基来活化暴露于表面的羧基。将700-1500RU on-配体固定在流通池上，将off-配体固定在另一个流通池上。配体固定后注射乙醇胺可去除非共价结合的Fc结合蛋白。配体结合后，蛋白质分析物积聚在表面上，从而增加了折射率。实时测量折射率的这种变化，并将其绘制为响应或共振单位(RU)与时间的关系。将分析物以适当的流速(μl/min)以系列稀释液施加至芯片。每次运行后，用再生缓冲液对芯片表面进行再生，并用运行缓冲液平衡。将对照样品施加到基质上。如前所述进行再生和再平衡。通过在25℃下使用
Figure BDA0002422685270000262
3000(GE Healthcare)进行结合研究。通过使用制造商提供的BIAevaluation3.0软件，使用Langmuir 1:1模型(RI＝0)进行数据评估。将估计的解离常数(KD)针对脱靶进行标准化，不同的人工Fc结合蛋白对于人IgG1-Fc、西妥昔单抗(IgG1)、那他珠单抗(IgG4)或帕尼单抗(IgG2)的KD值如表1所示。
表1.Fc结合蛋白对Ig的KD值
Figure BDA0002422685270000261
Figure BDA0002422685270000271
实施例8.与环氧活化的基质(epoxy-activated matrix)(Sepharose 6B)偶联的Fc结合蛋白
根据制造商的说明书(偶联条件：pH 9.0过夜，用乙醇胺封闭5小时)，将纯化的Fc结合蛋白与环氧活化的基质(Sepharose 6B，GE；目录号17-0480-01)偶联。西妥昔单抗用作IgG样品(5mg；1mg/ml基质)。将西妥昔单抗以饱和量施加到包含固定的Fc结合蛋白的基质上。用100mM甘氨酸缓冲液(pH 2.5)洗涤基质，以洗脱与固定的IgG结合蛋白结合的西妥昔单抗。为了测定Fc结合蛋白的结合活性，通过BLI(利用蛋白A Octet传感器和西妥昔单抗作为标准品的定量)测量洗脱的IgG的浓度。
图2A显示IB14(SEQ ID NO:78)和在位置43、46、47、50或58(分别为SEQ ID NO:74-77)处具有半胱氨酸的IB14变体的偶联效率。在位置43、46、47、50或58处具有Cys的所有IB14变体的偶联效率均高于IB14。图2B显示与具有C末端Cys的cs14相比和与商购可得的蛋白A相比，cs14 46C(SEQ ID NO:18)或cs14 43C(SEQ ID NO:17)与环氧活化的Sepharose6B基质的偶联。偶联条件为450μM，4500nmol/ml，pH 9，在30℃下2h或18h，1mM TCEP，1M(NH4)2SO4。在2h与18h之间，仅观察到净偶联率的微小变化。偶联率以nmol(结构域)/ml表示。
实施例9.与环氧活化的基质偶联的Fc结合蛋白的碱性稳定性
在室温(22℃+/-3℃)下，将柱子与0.5M NaOH一起孵育0h、6h、18h、24h、36h或72h。在与0.5M NaOH孵育之前和之后，分析固定的蛋白质的Ig结合活性。将NaOH处理之前固定的蛋白质的Ig结合活性定义为100％。连续0.5M NaOH处理6小时后的剩余IgG结合活性示于图3A(对于IB14变体(SEQ ID NO:74-77))。图3B显示对于cs14 46C、cs14 43C、cs14和商购可得的蛋白A的连续0.5M NaOH处理0h、18h或72h后的苛性稳定性。将蛋白在30℃下固定于环氧Sepharose 2h(4500nmol/ml)。在5分钟的停留时间测定动态结合能力DBC 10％。Cs1446C在连续0.5NaOH处理72小时后显示出19,5mg/ml的最高DBC 10％，比商购可得的蛋白A的测量值高20％以上。图4显示与cs26(SEQ ID NO:7)和野生型结构域C(SEQ ID NO:84)相比,cs26 46C(SEQ ID NO:27)在连续0.5M NaOH处理6小时、24小时和36小时后的剩余结合能力。在至少在36h 0.5M NaOH孵育后，cs26 A46C(单体或二聚体)的结合能力保持>20％，请参见表2。
表2与cs26和野生型结构域c相比cs26 A46C的苛性稳定性
Fc结合蛋白 0h 6h 24h 36h vs C@36h
cs26 A46C 100 95 83 78 42％
cs26 A46C(二聚体) 100 92 81 72 24.8％
cs26 100 105 82 73 27.7％
结构域C 100 95 76 62
实施例10.与基于琼脂糖的色谱珠粒PraestoTM Pure45偶联的Fc结合蛋白
按照制造商的说明书(偶联条件：pH 9.5、3小时，35℃，4.1M NaSO4，利用乙醇胺封闭过夜)，将纯化的Fc结合蛋白与基于琼脂糖的色谱珠粒(PraestoTM Pure45,Purolite；目录号PR01262-166)偶联。使用多克隆人IgG
Figure BDA0002422685270000291
(Ocatpharm)作为IgG样品(浓度为2.2mg/ml)。将多克隆hIgG样品以饱和量施加到包含固定的Fc结合蛋白的基质上。用pH2.0的100mM柠檬酸盐缓冲液洗涤基质以洗脱与固定的Fc结合蛋白结合的hIgG。通过在停留时间6分钟穿透10％的注射的hIgG的质量测定与重组野生型蛋白A相比的cs26 46C单体和二聚体；(SEQ ID NO:27、32))的动态结合能力。图5显示Cs2646C在停留时间6分钟时具有比重组蛋白A高61.2％的DBC。
实施例11.从与基于琼脂糖的色谱珠粒PraestoTM Pure45和/或Pure85偶联的Fc结合蛋白洗脱IgG
按照制造商的说明书，将纯化的Fc结合蛋白(cs26 46C)与基于琼脂糖的色谱珠粒(PraestoTM Pure45或Pure 5)偶联。将多克隆人IgG
Figure BDA0002422685270000292
和单克隆IgG1抗体西妥昔单抗用作IgG样品(浓度2.2mg/ml)，上样至高达DBC 10％。将多克隆hIgG样品以饱和量施加到包含固定的Fc结合蛋白的基质上。在一个两步过程中，首先用100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 3.5)洗涤基质，然后用100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 2.0)洗涤基质以洗脱与固定化Fc结合蛋白结合的hIgG。表3显示，在pH 3.5下，从偶联有cs26 46C的珠粒上洗脱了几乎100％的结合的IgG。
表3.从偶联至珠粒的cs26 46C上洗脱IgG
Figure BDA0002422685270000293
序列表
<110> Navigo Proteins GmbH
<120> 在螺旋3中具有半胱氨酸的Fc结合蛋白
<130> SP33 EP2
<160> 99
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列1
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> 可以被A, N, Q, V取代或缺失
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 可以被D或Q取代或缺失
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> 可以被N取代或缺失
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> 可以被Q或N取代或缺失
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> 可以被F取代或缺失
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> 可以被N取代或缺失
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> 可以被E取代
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> 可以被A或E取代
<220>
<221> 变体
<222> (11)..(11)
<223> 可以被S, N, I 或E取代
<220>
<221> 变体
<222> (15)..(15)
<223> 可以被Q取代
<220>
<221> 变体
<222> (16)..(16)
<223> 可以被V取代
<220>
<221> 变体
<222> (18)..(18)
<223> 可以被N取代
<220>
<221> 变体
<222> (19)..(19)
<223> 可以被M取代
<220>
<221> 变体
<222> (23)..(23)
<223> 可以被N取代
<220>
<221> 变体
<222> (24)..(24)
<223> 可以被A取代
<220>
<221> 变体
<222> (25)..(25)
<223> 可以被E取代
<220>
<221> 变体
<222> (29)..(29)
<223> 可以被G取代
<220>
<221> 变体
<222> (35)..(35)
<223> 可以被K或I取代
<220>
<221> 变体
<222> (40)..(40)
<223> 可以被Q或T取代
<220>
<221> 变体
<222> (42)..(42)
<223> 可以被A, K,或T取代
<220>
<221> 变体
<222> (43)..(43)
<223> 可以被S, N,或C取代
<220>
<221> 变体
<222> (44)..(44)
<223> 可以被L或V取代
<220>
<221> 变体
<222> (46)..(46)
<223> 可以被C或A取代
<220>
<221> 变体
<222> (47)..(47)
<223> 可以被C取代
<220>
<221> 变体
<222> (49)..(49)
<223> 可以被Q取代
<220>
<221> 变体
<222> (50)..(50)
<223> 可以被C取代
<220>
<221> 变体
<222> (51)..(51)
<223> 可以被C取代
<220>
<221> 变体
<222> (53)..(53)
<223> 可以被E或C取代
<220>
<221> 变体
<222> (54)..(54)
<223> 可以被S取代或缺失
<220>
<221> 变体
<222> (57)..(57)
<223> 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (58)..(58)
<223> 可以被K取代或缺失
<400> 1
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列2
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 可以被D取代或缺失
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> 可以被N取代或缺失
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> 可以被Q取代或缺失
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> 可以被F取代或缺失
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> 可以被E取代
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> 可以被A或E取代
<220>
<221> 变体
<222> (11)..(11)
<223> 可以被S, I,或E取代
<220>
<221> 变体
<222> (25)..(25)
<223> 可以被E取代
<220>
<221> 变体
<222> (35)..(35)
<223> 可以被I取代
<220>
<221> 变体
<222> (40)..(40)
<223> 可以被Q或T取代
<220>
<221> 变体
<222> (43)..(43)
<223> 可以被S,或C取代
<220>
<221> 变体
<222> (44)..(44)
<223> 可以被L或V取代
<220>
<221> 变体
<222> (46)..(46)
<223> 可以被C或A取代
<220>
<221> 变体
<222> (47)..(47)
