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CN111132552A - 用于调节内共生体的组合物和相关方法 - Google Patents

用于调节内共生体的组合物和相关方法 Download PDF

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CN111132552A
CN111132552A CN201880010183.1A CN201880010183A CN111132552A CN 111132552 A CN111132552 A CN 111132552A CN 201880010183 A CN201880010183 A CN 201880010183A CN 111132552 A CN111132552 A CN 111132552A
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CN201880010183.1A
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伊格纳西奥·马丁内斯
扎卡里·加罗·阿默
巴里·安德鲁·马丁
阿马多 梅尔·史蒂夫·阿文达尼奥
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Original Assignee
Flagship Entrepreneurship And Innovation Co 5
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Abstract

本文提供了方法和组合物，用于通过改变宿主和寄宿于该宿主中的一种或多种微生物之间的相互作用来调节宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的适合度。本发明的特征是一种组合物，该组合物包括调节剂(例如，多肽、核酸、小分子、或其组合)，该调节剂能以调节(例如，提高或降低)宿主适合度的方式诱导该宿主微生物区系的变化。本文所述的调节剂可以调节对农业、商业和/或公共健康重要的多种无脊椎动物的适合度。

Description

用于调节内共生体的组合物和相关方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年2月24日提交的美国临时申请号62/463,451和于2017年11月9日提交的美国临时申请号62/583,990的优先权，其各自的内容通过引用以其全文特此并入本文。
背景技术
无脊椎生物(例如，昆虫、软体动物或线虫)在人类环境中普遍存在。在一些情况下，无脊椎动物起到有益的作用，例如线虫或节肢动物在农业中用于授粉工作和有害生物控制或在商业中用于商业产品(例如，蜂蜜或蚕丝)的生产。在其他情况下，无脊椎动物可能是有害的，包括可能是严重的作物有害生物或疾病携带者的软体动物(例如，蜗牛和蛞蝓)、线虫或昆虫中的一些物种。因此，本领域需要调节在农业、商业或公共健康中重要的无脊椎动物的适合度的方法和组合物。
发明内容
本文披露了用于通过改变宿主和寄宿于宿主中的一种或多种微生物之间的相互作用来调节无脊椎动物(包括昆虫、线虫、或软体动物)的适合度的组合物和方法。
在一个方面，本文提供了用于降低昆虫的适合度的方法，该方法包括向该昆虫递送有效量的包含dsRNA的多核苷酸，相对于没有被给予该dsRNA的昆虫，该dsRNA降低了该昆虫中昆虫含菌细胞调节基因或昆虫免疫调节基因的表达。
在一些实施例中，该基因编码来自含菌细胞特异性的富含半胱氨酸蛋白BCR家族的蛋白、来自分泌蛋白SP家族的蛋白、BicD(双尾蛋白D)、Cact(cactus)、DIF(Dorsal相关免疫因子)、Toll(Toll相互作用蛋白)、或imd(免疫缺陷蛋白)。在一些实施例中，该基因编码与表5、表8或表9中列出的蛋白具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％氨基酸序列同一性的蛋白。在一些实施例中，该基因编码表5、表8、或表9中列出的蛋白的功能性同系物。例如，该基因可编码蚜虫中的cactus样蛋白(例如，GenBank登录号：XP_022175228.1、XP_016656687.1、NP_001156668.1、XP_008179071.1、或XP_016656686.1所述蛋白中的任何一种，其各自的相关氨基酸和核苷酸序列通过引用并入)。
在一些实施例中，该dsRNA与该昆虫中的该基因的10个至30个核苷酸(例如，10个至30个核苷酸、12个至28个核苷酸、14个至26个核苷酸、16个至24个核苷酸、14个至22个核苷酸、或18个至20个核苷酸)互补。在一些实施例中，该dsRNA与该昆虫中的该基因的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸互补。在一些实施例中，该dsRNA的整个长度与该基因互补。在替代性实施例中，只有该dsRNA的一部分与该基因互补。
在一些实施例中，该方法对于降低该基因在该昆虫中的表达是有效的，例如，相对于没有被给予该多核苷酸的昆虫降低了约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％或更多。在一些实施例中，该方法对于降低该基因在该昆虫中的表达是有效的，例如，如与参考水平相比(例如，如与一种或多种对照基因(例如，管家基因)的表达、与该同一基因在不同样品(例如，一种或多种对照样品)中的表达、或与该同一基因在同一样品中在一个或多个较早的时间点的表达相比)降低了约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％或更多。
在一些实施例中，该方法对于降低该基因在该昆虫中的表达是有效的，例如，相对于没有被给予该多核苷酸的昆虫，降低了约1.5x、1.75x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、25x、50x、75x、或100x倍。在一些实施例中，该方法对于降低该基因在该昆虫中的表达是有效的，例如，与参考水平相比(例如，如与一种或多种对照基因(例如，管家基因)的表达、与该同一基因在不同样品(例如，一种或多种对照样品)中的表达、或与该同一基因在同一样品中在一个或多个较早的时间点的表达相比)降低了约1.5x、1.75x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、25x、50x、75x、或100x倍。
在一些实施例中，该方法对于抑制该基因在该昆虫中的表达或将该基因的表达降低至不可检测的水平是有效的。
在一些实施例中，，相对于没有被递送该多核苷酸的昆虫，该方法对于降低寄宿于该昆虫中的一种或多种微生物的水平、多样性或代谢是有效的。在一些实施例中，该方法对于降低寄宿于该昆虫中的一种或多种微生物的水平、多样性或代谢是有效的，例如，相对于没有被递送该多核苷酸的昆虫降低了约1.5x、1.75x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、25x、50x、75x、或100x倍。在一些实施例中，该方法对于降低寄宿于该昆虫中的一种或多种微生物的水平、多样性或代谢是有效的，例如，相对于没有被递送该多核苷酸的昆虫降低了约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。在某些实施例中，该一种或多种微生物是布赫纳氏菌属物种(Buchnera spp)。
在一些实施例中，相对于没有被递送该多核苷酸的昆虫，该方法对于降低该昆虫的适合度是有效的。在一些实施例中，该方法对于降低该昆虫的适合度是有效的，例如，相对于没有被递送该多核苷酸的昆虫降低了约1.5x、1.75x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、25x、50x、75x、或100x倍。在一些实施例中，该方法对于降低该昆虫的适合度是有效的，例如，相对于没有被递送该多核苷酸的昆虫降低了约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。
在一些实施例中，将该多核苷酸以配制用于递送至昆虫的组合物递送。在一些实施例中，该递送包括递送该多核苷酸至昆虫有害生物生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个生境。在一些实施例中，该递送包括将该抗微生物肽喷洒在农作物上。在一些实施例中，将该多核苷酸作为昆虫可食用组合物递送，从而被该昆虫摄取的。
在一些实施例中，将该多核苷酸与农业上可接受的载体一起配制为液体、固体、气溶胶、膏剂、凝胶、或气体组合物。
在一些实施例中，该昆虫是蚜虫。
在另一方面，本文提供了被配制用于递送至昆虫的组合物，该组合物包含含有dsRNA的多核苷酸，其中该dsRNA与昆虫含菌细胞调节基因或昆虫免疫调节基因的15个至30个核苷酸互补。在一些实施例中，该基因编码选自下组的蛋白，该组由以下组成：来自含菌细胞特异性的富含半胱氨酸蛋白BCR家族的蛋白、来自分泌蛋白SP家族的蛋白、BicD(双尾蛋白D)、Cact(cactus)、DIF(Dorsal相关免疫因子)、Toll(Toll相互作用蛋白)、和imd(免疫缺陷蛋白)。在一些实施例中，该基因编码与表5、表8或表9中列出的蛋白具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％氨基酸序列同一性的蛋白。在一些实施例中，该基因编码表5、表8、或表9中列出的蛋白的功能性同系物。例如，该基因可编码蚜虫中的cactus样蛋白(例如，GenBank登录号：XP_022175228.1、XP_016656687.1、NP_001156668.1、XP_008179071.1、或XP_016656686.1所述蛋白中的任何一种，其各自的相关氨基酸和核苷酸序列通过引用并入)。在一些实施例中，该dsRNA与该昆虫中的该基因的10个至30个核苷酸(例如，10个至30个核苷酸、12个至28个核苷酸、14个至26个核苷酸、16个至24个核苷酸、14个至22个核苷酸、或18个至20个核苷酸)互补。在一些实施例中，该dsRNA与该昆虫中的该基因的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸互补。在一些实施例中，该dsRNA的整个长度与该基因互补。在替代性实施例中，只有该dsRNA的一部分与该基因互补。
在另外的方面，本文提供了一种植物，该植物包含本文所述的组合物的局部施用。
在又另一个方面，本文提供了在其基因组中具有重组DNA构建体的转基因植物细胞，其中该重组DNA构建体包括可操作地连接至编码RNA的DNA的异源启动子，该RNA包括至少一个双链RNA区域，该双链RNA区域的至少一条链包括与昆虫含菌细胞调节基因或昆虫免疫调节基因的15个至30个核苷酸互补的核苷酸序列。在一些实施例中，该基因编码选自下组的蛋白，该组由以下组成：来自该含菌细胞特异性的富含半胱氨酸蛋白BCR家族的蛋白、来自分泌蛋白SP家族的蛋白、BicD(双尾蛋白D)、Cact(cactus)、DIF(Dorsal相关免疫因子)、Toll(Toll相互作用蛋白)、和imd(免疫缺陷蛋白)。在一些实施例中，该基因编码与表5、表8或表9中列出的蛋白具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％氨基酸序列同一性的蛋白。在一些实施例中，该基因编码表5、表8、或表9中列出的蛋白的功能性同系物。例如，该基因可编码蚜虫中的cactus样蛋白(例如，GenBank登录号：XP_022175228.1、XP_016656687.1、NP_001156668.1、XP_008179071.1、或XP_016656686.1所述蛋白中的任何一种，其各自的相关氨基酸和核苷酸序列通过引用并入)。在一些实施例中，该dsRNA与该昆虫中的该基因的10个至30个核苷酸(例如，10个至30个核苷酸、12个至28个核苷酸、14个至26个核苷酸、16个至24个核苷酸、14个至22个核苷酸、或18个至20个核苷酸)互补。在一些实施例中，该dsRNA与该昆虫中的该基因的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸互补。在一些实施例中，该dsRNA的整个长度与该基因互补。在替代性实施例中，只有该dsRNA的一部分与该基因互补。
在又另一个方面，本文提供了如下组合物，这些组合物包括调节剂(例如，多肽(例如，抗体、细菌素、抗微生物肽、或含菌细胞调节肽)、核酸(例如，DNA、RNA(例如，mRNA、gRNA、或抑制性RNA(例如，RNAi、shRNA、miRNA))、CRISPR核酸)、小分子(例如，前列腺素)、或其组合)，该调节剂调节(例如，提高或降低)无脊椎动物宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的适合度，其中该调节剂改变该宿主和寄宿于该宿主中的一种或多种微生物之间的相互作用。
在一些实施例中，该调节剂(例如，多肽(例如，抗体、细菌素、抗微生物肽、或含菌细胞调节肽)、核酸(例如，DNA、RNA(例如，mRNA、gRNA、或抑制性RNA(例如，RNAi、shRNA、miRNA))、CRISPR核酸)、小分子(例如，前列腺素)、或其组合)靶向一种或多种宿主途径，该宿主途径介导该宿主和寄宿于该宿主中的一种或多种微生物之间的相互作用(例如，宿主-微生物区系相互作用)。在某些实施例中，靶向(例如，上调、下调、或抑制)该一种或多种宿主途径相比于没有被给予调节剂的宿主生物改变了寄宿于该宿主中的一种或多种微生物的水平、多样性或功能。在某些实施例中，靶向(例如，上调、下调、或抑制)该一种或多种宿主途径的相比于没有被给予调节剂的宿主生物提高了寄宿于该宿主中的一种或多种微生物的水平、多样性或功能。在替代性实施例中，靶向(例如，上调、下调、或抑制)该一种或多种宿主途径相比于没有被给予调节剂的宿主生物降低了寄宿于该宿主中的一种或多种微生物的水平、多样性或功能。
在一些实施例中，该宿主途径是调节含菌细胞功能或发育的途径。在一些实施例中，靶向含菌细胞功能或发育相比于没有被给予调节剂的宿主生物可提高和/或降低寄宿于含菌细胞中的一种或多种微生物的水平、多样性和/或功能。在某些实施例中，靶向含菌细胞功能或发育相比于没有被给予调节剂的宿主生物降低了寄宿于含菌细胞(例如，蚜虫的含菌细胞)中的一种或多种微生物的水平、多样性或功能。在某些实施例中，靶向含菌细胞功能或发育相比于没有被给予调节剂的宿主生物提高了寄宿于含菌细胞(例如，蚜虫的含菌细胞)中的一种或多种微生物的水平、多样性或功能。
在一些实施例中，该宿主途径是调节该宿主的免疫系统的途径。例如，在一些实施例中，该调节剂激活针对寄宿于该宿主中的一种或多种微生物的免疫应答，从而相比于没有被给予调节剂的宿主生物降低该一种或多种微生物的水平、多样性和/或功能。可替代地，在一些实施例中，该调节剂抑制针对寄宿于该宿主中的一种或多种微生物的免疫应答，从而相比于没有被给予调节剂的宿主生物提高该一种或多种微生物的水平、多样性和/或功能。
在一些实施例中，该调节剂(例如，多肽(例如，抗体、细菌素、抗微生物肽、或含菌细胞调节肽)、核酸(例如，DNA、RNA(例如，mRNA、gRNA、或抑制性RNA(例如，RNAi、shRNA、miRNA))、CRISPR核酸)、小分子(例如，前列腺素)、或其组合)相比于没有被给予调节剂的宿主生物通过改变该宿主中的基因表达靶向一种或多种宿主途径。例如，相比于没有被给予该调节剂的宿主生物，该调节剂可提高和/或降低在该宿主中的基因表达。在一些实施例中，相比于没有被给予该调节剂的宿主生物，该调节剂改变如下基因的表达，该基因编码表3、表4、表5、表7、表8、或表9中列出的蛋白。在一些实施例中，相比于没有被给予该调节剂的宿主生物，该调节剂降低了如下基因的表达，该基因编码表3、表4、表5、表7、表8、或表9中列出的蛋白。在一些实施例中，相比于没有被给予该调节剂的宿主生物，该调节剂降低了如下基因的表达，该基因编码表3、表4、表5、表7、表8、或表9中列出的蛋白。在一些实施例中，该基因编码含菌细胞调节肽。例如，该含菌细胞调节肽可能是表5或表8中所列出的一种(例如，BCR1)。在一些实施例中，该基因编码免疫系统组分。例如，该免疫系统组分可能是表9中列出的一种。在一些实施例中，该调节剂靶向该宿主中的多肽。在一些实施例中，该多肽是酶或细胞受体。在一些实施例中，相比于没有被给予该调节剂的宿主生物，该调节剂提高了和/或降低了酶活性。在一些实施例中，相比于没有被给予该调节剂的宿主生物，该调节剂提高了和/或降低了细胞受体信号传导。在一些实施例中，该宿主蛋白是表4、表5、表8、或表9中列出的一种。
该调节剂(例如，多肽(例如，抗体、细菌素、抗微生物肽、或含菌细胞调节肽)、核酸(例如，DNA、RNA(例如，mRNA、gRNA、或抑制性RNA(例如，RNAi、shRNA、miRNA))、CRISPR核酸)、小分子(例如，前列腺素)、或其组合)可另外地或可替代地靶向一种或多种微生物途径，该微生物途径介导该宿主和寄宿于该宿主中的一种或多种微生物之间的相互作用。在一些实施例中，相比于没有被给予该调节剂的宿主生物，该调节剂改变寄宿于该宿主中的一种或多种微生物的基因表达。例如，相比于没有被给予该调节剂的宿主生物，该调节剂可提高和/或降低该一种或多种微生物中的基因表达。在一些实施例中，相比于没有被给予该调节剂的宿主生物，该调节剂改变(例如，提高了或降低了)编码表3或表7中列出的蛋白的基因的表达。在一些实施例中，该调节剂靶向(例如，结合、拮抗、和/或激活)寄宿于该宿主中的一种或多种微生物中的多肽(例如，表3或表7中列出的蛋白)。
在一些实施例中，寄宿于该宿主中的该一种或多种微生物是内共生微生物。在一些实施例中，该一种或多种微生物寄宿于该宿主的肠中。在一些实施例中，该一种或多种微生物寄宿于该宿主中的含菌细胞中。在一些实施例中，寄宿于该宿主中的该一种或多种微生物是真菌或细菌。在一些实施例中，寄宿于宿主中的细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：暂定属物种(Candidatus spp)、布赫纳氏菌属物种(Buchenera spp)、布拉特杆菌属物种(Blattabacterium spp)、鲍曼属物种(Baumania spp)、威格尔斯沃思氏菌属物种(Wigglesworthia spp)、沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp)、立克次体属物种(Rickettsia spp)、东方体属物种(Orientia spp)、伴突属物种(Sodalis spp)、伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp)、贪铜菌属物种(Cupriavidus spp)、弗兰克氏菌属物种(Frankia spp)、中华根瘤菌属物种(Snirhizobium spp)、链球菌属物种(Streptococcusspp)、沃廉菌属物种(Wolinella spp)、木杆菌属物种(Xylella spp)、欧氏杆菌属物种(Erwinia spp)、农杆菌属物种(Agrobacterium spp)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、链霉菌属物种(Streptomyces spp)、微球菌属物种(Micrococcus spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、醋杆菌属物种(Acetobacter spp)、蓝细菌属物种(Cyanobacteria spp)、沙门氏菌属物种(Salmonellaspp)、红球菌属物种(Rhodococcus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp)、肠球菌属物种(Enterococcus spp)、产碱杆菌属物种(Alcaligenes spp)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、节杆菌属物种(Arthrobacter spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、短杆菌属物种(Brevibacterium spp)、栖热菌属物种(Thermusspp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、梭菌属物种(Clostridium spp)、以及埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp)。在一些实施例中，寄宿于宿主中的真菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：假丝酵母属(Candida)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、德巴利酵母属(Debaromyces)、Starmerella、毕赤酵母属(Pichia)、隐球菌属(Cryptococcus)、南极假丝酵母属(Pseudozyma)、Symbiotaphrina bucneri、Symbiotaphrina kochii、休哈塔假丝酵母(Scheffersomyces shehatae)、树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipites)、隐球菌属(Cryptococcus)、毛孢子菌属(Trichosporon)、Amylostereum areolatum、香柱菌属物种(Epichloe spp)、松果毕赤酵母(Pichia pinus)、荚膜汉逊酵母(Hansenula capsulate)、Daldinia decipien、长喙壳属物种(Ceratocystis spp)、长喙壳菌属物种(Ophiostomaspp)、以及Attamyces bromatificus。在一些实施例中，该调节剂改变寄宿于该宿主中的微生物的生长、分裂、生存力、代谢、和/或寿命。在一些实施例中，该调节剂降低该一种或多种微生物的生长、分裂、生存力、代谢、和/或寿命。在一些实施例中，该调节剂提高该一种或多种微生物的生长、分裂、生存力、代谢、和/或寿命。
在一些实施例中，该调节剂是多肽(例如，抗体、细菌素、抗微生物肽、或含菌细胞调节肽)、核酸(例如，DNA、RNA(例如，mRNA、gRNA、或抑制性RNA(例如，RNAi、shRNA、miRNA))、CRISPR核酸)、小分子(例如，前列腺素)、或其任何组合。
在一些实施例中，该调节剂是核酸。核酸可以是DNA分子、RNA分子(例如，双链RNA(dsRNA)或单链RNA(ssRNA))、或杂交DNA-RNA分子。在一些实施例中，RNA是信使RNA(mRNA)、指导RNA(gRNA)、或抑制性RNA。在一些实施例中，抑制性RNA是RNAi、shRNA、或miRNA。在一些实施例中，该核酸编码多肽。在一些实施例中，该核酸是编码多肽的表达运载体。在一些实施例中，该核酸是CRISPR核酸。
在一些实施例中，该调节剂是小分子。在一些实施例中，该小分子是激动剂、拮抗剂、抑制剂、或宿主免疫系统途径或含菌细胞调节途径的组分的激活剂。在一些实施例中，该小分子是前列腺素。
在一些实施例中，该调节剂是多肽。在一些实施例中，该多肽是抗体或抗体片段。例如，该抗体或抗体片段可以是该宿主中或寄宿于该宿主中的微生物中的酶(例如，免疫系统或含菌细胞调节酶)的激动剂或拮抗剂，其包括表5、表7、表8、或表9中列出的蛋白中的任一种。
在一些实施例中，该调节剂(例如，多肽(例如，抗体、细菌素、抗微生物肽、或含菌细胞调节肽)、核酸(例如，DNA、RNA(例如，mRNA、gRNA、或抑制性RNA(例如，RNAi、shRNA、miRNA))、CRISPR核酸)、小分子(例如，前列腺素)、或其组合)通过提高或降低该宿主对杀有害生物剂(例如，表11中列出的杀有害生物剂)的易感性来调节该宿主的适合度。在一些实施例中，该杀有害生物剂是杀细菌剂或杀真菌剂。在一些实施例中，该杀有害生物剂是杀昆虫剂、杀软体动物剂、或杀线虫剂。
在一些实施例中，该组合物包括多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、或多于10种)不同的调节剂(例如，多肽(例如，抗体、细菌素、抗微生物肽、或含菌细胞调节肽)、核酸(例如，DNA、RNA(例如，mRNA、gRNA、或抑制性RNA(例如，RNAi、shRNA、miRNA))、CRISPR核酸)、小分子(例如，前列腺素)、或其组合)。在一些实施例中，该组合物包括调节剂和杀有害生物剂(例如，表11中列出的杀有害生物剂)。在一些实施例中，该杀有害生物剂是杀细菌剂或杀真菌剂。在一些实施例中，该杀有害生物剂是杀昆虫剂、杀软体动物剂、或杀线虫剂。在一些实施例中，该组合物包括调节剂和提高作物生长的药剂。
在一些实施例中，该调节剂(例如，多肽(例如，抗体、细菌素、抗微生物肽、或含菌细胞调节肽)、核酸(例如，DNA、RNA(例如，mRNA、gRNA、或抑制性RNA(例如，RNAi、shRNA、miRNA))、CRISPR核酸)、小分子(例如，前列腺素)、或其组合)连接至第二部分。在一些实施例中，该第二部分选自下组，该组由以下组成：调节剂、肽核酸、细胞穿透肽(CPP)和靶向结构域。在一些实施例中，该调节剂包括接头。在一些实施例中，该接头是可裂解接头。在一些实施例中，该CPP是表10中列出的任一种。
在一些实施例中，该组合物进一步包括载体。在一些实施例中，该载体是农业上可接受的载体。在一些实施例中，该组合物进一步包括宿主诱饵、粘性剂、或其组合。在一些实施例中，该宿主诱饵是可食用试剂。在一些实施例中，该宿主诱饵是化学引诱剂。
在一些实施例中，该组合物是处于有效调节宿主适合度的剂量。在一些实施例中，该组合物是处于有效提高宿主适合度的剂量。在替代性实施例中，该组合物是处于有效降低宿主适合度的剂量。在一些实施例中，宿主适合度是通过该宿主的存活、寿限、繁殖、或代谢来测量的。
在一些实施例中，将该组合物配制用于向寄生在该宿主的肠道中的微生物递送。在一些实施例中，将该组合物配制用于向寄生在该宿主的含菌细胞中的微生物递送。在一些实施例中，将该组合物配制用于向植物进行递送。在一些实施例中，将该组合物配制用于在宿主进食站中使用。在一些实施例中，该组合物被配制成液体、粉剂、颗粒、或纳米颗粒。在一些实施例中，将该组合物配制为选自下组的一种，该组由以下组成：脂质体、聚合物、细菌分泌肽、以及合成纳米胶囊。在一些实施例中，该合成纳米胶囊向宿主中的靶位点递送组合物。在一些实施例中，该靶位点是宿主的肠。在一些实施例中，该靶位点是宿主中的含菌细胞。
在另一方面，本文提供了包括前述组合物(例如，调节剂(例如，多肽(例如，抗体、细菌素、抗微生物肽、或含菌细胞调节肽)、核酸(例如，DNA、RNA(例如，mRNA、gRNA、或抑制性RNA(例如，RNAi、shRNA、miRNA))、CRISPR核酸)、小分子(例如，前列腺素)、或其组合))中任一项的植物。在一些实施例中，该植物包括整合进植物基因组中的核酸，其中该核酸编码前述调节剂(例如，多肽(例如，抗体、细菌素(例如，colA)、抗微生物肽、含菌细胞调节肽、核酸、或小分子)中的任一项。该调节剂可以是对植物非内源的。在一些实施例中，该植物进一步包括用于无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的可食用试剂，其中该可食用试剂产生和/或携带该调节剂。在一些实施例中，该可食用试剂包括该植物的一种或多种组分。在一些实施例中，该植物的一种或多种组分包括根、茎、叶、花、汁液、树皮、木材、树突棘、花粉、花蜜、种子、果实、或其任何组合。例如，在一些实施例中，该植物产生如下调节剂，昆虫通过进食该植物的一种或多种组分摄取该调节剂。
在又另一方面，本文提供了包括前述组合物(例如，调节剂(例如，多肽(例如，抗体、细菌素、抗微生物肽、或含菌细胞调节肽)、核酸(例如，DNA、RNA(例如，mRNA、gRNA、或抑制性RNA(例如，RNAi、shRNA、miRNA))、CRISPR核酸)、小分子(例如，前列腺素)、或其组合))中任一项的宿主。该宿主可以是无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)。在一些实施例中，该无脊椎动物是昆虫。在一些实施例中，该昆虫是含有含菌细胞的昆虫。例如，在某些实施例中，该含有含菌细胞的昆虫可以是蚜虫(例如，玉米叶蚜虫或桃蚜)。在另外的实施例中，该昆虫是甲虫、象鼻虫、蝇、蚜虫、粉虱、叶蝉(leafhopper)、介壳虫、蛾、蝴蝶、蚱蜢、蟋蟀、蓟马、或螨(mite)。在其他实施例中，该无脊椎动物是软体动物。在一些实施例中，该软体动物是属于蛞蝓科(Veronicellidae)、瓶螺科(Ampullariidae)、玛瑙螺科(Achatinidae)、大蜗牛科(Helicidae)、Hydromiidae、扁卷螺科(Planobidae)、椎实螺科(Lymnaeidae)、尾环蜗牛科(Urocyclidae)、巴蜗牛科(Bradybaenidae)、野蛞蝓科(Agriolimacidae)、阿勇蛞蝓科(Arionidae)、或小蛞蝓科(Milacidae)的物种。在其他实施例中，该无脊椎动物可以是线虫。在一些实施例中，该线虫是属于环线虫科(Criconematidae)、刺线虫科(Belonolaimidae)、纽带线虫科(Hoplolaimidae)、异皮线虫科(Heteroderidae)、长针线虫科(Longidoridae)、短体科(Pratylenchidae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、或粒线虫科(Anguinidae)的物种。
在另一方面，本文提供了用于调节(例如，提高或降低)宿主的适合度的系统。该系统包括调节剂(例如，多肽(例如，抗体、细菌素、抗微生物肽、或含菌细胞调节肽)、核酸(例如，DNA、RNA(例如，mRNA、gRNA、或抑制性RNA(例如，RNAi、shRNA、miRNA))、CRISPR核酸)、小分子(例如，前列腺素)、或其组合)，该调节剂改变该宿主和寄宿于该宿主中的一种或多种微生物之间的相互作用，其中该系统对于调节(例如，提高或降低)该宿主的适合度是有效的，并且其中该宿主是无脊椎动物(例如，昆虫(例如，蚜虫)、软体动物、或线虫)。在一些实施例中，该系统的调节剂是前述组合物中的任一种。在一些实施例中，将该调节剂配制为粉剂。在一些实施例中，将该调节剂配制为溶剂。在一些实施例中，将该调节剂配制为浓缩物。在一些实施例中，将该调节剂配制为稀释剂。在一些实施例中，通过将先前组合物的任一个与载体组合来制备该调节剂用于递送。
在另一方面，本文提供了调节宿主-微生物区系相互作用的方法，该方法包括将本文所述的组合物(例如，调节剂(例如，多肽(例如，抗体、细菌素、抗微生物肽、或含菌细胞调节肽)、核酸(例如，DNA、RNA(例如，mRNA、gRNA、或抑制性RNA(例如，RNAi、shRNA、miRNA))、CRISPR核酸)、小分子(例如，前列腺素)、或其组合))中的任一种递送至该宿主，其中该调节剂调节该宿主和寄宿于该宿主中的一种或多种微生物之间的一种或多种相互作用。
在另一方面，本文提供了调节无脊椎动物宿主(例如，昆虫(例如，蚜虫)、软体动物、或线虫)的适合度的方法，其中该方法包括将本文所述的组合物(例如，调节剂(例如，多肽(例如，抗体、细菌素、抗微生物肽、或含菌细胞调节肽)、核酸(例如，DNA、RNA(例如，mRNA、gRNA、或抑制性RNA(例如，RNAi、shRNA、miRNA))、CRISPR核酸)、小分子(例如，前列腺素)、或其组合))中的任一种递送至该宿主并且其中该调节剂改变该宿主和寄宿于该宿主中的一种或多种微生物之间的相互作用。
在上述方法中的任一种的一些实施例中，寄宿于该宿主中的该一种或多种微生物可以是真菌或细菌。在一些实施例中，该一种或多种微生物是内共生微生物。在一些实施例中，该一种或多种微生物寄宿于该宿主的肠中。在一些实施例中，该一种或多种微生物寄宿于在该宿主中的含菌细胞中。在一些实施例中，该一种或多种微生物是宿主适合度或宿主存活所需的。
在上述方法中的任一种的一些实施例中，该调节剂可靶向一种或多种宿主途径，该一种或多种宿主途径介导该宿主和一种或多种微生物之间的相互作用。在一些实施例中，该宿主途径是调节昆虫(例如，蚜虫)含菌细胞功能或发育的途径。在一些实施例中，靶向宿主含菌细胞功能或发育降低了寄宿于该含菌细胞中的一种或多种微生物的水平、多样性和/或功能。可替代地，靶向宿主含菌细胞功能或发育提高了寄宿于该含菌细胞中的一种或多种微生物的水平、多样性和/或功能。在一些实施例中，该宿主途径是调节该宿主的免疫系统的途径。
在一些实施例中，该调节剂激活针对寄宿于该宿主中的一种或多种微生物的免疫应答，从而降低该一种或多种微生物的水平、多样性和/或功能。在一些实施例中，该调节剂抑制针对寄宿于该宿主中的一种或多种微生物的免疫应答，从而提高该一种或多种微生物的水平、多样性和/或功能。
在一些实施例中，该调节剂靶向一种或多种微生物途径，该一种或多种微生物途径介导该宿主和一种或多种微生物之间的相互作用。
在一些实施例中，该递送步骤包括以足以影响一种或多种微生物的剂量和时间来提供调节剂，从而调节该宿主中的微生物多样性。在一些实施例中，该递送步骤包括将先前组合物的任一个局部施用至植物。在一些实施例中，该递送步骤包括通过遗传修饰的、工程化的或转基因的植物(例如，本文所述的植物中的任一种)提供调节剂。在其他实施例中，该递送步骤包括向该宿主提供调节剂作为无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的可食用药剂。在另外的实施例中，该递送步骤包括提供携带该调节剂的宿主。在一些实施例中，携带调节剂的宿主可以将调节剂传播给一种或多种另外的宿主。
本文还提供了筛选测定以鉴定调节(例如，提高或降低)宿主的适合度的调节剂。该筛选测定可以包括以下步骤：(a)将可能寄宿于宿主中的微生物暴露于一种或多种候选调节剂下，和(b)鉴定提高或降低宿主适合度的调节剂。在一些实施例中，该调节剂是寄宿于该宿主中的微生物。在一些实施例中，该微生物是细菌。在一些实施例中，当寄宿于宿主中时，该细菌提高宿主适合度。可替代地，当寄宿于宿主中时，该细菌降低宿主适合度。在一些实施例中，该调节剂是本文所述的调节剂(例如，调节剂(例如，多肽(例如，抗体、细菌素、抗微生物肽、或含菌细胞调节肽(例如，鞘翅肽A)、核酸(例如，DNA、RNA(例如，mRNA、gRNA、或抑制性RNA(例如，RNAi、shRNA、miRNA))、CRISPR核酸)、小分子(例如，前列腺素)、或其组合))中的任一种。在一些实施例中，该调节剂由遗传修饰的噬菌体或细菌提供。在一些实施例中，该宿主的适合度通过调节宿主微生物区系来调节。
定义
如本文所用的，该术语“含菌细胞”是指在无脊椎动物，例如，昆虫、线虫、或软体动物中发现的特化细胞，其中细胞内细菌具有共生细菌的特性。在一些情况下，该含菌细胞可与其他的含菌细胞聚集以形成含菌体(bacteriome)。
如本文所用的，该术语“有效量”是指足以影响所述结果的调节剂(例如，多肽、核酸、小分子、或其组合)或包括所述药剂的组合物的量，例如以提高或降低宿主生物(例如，昆虫、线虫、或软体动物)的适合度；达到靶宿主内调节剂浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；达到靶宿主肠道内调节剂浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；达到靶宿主含菌细胞内调节剂浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；以调节靶宿主中一种或多种微生物(例如，内共生体)的水平或活性。
如本文所用的，该术语“适合度”是指宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)存活和/或产生存活后代的能力。宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的适合度可以通过一个或多个参数来测量，包括但不限于寿限、繁殖速率、迁移、体重、或代谢速率。取决于该宿主，适合度可另外地基于活动(例如，咬人动物或人、植物授粉)、疾病传播(例如，媒介-媒介传播或媒介-动物传播)、或产量(例如，蜂蜜或蚕丝)的测量值来测量。
如本文所用的，术语“肠”是指宿主肠的任何部分，包括宿主的前肠、中肠、或后肠。
如本文所用的，该术语“宿主”是指生物，如携带寄宿微生物(例如，内源微生物、内共生微生物(例如，原生或次生内共生体)、共栖生物、和/或致病微生物)的无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)。
如本文所用的，“降低宿主适合度”或“减少宿主适合度”是指由于给予调节剂而对宿主生理学或由所述宿主进行的任何活动的任何破坏，包括但不限于以下所希望效果中的任何一种或多种：(1)使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的群体降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(2)使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的繁殖速率降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(3)使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的迁移降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(4)使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的体重降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(5)使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的代谢速率或活性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(6)使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)对植物的侵染降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(7)使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)对疾病传播(例如，植物、动物、或人病原体的疾病传播)降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；或(8)使生长降低，使若虫死亡率提高，和/或使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的成虫不育性提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多。相比于未给予调节剂的宿主生物，可以确定宿主适合度的降低。
如本文所用的，“提高宿主适合度”或“促进宿主适合度”是指由于给予调节剂而产生的宿主生理学或所述宿主进行的任何活动的任何有利的改变，包括但不限于以下所希望效果中的任何一种或多种：(1)使宿主的群体提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(2)使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的繁殖速率提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(3)使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的迁移提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(4)使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的体重提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(5)使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的代谢速率或活性提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(6)使通过宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)进行的授粉(例如，在给定时间内被授粉的植物数量)提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(7)使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)副产物(例如，蜂蜜或蚕丝)的产量提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(8)使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的营养物(例如，蛋白、脂肪酸、或氨基酸)含量提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；或(9)使宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)对杀有害生物剂的抗性提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多。可以确定与未给予调节剂的宿主生物相比宿主适合度的提高。
如本文所用的，“宿主和寄宿于该宿主中的微生物之间的相互作用”或“宿主-微生物区系相互作用”是指(i)该宿主中的任何途径(例如，代谢、基因调控、细胞信号传导、或免疫炎性途径)，其直接或间接影响寄宿于该宿主中的微生物(例如，内共生微生物)的存活、生长、或代谢，(ii)寄宿微生物中的任何途径(例如，代谢或细胞信号传导途径)，其直接或间接影响该宿主无脊椎动物(例如，昆虫、线虫、或软体动物)的适合度，和/或(iii)寄宿微生物中的任何途径(例如，代谢、细胞信号传导、或免疫炎性途径)，其直接或间接影响该宿主的生存、生长或代谢，和/或(iv)该宿主中的任何途径(例如，代谢、基因调控、细胞信号传导、或免疫炎性途径)，其直接或间接影响寄宿微生物的适合度。
术语“昆虫”包括在任何发育阶段(即，未成熟昆虫和成虫昆虫)的属于节肢动物门以及属于昆虫纲(Insecta)或蛛形纲(Arachnida)的任何生物。
该术语“软体动物”包括属于软体动物门的任何生物，其包括在任何发育阶段的腹足纲的生物(例如，蜗牛和蛞蝓)，即，未成熟的和成熟的软体动物。
该术语“线虫”包括属于线虫门的在任何发育阶段的任何生物(例如，线虫)，即，未成熟的和成熟的线虫。
如本文所用的，该术语“微生物”或“微生物区系”是指细菌或真菌。微生物可以是指寄宿于宿主生物(例如，内源性微生物、内共生微生物(例如，原生或次生内共生体))的微生物或者对宿主为外源的微生物，包括那些可充当调节剂的微生物。如本文所用的，术语“靶微生物”是指寄宿于宿主中的并且直接或间接地受调节剂影响的微生物。
如本文所用的，该术语“调节剂”或“药剂”是指能够改变寄宿于宿主生物(例如，无脊椎动物，例如，昆虫、软体动物、或线虫)中的微生物的水平和/或功能，并且从而调节(例如，提高或降低)宿主生物的适合度的药剂。
如本文所定义，术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的并且是指直链的或支链的、单链或双链的RNA或DNA，或其杂交体，无论长度(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、500个、1000个、或更多个核酸)。该术语还涵盖RNA/DNA杂交体。核苷酸典型地通过磷酸二酯键连接在核酸中，尽管该术语“核酸”还涵盖具有其他类型的连接或主链的核酸类似物(例如，磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基氨基磷酸酯、吗啉代、锁核酸(LNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、和肽核酸(PNA)连接或主链，等)。核酸可能是单链、双链的，或含有单链和双链序列二者的部分。核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基(包括，例如，腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、和修饰的或非典型碱基(包括，例如，次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5，6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、和5羟基甲基胞嘧啶))的任何组合。
如本文所用的，该术语“有害生物”是指对植物或其他生物造成损害，或在其他方面对人，例如人类农业方法或产品不利的无脊椎动物(例如，昆虫、线虫、或软体动物)。
如本文所用的，术语“杀有害生物剂(pesticide或pesticidal agent)”是指可用于控制农业有害生物、环境有害生物、或家养/家居有害生物，如昆虫、软体动物、线虫、真菌、细菌、和病毒的物质。术语“杀有害生物剂”被理解为涵盖天然存在的或合成的杀昆虫剂(杀幼虫剂或杀成虫剂(adulticides)、昆虫生长调节剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂(杀螨药)、杀线虫剂、杀外寄生物药、杀细菌剂、杀真菌剂、或者除草剂(可用于农业以控制或改变植物生长的物质)。杀有害生物剂(pesticide或pesticidal agent)的另外的实例列于表11中。在一些情况下，该杀有害生物剂是化感物质。如本文所用的，“化感物质”或“化感剂”是由生物产生的物质，该物质可以影响另一种生物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的生理功能(例如，萌发、生长、存活或繁殖)。
如本文所用的，术语“肽”、“蛋白质”或“多肽”涵盖天然或非天然存在的氨基酸(D-或L-氨基酸)的任何链，无论长度(例如，至少2、3、4、5、6、7、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、100或更多个氨基酸)、存在或不存在翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)、或存在例如与肽共价连接的一个或多个非氨基酰基基团(例如，糖、脂质等)，并且包括例如天然蛋白、合成的或重组的多肽和肽、杂交分子、类肽或模拟肽。
如本文所用的，两个序列之间的“百分比同一性”通过BLAST 2.0算法(描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215：403-410，1990)确定。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。
如本文所用的，术语“植物”是指整株植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、种子、或它们的子代。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、枝、配子体、孢子体、花粉、或小孢子的细胞。植物部分包括分化的和未分化的组织，包括但不限于以下：根、茎、枝、叶、花粉、种子、肿瘤组织、或各种形式的细胞和培养物(例如，单细胞、原生质体、胚、以及愈伤组织)。植物组织可以在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。
如本文所用的，“转基因植物”、“基因工程化的植物”、或“遗传修饰的植物”是指其基因组(例如，染色体DNA、叶绿体DNA、或线粒体DNA)已被重组DNA的稳定整合改变的植物。转基因植物包括从最初转化的植物细胞再生的植物和来自转化植物的后面的世代或杂交的子代转基因植物。例如，转基因植物可以被基因工程化以产生例如，本文所述的方法或组合物中的调节剂中的任一种的异源(例如，非内源的)或非异源(例如，内源)编码蛋白或RNA。任何植物物种可以被转化以产生转基因植物。该转基因植物可以是双子叶植物或单子叶植物。例如并且非限制性地，本文所述的组合物和方法的转基因植物可以衍生自以下双子叶植物家族中的任一种：豆科(Leguminosae)，包括豌豆、苜蓿和大豆等植物；伞形科(Umbelliferae)，包括胡萝卜和芹菜等植物；茄科(Solanaceae)，包括番茄、马铃薯、茄子、烟草、和辣椒等植物；十字花科(Cruciferae)，尤其是芸苔属(Brassica)(其包括油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜和西蓝花等植物)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)；菊科植物(Compositae)，其包括莴苣等植物；锦葵科(Malvaceae)，其包括棉花；蝶形花科(Fabaceae)，其包括花生等植物。本发明的转基因植物可衍生自单子叶植物，例如像小麦、大麦、高粱、小米、黑麦、黑小麦、玉蜀黍、水稻、燕麦、柳枝稷、芒属植物和甘蔗。本发明的转基因植物还具体化为树木，如苹果树、梨树、榅桲树、李子树、樱桃树、桃树、油桃树、杏树、番木瓜树、芒果树和其他木本物种(包括松柏科和落叶树木，如杨树、松树、红杉、雪松、橡树、柳树等)。
从以下详细说明以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将会是显而易见的。
附图说明
附图旨在说明本发明的一个或多个特征、方面或实施例，而非旨在进行限制。
图1是一组图，这些图示出用毕赤酵母(P.pastoris)处理延迟了蚜虫发育。将第一龄和第二龄LSR-1蚜虫置于灌注水(阴性对照)或在水中的毕赤酵母(P.pastoris)溶液的叶片上并且在实验期间在每个指定的时间点监测发育阶段。示出了每组中蚜虫的平均百分比±SD。
图2是示出毕赤酵母(P.pastoris)处理导致蚜虫死亡的图。第一龄和第二龄LSR-1蚜虫用水(对照)或毕赤酵母(P.pastoris)通过叶灌注处理并且在实验期间每天监测存活。N＝62-63只蚜虫/组。使用对数秩(Mantel Cox)检验来测定统计学显著差异。****，p＜0.0001。
图3是一组图，这些图示出通过叶喷洒的毕赤酵母(P.pastoris)处理不影响蚜虫发育。将第一龄和第二龄LSR-1蚜虫用水(对照)或毕赤酵母(P.pastoris)通过喷枪喷洒处理并且监测随时间的发育阶段。示出了在各发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄或第5龄)在各时间点上的死亡蚜虫或存活蚜虫的平均百分比±SD。N＝30只蚜虫/组的两个重复。
图4是示出毕赤酵母(P.pastoris)处理提高了蚜虫死亡率的图。将第一龄和第二龄LSR-1蚜虫置于喷洒水(对照)或毕赤酵母(P.pastoris)的叶片上并且监测随时间的存活。N＝60只蚜虫/处理组。
图5A和图5B是示出在蚕豆叶上喷洒毕赤酵母(P.pastoris)减少了以这些叶为食的蚜虫中的内共生布赫纳氏菌的图。用毕赤酵母(P.pastoris)处理后第6(A)天和第9(B)天测定共生体效价。示出了平均布赫纳氏菌/蚜虫拷贝±SD。指示的数据集的上方框中的数字表示该组的中位数。每个点代表单个蚜虫。
图6是示出显微注射BCR-4 PNA减少了BCR-4表达的图。向第四龄和第五龄豌豆长管蚜(A.pisum)蚜虫注射20nl水或321ng/ul的BCR-4 PNA，7天后从蚜虫中提取RNA，并且进行RT-qPCR以测量BCR-4的表达。示出了平均BCR-4/肌动蛋白拷贝±SD。每个数据点代表单个蚜虫。每个数据集上方的框中的数字代表该数据的中位数。
图7是示出用针对BCR-4的PNA处理后昆虫存活降低的图。向第四龄和第五龄豌豆长管蚜(A.pisum)蚜虫注射水或针对BCR-4的PNA。在实验期间每天监测存活。N＝20只蚜虫/处理组。
图8是示出向蚜虫注射针对BCR-4的PNA导致繁殖力降低的图。向第四龄和第五龄豌豆长管蚜(A.pisum)蚜虫注射水或针对BCR-4的PNA。通过计算每个时间点每组产生的后代的数量来测量繁殖力，并且表示为每天由F0(成虫)产生的F1(第一代后代)的数量。N＝20只蚜虫/处理组。
图9是一组图，这些图示出用BCR-4 PNA处理延迟了蚜虫发育。将第一龄和第二龄LSR-1蚜虫置于灌注水(阴性对照)或在水中的BCR-4PNA溶液的叶片上并且在实验期间在每个指定的时间点监测发育阶段。示出了每组中蚜虫的平均百分比±SD。
图10是示出BCR-4处理导致蚜虫死亡增加的图。第一龄和第二龄LSR-1蚜虫用水(对照)或BCR-4 PNA通过叶灌注处理并且在实验期间每天监测存活。N＝60只蚜虫/组。使用对数秩(Mantel Cox)检验来测定统计学显著差异。
图11是示出用通过叶灌注递送的BCR-4 PNA处理提高了布赫纳氏菌滴度的图。将第一龄和第二龄LSR-1蚜虫用水(对照)或BCR4 PNA通过叶灌注处理并且在处理后第5天和第6天收集死亡的蚜虫。提取DNA，并且进行qPCR以测定布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝的数量。示出了6-7只蚜虫/组的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝的平均数±SD。
图12是示出将蚜虫用针对BCR-4的PNA通过叶灌注处理导致BCR-4表达减少的图。将第一龄和第二龄LSR-1蚜虫用水(对照)或BCR-4 PNA通过叶灌注处理并且在第7天，从存活的蚜虫中提取RNA并且进行RT-qPCR以量化相对于肌动蛋白表达的BCR-4表达。框中的数字代表该数据集的中位数。
图13是示出用dsRNA-ApGLNT1处理敲低了ApGLNT1表达的图。向第五龄豌豆长管蚜(A.pisum)蚜虫注射水或在水中的dsRNA-ApGLNT1。在处理后第2天，提取总RNA并且进行RT-qPCR以测定ApGLNT1基因相对表达(肌动蛋白作为内参考基因)。示出了5-7只蚜虫/组的ApGLNT1/肌动蛋白的相对表达的平均比率±SD。通过学生T检验确定统计学显著差异(**，p＜0.01)。
图14是示出用dsRNA-ApGLNT1处理提高了蚜虫死亡率的图。向LSR-1豌豆长管蚜(A.pisum)蚜虫注射水或在水中的dsRNA-ApGLNT1并且在实验期间监测存活。N＝40只蚜虫/组。如使用对数秩(Mantel Cox)检验所测定的，鉴定两组之间的统计学显著差异。
图15是示出用dsRNA-ApGLNT1处理导致布赫纳氏菌滴度降低的图。向LSR-1豌豆长管蚜(A.pisum)蚜虫注射水或在水中的dsRNA-ApGLNT1，在注射后第5天从蚜虫中提取DNA，并且进行qPCR以量化布赫纳氏菌。示出了布赫纳氏菌/蚜虫DNA的平均拷贝±SD。每个点代表个体蚜虫。每个数据集上方的框中的数字代表该组的中位数。
图16A和16B是一组图，这些图示出了显微注射dsRNA-ApGLNT1的蚜虫的后代表现出发育延迟。图16A：向LSR-1豌豆长管蚜(A.pisum)蚜虫注射水或在水中的dsRNA-ApGLNT1并且在注射后在指定的时间点监测生命阶段。示出了贯穿整个实验在各个龄期死亡或存活的蚜虫的平均百分比±SD。N＝40只蚜虫/组。图16B：在收集后代后4天，获取每只蚜虫的图像以测定每只蚜虫的面积。示出了从注射水或dsRNA-ApGLNT1的蚜虫获得的后代的平均面积±SD。使用学生T检验确定统计学显著差异；每个数据点代表一只个体蚜虫。
图17是示出dsRNA表达盒的图示。将pCaMV 35S启动子置于dsRNA表达序列的上游。将靶蚜虫基因的区域的正义链和反义链与小间隔子串联放置，该间隔子将充当发夹环。一旦表达，由于序列的互补性，形成的RNA将呈现双链构型。
图18是用于在烟草(N.tabacum)中表达dsRNA的构建体的穿梭运载体的图示。质粒包括与大肠杆菌(E.coli)和根癌农杆菌(A.tumefaciens)可相容的复制起点、卡那霉素和庆大霉素抗性标记物、欧芹泛素启动子下的绿色荧光表达盒、以及最后由pCaMV 35S驱动的dsRNA表达盒。
图19是一组图像，这些图像示出在根癌农杆菌浸润的烟草植物中的GFP表达。顶部图是用根癌农杆菌浸润的烟草，该根癌农杆菌含有可以组成性地驱动烟草中GFP表达的质粒(左上方是明场，并且右上方是绿色通道)。底部图是没有被根癌农杆菌浸润的阴性对照叶。
具体实施方式
本文提供了用于通过改变宿主和寄宿于该宿主中的一种或多种微生物之间的相互作用来调节宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的适合度的方法和组合物。本发明的特征是一种组合物，该组合物包括调节剂(例如，多肽、核酸、小分子、或其组合)，该调节剂可以以调节(例如，提高或降低)宿主适合度的方式间接诱导该宿主的微生物区系的变化。例如，该调节剂可靶向宿主途径(例如，免疫系统或含菌细胞途径)或微生物途径，这些途径改变(例如，提高或降低)了微生物水平、微生物活性、微生物代谢、和/或微生物多样性，并且转而调节(例如，提高或降低)对农业、商业和/或公共健康重要的多种无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的适合度。
本文所述方法和组合物部分地基于实例，这些实例示出不同药剂(例如，小化合物(例如，前列腺素)、抑制性RNA(例如，dsRNA或PNAs)和微生物(真菌或细菌))如何可用于改变该宿主对寄宿于该宿主中的微生物的免疫系统应答。本文所述的方法和组合物还可用于改变微生物典型地寄宿的宿主器官或细胞的功能。例如，RNA可用于损害蚜虫的含菌细胞功能，从而破坏寄宿于蚜虫的含菌细胞中的内共生微生物群体。蚜虫中微生物(例如，布赫纳氏菌属物种(Buchnera spp.))的内共生群体的破坏转而降低了蚜虫的适合度。核酸，例如RNA(例如，dsRNA)或PNA、或小分子(例如，前列腺素)是可用于本发明的调节剂的代表，并且这种类型的其他调节剂可用于本发明。在此基础上，本披露描述了调节(例如，提高或降低)无脊椎动物宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的适合度的药剂的使用的多种不同方法，其中该调节剂改变宿主和寄宿于该宿主中的一种或多种微生物之间的相互作用。
I.宿主
i.昆虫宿主
在一些情况下，本文所述的宿主是属于节肢动物门的生物。在一些情况下，该昆虫被认为是有害生物，例如，农业有害生物。在一些情况下，该昆虫携带被认为是植物有害生物的细菌或病毒，该植物有害生物在植物中引起疾病(例如，农杆菌或番茄黄化曲叶病毒(TYLCV))。该宿主可处于任何发育阶段。例如，该宿主可以是胚、幼虫、蛹、或成虫。
在一些情况下，该昆虫可属于以下目：蜱螨目(Acari)、蜘蛛目(Araneae)、虱目(Anoplura)、鞘翅目(Coleoptera)、弹尾目(Collembola)、革翅目(Dermaptera)、网翅目(Dictyoptera)、双尾目(Diplura)、双翅目(Diptera)(例如，斑翅果蝇(spotted-wingDrosophila))、纺足目(Embioptera)、蜉蝣目(Ephemeroptera)、蛩蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)(例如，蚜虫、温室白粉虱、或蝽象)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鳞翅目、食毛目(Mallophaga)、长翅目(Mecoptera)、脉翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、竹节虫目(Phasmida)、襀翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、啮虫目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphunculata)、缨尾目(Thysanura)、捻翅目(Strepsiptera)、缨翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)、或缺翅目(Zoraptera)。
在一些情况下，该昆虫来自蛛形纲(Arachnida)，例如，粉螨属物种(Acarusspp.)、柑橘瘤瘿螨(Aceria sheldoni)、刺皮节蜱属物种(Aculops spp.)、刺瘿螨属物种(Aculus spp.)、花蜱属物种(Amblyomma spp.)、山楂叶螨(Amphitetranychusviennensis)、锐缘蜱属物种(Argas spp.)、牛蜱属物种(Boophilus spp.)、短须螨属物种(Brevipalpus spp.)、草苔藓(Bryobia graminum)、苜蓿苔螨(Bryobia praetiosa)、刺尾蝎属物种(Centruroides spp.)、足螨属物种(Chorioptes spp.)、鸡皮刺螨(Dermanyssusgallinae)、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)、粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)、始叶螨属物种(Eotetranychus spp.)、枣叶锈螨(Epitrimerus pyri)、真叶螨属物种(Eutetranychus spp.)、瘿螨属物种(Eriophyesspp.)、家食甜螨(Glycyphagus domesticus)、赤足地螨(Halotydeus destructor)、跗线螨属物种(Hemitarsonemus spp.)、璃眼蜱属物种(Hyalomma spp.)、硬蜱属物种(Ixodesspp.)、寇蛛属物种(Latrodectus spp.)、斜蛛属物种(Loxosceles spp.)、Metatetranychus属物种、秋收恙螨(Neutrombicula autumnalis)、奴合撒属物种(Nuphersa spp.)、小爪螨属物种(Oligonychus spp.)、钝缘蜱属物种(Ornithodorosspp.)、禽刺螨属物种(Ornithonyssus spp.)、全爪螨属物种(Panonychus spp.)、柑橘锈螨(Phyllocoptruta oleivora)、侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemus latus)、螨属物种(Psoroptes spp.)、扇头蜱属物种(Rhipicephalus spp.)、根螨属物种(Rhizoglyphusspp.)、疥螨属物种(Sarcoptes spp.)、中东金蝎(Scorpio maurus)、狭跗线螨属物种(Steneotarsonemus spp.)、稻细螨(Steneotarsonemus spinki)、跗线属物种(Tarsonemusspp.)、四爪螨属物种(Tetranychus spp.)、阿氏真恙螨(Trombicula alfreddugesi)、Vaejovis属物种、Vasates lycopersici。
在一些情况下，该昆虫来自唇足纲(Chilopoda)，例如，地蜈蚣属物种(Geophilusspp.)、蚰蜒属物种(Scutigera spp.)。
在一些情况下，该昆虫来自弹尾目(Collembola)，例如，乳草长蝽(Onychiurusarmatus)。
在一些情况下，该昆虫来自倍足纲(Diplopoda)，例如，千足虫(Blaniulusguttulatus)。