<223> 可以被C取代
<220>
<221> 变体
<222> (49)..(49)
<223> 可以被Q取代
<220>
<221> 变体
<222> (50)..(50)
<223> 可以被C取代
<220>
<221> 变体
<222> (51)..(51)
<223> 可以被 C取代
<220>
<221> 变体
<222> (53)..(53)
<223> 可以被E或C取代
<220>
<221> 变体
<222> (54)..(54)
<223> 可以被S取代
<220>
<221> 变体
<222> (57)..(57)
<223> 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (58)..(58)
<223> 可以被K取代或缺失
<400> 2
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs14
<400> 3
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs27
<400> 4
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs20
<400> 5
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 6
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs42
<400> 6
Ile Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 7
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26
<400> 7
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 8
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24
<400> 8
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 9
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs17
<400> 9
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 10
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs25
<400> 10
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 11
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h3
<400> 11
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 12
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h4
<400> 12
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 13
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h1
<400> 13
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 14
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h2
<400> 14
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 15
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs41
<400> 15
Ile Ala Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 16
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs43
<400> 16
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 17
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs14 43C
<400> 17
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 18
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs14 46C
<400> 18
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 19
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs14 47C
<400> 19
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 20
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs14 11S 46C
<400> 20
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 21
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs27 43C
<400> 21
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 22
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs27 46C
<400> 22
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 23
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs27 47C
<400> 23
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 24
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs27 11S 46C
<400> 24
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 25
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs27 46C 二聚体
<400> 25
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ile Ala Ala Lys Phe Asp
50 55 60
Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser
100 105 110
Gln Ala Pro Lys
115
<210> 26
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 43C
<400> 26
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 27
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 46C
<400> 27
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 28
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 47C
<400> 28
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 29
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 11S 46C
<400> 29
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 30
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 9H 46C
<400> 30
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp His Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 31
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 36H 46C
<400> 31
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg His Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 32
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 46C二聚体
<400> 32
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ile Ala Ala Gln His Asp
50 55 60
Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys
115
<210> 33
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 delN 46C
<400> 33
Ala His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu
1 5 10 15
Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg
20 25 30
Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala Lys Lys Leu
35 40 45
Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 34
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 delNC 46C
<400> 34
Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu
1 5 10 15
Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg
20 25 30
Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala Lys Lys Leu
35 40 45
Asn Asp Ala Gln Ala
50
<210> 35
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 46C 三聚体
<400> 35
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ile Ala Ala Gln His Asp
50 55 60
Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile
145 150 155 160
Leu Cys Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
165 170
<210> 36
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24 43C
<400> 36
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 37