在一些情况下，该昆虫来自昆虫纲(Insecta)，例如，来自蜚蠊目(Blattodea)，例如，亚洲蟑螂(Blattella asahinai)、德国小蠊(Blatella germanica)、东方蜚蠊(Blattaorientalis)、马德拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、古巴蠊属物种(Panchlora spp.)、木蠊属物种(Parcoblatta spp.)、大蠊属物种(Periplaneta spp.)、棕带蟑螂(Supellalongipalpa)。
在一些情况下，该昆虫来自鞘翅目(Coleoptera)，例如，条纹南瓜甲虫(Acalymmavittatum)、大豆象(Acanthoscelides obtectus)、喙丽金龟属物种(Adoretus spp.)、桤木叶甲(Agelastica alni)、叩甲属物种(Agriotes spp.)、黑菌虫(Alphitobiusdiaperinus)、马铃薯鳃金龟(Amphimallon solstitialis)、家具窃蠹(Anobiumpunctatum)、星天牛属物种(Anoplophora spp.)、花象属物种(Anthonomusspp.)、圆皮蠹属物种(Anthrenus spp.)、长喙小象属物种(Apion spp.)、甘蔗金龟属物种(Apogonia spp.)、隐食甲属物种(Atomaria spp.)、毛皮蠹属物种(Attagenus spp.)、锥胸豆象(Bruchidius obtectus)、豆象属物种(Bruchus spp.)、龟金花虫属物种(Cassidaspp.)、豆叶甲(Cerotoma trifurcata)、龟象属物种(Ceutorrhynchus spp.)、凹胫跳甲属物种(Chaetocnema spp.)、Cleonus mendicus、宽胸叩头虫属物种(Conoderus spp.)、根颈象属物种(Cosmopolites spp.)、新西兰草金龟(Costelytra zealandica)、Ctenicera属物种、象鼻虫属物种(Curculio spp.)、锈赤扁谷盗(Cryptolestes ferrugineus)、杨干隐喙象(Cryptorhynchus lapathi)、细枝象属物种(Cylindrocopturus spp.)、大小蠹属物种(Dendroctonus spp.)(例如，中欧山松大小蠹(Dendroctonus ponderosae))、皮蠹属物种(Dermestes spp.)、条叶甲属物种(Diabrotica spp.)(例如，玉米根虫)、蛀野螟属物种(Dichocrocis spp.)、水稻铁甲(Dicladispa armigera)、Diloboderus属物种、植食瓢虫属物种(Epilachna spp.)、毛跳甲属物种(Epitrix spp.)、钻孔虫属物种(Faustinus spp.)、裸蛛甲(Gibbium psylloides)、阔角谷盗(Gnathocerus cornutus)、菜心螟(Hellulaundalis)、黑异爪蔗金龟(Heteronychus arator)、Heteronyx属物种、优雅海拉莫法种蝇(Hylamorpha elegans)、北美家天牛(Hylotrupes bajulus)、苜蓿叶象甲(Hyperapostica)、蓝绿象(Hypomeces squamosus)、咪小蠹属物种(Hypothenemus spp.)(咖啡果小蠹(Hypothenemus hampei))、甘蔗大褐齿爪鳃金龟(Lachnosterna consanguinea)、烟草甲(Lasioderma serricorne)、长头谷盗(Latheticus oryzae)、波缘薪甲属物种(Lathridiusspp.)、合爪负泥虫属物种(Lema spp.)、马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata)、银潜蛾属物种(Leucoptera spp.)、稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus)、筒喙象属物种(Lixus spp.)、Luperodes属物种、粉蠹属物种(Lyctus spp.)、Megascelis属物种、梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)、油菜花露尾甲(Meligethes aeneus)、鳃角金龟属物种(Melolontha spp.)、Migdolus属物种、墨天牛属物种(Monochamus spp.)、象甲(Naupactusxanthographus)、郭公虫属物种(Necrobia spp.)、黄蛛甲(Niptus hololeucus)、二疣犀甲(Oryctes rhinoceros)、锯谷盗(Oryzaephilus surinamensis)、Oryzaphagus oryzae、耳象属物种(Otiorrhynchus spp.)、小青花金龟(Oxycetonia jucunda)、辣根猿叶甲(Phaedon cochleariae)、鳃角金龟属物种(Phyllophaga spp.)、鳃金龟(Phyllophagahelleri)、条跳甲属物种(Phyllotreta spp.)、日本金龟子(Popillia japonica)、安第斯马铃薯象属(Premnotrypes)、大谷蠹(Prostephanus truncatus)、蚤跳甲属物种(Psylliodes spp.)、蛛甲属物种(Ptinus spp.)、暗色瓢虫(Rhizobius ventralis)、谷蠹(Rhizopertha dominica)、米象属(Sitophilus)、米象(Sitophilus oryzae)、尖隐喙象属物种(Sphenophorus spp.)、药材甲(Stegobium paniceum)、茎干象属物种(Sternechusspp.)、宽幅天牛属物种(Symphyletes spp.)、纤毛象属物种(Tanymecus spp.)、黄粉虫(Tenebrio molitor)、大谷盗(Tenebrioides mauretanicus)、拟谷盗属物种(Triboliumspp.)、斑皮蠹属物种(Trogoderma spp.)、籽象属物种(Tychius spp.)、脊虎天牛属物种(Xylotrechus spp.)、距步甲属物种(Zabrus spp.)；
来自双翅目(Diptera)，例如，伊蚊属物种(Aedes spp.)、潜蝇属物种(Agromyzaspp.)、实蝇属物种(Anastrepha spp.)、按蚊属物种(Anopheles spp.)、波瘿蚊属物种(Asphondylia spp.)、果实蝇属物种(Bactrocera spp.)、花园毛蚊(Bibio hortulanus)、绿头丽蝇(Calliphora erythrocephala)、红头丽蝇(Calliphora vicina)、地中海实蝇(Ceratitis capitata)、摇蚊属物种(Chironomus spp.)、金蝇属物种(Chrysomyia spp.)、斑虻属物种(Chrysops spp.)、高额麻虻(Chrysozona pluvialis)、锥蝇属物种(Cochliomyia spp.)、康瘿蚊属物种(Contarinia spp.)、噬人瘤蝇(Cordylobiaanthropophaga)、Cricotopus sylvestris、库蚊属物种(Culex spp.)、库蠓属物种(Culicoides spp.)、脉毛蚊属物种(Culiseta spp.)、黄蝇属物种(Cuterebra spp.)、油橄榄实蝇(Dacus oleae)、瘿蚊属物种(Dasyneura spp.)、地种蝇属物种(Delia spp.)、人皮蝇(Dermatobia hominis)、果蝇属物种(Drosophila spp.)、稻象甲属物种(Echinocnemusspp.)、厕蝇属物种(Fannia spp.)、胃蝇属物种(Gasterophilus spp.)、舌蝇属物种(Glossina spp.)、麻虻属物种(Haematopota spp.)、毛眼水蝇属物种(Hydrellia spp.)、大麦水蝇(Hydrellia griseola)、种蝇属物种(Hylemya spp.)、虱蝇属物种(Hippoboscaspp.)、牛皮蝇属物种(Hypoderma spp.)、斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)、绿蝇属物种(Lucilia spp.)、罗岭属物种(Lutzomyia spp.)、曼蚊属物种(Mansonia spp.)、蝇属物种(Musca spp.)(例如，家蝇(Musca domestica))、狂蝇属物种(Oestrus spp.)、瑞典杆蝇(Oscinella frit)、Paratanytarsus属物种、Paralauterborniella subcincta、泉蝇属物种(Pegomyia spp.)、白蛉属物种(Phlebotomus spp.)、草种蝇属物种(Phorbia spp.)、伏蝇属物种(Phormia spp.)、酪蝇(Piophila casei)、原螺纹属物种(Prodiplosis spp.)、胡萝卜茎蝇(Psila rosae)、绕实蝇属物种(Rhagoletis spp.)、麻蝇属物种(Sarcophagaspp.)、蚋属物种(Simulium spp.)、螫蝇属物种(Stomoxys spp.)、虻属物种(Tabanusspp.)、根斑蝇属物种(Tetanops spp.)、大蚊属物种(Tipula spp.)。
在一些情况下，该昆虫来自异翅亚目(Heteroptera)，例如，南瓜缘蝽(Anasatristis)、拟丽蝽属物种(Antestiopsis spp.)、Boisea属物种、土长蝽属物种(Blissusspp.)、俊盲蝽属物种(Calocoris spp.)、斑腿微刺盲蝽(Campylomma livida)、异背长蝽属物种(Cavelerius spp.)、臭虫属物种(Cimex spp.)、白辧麦寄蝇属物种(Collaria spp.)、Creontiades dilutus、胡椒缘蝽(Dasynus piperis)、Dichelops furcatus、厚氏长棒网蝽(Diconocoris hewetti)、棉红蝽属物种(Dysdercus spp.)、美洲蝽属物种(Euschistusspp.)、扁盾蝽属物种(Eurygaster spp.)、刺盲蝽属物种(Heliopeltis spp.)、棉红蝽(Horcias nobilellus)、稻缘蝽属物种(Leptocorisa spp.)、稻缘椿象(Leptocorisavaricornis)、北美叶足缘蝽(Leptoglossus phyllopus)、草盲蝽属物种(Lygus spp.)、蔗黑长蝽(Macropes excavatus)、盲蝽科(Miridae)、金光绿盲蝽(Monalonion atratum)、绿蝽属物种(Nezara spp.)、稻蝽属物种(Oebalus spp.)、蝽科(Pentomidae)、方背皮蝽(Piesma quadrata)、壁蝽属物种(Piezodorus spp.)、杂盲蝽属物种(Psallus spp.)、Pseudacysta persea、红猎蝽属物种(Rhodnius spp.)、可可褐盲蝽(Sahlbergellasingularis)、Scaptocoris castanea、黑蝽属物种(Scotinophora spp.)、梨冠网蝽(Stephanitis nashi)、Tibraca属物种、锥猎蝽属物种(Triatoma spp.)。
在一些情况下，该昆虫来自半翅目(Hemiptera)或同翅亚目(Homoptera)，例如，贝氏相思羞木虱(Acizzia acaciaebaileyanae)、多多萘虱(Acizzia dodonaeae)、木虱(Acizzia uncatoides)、长头蝗(Acrida turrita)、无网长管蚜属物种(Acyrthosiponspp.)、Acrogonia属物种、Aeneolamia属物种、垫刃线虫属物种(Agonoscena spp.)、欧洲甘蓝粉虱(Aleyrodes proletella)、甘蔗穴粉虱(Aleurolobus barodensis)、软毛粉虱(Aleurothrixus floccosus)、植莲木风(Allocaridara malayensis)、芒果叶蝉属(Amrasca spp.)、李薊圆尾蚜(Anuraphis cardui)、肾圆盾蚧属物种(Aonidiella spp.)、梨矮蚜(Aphanostigma pini)、蚜虫属(例如，棉蚜(Aphis gossypii))、葡萄叶蜂(Arboridia apicalis)、Arytainilla属物种、小圆盾蚧属物种(Aspidiella spp.)、圆盾蚧属物种(Aspidiotus spp.)、Atanus属物种、茄沟无网蚜(Aulacorthum solani)、烟粉虱(Bemisia tabaci)、Blastopsylla occidentalis、Boreioglycaspis melaleucae、杏圆尾蚜(Brachycaudus helichrysi)、微管蚜属物种(Brachycolus spp.)、甘蓝蚜(Brevicorynebrassicae)、喀木虱属物种(Cacopsylla spp.)、美加椴卡丽叶甲(Calligyponamarginata)、红头大叶蝉(Carneocephala fulgida)、甘蔗绵蚜(Ceratovacuna lanigera)、沫蝉科(Cercopidae)、蜡蚧属物种(Ceroplastes spp.)、Chaetosiphon fragaefolii、蔗黄雪盾蚧(Chionaspis tegalensis)、茶绿叶蝉(Chlorita onukii)、台湾大蝗(Chondracrisrosea)、核桃黑斑蚜(Chromaphis juglandicola)、褐圆蚧(Chrysomphalus ficus)、Cicadulina mbila、Coccomytilus halli、Coccus属物种、茶藨隐瘤蚜(Cryptomyzusribis)、Cryptoneossa 属物种、梳木虱属物种(Ctenarytaina spp.)、叶蝉属物种(Dalbulus spp.)、柑橘粉虱(Dialeurodes citri)、柑橘木虱(Diaphorina citri)、盾蚧属物种(Diaspis spp.)、履绵蚧属物种(Drosicha spp.)、西圆尾蚜属物种(Dysaphis spp.)、粉蚧属物种(Dysmicoccus spp.)、小绿叶蝉属物种(Empoasca spp.)、绵蚜属物种(Eriosoma spp.)、斑叶蝉属物种(Erythroneura spp.)、Eucalyptolyma属物种、褐木虱属物种(Euphyllura spp.)、Euscelis bilobatus、拂粉蚧属物种(Ferrisia spp.)、咖啡荒粉蚧(Geococcus coffeae)、Glycaspis 属物种、银合欢木虱(Heteropsylla cubana)、颊木虱(Heteropsylla spinulosa)、琉璃叶蝉(Homalodisca coagulata)、草翅叶蝉(Homalodiscavitripennis)、桃大尾蚜(Hyalopterus arundinis)、吹绵蚧属物种(Icerya spp.)、片角叶蝉属物种(Idiocerus spp.)、扁喙叶蝉属物种(Idioscopus spp.)、灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)、蜡蚧属物种(Lecanium spp.)、牡蛎蚧属物种(Lepidosaphes spp.)、萝卜蚜(Lipaphis erysimi)、长管蚜属物种(Macrosiphum spp.)、二点二叉叶蝉(Macrostelesfascifrons)、Mahanarva属物种、高粱蚜(Melanaphis sacchari)、Metcaifiella属物种、麦无网长管蚜(Metopolophium dirhodum)、黑缘平翅斑蚜(Monellia costalis)、Monelliopsis pecanis、瘤蚜属物种(Myzus spp.)、黑茶藨子长管蚜(Nasonoviaribisnigri)、黑尾叶蝉属物种(Nephotettix spp.)、Nettigoniclla spectra、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、Oncometopia属物种、延长旌介壳虫(Orthezia praelonga)、中华稻蝗(Oxya chinensis)、Pachypsylla属物种、杨梅粉蝨(Parabemisia myricae)、木虱属物种(Paratrioza spp.)、片盾蚧属物种(Parlatoria spp.)、天疱疮属物种(Pemphigusspp.)、玉米花翅飞虱(peregrinus maidis)、绵粉蚧属物种(Phenacoccus spp.)、杨平翅绵蚜(Phloeomyzus passerinii)、忽布疣额蚜(Phorodon humuli)、根瘤蚜属物种(Phylloxera spp.)、苏铁褐点并盾蚧(Pinnaspis aspidistrae)、臀纹粉蚧属物种(Planococcus spp.)、黄色普罗皮拉(Prosopidopsylla flava)、梨形原绵腊蚧(Protopulvinaria pyriformis)、桑白盾蚧(Pseudaulacaspis pentagona)、粉蚧属物种(Pseudococcus spp.)、Psyllopsis属物种、木虱属物种(Psylla spp.)、金小蜂属物种(Pteromalus spp.)、Pyrilla属物种、齿盾蚧属物种(Quadraspidiotus spp.)、Quesadagigas、平刺粉蚧属物种(Rastrococcus spp.)、缢管蚜属物种(Rhopalosiphum spp.)、黑盔蚧属物种(Saissetia spp.)、葡萄带叶蝉(Scaphoideus titanus)、麦二叉蚜(Schizaphisgraminum)、刺盾蚧(Selenaspidus articulatus)、长唇基飞虱属物种(Sogata spp.)、白背飞虱(Sogatella furcifera)、Sogatodes属物种、非替那角蝉(Stictocephala festina)、烟粉虱(Siphoninus phillyreae)、Tenalaphara malayensis、Tetragonocephela属物种、Tinocallis caryaefoliae、广胸沫蝉属物种(Tomaspis spp.)、Toxoptera属物种、温室粉虱(Trialeurodes vaporariorum)、个木虱属物种(Trioza spp.)、小叶蝉属物种(Typhlocyba spp.)、矢尖盾蚧属物种(Unaspis spp.)、葡萄根瘤蚜(Viteus vitifolii)、么叶蝉属物种(Zygina spp.)；来自膜翅目(Hymenoptera)，例如，顶切叶蚊属物种(Acromyrmex spp.)、叶蜂属物种(Athalia spp.)、南美切叶蚊属物种(Atta spp.)、松叶蜂属物种(Diprion spp.)、实叶蜂属物种(Hoplocampa spp.)、毛蚊属物种(Lasius spp.)、小黄家蚊(Monomorium pharaonis)、树蜂属物种(Sirex spp.)、红火蚊(Solenopsisinvicta)、蚊属物种(Tapinoma spp.)、大树蜂属物种(Urocerus spp.)、胡蜂属物种(Vespaspp.)、黑树蜂属物种(Xeris spp.)。在某些情况下，该昆虫是蚜虫(例如，玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)或桃蚜(Myzus persicae))。
在一些情况下，该昆虫来自等足目(Isopoda)，例如，鼠妇(Armadillidiumvulgare)、栉水虱潮虫(Oniscus asellus)、球鼠妇(Porcellio scaber)。
在一些情况下，该昆虫来自等翅目(Isoptera)，例如，乳白蚁属物种(Contariniaspp.)、Cornitermes cumulans、堆砂白蚁属物种(Cryptotermes spp.)、楹白蚁属物种(Incisitermes spp.)、稻麦小白蚁(Microtermes obesi)、土白蚁属物种(Odontotermesspp.)、散白蚁属物种(Reticulitermes spp)。
在一些情况下，该昆虫来自鳞翅目(Lepidoptera)，例如，小蜡螟(Achroiagrisella)、桑剑纹夜蛾(Acronicta major)、褐带卷蛾属物种(Adoxophyes spp.)、白纹伊蚊(Aedia leucomelas)、地夜蛾属物种(Agrotis spp.)、阿拉巴马属物种(Alabama spp.)、脐橙螟(Amyelois transitella)、条麦蛾属物种(Anarsia spp.)、干煞夜蛾属物种(Anticarsia spp.)、Argyroploce属物种、甘蓝夜蛾(Barathra brassicae)、禾弄蝶(Borbocinnara)、棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella)、松尺蠖(Bupaluspiniarius)、干夜蛾属物种(Busseola spp.)、Cacoecia属物种、茶细蛾(Caloptilia theivora)、烟卷蛾(Capuareticulana)、苹果蠹蛾(Carpocapsa pomonella)、桃小食心虫(Carposina niponensis)、冬尺蛾(Cheimatobia brumata)、禾草螟属物种(Chilo spp.)、卷蛾属物种(Choristoneuraspp.)、葡萄果蠹蛾(Clysia ambiguella)、Cnaphalocerus属物种、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、云卷蛾属物种(Cnephasia spp.)、蒂蛀虫属物种(Conopomorpha spp.)、球颈象属物种(Conotrachelus spp.)、Copitarsia属物种、小卷蛾属物种(Cydia spp.)、Dalaca noctuides、绢野螟属物种(Diaphania spp.)、蔗螟(Diatraea saccharalis)、钻夜蛾属物种(Earias spp.)、Ecdytolopha aurantium、Elasmopalpus lignosellus、甘薯杆螟(Eldana saccharina)、粉斑螟属物种(Ephestiaspp.)、叶小卷蛾属物种(Epinotia spp.)、苹果褐卷蛾(Epiphyas postvittana)、荚斑螟属物种(Etiella spp.)、Eulia属物种、女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella)、毒蛾属物种(Euproctis spp.)、切夜蛾属物种(Euxoa spp.)、脏切叶蛾属物种(Feltia spp.)、大蜡螟(Galleria mellonella)、细蛾属物种(Gracillaria spp.)、小食心虫属物种(Grapholithaspp.)、甘蔗螟属物种(Hedylepta spp.)、铃夜蛾属物种(Helicoverpa spp.)、实夜蛾属物种(Heliothis spp.)、褐家蛾(Hofmannophila pseudospretella)、同斑螟属物种(Homoeosoma spp.)、长卷蛾属物种(Homona spp.)、苹果巢蛾(Hyponomeuta padella)、柿举肢蛾(Kakivoria flavofasciata)、夜蛾属物种(Laphygma spp.)、梨小食心虫(Laspeyresia molesta)、茄黄斑螟(Leucinodes orbonalis)、银潜蛾属物种(Leucopteraspp.)、紫藤潜叶细蛾属物种(Lithocolletis spp.)、绿果冬夜蛾(Lithophaneantennata)、花翅小蛾属物种(Lobesia spp.)、豆白隆切根虫(Loxagrotis albicosta)、毒蛾属物种(Lymantria spp.)、潜蛾属物种(Lyonetia spp.)、天幕毛虫(Malacosomaneustria)、豆荚野螟(Maruca testulalis)、甘蓝夜蛾(Mamstra brassicae)、稻暮眼蝶(Melanitis leda)、毛胫夜蛾属物种(Mocis spp.)、Monopis obviella、粘虫(Mythimnaseparata)、橡长角蛾(Nemapogon cloacellus)、水螟属物种(Nymphula spp.)、Oiketicus属物种、Oria属物种、瘤丛螟属物种(Orthaga spp.)、秆野螟属物种(Ostrinia spp.)、负泥虫(Oulema oryzae)、小眼夜蛾(Panolis flammea)、稻弄蝶属物种(Parnara spp.)、红铃虫属物种(Pectinophora spp.)、潜叶蛾属物种(Perileucoptera spp.)、茄麦蛾属物种(Phthorimaea spp.)、柑橘潜叶蛾(Phyllocnistis citrella)、小潜细蛾属物种(Phyllonorycter spp.)、粉蝶属物种(Pieris spp.)、荷兰石竹小卷蛾(Platynotastultana)、印度谷螟(Plodia interpunctella)、金翅夜蛾属物种(Plusia spp.)、小菜蛾(Plutella xylostella)、小白巢蛾属物种(Prays spp.)、斜纹夜蛾属物种(Prodeniaspp.)、烟草天蛾属物种(Protoparce spp.)、拟粘液蛾属物种(Pseudaletia spp.)、一星黏虫(Pseudaletia unipuncta)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)、玉米螟(Pyraustanubilalis)、Rachiplusia nu、禾螟属物种(Schoenobius spp.)、白禾螟属物种(Scirpophaga spp.)、稻白螟(Scirpophaga innotata)、Scotia segetum、蛀茎夜蛾属物种(Sesamia spp.)、大螟(Sesamia inferens)、长须卷蛾属物种(Sparganothis spp.)、夜蛾属物种(Spodoptera spp.)、Spodoptera praefica、展足蛾属物种(Stathmopoda spp.)、花生麦蛾(Stomopteryx subsecivella)、透翅蛾属物种(Synanthedon spp.)、安第斯马铃薯块茎蛾(Tecia solanivora)、Thermesia gemmatalis、木塞谷蛾(Tinea cloacella)、袋谷蛾(Tinea pellionella)、幕谷蛾(Tineola bisselliella)、卷叶蛾属物种(Tortrixspp.)、毛毡衣蛾(Trichophaga tapetzella)、粉夜蛾属物种(Trichoplusia spp.)、三化螟(Tryporyza incertulas)、番茄斑潜蝇(Tuta absoluta)、灰蝶属物种(Virachola spp.)。
在一些情况下，该昆虫来自以下目：直翅目(Orthoptera)或跳跃目(Saltatoria)，例如，家蟋蟀(Acheta domesticus)、Dichroplus属物种、蝼蛄属物种(Gryllotalpa spp.)、蔗蝗属物种(Hieroglyphus spp.)、飞蝗属物种(Locusta spp.)、黑蝗属物种(Melanoplusspp.)、Schistocerca gregaria。
在一些情况下，该昆虫来自虱目(Phthiraptera)，例如，毛虱属物种(Damaliniaspp.)、血虱属物种(Haematopinus spp.)、毛虱属物种(Linognathus spp.)、虱属物种(Pediculus spp.)、阴虱(Ptirus pubis)、毛虱属物种(Trichodectes spp.)。
在一些情况下，该昆虫来自啮虫目(Psocoptera)，例如，Lepinatus属物种、书虱属物种(Liposcelis spp)。
在一些情况下，该昆虫来自蚤目(Siphonaptera)，例如，角叶蚤属物种(Ceratophyllus spp.)、栉首蚤属物种(Ctenocephalides spp.)、致痒蚤(Pulexirritans)、穿皮潜蚤(Tunga penetrans)、Xenopsylla cheopsis。
在一些情况下，该昆虫来自缨翅目(Thysanoptera)，例如，玉米黄呆蓟马(Anaphothrips obscurus)、稻蓟马(Baliothrips biformis)、鲜食葡萄镰蓟马(Drepanothrips reuteri)、Enneothrips flavens、花蓟马属物种(Frankliniella spp.)、阳蓟马属物种(Heliothrips spp.)、温室条蓟马(Hercinothrips femoralis)、腹钩蓟马(Rhipiphorothrips cruentatus)、硬蓟马属物种(Scirtothrips spp.)、Taeniothripscardamomi、蓟马属物种(Thrips spp)。
在一些情况下，该昆虫来自衣鱼目(Zygentoma)(＝缨尾目(Thysanura))，例如，毛衣鱼属物种(Ctenolepisma spp.)、家衣鱼(Lepisma saccharina)、盗火虫(Lepismodesinquilinus)、小灶衣鱼(Thermobia domestica)。
在一些情况下，该昆虫来自综合纲(Symphyla)，例如，小幺蚰属物种(Scutigerella spp)。
在一些情况下，该昆虫是螨，包括但不限于跗线螨，如Phytonemus pallidus、侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemus latus)、Tarsonemus bilobatus等；真足螨，如白菜螨(Penthaleus erythrocephalus)、叶爪螨(Penthaleus major)等；叶螨，如真梶小爪螨(Oligonychus shinkaji)、桔全爪螨(Panonychus citri)、桑全爪螨(Panonychus mori)、苹果全爪螨(Panonychus ulmi)、神泽氏叶螨(Tetranychus kanzawai)、二斑叶螨(Tetranychus urticae)等；瘿螨，如茶尖叶节蜱(Acaphylla theavagrans)、曲瘿螨(Aceria tulipae)、番茄刺皮瘿螨(Aculops lycopersici)、皮氏刺皮瘿螨(Aculopspelekassi)、苹果刺锈螨(Aculus schlechtendali)、Eriophyes chibaensis、柑橘锈螨(Phyllocoptruta oleivora)等；粉螨，如罗宾根螨(Rhizoglyphus robini)、腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)、三叶螨(Tyrophagus similis)等；蜂窝螨，如大蜂螨(Varroa jacobsoni)、狄斯瓦螨(Varroa destructor)等；蜱亚目，如微小牛蜱(Boophilusmicroplus)、血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)、长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)、褐黄血蜱(Haemophysalis flava)、铃头血蜱(Haemophysaliscampanulata)、卵形硬蜱(Ixodes ovatus)、全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)、花蜱属物种(Amblyomma spp.)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)等；肉食螨科(Cheyletidae)，如Cheyletiella yasguri、布氏姬螯螨(Cheyletiella blakei)等；蠕形螨科(Demodicidae)，如犬蠕形螨(Demodex canis)、猫蠕形螨(Demodex cati)等；痒螨科(Psoroptidae)，如羊痒螨(Psoroptes ovis)等；Scarcoptidae，如人疥螨(Sarcoptes scabiei)、猫耳螨(Notoedres cati)、膝螨属物种(Knemidocoptes spp.)等。
本文提供的方法和组合物可以与任何以下昆虫宿主一起使用，该昆虫宿主被认为是针对能够导致动物疾病的病原体的媒介。例如，该昆虫宿主可以包括但不限于：具有刺吸式口器的那些昆虫，如在半翅目(Hemiptera)和一些膜翅目(Hymenoptera)以及双翅目(Diptera)中发现的昆虫，如蚊子、蜜蜂、黄蜂、蠓、虱子、采采蝇、跳蚤以及蚊，连同蛛形纲动物(如蜱和螨)的成员；以下的目、纲或科：蜱螨目(蜱和螨)，例如隐喙蜱科(Argasidae)、皮刺螨科(Dermanyssidae)、硬蜱科(Ixodidae)、痒螨科(Psoroptidae)或疥螨科(Sarcoptidae)的代表，以及花蜱属物种(Amblyomma spp.)、Anocenton属物种(Anocentonspp.)、锐缘蜱属物种(Argas spp.)、牛蜱属物种(Boophilus spp.)、姬螯螨属物种(Cheyletiella spp.)、足螨属物种(Chorioptes spp.)、蠕形螨属物种(Demodex spp.)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)、Denmanyssus属物种(Denmanyssus spp.)、血蜱属物种(Haemophysalis spp.)、璃眼蜱属物种(Hyalomma spp.)、硬蜱属物种(Ixodes spp.)、Lynxacarus属物种(Lynxacarus spp.)、中气门目属物种(Mesostigmata spp.)、耳螨属物种(Notoednes spp.)、钝缘蜱属物种(Ornithodoros spp.)、禽刺螨属物种(Ornithonyssusspp.)、残喙蜱属物种(Otobius spp.)、耳痒螨属物种(otodectes spp.)、肺刺螨属物种(Pneumonyssus spp.)、螨属物种(Psoroptes spp.)、扇头蜱属物种(Rhipicephalusspp.)、疥螨科疥螨属物种(Sancoptes spp.)、或恙螨属物种(Trombicula spp.)的代表；虱目(Anoplura)(吸虱(sucking lice)和咬虱(biting lice))，例如牛虱属物种(Bovicolaspp.)、血虱属物种(Haematopinus spp.)、毛虱属物种(Linognathus spp.)、禽羽虱属物种(Menopon spp.)、虱属物种(Pediculus spp.)、天疱疮属物种(Pemphigus spp.)、根瘤蚜属物种(Phylloxera spp.)、或管虱属物种(Solenopotes spp.)的代表；双翅目(Diptera)(蝇)，例如，以下物种的代表：伊蚊属物种(Aedes spp.)、按蚊属物种(Anopheles spp.)、丽蝇属物种(Calliphora spp.)、金蝇属物种(Chrysomyia spp.)、斑虻属物种(Chrysopsspp.)、锥蝇属物种(Cochliomyia spp.)、Cw/ex属物种、库蠓属物种(Culicoides spp.)、黄蝇属物种(Cuterebra spp.)、皮蝇属物种(Dermatobia spp.)、胃蝇属物种(Gastrophilusspp.)、舌蝇属物种(Glossina spp.)、血蝇属物种(Haematobia spp.)、麻虻属物种(Haematopota spp.)、虱蝇属物种(Hippobosca spp.)、牛皮蝇属物种(Hypoderma spp.)、绿蝇属物种(Lucilia spp.)、角蝇属物种(Lyperosia spp.)、蜱蝇属物种(Melophagusspp.)、狂蝇属物种(Oestrus spp.)、绿蝇属物种(Phaenicia spp.)、白蛉属物种(Phlebotomus spp.)、伏蝇属物种(Phormia spp.)、麻蝇属物种(Sarcophaga spp.)、蚋属物种(Simulium spp.)、螫蝇属物种(Stomoxys spp.)、虻属物种(Tabanus spp.)、螗蜩属物种(Tannia spp.)、或Zzpu/alpha属物种；食毛目(Mallophaga)(咬虱(biting lice)，例如，Damalina属物种(Damalina spp.)、猫羽虱属物种(Felicola spp.)、袋鼠虱属物种(Heterodoxus spp.)、或毛虱属物种(Trichodectes spp.)的代表；或者蚤目(Siphonaptera)(无翅昆虫)，例如，角叶蚤属物种(Ceratophyllus spp.)、客蚤属物种(Xenopsylla spp)的代表；臭虫科(Cimicidae)(椿象)，例如，以下物种的代表：臭虫属物种(Cimex spp.)、Tritominae属物种、Rhodinius属物种、或锥蝽属物种(Triatoma spp)。在一些情况下，该昆虫是来自双翅目的吸血昆虫(blood-sucking insect)(例如，长角亚目(Nematocera)，例如，Colicidae科)。在一些情况下，该昆虫来自蚊亚科(Culicinae)、短咀蚊亚科(Corethrinae)、蠓科(Ceratopogonidae)、或蚋科(Simuliidae)。在一些情况下，该昆虫属于库蚊属物种(Culex spp.)、赛保蚊属物种(Theobaldia spp.)、伊蚊属物种(Aedesspp.)、按蚊属物种(Anopheles spp.)、伊蚊属物种(Aedes spp.)、Forciponiyia属物种(Forciponiyia spp.)、库蠓属物种(Culicoides spp.)、或Helea属物种(Helea spp.)。
ii.软体动物宿主
在一些情况下，本文所述的宿主可以是属于软体动物门的生物。在一些情况下，该软体动物被认为是有害生物，例如，农业有害生物。例如，这些方法和组合物适用于在农业和园艺中控制陆生腹足纲动物(例如，蛞蝓和蜗牛)。它们包括主要作为杂食性有害生物出现在农业和园艺作物上的所有陆生蛞蝓和蜗牛。
在一些情况下，该软体动物属于以下科：玛瑙螺科(Achatinidae)、野蛞蝓科(Agriolimacidae)、瓶螺科(Ampullariidae)、阿勇蛞蝓科(Arionidae)、巴蜗牛科(Bradybaenidae)、大蜗牛科(Helicidae)、Hydromiidae、椎实螺科(Lymnaeidae)、小蛞蝓科(Milacidae)、尾环蜗牛科(Urocyclidae)、或蛞蝓科(Veronicellidae)。
例如，在一些情况下，该软体动物是玛瑙螺属物种(Achatina spp.)、野蛞蝓属物种(Agriolimax spp.)、Arion属物种(例如，A.ater、A.circumscriptus、A.distinctus、A.fasciatus、A.hortensis、A.intermedius、红色蛞蝓(A.rufus)、A.subfuscus、A.silvaticus、A.lusitanicus)、双脐螺属物种(Biomphalaria spp)、缓行螺属物种(Bradybaena spp.)(例如，B.fruticum)、小泡螺属物种(Bulinus spp.)、蜗牛属物种(Cantareus spp.)(例如，C.asperses)、葱蜗牛属物种(Cepaea spp.)(例如，花园葱蜗牛(C.hortensis)、C.nemoralis)、白蜗牛属(Cernuella spp.)、螺蜗牛属(Cochlicellaspp.)、Cochlodina属物种(例如，C.laminata)、野蛞蝓属物种(Deroceras spp.)(例如，D.agrestis、D.empiricorum、D.laeve、D.panornimatum、D.reticulatum)；圆盘螺属物种(Discus spp.)(例如，D.rotundatus)；Euomphalia属物种、土蜗属(Galba spp.)(例如，G.trunculata)；厚壳大蜗牛属物种(Helicella spp.)(例如，H.itala、H.obvia)；Helicigona属物种(例如，H.arbustorum)；Helicodiscus属物种、大蜗牛属物种(Helixspp.)(例如，H.aperta、H.aspersa、H.pomatia)；蛞蝓属物种(Limax spp.)(例如，利迈科斯蛞蝓(L.cinereoniger)、黄蛞蝓(L.flavus))；椎实螺属物种(Lymnaea spp.)(例如，静水椎实螺(L.stagnalis))；菝葜属物种(Milax spp.)(例如，M.gagates、M.marginatus、M.sowerbyi、M.budapestensis)；钉螺属物种(Oncomelania spp.)、钻螺属物种(Opeasspp.)、Oxyloma属物种(例如，O.pfeifferi)；瓶螺属物种(Pomacea spp.)(例如，P.canaliculata)；琥珀螺属物种(Succinea spp.)、Tandonia属物种(例如，T.budapestensis、T.sowerbyi)；Theba属物种、瓦娄蜗牛属物种(Vallonia spp.)和类带螺属物种(Zonitoides spp.)(例如，光洁琥珀蜗牛(Z.nitidus))。
iii.线虫宿主
如本文所述的组合物或方法中的任一种的宿主还可以是属于线虫门的任何生物。在一些情况下，该线虫被认为是有害生物，例如，农业有害生物。例如，线虫可以是寄生的或引起植物或真菌的健康问题的线虫(例如，以下目的物种：滑刃目(Aphelenchida)、根结线虫属(Meloidogyne)、垫刃目(Tylenchida)等)或引起人类和动物的健康问题的线虫(例如，以下目的物种：Trichinellida、垫刃目(Tylenchida)、杆形亚目(Rhabditina)、和旋尾目(Spirurida))。
植物线虫涵盖植物寄生线虫和生活在土壤中的线虫。植物寄生线虫包括但不限于，体外寄生物如剑线虫属物种(Xiphinema spp.)、长针线虫属物种(Longidorus spp.)、和毛刺线虫属物种(Trichodorus spp.)；半寄生物，如垫刃线虫属物种(Tylenchulusspp.)；移栖体内寄生物，如短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)、穿孔线虫属物种(Radopholus spp.)、和盾线虫属物种(Scutellonema spp.)；定栖寄生物，如，异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、球异皮线虫属物种(Globodera spp.)、和根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)，以及茎叶体内寄生物，如，茎线虫属物种(Ditylenchus spp.)、滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)、和潜根线虫属物种(Hirschmaniella spp.)。特别有害的根寄生土壤线虫是如，异皮线虫属(Heterodera)或球异皮线虫属(Globodera)的囊肿形成线虫、和/或根结线虫属(Meloidogyne)的根结线虫。这些属的有害物种是例如，南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、大豆孢囊线虫(Heterodera glycines，soybean cystnematode)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)和马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)，用本文所述的调节剂有效地控制这些物种。然而，本文所述的调节剂的使用决不限于这些属或物种，而且也以相同的方式延伸至其他线虫。
植物线虫包括但不限于例如，通常地，居农野外垫刃线虫(Aglenchus agricola)、小麦粒线虫(Anguina tritici)、花生滑刃线虫(Aphelenchoides arachidis)、草莓滑刃线虫(Aphelenchoidesfragaria)和茎叶体内寄生物滑刃线虫属物种(Aphelenchoidesspp.)；通常地，细小刺线虫(Belonolaimus gracilis)、长尾刺线虫(Belonolaimuslongicaudatus)、诺托尼刺线虫(Belonolaimus nortoni)、椰子伞滑刃线虫(Bursaphelenchus cocophilus)、尔麻斯伞滑刃线虫(Bursaphelenchus eremus)、病原物松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)、和伞滑刃线虫属物种(Bursaphelenchus spp.)；通常地，瘟疫坏死线虫(Cacopauruspestis)、Criconemella curvata、Criconemella onoensis、装饰小环线虫(Criconemellaornata)、Criconemella rusium、Criconemella xenoplax(＝异盘中环线虫(Mesocriconema xenoplax))和小环线虫属物种(Criconemella spp.)；通常地，Criconemoides femiae、Criconemoides onoense；通常地，Criconemoides ornatum和轮线虫属物种(Criconemoides spp.)；通常地，Ditylenchus destructor、鳞球茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、食菌茎线虫(Ditylenchus myceliophagus)和茎叶体内寄生物茎线虫属物种(Ditylenchus spp.)、异头锥线虫(Dolichodorus heterocephalus)；通常地，马铃薯白线虫(Globodera pallida)(＝马铃薯白线虫(Heterodera pallida))、马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)(甘薯孢囊线虫)、Globodera solanacearum、烟草胞囊线虫(Globodera tabacum)、Globodera virginia和定栖胞囊寄生物球异皮线虫属物种(Globodera spp.)；通常地，双角螺旋线虫(Helicotylenchus digonicus)、双宫螺旋线虫(Helicotylenchus dihystera)、Helicotylenchus erythrine、香蕉螺旋线虫(Helicotylenchus multicinctus)、Helicotylenchus nannus、假强壮螺旋线虫(Helicotylenchus pseudorobustus)和螺旋属物种(Helicotylenchus spp.)；通常地，半轮线虫属(Hemicriconemoides)、蚤缀鞘线虫(Hemicycliophora arenaria)、裸出鞘线虫(Hemicycliophora nudata)、微细鞘线虫(Hemicycliophora parvana)、禾谷胞囊线虫(Heterodera avenae)、十字花科异皮线虫(Heterodera cruciferae)、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)、水稻孢囊线虫(Heterodera oryzae)、甜菜胞囊线虫(Heteroderaschachtii)、玉米孢囊线虫(Heterodera zeae)和定栖胞囊寄生物异皮线虫属物种(Heterodera spp.)；通常地，细潜根线虫(Hirschmaniella gracilis)、水稻潜根线虫(Hirschmaniella oryzae)、刺尾潜根线虫(Hirschmaniella spinicaudata)和茎叶体内寄生物潜根线虫属物种(Hirschmaniella spp.)；通常地，埃及纽带线虫(Hoplolaimusaegyptii)、加州纽带线虫(Hoplolaimus califomicus)、哥伦布纽带线虫(Hoplolaimuscolumbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、印度纽带线虫(Hoplolaimusindicus)、大针纽带线虫(Hoplolaimus magnistylus)、拟强壮纽带线虫(Hoplolaimuspararobustus)、非洲长针线虫(Longidorus africanus)、Longidorus breviannulatus、延伸长针线虫(Longidorus elongatus)、拉维科塔图斯长针线虫(Longidoruslaevicapitatus)、威尼亚克拉长针线虫(Longidorus vineacola)和体外寄生物长针线虫属物种(Longidorus spp.)；通常地，高粱根结线虫(Meloidogyne acronea)、非洲根结线虫(Meloidogyne africana)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、Meloidogynearenaria thamesi、阿特拉根结线虫(Meloidogyne artiella)、哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)、咖啡根结线虫(Meloidogyne coffeicola)、埃塞俄比亚根结线虫(Meloidogyne ethiopica)、短小根结线虫(Meloidogyne exigua)、假根结线虫(Meloidogyne fallax)、禾草根结线虫(Meloidogyne graminicola)、禾本科根结线虫(Meloidogyne graminis)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、Meloidogyne incognita acrita、爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)、基库斯根结线虫(Meloidogyne kikuyensis)、较小根结线虫(Meloidogyneminor)、纳西根结线虫(Meloidogyne naasi)、帕罗宁根结线虫(Meloidogyneparanaensis)、泰姆斯根结线虫(Meloidogyne thamesi)和定栖寄生物根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)；通常地，Meloinema属物种、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、Neotylenchus vigissi、假墙草异滑刃线虫(Paraphelenchus pseudoparietinus)、Paratrichodorus allius、Paratrichodorus lobatus、Paratrichodorus minor、次拟毛刺线虫(Paratrichodorus nanus)、胼胝拟毛刺线虫(Paratrichodorus porosus)、Paratrichodorus teres和拟毛刺属物种(Paratrichodorus spp.)、钩针线虫(Paratylenchus hamatus)、微小针线虫(Paratylenchus minutus)、突出针线虫(Paratylenchusprojectus)和针线虫属物种(Paratylenchus spp.)；通常地，敏捷短体线虫(Pratylenchus agilis)、艾氏针线虫(Pratylenchus alleni)、安第斯短体线虫(Pratylenchus andinus)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、谷类短体线虫(Pratylenchus cerealis)、咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、刻痕短体线虫(Pratylenchus crenatus)、德式短体线虫(Pratylenchus delattrei)、圆尾短体线虫(Pratylenchus giibbicaudatus)、古式短体线虫(Pratylenchus goodeyi)、钩状短体线虫(Pratylenchus hamatus)、六纹短体线虫(Pratylenchus hexincisus)、卢斯短体线虫(Pratylenchus loosi)、落选短体线虫(Pratylenchus neglectus)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、草地短体线虫(Pratylenchus pratensis)、斯氏短体线虫(Pratylenchus scribneri)、精美短体线虫(Pratylenchus teres)、索氏短体线虫(Pratylenchus thornei)、伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)、玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)和移栖体内寄生物短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)；通常地，Pseudohalenchus minutus、Psilenchus magnidens、Psilenchus tumidus、Punctoderachalcoensis、Quinisulcius acutus、柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、移栖体内寄生物穿孔线虫属物种(Radopholus spp.)；通常地，Rotylenchulus borealis、小圆腹轮虫(Rotylenchulus parvus)、肾形线虫(Rotylenchulus reniformis)和肾状线虫属物种(Rotylenchulus spp.)；通常地，直沟盘旋线虫(Rotylenchus laurentinus)、Rotylenchus macrodoratus、盘旋线虫(Rotylenchusrobustus)、Rotylenchus uniformis和盘旋属(Rotylenchus)；通常地，小尾盾线虫(Scutellonema brachyurum)、缓慢盾线虫(Scutellonema bradys)、克氏盾线虫(Scutellonema clathricaudatum)和移栖体内寄生物盾线虫属物种(Scutellonemaspp.)；通常地，Subanguina radiciola、Tetylenchus nicotianae、Trichodoruscylindricus、Trichodorus minor、Trichodorus primitivus、Trichodorus proximus、Trichodorus similis、Trichodorus sparsus和体外寄生物Trichodorus属物种；通常地，农田矮化线虫(Tylenchorhynchus agri)、矮化线虫(Tylenchorhynchus brassicae)、清亮矮化线虫(Tylenchorhynchus clarus)、Tylenchorhynchus claytoni、Tylenchorhynchusdigitatus、Tylenchorhynchus ebriensis、最大矮化线虫(Tylenchorhynchus maximus)、裸矮化线虫(Tylenchorhynchus nudus)、Tylenchorhynchus vulgaris和矮化线虫属物种(Tylenchorhynchus spp.)；通常地，半穿刺垫刃线虫(Tylenchulus semipenetrans)和半寄生物垫刃线虫属物种(Tylenchulus spp.)、美洲剑线虫(Xiphinema americanum)、短颈剑线虫(Xiphinema brevicolle)、Xiphinema dimorphicaudatum、剑线虫(Xiphinemaindex)和体外寄生物Xiphinema属物种。
线虫宿主的其他实例包括属于以下科的物种：环线虫科(Criconematidae)、刺线虫科(Belonolaimidae)、纽带科(Hoploaimidae)、异皮线虫科(Heteroderidae)、长针线虫科(Longidoridae)、短体科(Pratylenchidae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、或粒线虫科(Anguinidae)。
iv.有益的宿主
在一些情况下，本文所述的宿主是有益的昆虫、软体动物、或线虫(例如，授粉者、有害生物的天然竞争者、或对人类有用的物质的生产者)。如本文所用，该术语“有益的昆虫”、“有益的软体动物”或“有益的线虫”是指赋予人类、动物、生态系统、和/或环境益处(例如，经济的和/或生态的益处)的昆虫、软体动物、或线虫。例如，该宿主可以是参与商业产品的生产的无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)，包括但不限于培育来生产食物(例如，来自蜜蜂(例如，西方蜜蜂(Apis mellifera))的蜂蜜)、材料(例如，来自家蚕(Bombyxmori)的蚕丝)、和/或物质(例如，来自紫胶虫(Laccifer lacca)的紫胶或来自胭脂虫和瘿蜂科(Cynipidae)的颜料)的无脊椎动物。另外地，该宿主可以包括在农业应用中使用的无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)，包括有助于作物的授粉、传播种子或有害生物控制的无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)。此外，在一些情况下，该宿主可以是对废物处理和/或有机再循环有用的无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)(例如，蚯蚓、白蚁、或双翅目幼虫)。
在一些情况下，该宿主产生可用的产物(例如，蜂蜜、蚕丝、蜂蜡、或虫胶)。在一些情况下，该宿主是蜂。示例性的蜂属包括但不限于蜜蜂属(Apis)、熊蜂属(Bombus)、无刺蜂属(Trigona)、和壁蜂属(Osmia)。在一些情况下，该蜂是蜜蜂(例如属于蜜蜂属的昆虫)。在一些情况下，该蜂是以下物种：西方蜜蜂(Apis mellifera)(欧洲蜜蜂或西方蜜蜂)、中华蜜蜂(Apis cerana)(亚洲、东方或喜马拉雅蜜蜂)、排蜂(Apis dorsata)(“巨型”蜜蜂)、云南小蜜蜂(Apis florea)(“红矮”蜜蜂)、黑小蜜蜂(Apis andreniformis )(“黑矮”蜜蜂)、或苏拉威西蜂(Apis nigrocincta)。在一些情况下，该宿主是蚕。该蚕可以是蚕蛾科(Bombycidae)或天蚕蛾科(Saturniidae)中的物种。在一些情况下，该蚕是家蚕(Bombyxmori)。在一些情况下，该宿主是紫胶虫。紫胶虫是胶介壳虫科(Kerriidae)的物种。在一些情况下，紫胶虫是紫胶蚧(Kerria lacca)。
在一些情况下，该宿主有助于植物授粉(例如，蜂、甲虫、黄蜂、蝇、蝴蝶或蛾)。在一些实例中，有助于植物授粉的宿主是甲虫。在一些情况下，该甲虫是以下科中的物种：吉丁虫科(Buprestidae)、花萤科(Cantharidae)、天牛科(Cerambycidae)、叶甲科(Chrysomelidae)、郭公虫科(Cleridae)、瓢虫科(Coccinellidae)、叩甲科(Elateridae)、长朽木甲科(Melandryidae)、芫菁科(Meloidae)、拟花萤科(Melyridae)、花蚤科(Mordellidae)、露尾甲科(Nitidulidae)、拟天牛科(Oedemeridae)、金龟子科(Scarabaeidae)、或隐翅虫科(Staphyllinidae)。在一些情况下，有助于植物授粉的宿主是蝴蝶或蛾(例如，鳞翅目)。在一些情况下，蝴蝶或蛾是以下科中的物种：尺蛾科(Geometridae)、蝶科(Hesperiidae)、灰蝶科(Lycaenidae)、夜蛾科(Noctuidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、或天蛾科(Sphingidae)。在一些情况下，有助于植物授粉的宿主是蝇(例如，果蝇科(Drosophilidae))。在一些情况下，该蝇属于以下科：花蝇科(Anthomyiidae)、毛蚊科(Bibionidae)、蜂虻科(Bombyliidae)、丽蝇科(Calliphoridae)、瘿蚊科(Cecidomiidae)、Certopogonidae、Chrionomidae、眼蝇科(Conopidae)、蚊科(Culicidae)、长足虻科(Dolichopodidae)、舞虻科(Empididae)、水蝇科(Ephydridae)、尖翅蝇科(Lonchopteridae)、蝇科(Muscidae)、菌蚊科(Mycetophilidae)、蚤蝇科(Phoridae)、蚋科(Simuliidae)、水虻科(Stratiomyidae)、或食蚜蝇科(Syrphidae)。在一些情况下，有助于授粉的宿主是蚂蚁(例如，蚊科(Formicidae))、叶蜂(例如，叶蜂科(Tenthredinidae))、或黄蜂(wasp)(例如，泥蜂科(Sphecidae)或胡蜂科(Vespidae))。在一些情况下，有助于植物授粉的宿主是蜂。在一些情况下，该蜂属于以下科：地花蜂科(Andrenidae)、蜜蜂科(Apidae)、分舌花蜂科(Colletidae)、隧蜂科(Halictidae)、或切叶蜂科(Megachilidae)。
在一些情况下，该宿主有助于有害生物控制。在一些情况下，有助于有害生物控制的宿主是捕食性线虫。在特定的实例中，线虫是异小杆属(Heterorhabditis)或斯氏线虫属(Steinernema)的物种。在一些情况下，有助于有害生物控制的宿主是昆虫。例如，有助于有害生物控制的宿主可以是属于以下科的物种：小茧蜂科(Braconidae)(例如，寄生蜂)、步行虫科(Carabidae)(例如，土鳖虫)、草蛉科(Chrysopidae)(例如，草蛉)、瓢虫科(Coccinellidae)(例如，瓢虫)、褐蛉科(Hemerobiidae)(例如，褐蛉)、姬蜂科(Ichneumonidae)(例如，姬蜂)、萤科(Lampyridae)(例如，萤火虫)、螳螂科(Mantidae)(例如，螳螂)、蚊蛉科(Myrmeleontidae)(例如，蚊狮)、蜻蜓目(Odonata)(例如，蜻蜓和豆娘)、或食蚜蝇科(Syrphidae)(例如，食蚜虻)。在其他情况下，有助于有害生物控制的宿主是与被认为是有害生物(例如，农业有害生物)的昆虫竞争的昆虫。例如，地中海实蝇(Mediterranean fruit fly，Ceratitis capitata)是世界上的水果和蔬菜的常见有害生物。控制头状虫草(C.captitata)的一种方法是将绝育的雄性昆虫释放到环境中以与野生雄性竞争与雌性交配。在这些情况下，宿主可以是属于通常被认为是有害生物的物种的绝育雄性。
在一些情况下，该宿主有助于废物或有机材料降解。在一些实例中，有助于降解废物或有机材料的宿主属于天牛科(Cerambycidae)或果蝇科(Drosophilidae)。在一些情况下，属于双翅目的宿主属于以下科：丽蝇科(Calliphoridae)、拟果蝇科(Curtonotidae)、果蝇科(Drosophilidae)、厕蝇科(Fanniidae)、日蝇科(Heleomyzidae)、叶蝇科(Milichiidae)、蝇科(Muscidae)、蚤蝇科(Phoridae)、毛蠓科(Psychodidae)、粪蚊科(Scatopsidae)、鼓翅绳科(Sepsidae)、小粪蝇科(Sphaeroceridae)、水虻科(Stratiomyidae)、食蚜蝇科(Syrphidae)、实蝇科(Tephritidae)、或小金蝇科(Ulidiidae)。在一些情况下，属于天牛科(Cerambycidae)的宿主属于以下科：步行虫科(Carabidae)、水龟虫科(Hydrophilidae)、姬花甲科(Phalacaridae)、缨甲科(Ptiliidae)、或隐翅虫科(Staphylinidae)。
在一些情况下，该宿主可以是为可消耗产品(例如，食物或饲料)而培育的昆虫或蛛形纲动物。例如，该宿主可以是蛾、蝴蝶、蝇、蟋蟀、蜘蛛、或甲虫。在一些情况下，该宿主属于以下目：虱目(Anoplura)、蜘蛛目(Araneae)、蜚蠊目(Blattodea)、鞘翅目(Coleoptera)、革翅目(Dermaptera)、网翅目(Dictyoptera)、双尾目(Diplura)、双翅目(Diptera)、纺足目(Embioptera)、蜉蝣目(Ephemeroptera)、蛩蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、螳螂目(Mantidae)、长翅目(Mecoptera)、脉翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、竹节虫目(Phasmida)、襀翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、啮虫目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphunculata)、缨尾目(Thysanura)、捻翅目(Strepsiptera)、缨翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)、或缺翅目(Zoraptera)。
在一些实例中，该宿主是黑水虻(black soldier fly，Hermetia illucens)、家蝇、小粉虫(lesser mealworm)、编织蚊、蚕(家蚕(Bombyx mori))、蚱蜢、中华稻蝗(中华蚱蜢(Acrida cinerea))、黄粉虫(yellow mealworm)(Clarias gariepinns)、蛾(Anapheinfracta或家蚕(Bombyx mori))、海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)、家蟋蟀、白蚁、椰棕象虫(红棕象甲(Rhynchophorus ferruginens))、大负子蝽(印度田鳖(Lethocerusindicus))、龙虱、白蚁(非洲曼迪大白蚁(Macrotermes subhyalinus))、窃蠹甲(药材甲(Stegobium paniceum))、Imbrasia belina、紫棕象甲(Rhynchophorus phoenicis)、二疣犀甲(Oryctes rhinoceros)、非洲大白蚁(Macrotermes bellicosus)、Ruspoliadifferens、非洲蛀犀金龟甲(Oryctes Monoceros)、或黄猄蚊(Oecophylla smaragdina)。
v.降低宿主适合度
本文提供的方法和组合物可用于降低本文所述的宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)中的任一种的适合度。适合度的降低是由于宿主途径的改变，这些宿主途径介导该宿主和寄宿于该宿主中的微生物之间的相互作用，其中这些改变是给予调节剂的结果并且对宿主具有不利的作用。
在一些情况下，由于给予调节剂，宿主适合度的降低可表现为宿主生理学的恶化或下降(例如，健康或存活降低)。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，生物的适合度可通过一种或多种参数来测量，包括但不限于繁殖速率、生殖力、寿限、生存力、迁移、繁殖力、宿主发育、体重、代谢速率或活性、或存活。例如，本文提供的方法或组合物可有效降低宿主的总体健康或降低宿主的总体存活。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中找到的水平)，宿主的降低的存活是约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该方法和组合物有效降低了宿主繁殖(例如，繁殖速率、生殖力)。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，这些方法和组合物可有效使其他的生理参数(如迁移、体重、寿限、繁殖力、或代谢速率)降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，宿主适合度降低可表现为在该宿主中一种或多种营养物(例如，维生素、碳水化合物类、氨基酸、或多肽)产量的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中找到的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使宿主中的营养物(例如，维生素、碳水化合物类、氨基酸、或多肽)的产量降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，相比于没有被给予没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法或组合物可通过降低由宿主中的一种或多种微生物(例如，内共生体)产生的营养物的产量来降低宿主中的营养物。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，宿主适合度的降低可表现为宿主对杀有害生物剂(例如，表11中列出的杀有害生物剂)的敏感性的提高和/或宿主对杀有害生物剂(例如，表11中列出的杀有害生物剂)的抗性的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使该宿主对杀有害生物剂(例如，表11中列出的杀有害生物剂)的敏感性提高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。该杀有害生物剂可以是本领域已知的任何杀有害生物剂，包括杀昆虫剂。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法或组合物可通过降低宿主将杀有害生物剂代谢或降解为可用底物的能力来提高宿主对杀有害生物剂(例如，表11中列出的杀有害生物剂)的敏感性。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，宿主适合度的降低可表现为宿主对化感剂的敏感性的提高和/或宿主对化感剂的抗性的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中找到的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使宿主对化感剂的抗性降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，化感剂是咖啡因、大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂、杀螟松、单萜类、二萜酸、或酚类化合物(例如，丹宁酸、类黄酮)。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法或组合物可通过降低宿主将化感剂代谢或降解为可用底物的能力来提高宿主对化感剂的敏感性。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法或组合物可有效降低宿主对寄生虫或病原体(例如，真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体，或者寄生虫)的抗性。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中找到的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使宿主对病原体或寄生物(例如，真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体；或者寄生螨)的抗性降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法或组合物可有效降低该宿主携带或传播植物病原体(例如，植物病毒(例如，TYLCV)或植物细菌(例如，农杆菌属物种(Agrobacterium spp))的能力。例如，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使该宿主携带或传播植物病原体(例如，植物病毒(例如，TYLCV)或植物细菌(例如，农杆菌属物种(Agrobacteriumspp))的能力降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，宿主适合度降低可表现为其他适合度缺点，如对某些环境因素(例如，高温或低温耐受性)的耐受性降低、在某些生境中存活的能力降低、或维持某种饲料的能力降低。在一些情况下，本文提供的方法或组合物可以本文所述的任何多种方式有效降低宿主适合度。此外，该调节剂可在任何数量的宿主纲、目、科、属、或物种(例如，1个宿主物种、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、200个、250个、500个、或更多个宿主物种)中降低宿主适合度。在一些情况下，该调节剂作用于单一宿主纲、目、科、属、或物种。
可以使用本领域的任何标准方法来评估宿主适合度。在一些情况下，可以通过评估个体宿主来评估宿主适合度。可替代地，可以通过评估宿主群体来评估宿主适合度。例如，宿主适合度降低可表现为与其他昆虫的成功竞争的降低，从而导致该宿主群体的规模减小。
vi.提高宿主适合度
本文提供的方法和组合物可用于提高本文所述的宿主中任一种的适合度。适合度的提高是由于宿主途径的改变，这些宿主途径介导该宿主和寄宿于该宿主中的微生物之间的相互作用，其中这些改变是给予调节剂的结果并且对宿主具有有益的作用。
在一些情况下，由于给予调节剂，宿主适合度的提高可表现为宿主生理学的改善(例如，改善的健康或存活)。在一些情况下，生物的适合度可通过一种或多种参数来测量，这些参数包括但不限于相比于没有被给予调节剂的宿主生物的繁殖速率、寿限、迁移、繁殖力、体重、代谢速率或活性、或存活。例如，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法或组合物可有效改善该宿主的整体健康或改善该宿主的整体存活。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，该宿主的改善的存活是约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，这些方法和组合物有效提高了宿主繁殖(例如，繁殖速率)。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，这些方法和组合物可有效使其他的生理参数(如迁移、体重、寿限、繁殖力、或代谢速率)提高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，宿主适合度的提高可表现为相比于没有被给予调节剂的宿主生物，由所述宿主产生的产物的产量的提高。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使由如本文所述的宿主产生的产物(例如，蜂蜜、蜂蜡、花粉蜜、蜂胶、蚕丝、或紫胶)的产量提高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，宿主适合度的提高可表现为该宿主进行的所希望的活动(例如，授粉、捕食有害生物、种子传播、或废物或有机材料分解)的频率或功效的提高。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，本文提供的方法和组合物可有效使该宿主进行所希望的活动(例如，授粉、捕食有害生物、种子传播、或废物或有机材料分解)的频率或功效提高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该宿主适合度提高可表现为在该宿主中一种或多种营养物(例如，维生素、碳水化合物类、氨基酸、或多肽)产量的提高。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，本文提供的方法和组合物可有效使该宿主中的营养物(例如，维生素、碳水化合物类、氨基酸、或多肽)的产量提高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法和组合物可通过提高由该宿主中的一种或多种微生物(例如，内共生体)产生的营养物的产量来增加该宿主中的营养物。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，宿主适合度的提高可表现为该宿主对杀有害生物剂(例如，表11中列出的杀有害生物剂)的敏感性的降低和/或该宿主对杀有害生物剂(例如，表11中列出的杀有害生物剂)的抗性的提高。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使该宿主对杀有害生物剂(例如，表11中列出的杀有害生物剂)的敏感性降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。该杀有害生物剂可以是本领域已知的任何杀有害生物剂，包括杀昆虫剂。在一些情况下，该杀有害生物剂是新烟碱。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法和组合物可通过提高该宿主将杀有害生物剂代谢或降解为可用底物的能力来降低该宿主对杀有害生物剂(例如，表11中列出的杀有害生物剂)的敏感性。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，宿主适合度的提高可表现为该宿主对化感剂的敏感性的降低和/或该宿主对化感剂的抗性的提高。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，本文提供的方法和组合物可有效使该宿主对化感剂的抗性提高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，化感剂是咖啡因、大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂、杀螟松、单萜类、二萜酸、或酚类化合物(例如，丹宁酸、类黄酮)。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法和组合物可通过提高该宿主将化感剂代谢或降解为可用底物的能力来降低该宿主对化感剂的敏感性。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法和组合物可有效提高该宿主对寄生物或病原体(例如，真菌、细菌、或病毒病原体；或寄生螨(例如，蜜蜂中的狄斯瓦螨(Varroa destructor))的抗性。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中发现的水平)，本文提供的方法和组合物可有效使该宿主对病原体或寄生物(例如，真菌、细菌、或病毒病原体；或寄生螨(例如，蜜蜂中的狄斯瓦螨(Varroadestructor))的抗性提高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，宿主适合度提高可表现为其他适合度优点，如对某些环境因素(例如，高温或低温耐受性)的耐受性提高、在某些生境中的存活能力提高、或维持某种饲料的能力提高(例如，代谢大豆和玉米的能力提高)。在一些情况下，本文提供的方法和组合物可以以本文所述的多种方式中的任一种来有效提高宿主适合度。此外，该调节剂可在任何数量的宿主纲、目、科、属、或物种(例如，1个宿主物种，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、200个、250个、500个、或更多个宿主物种)中提高宿主适合度。在一些情况下，该调节剂作用于单一宿主纲、目、科、属、或物种。
可以使用本领域的任何标准方法来评估宿主适合度。在一些情况下，可以通过评估个体宿主来评估宿主适合度。可替代地，可以通过评估宿主群体来评估宿主适合度。例如，宿主适合度提高可表现为与其他昆虫的成功竞争的提高，从而导致该宿主群体的规模增加。
vii.农业中的宿主
本文所述的调节剂可用于促进植物生长。例如，通过减少有害无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的适合度，本文提供的调节剂可以有效促进典型地受到宿主损害的植物的生长。可替代地，通过提高有益的无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的适合度，本文提供的调节剂可有效促进受益于所述宿主的植物的生长。可以使用本文所述的任何配制品和递送方法，以有效调节(例如，提高或降低)宿主适合度并且从而有益于植物(例如，增强作物生长、提高作物产量、降低有害生物侵染、和/或减少对植物的损害)的量和持续时间，将调节剂递送至植物。这可能涉及或可能不涉及将调节剂直接施用于植物。例如，在原生宿主生境不同于植物生长的区域的情况下，可将调节剂施用于原生宿主生境、感兴趣的植物、或二者的组合。
在一些情况下，该植物可以是农业粮食作物，如谷物、谷粒、豆类、水果、或蔬菜作物，或非粮食作物，例如，草类、开花植物、棉花、干草、大麻。在收获谷物、谷粒、豆类、水果、蔬菜、或其他作物之前或之后的任何时间，可以将本文所述的组合物递送至作物。作物产量是通常用于作物植物的测量值，并且通常以公吨/公顷(或千克每公顷)计量。作物产量还可以指植物的实际种子产生。在一些情况下，与参考水平(例如，没有被给予调节剂的作物)相比，该调节剂可有效使作物产量提高(例如，提高每公顷谷物、谷粒、豆类、水果、或蔬菜的公吨和/或增加种子产生)约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更多。
在一些情况下，该植物(例如，作物)可能处于被有害生物侵染(例如，昆虫、软体动物、或线虫的侵染)的风险中或可能已经被有害生物侵染。通过减少侵染植物的无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的适合度，本文所述的方法和组合物可用于减少或预防在此类作物中的有害生物侵染。在一些情况下，与参考水平(例如，没有被给予调节剂的作物)相比，该调节剂可有效使作物侵染减少(例如，减少侵染的植物的数量、减小有害生物群体规模、减少对植物的损害)约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更多。在其他情况下，与参考水平(例如，没有被给予调节剂的作物)相比，该调节剂可有效预防作物侵染可能性或将该可能性降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更多。
任何合适的植物组织可受益于本文所述的组合物和方法，包括但不限于体细胞胚、花粉、叶、茎、愈伤组织、匍匐茎、微块茎(microtuber)或枝。本文所述的方法和组合物可以包括对以下被子植物或裸子植物的处理，如刺槐、苜蓿、苹果树、杏树、朝鲜蓟、白蜡树、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、桦树、山毛榉、黑莓、蓝莓、西兰花、孢子甘蓝、卷心菜、油菜、哈密瓜、胡萝卜、木薯、菜花、雪松、谷物、芹菜、板栗、樱桃、白菜、柑橘、小柑橘、三叶草、咖啡、玉米、棉花、针叶树、豇豆、黄瓜、柏树、茄子、榆树、欧洲菊苣、桉树、蚕豆、茴香、饲料作物、无花果、冷杉、水果和坚果树、天竺葵、葡萄、葡萄柚、花生、鹅莓、桉木、铁杉、大麻、山胡桃木、羽衣甘蓝、奇异果、甘蓝、落叶松、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、刺槐、松树、铁线蕨、玉蜀黍、芒果、枫树、甜瓜、小米、蘑菇、芥末、坚果、橡木、燕麦、秋葵、洋葱、橙子、观赏植物或花卉或树木、番木瓜、棕榈、香菜、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、peat、辣椒、柿子、木豆、松树、菠萝、芭蕉、李子树、石榴树、马铃薯、南瓜、菊苣、萝卜、油菜籽、覆盆子、水稻、黑麦、高粱、黄桦柳、黄豆、菠菜、云杉、瓜类蔬菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、柑橘、茶、烟草、番茄、树木、黑小麦、草皮草、萝卜、藤本植物、核桃、水田芥、西瓜、小麦、山药、红豆杉、或西葫芦。
viii.饲料/食品生产中的宿主
在达到所希望的生命阶段后，可以收获宿主，并且如果需要，可以对其进行处理以用于制造可消耗产品。在一些情况下，该收获的无脊椎动物宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)可以以完整的形式(例如，作为完整的、未经加工的宿主)作为可消耗产品分售。在一些情况下，该完整的收获的宿主被加工(例如，研磨)并作为可消耗产品分售。可替代地，可以从该宿主中提取该宿主的一个或多个部分(例如，一个或多个身体部分或一种或多种物质)用于制造可消耗产品。
该可消耗产品可以是对于人类或动物消耗(例如，摄取)来说是安全的任何产品。在一些情况下，该宿主可用于制造动物饲料。在一些情况下，该动物是牲畜或农场动物(例如，鸡、牛、马或猪)。在一些情况下，该动物是鸟类、爬行动物、两栖动物、哺乳动物或鱼类。在一些情况下，该宿主可用于制造替代动物的正常饲料的产品。可替代地，该宿主可用于制造补充动物的正常饲料的产品。该宿主还可用于制造人用食品、食品添加剂或食品成分。在一些情况下，该宿主用于制造人用营养补充剂(例如，蛋白补充剂)。
该宿主可以是野生的宿主或驯化的宿主。另外地，在递送或施用本文所述的该组合物时，该宿主可以处于任何发育阶段。此外，在收获该宿主用于制造可消耗产品时，该宿主可处于任何发育阶段。在一些情况下，在收获、使用、加工或制造时，该宿主是幼虫、蛹、或成虫。该调节剂的递送和收获步骤可同时或不同时发生。
在一些情况下，基于宿主物种的天然营养特征，对其进行选择。在一些情况下，将调节剂用于改善该昆虫的营养特征，其中相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂导致营养物的产量提高。营养物的实例包括维生素、碳水化合物类、氨基酸、多肽、或脂肪酸。在一些情况下，该提高的产量可能是由于寄宿于该宿主中的微生物产生的营养物的产量提高。可替代地，该提高的产量可能是由于该宿主昆虫本身产生的营养物的产量的提高，其中在递送或给予调节剂之后，该宿主具有提高的适合度。
在一些情况下，在最后加工中，将第一昆虫物种与第二昆虫物种结合，其中该第二昆虫物种的营养特征对食品或饲料产品的整体营养价值提供了补充性益处。例如，具有高蛋白特征的物种可与具有高ω3/6脂肪酸特征的物种结合。以这种方式，宿主蛋白粉可以定制混合以满足人类或不同动物物种的需要。
ix.疾病传播中的宿主昆虫
通过降低携带人和/或动物病原体的宿主昆虫的适合度，本文提供的调节剂可有效减少媒介传播疾病的传播。可以使用本文所述的的任何配制品和递送方法，以有效减少疾病传播，例如减少媒介之间的垂直或水平传播和/或减少向人和/或动物的传播的量和持续时间，将该调节剂递送至宿主。例如，相比于没有被给予调节剂的宿主生物本文所述的调节剂可使媒介传播的病原体的垂直或水平传播减少约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更多。作为另一个实例，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文所述的调节剂可使宿主媒介的媒介感受态减少约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更多。
可通过本文提供的组合物和方法控制的疾病的非限制性实例包括：由披膜病毒科(Togaviridae)病毒(例如，基孔肯雅病、罗斯河热(Ross River fever)、马亚罗病毒、奥绒绒热(Onyon-nyong fever)、辛德毕斯热(Sindbis fever)、东部脑脊髓炎、西方马脑脊髓炎(Wesetem equine encephalomyelitis)、委内瑞拉马脑脊髓炎(Venezualan equineencephalomyelitis)、或巴尔马森林病毒(Barmah forest))引起的疾病；由黄病毒科病毒(例如，登革热、黄热病、凯萨努森林病、鄂木斯克出血热、日本脑炎、墨累山谷脑炎、罗氏(Rocio)、圣路易脑炎(St.Louis encephalitis)、西尼罗河脑炎(West Nileencephalitis)、或蜱传播的脑炎)引起的疾病；由布尼亚病毒科(Bunyaviridae)病毒(例如，白蛉热(Sandly fever)、裂谷热、拉克罗斯脑炎(La Crosse encephalitis)、加州脑炎(California encephalitis)、克里米亚-刚果出血热、或奥罗普切热(Oropouche fever))引起的疾病；由弹状病毒科(Rhabdoviridae)病毒(例如，水泡性口炎)引起的疾病；由Orbiviridae(例如，蓝舌病(Bluetongue))引起的疾病；由细菌(例如，鼠疫、土拉菌病、Q热(Q fever)、落基山斑疹热(Rocky Mountain spotted fever)、鼠型斑疹伤寒、南欧斑疹热(Boutonneuse fever)、昆士兰壁虱斑疹伤寒(Queensland tick typhus)、西伯利亚斑疹伤寒(Siberian tick typhus)、恙虫病、回归热(Relapsing fever)、或莱姆病)引起的疾病；或由原生动物(例如，疟疾、非洲锥虫病、那加那病、查加斯病、利什曼病、梨浆虫病、班氏丝虫病(Bancroftian filariasis)、或布鲁格丝虫病(Brugian filariasis))引起的疾病。
II.靶微生物
本文所述的调节剂靶向的微生物可以包括寄宿于无脊椎动物宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)体内或体表的任何微生物，包括但不限于本文所述的任何细菌和/或真菌。寄宿于宿主中的微生物可以包括，例如，共生微生物(例如，为宿主提供有益的营养物或酶的内共生微生物)、共栖微生物、致病微生物、或寄生微生物。共生微生物(例如，细菌或真菌)可以是宿主的专性共生体或宿主的兼性共生体。寄宿于宿主中的微生物可以通过任何传播方式获得，包括垂直传播、水平传播或多个传播源。
i.细菌
可根据本文提供的方法和组合物靶向的示例性细菌包括但不限于，致病杆菌属物种(Xenorhabdus spp)、发光杆菌属物种(Photorhabdus spp)、Candidatus属物种、蚜虫布赫纳氏菌、布拉特杆菌属物种(Blattabacterium spp)、鲍曼属物种(Baumania spp)、威格尔斯沃思氏菌属物种(Wigglesworthia spp)、沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp)、立克次体属物种(Rickettsia spp)、东方体属物种(Orientia spp.)、伴突属物种(Sodalisspp)、伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp)、贪铜菌属物种(Cupriavidus spp)、弗兰克氏菌属物种(Frankia spp)、中华根瘤菌属物种(Snirhizobium spp)、链球菌属物种(Streptococcus spp)、沃廉菌属物种(Wolinella spp)、木杆菌属物种(Xylella spp)(例如，叶缘焦枯病菌(Xylella fastidiosa))、欧氏杆菌属物种(Erwinia spp)、农杆菌属物种(Agrobacterium spp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp)、Commensalibacter属物种(例如，Commensalibacter intestini)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、链霉菌属物种(Streptomyces spp)、微球菌属物种(Micrococcus spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、醋杆菌属物种(Acetobacter spp)(例如，果实醋杆菌(Acetobacter pomorum))、蓝细菌属物种(Cyanobacteria spp)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp)、红球菌属物种(Rhodococcus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonasspp)、泛菌属物种(Pantoea spp.)(例如，成团泛菌(Pantoea vagans))、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp)(例如，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))、溶杆菌属物种(Lysobacter spp.)、草螺菌属物种(Herbaspirillum spp)、肠球菌属物种(Enterococcusspp)、葡糖杆菌属物种(Gluconobacter spp)(例如，Gluconobacter morbifer)、产碱杆菌属物种(Alcaligenes spp)、Hamiltonella属物种、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、沙雷氏菌属物种(Serratia spp.)(例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens))、拉恩氏菌属物种(Rahnella spp.)(例如，水生拉恩菌(Rahnella aquatilis))、节杆菌属物种(Arthrobacter spp)、固氮菌属物种(Azotobacterspp.)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、短杆菌属物种(Brevibacterium spp)、Regiella属物种(例如，Regiella insecticola)、栖热菌属物种(Thermus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、梭菌属物种(Clostridium spp)、被孢霉属物种(Mortierellaspp.)(例如，长被孢霉(Mortierella elongata))和埃希氏杆菌属物种(Escherichiaspp.)。在一些情况下，该靶向的细菌是以下属的物种：致病杆菌属物种(Xenorhabdusspp.)、发光杆菌属物种(Photorhabdus spp.)、或沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp.)。在一些情况下，该靶向的细菌是以下目的物种：链霉菌目(Streptomycetales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、黄色单胞菌目(Xanthomondadales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、Chlorofelxales、红螺旋菌目(Rhodospirllales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、芽单胞菌目(Gemmatimonadales)、微球菌目(Micrococcales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、噬纤维菌目(Cytophagales)、厚壁菌门(Firmicutes)、微单孢菌科(Micromonosporales)、伯克霍尔德氏菌目(Burkholderiales)、立克次氏体目(Rickettsiales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、Acidimicroiales、红环菌目(Rhodocyclales)、或蛭弧菌目(Bdellovibrionales)。在一些情况下，该靶向的细菌是装甲菌门(Armatimonadetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、TM7、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、或放线菌门(Actinobacteria)。在一些情况下，该靶向的细菌是以下属的细菌：乳球菌属物种(Lactococcus spp.)、Aeromonas spp.、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、肠杆菌属物种(Enterobacter spp.)、柠檬酸杆菌属物种(Citrobacter spp.)、硫磺单胞菌属物种(Sulfurospillium spp.)、暗球腔菌属物种(Phaeosphaeria spp.)、或球腔菌属物种(Mycosphaerella spp.)。在一些情况下，调节剂靶向的细菌可以是可从该宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)传播给植物的那些，包括但不限于细菌性植物病原体(例如，农杆菌属物种(Agrobacterium spp.))。本文提供的方法和组合物可靶向的细菌的非限制性实例示出于表1中。在一些情况下，调节剂靶向的细菌的16S rRNA序列与表1中列出的序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.9％、或100％同一性。
表1：靶细菌和宿主昆虫的实例
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本文所述的组合物或方法可以靶向任何数量的细菌物种。例如，在一些情况下，该调节剂可以靶向单一细菌物种。在一些情况下，该调节剂可以靶向至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、或更多种不同的细菌物种中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以靶向约1至约5、约5至约10、约10至约20、约20至约50、约50至约100、约100至约200、约200至约500、约10至约50、约5至约20、或约10至约100种不同的细菌物种中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以靶向至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、或更多种细菌的门、纲、目、科或属中的任一者。
在一些情况下，该调节剂可以使该宿主中一种或多种细菌的群体增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以使该宿主中一种或多种细菌的群体减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以根除该宿主中的细菌的群体。
在一些情况下，与未被给予调节剂的宿主生物相比，该调节剂可以改变该宿主的细菌多样性和/或细菌组成。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，调节剂可使宿主中的细菌多样性相对于起始多样性增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，调节剂可使宿主中的细菌多样性相对于起始多样性减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。
在一些情况下，与未被给予调节剂的宿主生物相比，该调节剂可以改变一种或多种细菌细胞的功能、活性、生长、和/或分裂。例如，该调节剂可以改变细菌中一种或多种基因的表达。在一些情况下，该调节剂可以改变细菌中一种或多种蛋白质的功能。在一些情况下，该调节剂可以改变细菌中一种或多种细胞结构(例如，细胞壁、外膜或内膜)的功能。在一些情况下，该调节剂可以杀死(例如，裂解)细菌。
靶细菌可以寄宿于无脊椎动物宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的一个或多个部分中。此外，靶细菌可以是细胞内或细胞外的。在一些情况下，细菌可以寄宿于宿主肠内或肠表的一个或多个部分中，该肠包括例如，前肠、中肠和/或后肠。在一些情况下，该细菌作为细胞内细菌寄宿于该宿主的细胞内。在一些情况下，该细菌寄宿于宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的含菌细胞中。
可以通过本领域已知的任何方法，例如标准培养技术、CFU计数、微阵列、聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR、流式细胞术、荧光显微镜法、透射电子显微术、荧光原位杂交技术(例如FISH)、分光光度计法、基质辅助激光解析电离-质谱法(MALDI-MS)、或DNA测序确定该宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)中细菌的群体的改变。在一些情况下，对用调节剂处理的宿主样品进行测序(例如，通过16S rRNA或rDNA的宏基因组测序)以确定在递送或给予调节剂后宿主的微生物组。在一些情况下，还对未接受调节剂的宿主样品进行测序以提供参考。
ii.真菌和酵母
根据本文提供的方法和组合物可靶向的示例性真菌包括但不限于：Amylostereumareolatum、香柱菌属物种(Epichloe spp)、松果毕赤酵母(Pichia pinus)、荚膜汉逊酵母(Hansenula capsulate)、Daldinia decipien、长喙壳属物种(Ceratocystis spp)、长喙壳菌属物种(Ophiostoma spp)、以及Attamyces bromatificus。无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)中发现的酵母和酵母样共生体的非限制性实例包括假丝酵母属(Candida)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、白鬼伞属(Leucocoprinu)(例如，Leucocoprinusgongylophorus)、德巴利酵母属(Debaromyces)、休哈塔假丝酵母(Scheffersomycesshehatae)和树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipites)、Starmerella、毕赤酵母属(Pichia)、毛孢子菌属(Trichosporon)、隐球菌属(Cryptococcus)、南极假丝酵母属(Pseudozyma)、以及来自盘菌亚门(盘菌亚门(subphylum Pezizomycotina))的酵母样共生体(例如，Symbiotaphrina bucneri和Symbiotaphrina kochii)。本文的方法和组合物可靶向的酵母的非限制性实例列于表2中。
表2：昆虫中酵母的实例
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本文所述的组合物或方法可以靶向任何数量的真菌物种。例如，在一些情况下，该调节剂可以靶向单一真菌物种。在一些情况下，该调节剂可以靶向至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、或更多种不同的真菌物种中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以靶向约1至约5、约5至约10、约10至约20、约20至约50、约50至约100、约100至约200、约200至约500、约10至约50、约5至约20、或约10至约100种不同的真菌物种中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以靶向至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、或更多种真菌的门、纲、目、科或属中的任一者。
在一些情况下，相比于未被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中一种或多种真菌的群体增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，相比于未被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中一种或多种真菌的群体减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以根除该宿主中的真菌的群体。
在一些情况下，该调节剂可以改变宿主的真菌多样性和/或真菌组成。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中的真菌多样性相对于起始多样性增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中的真菌多样性相对于起始多样性减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。
在一些情况下，该调节剂可以改变一种或多种真菌的功能、活性、生长、和/或分化。例如，该调节剂可以改变真菌中一种或多种基因的表达。在一些情况下，该调节剂可以改变真菌中一种或多种蛋白质的功能。在一些情况下，该调节剂可以改变真菌中一种或多种细胞组分的功能。在一些情况下，该调节剂可以杀死真菌。
此外，靶真菌可以寄宿于昆虫的一个或多个部分中。在一些情况下，真菌可以寄宿于昆虫肠内或肠表的一个或多个部分中，该肠包括例如，前肠、中肠和/或后肠。在一些情况下，真菌在细胞外生活在宿主的血淋巴、脂肪体或在特化结构中。
可以通过本领域已知的任何方法(如微阵列、聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR、流式细胞术、荧光显微镜法、透射电子显微术、荧光原位杂交技术(例如FISH)、分光光度计法、基质辅助激光解析电离-质谱法(MALDI-MS)、以及DNA测序)确定宿主中真菌的群体的改变。在一些情况下，对用调节剂处理的宿主样品进行测序(例如，通过宏基因组测序)以确定在递送或给予调节剂后宿主的微生物组。在一些情况下，还对未接受调节剂的宿主样品进行测序以提供参考。
III.调节剂
本文提供的方法和组合物的调节剂可以包括多肽、核酸、小分子、或其任何组合。在一些情况下，该调节剂是核酸分子(例如，DNA分子或RNA分子，例如，mRNA、指导RNA(gRNA)、或抑制性RNA分子(例如，siRNA、shRNA、或miRNA)，或杂交DNA-RNA分子)、小分子、肽、或多肽(例如，抗体分子，例如，抗体或其抗原结合片段)。这些药剂中的任一种可以用于通过靶向该宿主和/或寄宿微生物中的途径(例如，介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如宿主免疫系统途径或含菌细胞途径)，改变宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的微生物区系。例如，本文所述的任何调节剂可以用于调节(例如，诱导或抑制)寄宿于该宿主中的宿主或微生物中的基因或蛋白(例如，表7、表8、或表9中列出的蛋白或编码表7、表8、或表9中列出的蛋白的基因)。
i.多肽
本文所述的调节剂可以包括多肽(例如，抗体)。在一些情况下，本文所述的调节剂包括多肽或其功能片段或衍生物，该多肽或其功能片段或衍生物靶向该宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)和/或寄宿微生物中的途径(例如，介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如宿主免疫系统途径或含菌细胞途径)。在一些情况下，该药剂是表7、表8、或表9中列出的多肽，其中通过参考该药剂多肽的登录号，提供该药剂多肽的一级序列。
包括如本文所述的多肽的调节剂可以按足以实现以下项的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
本文包括的多肽可以包括天然存在的多肽或重组产生的变体。在一些情况下，该多肽可以是功能片段或其变体(例如表7、表8、或表9中列出的多肽的酶活性片段或其变体)。可以如本文所述制备此类片段或变体并且针对类似活性进行筛选，并且在以下披露的方法和组合物中会是等同的。例如，该多肽可以是本文所述的任何多肽的功能活性变体，例如在指定区域或整个序列上与本文所述的多肽或天然存在的多肽的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。在一些情况下，参考提供的登录号，该多肽可以与表7、表8、或表9中列出的蛋白的氨基酸序列具有至少50％(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、或更大)同一性。
制造治疗性多肽的方法在本领域是常规的。通常，参见Smales和James(编辑)，Therapeutic Proteins：Methods and Protocols[治疗性蛋白：方法和方案](Methods inMolecular Biology[分子生物学方法])，Humana Press[胡玛纳出版社](2005)；以及Crommelin，Sindelar和Meibohm(编辑)，Pharmaceutical Biotechnology：Fundamentalsand Applications[药物生物技术：基础与应用]，Springer[斯普林格出版社](2013)。
用于产生多肽的方法涉及在哺乳动物细胞中表达，尽管也可以使用昆虫细胞、酵母、细菌、或其他细胞，在适当的启动子控制下，产生重组蛋白。哺乳动物表达运载体可以包含非转录元件，如复制起点、合适的启动子和增强子、以及其他5′或3’侧翼非转录序列、以及5′或3′非翻译序列，如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和接受位点、以及终止序列。源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化位点可以用于提供异源DNA序列表达所需的其他遗传元件。在以下文献中描述了用于与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达运载体：Green&Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆实验室手册](第四版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](2012)。
不同哺乳动物细胞培养系统可以用于表达和制造重组多肽药剂(例如，表4、5、或6中列出的)。哺乳动物表达系统的实例包括但不限于CHO细胞、COS细胞、HeLA和BHK细胞系。在以下文献中描述了用于产生蛋白治疗剂的宿主细胞培养的过程：例如，Zhou和Kantardjieff(编辑)，Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing [用于生物制品制造的哺乳动物细胞培养](Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[生物化学工程/生物科技的进展])，Springer[斯普林格出版社](2014)。在以下文献中描述了蛋白治疗剂的纯化：Franks，Protein Biotechnology：Isolation，Characterization，and Stabilization[蛋白生物技术：分离、表征、和稳定定化]，HumanaPress[胡玛纳出版社](2013)；以及Cutler，Protein Purification Protocols[蛋白纯化方案](Methods in Molecular Biology[分子生物学方法])，Humana Press[胡玛纳出版社](2010)。以下文献中描述了蛋白治疗剂的配制品：Meyer(编辑)，Therapeutic ProteinDrug Products：Practical Approaches to formulation in the Laboratory，Manufacturing，and the Clinic[治疗性蛋白药物产品：实验室、制造和临床中配制品的实践方法]，Woodhead Publishing Series[伍德海德出版系列(20l2)。
以下讨论的多肽调节剂，即抗体、细菌素、抗微生物肽、和含菌细胞调节肽，可以用于改变宿主中的途径，这些途径介导如在用于增加或减少宿主的适合度的部分中所示的宿主和寄宿于该宿主中的微生物之间的相互作用。
(a)抗体
在一些情况下，该调节剂包括抗体或其抗原结合片段。例如，本文所述的试剂可以是阻断或增强表8或表9中列出的宿主免疫系统途径或含菌细胞调节途径的组分的活性和/或功能的抗体。该抗体可以充当宿主或寄宿于宿主中的微生物中的多肽(例如酶或细胞受体，包括表7、表8、或表9中列出的任何蛋白)的拮抗剂或激动剂。
针对靶抗原(例如，介导宿主-微生物区系相互作用的蛋白，例如宿主免疫系统蛋白或含菌细胞蛋白，例如表7、表8、或表9中的蛋白)的抗体的制造和用途是本领域已知的。参见例如Zhiqiang An(编辑)，Therapeutic Monoclonal Antibodies：From Bench toClinic[治疗性单克隆抗体，从实验室到临床]，第1版，Wiley，2009以及Greenfield(编辑)，Antibodies：A Laboratory Manual[抗体：实验室手册]，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社]，2013获得制造重组抗体的方法，包括抗体工程、简并寡核苷酸的使用、5′-RACE、噬菌体展示、以及诱变；抗体测试和表征；抗体药代动力学和药效动力学；抗体纯化和储存；以及筛选和标记技术。
(b)细菌素
本文所述的调节剂可以包括细菌素。在一些情况下，该细菌素是由革兰氏阳性细菌天然产生的，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、或乳酸菌(LAB，如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis))。在一些情况下，该细菌素是由革兰氏阴性细菌天然产生的，例如蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、Serratia plymithicum、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、或大肠杆菌(Escherichia coli)。示例性细菌素包括但不限于I-IV类LAB抗生素(例如羊毛硫抗生素)、大肠杆菌素、小菌素(microcin)和脓菌素。细菌素的非限制性实例列于表3中。
表3：细菌素的实例
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在一些情况下，该细菌素是由革兰氏阴性细菌产生的大肠杆菌素、脓菌素、或小菌素(microcin)。在一些情况下，该细菌素是大肠杆菌素。大肠杆菌素可以是A组大肠杆菌素(例如，使用Tol系统以渗透靶细菌的外膜)或B组大肠杆菌素(例如，使用Ton系统以渗透靶细菌的外膜)。在一些情况下，该细菌素是小菌素(microcin)。小菌素(microcin)可以是I类小菌素(microcin)(例如，＜5kDa，具有翻译后修饰)或II类小菌素(microcin)(例如，5-10kDa，具有或不具有翻译后修饰)。在一些情况下，II类小菌素(microcin)是IIa类小菌素(microcin)(例如，需要多于一个基因以合成和组装功能肽)或IIb类小菌素(microcin)(例如，在C-末端具有或不具有翻译后修饰的线性肽)。在一些情况下，该细菌素是脓菌素。在一些情况下，该脓菌素是R-脓菌素、F-脓菌素、或S-脓菌素。
在一些情况下，该细菌素是由革兰氏阳性细菌产生的I类、II类、III类、或IV类、细菌素。在一些情况下，该调节剂包括I类细菌素(例如，由革兰氏阳性细菌产生的含有羊毛硫氨酸的抗生素(羊毛硫抗生素))。I类细菌素或羊毛硫抗生素可以是低分子量肽(例如，小于约5kDa)并且可以具有翻译后修饰的氨基酸残基(例如，羊毛硫氨酸、β-甲基羊毛硫氨酸、或脱水氨基酸)。
在一些情况下，该细菌素是II类细菌素(例如，由革兰氏阳性细菌产生的非羊毛硫抗生素)。许多是带正电荷的不含羊毛硫氨酸的肽，这些肽(与羊毛硫抗生素不同)不进行广泛的翻译后修饰。II类细菌素可能属于以下子类之一：“片球菌素(pediocin)样”细菌素(例如，片球菌素(pediocin)PA-1和肉食杆菌素(camobacteriocin)X(IIa类))；双肽细菌素(例如，乳酸菌素F和ABP-118(IIb类))；环形细菌素(例如，环状细菌素(carnocyclin)A和肠道菌素AS-48(IIc类))；或未修饰的、线性的、非片球菌素(pediocin)样细菌素(例如，表皮菌素(epidermicin)NI01和乳球菌素A(IId类))。
在一些情况下，该细菌素是III类细菌素(例如，由革兰氏阳性细菌产生的)。III类细菌素可以具有大于10kDa的分子量并且可以是热不稳定的蛋白质。III类细菌素可以进一步细分为IIIA组细菌素和IIIB组细菌素。IIIA组细菌素包括溶菌酶，其通过细胞壁的裂解来杀死敏感菌株，例如Enterolisin A。IIIB组细菌素包括非裂解性蛋白质，例如Caseicin80、Helveticin J和乳酸菌素B。
在一些情况下，该细菌素是IV类细菌素(例如，由革兰氏阳性细菌产生的)。IV类细菌素是一组复合物蛋白，与其他脂质或碳水化合物部分相关，似乎是活性所需的。它们是相对疏水且热稳定的。IV类细菌素的实例leuconocin S、乳酸菌素27、和乳酸菌素S。
在一些情况下，该细菌素是R型细菌素。R型细菌素是收缩性杀菌蛋白复合物。一些R型细菌素具有收缩性的噬菌体尾样结构。噬菌体尾丝蛋白的C-末端区域决定靶结合特异性。它们可以通过受体结合蛋白(例如尾丝)附着于靶细胞。附着之后是鞘收缩以及通过靶细菌的包膜插入核心。核心穿透导致细胞膜电位的快速去极化并促使细胞死亡。与单一R型细菌素颗粒接触可导致细胞死亡。例如，R型细菌素可以是不耐热的、温和酸抗性的、胰蛋白酶抗性的、可通过离心沉降的、可通过电子显微镜分辨的、或其组合。其他R型细菌素可以是包括多种蛋白质、多肽或亚单元的复合物分子，并且可以类似于肌尾噬菌体科(Myoviridae)的细菌噬菌体的尾结构。在天然存在的R型细菌素中，亚单元结构可以由细菌基因组编码，例如艰难梭状芽孢杆菌(C.Difficile)或铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)的基因组并形成R型细菌素以用作针对其他细菌的天然防御。在一些情况下，该R型细菌素是脓菌素。在一些情况下，该脓菌素是R-脓菌素、F-脓菌素、或S-脓菌素。
在一些情况下，该细菌素是本文所述的细菌素的功能活性变体。在一些情况下，该细菌素的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的细菌素或天然存在的细菌素的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。
在一些情况下，根据标准方法，该细菌素可以被生物工程化以调节其生物活性(例如，增加或减少或调节)或指定其靶微生物。在其他情况下，该细菌素是由微生物细胞的翻译机制(例如核糖体等)产生的。在一些情况下，该细菌素是化学合成的。一些细菌素可以衍生自多肽前体。该多肽前体可以经历切割(例如，通过蛋白酶加工)以产生细菌素本身的多肽。因此，在一些情况下，该细菌素由前体多肽产生。在一些其他情况下，该细菌素包括已经历翻译后修饰(例如切割，或添加一个或多个官能团)的多肽。
可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的细菌素。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的细菌素，如至少约1种细菌素、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100、或更多种细菌素中的任一者。本文所述的组合物中每种细菌素的合适的浓度取决于如功效、细菌素的稳定性、组合物中不同细菌素类型的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中每种细菌素是从约0.01ng/ml至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中每种细菌素是从约0.01ng/g至约100mg/g。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的细菌素，每种类型的细菌素的浓度可以相同或不同。在一些情况下，该细菌素提供于包括分泌该细菌素的细菌细胞的组合物中。在一些情况下，该细菌素提供于包括多肽(例如，从细菌细胞分离的多肽)的组合物中。
细菌素可以中和(例如，杀死)除制备多肽的个体细菌细胞以外的至少一种微生物，包括与细菌细胞和其他微生物细胞克隆相关的细胞。因此，细菌细胞可通过分泌细菌素对多种微生物有机体发挥细胞毒性或生长抑制作用。在一些情况下，细菌素经由细胞质膜孔形成、细胞壁干扰(例如，肽聚糖酶活性)或核酸酶活性(例如，DNA酶活性、16S rRNA酶活性或tRNA酶活性)靶向并杀死寄宿于宿主中的一种或多种细菌。
在一些情况下，该细菌素具有中和活性。细菌素的中和活性可以包括但不限于阻止微生物繁殖或细胞毒性。一些细菌素具有细胞毒活性，并且因此可以杀死微生物有机体，例如细菌、酵母、藻类等。一些细菌素可以抑制微生物有机体(例如细菌、酵母、藻类等)的繁殖，例如通过阻止细胞周期。
在一些情况下，该细菌素具有杀伤活性。细菌素的杀伤机制对每组细菌素都是特异性的。在一些情况下，该细菌素具有窄谱生物活性。已知细菌素针对其靶菌株具有非常高的效力。一些细菌素活性仅限于与细菌素生产菌株密切相关的菌株(窄谱生物活性)。在一些情况下，该细菌素针对宽范围的属具有广谱生物活性。
在一些情况下，细菌素与靶细菌细胞膜上的受体分子或对接分子相互作用。例如，乳链菌肽针对其靶细菌菌株非常有效，即使在一位数的纳摩尔浓度下也显示出抗微生物活性。乳链菌肽分子已被证明与脂质II结合，脂质II是肽聚糖亚单元从细胞质到细胞壁的主要转运体。
在一些情况下，该细菌素具有抗真菌活性。已经鉴定了许多具有抗酵母或抗真菌活性的细菌素。例如，已经显示来自芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌素具有针对一些酵母菌株的中和活性(参见，例如，Adetunji和Olaoye，Malaysian Journal of Microbiology[马来西亚微生物学杂志]9：130-13，2013)。在另一个实例中，已显示粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)肽具有针对假丝酵母属(Candida)物种的中和活性(参见，例如，Shekh和Roy，BMCMicrobiology[BMC微生物学]12：132，2012)。在另一个实例中，已显示来自假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌素具有针对真菌的中和活性，如月状弯孢霉(Curvularia lunata)、镰刀菌属(Fusarium)物种、长蠕孢属(Helminthosporium)物种、和离蠕孢属(Biopolaris)物种(参见，例如，Shalani和Srivastava，The Internet Journal of Microbiology[网络微生物学杂志]，第5卷，第2期，2008)。在另一个实例中，已显示来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的botrycidin AJ1316和alirin B1具有抗真菌活性。
包括如本文所述的细菌素的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内细菌素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内细菌素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内细菌素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
如实例5所示，细菌素(例如，由转基因植物产生的colA)可以用作靶向宿主途径(例如昆虫，例如蚜虫)的调节剂，这些途径改变寄宿于宿主中的内共生细菌(例如布赫纳氏菌属物种(Buchnera spp))的活性、水平、或代谢，从而调节(例如降低)该宿主的适合度。
(c)抗微生物肽
本文所述的调节剂可以包括抗微生物肽(AMP)。可以使用任何适用于抑制寄宿于宿主的微生物的AMP。AMP是一组多样化的分子，根据其氨基酸组成和结构分为亚组。AMP可以源自或产生自天然产生AMP的任何生物，该AMP包括源自植物的AMP(例如，copsin)、源自昆虫的AMP(例如，蜂毒肽(Mastoparan)、poneratoxin、杀菌肽、家蚕抗菌肽、蜂毒素)、源自蛙类的AMP(例如，爪蟾抗菌肽、皮抑菌肽、aurein)、以及源自哺乳动物的AMP(例如，组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)、防御素和抗菌肽)。AMP的非限制性实例列于表4中。