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24 46C
<400> 37
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 38
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24 47C
<400> 38
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 39
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24 11S 46C
<400> 39
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 40
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h3 43C
<400> 40
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 41
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h3 46C
<400> 41
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 42
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h3 47C
<400> 42
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 43
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h3 11S 46C
<400> 43
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 44
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h4 43C
<400> 44
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 45
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h4 46C
<400> 45
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 46
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h4 47C
<400> 46
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 47
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h1 43C
<400> 47
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 48
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h1 46C
<400> 48
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 49
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h1 47C
<400> 49
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 50
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h2 43C
<400> 50
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 51
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h2 46C
<400> 51
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 52
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h2 47C
<400> 52
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 53
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs20 46C
<400> 53
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Leu Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 54
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs20 43C
<400> 54
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ser Leu Cys Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 55
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs20 47C
<400> 55
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Leu Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 56
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs20 11S 46C
<400> 56
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Leu Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 57
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs17 46C
<400> 57
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 58
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs42 46C
<400> 58
Ile Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 59
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs42 47C
<400> 59
Ile Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 60
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs42 43C
<400> 60
Ile Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Cys Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 61
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs42 11S 46C
<400> 61
Ile Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 62
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs41 46C
<400> 62
Ile Ala Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 63
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs28 46C
<400> 63
Ile Asp Ala Gln His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 64
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs23 46C
<400> 64
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 65
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs25 46C
<400> 65
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 66
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs31 46C
<400> 66
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asp Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 67
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs43 46C
<400> 67
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 68
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs44 46C
<400> 68
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 69
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs45 46C
<400> 69
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Ala Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asp Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 70
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs15 46C
<400> 70
Ile Asp Asn Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 71
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs16 46C
<400> 71
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 72
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs35 46C
<400> 72
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Leu Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 73
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs17 11S 46C
<400> 73
Ile Asp Ser Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu
35 40 45
Cys Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55 60
<210> 74
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB14 43C
<400> 74