表4：抗微生物肽的实例
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AMP可以针对任何数量的靶微生物具有活性。在一些情况下，该AMP可具有抗细菌和/或抗真菌活性。在一些情况下，该AMP可具有窄谱生物活性或广谱生物活性。例如，一些AMP仅靶向并杀死很少数种类的细菌或真菌，而其他AMP则针对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌两者以及真菌都具有活性。
此外，该AMP可以通过许多已知的作用机制起作用。例如，细胞质膜是AMP的常见靶，但AMP也可能干扰DNA和蛋白质合成、蛋白质折叠和细胞壁合成。在一些情况下，具有净阳离子电荷和两亲性质的AMP破坏细菌膜，导致细胞裂解。在一些情况下，AMP可进入细胞并与细胞内靶相互作用以干扰DNA、RNA、蛋白质或细胞壁合成。除杀死微生物外，AMP已证明还具有许多免疫调节功能，这些功能与感染的清除有关，包括以下的能力：改变宿主基因表达、充当趋化因子和/或诱导趋化因子产生、抑制脂多糖诱导的促炎细胞因子产生、促进伤口愈合、并调节树突细胞和适应性免疫应答细胞的反应。
在一些情况下，该AMP是本文所述的AMP的功能活性变体。在一些情况下，该AMP的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的AMP或天然衍生的AMP的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。
在一些情况下，该AMP可以被生物工程化以调节其生物活性(例如，增加或减少或调节)或指定其靶微生物。在一些情况下，该AMP是由细胞的翻译机制(例如核糖体等)产生的。在一些情况下，该AMP是化学合成的。在一些情况下，该AMP衍生自多肽前体。该多肽前体可以经历切割(例如，通过蛋白酶加工)以产生AMP本身的多肽。因此，在一些情况下，该AMP由前体多肽产生。在一些情况下，该AMP包括已经历翻译后修饰(例如切割，或添加一个或多个官能团)的多肽。
可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的AMP。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的AMP，如至少约1种AMP、2、3、4、5、10、15、20、或更多种AMP中的任一者。组合物中每种AMP的合适的浓度取决于如功效、AMP的稳定性、组合物中不同AMP的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中每种AMP是从约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中每种AMP是从约0.1ng/g至约100mg/g。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的AMP，每种类型的AMP的浓度可以相同或不同。
包括如本文所述的AMP的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内AMP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内AMP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内AMP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
(d)含菌细胞调节肽
本文所述的调节剂可以包括含菌细胞调节肽(BRP)。BRP是在昆虫的含菌细胞中表达的肽。这些基因首先在与共生体的掺入一致的发育时间点表达，并且在整个昆虫的生命中维持它们的含菌细胞特异性表达。在一些情况下，该BRP具有预测为信号肽的疏水氨基末端结构域。此外，一些BRP具有富含半胱氨酸的结构域。在一些情况下，该含菌细胞调节肽是含菌细胞特异性富含半胱氨酸(BCR)的蛋白质。含菌细胞调节肽具有在约40至150个之间的氨基酸的长度。在一些情况下，该含菌细胞调节肽具有在约45至约145、约50至约140、约55至约135、约60至约130、约65至约125、约70至约120、约75至约115、约80至约110、约85至约105、或其间任何范围的范围内的长度。BRP的非限制性实例及其活性列于表5中。
表5：含菌细胞调节肽的实例
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Figure BDA0002155467980001581
在一些情况下，该BRP改变寄宿于宿主的含菌细胞中一种或多种细菌的生长和/或活性。在一些情况下，该BRP可以被生物工程化以调节其生物活性(例如，增加、减少或调节)或指定其靶微生物。在一些情况下，该BRP是由细胞的翻译机制(例如核糖体等)产生的。在一些情况下，该BRP是化学合成的。在一些情况下，该BRP衍生自多肽前体。该多肽前体可以经历切割(例如，通过蛋白酶加工)以产生BRP本身的多肽。因此，在一些情况下，该BRP由前体多肽产生。在一些情况下，该BRP包括已经历翻译后修饰(例如切割，或添加一个或多个官能团)的多肽。
如本文所述的BRP的功能活性变体也可用于本文所述的组合物和方法中。在一些情况下，该BRP的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的BRP或天然衍生的BRP的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。
可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的BRP。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的BRP，如至少约1种BRP、2、3、4、5、10、15、20、或更多种BRP中的任一者。组合物中每种BRP的合适的浓度取决于如功效、BRP的稳定性、不同BRP的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中每种BRP是从约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中每种BRP是从约0.1ng/g至约100mg/g。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的BRP，每种类型的BRP的浓度可以相同或不同。
包括如本文所述的BRP的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内BRP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内BRP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内BRP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
ii.小分子
在一些情况下，该调节剂包括小分子。在本文所述的方法和组合物中，许多小分子药剂是有用的。以下讨论的小分子可以用于改变宿主中的途径，这些途径介导宿主和寄宿于该宿主中的微生物之间的相互作用，如在用于降低昆虫，如蚜虫的适合度的部分中所示。还可以基于其靶向宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)和/或寄宿微生物中的途径的组分(例如，多肽，例如，酶或细胞表面受体)(例如，介导宿主-微生物区系相互作用，例如，宿主免疫系统途径或含菌细胞途径的多肽)的能力，筛选另外的小分子药剂。在一些情况下，该小分子包括激动剂、拮抗剂、抑制剂、或激活剂。例如，本文所述的小分子可以是阻断或增强表8或表9中列出的宿主免疫系统途径或含菌细胞调节途径的组分的活性和/或功能的激动剂、拮抗剂、抑制剂、或激活剂。该小分子可以充当宿主或寄宿于宿主中的微生物中的多肽(例如酶或细胞受体，包括表7、表8、或表9中列出的任何蛋白)的拮抗剂或激动剂。
小分子包括但不限于小肽、模拟肽(例如，类肽)、氨基酸、氨基酸类似物、合成的多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核甘酸类似物、通常具有小于约5,000克/摩尔的分子量的有机和无机化合物(包括杂有机(heterorganic)化合物和有机金属化合物)，例如，具有小于约2,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物，例如，具有小于约1,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物，例如，具有小于约500克/摩尔的分子量的有机或无机化合物，以及此类化合物的盐、酯和其他药学上可接受的形式。
可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的小分子。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的小分子，如至少约1个小分子、2、3、4、5、10、15、20、或更多个小分子中的任一者。组合物中每种小分子的合适浓度取决于多种因素，如功效、小分子的稳定性、不同小分子的数量、配制品、以及该组合物的施用方法。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的小分子，每种类型的小分子的浓度可以是相同或不同的。
包括如本文所述的小分子的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内小分子浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内小分子浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内小分子浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
在一些情况下，与未被给予该小分子的宿主生物相比，该小分子触发、刺激、或增加了宿主的免疫应答。例如，小分子可以是肽聚糖分子，其通过结合上皮细胞表面激活昆虫中的ROS系统，这转而通过动员细胞内钙，诱导DUOX酶活性。在另一个实例中，分子二羟基苯丙氨酸(DOPA)是对于角质层合成而言的必要组分。一旦角质层形成，DOPA在昆虫中达到高含量，这触发细胞凋亡和自噬激活。在另一个情况下，与未被给予该小分子的宿主生物相比，免疫应答可有效降低内共生体的水平或杀死内共生体。在一些情况下，与未被给予调节剂的宿主生物相比，小分子可有效破坏或降低含菌细胞功能。例如，阻断含菌细胞内必需氨基酸前体的运输的分子还破坏了必需氨基酸，例如精氨酸的产生。这一改变最终导致内共生体的死亡，并且最后导致宿主的死亡。可以用于刺激宿主的免疫系统并且由此降低寄宿于该宿主中的内共生体的水平的调节剂的其他实例包括脂多糖、雷帕霉素、和β-葡聚糖。
在一些情况下，小分子通过结合非编码RNA区域，降低或增加寄宿微生物的基因表达。例如，小分子可以是在编码参与核黄素合成的合酶的信使RNA的非编码区域中，结合“核糖开关”调节域的核糖开关抑制剂，例如ribocil，因此抑制此途径。在另一个情况下，小分子可有效增加或减少导致杀死内共生体的基因表达。在一些情况下，小分子可有效破坏含菌细胞功能。
在一些情况下，小分子改变宿主的体内平衡。例如，小分子可以是类二十烷酸分子，如前列腺素，其激活对唾液腺中的感染连同蛋白胞外分泌的发热反应。除了体内平衡中的持续作用，某些类二十烷酸作用发生在昆虫生活史中的关键点，如在感染攻击和繁殖中的重要事件期间。类二十烷酸介导昆虫中的细胞防御反应。在一个实例中，抑制前列腺素合成严重损害了该昆虫从血淋巴清除细菌的能力。在另一个情况下，小分子可有效增加或降低宿主中对内共生体的免疫应答，或增加或减少宿主中的导致杀死内共生体的发热反应。在一些情况下，小分子可有效破坏含菌细胞功能。
如实例14所示，小分子(例如，前列腺素)可以用作靶向宿主途径的调节剂，其转而改变了宿主中内共生细菌的活性、水平、或代谢，由此调节(例如，降低)该宿主的适合度。
iii.核酸
许多核酸在本文所述的组合物和方法中是有用的。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的核酸(例如，DNA分子或RNA分子，例如，mRNA、指导RNA(gRNA)、或抑制性RNA分子(例如，siRNA、shRNA、或miRNA)，或杂交DNA-RNA分子)，如至少约1个核酸类别或变体，2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个或更多个核酸类别或变体。组合物中每种核酸的合适浓度取决于多种因素，如功效、核酸的稳定性、不同核酸的数量、配制品、以及该组合物的施用方法。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的核酸，每种类型的核酸的浓度可以是相同或不同的。
包括如本文所述的核酸的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内核酸浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内核酸浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内核酸浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
以下讨论的核酸调节剂(包括编码多肽的核酸、合成的RNA、抑制性RNA、和基因编辑系统)可以用于改变宿主中的途径，这些途径介导如在用于增加或减少宿主(例如蚜虫)的适合度的部分中所示的宿主和寄宿于该宿主中的微生物之间的相互作用。
(a)编码多肽的核酸
在一些情况下，组合物包括编码本文所述的多肽中的任一种的核酸。编码多肽的核酸可以具有以下长度：从约10至约50,000个核苷酸(nts)、约25至约100nts、约50至约150nts、约100至约200nts、约150至约250nts、约200至约300nts、约250至约350nts、约300至约500nts、约10至约1000nts、约50至约1000nts、约100至约1000nts、约1000至约2000nts、约2000至约3000nts、约3000至约4000nts、约4000至约5000nts、约5000至约6000nts、约6000至约7000nts、约7000至约8000nts、约8000至约9000nts、约9000至约10,000nts、约10,000至约15,000nts、约10,000至约20,000nts、约10,000至约25,000nts、约10,000至约30,000nts、约10,000至约40,000nts、约10,000至约45,000nts、约10,000至约50,000nts、或介于其间的任何范围。
调节剂还可以包括本文所述的核酸的功能活性变体。在一些情况下，核酸的变体与本文所述的核酸的序列，例如，在指定区域上或在整个序列上具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。在一些情况下，本发明包括由如本文所述的核酸变体编码的功能活性多肽。在一些情况下，由核酸变体编码的功能活性多肽与本文所述的多肽的序列或天然来源的多肽序列，例如，在指定区域上或在整个氨基酸序列上具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。
一些用于表达编码蛋白的核酸的方法可以涉及在适当的启动子控制下，在细胞中表达，这些细胞包括宿主细胞(例如，昆虫细胞、软体动物细胞、或线虫细胞)、酵母细胞、细菌细胞、或其他细胞。表达运载体可以包括非转录元件，如复制起点、合适的启动子和增强子、以及其他5′或3侧翼非转录序列、以及5′或3′非翻译序列，如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、以及终止序列。源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化位点可以用于提供异源DNA序列表达所需的其他遗传元件。在以下文献中描述了用于与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达运载体：Green等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual[分子克隆-实验室手册]，第四版，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]，2012。
使用重组方法的遗传修饰通常是本领域已知的。可以使用本领域已知的重组方法获得编码希望的基因的核酸序列，例如像使用标准技术，通过从表达该基因的细胞中筛选文库、通过从已知包括该基因的运载体获得该基因、或通过从包含该基因的细胞和组织直接分离。可替代地，感兴趣的基因可以是以合成方式产生的，而不是克隆的。
天然的或合成的核酸的表达典型地通过以下实现：将编码感兴趣的基因的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体并入表达运载体。表达运载体可适用于在细菌中复制和表达。表达运载体还可适用于在真核生物中复制和整合。典型的克隆运载体含有转录和翻译终止子、起始序列、和启动子，可用于希望的核酸序列的表达。
另外的启动子元件，例如，增强子，调节转录起始的频率。典型地，这些元件位于起始位点上游30-110个碱基对(bp)的区域中，尽管最近已经显示多个启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当反转元件或使元件相对彼此移动时能够保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加至50bp。取决于启动子，似乎单个元件可以共同地或独立地发挥功能，以激活转录。
合适的启动子的一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这一启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(Elongation Growth Factor-1α，EF-1α)。然而，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、艾普斯登-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)即时早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、连同人类基因启动子(例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子、以及肌酸激酶启动子)。
可替代地，启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，当希望这种表达时，该分子开关能够开启与该启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或当不希望表达时，则能够关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、和四环素启动子。
待引入的表达运载体还可以含有选择性标记基因或报告基因或二者，从而便于从寻求通过病毒运载体转染或感染的细胞的群体中，鉴定和选择表达性细胞。在其他方面，选择性标记物可以在一段单独的DNA上进行，并且用于共转染程序。选择性标记物和报告基因二者侧翼可以是适当的调节序列，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因可以用于鉴定潜在转化的细胞并且用于评估调节序列的功能性。通常，报告基因是不存在于受者来源或不由受者来源表达，并且编码其表达由一些易于检测特性(例如酶活性)所证明的多肽的基因。在DNA已经引入受者细胞之后的合适的时间，测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，FEBSLetters[欧洲生化学会联合会快报]479：79-82，2000)。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知技术制备或以商业途径获得。通常，显示了报告基因的最高表达水平的具有最小5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以连接至报告基因，并且用于评估药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些情况下，生物可以被遗传修饰从而改变一种或多种蛋白的表达。一种或多种蛋白的表达可以被修饰用于具体时间，例如生物的发育或分化状态。在一种情况下，本发明包括用来改变一种或多种蛋白(例如影响活性、结构、或功能的蛋白)的表达的组合物。一种或多种蛋白的表达可以限制在一个或多个具体位置，或遍布整个生物中。
(b)合成的mRNA
调节剂可以包括mRNA分子，例如，编码多肽的合成的mRNA分子。在一些情况下，mRNA分子可以增加药剂(例如正功能调节因子，例如表7、表8、或表9中列出的基因或基因产物)的水平(例如，蛋白和/或mRNA水平)和/或活性。在一些情况下，mRNA分子编码多肽药剂或其片段。例如，mRNA分子可以编码与表7、表8、或表9中列出的药剂(均参考提供的登录号)的氨基酸序列具有至少50％(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、或更大)同一性的多肽。在其他实例中，mRNA分子与编码表7、表8、或表9中列出的药剂的核酸序列具有至少50％(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、或更大)同一性。在一些情况下，mRNA分子编码与表7、表8、或表9中列出的药剂(均参考提供的登录号)的氨基酸序列相差不多于30个(例如，不多于30个、20个、10个、5个、4个、3个、2个、或1个)氨基酸的氨基酸序列。在一些情况下，mRNA分子包括编码表7、表8、或表9中列出的基因或基因产物(均参考提供的登录号)的片段的序列。例如，该片段在长度上包括10-20、20-40、40-60、60-80、80-100、100-120、120-140、140-160、160-180、180-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-600、或更多个氨基酸。在一些情况下，该片段是功能片段，例如其具有表7、表8、或表9中列出的全长基因或基因产物(均参考提供的登录号)的活性的至少20％，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更大。在一些情况下，mRNA分子提高了药剂(或其片段)的水平和/或活性或者对其进行编码。
示例性mRNA分子包括编码选自表7、表8、或表9的任何多肽的RNA。
合成的mRNA分子可以被修饰，例如被化学修饰。mRNA分子可以是化学合成的，或在体外转录。mRNA分子可以设置在质粒上，例如，病毒运载体、细菌运载体、或真核表达运载体。在一些实例中，可以通过转染、电穿孔、或转导(例如，腺病毒或慢病毒转导)，将mRNA分子递送至细胞。
在一些情况下，本文所述的修饰的感兴趣的RNA药剂具有修饰的核苷或核苷酸。此类修饰是已知的，并且描述于以下文献中：例如WO 2012/019168。在以下文献中描述了另外的修饰：例如WO 2015/038892；WO 2015/038892；WO 2015/089511；WO 2015/196130；WO2015/196118和WO 2015/196128 A2。
在一些情况下，编码本文所述的感兴趣的多肽的修饰的RNA具有一个或多个末端修饰，例如5′帽结构和/或多聚A尾(例如，长度在100-200个核苷酸之间)。5′帽结构可以选自下组，该组由以下组成：CapO、Capl、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2′氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、和2-叠氮-鸟苷。在一些情况下，修饰的RNA还含有5′UTR(其包括至少一个Kozak序列)和3′UTR。此类修饰是已知的，并且描述于以下文献中：例如，WO 2012/135805和WO 2013/052523。以下文献中描述了另外的末端修饰，例如，WO2014/164253和WO 2016/011306、WO 2012/045075、以及WO 2014/093924。
用于合成加帽RNA分子(例如，修饰的mRNA)(其可以包括至少一个化学修饰)的嵌合酶描述于WO 2014/028429中。
在一些情况下，修饰的mRNA可以环化或串联，从而产生具有翻译能力的分子，进而辅助多聚A结合蛋白和5′-端结合蛋白之间的相互作用。可以通过至少3种不同途径发生环化或串联机制：1)化学途径，2)酶途径，以及3)核酶催化途径。新形成的5′-/3′-连接可以是分子内或分子间的。描述了此类修饰，例如在WO 2013/151736中。
制造和纯化修饰的RNA的方法是本领域已知的，并且已在本领域披露。例如，仅使用体外转录(IVT)酶合成制造修饰的RNA。制造IVT多核苷酸的方法是本领域已知的，并且描述于以下文献中：WO 2013/151666、WO 2013/151668、WO 2013/151663、WO 2013/151669、WO2013/151670、WO 2013/151664、WO 2013/151665、WO 2013/151671、WO 2013/151672、WO2013/151667和WO 2013/151736。纯化方法包括通过以下纯化包括多聚A尾在内的RNA转录物：在使得RNA转录物结合至与多个胸苷或其衍生物和/或多个尿嘧啶或其衍生物(多聚T/U)连接的表面的条件下使样品与该表面接触，并且从该表面洗脱纯化的RNA转录物(WO2014/152031)；经由可扩展的方法，使用允许长度高达10,000个核苷酸的较长RNA分离的离子(例如阴离子)交换色谱法(WO 2014/144767)；并且使修饰的mRNA样品经受DNA酶处理(WO2014/152030)。
修饰的RNA的配制品是已知的并且描述于例如，WO 2013/090648中。例如，配制品可以是但不限于纳米颗粒、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球、类脂质、脂复合物、脂质体、聚合物、碳水化合物类(包括简单糖)、阳离子脂质、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶、纤维蛋白胶、纤维蛋白封闭剂、纤维蛋白原、凝血酶、快速消除的脂质纳米颗粒(reLNP)及其组合。
在人类疾病、抗体、病毒和多种体内环境的领域中，编码多肽的修饰的RNA是已知的，并且披露于例如国际公开号WO 2013/151666、WO 2013/151668、WO 2013/151663、WO2013/151669、WO 2013/151670、WO 2013/151664、WO 2013/151665、WO 2013/151736的表6中；国际公开号WO 2013/151672的表6和表7中；国际公开号WO 2013/151671的表6、表178和表179中；国际公开号WO 2013/151667的表6、185和186中。可以将以上项中的任一种合成为IVT多核苷酸、嵌合多核苷酸或环状多核苷酸，并且各自可以包括一种或多种修饰的核苷酸或末端修饰。
(c)抑制性RNA
在一些情况下，调节剂包括抑制性RNA分子，例如，该抑制性RNA分子经由RNA干扰(RNAi)途径发挥作用。例如，抑制性RNA分子可以包括靶向宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)中的宿主途径(例如介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如宿主免疫系统途径或含菌细胞途径，例如表8或表9中列出的蛋白或编码这些蛋白的基因，均参考提供的登录号)和/或寄宿微生物中的途径(例如表7中列出的蛋白或编码这些蛋白的基因均参考提供的登录号)的短干扰RNA、短发夹RNA、和/或微小RNA，。某些RNA分子可以通过RNA干扰(RNAi)的生物过程抑制基因表达。RNAi分子包括RNA或RNA样结构，这些结构典型地含有15-50个碱基对(如约18-25个碱基对)，并且具有与细胞内的表达的靶基因中的编码序列同一的(互补的)或接近同一的(基本上互补的)核碱基序列。RNAi分子包括但不限于：短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、部分双链体(meroduplex)、dicer酶底物、和多价RNA干扰(美国专利号8,084,599、8,349,809、8,513,207和9,200,276)。shRNA是包含经由RNAi降低靶基因表达的发夹弯(发夹弯)的RNA分子。可以按质粒的形式，例如，病毒或细菌运载体，例如通过转染、电穿孔、或转导，将shRNA递送至细胞。微小RNA是典型地具有约22个核苷酸的长度的非编码RNA分子。MiRNA结合mRNA分子上的靶位点，并且使该mRNA沉默，例如，通过引起该mRNA的切割，使该mRNA去稳定，或抑制该mRNA的翻译。在一些情况下，抑制性RNA分子降低负功能调节因子的水平和/或活性。在其他实施例中，抑制性RNA分子降低正功能调节因子的抑制剂的水平和/或活性。
RNAi分子包括与靶基因的全部或片段基本上互补、或完全互补的序列。RNAi分子可以与内含子和外显子之间的边界处的序列互补，从而防止特异性基因的新产生的核RNA转录物成熟为用于转录的mRNA。与特异性基因互补的RNAi分子可以与靶基因的mRNA杂交，并且防止其翻译。反义分子可以是DNA、RNA、或其衍生物或杂交体。此类衍生物分子的实例包括但不限于，肽核酸(PNA)和硫代磷酸酯基分子，如脱氧核糖核酸胍(DNG)或核糖核酸胍(RNG)。
RNAi分子可以作为体外合成的“即用型”RNA提供，或作为转染到细胞中的反义基因提供，当转录时，这些细胞将产生RNAi分子。与mRNA杂交导致杂交的分子被RNA酶H降解，和/或翻译复合物的形成的抑制。二者都导致不能产生原始基因的产物。
与感兴趣的转录物杂交的RNAi分子的长度可以是约10个核苷酸，约15或30个核苷酸之间，或约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸。反义序列与靶向的转录物的同一性程度可以是至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。
RNAi分子还可以包括突出端，即典型地不成对的、悬突核苷酸，其不直接参与正常情况下由本文限定的正义链和反义链对的核心序列形成的双螺旋结构。RNAi分子可以含有独立地位于每条正义链和反义链上的约1-5个碱基的3′和/或5′突出端。在一些情况下，正义链和反义链二者都含有3′和5′突出端。在一些情况下，一条链的一个或多个3′突出端核苷酸与另一条链的一个或多个5′突出端核苷酸碱基配对。在其他情况下，一条链的一个或多个3′突出端核苷酸不与另一条链的一个或多个5′突出端核苷酸碱基配对。RNAi分子的正义和反义链可以含有或可以不含有相同数量的核苷酸碱基。反义和正义链可以形成双链体，其中仅5′端具有钝端，仅3’端具有钝端，5′和3′端都是钝端，或5′端和3’端都不是钝端。在另一个情况下，突出端中的一个或多个核苷酸含有硫代磷酸、硫代磷酸酯、反转的脱氧核苷酸(3′至3’连接的)核苷酸，或是修饰的核糖核苷酸或脱氧核苷酸。
小干扰RNA(siRNA)分子包括与靶mRNA的约15至约25个连续核苷酸同一的核苷酸序列。在一些情况下，siRNA序列以二核苷酸AA开始，包括含量为为30％-70％(约30％-60％、约40％-60％、或约45％-55％)的GC，并且与除了待引入其中的基因组中的靶标之外的任何核苷酸序列不具有高同一性百分比，例如，如通过标准BLAST检索确定的。
siRNA和shRNA类似于内源性微小RNA(miRNA)基因的加工途径中的中间体(Bartel，Cell[细胞]116：281-297，2004)。在一些情况下，siRNA可以作为miRNA起作用，反之亦然(Zeng等人，Mol.Cell[分子细胞学]9：1327-1333，2002；Doench等人，Genes Dev.[基因和发育]17：438-442，2003)。外源性siRNA下调与siRNA具有种子互补性的mRNA(Birmingham等人，Nat.Methods[自然方法]3：199-204，2006)。3′UTR内的多个靶位点给出了更强的下调(Doench等人，Genes Dev.[基因和发育]17：438-442，2003)。
已知的有效的siRNA序列和同源结合位点也很好地呈现在相关文献中。通过本领域已知的技术，RNAi分子是易于设计和产生的。此外，存在增加发现有效并且特异性的基序的机会的计算工具(Pei等人，Nat.Methods[自然方法]3(9)：670-676，2006；Reynolds等人，Nat.Biotechnol.[自然生物技术]22(3)：326-330，2004；Khvorova等人，Nat.Struct.Biol.[自然结构生物学]10(9)：708-712，2003；Schwarz等人，Cell[细胞]115(2)：199-208，2003；Ui-Tei等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]32(3)：936-948，2004；Heale等人，NucleicAcids Res.[核酸研究]33(3)：e30，2005；Chalk等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.[生化及生物物理研究通讯]319(1)：264-274，2004；以及Amarzguioui等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.[生化及生物物理研究通讯]316(4)：1050-1058，2004)。
RNAi分子调节由基因编码的RNA的表达。因为多个基因可能彼此共享一定程度的序列同源性，所以在一些情况下，可以设计RNAi分子以靶向具有充分序列同源性的一类基因。在一些情况下，RNAi分子可以含有与在不同基因靶标中共享的序列或对于特异性基因靶标而言是独特的序列具有互补性的序列。在一些情况下，可以设计RNAi分子以靶向在若干基因之间具有同源性的RNA序列的保守区，由此靶向一个基因家族中的若干基因(例如，不同基因同种型、剪接变体、突变基因等)。在一些情况下，可以设计RNAi分子以靶向对于单个基因的特异性RNA序列而言是独特的序列。
在一些情况下，抑制性RNA分子降低宿主组分(例如介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如宿主免疫系统途径或含菌细胞途径中的组分)和/或微生物组分，包括编码表7、表8、或表9中列出的蛋白的基因(均参考提供的登录号)的水平和/或活性。在一些情况下，抑制性RNA分子抑制宿主组分(例如介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如宿主免疫系统途径或含菌细胞途径中的组分)或微生物组分，例如编码表7、表8、或表9中列出的蛋白的基因的表达(例如，抑制翻译成蛋白)。在其他情况下，抑制剂RNA分子增加宿主组分(例如介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如宿主免疫系统途径或含菌细胞途径中的组分)和/或微生物组分，例如编码表7、表8、或表9中列出的蛋白的基因的降解，和/或降低途径组分的稳定性(即半衰期)。抑制性RNA分子可以是化学合成的或在体外转录。
在一些情况下，本文所述的组合物包括RNAi，例如，siRNA，从而调节(例如，抑制)编码调节宿主的免疫系统的本文所述的组分中的任一种的基因的表达。在一些情况下，组合物包括RNAi，例如，siRNA，从而抑制调节(例如抑制)宿主中的含菌细胞的发育或功能的本文所述的基因中的任一种的表达。在一些情况下，调节宿主免疫系统导致该宿主中内共生微生物的减少或杀死，并且转而降低该宿主的适合度。在一些情况下，调节含菌细胞发育和/或功能导致该宿主中内共生微生物的减少或杀死，并且转而降低该宿主的适合度。在一些情况下，RNAi(例如，siRNA)可以抑制Ubx的表达，从而破坏含菌细胞的共生体定位。在一些情况下，RNAi(例如，siRNA)抑制abd-A和Antp的表达，从而破坏含菌体(bacteriome)完整性和定位。
在一些情况下，一种或多种RNAi分子靶向编码任何本文所述的蛋白的任何基因，例如参见表7、表8、或表9。在一些情况下，一种或多种RNAi分子靶向如本文所述的细菌基因。在一些情况下，一种或多种RNAi分子靶向如本文所述的内共生体基因在一些情况下，一种或多种RNAi分子靶向如本文所述的含菌细胞基因。在一些情况下，一种或多种RNAi分子靶向如本文所述的宿主基因。在一些情况下，一种或多种RNAi分子靶向如本文所述的宿主中的免疫系统基因。
抑制性RNA分子可以被修饰，例如，从而含有修饰的核苷酸，例如，2’-氟、2’-邻甲基、2’-脱氧、解锁核酸、2’-羟基、硫代磷酸酯、2’-硫尿核苷、4’-硫尿核苷、2’-脱氧尿苷。不希望受理论约束，据信此类修饰可以增加核酸酶抗性和/或血清稳定性，或降低免疫原性。
在一些情况下，经由生理上不稳定的键或接头将RNAi分子连接至递送聚合物。选择生理上不稳定的接头，使得存在于某些生理条件下时，经历化学转化(例如，切割)(例如，在细胞质的还原性环境下，经二硫键切割)。通过切割生理上不稳定的连接，从聚合物释放分子，促进了分子与对于活性而言适当的细胞组分的相互作用。
可以通过将分子与聚合物共价连接，形成RNAi分子-聚合物偶联物。聚合物是聚合的或修饰的，使得它含有反应性基团A。RNAi分子也是聚合的或修饰的，使得它含有反应性基团B。选择反应性基团A和B，使得可以使用本领域已知的方法，经由可逆的共价键，连接它们。
在过量的聚合物存在下，可以进行RNAi分子与聚合物的偶联。因为在偶联期间，RNAi分子和聚合物可以具有相反的电荷，所以过量的聚合物的存在可以减少或消除偶联物的聚集。可替代地，可以使用过量的运载体聚合物，例如聚阳离子。可以在给予该偶联物之前，从偶联的聚合物去除过量聚合物。可替代地，可以与偶联物一起共给予过量聚合物。
在胚胎发生期间，注射双链RNA(dsRNA)到母体昆虫中有效抑制了其后代的基因表达，参见例如，Khila等人，PLoS Genet.[公共科学图书馆遗传学]5(7)：e1000583，2009；以及Liu等人，Development[发育]131(7)：1515-1527，2004。Matsuura等人(PNAS 112(30)：9376-9381，2015)已经显示，抑制Ubx消除了含菌细胞和含菌细胞的共生体定位。
基于非编码RNA，如核酶、RNA酶P、siRNA、和miRNA的抑制剂的制备和使用也是本领域已知的，例如，如在以下文献中描述的：Sioud，RNA Therapeutics：Function，Design，and Delivery[RNA治疗剂：功能、涉及、和递送](Methods in Molecular Biology[分子生物学 方法]).Humana Press[胡玛纳出版社](2010)。
可以在本文中使用的核酸调节剂的其他实例包括与SEQ ID NO：148-150中的任一项的序列具有至少50％(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、或更大)同一性的dsRNA。
如实例1-4和7-9所示，抑制性RNA(例如，dsRNA或PNA)可以用作调节剂，该调节剂靶向宿主途径(例如，昆虫，例如，蚜虫)，这转而改变寄宿于该宿主中的内共生细菌，如布赫纳氏菌属物种(Buchnera spp)的活性、水平、或代谢，并且由此调节(例如，降低)该宿主的适合度。
(d)基因编辑
本文所述的调节剂可以包括基因编辑系统的组分。例如，在涉及宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的免疫系统或含菌细胞的基因中，或在寄宿于该宿主无脊椎动物中的微生物中的基因中，例如表7、表8、或表9中描述的酶或受体基因(均参考提供的登录号)，药剂可以引入改变(例如插入、缺失(例如敲除)、易位、反转、单点突变、或其他突变)。示例性基因编辑系统包括锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活剂效应因子基核酸酶(TALEN)、和规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)系统。以下文献中描述了基于ZFN、TALEN、和CRISPR的方法：例如Gaj等人，Trends Biotechnol.[生物技术趋势]31(7)：397-405，2013。
在典型的CRISPR/Cas系统中通过靶向单链或双链DNA序列的序列特异性的、非编码“指导RNA”，将内切核酸酶导向靶核苷酸序列(例如，待进行序列编辑的基因组中的位点)。已经鉴定了三个类别(I-III)的CRISPR系统。II类CRISPR系统使用单一Cas内切核酸酶(而不是多种Cas蛋白)。一个II类CRISPR系统包括II型Cas内切核酸酶，如Cas9、CRISPR RNA(“crRNA”)、和反式激活crRNA(“tracrRNA”)。crRNA含有“指导RNA”，即典型地，对应于靶DNA序列的一个约20个核苷酸的RNA序列。crRNA还含有结合tracrRNA的区域，从而形成被RNA酶III切割的部分双链结构，产生crRNA/tracrRNA杂交体。RNA作为指导物以指导Cas蛋白使特异性DNA/RNA序列沉默，这取决于间隔子序列。参见例如，Horvath等人，Science[科学]327：167-170，2010；Makarova等人，Biology Direct[生物学指导]1：7，2006；Pennisi，Science[科学]341：833-836，2013。靶DNA序列必须总体上邻近针对给定Cas内切核酸酶来说是特异性的“原型间隔子邻近基序”(“PAM”)；然而，PAM序列似乎遍布整个给定基因组。从不同原核物种鉴定的CRISPR内切核酸酶具有独特的PAM序列要求；PAM序列的实例包括5’-NGG(SEQID NO：78)(酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))、5’-NNAGAA(SEQ ID NO：79)(嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CRISPR1)、5’-NGGNG(SEQ ID NO：80)(嗜热链球菌CRISPR3)、和5’-NNNGATT(SEQ ID NO：81)(奈瑟氏脑膜炎双球菌(Neisseriameningiditis))。一些内切核酸酶，例如，Cas9内切核酸酶，与富含G的PAM位点(例如，5’-NGG(SEQ ID NO：78))相关，并且在距离PAM位点上游(距离PAM位点的5’)3个核苷酸的位置处，进行靶DNA的钝端切割。另一个II类CRISPR系统包括V型内切核酸酶Cpf1，其比Cas9小；实例包括AsCpf1(来自氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.))和LbCpf1(来自毛螺菌科物种(Lachnospiraceae sp.))。Cpf1相关CRISPR阵列被加工成成熟crRNA，而不需要tracrRNA；换言之，Cpf1系统仅需要Cpf1核酸酶和crRNA来切割靶DNA序列。Cpf1内切核酸酶与富含T的PAM位点，例如，5’-TTN相关。Cpf1还可以识别5’-CTA PAM基序。通过引入具有4个或5个核苷酸的5’突出端的偏移的或交错的双链断裂，Cpf1切割靶DNA，例如切割如下靶DNA，该靶DNA中的5个核苷酸偏移或交错的切割位于距离编码链上的PAM位点下游(距离PAM位点的3’)18个核苷酸的位置处和距离互补链上PAM位点下游23个核苷酸的位置处；源自此类偏移切割的5个核苷酸的突出端允许通过同源重组的DNA插入，而不是通过在钝端切割的DNA的插入，进行更精确的基因组编辑。参见例如，Zetsche等人，Cell[细胞]163：759-771，2015。
出于基因编辑的目的，可以设计CRISPR阵列以含有对应于希望的靶DNA序列的一个或多个指导RNA序列参加例如，Cong等人，Science[科学]339：819-823，2013；Ran等人，Nature Protocols[自然实验手册]8：2281-2308，2013。用于进行DNA切割，Cas9需要gRNA序列的至少约16或17个核苷酸；对于Cpf1，需要gRNA序列的至少约16个核苷酸，从而实现可检测的DNA切割。在实践中，指导RNA序列通常被设计为具有17-24个核苷酸之间(例如，19、20、或21个核苷酸)的长度，并且与靶向的基因或核酸序列互补性。定制的gRNA产生器和算法是可商购的，用于设计有效的指导RNA。使用嵌合的“单指导RNA”(“sgRNA”)，即模拟天然存在的crRNA-tracrRNA复合物并且含有tracrRNA(用于结合核酸酶)和至少一个crRNA(用来指导核酸酶至靶向用于编辑的序列)的工程化(合成的)单RNA分子，已经实现了基因编辑。也已经证明，在基因组编辑中，化学修饰的sgRNA是有效的。参见例如，Hendel等人，NatureBiotechnol.[自然生物技术]985-991，2015。
而在由gRNA靶向的特异性DNA序列上，野生型Cas9产生双链断裂(DSB)，多种具有修饰的功能性的CRISPR内切核酸酶是可得的，例如：Cas9的“切口酶”版本仅产生单链断裂；无催化活性的Cas9(“dCas9”)不切割靶DNA，但是通过位阻干扰转录。dCas9可以进一步与效应因子融合，从而抑制(CRISPRi)或激活(CRISPRa)靶基因的表达。例如，Cas9可以与转录阻遏因子(例如，KRAB结构域)或转录激活剂融合(例如，dCas9-VP64融合物)。融合至FokI核酸酶(“dCas9-FokI”)的无催化活性的Cas9(dCas9)可以用于在与两个gRNA同源的靶序列上产生DSB。参见例如，许多CRISPR/Cas9质粒披露于并且可公开获得自阿德基因质粒库(Addgene repository)(阿德基因公司(Addgene)，西德尼大街75号(Sidney St.)，550A单元，剑桥郡，马萨诸塞州02139；addgene，org/crispr/)。引入两个单独的双链断裂(各自由单独的指导RNA指导)的“双切口酶”Cas9被以下文献描述为实现了更精确的基因组编辑：Ran等人，Cell[细胞]154：1380-1389，2013。
用于编辑真核生物的基因的CRISPR技术披露于以下文献中：美国专利申请公开US2016/0138008 A1和US 2015/0344912 A1，以及美国专利8,697,359、8,771,945、8,945,839、8,999,641、8,993,233、8,895,308、8,865,406、8,889,418、8,871,445、8,889,356、8,932,814、8,795,965、和8,906,616。Cpf1内切核酸酶和对应的指导RNA以及PAM位点披露于美国专利申请公开2016/0208243 A1中。
在一些情况下，希望的基因组修饰涉及同源重组，其中由RNA指导的核酸酶和一种或多种指导RNA产生靶核苷酸序列中的一个或多个双链DNA断裂，随后使用同源重组机制(“同源定向修复”)，修复该一个或多个断裂。在这样的情况下，将编码待在双链断裂处插入或敲入的希望的核苷酸序列的供体模板提供至细胞或受试者；合适的模板的实例包括单链DNA模板和双链DNA模板(例如，与本文所述的多肽连接)。通常，以单链DNA的形式，提供编码小于约50个核苷酸的区域内的核苷酸变化的供体模板；更大的供体模板(例如，多于100个核苷酸)通常作为双链DNA质粒提供。在一些情况下，以足以实现希望的同源定向修复，但是在给定时间段后(例如在一个或多个细胞分裂周期后)不存留于细胞或受试者中的量，将供体模板提供至细胞或受试者。在一些情况下，供体模板具有与靶核苷酸序列(例如同源内源基因组区)相差至少1、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、或更多个核苷酸的核心核苷酸序列。此核心序列侧翼是“同源性臂”或与靶向的核苷酸序列具有高度序列同一性的区域；在一些情况下，具有高度同一性的区域包括在核心序列的每一侧上的至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少750、或至少1000个核苷酸。在一些情况下，其中供体模板处于单链DNA的形式，核心序列侧翼是同源性臂，该同源性臂包括在核心序列的每一侧上的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、或至少100个核苷酸。在多种情况下，其中供体模板处于双链DNA的形式，核心序列侧翼是同源性臂，该同源性臂包括在核心序列的每一侧上的至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、或至少1000个核苷酸。在一种情况下，用“双切口酶”Cas9，将两个单独的双链断裂引入细胞或受试者的靶核苷酸序列(参见Ran等人，Cell[细胞]154：1380-1389，2013)，随后是供体模板的递送。
在一些情况下，该组合物包括gRNA和靶向的核酸酶，例如，Cas9，例如，野生型Cas9、切口酶Cas9(例如，Cas9 D10A)、失活Cas9(dCas9)、eSpCas9、Cpf1、C2C1、或C2C3，或编码这样的核酸酶的核酸。通过靶向的突变是否是核苷酸的缺失、取代、或添加，例如靶向的序列的核苷酸缺失、取代、或添加，确定核酸酶和一种或多种gRNA的选择。无催化活性的内切核酸酶，例如，失活Cas9(dCas9，例如，D10A、H840A)与(一个或多个)效应因子结构域的全部或一部分(例如生物活性部分)链连的融合物产生可有与多肽连接的嵌合蛋白，从而通过一个或多个RNA序列(sgRNA)指导该组合物至特定的DNA位点，进而调节一个或多个靶核酸序列的活性和/或表达。
在多种情况下，药剂包括指导RNA(gRNA)，用于进行基因编辑的CRISPR系统。在一些情况下，药剂包括锌指核酸酶(ZFN)，或编码ZFN的mRNA，其靶向(例如，切割)涉及宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)和/或寄宿微生物中的途径(例如，介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如，宿主免疫系统途径或含菌细胞途径)的基因，例如，编码表7、表8、或表9中列出的蛋白(均参考提供的登录号)的基因的核酸序列(例如，DNA序列)。在一些情况下，药剂包括TALEN，或编码TALEN的mRNA，其靶向(例如，切割)涉及宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)和/或寄宿微生物中的途径(例如，介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如，宿主免疫系统途径或含菌细胞途径)的基因，例如，编码表7、表8、或表9中列出的蛋白(均参考提供的登录号)的基因中的核酸序列(例如，DNA序列)。
例如，gRNA可以用于CRISPR系统，从而将涉及宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)和/或寄宿微生物中的途径(例如，介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如，宿主免疫系统途径或含菌细胞途径)的基因，例如，编码表7、表8、或表9中列出的蛋白(均参考提供的登录号)的基因中的改变工程化。在其他实例中，ZFN和/或TALEN可用于将涉及宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)和/或寄宿微生物中的途径(例如，介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如，宿主免疫系统途径或含菌细胞途径)的基因，例如，编码表7、表8、或表9中列出的蛋白(均参考提供的登录号)的基因中的改变工程化。示例性改变包括插入、缺失(例如，敲除)、易位、反转、单点突变、或其他突变。可以将改变引入细胞中的基因中，例如体外、离体、或体内进行。在一些实例中，改变增加了涉及宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)和/或寄宿微生物中的途径(例如，介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如，宿主免疫系统途径或含菌细胞途径)的基因，例如，编码表7、表8、或表9中列出的蛋白(均参考提供的登录号)的基因的水平和/或活性。在其他实例中，改变降低了涉及宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)和/或寄宿微生物中的途径(例如，介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如，宿主免疫系统途径或含菌细胞途径)的基因，例如，编码表7、表8、或表9中列出的蛋白(均参考提供的登录号)的基因的水平和/或活性(例如敲低或敲除)。仍在另一个实例中，改变校正了涉及宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)和/或寄宿微生物中的途径(例如，介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如，宿主免疫系统途径或含菌细胞途径)的基因，例如，编码表7、表8、或表9中列出的蛋白(均参考提供的登录号)的基因中的缺陷(例如，引起缺陷的突变)。
在一些情况下，将CRISPR系统用于编辑(例如添加或使碱基对缺失)靶基因(例如涉及宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)和/或寄宿微生物中的途径，例如，介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如，宿主免疫系统途径或含菌细胞途径的基因)，例如，编码表7、表8、或表9中列出的蛋白(均参考提供的登录号)的基因。在其他情况下，将CRISPR系统用于引入提前终止密码子，例如由此降低靶基因的表达。仍在其他情况下，将CRISPR系统用于以可逆的方式，例如类似于RNA干扰，关闭靶基因。在一些情况下，将CRISPR系统用于将Cas指导至基因的启动子，由此以位阻方式阻断RNA聚合酶。
在一些情况下，可以产生CRISPR系统，从而使用描述于以下文献中的技术，编辑涉及宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)和/或寄宿微生物中的途径(例如，介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如，宿主免疫系统途径或含菌细胞途径)的基因，例如，编码表7、表8、或表9中列出的蛋白(均参考提供的登录号)的基因：例如，美国公开号20140068797，Cong，Science[科学]339：819-823，2013；Tsai，Nature Biotechnol.[自然生物技术]32：6569-576，2014；美国专利号：8,871,445、8,865,406、8,795,965、8,771,945、和8,697,359。
在一些情况下，CRISPR干扰(CRISPRi)技术可以用于具体基因，例如编码宿主免疫系统或含菌细胞组分(例如本文所述的酶或受体)的基因的转录抑制。在CRISPRi中，工程化的Cas9蛋白(例如，无核酸酶的dCas9、或dCas9融合蛋白，例如，dCas9-KRAB或dCas9-SID4X融合物)可以与序列特异性指导RNA(sgRNA)配对。Cas9-gRNA复合物可以阻断RNA聚合酶，由此干扰转录延伸。该复合物还可以通过干扰转录因子结合，阻断转录起始。CRISPRi方法是特异性的，具有最小的脱靶效应并且是可多路共用的，例如可以同时抑制多于一个基因(例如，使用多个gRNAs)。而且，CRISPRi方法允许可逆的基因抑制。
在一些情况下，CRISPR介导的基因激活(CRISPRa)可以用于本文所述的一个或多个基因(例如，编码表7、表8、或表9中列出的蛋白中的任一种的基因)的转录激活。在CRISPRa技术中，dCas9融合蛋白募集了转录激活剂。例如，dCas9可以与多肽(例如，激活域)，如VP64或p65激活域(p65D)融合，并且与sgRNA(例如，单个sgRNA或多个sgRNAs)一起使用，从而激活一个或多个基因，例如宿主或寄宿于该宿主中的微生物中的一个或多个内源基因。可以使用多种sgRNA募集多种激活剂-这可以增加激活功效。可以使用多种激活域和单个或多个激活域。除了将dCas9工程化来募集激活剂，还可以将sgRNA工程化来募集激活剂。例如，可以将RNA适配体并入sgRNA来募集蛋白(例如，激活域)，如VP64。在一些实例中，协同激活介导因(SAM)系统可以用于转录激活。在SAM中，将MS2适配体添加至sgRNA。MS2募集融合至p65AD和热休克因子1(HSF1)的MS2外壳蛋白(MCP)。
以下文献更详细地描述了CRISPRi和CRISPRa技术例如，Dominguez等人，Nat.Rev.Mol.CellBiol.[自然综述分子细胞生物学]17：5-15，2016，将其通过引用并入本文。此外，使用如在Dominguez等人中描述的CRISPR系统，dCas9介导的外遗传修饰和同时的激活与抑制可以用于调节本文所述的宿主或微生物途径(例如，介导宿主-微生物区系相互作用的途径，例如，宿主免疫系统途径或含菌细胞途径)的组分，例如，编码表7、表8、或表9中列出的蛋白(均参考提供的登录号)的基因。
iv.靶基因和蛋白
本文所述的调节剂中的任一种可以用于改变(例如，增加或减少)基因表达，改变(例如，增加或减少)靶蛋白活性，和/或改变该宿主或寄宿于该宿主中的微生物的功能。可以靶向多个过程中涉及的蛋白或基因，包括表6中列出的功能类别中的任一种。
表6：靶基因的功能类别
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(a)靶微生物基因和蛋白
本文所述的调节剂中的任一种可以用于改变寄宿于该宿主中的微生物中的基因表达或靶蛋白。在一些情况下，调节剂(例如，抗体)直接靶向寄宿于该宿主中的微生物中的蛋白，包括表7中列出的蛋白中的任一种。在其他情况下，与未被给予调节剂的宿主生物相比，调节剂(例如，核酸，例如，RNAi)改变寄宿于该宿主中的微生物中的基因表达(例如，增加或减少基因表达)，包括编码表7中列出的蛋白中的任一种的基因。
表7：靶细菌蛋白
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(b)宿主中的靶基因和蛋白
本文所述的调节剂中的任一种可以用于改变宿主中的基因表达或靶蛋白。在一些情况下，调节剂(例如，抗体)直接靶向宿主中的蛋白，包括表8或表9中列出的蛋白中的任一种。在其他情况下，调节剂(例如，核酸，例如，RNAi)靶向宿主中的基因，包括编码表8或表9中列出的蛋白中的任一种的基因。例如，与未被给予调节剂的宿主生物相比，本文所述的核酸可以用于改变(例如，增加或减少)宿主中的基因表达(例如调节含菌细胞功能或发育的基因(例如，含菌细胞调节肽)，或调节免疫系统的基因)，包括但不限于表8和表9中列出的基因中的任一种。
表8：调节含菌细胞功能的蛋白
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在一些情况下，与未被给予调节剂的宿主生物相比，本文提供的方法或组合物可以有效降低宿主对寄生物或病原体(例如真菌的、细菌的、或病毒的病原体或寄生物)的抗性。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中找到的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使宿主对病原体或寄生物(例如，真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体；或者寄生螨)的抗性降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，相对于未给予调节剂的宿主生物，调节剂可有效改变宿主的先天性免疫系统，从而间接改变宿主中的微生物多样性。无脊椎动物表现出多种免疫反应，其中的一些与哺乳动物中发现的免疫机制是同源的。其他综述已经总结了昆虫中先天免疫的总则(Lemaitre等人，Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度评论]25：697-743，2007；Charroux等人，Fly[蝇]4：40-47，2010；Ganesan等人.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.[微生物学与免疫学研究现状]349：25-60，2011；Chambers等人，Curr.Opin.Immunol.[免疫学新见]24：10-14，2012)。例如，在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中，在肠上皮细胞层中存在实现局部免疫的两种主要的可诱导应答：AMP的产生和活性氧(ROS)的合成。尽管这两种诱导的应答都可以被视为经典抗性机制，但二者都包括负反馈回路和调节组分，其可以赋予宿主对共栖的肠微生物区系的耐受性。
共生细菌的肠的定殖可以诱导免疫致敏事件，导致不仅针对共栖细菌的重新定殖，而且也针对病原体的免疫应答的激活或改变。肠微生物区系不仅对于致敏针对细菌的宿主，例如针对疟原虫属(Plasmodium)的蚊子的免疫系统是必需的，而且对于用细菌重新激发宿主时引起致敏应答也是必需的。在蚊子中，细菌依赖型致敏应答特征在于原血细胞分化为粒细胞，并且存在增加数量的具有改变的形态学和结合特性的循环粒细胞。在另一个实例中，采采蝇(tsetse fly)细菌共生体，包括肠栖γ变形菌门(Gammaproteobacterium)S.glossinidius，在幼虫发育期间是必需的，使得成蝇可以呈现锥虫不应(trypanosome-refractory)表型。在这种情况下，细菌似乎影响了成虫围食膜基质的形成和完整性，由此间接调节了采采蝇检测并且响应锥虫存在的能力。
在一些情况下，通过调节剂的产生调节免疫应答。例如，在黑腹果蝇的全身免疫应答中，Toll和IMD是诱导抗微生物肽(AMP)产生的两种主要信号传导途径。在病原体暴露时，仅IMD途径具有活性，并且触发局部AMP应答。通过使细菌肽聚糖(PGN)的不同变体与属于肽聚糖识别蛋白(PGRP)家族的细胞外或细胞内上皮细胞受体结合使激活发生。在细胞质中，蛋白Pirk隔离了特异性PGN结合受体(PGRP-LC)，由此减少了定位至细胞表面的这些受体的数量，并且阻碍了IMD途径信号传导。经由酰胺酶和Pirk的上调，PGRP-LE确保了对共栖微生物区系的免疫耐受性。经由IMD途径的下游信号传导导致了转录因子Relish的激活，这转而诱导了若干AMP和其他免疫相关基因的表达。PGRP-LE诱导了对致病细菌的Relish依赖型免疫应答。经由酰胺酶和Pirk的上调，PGRP-LE也确保了对共栖微生物区系的免疫耐受性。
通过结合启动子区，同源异型盒转录因子Caudal特异性抑制了肠中的AMP基因转录。Caudal缺陷引起了组成型AMP产生发生，以及肠微生物区系改变。在一个实施例中，IMD途径被灭活，从而限制一个或多个AMP和/或免疫相关基因的表达，例如caudal缺陷，由此激活对肠微生物区系的免疫应答。
在一些情况下，经由膜相关双重氧化酶(DUOX)系统，暴露于肠中的病原体触发ROS的产生。例如，在黑腹果蝇中，PGN依赖型和PGN独立型信号传导途径产生ROS，其不仅引起对细菌的氧化应激，而且也引起对宿主的上皮细胞的氧化应激。通过激活免疫反应性过氧化氢酶，黑腹果蝇消除了过量的ROS。由于可能通过局部地限制的过氧化氢酶活性，减少了细菌诱导的免疫应答引起的自伤，这种过氧化氢酶产生导致例如对上皮表面附近增加的耐受性。在一个实施例中，免疫反应性过氧化氢酶被灭活或抑制，从而维持经由DUOX系统的ROS产生，以及经由PGN依赖型和PGN独立型信号传导途径的氧化应激，从而激活对肠微生物区系的免疫应答。
在一些情况下，与未被给予调节剂的宿主生物相比，调节剂可有效改变(例如，增加或减少)宿主中的基因表达，从而增加或减少宿主的免疫系统应答或免疫调节信号传导，例如，对寄宿于该宿主中的微生物(例如，寄宿于宿主含菌细胞中的微生物)的免疫系统应答。含菌细胞中的免疫系统相关基因/蛋白的非限制性实例显示在表9中。
表9：调节含菌细胞的免疫调节蛋白
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Figure BDA0002155467980002011
v.作为调节剂的细菌
在一些情况下，本文所述的调节剂包括一种或多种细菌。许多种细菌在本文所述的组合物和方法中是有用的。在一些情况下，该药剂是在宿主中内源发现的细菌物种。在一些情况下，该细菌调节剂是内共生细菌物种。在一些情况下，细菌调节剂是宿主中的病原体。可用作调节剂的细菌的非限制性实例包括具体实施方式的部分II中本文所述的所有细菌物种和表1中列出的那些细菌物种。例如，该调节剂可以是来自宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)肠中存在的任何细菌门的细菌物种，包括γ变形菌门(Gammaproteobacteria)、α变形菌门(Alphaproteobacteria)、β变形菌门(Betaproteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)(例如，乳杆菌属(Lactobacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)物种)、梭菌属(Clostridia)、放线菌属(Actinomycetes)、螺旋体属(Spirochetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、和放线菌门(Actinobacteria)。
在一些情况下，细菌可以用作调节剂，从而刺激宿主中的免疫应答，这导致一种或多种寄宿于该宿主中的微生物的水平、多样性、或代谢的降低。在一些情况下，将细菌作为活细菌细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)细胞)递送。可替代地，细菌可以作为热灭活细菌细胞(例如，热灭活大肠杆菌(E.coli)细胞)递送。在其他情况下，细菌可以作为裂解物(例如，从裂解的全细胞制备)或其级分递送。
在一些情况下，调节剂包括如本文所述的遗传修饰的或转化的细菌。在一些情况下，细菌是遗传修饰的。例如，可以经由使用本领域中的标准方法(例如，转导、转化、或偶联)，将遗传物质引入细菌中来修饰细菌，由此修饰或改变细菌的细胞生理学和/或生物化学。通过引入遗传物质，修饰的细菌可以获得新功能或特性。在一些情况下，遗传修饰的细菌可以产生和分泌本文所述的调节剂。例如，遗传修饰的细菌可以产生靶向具体的宿主内共生体或其他寄宿于该宿主中的微生物的多肽、小分子、或核酸。在一些情况下，遗传修饰的细菌可以用于产生刺激宿主免疫应答的产物。
在一些情况下，提供基因工程化的或转化的细菌，来赋予宿主新的功能性。新的功能性可以包括，例如，降解杀有害生物剂(例如，杀昆虫剂、杀软体动物剂、或杀线虫剂；例如表11中列出的杀有害生物剂)、植物化感物质、或产生营养物的能力。例如，可以从杀有害生物剂(例如，杀昆虫剂、杀软体动物剂、或杀线虫剂；例如表11中列出的杀有害生物剂)抗性有害生物分离的天然存在的细菌，例如来自昆虫点蜂缘蝽(Riptortus pedestris)的伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)菌株，产生遗传修饰的细菌。当将来自杀昆虫剂抗性有害生物的细菌与分离自感兴趣的宿主(例如，蜜蜂)的共栖细菌一起培养时，可以将赋予杀昆虫剂抗性的基因(例如使用杀昆虫剂作为碳源的能力)转移至感兴趣的宿主(例如，蜜蜂)的共生细菌。然后可以将遗传修饰的细菌重新引宿主，例如，蜜蜂，并且通过在富含杀昆虫剂的环境中繁殖它们来选择杀昆虫剂抗性昆虫。可以修饰通常存在于宿主中的任何细菌门以具有新功能性，包括但不限于γ变形菌门(Gammaproteobacteria)、α变形菌门(Alphaproteobacteria)、β变形菌门(Betaproteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)(包括乳杆菌属(Lactobacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)物种)、梭菌属(Clostridia)、放线菌属(Actinomycetes)、螺旋体属(Spirochetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、放线菌门(Actinobacteria)等。
细菌可以被遗传修饰，从而降低宿主的适合度，或杀死宿主。在一些情况下，细菌可以被遗传修饰，从而改善其在宿主细胞中的存活，从而增加其对宿主细胞的毒性，和/或从而提供降低宿主的适合度的功能(例如，对杀有害生物剂，例如，表11中列出的杀有害生物剂的降低的抗性)。在一些情况下，细菌被修饰，从而不再合成其典型地提供给宿主细胞的必需分子。在一些情况下，细菌被遗传修饰，使得细菌的群体增加至负面影响宿主的水平，例如通过必需材料或机制的过量利用，或通过与寄宿于该宿主中的有益微生物竞争。在一些情况下，在进一步的人为干预后，细菌仅杀死宿主。
可以使用本领域已知的任何方法，产生本文所述的遗传修饰的细菌。例如，用于递送核酸至细菌的方法包括但不限于不同的化学的、电化学的和生物的方法，例如热休克转化、电穿孔、转染，例如脂质体介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或磷酸钙转染。在一些情况下，使用用于转移遗传物质的媒介物、或运载体，将核酸构建体，例如，包括至少一个核酸序列的表达构建体引入细菌。用于将遗传物质转移至细菌的运载体是本领域技术人员熟知的，并且包括例如质粒、人工染色体、以及病毒运载体。用于构建核酸构建体(包括表达构建体(包括组成型或诱导型异源启动子)、敲除和敲低构建体)的方法，连同用于递送核酸或核酸构建体至细菌的方法和运载体是本领域技术人员熟知的，并且描述于以下文献中：例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第3版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，2001；Amberg等人，Methods in Yeast Genetics：ACold Spring Harbor Laboratory Course Manual[酵母遗传实验方法：冷泉港实验课手册]，冷泉港实验室出版社，2005；Abelson等人，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology[酵母遗传学和分子生物学指南]，A部分，卷194(Methods in Enzymology Serie[酶学系列方法]，194)，Academic Press[学术出版社]，2004；Guthrie等人，Guide toYeast Genetics and Molecular and Cell Biology[酵母遗传学和分子与细胞生物学指南]，第1版，B部分，卷350(Methods in Enzymology[酶学方法]，卷350)，Academic Press[学术出版社]，2002；Stephanopoulos 等人，Metabolic Engineering：Principles andMethodologies[代谢工程：原理与方法]，第1版，Academic Press[学术出版社]，1998；以及Smolke，The Metabolic Pathway Engineering Handbook：Fundamentals[代谢途径工程手册-基本原理]，第1版，CRCPress[CRC出版社]，2009，将所有这些文献通过引用以其全文并入本文。
vi.作为调节剂的真菌
在一些情况下，本文所述的调节剂包括一种或多种真菌。在组合物和方法中，许多真菌是有用的。例如，真菌调节剂可以是酵母，如酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)。
在一些情况下，真菌(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)或毕赤酵母(P.Pastoris))可以用作调节剂，从而刺激宿主中的免疫应答，这导致一种或多种寄宿于该宿主中的微生物(例如，细菌或真菌)的水平、多样性、或代谢的降低。在一些情况下，真菌可以作为活的真菌细胞(例如，毕赤酵母(P.pastoris)细胞，参见实例15)递送。可替代地，真菌可以作为热灭活真菌细胞(例如热灭活酿酒酵母细胞)递送。在其他情况下，真菌可以作为裂解物(例如，从裂解的全细胞制备)或其级分递送。
在一些情况下，调节剂包括如本文所述的遗传修饰的或转化的真菌。在一些情况下，真菌是遗传修饰的。例如，可以经由使用本领域中的标准方法将遗传物质引入真菌中来修饰真菌，由此修饰或改变真菌的细胞生理学和/或生物化学。通过引入遗传物质，修饰的真菌可以获得新功能或或特性。在一些情况下，遗传修饰的真菌可以产生和分泌本文所述的调节剂。在一些情况下，遗传修饰的真菌可以用于产生刺激宿主免疫应答的产物。
在一些情况下，提供基因工程化的或转化的真菌，来赋予宿主新的功能性。新的功能性可以包括，例如，降解杀有害生物剂(例如，杀昆虫剂)、植物化感物质、或产生营养物的能力。可以遗传修饰通常存在于宿主中的任何真菌门以具有新功能性，包括但不限于假丝酵母属(Candida)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、德巴利酵母属(Debaromyces)、休哈塔假丝酵母(Scheffersomyces shehatae)和树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipite)、Starmerella、毕赤酵母属(Pichia)、毛孢子菌属(Trichosporon)、隐球菌属(Cryptococcus)、南极假丝酵母属(Pseudozyma)，以及来自盘菌亚门(subphylumPezizomycotina)的酵母样共生体(例如，Symbiotaphrina bucneri和Symbiotaphrinakochii)。
如实例15所示，酵母，例如毕赤酵母可以用作调节剂，其刺激宿主免疫应答(例如，在昆虫，例如，蚜虫中)，这转而改变寄宿于该宿主中的内共生细菌，如布赫纳氏菌属物种(Buchnera spp)的活性、水平、或代谢，并且由此调节(例如，降低)该宿主的适合度。
vii.对调节剂的修饰
在一些情况下，可以修饰核酸分子、肽、多肽、或抗体分子。例如，修饰可以是化学修饰，例如偶联至标记，例如荧光标记物或放射性标记物。在其他实例中，修饰可以包括与如下部分偶联或操作性连接，该部分增强药剂(例如脂质、聚糖、聚合物(例如PEG)、阳离子部分)的稳定性、递送、靶向、生物利用度、或半衰期。
(a)融合
本文所述的任何调节剂可以与另外的部分融合或连接。在一些情况下，该调节剂包括一种或多种另外的部分(例如，1种另外的部分、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种另外的部分)的融合。在一些情况下，该另外的部分是本文所述的调节剂(例如，肽、多肽、小分子、或抗生素)中的任一者。可替代地，该另外的部分本身可以不充当调节剂，而是可以起辅助作用。例如，该另外的部分可以帮助调节剂在宿主中的靶位点(例如，宿主肠或宿主含菌细胞)处或在寄宿于宿主中的靶微生物处接近、结合或激活。
在一些情况下，该另外的部分可以帮助调节剂渗透寄宿于宿主中的靶宿主细胞或靶微生物。例如，该另外的部分可以包括细胞穿透肽。细胞穿透肽(CPP)可以是衍生自以下的天然序列：蛋白质；通过两个天然序列的融合形成的嵌合肽；或合成的CPP，它们是基于结构-活性研究的合成设计的序列。在一些情况下，CPP具有普遍穿过具有有限毒性的细胞膜(例如，原核细胞膜和真核细胞膜)的能力。此外，CPP可能具有经由能量依赖性和/或独立机制，同时不需要特异性受体的手性识别而穿过细胞膜的能力。CPP的非限制性实例列于表10中。
表10：细胞穿透肽(CPP)的实例
Figure BDA0002155467980002071
在一些情况下，另外的部分是肽核酸(PNA)。肽核酸(PNA)包括连接至酰胺主链的一个或多个核酸侧链。PNA中的一个或多个氨基酸单元具有含酰胺主链，例如氨乙基-甘氨酸，类似于肽主链，具有代替氨基酸侧链的核酸侧链。已知PNA与互补DNA和RNA杂交，具有与其寡核苷酸对应物更高的亲合力。PNA的此特征不仅使得本发明的多肽与核酸侧链稳定杂交，而且同时，中性主链和疏水侧链在多肽内生成疏水单元。PNA部分的实例包括：包括肽的分子，如CPP(例如与SEQ ID NO：106具有至少80％(例如80％、90％、95％、97％、99％、或更大)同一性的氨基酸序列)，以及与SEQ ID NO：105或151-153中的任一种的序列具有至少80％(例如80％、90％、95％、97％、99％、或更大)同一性的核苷酸序列。
核酸侧链包括但不限于嘌呤或嘧啶侧链，如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、和尿嘧啶。在一种情况下，核酸侧链包括核苷类似物，如5-氟尿嘧啶；5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、4-甲基苯并咪唑、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、二氢尿苷、β-D-半乳糖基辫苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(beta-D-mannosylqueosine)、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶(acp3U)、2，6-二氨基嘌呤、3-硝基吡咯、肌苷、硫尿核苷、辫苷(queuosine)、怀俄苷、二氨基嘌呤、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、二氨基嘧啶、2，4-二氟甲苯、异喹啉、吡咯并[2，3-β]吡啶、以及可以与嘌呤或嘧啶侧链碱基配对的任何其他物质。
在其他情况下，该另外的部分帮助调节剂结合寄宿于宿主的靶微生物(例如，真菌或细菌)。该另外的部分可以包括一个或多个靶向结构域。在一些情况下，该靶向结构域可以将调节剂靶向寄宿于宿主肠中的一种或多种微生物(例如，细菌或真菌)。在一些情况下，该靶向结构域可以将调节剂靶向宿主的特异性区域(例如，宿主肠或含菌细胞)以接近通常存在于所述宿主区域中的微生物。例如，该靶向结构域可以将调节剂靶向宿主的前肠、中肠或后肠。在其他情况下，该靶向结构域可以将调节剂靶向宿主中的含菌细胞和/或寄宿于宿主含菌细胞中的一种或多种特异性细菌。
(b)前结构域(Pre-domain或Pro-domain)
在一些情况下，该调节剂可以包括前氨基酸序列(pre-amino acid sequence或pro-amino acid sequence)。例如，该调节剂可以是可以通过前序列(pre-sequence或pro-sequence)的切割或翻译后修饰来激活的无活性蛋白质或肽。在一些情况下，该调节剂是用失活的前序列(pre-sequence或pro-sequence)工程化的。例如，该前序列(pre-sequence或pro-sequence)可以模糊调节剂上的激活位点(例如受体结合位点)，或可以诱导调节剂的构象变化。因此，在切割前序列(pre-sequence或pro-sequence)后，该调节剂被激活。
可替代地，该调节剂可以包括前小分子(pre-small molecule或pro-smallmolecule)，例如抗生素。该调节剂可以是可以在宿主内的靶环境中被激活的本文所述的无活性小分子。例如，该小分子可在宿主肠中达到一定pH时被激活。
(c)接头
在调节剂与另外的部分连接的情况下，该调节剂可以进一步包括接头。例如，该接头可以是化学键，例如一个或多个共价键或非共价键。在一些情况下，该接头可以是肽接头(例如，2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、20、25、30、35、40、或更多个氨基酸长)。该接头可能包括本文所述的任何柔性、刚性或可裂解的接头。
柔性肽接头可以包括本领域常用的任何接头，包括具有主要具有Gly和Ser残基的序列的接头(“GS”接头)。柔性接头可以有用于连接需要一定程度的移动或相互作用的结构域，并且可以包括小的、非极性的(例如Gly)或极性的(例如Ser或Thr)氨基酸。
可替代地，肽接头可以是刚性接头。刚性接头有用于保持各部分之间的固定距离并维持它们的独立功能。当结构域的空间分离对于保持融合中一种或多种组分的稳定性或生物活性至关重要时，刚性接头也可以是有用的。例如，刚性接头可以具有α螺旋结构或富含脯氨酸的序列(Pro-rich sequence)、(XP)n，其中X表示任何氨基酸，优选Ala、Lys或Glu。
在又其他情况下，肽接头可以是可裂解的接头。在一些情况下，接头可以在特异性条件下(例如在还原剂或蛋白酶的存在下)裂解。体内可裂解接头可利用二硫键的可逆性质。一个实例包括两个Cys残基之间的凝血酶敏感性序列(例如，PRS)。CPRSC的体外凝血酶处理导致凝血酶敏感性序列的切割，而可逆的二硫键保持完整。此类接头是已知的并且描述于，例如，Chen等人，Adv.Drug Deliv.Rev.[先进药物输送评论]65(10)：1357-1369，2013。融合中接头的切割也可以通过在宿主或寄宿于宿主中的微生物的特异性细胞或组织的条件下体内表达的蛋白酶进行。在一些情况下，接头的切割可在到达靶位点或细胞时释放游离的功能调节剂。
本文所述的融合可以可替代地通过连接分子连接，这些连接分子包括疏水接头，如带负电荷的磺酸酯基团；脂质，如聚(--CH2--)烃链，如聚乙二醇(PEG)基团，其不饱和变体，其羟基化变体，其酰胺化或其他含N的变体，非碳接头；碳水化合物接头；磷酸二酯接头，或能够共价连接两个或多个分子(例如两种调节剂)的其他分子。可以使用非共价接头(如调节剂与之连接的疏水性脂质小球)例如通过调节剂的疏水区域或调节剂的疏水延伸，如富含亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、或者也可能是丙氨酸、苯丙氨酸、或甚至酪氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸的一系列残基或其他疏水残基。该调节剂可以使用基于电荷的化学连接，使得调节剂的带正电荷的部分与另一种调节剂或另外的部分的带负电荷的部分连接。
IV.配制品和组合物
可以将本文所述的组合物以纯的形式(例如，组合物仅含有调节剂)配制或与一种或多种另外的药剂(如赋形剂、递送媒介物、载体、稀释剂、稳定剂等)一起配制以促进组合物的施用或递送。合适的赋形剂和稀释剂的实例包括但不限于：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水溶液、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
在一些情况下，该组合物包括递送媒介物或载体。在一些情况下，该递送媒介物包括赋形剂。示例性赋形剂包括但不限于：固体或液体载体材料、溶剂、稳定剂、缓释赋形剂、色素和表面活性物质(表面活性剂)。在一些情况下，该递送媒介物是稳定性媒介物。在一些情况下，该稳定性媒介物包括稳定赋形剂。示例性稳定赋形剂包括但不限于：环氧化植物油、消泡剂(例如硅油)、防腐剂、粘度调节剂、粘合剂和增粘剂。在一些情况下，该稳定性媒介物是适用于调节剂的缓冲液。在一些情况下，将组合物微囊包封在聚合物珠递送媒介物中。在一些情况下，该稳定性媒介物保护调节剂免受UV和/或酸性条件的影响。在一些情况下，该递送媒介物含有pH缓冲液。在一些情况下，将组合物配制为具有在约4.5至约9.0的范围内的pH，包括例如范围在5.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约6.5至约7.0中的任一者的pH。
取决于预期的目的和当时环境，可以将组合物配制为可乳化的浓缩物、悬浮浓缩物、可直接喷雾的溶液或可稀释的溶液、可涂覆的膏剂、稀释的乳液、喷雾粉剂、可溶性粉剂、可分散性粉剂、可湿性粉剂、尘剂、粒剂、聚合物质中的包封物、微胶囊、泡沫、气溶胶、二氧化碳气体制剂、片剂、树脂制剂、纸制剂、非织造织物制剂、或针织织物制剂或机织织物制剂。在一些情况下，该组合物是液体。在一些情况下，该组合物是固体。在一些情况下，该组合物是气溶胶，如在加压气溶胶罐中。在一些情况下，该组合物存在于有害生物的废物(如粪便)中。在一些情况下，该组合物存在于活有害生物中或活有害生物上。
在一些情况下，该递送媒介物是宿主的食物或水。在其他情况下，该递送媒介物是宿主的食物来源。在一些情况下，该递送媒介物是宿主的食物诱饵。在一些情况下，该组合物是被宿主食用的可食用试剂。在一些情况下，该组合物通过宿主被递送至第二宿主，并被第二宿主食用。在一些情况下，该组合物被宿主或第二宿主食用，并且该组合物经由宿主或第二宿主的废物(如粪便)释放到宿主或第二宿主的周围。在一些情况下，该调节剂包括于旨在由宿主食用或携带回其集落的食物诱饵中。
在一些情况下，该递送媒介物是细菌运载体。可以使用本领域已知的任何合适的克隆方法和药剂(如在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]，ColdSpring Harbor[冷泉港]，纽约，1989中所述的)将调节剂掺入细菌运载体中。如本文所用的“细菌运载体”是指任何遗传元件，如质粒、细菌噬菌体运载体、转座子、粘粒和染色体，该遗传元件能够在细菌细胞内复制并且能够在细胞之间转移基因。示例性细菌运载体包括但不限于：λ媒介系统gtl 1，gt WES.tB，Charon 4和质粒运载体，如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKClOl、SV 40、pBluescript IISK+/-或KS+/-(参见“Stratagene克隆系统”目录，Stratagene公司，加利福尼亚州拉荷亚，1993)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(参见Studier等人，“Use of T7 RNA Polymerase toDirect Expression of Cloned Genes，”[使用T7 RNA聚合酶指导克隆基因的表达]GeneExpression Technology[基因表达技术]第185卷，1990)，及其任何衍生物。
每种细菌运载体可以编码一种或多种调节剂。在一些情况下，细菌运载体包括编码在靶共生细菌或宿主细菌中表达的多肽的核酸分子。在一些情况下，细菌运载体包括编码将在靶细菌中表达的细菌素的核酸分子。在一些情况下，细菌运载体进一步包括一种或多种调节元件，如启动子、终止信号、以及转录和翻译元件。在一些情况下，调节序列可操作地连接至编码待在靶共生细菌中表达的基因的核酸(例如本文所述的核酸中的任一种)。
在一些情况下，将细菌运载体引入细菌中以供宿主或宿主的集落中的成员食用。在一些情况下，该细菌是靶共生细菌。在一些情况下，该细菌是宿主肠的天然存在的细菌，或其遗传修饰的衍生物，其可以通过摄取容易地引入宿主中。用于在携带细菌运载体中使用的示例性细菌包括但不限于：变形菌门(Proteobacter)(包括假单胞菌属(Pseudomonas)；不动杆菌属(Actinobacter)，包括丙酸菌属(Priopionibacterium)和棒状杆菌属(Corynebacterium))；厚壁菌门(Firmicutes)，包括支原体属(Mycoplasma)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)属的任一物种；纤维杆菌门(Fibrobacteres)，螺旋体属(Spirochaetes)(包括密螺旋体属(Treponema)和包柔氏螺旋体属(Borrelia))；拟杆菌(Bacteroide)(包括拟杆菌属(Bacteroide)和黄杆菌属(Flavobacterium))。还合适的是：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括沙雷氏菌属(Serratia)，包括但不限于黏质沙雷氏菌(S.marcescens)、嗜虫沙雷氏菌(S.entomophila)、变形斑沙雷氏菌(S.proteamaculans))的任何细菌；肠杆菌属(Enterobacter)(包括但不限于阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产气肠杆菌(E.aerogenes)、溶解肠杆菌(E.dissolvens)、集聚肠杆菌(E.agglomerans)、E.hafiiiae)的任何物种；以及属于以下属的任何物种：柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、克吕沃氏菌属(Kluyvera)、泛菌属(Pantoea)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌(Salmonella)、致病杆菌属(Xenorhabdus)、和预研菌属(Yokenella)。
在一些情况下，该调节剂可占该组合物的约0.1％至约100％，如约0.01％至约100％、约1％至约99.9％、约0.1％至约10％、约1％至约25％、约10％至约50％、约50％至约99％、或约0.1％至约90％的活性成分(例如，多肽、核酸、小分子、或其组合)中的任一者。在一些情况下，组合物至少包括0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更多活性成分(例如，多肽、核酸、小分子、或其组合)中的任一者。在一些情况下，优选浓缩剂作为商业产品，最终使用者通常使用稀释药剂(具有显著较低浓度的活性成分)。
本文所述的任何配制品能以诱饵、蚊香、电蚊香片、烟制剂、熏剂或片剂的形式使用。
i.液体配制品
本文提供的组合物可以是液体配制品的形式。液体配制品通常与水混合，但在一些情况下可与作物油、柴油燃料、煤油或其他轻油一起用作载体。活性成分的量的范围通常为按重量计从约0.5％至约80％。
可乳化的浓缩物配制品可含有液体活性成分，一种或多种基于石油的溶剂，和允许配制品与水混合形成乳液的药剂。此类浓缩物可用于农业、观赏植物和草坪、林业、建筑业、食品加工、畜牧业、和公共卫生有害生物配制品。这些可适用于从小型便携式喷雾器到液压喷雾器、小容量地面喷雾器、弥雾器弥雾机和小容量飞机喷雾器的施用设备。一些活性成分易溶于液体载体中。当与载体混合时，它们形成不会沉淀或分离的溶液，例如均相溶液。这些类型的配制品可以包括活性成分、载体和一种或多种其他成分。溶液可用于室内和室外任何类型的喷雾器。
在一些情况下，可以将该组合物可以配制为逆乳液。逆乳液是分散在油载体中的水溶性活性成分。逆乳液需要乳化剂，其允许活性成分与大量基于石油的载体(通常为燃料油)混合。逆乳液有助于减少漂移。对于其他配制品，当水滴在到达靶表面之前开始蒸发时会产生一些喷雾漂移；结果，液滴变得非常小且重量轻。由于油的蒸发速度比水慢，因此逆乳液液滴收缩较少，并且更多的活性成分到达靶。油进一步有助于减少径流并改善抗雨性。它还通过改善表面覆盖和吸收作为粘展剂。由于液滴相对较大且较重，因此难以在叶子的下侧进行彻底覆盖。最常沿着路域(rights-of-way)(其中漂移到易受影响的非靶区域)使用的逆乳液可能是一个问题。
可流动或液体配制品结合了可乳化浓缩物和可湿性粉剂的许多特征。当活性成分是不溶于水或油的固体时，制造商使用这些配制品。将浸渍在如黏土的物质上的活性成分研磨成非常细的粉剂。然后将粉剂悬浮在少量液体中。得到的液体产品很稠。可流动物和液体具有可乳化浓缩物的许多特征，并且它们具有类似的缺点。它们需要适度的搅拌以使它们保持悬浮并留下可见的残留物，类似于可湿性粉剂中的那些。
可流动物/液体易于处理和施用。因为它们是液体，所以它们会溢出和溅出。它们含有固体颗粒，因此会导致喷嘴和泵的磨损。可流动物和液体悬浮液在其容器中沉淀。由于可流动物和液体配制品倾向于沉淀，因此在五加仑或更少的容器中包装使得更容易再混合。
气溶胶配制品含有一种或多种活性成分和溶剂。大多数气溶胶含有低百分比的活性成分。有两种类型的气溶胶配制品-通常可在加压密封容器中使用的即用型，和用于电动或汽油动力气溶胶发生器(将配制品释放为烟或雾)的那些产品。
即用型气溶胶配制品通常是小型的独立单元，在喷嘴阀被触发时释放配制品。在压力下通过惰性气体驱动配制品穿过细孔，产生细小液滴。这些产品用于温室、建筑物内的小区域或小范围的室外区域。具有五至5磅的活性成分的商业模型通常是可再填充的。
烟或雾气溶胶配制品不在压力条件下。它们用于使用快速旋转盘或加热表面将液体配制品破碎成细水雾或雾(气溶胶)的机器中。
ii.干配制品或固体配制品
干配制品可分为两种类型：即用型和必须与水混合以作为喷雾施用的浓缩物。大多数尘剂配制品都可以即刻使用，并且含有低百分比的活性成分(按重量计小于约10％)，加上由滑石、白垩、黏土、坚果壳或火山灰制成的非常细的干惰性载体。单个尘剂颗粒的大小各不相同。一些尘剂配制品是浓缩物，并且含有高百分比的活性成分。在施用前将它们与干惰性载体混合。尘剂总是干燥使用，并且很容易漂移到非靶位点。
iii.粒剂或丸剂配制品
在一些情况下，将该组合物配制为粒剂。粒剂配制品类似于尘剂配制品，除了粒剂颗粒更大更重。粗颗粒可以由如黏土、玉米芯或胡桃壳之类的材料制成。活性成分涂覆在粒剂外面或被吸收进其中。活性成分的量可以相对较低，通常范围为按重量计从约0.5％至约15％。粒剂配制品最常用于施用于土壤，生活在土壤中的昆虫、软体动物、或线虫，或通过根吸收到植物中。粒剂配制品有时通过飞机或直升机施用，以最小化漂移或以渗透茂密的植被。一旦施用，粒剂可缓慢释放活性成分。一些粒剂需要土壤水分来释放活性成分。粒剂配制品也用于控制幼虫蚊子和其他水生有害生物。粒剂用于农业、建筑业、观赏植物、草坪、水生动物、道路和公共卫生(咬虫)有害生物控制操作。
在一些情况下，将该组合物配制为丸剂。大多数丸剂配制品与粒剂配制品非常相似；这些术语可互换使用。然而，在丸剂配制品中，所有颗粒具有相同的重量和形状。颗粒的均匀性允许与精密施用设备一起使用。
iv.粉剂
在一些情况下，将该组合物配制为粉剂。在一些情况下，将该组合物配制为可湿性粉剂。可湿性粉剂是干燥的，精细研磨的配制品，看起来像尘剂。它们通常必须与水混合用于作为喷雾施用。然而，一些产品可以作为尘剂或可湿性粉剂施用-选择取决于上涂装置。可湿性粉剂含有按重量计约1％至约95％的活性成分；在一些情况下超过约50％。这些颗粒不溶于水。它们很快沉淀，除非经常搅拌以使其悬浮。它们可用于大多数有害生物问题，并且也可用于大多数可以搅拌的喷雾设备。可湿性粉剂具有优异的残留活性。由于它们的物理特性，大多数配制品保留在经处理的多孔材料(例如混凝土)、石膏和未经处理的木材的表面上。在此类情况下，只有水渗透材料。
在一些情况下，将该组合物配制为可溶性粉剂。可溶性粉剂配制品看起来像可湿性粉剂。然而，当与水混合时，可溶性粉剂容易溶解并形成真溶液。将它们彻底混合后，不需要另外的搅拌。可溶性粉剂中活性成分的量通常范围为按重量计从约15％至约95％，在一些情况下超过约50％。可溶性粉剂具有可湿性粉剂的所有优点，并且除了混合期间的吸入危害外，不具有可湿性粉剂的任何缺点。
在一些情况下，将该组合物配制为水可分散性粒剂。水可分散性粒剂，也称为干可流动物，就像可湿性粉剂(除了不是尘剂样外)，它们被配制为易于测量的粒剂。水可分散性粒剂必须与水混合才能施用。一旦进入水中，粒剂就会分解成类似于可湿性粉剂的细颗粒。该配制品需要恒定搅拌以使其悬浮在水中。活性成分的百分比很高，通常按重量计高达90％。水可分散性粒剂(除了它们更容易测量和混合)具有许多与可湿性粉剂相同的优点和缺点。由于尘剂较少，因此在处理期间对上涂装置的吸入危害较小。
v.诱饵
在一些情况下，该组合物包括诱饵。诱饵可以是任何合适的形式，如固体、膏剂、丸剂或粉状形式。诱饵也可以被该宿主带回到所述宿主的群体(例如，集落或蜂巢)。然后诱饵可以充当该集落的其他成员的食物来源，从而为大量宿主和潜在的整个宿主集落提供有效的调节剂。
诱饵可以提供于合适的“壳体”或“捕获器”中。此类壳体和捕获器是可商购的，并且现有的捕获器可以被调适成包括本文所述的组合物。壳体或捕获器可以是例如盒形的，并且可以在预成型条件下提供，或者可以例如由可折叠纸板形成。用于壳体或捕获器的合适材料包括塑料和纸板，特别是瓦楞纸板。捕获器的内表面可以内衬有粘性物质，以限制宿主一旦在捕获器内的移动。壳体或捕获器可以内部含有合适的槽，它可以将诱饵保持在适当位置。捕获器与壳体是有区别的，因为宿主在进入后不能容易地离开捕获器，而壳体充当“进食站”，其为宿主提供优选的环境，在该环境中它们可以进食并且远离捕食者而感到安全。
vi.引诱剂
在一些情况下，该组合物包括引诱剂(例如，化学引诱剂)。引诱剂可以将成虫宿主或未成熟宿主(例如，幼虫)吸引到组合物的附近。引诱剂包括信息素，一种由动物，特别是宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)分泌的化学物质，其影响同一物种的其他个体的行为或发育。其他引诱剂包括糖和蛋白水解产物糖浆、酵母和腐肉。引诱剂还可以与活性成分组合并喷雾到处理区域中的叶子或其他物品上。
已知各种引诱剂影响宿主行为，例如宿主对食物、产卵或交配地点或配偶的搜索。可用于本文所述方法和组合物的引诱剂包括，例如，丁香酚、丙酸苯乙酯、乙基二甲基异丁基环丙烷羧酸酯、丙基苯并二噁烷羧酸酯、顺式-7，8-环氧-2-甲基十八烷、反式-8、反式-0-十二碳二烯醇、顺式-9-十四烯醛(具有顺式-11-十六烯醛)、反式-11-十四烯醛、顺式-11-十六烯醛、(Z)-11，12-十六碳二烯醛、顺式-7-十二烯基乙酸酯、顺式-8-十二烯基乙酸酯、顺式-9-十二烯基乙酸酯、顺式-9-十四碳烯基乙酸酯、顺式-11-十四碳烯基乙酸酯、反式-11-十四碳烯基乙酸酯(具有顺式-11)、顺式-9、反式-11-十四碳二烯基乙酸酯(具有顺式-9、反式-12)、顺式-9、反式-12-十四碳二烯基乙酸酯、顺式-7、顺式-11-十六碳双烯乙酸酯(具有顺式-7、反式-11)、顺式-3、顺式-13-十八碳二烯基乙酸酯、反式-3、顺式-13-十八碳二烯基乙酸酯、茴香脑和异戊基水杨酸盐。
除化学引诱物之外的其他方法也可用于吸引宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)，包括各种波长或颜色的光。
vii.纳米胶囊/微胶囊/脂质体
在一些情况下，将组合物以微胶囊化配制品提供。将微胶囊化配制品与水混合并以与其他可喷雾配制品相同的方式喷雾。喷雾后，塑料涂层破裂并缓慢释放活性成分。
viii.载体
可配制本文所述的任何组合物以包括本文所述的调节剂和惰性载体。此类载体可以是固体载体、液体载体、凝胶载体和/或气体载体。在某些情况下，该载体可以是种子涂层。种子涂层是任何非天然存在的配制品，其全部或部分地粘附于种子表面。该配制品可以进一步包含佐剂或表面活性剂。该配制品还可以包含一种或多种调节剂以扩大作用光谱。
用于配制品的固体载体包括黏土(例如高岭土、硅藻土、膨润土、Fubasami黏土、酸性黏土等)、合成水合氧化硅、滑石、陶瓷、其他无机矿物质(例如，绢云母、石英、硫磺、活性炭、碳酸钙、水合二氧化硅等)、可以升华并在室温下呈固体形式的物质(例如，2，4，6-三异丙基-1，3，5-三氧杂环己烷、萘、对二氯苯、樟脑(camphor)、刚烷等)的细粉剂或粒剂；羊毛；蚕丝；棉花；大麻；纸浆；合成树脂(例如，聚乙烯树脂，如低密度聚乙烯、直低密度聚乙烯和高密度聚乙烯；乙烯-乙烯酯共聚物，如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物，如乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物和乙烯-甲基丙烯酸乙酯共聚物；乙烯-丙烯酸酯共聚物，如乙烯-丙烯酸甲酯共聚物和乙烯-丙烯酸乙酯共聚物；乙烯-乙烯基羧酸共聚物，如乙烯-丙烯酸共聚物；乙烯-四环十二烯共聚物；聚丙烯树脂，如丙烯均聚物和丙烯-乙烯共聚物；聚-4-甲基戊烯-1、聚丁烯-1、聚丁二烯、聚苯乙烯；丙烯腈-苯乙烯树脂；苯乙烯类弹性体，如丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂、苯乙烯-共轭二烯嵌段共聚物、和苯乙烯-共轭二烯嵌段共聚物氢化物；氟树脂；丙烯酸树脂，如聚(甲基丙烯酸甲酯)；聚酰胺树脂，如尼龙6和尼龙66；聚酯树脂，如聚乙烯对苯二甲酸酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚丁烯对苯二甲酸酯、和聚对苯二甲酸亚环己基二亚甲酯；聚碳酸酯、聚缩醛、聚丙烯酰砜、聚芳酯、羟基苯甲酸聚酯、聚醚酰亚胺、聚酯碳酸酯、聚苯醚树脂、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚氨酯、和有孔树脂(如发泡聚氨酯、发泡聚丙烯、或发泡乙烯等))、玻璃、金属、陶瓷、纤维、布料、针织物、片材、纸张、纱线、泡沫、有孔物质和复丝。
液体载体可以包括，例如，芳香族或脂肪族碳氢化合物(例如，二甲苯、甲苯、烷基萘、苯基二甲苯基乙烷、煤油、瓦斯油、己烷、环己烷等)、卤代烃(例如，氯苯、二氯甲烷、二氯乙烷、三氯乙烷等)、醇类(例如，甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、己醇、苄基醇、乙二醇等)、醚类(例如，乙醚、乙二醇二甲醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单乙醚、丙二醇单甲醚、四氢呋喃、二噁烷等)、酯类(例如，乙酸乙酯、乙酸丁酯等)、酮类(例如，丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、环己酮等)、腈类(例如，乙腈、异丁腈等)、亚砜(例如，二甲亚砜等)、酰胺(例如，N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺)、环状亚胺(例如N-甲基吡咯烷酮)、亚烷基碳酸酯(例如，碳酸丙烯酯等)、蔬菜油(例如，大豆油、棉花籽油等)、植物精油(例如，橙油、海索油、柠檬油等)、或水。
气体载体可以包括，例如丁烷气、氟里昂气、液化石油气(LPG)、二甲醚和二氧化碳气体。
ix.佐剂
在一些情况下，本文提供的组合物可以包括佐剂。佐剂是不具有活性的化学物质。将佐剂在配制品中预混合或添加至喷雾罐中以改善混合或改善施用或提高性能。它们广泛用于为叶子施用而设计的产品中。佐剂可用于为特异性需要而定制配制品并补偿局部条件。佐剂可以设计用于执行特异性功能，包括润湿、涂抹、粘附、减少蒸发、减少挥发、缓冲、乳化、分散、减少喷雾漂移和减少发泡。没有单一佐剂可以执行所有这些功能，但是通常可以组合相容的佐剂以同时执行多种功能。
包含于配制品中的佐剂的非限制性实例包括：粘合剂、分散剂和稳定剂，具体为例如，酪蛋白、明胶、多糖(例如，淀粉、阿拉伯树胶、纤维素衍生物、海藻酸等)、木质素衍生物、膨润土、糖、合成水溶性聚合物(例如，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸等)、PAP(酸性异丙基磷酸酯)、BHT(2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚)、BHA(2-叔丁基-4-甲氧基苯酚和3-叔丁基-4-甲氧基苯酚的混合物)、植物油、矿物油、脂肪酸和脂肪酸酯。
x.表面活性剂
在一些情况下，本文提供的组合物包括表面活性剂。表面活性剂，也称为润湿剂和涂布剂，在物理上改变喷雾液滴的表面张力。为了使配制品能够正常发挥其功能，喷雾液滴必须能够润湿叶子并均匀地散布在叶上。表面活性剂扩大了配制品的覆盖面积，从而增加了有害生物对化学物质的暴露。当将配制品施用于蜡质或多毛的叶时，表面活性剂特别重要。如果没有适当的润湿和涂布，喷雾液滴通常会流失或无法充分覆盖叶表面。然而，过多的表面活性剂会导致过多的径流并降低功效。
表面活性剂按其电离或分裂成称为离子的带电荷的原子或分子的方式分类。带负电荷的表面活性剂是阴离子的。带正电荷的表面活性剂是阳离子的，而不带电荷的表面活性剂是非离子的。在非离子表面活性剂存在下的配制品活性可以与在阳离子或阴离子表面活性剂存在下的活性完全不同。选择错误的表面活性剂会降低杀有害生物剂产品的功效并损害靶植物。当与接触杀有害生物剂(通过直接接触而不是系统吸收来控制有害生物的杀有害生物剂)一起使用时，阴离子表面活性剂是最有效的。阳离子表面活性剂绝不能用作独立的表面活性剂，因为它们通常具有植物毒性。
通常与系统杀有害生物剂一起使用的非离子表面活性剂有助于杀有害生物剂喷雾渗透植物角质层。非离子表面活性剂与大多数杀有害生物剂相容，并且大多数需要表面活性剂的EPA注册的杀有害生物剂推荐使用非离子型。佐剂包括但不限于黏着剂、增量剂、植物渗透剂、相容剂、缓冲液或pH改性剂、漂移控制添加剂、消泡剂、和增稠剂。
本文所述的组合物中包括的表面活性剂的非限制性实例包括烷基硫酸酯盐、烷基磺酸酯、烷基芳基磺酸酯、烷基芳基醚及其聚氧乙烯化产物、聚乙二醇醚、多元醇酯和糖醇衍生物。
xi.组合
在配制品和由这些配制品制备的使用形式中，调节剂可以处于含有其他活性化合物(例如杀有害生物剂(例如杀昆虫剂、杀菌剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或杀真菌剂；例如，表11中列出的杀有害生物剂)、引诱剂、生长调节物质或除草剂)的混合物中。如本文所用的，术语“杀有害生物剂”是指旨在用于预防、破坏、抵制或减轻任何有害生物的任何物质或物质的混合物。杀有害生物剂可以是用于对抗有害生物(包括与人类竞争食物、破坏财产、传播疾病或是令人讨厌的昆虫、软体动物、病原体、杂草、线虫、和微生物)的化学物质或生物制剂。术语“杀有害生物剂”可以进一步涵盖其他生物活性分子，如抗生素、抗病毒杀有害生物剂、抗真菌剂、抗蠕虫剂、营养物、花粉、蔗糖和/或使昆虫运动减弱或减缓的药剂。
在将调节剂施用于植物的情况下，也可以使用含有其他已知化合物(例如除草剂、肥料、生长调节剂、安全剂、化学信息素)或用于改善植物特性的药剂的混合物。
V.递送
本文所述的宿主可以以允许将组合物递送或给予至宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的任何合适方式而暴露于本文所述的任何组合物。调节剂可以单独递送或与其他活性或非活性物质组合递送，并且可以通过例如喷雾、显微注射、通过植物、倾倒、浸渍，以配制以递送有效浓度的调节剂的浓缩液体、凝胶、溶液、悬浮液、喷雾、粉剂、丸剂、块剂、砖剂等形式施用。施用本文所述的组合物的量和位置通常取决于宿主的习性、宿主微生物可被调节剂靶向的生命周期阶段、将施用的位置、以及调节剂的物理和功能特征。本文所述的调节剂可通过经口摄取给予至宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)，但也可通过允许穿透角质层或穿透宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)呼吸系统的方式给予。
在一些情况下，可以用包括调节剂的溶液简单地“浸泡”或“喷雾”无脊椎动物宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)。可替代地，调节剂可以与无脊椎动物宿主(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的食物成分(例如，可食用组分)连接以便于递送和/或为了增加宿主对调节剂的摄取。用于经口引入的方法包括，例如将调节剂与宿主的食物直接混合，将调节剂喷雾在宿主的生境或田地中，以及工程化方法，其中将用作食物的物种工程化以表达调节剂，然后向有待被影响的宿主饲喂该物种。在一些情况下，例如，该调节剂组合物可以掺入昆虫的饮食中或覆盖在宿主的饮食的顶部。例如，可以将该调节剂组合物喷雾到宿主栖息的作物田地上。
在一些情况下，通过例如背包喷雾、空中喷雾、作物喷雾/尘剂等将组合物直接喷雾到植物(例如作物)上。在将调节剂递送至植物的情况下，接受调节剂的植物可以处于植物生长的任何阶段。例如，配制的调节剂可以在植物生长的早期阶段作为种子涂层或根处理施用，或者在作物周期的后期作为总植物处理施用。在一些情况下，该调节剂可以作为局部制剂施用于植物，使得宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)在摄取或以其他方式与植物接触时与植物相互作用。
此外，可以将调节剂(例如，在植物生长的土壤中，或在用于浇灌植物的水中)作为通过植物组织或动物宿主而吸收和分布的内吸剂(systemic agent)施用，使得其上进食的宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)将获得有效剂量的调节剂。在一些情况下，可以对植物或食物生物进行遗传转化以表达调节剂，使得以植物或料饵生物为食的宿主摄取调节剂。
延迟或持续释放也可以通过将调节剂或含有一种或多种调节剂的组合物涂覆有可溶解或生物可侵蚀涂层(例如明胶)(该涂层在使用环境中溶解或侵蚀，以使得该调节剂可用)或通过将药剂分散在可溶解或可侵蚀的基质中来实现。此类持续释放和/或分配方式装置可有利地用于在特异性宿主生境中始终维持本文所述的一种或多种调节剂的有效浓度。
可替代地，在细菌或真菌细胞中表达调节剂，并且由宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)物种摄取或进食该细菌或真菌细胞。细菌或真菌可以被工程化，从而产生本文所述的调节剂中的任一种。在其他情况下，也可以使用病毒，如特异性感染宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的杆状病毒。这确保对哺乳动物，尤其是人类和动物的安全性，因为病毒将不感染哺乳动物。
调节剂也可以掺入宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)生长、生活、繁殖、进食或侵染的培养基中。例如，调节剂可以掺入食物容器、进食站、保护性包装或蜂巢中。对于一些施用，该调节剂可以与固体支持物结合，用于以粉剂形式或于“捕获器”或“进食站”中施用。例如，对于其中组合物用于捕获器或作为特定宿主无脊椎动物(例如，昆虫、软体动物、或线虫)的诱饵的施用，该组合物也可以结合到固体支持物上或包封在定时释放材料中。例如，可以通过递送该组合物至该农业有害生物(例如，蚜虫)生长、生活、繁殖或进食的至少一个生境中，给予本文所述的该组合物。
i.工程化的植物
术语“基因工程化的植物”或“转基因植物”是指表达调节剂的植物细胞或植物。转基因植物还旨在包括此类转基因植物的任一代的子代(子孙、后代等)，或所有此类转基因植物的任一代的种子，其中所述子代或种子包括调节剂。
本领域技术人员将认识到，本领域存在多种转化技术，并且新技术不断变得可供使用。可以采用适用于靶宿主植物的任何技术。例如，构建体可以以多种形式引入，包括但不限于DNA链、质粒、或人工染色体。可以通过多种技术实现将构建体引入靶植物细胞，这些技术包括但不限于异源核酸的农杆菌介导的转化、电穿孔、显微注射、微弹轰击磷酸钙-DNA共沉淀或脂质体介导的转化。植物的转化优选是永久的，即通过将引入的表达构建体整合到宿主基因组中，使得引入的构建体被传递到连续的植物世代。
任何植物物种都可以被转化以产生转基因植物。该转基因植物可以是双子叶植物或单子叶植物。例如并且非限制性地，本文所述的组合物和方法的转基因植物可以衍生自以下双子叶植物家族中的任一种：豆科(Leguminosae)，包括豌豆、苜蓿和大豆等植物；伞形科(Umbelliferae)，包括胡萝卜和芹菜等植物；茄科(Solanaceae)，包括番茄、马铃薯、茄子、烟草、和辣椒等植物；十字花科(Cruciferae)，尤其是芸苔属(Brassica)(其包括油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜和西蓝花等植物)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)；菊科植物(Compositae)，其包括莴苣等植物；锦葵科(Malvaceae)，其包括棉花；蝶形花科(Fabaceae)，其包括花生等植物。本发明的转基因植物可衍生自单子叶植物，例如像小麦、大麦、高粱、小米、黑麦、黑小麦、玉蜀黍、水稻、燕麦、柳枝稷、芒属植物和甘蔗。本发明的转基因植物还具体化为树木，如苹果树、梨树、榅桲树、李子树、樱桃树、桃树、油桃树、杏树、番木瓜树、芒果树和其他木本物种(包括松柏科和落叶树木，如杨树、松树、红杉、雪松、橡树、柳树等)。
可以使用能够驱动感兴趣的植物表达的任何启动子。对于植物宿主，启动子可以是天然的或类似的或外源的或异源的。待包括的启动子的选择取决于若干因素，包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、希望的表达水平、和细胞或组织优先表达。对本领域技术人员而言的常规问题是通过相对于序列适当地选择并且定位启动子和其他调节区来调节该序列的表达。
为了驱动在绿色组织，例如叶和茎中转录，特别有兴趣的是在光合组织中有活性的启动子。最合适的是唯一地或主要地在此类组织中驱动表达的启动子。启动子可以赋予组成性地遍布植物的表达，或相对于绿色组织差异地表达，或相对于其中发生表达的绿色组织的发育阶段差异地表达，或响应外部刺激的表达。
这类启动子的实例包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子，如来自美洲落叶松(Larix laricina)的RbcS启动子、松树cab6启动子(Yamamoto等人，Plant CellPhysiol.[植物与细胞生理学]35：773-778，1994)、来自小麦的Cab-1基因启动子(Fejes等人，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]15：921-932，1990)、来自菠菜的CAB-1启动子(Lubberstedt等人，Plant Physiol.[植物生理学]104：997-1006，1994)、来自水稻的cab1R启动子(Luan等人，Plant Cell[植物细胞]4：971-981，1992)、来自玉米的丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)启动子(Matsuoka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90：9586-9590，1993)、烟草Lhcb1*2启动子(Cerdan等人(1997)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]33：245-255)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)SUC2蔗糖-H+同向转运体启动子(Truemit等人，Planta[植物]196：564-570，1995)、以及来自菠菜的类囊体膜蛋白启动子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS)。驱动在茎、叶和绿色组织中转录的其他启动子描述于美国专利公开号2007/0006346中。TrpA启动子是髓偏好性启动子，并且已经描述于美国专利号6,018,104中。
以下文献已经描述了编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉蜀黍基因：Hudspeth等人(PlantMolec.Biol.[植物分子生物学]12：579-589，1989)。使用标准分子生物学技术，针对此基因的启动子可以用于以绿色组织特异性的方式，驱动任何基因在转基因植物中表达。
在一些其他情况下，诱导型启动子是希望的。诱导型启动子响应外部刺激，如化学药剂或环境刺激，驱动转录。例如，诱导型启动子可以以响应激素，如赤霉酸或乙烯，或响应光或干旱，赋予转录。
VI.筛选
可以从筛选测定分离本文所述的调节剂中的任一种，其中筛选调节剂的文库(例如起始调节剂的变体的混合物)中的调节剂(例如调节剂变体)，筛选出的调节剂可有效改变宿主(例如，昆虫/软体动物/线虫)的微生物区系，并且由此调节(例如，增加或减少)宿主适合度。
例如，本文提供的筛选测定可以有效鉴定一种或多种调节剂(例如，多肽、核酸、小分子、或其组合)，该调节剂靶向寄宿于该宿主中的共生微生物，并且由此降低宿主的适合度。例如，鉴定的调节剂(例如，多肽、核酸、小分子、或其组合)可以有效减少杀有害生物剂或降解化感物质的微生物(例如，细菌，例如降解表11中列出的杀有害生物剂的细菌)的生存力，从而增加宿主对杀有害生物剂(例如，对表11中列出的杀有害生物剂的敏感性)或化感剂的敏感性。
可替代地，筛选测定可以用于鉴定调节剂，该调节剂可有效增加宿主适合度(例如，昆虫、软体动物、或线虫适合度)。例如，筛选测定可以用于鉴定一种或多种调节剂，该一种或多种调节剂靶向具体的微生物和/或具体的宿主。此外，筛选测定可以用于鉴定调节剂，这些调节剂提供具有增强的功能性的一种或多种微生物。例如，筛选测定可有效分离调节剂，这些调节剂向一种或多种微生物提供增强的能力的，该能力是代谢(例如降解)杀有害生物剂(例如，杀昆虫剂，例如，新烟碱)或植物化感物质(例如，咖啡因、大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂、杀螟松、单萜类、二萜酸、或酚类化合物(例如，丹宁酸、类黄酮))。分离的微生物在宿主中的递送和定殖可以增加该宿主对杀有害生物剂或植物化感物质的抗性，由此增加宿主适合度。这些方法对于分离调节剂也是有用的，这些调节剂向微生物提供增强的能力，该能力是在本文所述的宿主中的任一种中定殖。
表11：杀有害生物剂
Figure BDA0002155467980002301
Figure BDA0002155467980002311
实例
以下是本发明的方法的实例。应理解，鉴于以上提供的一般性描述，可以实践各种其他的实施例。
实例1：从玉米叶蚜虫幼虫(玉米蚜(Rhopalosiphum maidis))产生cDNA文库。
本实例证明了从玉米叶蚜虫幼虫(玉米蚜(Rhopalosiphum maidis))产生cDNA文库。
实验设计：
为了产生文库，使用以下基于苯酚/TRI
Figure BDA0002155467980002321
的方法(分子研究中心(MOLECULAR RESEARCH CENTER)，辛辛那提(Cincinnati)，俄亥俄州)纯化来自0.9g整个一龄幼虫(孵化后4至5天；保持在16℃)的RNA。将幼虫在室温下在15mL匀浆器中与10mL的TRI
Figure BDA0002155467980002322
匀浆，直至获得均匀的悬浮液。在室温下孵育5min后，将匀浆分配到1.5mL微量离心管(每管1mL)中，添加200μL氯仿，并将混合物剧烈振荡15秒。允许在室温下静置提取液10min后，通过在4℃以12,000×g离心分离各相。将上层相(包括约0.6mL)小心地转移到另一个无菌1.5mL管中，并添加等体积的室温异丙醇。在室温下孵育5至10min后，将该混合物以12,000×g(4℃或25℃)离心8min。
小心去除上清液并弃去，并且通过用75％乙醇涡旋来洗涤RNA沉淀两次，每次洗涤后以7,500×g(4℃或25℃)离心回收5min。小心地去除乙醇，允许该沉淀风干3至5min，并且然后溶解在无核酸酶的无菌水中。通过测量260nm和280nm处的吸光度(A)来确定RNA浓度。将提取的RNA储存在-80℃直至进一步处理，并且通过将等分试样通过1％琼脂糖凝胶来确定RNA质量。
使用随机引发将幼虫总RNA转化为cDNA文库。使幼虫cDNA文库在EUROFINS MWGOperon公司通过GS FLX 454 TitaniumTM系列化学以1/2板规模进行测序，产生平均阅读长度为348bp的超过600,000个读数。350,000个读数被组合成超过50,000个重叠群。使用公开可得的程序FORMATDB(可从NCBI获得)将未组合的读数和重叠群两者转化为BLASTable数据库。
实例2：Bcr1 dsRNA的产生和纯化
本实例证明了从cDNA文库中产生和纯化合成的dsRNA。
实验设计：
Bcr1基因(ACYPI32128)是用于含菌细胞调节并在昆虫中起作用的必需基因。Bcr1cDNA由实例1中描述的幼虫总RNA制备，并且针对Bcr1 dsRNA合成，使用以下引物对通过PCR制备：正向5′-aaactgctgcatggctttct-3′(SEQ ID NO：90)和反向5′-acaggcctttcaggctttta-3′(SEQ ID NO：91)。对于靶基因区，进行两次单独的PCR扩增。第一次PCR扩增在扩增的正义链的5′端引入T7启动子序列(TTAATACGACTCACTATAGGGAGA；SEQ IDNO：92)。第二次反应在反义链的5′端掺入T7启动子序列。然后将靶Bcr1基因的每个区的两个PCR扩增的片段以等量混合，并且将该混合物用作用于dsRNA产生的转录模板。使用
Figure BDA0002155467980002331
Figure BDA0002155467980002332
RNAi试剂盒按照制造商的说明(英杰公司(INVITROGEN))或使用
Figure BDA0002155467980002333
T7体外转录试剂盒按照制造商的说明(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs)，伊普斯威奇(Ipswich)，马萨诸塞州)合成和纯化用于昆虫生物测定的双链RNA。使用NANODROPTM 8000分光光度计(赛默飞世尔科技公司(THERMO SCIENTIFIC)，威明顿(Wilmington)，德拉瓦州)测量Bcr1 dsRNA的浓度，并且在TE缓冲液中制备纯化的Bcr1dsRNA。
Bcr1 dsRNA一条链的发夹序列：
Figure BDA0002155467980002341
实例3：用Bcr1 dsRNA处理蚜虫(玉米蚜(Rhopalosiphum maidis))
本实例通过靶向Bcr1基因(ACYPI32128)的表达，证明了通过用dsRNA溶液处理来杀死或降低蚜虫，玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)的适合度的能力，该Bcr1基因是用于含菌细胞调节并在昆虫中起作用的必需基因。
蚜虫是最重要的农业昆虫有害生物之一。它们对作物造成直接的进食损害，并用作植物病毒的运载体。此外，蚜虫蜜露促进了烟霉(sooty mold)的生长，并吸引了令人讨厌的蚂蚁。化学处理的使用(不幸的是，仍然普遍存在)导致选择抗性个体，这些个体的根除变得越来越困难。
治疗性设计：将dsRNA溶液与来自实例2的0(阴性对照)、0.5、1或5μg/ml的Bcr1dsRNA在10 mL的含有0.5％蔗糖和必需氨基酸的TE缓冲液中一起配制。
实验设计：
为了准备处理，使蚜虫在实验室环境和培养基中生长。在气候控制室(16h光照光周期；60％±5％RH；20℃±2℃)中，蚕豆植物生长在蛭石和珍珠岩的混合物中，并且被蚜虫侵染。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，将从健康植物收集第二龄和第三龄蚜虫并将其分成不同处理，使得每个处理从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
将96孔板的孔填充200μl的人工蚜虫饲料(Febvay等人，Canadian Journal ofZoology[加拿大动物学杂志]，66(11)：2449-2453，1988)，并且将板用石蜡膜覆盖以制成进食小袋。将人工饲料与作为阴性对照的仅含0.5％蔗糖和必需氨基酸的TE缓冲液(Tris HCl(1mM)加EDTA(0.1mM)缓冲液，pH 7.2)混合，或与在含有不同浓度的dsRNA的TE缓冲液中稀释的dsRNA溶液混合。将dsRNA溶液与人工饲料混合以获得0.5至5μg/ml之间的最终浓度。
对于每次重复处理，将30-50只第二龄和第三龄蚜虫分别置于96孔板的孔中，并在其上方倒置进食小袋板，允许昆虫通过石蜡膜进食并将它们限制在单个孔中。将实验蚜虫与蚜虫集落保持在相同的环境条件下。在蚜虫进食24小时后，将进食小袋用含有无菌人工饲料的新进食小袋替换，并且每24小时提供新的无菌小袋，持续4天。在替换小袋时，还检查蚜虫的死亡率。如果蚜虫已经变成棕色或位于孔底并且在观察期间不移动，则将其视为死亡。如果蚜虫在进食小袋的石蜡膜上但没有移动，则认为它将进食并且存活。
将用Bcr1 dsRNA处理的蚜虫的存活率与用阴性对照处理的蚜虫进行比较。与对照处理的蚜虫相比，用Bcr1 dsRNA处理的蚜虫的存活率降低。
实例4：产生表达Bcr1 dsRNA的转基因草
本实例证明了用于递送至蚜虫的转基因草中Bcr1 dsRNA的遗传修饰和产生。
通过使用基于高叶绿素和胚性细胞系‘TIANSJ98’的系统的微弹轰击法产生通过表达稳定整合到植物基因组中的嵌合基因产生Bcr1 dsRNA分子的转基因牧草蓝牧草(bluegrama)，格兰马草(Bouteloua gracilis)(Aguado-Santacruz等人，Theoretical andApplied Genetics[理论与应用遗传学]104(5)：763-771，2002)。
‘TIANSJ98’细胞系建立和维持：如(Aguado-Santacruz等人，Plant Cell Rep.[植物细胞报告]20：131-136，2001)中描述的，从在液体MPC培养基中培养枝尖衍生的绿色愈伤组织获得胚性高叶绿素‘TIANSJ98’细胞系。每20天对该细胞系进行继代培养，将1ml细胞悬浮液转移到24ml新鲜的MPC培养基中。利用精细分散状态的胚性愈伤组织的原因是：1)使靶细胞的生理阶段同步，2)使全能性材料在纸过滤器上的分布最大化(优化轰击的质粒的射击覆盖)，以及3)促进在选择下分散的细胞簇内鉴定独立的转化事件(绿色点)。
胚性细胞的微弹轰击：
二元转化运载体与用于Bcr1 dsRNA表达的模板片段一起使用。该质粒含有在双35S花椰菜花叶病毒启动子控制下的靶Bcr1基因的反向重复，以及来自苜蓿花叶病毒的前导序列(Aguado-Santacruz等人，Theoretical and Applied Genetics[理论与应用遗传学]104(5)：763-771，2002)。