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Cys Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 75
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB14 46C
<400> 75
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 76
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB14 47C
<400> 76
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 77
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB14 50C
<400> 77
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Cys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 78
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB14
<400> 78
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 79
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB27
<400> 79
Ala Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 80
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB24
<400> 80
Ala Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 81
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB26
<400> 81
Ala Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 82
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB28
<400> 82
Ala Asp Ala Gln His Asp Glu Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 83
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB20
<400> 83
Ala Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Thr Ser Lys Ser Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 84
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结构域C
<400> 84
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 85
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结构域 B
<400> 85
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 86
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结构域 Z
<400> 86
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子
<400> 87
Ala Ser Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ser Ala
1 5 10
<210> 88
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子和标签
<400> 88
Ala Ser Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ser Ala Cys Ala Ser Trp Ser His
1 5 10 15
Pro Gln Phe Glu Lys
20
<210> 89
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于纯化的标签
<400> 89
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 90
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 50C
<400> 90
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Cys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 91
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 51C
<400> 91
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Cys Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 92
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 53C
<400> 92
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Cys Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 93
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24 50C
<400> 93
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Cys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 94
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24 51C
<400> 94
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Cys Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 95
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24 53C
<400> 95
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Cys Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 96
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 40C
<400> 96
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Cys Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 97
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 42C
<400> 97
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Cys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 98
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 49C
<400> 98
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Cys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 99
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 54C
<400> 99
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Cys Gln Ala Pro Lys
50 55

Claims (15)

1.一种包含一个或多个结构域的Fc结合蛋白，其中对应于SEQ ID NO:2的位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处的至少一个氨基酸是半胱氨酸。
2.权利要求1的Fc结合蛋白，其中至少一个结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置40、42、43、46、47、49、50、51、53或54处的至少一个氨基酸是半胱氨酸。
3.权利要求1的Fc结合蛋白，其中至少一个结构域分别包含SEQ ID NO:3-16的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:3-16的位置40、42、43、46、47、50、51、53或54处的至少一个氨基酸是半胱氨酸。
4.权利要求1的Fc结合蛋白，其中至少一个结构域分别包含SEQ ID NO:7-8的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:7-8的位置40、42、43、46、47、50、51、53或54处的至少一个氨基酸是半胱氨酸。
5.权利要求1的Fc结合蛋白，其中对应于SEQ ID NO:2的位置43、46或47处的至少一个氨基酸是半胱氨酸。
6.权利要求1的Fc结合蛋白，其中至少一个结构域分别包含选自SEQ ID NO:17-86、90-99的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列。
7.权利要求1的Fc结合蛋白，其中所述结构域在其N端的前4个氨基酸内具有1个、2个或3个氨基酸的缺失和/或在其C端的前2个氨基酸内具有1个或2个氨基酸的缺失。
8.权利要求1-7的Fc结合蛋白，其中所述蛋白包含彼此连接的2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个结构域。
9.权利要求8的Fc结合蛋白，其中所述蛋白质是同源多聚体或异源多聚体。
10.权利要求9的Fc结合蛋白，其中一个或多个结构域彼此直接连接或通过一个或多个接头，优选肽接头彼此连接。
11.权利要求1-10中任一项的Fc结合蛋白，其中所述蛋白优选地通过位置40、42、43、46、47、50、51、53或54处的半胱氨酸缀合于固体载体。
12.权利要求1-11中任一项的Fc结合蛋白，其中所述蛋白与包含Fc区的IgG1、IgG2、IgG4、IgM、IgA、Ig片段、包含Ig的Fc区的融合蛋白以及包含Ig的Fc区的缀合物结合。
13.一种亲和分离基质，其包含权利要求1至12中任一项的Fc结合蛋白。
14.权利要求1至12中任一项的Fc结合蛋白或权利要求13中的亲和分离基质的用途，其用于包含Fc序列的任何蛋白质的亲和纯化。
15.一种亲和纯化包含Fc序列的蛋白质的方法，所述方法包括：(a)提供含有包含Fc序列的蛋白质的液体；(b)提供一种亲和分离基质，其包含与所述亲和分离基质偶联的权利要求1至12中任一项所述的至少一种Fc结合蛋白；(c)在允许权利要求1至12中任一项所述的至少一种Fc结合蛋白与包含Fc序列的蛋白结合的条件下使所述亲和分离基质与所述液体接触；以及(d)从所述亲和纯化基质上洗脱包含Fc序列的所述蛋白质。
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