高叶绿素胚性细胞系‘TIANSJ98’用作微弹递送实验的靶标。将细胞分布在2.0-cm直径的滤纸圆盘上(大约2g FW细胞)。轰击混合物如下：将50μL的M10钨颗粒(15mg/ml)、10μL的DNA(1μg/ml)、50μL的2.5M CaCl2和20μL的0.1M亚精胺按顺序混合，涡旋5min，并且然后短暂超声。将该混合物以10,000rpm离心10s。去除60μL的上清液，并且将其余的分配到5-μL等分试样中用于单次射击。使用颗粒流入枪(Particle Inflow Gun)(Finer等人，PlantCell Rep.[植物细胞报告]11：323-328，1992)进行轰击。将颗粒/DNA混合物置于针筒式滤器单元的中心。将胚性细胞用500-μm挡板覆盖，置于离含有颗粒的筛网滤器单元10cm的距离处，并在真空室中以60mmHg轰击一次。测试用于轰击前和轰击后处理的两种不同的渗透介质(在固化的MPC培养基中提供的0.4和1M甘露醇)和三种轰击压力(60、80和100PSI)。射击前24hr进行轰击前处理。在排出后，将支持胚性细胞的纸过滤器在与轰击处理中使用的相同渗透介质上再维持3天。因此，用每次处理轰击的10个盘评估总共9次处理。作为对照，使用没有DNA的颗粒轰击具有悬浮材料的滤器。
稳定转化的克隆的选择和植物的回收：
在含有0.4或1M甘露醇但缺乏抗生素的MPC培养基上轰击后渗透处理3天后，将支持轰击的细胞的滤纸圆盘转移到含有140mg/l的卡那霉素的MPC培养基上，并在由冷荧光灯提供的白光中在30℃±1℃孵育。对于轰击的但未经受渗透处理的细胞，遵循相同的方法。2个月后将卡那霉素浓度升高至150或160mg/l。每3周对细胞进行继代培养，并在选择中维持8个月。在此期间之后，将卡那霉素抗性克隆转移到含有全强度MS培养基、3％蔗糖、2.5％植物凝胶(phytagel)(西格玛公司(Sigma)，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州)但不含抗生素的再生培养基中。将再生的枝转移至含有3.0μM(0.56mg/l)α-萘乙酸、2.5μM(0.51mg/l)吲哚-3-丁酸和2.5％植物凝胶的1/2MS中进行生根，并在连续的荧光灯下在30℃±1℃孵育。之后，将生根的小植物转移到盆中，使其长壮，并在温室中生长至成熟。
PCR分析用于转化验证：
使用以下方案从卡那霉素抗性和未转化的对照植物制备总基因组DNA：将大约250mg的细胞收集在2-ml Eppendorf管中，并且使用附接至匀浆器(Cafrfamo公司，搅拌器类型RZR)的玻璃杵在液体N2中研磨成精细粉剂。将粉状的细胞用500μL提取缓冲液(7.0M尿素、0.35M NaCl、0.05M Tris-HCl(pH 8.0)、0.02M EDTA、1％肌氨酸)重悬浮至少45min。用1体积的苯酚/氯仿提取细胞匀浆。通过离心分离水相，并且然后使用等体积的异丙醇沉淀。沉淀的DNA用70％乙醇洗涤一次，并且重悬于TE缓冲液(0.01M Tris-HCl，0.01M EDTA，pH8.0)中。
对于PCR分析，100至150ng用于在25-μL反应物中的基因组DNA扩增。正向引物5′-aaactgctgcatggctttct-3′(SEQ ID NO：91)和反向引物5′-acaggcctttcaggctttta-3′(SEQID NO：92)被设计用于扩增Bcr1正义反义插入片段的内部169-bp片段。使用珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)的热循环仪进行30个循环的PCR反应。反应温度为，变性95℃(2min)，退火56℃(30s)，以及延伸72℃(30s)。该25-μL反应体积含有：1×PCR缓冲液、0.25mM的dNTP、2mM MgCl2、0.2μM的引物以及2.5u的Taq。通过在1％琼脂糖/SYBR绿色凝胶中的电泳来分析扩增产物。
实例5：产colA细菌素的转基因草的产生
本实例证明了转基因草中含菌细胞调节肽鞘翅肽A(colA)的遗传修饰和产生以递送至蚜虫。
通过使用实例4中描述的系统的微弹轰击法产生通过表达稳定整合到植物基因组中的嵌合基因产生鞘翅肽A的转基因牧草蓝牧草，格兰马草。
每20天对胚性高叶绿素‘TIANSJ98’细胞系进行继代培养，将1ml细胞悬浮液转移到24ml新鲜的MPC培养基中。
鞘翅肽A(colA)
Figure BDA0002155467980002391
构建用于鞘翅肽(colA)表达的转化质粒。该质粒含有在双35S花椰菜花叶病毒启动子控制下的colA的核酸，以及来自苜蓿花叶病毒的前导序列(Aguado-Santacruz等人，Theoretical and Applied Genetics[理论与应用遗传学]104(5)：763-771，2002)。
高叶绿素胚性细胞系‘TIANSJ98’用作微弹递送实验的靶标。将细胞分布在2.0-cm直径的滤纸圆盘上(大约2g FW细胞)。轰击混合物如下：将50μL的M10钨颗粒(15mg/ml)、10μL的DNA(1μg/ml)、50μL的2.5M CaCl2和20μL的0.1M亚精胺按顺序混合，涡旋5min，并且然后短暂超声。将该混合物以10,000 rpm离心10s。去除60μL的上清液，并且将其余的分配到5-μL等分试样中用于单次射击。使用颗粒流入枪(Finer等人，Plant CellRep.[植物细胞报告]11：323-328，1992)进行轰击。将颗粒/DNA混合物置于针筒式滤器单元的中心。将胚性细胞用500-μm挡板覆盖，置于离含有颗粒的筛网滤器单元10cm的距离处，并在真空室中以60mmHg轰击一次。测试用于轰击前和轰击后处理的两种不同的渗透介质(在固化的MPC培养基中提供的0.4和1M甘露醇)和三种轰击压力(60、80和100PSI)。射击前24hr进行轰击前处理。在排出后，将支持胚性细胞的纸过滤器在与轰击处理中使用的相同渗透介质上再维持3天。因此，用每次处理轰击的10个盘评估总共9次处理。作为对照，使用没有DNA的颗粒轰击具有悬浮材料的滤器。
稳定转化的克隆的选择和植物的回收：
在含有0.4或1M甘露醇但缺乏抗生素的MPC培养基上轰击后渗透处理3天后，将支持轰击的细胞的滤纸圆盘转移到含有140mg/l的卡那霉素的MPC培养基上，并在由冷荧光灯提供的白光中在30℃±1℃孵育。对于轰击的但未经受渗透处理的细胞，遵循相同的方法。2个月后将卡那霉素浓度升高至150或160mg/l。每3周对细胞进行继代培养，并在选择中维持8个月。在此期间之后，将卡那霉素抗性克隆转移到含有全强度MS培养基、3％蔗糖、2.5％植物凝胶(phytagel)(西格玛公司(Sigma)，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州)但不含抗生素的再生培养基中。将再生的枝转移至含有3.0μM(0.56mg/l)α-萘乙酸、2.5μM(0.51mg/l)吲哚-3-丁酸和2.5％植物凝胶的1/2MS中进行生根，并在连续的荧光灯下在30℃±1℃孵育。之后，将生根的小植物转移到盆中，使其长壮，并在温室中生长至成熟。
PCR分析用于转化验证：
使用以下方案从卡那霉素抗性和未转化的对照植物制备总基因组DNA：将大约250mg的细胞收集在2-ml Eppendorf管中，并且使用附接至匀浆器(Caframo公司，搅拌器类型RZR)的玻璃杵在液体N2中研磨成精细粉剂。将粉状的细胞用500μL提取缓冲液(7.0M尿素、0.35M NaCl、0.05M Tris-HCl(pH 8.0)、0.02M EDTA、1％肌氨酸)重悬浮至少45min。用1体积的苯酚/氯仿提取细胞匀浆。通过离心分离水相，并且然后使用等体积的异丙醇沉淀。沉淀的DNA用70％乙醇洗涤一次，并且重悬于TE缓冲液(0.01M Tris-HCl，0.01M EDTA，pH8.0)中。
对于PCR分析，100至150ng用于在25-μL反应物中的基因组DNA扩增。正向引物5′-caacgatcaggcgatgtatg-3′(SEQ ID NO：95)和反向引物5′-ttaatttccacctgcgcttt-3′(SEQID NO：96)被设计用于扩增colA基因插入片段的内部165-bp片段。使用珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)的热循环仪进行30个循环的PCR反应。反应温度为，变性95℃(2min)，退火56℃(30s)，以及延伸72℃(30s)。该25-μL反应体积含有：1×PCR缓冲液、0.25mM的dNTP、2mMMgCl2、0.2μM的引物以及2.5u的Taq。通过在1％琼脂糖/SYBR绿色凝胶中的电泳来分析扩增产物。
实例6：产colA细菌素的转基因草的产生
本实例证明了转基因草中colA细菌素的遗传修饰和产生以递送至蚜虫。
通过使用基于高叶绿素和胚性细胞系‘TIANSJ98’的系统的微弹轰击法产生通过表达稳定整合到植物基因组中的嵌合基因产生colA细菌素的转基因牧草蓝牧草，格兰马草(Aguado-Santacruz等人，2002.Theoretical and Applied Genetics[理论与应用遗传学]，104(5)，763-771)。
‘TIANSJ98’细胞系建立和维持：如(Aguado-Santacruz等人，2001.exSteud.Plant Cell Rep[植物细胞报告]20：131-136)中描述的，从在液体MPC培养基中培养枝尖衍生的绿色愈伤组织获得胚性高叶绿素‘TIANSJ98’细胞系。每20天对该细胞系进行继代培养，将1ml细胞悬浮液转移到24ml新鲜的MPC培养基中。利用精细分散状态的胚性愈伤组织的原因是：1)使靶细胞的生理阶段同步，2)使全能性材料在纸过滤器上的分布最大化(优化轰击的质粒的射击覆盖)，以及3)促进在选择下分散的细胞簇内鉴定独立的转化事件(绿色点)。
胚性细胞的微弹轰击
转化运载体与用于colA细菌素表达的模板片段一起使用。
colA细菌素
Figure BDA0002155467980002421
该质粒含有在双35S花椰菜花叶病毒启动子控制下的colA细菌素的核酸，以及来自苜蓿花叶病毒的前导序列(Aguado-Santacruz等人，2002.Theoretical and AppliedGenetics[理论与应用遗传学]，104(5)，763-771)。
高叶绿素胚性细胞系‘TIANSJ98’用作微弹递送实验的靶标。将细胞分布在2.0-cm直径的滤纸圆盘上(大约2g FW细胞)。轰击混合物如下：将50μL的M10钨颗粒(15mg/ml)、10μL的DNA(1μg/ml)、50μL的2.5 M CaCl2和20μL的0.1M亚精胺按顺序混合，涡旋5min，并且然后短暂超声。将该混合物以10,000 rpm离心10s。去除60μL的上清液，并且将其余的分配到5-μL等分试样中用于单次射击。
使用颗粒流入枪(Finer等人，1992.Plant Cell Rep.[植物细胞报告]11：323-328)进行轰击。将颗粒/DNA混合物置于针筒式滤器单元的中心。将胚性细胞用500-μm挡板覆盖，置于离含有颗粒的筛网滤器单元10cm的距离处，并在真空室中以60mmHg轰击一次。测试用于轰击前和轰击后处理的两种不同的渗透介质(在固化的MPC培养基中提供的0.4和1M甘露醇)和三种轰击压力(60、80和100PSI)。射击前24hr进行轰击前处理。
在排出后，将支持胚性细胞的纸过滤器在与轰击处理中使用的相同渗透介质上再维持3天。因此，用每次处理轰击的10个盘评估总共9次处理。作为对照，使用没有DNA的颗粒轰击具有悬浮材料的滤器。
稳定转化的克隆的选择和植物的回收
在具有0.4或1M甘露醇但缺乏抗生素的MPC培养基上轰击后渗透处理3天后，将支持轰击的细胞的滤纸圆盘转移到含有140mg/l的卡那霉素的MPC培养基上，并在由冷荧光灯提供的白光中在30℃±1℃孵育。对于轰击的但未经受渗透处理的细胞，遵循相同的方法。2个月后将卡那霉素浓度升高至150或160mg/l。每3周对细胞进行继代培养，并在选择中维持8个月。在此期间之后，将卡那霉素抗性克隆转移到具有全强度MS培养基、3％蔗糖、2.5％植物凝胶(西格玛公司(Sigma)，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州)但不含抗生素的再生培养基中。将再生的芽转移至具有3.0μM(0.56mg/l)α-萘乙酸、2.5μM(0.51mg/l)吲哚-3-丁酸和2.5％植物凝胶的1/2MS中，并在连续的荧光灯下在30℃±1℃孵育。之后，将生根的小植物转移到盆中，使其长壮，并在温室中生长至成熟。
PCR分析用于转化验证
使用以下方案从卡那霉素抗性和未转化的对照植物制备总基因组DNA：将大约250mg的细胞收集在2-ml Eppendorf管中，并且使用附接至匀浆器(Caframo公司，搅拌器类型RZR)的玻璃杵在液体N2中研磨成精细粉剂。将粉状的细胞用500μL提取缓冲液(7.0M尿素、0.35M NaCl、0.05M Tris-HCl(pH 8.0)、0.02M EDTA、1％肌氨酸)重悬浮至少45min。用1体积的苯酚/氯仿提取细胞匀浆。通过离心分离水相，并且然后使用等体积的异丙醇沉淀。沉淀的DNA用70％乙醇洗涤一次，并且重悬于TE缓冲液(0.01M Tris-HCl，0.01M EDTA，pH8.0)中。
对于PCR分析，100至150ng用于在25-μL反应物中的基因组DNA扩增。正向引物5′-caacgatcaggcgatgtatg-3′和反向引物5′-ttaatttccacctgcgcttt-3′被设计用于扩增ColA基因插入片段的内部165-bp片段。使用珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)的热循环仪进行30个循环的PCR反应。反应温度为，变性95℃(2min)，退火56℃(30s)，以及延伸72℃(30s)。该25-μL反应体积含有：1×PCR缓冲液、0.25mM的dNTP、2mM MgCl2、0.2μM的引物以及2.5u的Taq。通过在1％琼脂糖/SYBR绿色凝胶中的电泳来分析扩增产物。
实例7：从桃蚜(green peach aphid，Myzuspersicae)产生cDNA文库。
本实例证明了从桃蚜幼虫(桃蚜(Myzus persicae))产生cDNA文库。
从蚜虫幼虫分离总RNA以及cDNA文库制备：
使用以下基于苯酚/
Figure BDA0002155467980002441
的方法(分子研究中心，辛辛那提(Cincinnati)，俄亥俄州)提取来自0.9g的整个一龄幼虫(孵化后4至5天；保持在16℃)的总RNA。将幼虫在室温下在15mL匀浆器中与10mL的TRI
Figure BDA0002155467980002442
匀浆，直至获得均匀的悬浮液。在室温下孵育5min后，将匀浆分配到1.5mL微量离心管(每管1mL)中，添加200μL氯仿，并将混合物剧烈振荡15秒。允许在室温下静置提取液10min后，通过在4℃以12,000×g离心分离各相。将上层相(包括约0.6mL)小心地转移到另一个无菌1.5mL管中，并添加等体积的室温异丙醇。在室温下孵育5至10min后，将该混合物以12,000×g(4℃或25℃)离心8min。
小心去除上清液并弃去，并且通过用75％乙醇涡旋来洗涤RNA沉淀两次，每次洗涤后以7,500×g(4℃或25℃)离心回收5min。小心地去除乙醇，允许该沉淀风干3至5min，并且然后溶解在无核酸酶的无菌水中。通过测量260nm和280nm处的吸光度(A)来确定该RNA浓度。将RNA储存在-80℃，并且通过将等分试样通过1％琼脂糖凝胶确定该RNA质量。
使用随机引发将幼虫总RNA转化为cDNA文库。使幼虫cDNA文库在EUROFINS MWGOperon公司通过GS FLX 454 TitaniumTM系列化学以1/2板规模进行测序，产生平均阅读长度为348bp的超过600,000个读数。350,000个读数被组合成超过50,000个重叠群。使用公开可得的程序FORMATDB(可从NCBI获得)将未组合的读数和重叠群两者转化为BLASTable数据库。
实例8：Bcr1 dsRNA的产生
本实例证明了从cDNA文库中产生和纯化合成的dsRNA。
实验设计：
Bcr1基因(ACYPI32128)是用于含菌细胞调节并在昆虫中起作用的必需基因。实例6中描述的cDNA用于Bcr1 dsRNA合成，通过使用以下引物对的PCR制备：正向5′-aaactgctgcatggctttct-3′(SEQ ID NO：90)和反向5′-acaggcctttcaggctttta-3′(SEQ IDNO：91)。对于靶基因区，进行两次单独的PCR扩增。第一次PCR扩增在扩增的正义链的5′端引入T7启动子序列(TTAATACGACTCACTATAGGGAGA；SEQ ID NO：92)。第二次反应在反义链的5′端掺入T7启动子序列。然后将靶基因Bcr1的每个区的两个PCR扩增的片段以等量混合，并且将该混合物用作用于dsRNA产生的转录模板。使用
Figure BDA0002155467980002451
RNAi试剂盒按照制造商的说明(英杰公司(INVITROGEN))或使用
Figure BDA0002155467980002462
T7体外转录试剂盒按照制造商的说明(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)，伊普斯威奇(Ipswich)，马萨诸塞州)合成和纯化用于昆虫生物测定的双链RNA。使用NANODROPTM 8000分光光度计(赛默飞世尔科技公司(THERMO SCIENTIFIC)，威明顿(Wilmington)，德拉瓦州)测量针对Bcr1的dsRNA的浓度，并且在TE缓冲液中制备纯化的dsRNA分子。
Bcr1 dsRNA一条链的发夹序列：
Figure BDA0002155467980002461
实例9：用Bcr1 dsRNA的溶液处理蚜虫(桃蚜(Myzus persicae))
本实例通过靶向Bcr1基因(ACYPI32128)的表达，证明了通过用dsRNA溶液处理蚜虫，桃蚜(Myzus persicae)来杀死或降低它们的适合度的能力，该Bcr1基因是用于含菌细胞调节并在昆虫中起作用的必需基因。
蚜虫是最重要的农业昆虫有害生物之一。它们对作物造成直接的进食损害，并用作植物病毒的运载体。此外，蚜虫蜜露促进了烟霉(sooty mold)的生长，并吸引了令人讨厌的蚂蚁。化学处理的使用(不幸的是，仍然普遍存在)导致选择抗性个体，这些个体的根除变得越来越困难。
治疗性设计：将dsRNA溶液与来自实例7的0(阴性对照)、0.5、1或5μg/mL的Bcr1dsRNA在10mL的含有0.5％蔗糖和必需氨基酸的TE缓冲液中一起配制。
实验设计：
为了准备处理，使蚜虫在实验室环境和培养基中生长。在气候控制室(16hr光照光周期；60％±5％RH；20℃±2℃)中，植物生长在蛭石和珍珠岩的混合物中，并且被蚜虫侵染。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，将从健康植物收集第二龄和第三龄蚜虫并将其分成不同处理，使得每个处理从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
将96孔板的孔填充200μl的人工蚜虫饲料(Febvay等人，Canadian Journal ofZoology[加拿大动物学杂志]，66(11)：2449-2453，1988)，并且将板用石蜡膜覆盖以制成进食小袋。将人工饲料与作为阴性对照的仅含0.5％蔗糖和必需氨基酸的TE缓冲液(Tris HCl(1mM)加EDTA(0.1mM)缓冲液，pH 7.2)混合，或与在含有不同浓度的dsRNA的TE缓冲液中稀释的dsRNA溶液混合。将dsRNA溶液与人工饲料混合以获得0.5至5μg/ml之间的最终浓度。
对于每次重复处理，将30-50只第二龄和第三龄蚜虫分别置于96孔板的孔中，并在其上方倒置进食小袋板，允许昆虫通过石蜡膜进食并将它们限制在单个孔中。将实验蚜虫与蚜虫集落保持在相同的环境条件下。在蚜虫进食24小时后，将进食小袋用含有无菌人工饲料的新进食小袋替换，并且每24小时提供新的无菌小袋，持续4天。在替换小袋时，还检查蚜虫的死亡率。如果蚜虫已经变成棕色或位于孔底并且在观察期间不移动，则将其视为死亡。如果蚜虫在进食小袋的石蜡膜上但没有移动，则认为它将进食并且存活。
将用Bcr1 dsRNA处理的蚜虫的存活率与用阴性对照处理的蚜虫进行比较。与对照处理的蚜虫相比，用Bcr1 dsRNA处理的蚜虫的存活率降低。
实例10：用于作物保护的含菌细胞特异性dsRNA的局部-植物递送
本实例证明了通过在烟草植物叶上局部施用来递送含菌细胞特异性dsRNA的能力。dsRNA靶向Bcr1基因(ACYPI32128)的表达，该基因是用于含菌细胞调节并在昆虫中起作用的必需基因。
治疗性设计：在125uL/cm2叶表面下，将dsRNA-LDH喷雾溶液与实例7中产生的Bcr1dsRNA以1∶0(阴性对照)、1∶1、1∶2或1∶3比例的dsRNA∶LDH一起配制。LDH纳米片的制备和表征：
片状黏土纳米颗粒，特别是带正电荷的LDH，是用于dsRNA的优异纳米载体系统，以递送RNAi作为用于作物保护的稳定喷雾配制品(Mitter等人，Nature Plants[自然植物]1-10，2017)。即使在剧烈漂洗后，LDH缀合物仍然强烈地粘附在叶表面上，并且在环境条件下持续很长一段时间增强dsRNA的稳定性。通过在大气CO2和湿度下在叶表面形成碳酸促进dsRNA的持续释放，这有助于降解LDH纳米片。
LDH纳米片根据(Mitter等人，Nature Plants[自然植物]1-10，2017)通过改进的非水性沉淀，随后热处理、纯化并在水中分散制备，以得到45nm的平均粒度。通过NanosizerNano ZS仪器(马尔文仪器公司(Malvem Instruments))表征颗粒(五个重复的LDH样品)以获得Z均粒径和PdI并使用JEOL JSM-2010 TEM22成像。使用Rigaku Miniflex X射线衍射仪和Nicolet 6700FT-IR(美国热电集团(Thermo Electron Corporation))，通过具有5个LDH样品的粉末XRD和具有衰减全反射模式的傅里叶变换红外光谱分别验证化学组合物和晶体结构。
在LDH上加载的dsRNA：
为了对将实例7中获得的dsRNA发夹构建体的最佳和完全加载到LDH纳米片上进行定义，将体外转录的dsRNA(500ng)与LDH的比例(dsRNA-LDH(w/w))以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和1∶10测定多次。将dsRNA和LDH在室温下以10μL的总体积孵育30min，伴随温和的定轨搅动。通过在1％琼脂糖凝胶的孔中保留dsRNA-LDH复合物来评估完整的dsRNA加载。不管所需的放大体积如何，适当的加载比例都是一致的。
如(Mitter等人，Nature Plants[自然植物]1-10，2017)中描述的测试从dsRNA-LDH复合物中dsRNA的释放和释放的dsRNA的稳定性。
针对叶中dsRNA检测的Northern印迹分析：
为了检测dsRNA摄取，在第0天用LDH、Bcr1-dsRNA或Bcr1-dsRNA-LDH喷洒烟草(N.tabacum)植物(三次重复)。测试的复合物的比例是：1∶1、1∶2或1∶3比例的dsRNA-LDH。植物在10cm宽的盆中的UQ23土壤中在温室条件(平均温度为25℃，伴随自然光)下生长。在喷雾时使用封条覆盖这些植物的顶点。收集喷雾后20天出现的新叶。通过TRIzol提取法提取总RNA并富集小RNA(Mitter等人，Am.Phytopathological Soc.[美国植物病理学会]16：936-944，2003)。使每次处理的小RNA(20μg)在15％(wt/vol)变性尿素聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上运行。在3′端将DIG标记的ZR小RNA梯(Zymo Research公司)用作标记物。通过转印迹SD半干转印单元(伯乐公司(Bio-Rad))在Hybond-N膜(罗氏公司(Roche))上转印印迹。根据制造商的推荐使用DIG标记的Bcr1 24nt探针(5-atgctgaccatgcatctgagcatt)，专用缓冲装置(罗氏公司)处理印迹。杂交后，使用CSPD化学发光碱性磷酸酶底物检测滤器。使用NIH成像1.6(NIH Image 1.6)软件进行定量分析。
实例11：PNA的固相合成
本实例证明了PNA的固相合成。
治疗性设计：针对含菌细胞靶基因Bcr1的互补反义PNA构建体：gaatgcagctgc
实验设计：
通过固相法使用标准Fmoc(N-(9-芴基)甲氧基羰基)化学以连续流动模式自动合成(MilliGen 9050肽合成仪)PNA反义。
PNA反义纯化通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行，使用半制备性柱C18(10μm，300×7.7mm，Xterra Waters，
Figure BDA0002155467980002501
)在260nm处进行UV检测，用含有0.1％TFA的水(洗脱液A)和含有0.1％TFA的乙腈(洗脱液B)洗脱；洗脱梯度：在30min内从100％A至50％B，流速：4ml/min。使用Acquity UPLC BEH C18，2.1×50MM，1.7μm柱，通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS；Waters Acquity配备有ESI-Q分析仪)检查纯化的PNA反义的纯度和同一性。观察到正确的氨基酸和核酸序列的预期的质量峰。
实例12：Cy3标记的PNA的产生
本实例证明将实例10中描述的PNA与作为标记物的Cy3染料连接以通过点击化学标记PNA。
治疗性设计：具有二苄基环辛炔(DBCO)修饰的PNA和具有叠氮化物修饰的Cy3染料：Cy3-gaatgcagctgc。
实验设计：
为了准备点击反应，用DBCO(格伦研究公司(Glen Research)，斯特灵(Sterling)，弗吉尼亚州)标记实例10中合成的PNA。将DBCO-磺基-NHS酯以5.2mg/60μL的浓度溶解在水或无水DMSO中。该储备溶液用于将氨基修饰的PNA缀合在碳酸钠/碳酸氢钠缀合缓冲液(pH＝约9)中。
对于0.2μmol PNA的合成，将PNA溶解在500μL的缀合缓冲液中。将大约6倍过量(6μL)的DBCO-磺基-NHS酯溶液添加至溶解的PNA中。将该混合物涡旋并在室温下孵育2-4小时直至约过夜。将缀合的PNA在脱盐柱(格伦研究公司(Glen Research)，斯特灵，弗吉尼亚州)上脱盐以去除盐和有机物。
Cy3-叠氮化物修饰的染料获得自西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)(777315)。对于点击反应，将1mg的Cy3-叠氮化物溶解在150μL的DMSO中。将Cy3-叠氮化物溶液添加至在100μL水中的10OD的DBCO缀合的PNA中。将该混合物在室温下孵育过夜。将连接的PNA在脱盐柱(格伦研究公司(Glen Research)，斯特灵，弗吉尼亚州)上脱盐以去除盐和有机物。
实例13：用Cy3-PNA的溶液处理蚜虫(桃蚜(Myzus persicae))
本实例通过用靶向Bcr1基因(ACYPI32128)的表达的Cy3-PNA构建体处理蚜虫，桃蚜(Myzus persicae)来杀死或降低它们的适合度的能力，该Bcr1基因是用于含菌细胞调节并在昆虫中起作用的必需基因。
蚜虫是最重要的农业昆虫有害生物之一。它们对作物造成直接的进食损害，并用作植物病毒的运载体。此外，蚜虫蜜露促进了烟霉(sooty mold)的生长，并吸引了令人讨厌的蚂蚁。化学处理的使用(不幸的是，仍然普遍存在)导致选择抗性个体，这些个体的根除变得越来越困难。
治疗性设计：将Cy3-PNA溶液与来自实例11的0、0.5、1、5或10mg/L的Cy3-PNA在10mL的含有0.5％蔗糖和必需氨基酸的溶液中一起配制。
实验设计：
为了准备处理，使蚜虫在实验室环境和培养基中生长。在气候控制室(16小时光照光周期；60％±5％RH；20℃±2℃)中，植物生长在蛭石和珍珠岩的混合物中，并且被蚜虫侵染。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，将从健康植物收集第二龄和第三龄蚜虫并将其分成不同处理，使得每个处理从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
将96孔板的孔填充200μl的人工蚜虫饲料(Febvay等人，Canadian Journal ofZoology[加拿大动物学杂志]，66(11)：2449-2453，1988)，并且将板用石蜡膜覆盖以制成进食小袋。将人工饲料与作为阴性对照的仅含0.5％蔗糖和必需氨基酸的无菌水的溶液混合，或与Cy3-PNA溶液混合。将Cy3-PNA溶液与人工饲料混合以获得0.5至10mg/L之间的最终浓度。
对于每次重复处理，将30-50只第二龄和第三龄蚜虫分别置于96孔板的孔中，并在其上方倒置进食小袋板，允许昆虫通过石蜡膜进食并将它们限制在单个孔中。将实验蚜虫与蚜虫集落保持在相同的环境条件下。在蚜虫进食24小时后，将进食小袋用含有无菌人工饲料的新进食小袋替换，并且每24小时提供新的无菌小袋，持续4天。在替换小袋时，还检查蚜虫的死亡率。如果蚜虫已经变成棕色或位于孔底并且在观察期间不移动，则将其视为死亡。如果蚜虫在进食小袋的石蜡膜上但没有移动，则认为它将进食并且存活。
将用Bcr1特异性Cy3-PNA处理的蚜虫的存活率与用阴性对照处理的蚜虫进行比较。与对照处理的蚜虫相比，用Bcr1特异性Cy3-PNA处理的蚜虫的存活率降低。
实例14：用于作物保护的Cy3-PNA的局部-植物递送
本实例证明了通过在烟草植物叶上局部施用来递送Cy3-PNA的能力。Cy3-PNA靶向Bcr1基因(ACYPI32128)的表达，该基因是用于含菌细胞调节并在昆虫中起作用的必需基因。
治疗性设计：在125uL/cm2叶表面下，将Cy3-PNA-LDH喷雾溶液与实例11中合成的Cy3-PNA以1∶0(阴性对照)、1∶1、1∶2或1∶3比例的Cy3-PNA∶LDH一起配制。
LDH纳米片的制备和表征：
片状黏土纳米颗粒，特别是带正电荷的LDH是优异纳米载体系统，以递送核酸作为用于作物保护的稳定喷雾配制品(Mitter等人，Nature Plants[自然植物]1-10，2017)。即使在剧烈漂洗后，LDH缀合物仍然强烈地粘附在叶表面上，并且在环境条件下持续很长一段时间增强PNA的稳定性。通过在大气CO2和湿度下在叶表面形成碳酸促进PNA的持续释放，这有助于降解LDH纳米片。
LDH纳米片根据(Mitter等人，Nature Plants[自然植物]1-10，2017)通过改进的非水性沉淀，随后热处理、纯化并在水中分散制备，以得到45nm的平均粒度。通过NanosizerNano ZS仪器(马尔文仪器公司(Malvern Instruments))表征颗粒(五个重复的LDH样品)以获得Z均粒径和PdI并使用JEOL JSM-2010TEM22成像。使用Rigaku Miniflex X射线衍射仪和Nicolet 6700 FT-IR(美国热电集团(Thermo Electron Corporation))，通过具有5个LDH样品的粉末XRD和具有衰减全反射模式的傅里叶变换红外光谱分别验证化学组合物和晶体结构。
在LDH上加载的Cy3-PNA：
为了对将实例11中获得的Cy3-PNA的最佳和完全加载到LDH纳米片中进行定义，将Cy3-PNA(0.5μg)与LDH的比例(Cy3-PNA-LDH(w/w))以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和1∶10测定多次。将Cy3-PNA和LDH在室温下以10μL的总体积孵育30min，伴随温和的定向搅动。通过在1％琼脂糖凝胶的孔中保留Cy3-PNA-LDH复合物来评估完整的Cy3-PNA加载。不管所需的放大体积如何，适当的加载比例都是一致的。
针对植物叶中Cy3-PNA检测的共焦成像：
将拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0的表面灭菌的种子春化、铺板并且在21℃(16h/8h白天/黑夜)垂直地生长在固体MS培养基上11天。
为了检测Cy3-PNA的摄取，用3μL仅Cy3、Cy3-PNA(1μg)、和Cy3-PNA-LDH(1∶3)的液滴处理3次重复中的11日龄拟南芥(A.thaliana)幼苗。将液滴施用到单个叶上。48h后，在3ml的水中通过剧烈的移液将叶漂洗两次，持续2min，并且在表皮下方可视化，因为在LDH处理的情况下荧光残留在表面上。用650-800nm带通滤器检测天然叶绿素荧光。Z-堆叠用于验证在海绵状叶肉和木质部中观察到的荧光是内化的。在Zeiss LSM510 META(卡尔蔡司公司(Carl Zeiss))共聚焦激光扫描显微镜下观察叶。通过用HeNe激光在543nm处激发使Cy3荧光可视化，并且用560-615nm带通滤器检测。
实例15：用升高体温的溶液处理蚜虫
本实例证明了通过用前列腺素处理蚜虫来杀死或降低蚜虫适合度的能力。前列腺素是与免疫功能相关的类二十烷酸，其迅速诱导脊椎动物和无脊椎动物发热。本实例证明前列腺素对蚜虫的作用是通过调节对蚜虫内源的细菌群体来介导的，该细菌群体对由前列腺素产生的温度升高敏感。一个靶向的细菌菌株是布赫纳氏菌。
治疗性设计：将前列腺素溶液E2(PGE2)与在含有0.5％蔗糖和必需氨基酸的乙醇和无菌水的溶液中配制的0(阴性对照)、10、20或50μg/μl的前列腺素一起配制。
实验设计：
为了准备处理，使蚜虫在实验室环境和培养基中生长。在气候控制室(16h光照光周期；60％±5％RH；20℃±2℃)中，在24℃，伴随16h的光照和8h的黑暗，蚕豆植物生长在蛭石和珍珠岩的混合物中。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，将从健康植物收集第二龄和第三龄蚜虫并将其分成不同处理，使得每个处理从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
通过将前列腺素(西格玛奥德里奇公司(SIGMA-ALDRICH)，P5640)溶解在含有0.5％蔗糖和必需氨基酸的无菌水和乙醇(1∶1)中制备前列腺素溶液。将96孔板的孔填充200μl的人工蚜虫饲料(Febvay等人，Canadian Journal of Zoology[加拿大动物学杂志]，1988，66(11)：2449-2453)并且用石蜡膜覆盖板以制成进食小袋。将人工饲料与作为阴性对照的无菌水以及0.5％蔗糖和必需氨基酸混合，或与含有其中一种浓度的前列腺素的前列腺素溶液混合。将前列腺素溶液与人工饲料混合以得到10和50μg/μL之间的最终浓度。
对于每次重复处理，将30-50只第二龄和第三龄蚜虫分别置于96孔板的孔中，并在其上方倒置进食小袋板，允许昆虫通过石蜡膜进食并将它们限制在单个孔中。将实验蚜虫与蚜虫集落保持在相同的环境条件下。在蚜虫进食24小时后，将进食小袋用含有无菌人工饲料的新饲喂小袋替换，并且每24小时提供新的无菌小袋，持续四天。在替换小袋时，还检查蚜虫的死亡率。如果蚜虫已经变成棕色或位于孔底并且在观察期间不移动，则将其视为死亡。如果蚜虫在进食小袋的石蜡膜上但没有移动，则认为它将进食并且存活。
通过PCR评估蚜虫样品中布赫纳氏菌的状态。根据制造商的方案，使用昆虫DNA试剂盒(OMEGA，Bio-tek公司)从对照(非前列腺素处理的)和前列腺素处理的个体中分离总DNA。基于23S-5S rRNA序列(获得自布赫纳氏菌基因组(保藏号：GCA_000009605.1))，使用Primer 5.0软件(引物E有限公司，英国普利茅斯)设计布赫纳氏菌的引物(正向引物5′-GTCGGCTCATCACATCC-3′(SEQ ID NO：97)和反向引物5′-TTCCGTCTGTATTATCTCCT-3′(SEQ IDNO：98))(Shigenobu等人，Nature[自然]200.407，81-86)。PCR扩增循环包括95℃下持续5min的初始变性步骤，95℃持续30s、55℃持续30s、和72℃持续60s的35个循环，以及72℃下持续10min的最终延伸步骤。在1％琼脂糖凝胶上分析来自前列腺素处理和对照样品的扩增产物，用SYBR safe染料染色，并且使用成像系统可视化。前列腺素处理的蚜虫显示出布赫纳氏菌属(Buchnera)特异性基因的减少。
将用前列腺素溶液处理的蚜虫的存活率与用阴性对照处理的蚜虫进行比较。与对照相比，用前列腺素溶液处理的蚜虫的存活率降低。
实例16：用dsRNA处理蚜虫以刺激昆虫免疫应答以降低适合度
本实例证明用双链RNA(dsRNA)处理蚜虫导致免疫调节基因的敲低以诱导免疫应答并降低蚜虫适合度。通过抑制免疫调节基因诱导免疫应答，具体地，Cact是Toll途径的负调节物，该途径是蚜虫的主要免疫途径，以诱导Toll途径激活以表达和分泌最终影响对蚜虫内源的细菌群体的抗微生物肽、溶菌酶和酚氧化酶。本实例证明了降低蚜虫中Cact水平以上调全身免疫应答，导致对蚜虫内源的细菌群体失调，该细菌群体对由Toll途径激活产生的蚜虫免疫应答增加敏感。一个靶向的细菌菌株是布赫纳氏菌。
治疗性设计：显微注射第5龄LSR-1蚜虫。注射溶液将是dd-水(阴性对照)或在各种浓度(8或60ng/蚜虫；见下文)的dd-水中稀释的dsRNA。
实验设计：
蚜虫LSR-1(仅含有布赫纳氏菌属(Buchnera))，豌豆长管蚜(A.pisum)将在气候控制培养箱(16h光照/8h黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃下伴随16h的光照和8h的黑暗，蚕豆植物将在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，来自不同植物的5-10个成虫将分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，将从健康植物收集第五龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：1)水(阴性对照)或2)针对ApGLNT1的dsRNA(以本文指示的浓度)。
显微注射递送实验设计
将使用具有内部拉出的硼硅酸盐针的NanoJet III Auto-Nanoliter注射器(Drummond Scientific公司；目录号3-000-203-G/XL)进行显微注射。将使用漆刷将蚜虫转移到与真空连接的管道系统，该管道系统在显微注射期间将蚜虫保持在适当位置。注射位点将位于蚜虫的腹侧胸腔。成年蚜虫的注射体积将为20nl，速率为2nl/sec。每个处理组将具有从每个收集植物注射的大约相同数量的个体。
注射后，蚜虫将被释放到有盖培养皿中的蚕豆叶上，这些叶的茎在填充有1ml水的Eppendorf管中。将每天监测蚜虫的存活，并且发现死蚜虫时将其去除。将计数每组的后代数量，并将繁殖力测量为在每个时间点每只蚜虫产生的后代(F1代)数量。
在选择实验中，将通过每天记录后代的发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄和第5龄)测量来自每个处理组的后代的组中的发育。还将通过在收集后4天对蚜虫进行成像并确定其面积来测量发育。用于合成dsRNA的模板将是从mRNA逆转录的cDNA。将从一个第5龄豌豆长管蚜(A.pisum)(LSR-1菌株)中提取RNA，并且通过Nanodrop(赛默飞世尔科技公司(Thermo fisher scientific))定量。根据制造商的方案，使用Superscript IV试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo fisher scientific))，约100μg的总RNA将作为模板添加至逆转录反应中。
为了扩增用于dsRNA的模板，cDNA将稀释100倍并用于以下PCR。PCR反应(25μl最终体积)含有12.5μL的Go Taq Green 2X mix(普洛麦格公司(Promega))、0.2μl的正向引物(表12)、0.2μl的反向引物(表12)和12.1μl的100倍稀释的cDNA。使用以下条件进行PCR反应：1)95℃持续2分钟，2)95℃持续20秒，3)55℃持续15秒，4)72℃持续30秒，5)重复步骤2-4，35x，6)72℃持续5分钟。通过在1.5％琼脂糖上进行电泳来验证PCR扩增产物的大小，并通过QIAquick DNA纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen))切割和纯化预期大小的条带。根据制造商的方案，使用T7MEGAscript试剂盒(Ambion，赛默飞世尔科技公司(Thermo fisherscientific)；目录号AM1334)将在体外合成dsRNA。通过Nanodrop(赛默飞世尔科技公司(Thermo fisher scientific))测量dsRNA的浓度。
表12：Cact dsRNA序列：
Figure BDA0002155467980002591
将通过PCR评估蚜虫样品中布赫纳氏菌属(Buchnera)的状态。将来自阴性对照和噬菌体处理的蚜虫成虫将首先用70％乙醇(持续1min)、10％漂白剂((持续1min)表面灭菌，并用超纯水(持续1分钟)洗涤三次。根据制造商的方案，将使用昆虫DNA试剂盒(OMEGA，Bio-tek公司)从每个个体(全身)中提取总DNA。基于23S-5SrRNA序列(获得自布赫纳氏菌基因组(保藏号：GCA_000009605.1))，使用Primer 5.0软件(引物E有限公司，英国普利茅斯)设计布赫纳氏菌的引物(正向引物5′-GTCGGCTCATCACATCC-3′(SEQ ID NO：97)和反向引物5′-TTCCGTCTGTATTATCTCCT-3′(SEQ ID NO：98))(Shigenobu等人，Nature[自然]200.407，81-86)。PCR扩增循环包括在95℃持续5min的初始变性步骤，95℃持续30s、55℃持续30s、和72℃持续60s的35个循环，以及在72℃进行10min的最终延伸步骤。来自利福平处理和对照样品的扩增产物将在1％琼脂糖凝胶上分析，用SYBR safe染料染色，并且使用成像系统可视化。预期dsRNA处理的蚜虫显示出布赫纳氏菌属(Buchnera)特异性基因的减少。
将用Cactus处理的蚜虫与用阴性对照处理的蚜虫的Cact的表达以及存活率进行比较。与对照处理的蚜虫相比，预期用针对Cact的dsRNA处理的蚜虫的Cact的表达以及存活率降低。
实例17：将蚜虫用刺激昆虫免疫应答的真菌溶液处理以降低适合度
本实例证明了用毕赤酵母(Pichia pastoris)的溶液处理蚜虫，毕赤酵母是导致蚜虫适合度降低的酵母菌株。尽管蚜虫中不存在存在于昆虫中的许多先天免疫系统途径，但识别并诱导针对真菌的免疫应答的关键参与物仍然保持完整。具体地，真菌的存在诱导蚜虫丝氨酸蛋白酶Persephone的切割，然后激活Toll途径。接下来，Cactus被磷酸化并且Dorsal被释放并易位至核，激活抗微生物肽、溶菌酶和酚氧化酶的表达和分泌，最终影响对蚜虫内源的细菌群体。本实例证明毕赤酵母的溶液对蚜虫的影响是通过调节对蚜虫内源的细菌群体来介导的，该细菌群体对由酵母的存在产生的蚜虫免疫应答的增加敏感。一个靶向的细菌菌株是布赫纳氏菌属(Buchnera)。
蚜虫是对植物造成直接进食损害，并作为植物病毒的媒介的农业昆虫有害生物。此外，蚜虫蜜露促进了烟霉(sooty mold)的生长，并吸引了令人讨厌的蚂蚁。化学处理的使用(不幸的是，仍然普遍存在)导致选择抗性个体，这些个体的根除变得越来越困难。
治疗性设计
使用两种不同方法递送毕赤酵母(P.pastoris)：蚕豆叶灌注和喷枪喷洒到蚕豆叶上。对于每个实验，有两个实验组：1)用水处理作为阴性对照；和2)用在水中的毕赤酵母(P.pastoris)处理。处理方法和剂量在本文的实验设计部分中描述。
叶灌注实验设计
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中，蚜虫(LSR-1菌株，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成两个不同的处理组：1)允许以用水灌注的叶子为食的那些；和2)允许以用在水中的毕赤酵母(P.pastoris)溶液灌注的叶为食的那些。
将来自毕赤酵母Pink系统(Pichia Pink System)(赛默飞世尔科技公司(Thermofisher scientific))的“蛋白酶野生型”ade2敲除菌株(菌株1)用于实验。毕赤酵母(P.pastoris)在YPD中于30℃生长过夜，并且第二天，将培养物用水洗涤一次并且重悬于水中至最终OD600为0.918，用于在实验的第0天的第一次叶灌注或至最终OD600为5.58，用于在实验的第3天的第二次叶灌注。对于每次叶灌注，将大约1ml的毕赤酵母(P.pastoris)溶液或水(阴性对照)注射入蚕豆叶中。然后将叶的茎置于1.5ml的Eppendorf中，用石蜡膜密封。然后将叶茎置于深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶并允许其进食。在实验的第3天更换叶，并用用毕赤酵母(P.pastoris)(以指定的OD600)或水灌注的新叶替换旧叶。
对于每次处理，将62-63只蚜虫放置在每片叶上。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其去除。此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、和第5龄)。
处理6天后，从来自每个处理组的多个蚜虫提取DNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量布赫纳氏菌和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌属(Buchnera)的引物是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：101)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：102)(Chong和Moran，2016PNAS)。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：103)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：104)(Chong和Moran ，2016PNAS)。使用1.6℃/s的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-3，40x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio Design and Analysis软件)分析qPCR数据。
用酵母溶液处理延迟蚜虫发育的进展
如叶灌注实验设计中所定义的将LSR-1第一龄和第二龄蚜虫分成两个处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。到实验的第6天，大约30％的以用水灌注的叶为食的蚜虫到达第五龄期(图1)。相比之下，到实验的第6天，只有大约3％的以用毕赤酵母(P.pastoris)灌注的叶为食的蚜虫到达第五龄期(图1)。大多数存活至第6天的以用毕赤酵母(P.pastoris)灌注的叶为食的蚜虫是处于第4龄期(约5％)(图1)。这些数据表明毕赤酵母(P.pastoris)处理减缓了蚜虫的发育。
用酵母溶液处理增加了蚜虫死亡率
在处理期间还测量了蚜虫的存活。大约55.5％的以用水灌注的叶为食的蚜虫存活至实验的第6天(图2)。相反，以用毕赤酵母(P.pastoris)灌注的叶为食的蚜虫在处理后第2天迅速开始死亡，并且到第6天，只有11％的蚜虫存活(图2)。这些数据表明通过叶灌注递送的毕赤酵母(P.pastoris)处理导致蚜虫死亡率显著(p＜0.0001)增加。
为了测试毕赤酵母(P.pastoris)处理是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌属(Buchnera)的丧失，并且这种损失影响蚜虫适合度，在处理6天后从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌属(Buchnera)/蚜虫拷贝数。结果是不确定的，因为在第6天毕赤酵母(P.pastoris)处理组中残留的蚜虫数量少，并且缺乏可提取的布赫纳氏菌属(Buchnera)DNA。
喷枪喷洒实验设计：
如本文所述，蚜虫(LSR-1菌株，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物上生长。对于实验，从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：1)将蚜虫置于喷洒水(阴性对照)的叶上，和2)将蚜虫置于喷洒毕赤酵母(P.pastoris)的叶上。
将来自毕赤酵母Pink系统(Pichia Pink System)(赛默飞世尔科技公司(Thermofisher scientific))的“蛋白酶野生型”ade2敲除菌株(菌株1)用于实验。毕赤酵母(P.pastoris)在YPD中于30℃生长过夜，并且第二天，将培养物用水洗涤一次并且重悬于水中至最终OD600为0.918，用于第一次和第二次叶喷洒(在第0天和第3天)以及至最终OD600为5.58，用于在实验的第6天的最终叶喷洒。对于处理，切割蚕豆叶并将茎置于含有无菌水的1.5ml Eppendorf管中，并使用喷枪用上述浓度的水或毕赤酵母(P.pastoris)在两侧喷洒。然后将叶置于深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶并允许其进食。在实验的第3天和第6天，用新的、新鲜喷洒的叶替换旧叶。
每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。对于每次处理，将30只蚜虫放置在每片叶上。每个处理一式两份进行，总共60只蚜虫/处理组。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其去除。此外，在整个实验中每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄和第5龄)。
在处理6天和9天后，从每个处理组的多个蚜虫中提取DNA，并如本文所述的进行用于定量布赫纳氏菌属(Buchnera)水平的qPCR。
用酵母溶液处理没有显著影响蚜虫发育
如本文所述的喷枪喷洒实验设计中所定义的将LSR-1第一龄和第二龄蚜虫分成两个处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。到处理后第6天，来自两个处理组的蚜虫开始到达第5龄期(图3)。到处理后第9天，每组中几乎所有剩余的蚜虫都达到成熟期(图3)。这些数据表明用水或毕赤酵母(P.pastoris)处理的蚜虫之间在发育上几乎没有差异。
经由喷雾进行酵母溶液处理导致蚜虫死亡率升高
在叶喷洒实验期间还测量了蚜虫的存活。在整个实验过程中，只有少数以喷洒水的叶为食的蚜虫死亡，而在毕赤酵母(P.pastoris)处理组的每个时间点都有更多数量的蚜虫死亡(图4)。具体地，在处理后第2天，91％的水处理的蚜虫仍然存活，而仅80％的毕赤酵母(P.pastoris)处理的蚜虫仍然存活。这一趋势持续到实验的第3天、第6天和第7天，其中分别82％、66％和60％的水处理的蚜虫在每个时间点存活，相反分别只有73％、55％和49％的毕赤酵母(P.pastoris)处理的蚜虫在每个时间点存活(图4)。这些数据表明，与单独用水处理相比，通过喷枪喷洒递送的毕赤酵母(P.pastoris)处理导致更高的死亡率。
酵母溶液处理降低了蚜虫中的布赫纳氏菌属(Buchnera)滴度
为了测试通过喷枪喷洒递送的毕赤酵母(P.pastoris)是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌属(Buchnera)的丧失，并且这种损失影响蚜虫适合度，在处理6天和9天后从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌属(Buchnera)/蚜虫拷贝数。在处理后第6天，以喷洒水的叶为食的蚜虫的平均布赫纳氏菌属(Buchnera)/蚜虫比例为47.5(图5)。相反，在以用毕赤酵母(P.pastoris)喷洒的叶为食的蚜虫中，平均布赫纳氏菌属(Buchnera)/蚜虫比例低大约1.2倍(约39)(图5)。然而，在处理后第9天，两个处理组中布赫纳氏菌属(Buchnera)/蚜虫DNA拷贝的比例相似(图5)。
这些数据表明，在处理后6天后，将毕赤酵母(P.pastoris)喷洒到蚕豆叶上减少了蚜虫中的内共生布赫纳氏菌属(Buchnera)。存活至处理后第9天的毕赤酵母(P.pastoris)处理的蚜虫有可能克服免疫应答增加的不利影响，并且可以解释为什么这些蚜虫与水处理的对照具有相似的布赫纳氏菌属(Buchnera)滴度。尽管如此，在第9天检查中位数布赫纳氏菌属(Buchnera)/蚜虫拷贝，揭示了毕赤酵母(P.pastoris)处理组中中位数布赫纳氏菌属(Buchnera)降低的趋势。
确认毕赤酵母(P.pastoris)上调了蚜虫中的免疫应答
鉴于用毕赤酵母(P.pastoris)处理导致蚜虫适合度降低和蚜虫内共生体，布赫纳氏菌属(Buchnera)的滴度降低，下一个实验是确认毕赤酵母(P.pastoris)上调免疫应答。为了测试这一点，在本文所述的每个实验(叶灌注实验设计和喷枪喷洒实验设计)中从蚜虫中分离RNA，并将测量参与真菌免疫应答途径的基因(Persephone、Cactus和Dorsal)的表达，如在Gerardo等人，2010，Genome Biology[基因组生物学]，11：R21，https：//doi.org/10.1186/gb-2010-11-2-r21中所述。预期会看到参与该途径的基因的上调。
总之，这些实例中所述的数据证明了通过用毕赤酵母(P.pastoris)处理蚜虫(这可能导致蚜虫免疫应答的激活)来杀死和减少它们的发育、寿命和内源性细菌群体(例如适合度)的能力。
实例18：用肽核酸的溶液处理的蚜虫
本实例证明用与细胞穿透肽(CPP)融合的针对BCR-4的肽核酸(PNA)(本文是指针对BCR-4的PNA或BCR-4PNA)处理蚜虫(Cermenati等人，2011；Zhou等人，2015)，导致BCR-4基因表达的敲低和蚜虫适合度的降低。
BCR-4是在豌豆蚜(豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))的含菌细胞中表达的若干种富含半胱氨酸的分泌肽之一。专性蚜虫细菌共生体布赫纳氏菌属(Buchnera)被容纳在含菌细胞内。BCR-4与许多根瘤富含半胱氨酸(NCR)肽具有序列同源性，这些肽参与控制植物细菌共生体数量(Pan和Wang，2017 Nature Plants[自然植物]和Durgo等人，2015Proteomics[蛋白质组学])。鉴于BCR-4和NCR的序列相似性，本实例证明BCR-4通过基因敲低破坏BCR-4来使布赫纳氏菌属(Buchnera)失调，从而对蚜虫适合度产生负面影响，而在维持含菌细胞内的内共生体体内平衡中起类似作用。
治疗性设计
通过显微注射或通过蚕豆叶灌注递送BCR-4 PNA。对于显微注射实验，注射溶液是水(阴性对照)或在水中的BCR-4 PNA。对于叶灌注研究，将蚕豆叶用水(阴性对照)或用在水中的BCR-4 PNA灌注。以下详细解释每种递送实验设计。
显微注射递送实验设计
使用具有内部拉出的硼硅酸盐针的NanoJet III Auto-Nanoliter注射器(Drummond Scientific公司；目录号3-000-203-G/XL)进行显微注射。使用漆刷将蚜虫转移到与真空连接的管道系统，该管道系统在注射期间将蚜虫保持在适当位置。注射位点在蚜虫的腹侧胸腔。注射溶液是水(阴性对照)或321ng/μl的在水中的BCR-4 PNA。成年(第4龄和第5龄)蚜虫的注射体积为20nl，速率为2nl/sec。每个处理组具有从每个收集植物注射的大约相同数量的个体。注射后，蚜虫被释放到有盖培养皿中的蚕豆叶上，这些叶的茎在填充有1ml水的Eppendorf管中。在实验过程中监测存活和繁殖力。
蚜虫饲养和维持：
蚜虫LSR-1(仅含有布赫纳氏菌属(Buchnera))，豌豆长管蚜(A.pisum)在气候控制培养箱(16h光照/8h黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，将从健康植物收集第四龄和第五龄蚜虫，并且分成两个处理组：1)水(阴性对照)或2)在水中的BCR-4PNA。
BCR-4 PNA合成
BCR-4-CPP由PNA bio合成并且序列是YGRKKRRQRRR-CGTACAATAATCTCATGG；SEQ IDNO：105和106。CPP(Tat)的序列是YGRKKRRQRRR；SEQ ID NO：106。将PNA溶解在补充有0.1％三氟乙酸(TFA)的80％乙腈和20％水中。一旦溶解，将PNA等分[每等分试样32.1μg/5nmol]、风干、并储存在-20℃。PNA的工作溶液在水中以50μM制备。
处理7天后，从每个处理组的剩余蚜虫中提取RNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且根据制造商的说明，使用RNA提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，miRNeasy试剂盒)从每个个体蚜虫中提取总RNA。使用nanodrop核酸定量法测量RNA浓度。通过RT-qPCR测量BCR-4相对表达。使用的引物是ApBCR-4F(CTCTGTCAACCACCATGAGATTA；SEQ ID NO：107)和ApBCR-4R(TGCAGACTACAGCACAATACTT；SEQ ID NO：108)。内参考基因引物是针对肌动蛋白(管家基因)。正向序列是GATCAGCAGCCACACACAAG；SEQ ID NO：109，并且反向序列是TTTGAACCGGTTTACGACGA；SEQ ID NO：110。使用1.6℃/s的qPCR扩增斜率和以下条件进行RT-qPCR：1)48℃持续30min，2)95℃持续10分钟，3)95℃持续15秒，4)60℃持续1分钟，5)重复步骤3-4，40x，6)95℃持续15秒，7)60℃持续1分钟，8)斜率改变为0.15℃/s，9)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio Designand Analysis软件)分析RT-qPCR数据。
用针对BCR-4基因的PNA显微注射导致BCR-4的表达降低
为了测试通过显微注射递送的针对BCR-4的PNA是否导致蚜虫中BCR-4基因表达降低，用水(对照)或BCR-4 PNA注射蚜虫。处理7天后，从各处理组的蚜虫中提取RNA，并且进行RT-qPCR。与注射BCR-4 PNA的蚜虫相比(图6)，用水显微注射的蚜虫具有大约2倍高的BCR-4表达，表明注射BCR-4 PNA导致BCR-4的敲低。
用针对BCR-4的PNA处理增加了蚜虫死亡率
在处理期间还测量了蚜虫的存活率。在实验期间的大多数时间点，与用针对BCR-4的PNA注射的蚜虫相比，有更多的对照(注射水的)蚜虫存活(图7)。这些数据表明，用针对BCR-4的PNA注射后存活略有下降。
用针对BCR-4的PNA处理降低了蚜虫繁殖力
在实验期间还评估了由每个处理组中蚜虫产生的后代的数量，并且繁殖力表示为在每个评估的时间点每个成虫产生的后代的数量。总体而言，与用针对BCR-4的PNA注射的那些相比，对照(注射水的)蚜虫有产生更多后代的趋势。具体地，在处理后第3天和第7天，水处理组中的蚜虫平均产生5个后代/成虫，而BCR-4 PNA处理组中的蚜虫仅产生4个后代/成虫(图8)。这些数据表明用BCR-4 PNA处理导致蚜虫繁殖力略有下降。
叶灌注实验设计
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中，蚜虫(LSR-1菌株，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成两个不同的处理组：1)允许以用水灌注的叶为食的那些，以及2)允许以用在水中的BCR-4 PNA溶液灌注的叶为食的那些。
如本文所述的合成与CPP融合的BCR-4 PNA(参见显微注射递送实验设计BCR-4PNA合成)。
对于每次叶灌注，将大约1ml的水(阴性对照)或1μM BCR-4 PNA溶液注射入蚕豆叶中。然后将叶的茎置于1.5ml的Eppendorf中，用石蜡膜密封。然后将叶茎置于深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶并允许其进食。贯穿整个实验，每2-3天用新的、新鲜注射的叶替换旧叶。对于每次处理，将60只蚜虫放置在每片叶上。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其去除。此外，在整个实验中每天确定发育阶段(第1龄，第2龄、第3龄、第4龄和第5龄)。
处理5天和6天后，从来自每个处理组的死蚜虫提取DNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量布赫纳氏菌和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌的引物是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：101)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：102)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：103)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：104)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。使用1.6℃/秒的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-340x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio设计和分析)分析qPCR数据。
在处理后第7天，从活蚜虫中提取RNA，并如上所述进行RT-pPCR(参见显微注射递送实验设计)以定量BCR-4的表达。
用BCR-4 PNA叶灌注处理延迟蚜虫发育的进展
如叶灌注实验设计中所定义的将LSR-1第一龄和第二龄蚜虫分成两个组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。在实验期间的若干个时间点，用BCR-4 PNA处理的蚜虫的发育延迟。例如在处理后第2天，大约19％的以用水灌注的叶为食的蚜虫处于第3龄期(图9)。相比之下，仅8％的以用针对BCR-4的PNA灌注的叶为食的蚜虫处于第3龄期。这些数据表明用针对BCR-4的PNA处理减缓了蚜虫的发育。用BCR-4 PNA叶灌注处理增加了蚜虫死亡率
贯穿整个处理过程还监测了存活。到处理后第7天，水(对照)处理组中53％的蚜虫仍然存活(图10)。相反，PNA BCR-4处理组中仅30％的蚜虫在第7天存活(图10)。这些数据表明用针对BCR-4的PNA处理导致蚜虫的死亡率增加。
用BCR-4 PNA叶灌注处理增加了蚜虫中的布赫纳氏菌属(Buchnera)滴度
为了测试通过叶灌注递送的BCR-4 PNA是否特异性地导致影响蚜虫中布赫纳氏菌属(Buchnera)，并且影响蚜虫适合度，在处理后5天和6天后从每个处理组的死蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定每个处理组中布赫纳氏菌属(Buchnera)滴度。虽然以用水灌注的叶为食的蚜虫的平均比例为大约20个布赫纳氏菌属(Buchnera)/蚜虫拷贝，但以用针对BCR-4的PNA灌注的叶为食的蚜虫具有显著更高的布赫纳氏菌属(Buchnera)/蚜虫拷贝(大约57)，见图11。这些数据表明用针对BCR-4的PNA处理会导致布赫纳氏菌属(Buchnera)滴度失衡。
经由叶灌注用针对BCR-4的PNA处理敲低了BCR-4
为了评估在以用针对BCR-4的PNA灌注的叶为食的蚜虫中BCR-4表达是否降低，在处理7天后从活蚜虫中分离RNA并进行RT-qPCR。与单独用水处理的蚜虫相比，用针对BCR-4的PNA处理的蚜虫中BCR-4的中位数转录物水平低大约3倍(图12)，证实针对BCR-4的PNA敲低了BCR-4表达。
总之，这些数据证明了通过用靶向含菌细胞中表达的基因(BCR-4)的PNA处理蚜虫来控制内共生体布赫纳氏菌属(Buchnera)的群体，以杀死和降低蚜虫的发育、繁殖力和寿命(例如，适合度)的能力。
实例19：用针对含菌细胞转运体的dsRNA溶液处理的蚜虫
本实例证明了用双链RNA(dsRNA)处理蚜虫导致一些必需基因的敲低，包括谷氨酰胺转运体1基因(ApGLNT1)，该基因已在蚜虫豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)的含菌细胞中鉴定。谷氨酰胺转运体负责将谷氨酰胺从蚜虫血淋巴摄取到含菌细胞中，其中专性内共生体蚜虫布赫纳氏菌(Buchnera aphidicola)位于含菌细胞中。共生功能体(豌豆长管蚜(A.pisum)和布赫纳氏菌属(Buchnera))的组合生物合成能力足以用于所有20个蛋白编码氨基酸(包括蚜虫单独不能合成的氨基酸)的生物合成。通过使谷氨酰胺转运体减活或沉默(例如通过dsRNA的RNAi)阻断谷氨酰胺摄取对含菌细胞和整个蚜虫中的氨基酸和蛋白合成产生负面影响，从而对其适合度产生负面影响。
治疗性设计
显微注射第5龄LSR-1蚜虫。注射溶液是dd-水(阴性对照)或在各种浓度(8或60ng/蚜虫；见下文)的dd-水中稀释的dsRNA。
蚜虫饲养和维持
蚜虫LSR-1(仅含有布赫纳氏菌属(Buchnera))，豌豆长管蚜(A.pisum)在气候控制培养箱(16h光照/8h黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第五龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组；1)水(阴性对照)或2)针对ApGLNT1的dsRNA(以本文指示的浓度)。
显微注射递送实验设计
使用具有内部拉出的硼硅酸盐针的NanoJet III Auto-Nanoliter注射器(Drummond Scientific公司；目录号3-000-203-G/XL)进行显微注射。使用漆刷将蚜虫转移到与真空连接的管道系统，该管道系统在显微注射期间将蚜虫保持在适当位置。注射位点在蚜虫的腹侧胸腔。成年蚜虫的注射体积为20nl，速率为2nl/sec。每个处理组具有从每个收集植物注射的大约相同数量的个体。
注射后，蚜虫被释放到有盖培养皿中的蚕豆叶上，这些叶的茎在填充有1ml水的Eppendorf管中。每天监测蚜虫的存活，并且发现死蚜虫时将其去除。计数每组的后代数量，并将繁殖力测量为在每个时间点每只蚜虫产生的后代(F1代)数量。
在选择实验中，通过每天记录后代的发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄和第5龄)测量来自每个处理组的后代的组中的发育。还通过在收集后4天对蚜虫进行成像并确定其面积来测量发育。用于合成dsRNA的模板是从mRNA逆转录的cDNA。从一个第5龄豌豆长管蚜(A.pisum)(LSR-1菌株)中提取RNA，并且通过Nanodrop(赛默飞世尔科技公司(Thermofisher scientific))定量。根据制造商的方案，使用Superscript IV试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo fisher scientific))，将约100μg的总RNA作为模板添加至逆转录反应中。
为了扩增用于dsRNA的模板，将cDNA稀释100倍并用于以下PCR。PCR反应(25μl最终体积)含有12.5μL的Go Taq Green 2X mix(普洛麦格公司(Promega))、0.2μl的正向引物(表12)、0.2μl的反向引物(表12)和12.1μl的100倍稀释的cDNA。使用以下条件进行PCR反应：1)95℃持续2分钟，2)95℃持续20秒，3)55℃持续15秒，4)72℃持续30秒，5)重复步骤2-4，35x，6)72℃持续5分钟。通过在1.5％琼脂糖上进行电泳来验证PCR扩增产物的大小，并通过QIAquick DNA纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen))切割和纯化预期大小的条带。根据制造商的方案，使用T7MEGAscript试剂盒(Ambion，赛默飞世尔科技公司(Thermo fisherscientific)；目录号AM1334)在体外合成dsRNA。通过Nanodrop(赛默飞世尔科技公司(Thermo fisher scientific))测量dsRNA的浓度。
表12：用于dsRNA合成的登录号和引物。
Figure BDA0002155467980002751
在处理后的指定时间点，从每个处理组的蚜虫中提取DNA和/或RNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且根据制造商的说明，使用DNA或RNA提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，分别是DNeasy或miRNeasy试剂盒)从每个个体蚜虫中提取总DNA或RNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA和RNA浓度。通过qPCR测量布赫纳氏菌属(Buchnera)和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌属(Buchnera)的引物是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：101)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：102)(Chong和Moran，2016 PNAS)。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：103)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：104)(Chong和Moran，2016PNAS)。使用1.6℃/s的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-3，40x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudioDesign and Analysis软件)分析qPCR数据。通过RT-qPCR测量ApGLNTl相对表达。用于ApGLNT1的引物是ACYPI001018-正向(CCTGAAATCGACGGGGTCC；SEQ ID NO：113)和ACYPI001018-反向(AGATCGGCAACATCTGTTCGT；SEQ ID NO：114)(两者均由NCBIpickprimers软件设计)。内参考基因是肌动蛋白(管家基因)。用于肌动蛋白的引物是肌动蛋白-F(GATCAGCAGCCACACACAAG；SEQ ID NO：109)和肌动蛋白-R(TTTGAACCGGTTTACGACGA；SEQ IDNO：110)使用1.6℃/s的qPCR扩增斜率和以下条件进行RT-qPCR：1)48℃持续30min，2)95℃持续10分钟，3)95℃持续15秒，4)60℃持续1分钟，5)重复步骤3-4，40x，6)95℃持续15秒，7)60℃持续1分钟，8)斜率改变为0.15℃/s，9)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio Design and Analysis软件)分析RT-qPCR数据。
用dsRNA显微注射敲低了蚜虫中的含菌细胞转运体基因表达
初步的实验评估了将dsRNA注射入蚜虫是否会导致基因表达下降。用8ngdsRNA或水(作为阴性对照)注射成年蚜虫。在后注射第两天，从每个处理组中剩余的蚜虫中提取RNA，并进行RT-qPCR以定量ApGLNT1的表达。用阴性对照溶液(水)显微注射的蚜虫具有ApGLNT1基因的高相对表达。相比之下，用ApGLNT1的dsRNA显微注射的蚜虫成虫具有剧烈并且显著的ApGLNT1基因表达降低(图13)，表明dsRNA显微注射处理降低了ApGLNT1基因的表达。
dsRNA-ApGLNT1的显微注射导致蚜虫死亡率升高
为了评估dsRNA-ApGLNT1显微注射对昆虫适合度的影响，向LSR-1第五龄蚜虫注射60ng dsRNA并且监测存活5天。在注射后第3天，大约72％的注射水的蚜虫存活(图14)。相反，仅52％的注射dsRNA的蚜虫存活(图14)。在注射后第4天和第5天，与注射dsRNA的组相比，注射水的组中有显著更多的蚜虫存活。在第4天和第5天分别有大约62％和51％的注射水的蚜虫存活，而在第4天和第5天分别仅30％和12.5％的注射dsRNA的蚜虫存活(图14)。这些数据表明，与注射水的对照相比，针对ApGLNT1的dsRNA显著(p＝0.0004)增加了蚜虫死亡率。
dsRNA-ApGLNT1的显微注射导致布赫纳氏菌属(Buchnera)滴度降低
为了测试存活和适合度的降低是否是由于内共生体数量的降低，在后注射第5天从活蚜虫中提取DNA，并进行qPCR以量化蚜虫中存在的布赫纳氏菌属(Buchnera)的量。用水显微注射的蚜虫的平均比例为大约11个布赫纳氏菌属(Buchnera)/蚜虫拷贝(图15)。相比之下，注射针对ApGLNT1的dsRNA的蚜虫中的布赫纳氏菌属(Buchnera)/蚜虫拷贝低大约1.28倍(图15)。这些数据显示，dsRNA-ApGLNT1的显微注射导致布赫纳氏菌属(Buchnera)滴度降低，这导致蚜虫适合度降低。
用dsRNA-ApGLNT1显微注射的蚜虫后代的发育延迟
在注射后第3天，将来自每个处理组的40个后代(第一龄)转移到它们自己的人工喂养系统(含有蚕豆叶茎的有盖培养皿放入用石蜡膜密封的1.5ml Eppendorf管中)并监测随着时间的发育。总体而言，从注射了dsRNA-ApGLNT1的成虫中取得的后代的发育延迟。到后代转移后第4天，来自注射水的蚜虫的后代中大约22.5％开始到达第5龄期(图4A)。相反，在第4天，来自注射dsRNA-ApGLNT1的成虫的后代中仅7.5％达到第5龄期(图16A)。另外，通过对每组中的每只蚜虫进行成像，在第4天测量蚜虫面积。虽然来自注射水的成虫的后代的平均大小为0.55mm2，但注射dsRNA-ApGLNT1的后代成虫显着更小(p＝0.009)，并且平均大小为0.4mm2(图16B)。这些数据表明用dsRNA-ApGLNT1处理成虫导致后代发育严重延迟。
实例20：通过用转基因植物处理蚜虫来生产表达dsRNA的转基因植物，该dsRNA靶向多种途径以使昆虫-共生体体内平衡不稳定
本实例证明了遗传修饰烟草(Nicotiana tabacum)以产生dsRNA用于递送至蚜虫以影响昆虫-共生体体内平衡的能力。使用将质粒携带至植物的转基因根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将在烟草(Nicotiana tabacum)中稳定表达dsRNA的遗传构建体递送至植物。
实验设计
若干种基因将被靶向用于在多种途径中敲低，这些途径对于蚜虫与其专性内共生细菌布赫纳氏菌属(Buchnera)之间的共生关系至关重要。具体地，含菌细胞(GlnT1)、ultrabithorax(Ubx)、β丙氨酸合酶(bAS)和cactus(Cact)的谷氨酰胺转运体被靶向。GlnT1是一种谷氨酰胺转运体，用于将谷氨酰胺导入含菌细胞，并且谷氨酰胺的下游产物对于通过布赫纳氏菌属(Buchnera)合成必需氨基酸至关重要。Ubx是参与蚜虫一般发育，以及会容纳布赫纳氏菌属(Buchnera)的含菌细胞的形成的基因。bAS是合成β丙氨酸所需的蚜虫基因，β丙氨酸是通过布赫纳氏菌属(Buchnera)合成维生素B5的前体。Cact是Toll途径的负调节物，它是蚜虫中的主要免疫途径。降低Cact水平可以上调导致布赫纳氏菌属(Buchnera)水平失调的全身免疫应答。
生成含有dsRNA表达盒的质粒：
大肠杆菌(E.coli)和根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)之间的穿梭运载体将用于携带dsRNA表达盒，该表达盒包括dsRNA表达序列上游的花椰菜花叶病毒35S启动子(pCaMV 35S)。dsRNA表达序列包括正义序列，随后是通过小发夹环序列连接的靶蚜虫基因区域的反义序列(图17)。
然后将dsRNA表达盒置于大肠杆菌(E.coli)和根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的穿梭运载体中(图18)。质粒还将含有可用作选择标记物的卡那霉素和庆大霉素抗性盒。将转录终止子置于dsRNA表达转录物之后以消除失控转录。
可以经由Gibson assembly技术将各种基因(GlnT1、Ubx、bAS和Cact)的dsRNA表达序列引入运载体中。首先，在PCR中使用适当的引物将产生具有与质粒中的邻近区域匹配的突出端的正义和反义扩增子。具体地，正义链的左突出端将具有与pCaMV 35S同源的区域(约30bp)，并且反义链的右突出端将具有与35S终止子区域同源的区域(约30bp)。正义链的右突出端和反义链的左突出端将具有彼此重叠的部分，其中包括小发夹区域(acacgt，SEQID NO：115)。产生扩增子的引物序列示出于表13中。
表13产生用于Gibson assembly技术的扩增子以产生针对豌豆长管蚜(A.pisum)基因的发夹dsRNA序列的引物列表。每个靶基因的区域将被扩增为正义或反义，其侧翼区域与用于Gibson assembly技术的质粒主链同源。
Figure BDA0002155467980002791
Figure BDA0002155467980002801
表14：产生用于Gibson assembly技术的扩增子以产生针对桃蚜(Myzuspersicae)基因的发夹dsRNA序列的引物列表。每个靶基因的区域将被扩增为正义或反义，其侧翼区域与用于Gibson assembly技术的质粒主链同源。
Figure BDA0002155467980002802
Figure BDA0002155467980002811
一旦产生正义和反义扩增子，质粒将被双酶解以在pCaMV 35S的末端和35S终止子的起始处产生突出端。将使用Gibson assembly试剂盒(如SGI Gibson assembly试剂盒)在Gibson assembly系统中将酶解的质粒，正义和反义扩增子组合在一起。然后将用质粒转化大肠杆菌(E.coli)(DH5α，电转感受态细胞)并使其在含有50mg/ml卡那霉素的LB平板上生长。抗性菌落将用于收获含有dsRNA表达盒的质粒。对于四种不同插入物中的每一种，质粒将命名为pGlnT1dsRNA、pUbxdsRNA、pbASdsRNA和pCactdsRNA。这些质粒将用于经由电穿孔转化根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)。在含有卡那霉素(50mg/ml)和庆大霉素(50mg/ml)的LB培养基上进行选择后，抗性菌落将被分离并且维持在选择平板上。
转化的根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)浸润到烟草(N.tabacum)中：
使转化的根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)在含有选择抗生素的LB培养基中生长过夜直至OD 600为0.6。将细胞沉淀下来，重悬于浸润培养基(10mM MES、150μM乙酰丁香酮和10mM MgCl2，pH 5.5)中，并调节至OD600为0.6。将细胞在室温下孵育2-4小时。将细胞悬浮液浸润到健康的烟草(N.tabacum)叶中。通过将1ml注射器的钝开口端置于叶的下侧并迫使细胞悬浮液进入叶来实现浸润过程。浸润区域很容易与未处理的区域区分开，并使用标记物清楚地分界。然后覆盖植物以产生高水分环境，持续24h。
这些叶表达绿色荧光蛋白，并在1-2天后在落射荧光显微镜下可视化，见图19。由根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)转移到植物中的遗传物质含有由在烟草(N.tabacum)中有活性的泛素启动子驱动的绿色荧光(GFP)表达盒。GFP的表达将用作dsRNA表达的替代指示。
产生表达dsRNA的烟草(N.tabacum)的稳定克隆
显示GFP表达的浸润的叶将被分离，并且非常强烈地表达GFP的中脉附近的叶区域将被切除。然后将通过搅动使用灭菌溶液(2％次氯酸盐，0.01％tween 20)将叶圆盘彻底灭菌10min。在25℃，16h:8h光照:黑暗循环下，将无菌叶圆盘置于含有生芽培养基(2.15g/lMurashige和Skoog盐(不含IAA、激动素或蔗糖)、0.8％(w/v)琼脂、3.0％(w/v)蔗糖、0.1mg/l吲哚丁酸、0.8mg/l 6-苄基氨基嘌呤、0.1mg/l羧苄青霉素、0.2mg/l替卡西林/克拉维酸和适合选择携带FP融合构建体的二元媒介)的有盖培养皿上，直至枝出现。然后在25℃，16h:8h光照:黑暗循环下，将新枝移植到含有生根培养基(2.15g/l Murashige和Skoog盐、0.8％(w/v)琼脂、3.0％(w/v)蔗糖、0.5mg/l吲哚丁酸、0.1mg/l羧苄青霉素、0.2mg/l替卡西林/克拉维酸)的平板中直至根出现。这些新植物将被转移到phytatray箱中以形成更大的根，以便它们可以转移到土壤中。将在所有新克隆中测试GFP的表达以确保稳定表达。
通过在表达dsRNA的烟草(N.tabacum)上饲养蚜虫实现用dsRNA处理蚜虫
蚜虫将在气候控制培养箱中的10周龄烟草(N.tabacum)植物上生长(16h:8h光照:黑暗循环，60％湿度，25℃)。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，来自不同植物的5-10个成虫将分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，将从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成两个不同的处理组：1)允许以表达dsRNA的叶为食的那些，和2)允许以不表达dsRNA的对照叶为食的那些。
对于每个喂养实验，将从植物中取出叶并且置于用石蜡膜密封的1.5mlEppendorf中。叶茎将置于深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并且蚜虫将被施用于植物的叶并允许其进食。贯穿整个实验，每2-3天将用新的、新鲜注射的叶替换旧叶。对于每次处理，60只蚜虫将放置在每片叶上。将每天监测蚜虫的存活，并且当发现死蚜虫时将其去除。此外，将在整个实验中每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄和第5龄)。
处理5天和6天后，将从来自每个处理组的死蚜虫提取DNA。简言之，将通过使蚜虫浸入6％漂白溶液持续大约5秒对蚜虫体表进行灭菌。然后将在无菌水中漂洗蚜虫，并且根据制造商的说明，将使用DNA提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，DNeasy试剂盒)从每个个体蚜虫中提取DNA。将使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且将通过qPCR测量布赫纳氏菌属(Buchnera)和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌属(Buchnera)的引物将是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：101)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：102)(Chong和Moran，2016 PNAS)。用于蚜虫的引物将是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：103)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：104)(Chong和Moran，2016PNAS)。将使用1.6℃/s的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-340x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。将使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio Design and Analysis软件)分析qPCR数据。
在处理后7天，将从活蚜虫中提取RNA，并且将进行RT-pPCR以定量BCR-4的表达。简言之，将通过使蚜虫浸入6％漂白溶液持续大约5秒对蚜虫体表进行灭菌。然后将在无菌水中漂洗蚜虫，并且根据制造商的说明，将使用RNA提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，miRNeasy试剂盒)从每个个体蚜虫中提取总RNA。将使用nanodrop核酸定量法测量RNA浓度。将通过RT-qPCR测量BCR-4相对表达。使用的引物将是ApBCR-4F(CTCTGTCAACCACCATGAGATTA；SEQID NO：107)和ApBCR-4R(TGCAGACTACAGCACAATACTT；SEQ ID NO：108)。内参考基因引物是针对肌动蛋白(管家基因)。正向序列是GATCAGCAGCCACACACAAG；SEQ ID NO：109，并且反向序列是TTTGAACCGGTTTACGACGA；SEQ ID NO：110。将使用1.6℃/s的RT-qPCR扩增斜率和以下条件进行RT-qPCR：1)48℃持续30min，2)95℃持续10分钟，3)95℃持续15秒，4)60℃持续1分钟，5)重复步骤3-4，40x，6)95℃持续15秒，7)60℃持续1分钟，8)斜率改变为0.15℃/s，9)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio Design and Analysis软件)分析RT-qPCR数据。
如先前的实例中示出的，与对照叶上饲养的蚜虫相比，预期以表达针对蚜虫靶基因的dsRNA的叶为食的蚜虫具有较低的存活率，发育较慢，含有较少的布赫纳氏菌属(Buchnera)，并且具有降低的靶基因表达。
本文所述的这些数据一起证明了通过用表达靶向蚜虫中的含菌细胞的一个或多个必需基因(例如谷氨酰胺转运体ApGLNT1)的dsRNA的植物处理蚜虫来杀死和减少蚜虫的发育和寿命(例如，适合度)的能力。
其他实施例
尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和实例详细地描述了前述发明，但是描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的披露都明确地通过引用以其全文并入。
序列表
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tagactagag tctcatagag ggaggtagaa ttctaggtgt agcggtgaaa tgcgtagata 720
tctagaggaa tacccgtggc gaaagcgacc tcctaaatga aaactgacgc tgaggtgcga 780
aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc atgctgtaaa cgatgtcgac 840
ttggaggttg tttcctagag aagtggcttc cgaagctaac gcattaagtc gaccgcctgg 900
ggagtacggt cgcaaggcta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 960
gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag aaccttacct ggtcttgaca tccatagaat 1020
tttttagaga taaaagagtg ccttagggaa ctatgagaca ggtgctgcat ggctgtcgtc 1080
agctcgtgtt gtgaaatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaacccct atcctttgtt 1140
gccatcaggt tatgctggga actcagagga gactgccggt tataaaccgg aggaaggtgg 1200
ggatgacgtc aagtcatcat ggcccttacg accagggcta cacacgtgct acaatggcat 1260
atacaaagag atgcaactct gcgaagataa gcaaacctca taaagtatgt cgtagtccgg 1320
actggagtct gcaactcgac tccacgaagt aggaatcgct agtaatcgtg gatcagaatg 1380
ccacggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt 1440
gcaaaagaag caggtagctt aaccagatta ttttattgga gggcgcttac cactttgtga 1500
ttcatgactg gggtgaagtc gtaacaaggt aaccgtaggg gaacctgcgg ttggatcacc 1560
tcctta 1566
<210> 6
<211> 828
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌BCc
<400> 6
atgagatcat taatatataa aaatcatgtt ccaattaaaa aattaggaca aaatttttta 60
cagaataaag aaattattaa tcagataatt aatttaataa atattaataa aaatgataat 120
attattgaaa taggatcagg attaggagcg ttaacttttc ctatttgtag aatcattaaa 180
aaaatgatag tattagaaat tgatgaagat cttgtgtttt ttttaactca aagtttattt 240
attaaaaaat tacaaattat aattgctgat attataaaat ttgatttttg ttgttttttt 300
tctttacaga aatataaaaa atataggttt attggtaatt taccatataa tattgctact 360
atattttttt taaaaacaat taaatttctt tataatataa ttgatatgca ttttatgttt 420
caaaaagaag tagcaaagag attattagct actcctggta ctaaagaata tggtagatta 480
agtattattg cacaatattt ttataagata gaaactgtta ttaatgttaa taaatttaat 540
ttttttccta ctcctaaagt agattctact tttttacgat ttactcctaa atattttaat 600
agtaaatata aaatagataa acatttttct gttttagaat taattactag attttctttt 660
caacatagaa gaaaattttt aaataataat ttaatatctt tattttctac aaaagaatta 720
atttctttag atattgatcc atattcaaga gcagaaaatg tttctttaat tcaatattgt 780
aaattaatga aatattattt gaaaagaaaa attttatgtt tagattaa 828
<210> 7
<211> 921
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌 (柏大蚜)
<400> 7
ttatcttatt tcacatatac gtaatattgc gctgcgtgca cgaggatttt tttgaatttc 60
agatatattt ggtttaatac gtttaataaa acgtattttt ttttttattt ttcttatttg 120
caattcagta ataggaagtt ttttaggtat atttggataa ttactgtaat tcttaataaa 180
gttttttaca atcctatctt caatagaatg aaaactaata atagcaattt ttgatccgga 240
atgtaatatg ttaataataa tttttaatat tttatgtaat tcatttattt cttggttaat 300
atatattcga aaagcttgaa atgttctcgt agctggatgt ttaaatttgt catattttgg 360
gattgatttt tttatgattt gaactaactc taacgtgctt gttatggttt ttttttttat 420
ttgtaatatg atggctcggg atattttttt tgcgtatttt tcttcgccaa aattttttat 480
tacctgttct attgtttttt ggtttgtttt ttttaaccat tgactaactg atattccaga 540
tttagggttc atacgcatat ctaaaggtcc atcattcata aatgaaaatc ctcggatact 600
agaatttaac tgtattgaag aaatacctaa atctaataat attccatcta ttttatctct 660
atttttttct ttttttaata ttttttcaat attagaaaat ttacctaaaa atattttaaa 720
tcgcgaatct tttatttttt ttccgatttt tatagattgt gggtcttgat caatactata 780
taactttcca ttaaccccta attcttgaag aattgctttt gaatgaccac cacctccaaa 840
tgtacaatca acatatgtac cgtctttttt tatttttaag tattgtatga tttcttttgt 900
taaaacaggt ttatgaatca t 921
<210> 8
<211> 822
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌菌株G002 (桃蚜)
<400> 8
atgaaaagta taaaaacttt taaaaaacac tttcctgtga aaaaatatgg acaaaatttt 60
cttattaata aagagatcat aaaaaatatt gttaaaaaaa ttaatccaaa tatagaacaa 120
acattagtag aaatcggacc aggattagct gcattaactg agcccatatc tcagttatta 180
aaagagttaa tagttattga aatagactgt aatctattat attttttaaa aaaacaacca 240
ttttattcaa aattaatagt tttttgtcaa gatgctttaa actttaatta tacaaattta 300
ttttataaaa aaaataaatt aattcgtatt tttggtaatt taccatataa tatctctaca 360
tctttaatta tttttttatt tcaacacatt agagtaattc aagatatgaa ttttatgctt 420
caaaaagaag ttgctgcaag attaattgca ttacctggaa ataaatatta cggtcgtttg 480
agcattatat ctcaatatta ttgtgatatc aaaattttat taaatgttgc tcctgaagat 540
ttttggccta ttccgagagt tcattctata tttgtaaatt taacacctca tcataattct 600
ccttattttg tttatgatat taatatttta agccttatta caaataaggc tttccaaaat 660
agaagaaaaa tattacgtca tagtttaaaa aatttatttt ctgaaacaac tttattaaat 720
ttagatatta atcccagatt aagagctgaa aatatttctg tttttcagta ttgtcaatta 780
gctaattatt tgtataaaaa aaattatact aaaaaaaatt aa 822
<210> 9
<211> 822
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌菌株Ak (苜蓿无网长管蚜)
<400> 9
attataaaaa attttaaaaa acattttcct ttaaaaaggt atggacaaaa ttttcttgtc 60
aatacaaaaa ctattcaaaa gataattaat ataattaatc caaacaccaa acaaacatta 120
gtggaaattg gacctggatt agctgcatta acaaaaccaa tttgtcaatt attagaagaa 180
ttaattgtta ttgaaataga tcctaattta ttgtttttat taaaaaaacg ttcattttat 240
tcaaaattaa cagtttttta tcaagacgct ttaaatttca attatacaga tttgttttat 300
aagaaaaatc aattaattcg tgtttttgga aacttgccat ataatatttc tacatcttta 360
attatttctt tattcaatca tattaaagtt attcaagata tgaattttat gttacagaaa 420
gaggttgctg aaagattaat ttctattcct ggaaataaat cttatggccg tttaagcatt 480
atttctcagt attattgtaa aattaaaata ttattaaatg ttgtacctga agattttcga 540
cctataccga aagtgcattc tgtttttatc aatttaactc ctcataccaa ttctccatat 600
tttgtttatg atacaaatat cctcagttct atcacaagaa atgcttttca aaatagaagg 660
aaaattttgc gtcatagttt aaaaaattta ttttctgaaa aagaactaat tcaattagaa 720
attaatccaa atttacgagc tgaaaatatt tctatctttc agtattgtca attagctgat 780
tatttatata aaaaattaaa taatcttgta aaaatcaatt aa 822
<210> 10
<211> 822
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌菌株Ua (Uroleucon ambrosiae)
<400> 10
atgatactaa ataaatataa aaaatttatt cctttaaaaa gatacggaca aaattttctt 60
gtaaatagag aaataatcaa aaatattatc aaaataatta atcctaaaaa aacgcaaaca 120
ttattagaaa ttggaccggg tttaggtgcg ttaacaaaac ctatttgtga atttttaaat 180
gaacttatcg tcattgaaat agatcctaat atattatctt ttttaaagaa atgtatattt 240
tttgataaat taaaaatata ttgtcataat gctttagatt ttaattataa aaatatattc 300
tataaaaaaa gtcaattaat tcgtattttt ggaaatttac catataatat ttctacatct 360
ttaataatat atttatttcg gaatattgat attattcaag atatgaattt tatgttacaa 420
caagaagtgg ctaaaagatt agttgctatt cctggtgaaa aactttatgg tcgtttaagt 480
attatatctc aatattattg taatattaaa atattattac atattcgacc tgaaaatttt 540
caacctattc ctaaagttaa ttcaatgttt gtaaatttaa ctccgcatat tcattctcct 600
tattttgttt atgatattaa tttattaact agtattacaa aacatgcttt tcaacataga 660
agaaaaatat tgcgtcatag tttaagaaat tttttttctg agcaagattt aattcattta 720
gaaattaatc caaatttaag agctgaaaat gtttctatta ttcaatattg tcaattggct 780
aataatttat ataaaaaaca taaacagttt attaataatt aa 822
<210> 11
<211> 816
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌 (大豆蚜)
<400> 11
atgaaaaagc atattcctat aaaaaaattt agtcaaaatt ttcttgtaga tttgagtgtg 60
attaaaaaaa taattaaatt tattaatccg cagttaaatg aaatattggt tgaaattgga 120
ccgggattag ctgctatcac tcgacctatt tgtgatttga tagatcattt aattgtgatt 180
gaaattgata aaattttatt agatagatta aaacagttct cattttattc aaaattaaca 240
gtatatcatc aagatgcttt agcatttgat tacataaagt tatttaataa aaaaaataaa 300
ttagttcgaa tttttggtaa tttaccatat catgtttcta cgtctttaat attgcattta 360
tttaaaagaa ttaatattat taaagatatg aattttatgc tacaaaaaga agttgctgaa 420
cgtttaattg caactccagg tagtaaatta tatggtcgtt taagtattat ttctcaatat 480
tattgtaata taaaagtttt attgcatgtg tcttcaaaat gttttaaacc agttcctaaa 540
gtagaatcaa tttttcttaa tttgacacct tatactgatt atttccctta ttttacttat 600
aatgtaaacg ttcttagtta tattacaaat ttagcttttc aaaaaagaag aaaaatatta 660
cgtcatagtt taggtaaaat attttctgaa aaagttttta taaaattaaa tattaatccc 720
aaattaagac ctgagaatat ttctatatta caatattgtc agttatctaa ttatatgata 780
gaaaataata ttcatcagga acatgtttgt atttaa 816
<210> 12
<211> 1463
<212> DNA
<213> Annandia pinicola
<400> 12
agattgaacg ctggcggcat gccttacaca tgcaagtcga acggtaacag gtcttcggac 60
gctgacgagt ggcgaacggg tgagtaatac atcggaacgt gcccagtcgt gggggataac 120
tactcgaaag agtagctaat accgcatacg atctgaggat gaaagcgggg gaccttcggg 180
cctcgcgcga ttggagcggc cgatggcaga ttaggtagtt ggtgggataa aagcttacca 240
agccgacgat ctgtagctgg tctgagagga cgaccagcca cactggaact gagatacggt 300
ccagactctt acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca 360
gctatgtcgc gtgtatgaag aagaccttag ggttgtaaag tactttcgat agcataagaa 420
gataatgaga ctaataattt tattgtctga cgttagctat agaagaagca ccggctaact 480
ccgtgccagc agccgcggta atacgggggg tgctagcgtt aatcggaatt actgggcgta 540
aagagcatgt aggtggttta ttaagtcaga tgtgaaatcc ctggacttaa tctaggaact 600
gcatttgaaa ctaataggct agagtttcgt agagggaggt agaattctag gtgtagcggt 660
gaaatgcata gatatctaga ggaatatcag tggcgaaggc gaccttctgg acgataactg 720
acgctaaaat gcgaaagcat gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccatgctg 780
taaacgatgt cgactaagag gttggaggta taacttttaa tctctgtagc taacgcgtta 840
agtcgaccgc ctggggagta cggtcgcaag gctaaaactc aaatgaattg acgggggcct 900
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gtaaaacctt acctggtctt 960
gacatccaca gaattttaca gaaatgtaga agtgcaattt gaactgtgag acaggtgctg 1020
catggctgtc gtcagctcgt gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080
cttgtccttt gttaccataa gatttaagga actcaaagga gactgccggt gataaactgg 1140
aggaaggcgg ggacgacgtc aagtcatcat ggcccttatg accagggcta cacacgtgct 1200
acaatggcat atacaaagag atgcaatatt gcgaaataaa gccaatctta taaaatatgt 1260
cctagttcgg actggagtct gcaactcgac tccacgaagt cggaatcgct agtaatcgtg 1320
gatcagcatg ccacggtgaa tatgtttcca ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg 1380
gaagtggatt gcaaaagaag taagaaaatt aaccttctta acaaggaaat aacttaccac 1440
tttgtgactc ataactgggg tga 1463
<210> 13
<211> 1554
<212> DNA
<213> Moranella endobia
<400> 13
tctttttggt aaggaggtga tccaaccgca ggttccccta cggttacctt gttacgactt 60
caccccagtc atgaatcaca aagtggtaag cgccctccta aaaggttagg ctacctactt 120
cttttgcaac ccacttccat ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc 180
accgtggcat tctgatccac gattactagc gattcctact tcatggagtc gagttgcaga 240
ctccaatccg gactacgacg cactttatga ggtccgctaa ctctcgcgag cttgcttctc 300
tttgtatgcg ccattgtagc acgtgtgtag ccctactcgt aagggccatg atgacttgac 360
gtcatcccca ccttcctccg gtttatcacc ggcagtctcc tttgagttcc cgaccgaatc 420
gctggcaaaa aaggataagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tttcacaaca 480
cgagctgacg acagccatgc agcacctgtc tcagagttcc cgaaggtacc aaaacatctc 540
tgctaagttc tctggatgtc aagagtaggt aaggttcttc gcgttgcatc gaattaaacc 600
acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattcattt gagttttaac cttgcggccg 660
tactccccag gcggtcgatt taacgcgtta actacgaaag ccacagttca agaccacagc 720
tttcaaatcg acatagttta cggcgtggac taccagggta tctaatcctg tttgctcccc 780
acgctttcgt acctgagcgt cagtattcgt ccagggggcc gccttcgcca ctggtattcc 840
tccagatatc tacacatttc accgctacac ctggaattct acccccctct acgagactct 900
agcctatcag tttcaaatgc agttcctagg ttaagcccag ggatttcaca tctgacttaa 960
taaaccgcct acgtactctt tacgcccagt aattccgatt aacgcttgca ccctccgtat 1020
taccgcggct gctggcacgg agttagccgg tgcttcttct gtaggtaacg tcaatcaata 1080
accgtattaa ggatattgcc ttcctcccta ctgaaagtgc tttacaaccc gaaggccttc 1140
ttcacacacg cggcatggct gcatcagggt ttcccccatt gtgcaatatt ccccactgct 1200
gcctcccgta ggagtctgga ccgtgtctca gttccagtgt ggctggtcat cctctcagac 1260
cagctaggga tcgtcgccta ggtaagctat tacctcacct actagctaat cccatctggg 1320
ttcatctgaa ggtgtgaggc caaaaggtcc cccactttgg tcttacgaca ttatgcggta 1380
ttagctaccg tttccagcag ttatccccct ccatcaggca gatccccaga ctttactcac 1440
ccgttcgctg ctcgccggca aaaaagtaaa cttttttccg ttgccgctca acttgcatgt 1500
gttaggcctg ccgccagcgt tcaatctgag ccatgatcaa actcttcaat taaa 1554
<210> 14
<211> 1539
<212> DNA
<213> Ishikawaella capsulata Mpkobe
<400> 14
aaattgaaga gtttgatcat ggctcagatt gaacgctagc ggcaagctta acacatgcaa 60
gtcgaacggt aacagaaaaa agcttgcttt tttgctgacg agtggcggac gggtgagtaa 120
tgtctgggga tctacctaat ggcgggggat aactactgga aacggtagct aataccgcat 180
aatgttgtaa aaccaaagtg ggggacctta tggcctcaca ccattagatg aacctagatg 240
ggattagctt gtaggtgggg taaaggctca cctaggcaac gatccctagc tggtctgaga 300
ggatgaccag ccacactgga actgagatac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg 360
ggaatcttgc acaatgggcg caagcctgat gcagctatgt cgcgtgtatg aagaaggcct 420
tagggttgta aagtactttc atcggggaag aaggatatga gcctaatatt ctcatatatt 480
gacgttacct gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taacacggag 540
ggtgcgagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagagcac gtaggtggtt tattaagtca 600
tatgtgaaat ccctgggctt aacctaggaa ctgcatgtga aactgataaa ctagagtttc 660
gtagagggag gtggaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagatatctg gaggaatatc 720
agaggcgaag gcgaccttct ggacgaaaac tgacactcag gtgcgaaagc gtggggagca 780
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc tgtaaacaat gtcgactaaa aaactgtgag 840
cttgacttgt ggtttttgta gctaacgcat taagtcgacc gcctggggag tacggccgca 900
aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggt ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960
tcgatgcaac gcgaaaaacc ttacctggtc ttgacatcca gcgaattata tagaaatata 1020
taagtgcctt tcggggaact ctgagacgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa 1080
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgccct tatcctctgt tgccagcggc atggccggga 1140
actcagagga gactgccagt attaaactgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat 1200
ggcccttatg accagggcta cacacgtgct acaatggtgt atacaaagag aagcaatctc 1260
gcaagagtaa gcaaaactca aaaagtacat cgtagttcgg attagagtct gcaactcgac 1320
tctatgaagt aggaatcgct agtaatcgtg gatcagaatg ccacggtgaa tacgttctct 1380
ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtaagtt gcaaaagaag taggtagctt 1440
aacctttata ggagggcgct taccactttg tgatttatga ctggggtgaa gtcgtaacaa 1500
ggtaactgta ggggaacctg tggttggatt acctcctta 1539
<210> 15
<211> 1561
<212> DNA
<213> Baumannia cicadellinicola
<400> 15
ttcaattgaa gagtttgatc atggctcaga ttgaacgctg gcggtaagct taacacatgc 60
aagtcgagcg gcatcggaaa gtaaattaat tactttgccg gcaagcggcg aacgggtgag 120
taatatctgg ggatctacct tatggagagg gataactatt ggaaacgata gctaacaccg 180
cataatgtcg tcagaccaaa atgggggacc taatttaggc ctcatgccat aagatgaacc 240
cagatgagat tagctagtag gtgagataat agctcaccta ggcaacgatc tctagttggt 300
ctgagaggat gaccagccac actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag 360
cagtggggaa tcttgcacaa tgggggaaac cctgatgcag ctataccgcg tgtgtgaaga 420
aggccttcgg gttgtaaagc actttcagcg gggaagaaaa tgaagttact aataataatt 480
gtcaattgac gttacccgca aaagaagcac cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa 540
gacggagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgtatgta ggcggtttat 600
ttagtcaggt gtgaaagccc taggcttaac ctaggaattg catttgaaac tggtaagcta 660
gagtctcgta gaggggggga gaattccagg tgtagcggtg aaatgcgtag agatctggaa 720
gaataccagt ggcgaaggcg cccccctgga cgaaaactga cgctcaagta cgaaagcgtg 780
gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgctgt aaacgatgtc gatttgaagg 840
ttgtagcctt gagctatagc tttcgaagct aacgcattaa atcgaccgcc tggggagtac 900
gaccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 960
gtttaattcg atacaacgcg aaaaacctta cctactcttg acatccagag tataaagcag 1020
aaaagcttta gtgccttcgg gaactctgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt 1080
gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttatccttt gttgccaacg 1140
attaagtcgg gaactcaaag gagactgccg gtgataaacc ggaggaaggt gaggataacg 1200
tcaagtcatc atggccctta cgagtagggc tacacacgtg ctacaatggt gcatacaaag 1260
agaagcaatc tcgtaagagt tagcaaacct cataaagtgc atcgtagtcc ggattagagt 1320
ctgcaactcg actctatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg tggatcagaa tgccacggtg 1380
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtgta ttgcaaaaga 1440
agttagtagc ttaactcata atacgagagg gcgcttacca ctttgtgatt cataactggg 1500
gtgaagtcgt aacaaggtaa ccgtagggga acctgcggtt ggatcacctc cttacactaa 1560
a 1561
<210> 16
<211> 1464
<212> DNA
<213> 伴突属样
<400> 16
attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc ggcagcggga agaagcttgc 60
ttctttgccg gcgagcggcg gacgggtgag taatgtctgg ggatctgccc gatggagggg 120
gataactact ggaaacggta gctaataccg cataacgtcg caagaccaaa gtgggggacc 180
ttcgggcctc acaccatcgg atgaacccag gtgggattag ctagtaggtg gggtaatggc 240
tcacctaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagtcacact ggaactgaga 300
cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gggaaaccct 360
gatgcagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg ccttcgggtt gtaaagcact ttcagcgggg 420
aggaaggcga tggcgttaat agcgctatcg attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc 480
taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcga gcgttaatcg gaattactgg 540
gcgtaaagcg tacgcaggcg gtctgttaag tcagatgtga aatccccggg ctcaacctgg 600
gaactgcatt tgaaactggc aggctagagt ctcgtagagg ggggtagaat tccaggtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg aaggcggccc cctggacgaa 720
gactgacgct caggtacgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgctgtaaac gatgtcgatt tgaaggttgt ggccttgagc cgtggctttc ggagctaacg 840
tgttaaatcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg 900
ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta 960
ctcttgacat ccagagaact tggcagagat gctttggtgc cttcgggaac tctgagacag 1020
gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080
gcaaccctta tcctttattg ccagcgattc ggtcgggaac tcaaaggaga ctgccggtga 1140
taaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg cccttacgag tagggctaca 1200
cacgtgctac aatggcgcat acaaagagaa gcgatctcgc gagagtcagc ggacctcata 1260
aagtgcgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcgactc catgaagtcg gaatcgctag 1320
taatcgtgga tcagaatgcc acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380
acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa ccttcgggag ggcgcttacc 1440
actttgtgat tcatgactgg ggtg 1464
<210> 17
<211> 1465
<212> DNA
<213> Hartigia pinicola
<400> 17
agatttaacg ctggcggcag gcctaacaca tgcaagtcga gcggtaccag aagaagcttg 60
cttcttgctg acgagcggcg gacgggtgag taatgtatgg ggatctgccc gacagagggg 120
gataactatt ggaaacggta gctaataccg cataatctct gaggagcaaa gcaggggaac 180
ttcggtcctt gcgctatcgg atgaacccat atgggattag ctagtaggtg aggtaatggc 240
tcccctaggc aacgatccct agctggtctg agaggatgat cagccacact gggactgaga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct 360
gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ctttagggtt gtaaagtact ttcagtcgag 420
aggaaaacat tgatgctaat atcatcaatt attgacgttt ccgacagaag aagcaccggc 480
taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg 540
gcgtaaagcg cacgcaggcg gttaattaag ttagatgtga aagccccggg cttaacccag 600
gaatagcata taaaactggt caactagagt attgtagagg ggggtagaat tccatgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaat accagtggcg aaggcggccc cctggacaaa 720
aactgacgct caaatgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
tgctgtaaac gatgtcgatt tggaggttgt tcccttgagg agtagcttcc gtagctaacg 840
cgttaaatcg accgcctggg ggagtacgac tgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaaa aaccttacct 960
actcttgaca tccagataat ttagcagaaa tgctttagta ccttcgggaa atctgagaca 1020
ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtt gtgaaatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt atcctttgtt gccagcgatt aggtcgggaa ctcaaaggag actgccggtg 1140
ataaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacga gtagggctac 1200
acacgtgcta caatggcata tacaaaggga agcaacctcg cgagagcaag cgaaactcat 1260
aaattatgtc gtagttcaga ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta 1320
gtaatcgtag atcagaatgc tacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccatgg gagtgggttg caaaagaagt aggtaactta accttatgga aagcgcttac 1440
cactttgtga ttcataactg gggtg 1465
<210> 18
<211> 1571
<212> DNA
<213> Tremblaya phenacola
<400> 18
aggtaatcca gccacacctt ccagtacggc taccttgtta cgacttcacc ccagtcacaa 60
cccttacctt cggaactgcc ctcctcacaa ctcaaaccac caaacacttt taaatcaggt 120
tgagagaggt taggcctgtt acttctggca agaattattt ccatggtgtg acgggcggtg 180
tgtacaagac ccgagaacat attcaccgtg gcatgctgat ccacgattac tagcaattcc 240
aacttcatgc actcgagttt cagagtacaa tccgaactga ggccggcttt gtgagattag 300
ctcccttttg caagttggca actctttggt ccggccattg tatgatgtgt gaagccccac 360
ccataaaggc catgaggact tgacgtcatc cccaccttcc tccaacttat cgctggcagt 420
ctctttaagg taactgacta atccagtagc aattaaagac aggggttgcg ctcgttacag 480
gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc tgtgcactaa 540
ttctctttca agcactcccg cttctcaaca ggatcttagc catatcaaag gtaggtaagg 600
tttttcgcgt tgcatcgaat taatccacat catccactgc ttgtgcgggt ccccgtcaat 660
tcctttgagt tttaaccttg cggccgtact ccccaggcgg tcgacttgtg cgttagctgc 720
accactgaaa aggaaaactg cccaatggtt agtcaacatc gtttagggca tggactacca 780
gggtatctaa tcctgtttgc tccccatgct ttagtgtctg agcgtcagta acgaaccagg 840
aggctgccta cgctttcggt attcctccac atctctacac atttcactgc tacatgcgga 900
attctacctc cccctctcgt actccagcct gccagtaact gccgcattct gaggttaagc 960
ctcagccttt cacagcaatc ttaacaggca gcctgcacac cctttacgcc caataaatct 1020
gattaacgct cgcaccctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagtttg ccggtgctta 1080
ttctttcggt acagtcacac caccaaattg ttagttgggt ggctttcttt ccgaacaaaa 1140
gtgctttaca acccaaaggc cttcttcaca cacgcggcat tgctggatca ggcttccgcc 1200
cattgtccaa gattcctcac tgctgccttc ctcagaagtc tgggccgtgt ctcagtccca 1260
gtgtggctgg ccgtcctctc agaccagcta ccgatcattg ccttgggaag ccattacctt 1320
tccaacaagc taatcagaca tcagccaatc tcagagcgca aggcaattgg tcccctgctt 1380
tcattctgct tggtagagaa ctttatgcgg tattaattag gctttcacct agctgtcccc 1440
cactctgagg catgttctga tgcattactc acccgtttgc cacttgccac caagcctaag 1500
cccgtgttgc cgttcgactt gcatgtgtaa ggcatgccgc tagcgttcaa tctgagccag 1560
gatcaaactc t 1571
<210> 19
<211> 1535
<212> DNA
<213> Tremblaya princeps
<400> 19
agagtttgat cctggctcag attgaacgct agcggcatgc attacacatg caagtcgtac 60
ggcagcacgg gcttaggcct ggtggcgagt ggcgaacggg tgagtaacgc ctcggaacgt 120
gccttgtagt gggggatagc ctggcgaaag ccagattaat accgcatgaa gccgcacagc 180
atgcgcggtg aaagtggggg attctagcct cacgctactg gatcggccgg ggtctgatta 240
gctagttggc ggggtaatgg cccaccaagg cttagatcag tagctggtct gagaggacga 300
tcagccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaatc 360
ttggacaatg ggcgcaagcc tgatccagca atgccgcgtg tgtgaagaag gccttcgggt 420
cgtaaagcac ttttgttcgg gatgaagggg ggcgtgcaaa caccatgccc tcttgacgat 480
accgaaagaa taagcaccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggtgcg 540
agcgttaatc ggaatcactg ggcgtaaagg gtgcgcgggt ggtttgccaa gacccctgta 600
aaatcctacg gcccaaccgt agtgctgcgg aggttactgg taagcttgag tatggcagag 660
gggggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa tgcgtagata tctggaggaa taccgaaggc 720
gaaggcaacc ccctgggcca tcactgacac tgaggcacga aagcgtgggg agcaaacagg 780
attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa ccatgtcgac tagttgtcgg ggggagccct 840
ttttcctcgg tgacgaagct aacgcatgaa gtcgaccgcc tggggagtac gaccgcaagg 900
ttaaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggatgatgtg gattaattcg 960
atgcaacgcg aaaaacctta cctacccttg acatggcgga gattctgccg agaggcggaa 1020
gtgctcgaaa gagaatccgt gcacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080
atgttgggtt aagtcccata acgagcgcaa cccccgtctt tagttgctac cactggggca 1140
ctctatagag actgccggtg ataaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg 1200
gcctttatgg gtagggcttc acacgtcata caatggctgg agcaaagggt cgccaactcg 1260
agagagggag ctaatcccac aaacccagcc ccagttcgga ttgcactctg caactcgagt 1320
gcatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtgg atcagcatgc cacggtgaat acgttctcgg 1380
gtcttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtaagccg catcagaagc agcctcccta 1440
accctatgct gggaaggagg ctgcgaaggt ggggtctatg actggggtga agtcgtaaca 1500
aggtagccgt accggaaggt gcggctggat tacct 1535
<210> 20
<211> 1450
<212> DNA
<213> Nasuia deltocephalinicola
<400> 20
agtttaatcc tggctcagat ttaacgcttg cgacatgcct aacacatgca agttgaacgt 60
tgaaaatatt tcaaagtagc gtataggtga gtataacatt taaacatacc ttaaagttcg 120
gaataccccg atgaaaatcg gtataatacc gtataaaagt atttaagaat taaagcgggg 180
aaaacctcgt gctataagat tgttaaatgc ctgattagtt tgttggtttt taaggtaaaa 240
gcttaccaag actttgatca gtagctattc tgtgaggatg tatagccaca ttgggattga 300
aataatgccc aaacctctac ggagggcagc agtggggaat attggacaat gagcgaaagc 360
ttgatccagc aatgtcgcgt gtgcgattaa gggaaactgt aaagcacttt tttttaagaa 420
taagaaattt taattaataa ttaaaatttt tgaatgtatt aaaagaataa gtaccgacta 480
atcacgtgcc agcagtcgcg gtaatacgtg gggtgcgagc gttaatcgga tttattgggc 540
gtaaagtgta ttcaggctgc ttaaaaagat ttatattaaa tatttaaatt aaatttaaaa 600
aatgtataaa ttactattaa gctagagttt agtataagaa aaaagaattt tatgtgtagc 660
agtgaaatgc gttgatatat aaaggaacgc cgaaagcgaa agcatttttc tgtaatagaa 720
ctgacgctta tatacgaaag cgtgggtagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccctaaacta tgtcaattaa ctattagaat tttttttagt ggtgtagcta acgcgttaaa 840
ttgaccgcct gggtattacg atcgcaagat taaaactcaa aggaattgac ggggaccagc 900
acaagcggtg gatgatgtgg attaattcga tgatacgcga aaaaccttac ctgcccttga 960
catggttaga attttattga aaaataaaag tgcttggaaa agagctaaca cacaggtgct 1020
gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080
ccctactctt agttgctaat taaagaactt taagagaaca gctaacaata agtttagagg 1140
aaggagggga tgacttcaag tcctcatggc ccttatgggc agggcttcac acgtcataca 1200
atggttaata caaaaagttg caatatcgta agattgagct aatctttaaa attaatctta 1260
gttcggattg tactctgcaa ctcgagtaca tgaagttgga atcgctagta atcgcggatc 1320
agcatgccgc ggtgaatagt ttaactggtc ttgtacacac cgcccgtcac accatggaaa 1380
taaatcttgt tttaaatgaa gtaatatatt ttatcaaaac aggttttgta accggggtga 1440
agtcgtaaca 1450
<210> 21
<211> 1536
<212> DNA
<213> Zinderia insecticola CARI
<400> 21
atataaataa gagtttgatc ctggctcaga ttgaacgcta gcggtatgct ttacacatgc 60
aagtcgaacg acaatattaa agcttgcttt aatataaagt ggcgaacggg tgagtaatat 120
atcaaaacgt accttaaagt gggggataac taattgaaaa attagataat accgcatatt 180
aatcttagga tgaaaatagg aataatatct tatgctttta gatcggttga tatctgatta 240
gctagttggt agggtaaatg cttaccaagg caatgatcag tagctggttt tagcgaatga 300
tcagccacac tggaactgag acacggtcca gacttctacg gaaggcagca gtggggaata 360
ttggacaatg ggagaaatcc tgatccagca ataccgcgtg agtgatgaag gccttagggt 420
cgtaaaactc ttttgttagg aaagaaataa ttttaaataa tatttaaaat tgatgacggt 480
acctaaagaa taagcaccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggtgca 540
agcgttaatc ggaattattg ggcgtaaaga gtgcgtaggc tgttatataa gatagatgtg 600
aaatacttaa gcttaactta agaactgcat ttattactgt ttaactagag tttattagag 660
agaagtggaa ttttatgtgt agcagtgaaa tgcgtagata tataaaggaa tatcgatggc 720
gaaggcagct tcttggaata atactgacgc tgaggcacga aagcgtgggg agcaaacagg 780
attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa ctatgtctac tagttattaa attaaaaata 840
aaatttagta acgtagctaa cgcattaagt agaccgcctg gggagtacga tcgcaagatt 900
aaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg atgatgtgga ttaattcgat 960
gcaacacgaa aaaccttacc tactcttgac atgtttggaa ttttaaagaa atttaaaagt 1020
gcttgaaaaa gaaccaaaac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080
gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgttatta tttgctaata aaaagaactt 1140
taataagact gccaatgaca aattggagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc 1200
cttatgagta gggcttcaca cgtcatacaa tgatatatac aatgggtagc aaatttgtga 1260
aaatgagcca atccttaaag tatatcttag ttcggattgt agtctgcaac tcgactacat 1320
gaagttggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tctcgggtct 1380
tgtacacacc gcccgtcaca ccatggaagt gatttttacc agaaattatt tgtttaacct 1440
ttattggaaa aaaataatta aggtagaatt catgactggg gtgaagtcgt aacaaggtag 1500
cagtatcgga aggtgcggct ggattacatt ttaaat 1536
<210> 22
<211> 1423
<212> DNA
<213> Hodgkinia
<400> 22
aatgctggcg gcaggcctaa cacatgcaag tcgagcggac aacgttcaaa cgttgttagc 60
ggcgaacggg tgagtaatac gtgagaatct acccatccca acgtgataac atagtcaaca 120
ccatgtcaat aacgtatgat tcctgcaaca ggtaaagatt ttatcgggga tggatgagct 180
cacgctagat tagctagttg gtgagataaa agcccaccaa ggccaagatc tatagctggt 240
ctggaaggat ggacagccac attgggactg agacaaggcc caaccctcta aggagggcag 300
cagtgaggaa tattggacaa tgggcgtaag cctgatccag ccatgccgca tgagtgattg 360
aaggtccaac ggactgtaaa actcttttct ccagagatca taaatgatag tatctggtga 420
tataagctcc ggccaacttc gtgccagcag ccgcggtaat acgaggggag cgagtattgt 480
tcggttttat tgggcgtaaa gggtgtccag gttgctaagt aagttaacaa caaaatcttg 540
agattcaacc tcataacgtt cggttaatac tactaagctc gagcttggat agagacaaac 600
ggaattccga gtgtagaggt gaaattcgtt gatacttgga ggaacaccag aggcgaaggc 660
ggtttgtcat accaagctga cactgaagac acgaaagcat ggggagcaaa caggattaga 720
taccctggta gtccatgccc taaacgttga gtgctaacag ttcgatcaag ccacatgcta 780
tgatccagga ttgtacagct aacgcgttaa gcactccgcc tgggtattac gaccgcaagg 840
ttaaaactca aaggaattga cggagacccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 900
aagctacacg aagaacctta ccagcccttg acataccatg gccaaccatc ctggaaacag 960
gatgttgttc aagttaaacc cttgaaatgc caggaacagg tgctgcatgg ctgttgtcag 1020
ttcgtgtcgt gagatgtatg gttaagtccc aaaacgaaca caaccctcac ccatagttgc 1080
cataaacaca attgggttct ctatgggtac tgctaacgta agttagagga aggtgaggac 1140
cacaacaagt catcatggcc cttatgggct gggccacaca catgctacaa tggtggttac 1200
aaagagccgc aacgttgtga gaccgagcaa atctccaaag accatctcag tccggattgt 1260
actctgcaac ccgagtacat gaagtaggaa tcgctagtaa tcgtggatca gcatgccacg 1320
gtgaatacgt tctcgggtct tgtacacgcc gcccgtcaca ccatgggagc ttcgctccga 1380
tcgaagtcaa gttacccttg accacatctt ggcaagtgac cga 1423
<210> 23
<211> 1504
<212> DNA
<213> 沃尔巴克氏体属物种wPip
<400> 23
aaatttgaga gtttgatcct ggctcagaat gaacgctggc ggcaggccta acacatgcaa 60
gtcgaacgga gttatattgt agcttgctat ggtataactt agtggcagac gggtgagtaa 120
tgtataggaa tctacctagt agtacggaat aattgttgga aacgacaact aataccgtat 180
acgccctacg ggggaaaaat ttattgctat tagatgagcc tatattagat tagctagttg 240
gtggggtaat agcctaccaa ggtaatgatc tatagctgat ctgagaggat gatcagccac 300
actggaactg agatacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa 360
tgggcgaaag cctgatccag ccatgccgca tgagtgaaga aggcctttgg gttgtaaagc 420
tcttttagtg aggaagataa tgacggtact cacagaagaa gtcctggcta actccgtgcc 480
agcagccgcg gtaatacgga gagggctagc gttattcgga attattgggc gtaaagggcg 540
cgtaggctgg ttaataagtt aaaagtgaaa tcccgaggct taaccttgga attgctttta 600
aaactattaa tctagagatt gaaagaggat agaggaattc ctgatgtaga ggtaaaattc 660
gtaaatatta ggaggaacac cagtggcgaa ggcgtctatc tggttcaaat ctgacgctga 720
agcgcgaagg cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ctgtaaacga 780
tgaatgttaa atatggggag tttactttct gtattacagc taacgcgtta aacattccgc 840
ctggggacta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg 900
tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaaaaacctt accacttctt gacatgaaaa 960
tcatacctat tcgaagggat agggtcggtt cggccggatt ttacacaagt gttgcatggc 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aaccctcatc 1080
cttagttgcc atcaggtaat gctgagtact ttaaggaaac tgccagtgat aagctggagg 1140
aaggtgggga tgatgtcaag tcatcatggc ctttatggag tgggctacac acgtgctaca 1200
atggtgtcta caatgggctg caaggtgcgc aagcctaagc taatccctaa aagacatctc 1260
agttcggatt gtactctgca actcgagtac atgaagttgg aatcgctagt aatcgtggat 1320
cagcatgcca cggtgaatac gttctcgggt cttgtacaca ctgcccgtca cgccatggga 1380
attggtttca ctcgaagcta atggcctaac cgcaaggaag gagttattta aagtgggatc 1440
agtgactggg gtgaagtcgt aacaaggtag cagtagggga atctgcagct ggattacctc 1500
ctta 1504
<210> 24
<211> 1532
<212> DNA
<213> Uzinura diaspidicola
<400> 24
aaaggagata ttccaaccac accttccggt acggttacct tgttacgact tagccctagt 60
catcaagttt accttaggca gaccactgaa ggattactga cttcaggtac ccccgactcc 120
catggcttga cgggcggtgt gtacaaggtt cgagaacata ttcaccgcgc cattgctgat 180
gcgcgattac tagcgattcc tgcttcatag agtcgaattg cagactccaa tccgaactga 240
gactggtttt agagattagc tcctgatcac ccagtggctg ccctttgtaa ccagccattg 300
tagcacgtgt gtagcccaag gcatagaggc catgatgatt tgacatcatc cccaccttcc 360
tcacagttta caccggcagt tttgttagag tccccggctt tacccgatgg caactaacaa 420
taggggttgc gctcgttata ggacttaacc aaacacttca cagcacgaac tgaagacaac 480
catgcagcac cttgtaatac gtcgtataga ctaagctgtt tccagcttat tcgtaataca 540
tttaagcctt ggtaaggttc ctcgcgtatc atcgaattaa accacatgct ccaccgcttg 600
tgcgaacccc cgtcaattcc tttgagtttc aatcttgcga ctgtacttcc caggtggatc 660
acttatcgct ttcgctaagc cactgaatat cgtttttcca atagctagtg atcatcgttt 720
agggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg tgcactgagc 780
gtcagtaaag atttagcaac ctgccttcgc tatcggtgtt ctgtatgata tctatgcatt 840
tcaccgctac accatacatt ccagatgctc caatcttact caagtttacc agtatcaata 900
gcaattttac agttaagctg taagctttca ctactgactt aataaacagc ctacacaccc 960
tttaaaccca ataaatccga ataacgcttg tgtcatccgt attgccgcgg ctgctggcac 1020
ggaattagcc gacacttatt cgtatagtac cttcaatctc ctatcacgta agatatttta 1080
tttctataca aaagcagttt acaacctaaa agaccttcat cctgcacgcg acgtagctgg 1140
ttcagagttt cctccattga ccaatattcc tcactgctgc ctcccgtagg agtctggtcc 1200
gtgtctcagt accagtgtgg aggtacaccc tcttaggccc cctactgatc atagtcttgg 1260
tagagccatt acctcaccaa ctaactaatc aaacgcaggc tcatcttttg ccacctaagt 1320
tttaataaag gctccatgca gaaactttat attatggggg attaatcaga atttcttctg 1380
gctatacccc agcaaaaggt agattgcata cgtgttactc acccattcgc cggtcgccga 1440
caaattaaaa atttttcgat gcccctcgac ttgcatgtgt taagctcgcc gctagcgtta 1500
attctgagcc aggatcaaac tcttcgttgt ag 1532
<210> 25
<211> 1470
<212> DNA
<213> Sulcia muelleri
<400> 25
ctcaggataa acgctagcgg agggcttaac acatgcaagt cgaggggcag caaaaataat 60
tatttttggc gaccggcaaa cgggtgagta atacatacgt aactttcctt atgctgagga 120
atagcctgag gaaacttgga ttaatacctc ataatacaat tttttagaaa gaaaaattgt 180
taaagtttta ttatggcata agataggcgt atgtccaatt agttagttgg taaggtaatg 240
gcttaccaag acgatgattg gtagggggcc tgagaggggc gttcccccac attggtactg 300
agacacggac caaacttcta cggaaggctg cagtgaggaa tattggtcaa tggaggaaac 360
tctgaaccag ccactccgcg tgcaggatga aagaaagcct tattggttgt aaactgcttt 420
tgtatatgaa taaaaaattc taattataga aataattgaa ggtaatatac gaataagtat 480
cgactaactc tgtgccagca gtcgcggtaa gacagaggat acaagcgtta tccggattta 540
ttgggtttaa agggtgcgta ggcggttttt aaagtcagta gtgaaatctt aaagcttaac 600
tttaaaagtg ctattgatac tgaaaaacta gagtaaggtt ggagtaactg gaatgtgtgg 660
tgtagcggtg aaatgcatag atatcacaca gaacaccgat agcgaaagca agttactaac 720
cctatactga cgctgagtca cgaaagcatg gggagcaaac aggattagat accctggtag 780
tccatgccgt aaacgatgat cactaactat tgggttttat acgttgtaat tcagtggtga 840
agcgaaagtg ttaagtgatc cacctgagga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaat cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgata cacgaggaac 960
cttaccaaga cttaaatgta ctacgaataa attggaaaca atttagtcaa gcgacggagt 1020
acaaggtgct gcatggttgt cgtcagctcg tgccgtgagg tgtaaggtta agtcctttaa 1080
acgagcgcaa cccttattat tagttgccat cgagtaatgt caggggactc taataagact 1140
gccggcgcaa gccgagagga aggtggggat gacgtcaaat catcacggcc cttacgtctt 1200
gggccacaca cgtgctacaa tgatcggtac aaaagggagc gactgggtga ccaggagcaa 1260
atccagaaag ccgatctaag ttcggattgg agtctgaaac tcgactccat gaagctggaa 1320
tcgctagtaa tcgtgcatca gccatggcac ggtgaatatg ttcccgggcc ttgtacacac 1380
cgcccgtcaa gccatggaag ttggaagtac ctaaagttgg ttcgctacct aaggtaagtc 1440
taataactgg ggctaagtcg taacaaggta 1470
<210> 26
<211> 1761
<212> DNA
<213> Symbiotaphrina buchneri
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (30)..(30)
<223> n是a、g、c或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(40)
<223> n是a、g、c或t
<400> 26
agattaagcc atgcaagtct aagtataagn aatctatacn gtgaaactgc gaatggctca 60
ttaaatcagt tatcgtttat ttgatagtac cttactacat ggataaccgt ggtaattcta 120
gagctaatac atgctaaaaa ccccgacttc ggaaggggtg tatttattag ataaaaaacc 180
aatgcccttc ggggctcctt ggtgattcat gataacttaa cgaatcgcat ggccttgcgc 240
cggcgatggt tcattcaaat ttctgcccta tcaactttcg atggtaggat agtggcctac 300
catggtttta acgggtaacg gggaattagg gttcgattcc ggagagggag cctgagaaac 360
ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcccga cacggggagg 420
tagtgacaat aaatactgat acagggctct tttgggtctt gtaattggaa tgagtacaat 480
ttaaatccct taacgaggaa caattggagg gcaagtctgg tgccagcagc cgcggtaatt 540
ccagctccaa tagcgtatat taaagttgtt gcagttaaaa agctcgtagt tgaaccttgg 600
gcctggctgg ccggtccgcc taaccgcgtg tactggtccg gccgggcctt tccttctggg 660
gagccgcatg cccttcactg ggtgtgtcgg ggaaccagga cttttacttt gaaaaaatta 720
gagtgttcaa agcaggccta tgctcgaata cattagcatg gaataataga ataggacgtg 780
cggttctatt ttgttggttt ctaggaccgc cgtaatgatt aatagggata gtcgggggca 840
tcagtattca attgtcagag gtgaaattct tggatttatt gaagactaac tactgcgaaa 900
gcatttgcca aggatgtttt cattaatcag tgaacgaaag ttaggggatc gaagacgatc 960
agataccgtc gtagtcttaa ccataaacta tgccgactag ggatcgggcg atgttattat 1020
tttgactcgc tcggcacctt acgagaaatc aaagtctttg ggttctgggg ggagtatggt 1080
cgcaaggctg aaacttaaag aaattgacgg aagggcacca ccaggagtgg agcctgcggc 1140
ttaatttgac tcaacacggg gaaactcacc aggtccagac acattaagga ttgacagatt 1200
gagagctctt tcttgattat gtgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga 1260
tttgtctgct taattgcgat aacgaacgag accttaacct gctaaatagc ccggtccgct 1320
ttggcgggcc gctggcttct tagagggact atcggctcaa gccgatggaa gtttgaggca 1380
ataacaggtc tgtgatgccc ttagatgttc tgggccgcac gcgcgctaca ctgacagagc 1440
caacgagtaa atcaccttgg ccggaaggtc tgggtaatct tgttaaactc tgtcgtgctg 1500
gggatagagc attgcaatta ttgctcttca acgaggaatt cctagtaagc gcaagtcatc 1560
agcttgcgct gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgctac taccgattga 1620
atggctcagt gaggccttcg gactggcaca gggacgttgg caacgacgac ccagtgccgg 1680
aaagttggtc aaacttggtc atttagagga agtaaaagtc gtaacaaggt ttccgtaggt 1740
gaacctgcgg aaggatcatt a 1761
<210> 27
<211> 1801
<212> DNA
<213> Symbiotaphrina kochii
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1753)..(1755)
<223> n是a、g、c或t
<400> 27
tacctggttg attctgccag tagtcatatg cttgtctcaa agattaagcc atgcaagtct 60
aagtataagc aatctatacg gtgaaactgc gaatggctca ttaaatcagt tatcgtttat 120
ttgatagtac cttactacat ggataaccgt ggtaattcta gagctaatac atgctaaaaa 180
cctcgacttc ggaaggggtg tatttattag ataaaaaacc aatgcccttc ggggctcctt 240
ggtgattcat gataacttaa cgaatcgcat ggccttgcgc cggcgatggt tcattcaaat 300
ttctgcccta tcaactttcg atggtaggat agtggcctac catggtttca acgggtaacg 360
gggaattagg gttcgattcc ggagagggag cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag 420
gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcccga cacggggagg tagtgacaat aaatactgat 480
acagggctct tttgggtctt gtaattggaa tgagtacaat ttaaatccct taacgaggaa 540
caattggagg gcaagtctgg tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat 600
taaagttgtt gcagttaaaa agctcgtagt tgaaccttgg gcctggctgg ccggtccgcc 660
taaccgcgtg tactggtccg gccgggcctt tccttctggg gagccgcatg cccttcactg 720
ggtgtgtcgg ggaaccagga cttttacttt gaaaaaatta gagtgttcaa agcaggccta 780
tgctcgaata cattagcatg gaataataga ataggacgtg tggttctatt ttgttggttt 840
ctaggaccgc cgtaatgatt aatagggata gtcgggggca tcagtattca attgtcagag 900
gtgaaattct tggatttatt gaagactaac tactgcgaaa gcatttgcca aggatgtttt 960
cattaatcag tgaacgaaag ttaggggatc gaagacgatc agataccgtc gtagtcttaa 1020
ccataaacta tgccgactag ggatcgggcg atgttattat tttgactcgc tcggcacctt 1080
acgagaaatc aaagtctttg ggttctgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag 1140
aaattgacgg aagggcacca ccaggagtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg 1200
gaaactcacc aggtccagac acattaagga ttgacagatt gagagctctt tcttgattat 1260
gtgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctgct taattgcgat 1320
aacgaacgag accttaacct gctaaatagc ccggtccgct ttggcgggcc gctggcttct 1380
tagagggact atcggctcaa gccgatggaa gtttgaggca ataacaggtc tgtgatgccc 1440
ttagatgttc tgggccgcac gcgcgctaca ctgacagagc caacgagtac atcaccttgg 1500
ccggaaggtc tgggtaatct tgttaaactc tgtcgtgctg gggatagagc attgcaatta 1560
ttgctcttca acgaggaatt cctagtaagc gcaagtcatc agcttgcgct gattacgtcc 1620
ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgctac taccgattga atggctcagt gaggccttcg 1680
gactggcaca gggacgttgg caacgacgac ccagtgccgg aaagttcgtc aaacttggtc 1740
atttagagga agnnnaagtc gtaacaaggt ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt 1800
a 1801
<210> 28
<211> 1490
<212> DNA
<213> 伯克霍尔德氏菌属物种SFA1
<400> 28
agtttgatcc tggctcagat tgaacgctgg cggcatgcct tacacatgca agtcgaacgg 60
cagcacgggg gcaaccctgg tggcgagtgg cgaacgggtg agtaatacat cggaacgtgt 120
cctgtagtgg gggatagccc ggcgaaagcc ggattaatac cgcatacgac ctaagggaga 180
aagcggggga tcttcggacc tcgcgctata ggggcggccg atggcagatt agctagttgg 240
tggggtaaag gcctaccaag gcgacgatct gtagctggtc tgagaggacg accagccaca 300
ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat tttggacaat 360
gggggcaacc ctgatccagc aatgccgcgt gtgtgaagaa ggcttcgggt tgtaaagcac 420
ttttgtccgg aaagaaaact tcgtccctaa tatggatgga ggatgacggt accggaagaa 480
taagcaccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggtgcg agcgttaatc 540
ggaattactg ggcgtaaagc gtgcgcaggc ggtctgttaa gaccgatgtg aaatccccgg 600
gcttaacctg ggaactgcat tggtgactgg caggctttga gtgtggcaga ggggggtaga 660
attccacgtg tagcagtgaa atgcgtagag atgtggagga ataccgatgg cgaaggcagc 720
cccctgggcc aactactgac gctcatgcac gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata 780
ccctggtagt ccacgcccta aacgatgtca actagttgtt ggggattcat ttccttagta 840
acgtagctaa cgcgtgaagt tgaccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa 900
ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg atgatgtgga ttaattcgat gcaacgcgaa 960
aaaccttacc tacccttgac atggtcggaa ccctgctgaa aggtgggggt gctcgaaaga 1020
gaaccggcgc acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080
gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcctta gttgctacgc aagagcactc taaggagact 1140
gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttatgggta 1200
gggcttcaca cgtcatacaa tggtcggaac agagggttgc caagccgcga ggtggagcca 1260
atcccagaaa accgatcgta gtccggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga 1320
atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac 1380
cgcccgtcac accatgggag tgggtttcac cagaagtagg tagcctaacc gcaaggaggg 1440
cgcttaccac ggtgggattc atgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc 1490
<210> 29
<211> 1408
<212> DNA
<213> 伯克霍尔德氏菌属物种KM-A
<400> 29
gcaaccctgg tggcgagtgg cgaacgggtg agtaatacat cggaacgtgt cctgtagtgg 60
gggatagccc ggcgaaagcc ggattaatac cgcatacgat ctacggaaga aagcggggga 120
tccttcggga cctcgcgcta taggggcggc cgatggcaga ttagctagtt ggtggggtaa 180
aggcctacca aggcgacgat ctgtagctgg tctgagagga cgaccagcca cactgggact 240
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga attttggaca atgggggcaa 300
ccctgatcca gcaatgccgc gtgtgtgaag aaggccttcg ggttgtaaag cacttttgtc 360
cggaaagaaa acgtcttggt taatacctga ggcggatgac ggtaccggaa gaataagcac 420
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt gcgagcgtta atcggaatta 480
ctgggcgtaa agcgtgcgca ggcggtctgt taagaccgat gtgaaatccc cgggcttaac 540
ctgggaactg cattggtgac tggcaggctt tgagtgtggc agaggggggt agaattccac 600
gtgtagcagt gaaatgcgta gagatgtgga ggaataccga tggcgaaggc agccccctgg 660
gccaacactg acgctcatgc acgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta 720
gtccacgccc taaacgatgt caactagttg ttggggattc atttccttag taacgtagct 780
aacgcgtgaa gttgaccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca aaggaattga 840
cggggacccg cacaagcggt ggatgatgtg gattaattcg atgcaacgcg aaaaacctta 900
cctacccttg acatggtcgg aagtctgctg agaggtggac gtgctcgaaa gagaaccggc 960
gcacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1020
acgagcgcaa cccttgtcct tagttgctac gcaagagcac tctaaggaga ctgccggtga 1080
caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcctcatgg cccttatggg tagggcttca 1140
cacgtcatac aatggtcgga acagagggtt gccaagccgc gaggtggagc caatcccaga 1200
aaaccgatcg tagtccggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag 1260
taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac accgcccgtc 1320
acaccatggg agtgggtttc accagaagta ggtagcctaa ccgcaaggag ggcgcttacc 1380
acggtgggat tcatgactgg ggtgaagt 1408
<210> 30
<211> 1383
<212> DNA
<213> 伯克霍尔德氏菌属物种KM-G
<400> 30
gcaaccctgg tggcgagtgg cgaacgggtg agtaatacat cggaacgtgt cctgtagtgg 60
gggatagccc ggcgaaagcc ggattaatac cgcatacgac ctaagggaga aagcggggga 120
tcttcggacc tcgcgctata ggggcggccg atggcagatt agctagttgg tggggtaaag 180
gcctaccaag gcgacgatct gtagctggtc tgagaggacg accagccaca ctgggactga 240
gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat tttggacaat gggggcaacc 300
ctgatccagc aatgccgcgt gtgtgaagaa ggccttcggg ttgtaaagca cttttgtccg 360
gaaagaaaac ttcgaggtta atacccttgg aggatgacgg taccggaaga ataagcaccg 420
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc gagcgttaat cggaattact 480
gggcgtaaag cgtgcgcagg cggtctgtta agaccgatgt gaaatccccg ggcttaacct 540
gggaactgca ttggtgactg gcaggctttg agtgtggcag aggggggtag aattccacgt 600
gtagcagtga aatgcgtaga gatgtggagg aataccgatg gcgaaggcag ccccctgggc 660
caacactgac gctcatgcac gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 720
ccacgcccta aacgatgtca actagttgtt ggggattcat ttccttagta acgtagctaa 780
cgcgtgaagt tgaccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg 840
gggacccgca caagcggtgg atgatgtgga ttaattcgat gcaacgcgaa aaaccttacc 900
tacccttgac atggtcggaa gtctgctgag aggtggacgt gctcgaaaga gaaccggcgc 960
acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1020
gagcgcaacc cttgtcctta gttgctacgc aagagcactc taaggagact gccggtgaca 1080
aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttatgggta gggcttcaca 1140
cgtcatacaa tggtcggaac agagggttgc caagccgcga ggtggagcca atcccagaaa 1200
accgatcgta gtccggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta 1260
atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac 1320
accatgggag tgggtttcac cagaagtagg tagcctaacc tgcaaaggag ggcgcttacc 1380
acg 1383
<210> 31
<211> 538
<212> DNA
<213> Xiphinematobacter属物种
<400> 31
gcaagtcgaa cggagtggaa cctgcagtaa tgcagattcg attcagtggc gtacgggtgc 60
gtaacacgtg agtgatctac cggtaagtgg gggataaccc gccgaaaggc gaattaatac 120
cgcatgtggc tagggatgcc ttcatcctgt agctaaagtc gattttgacg ctttctgatg 180
agctcgcggc ctatcagctt gttggtggag gtaatggccc accaaggcaa tgacgggtag 240
ctggtctgag aggacgatca gccacactgg aactgagaca cggtccagac acctacgggt 300
ggcagcagtc gagaattttt cacaatgggg gaaaccctga tgaagcaacg ccgcgtggag 360
gatgaagggc ttcgcgctcg taaactcctg tcaagcggga acaagaaagt gatagtaccg 420
ctagaggaag agacggctaa ctctgtgcca gcagccgcgg taatacagag gtctcgagcg 480
ttgttcggat ttattgggcg taaagggtgc gtaggcggtg tggcaagtca agtgtgaa 538
<210> 32
<211> 975
<212> DNA
<213> 沃尔巴克氏体属物种wOo
<400> 32
atgacacaca taccggtttt actaaaagaa atgctatcgc aactttcacc acaaaatggt 60
agtgtatatg tggatgccac atttggagct ggaggatata gtaaagcaat attggagtca 120
gctgattgca gagtgtatgc aatcgacaga gatgaaacgg ttattaaatt ttataatagt 180
ttgaatacca agtaccacgg taaaataaaa ctatttattg aaaagtttag caatattcaa 240
actatactaa acagtagtaa tctcaaacac tttacagaac cttccgtcat tgtttcagct 300
ggaattcaga aaaaaaatgc aaggtcaagc accgagatga tacaaagtaa taccgtagat 360
ggagttgtgt tcgatatagg agtatcgtct atgcagcttg atgaagaaaa tagaggattt 420
tcatttttac ataacagtcc gcttgatatg cgcatggata cctcttctca cattaacgct 480
tcaatatttg ttaatgcctt acgcgaagaa gaaattgcaa acactatata tagctatgga 540
ggtgaacgtt attctcgcaa aattgcaaga gcaatagtga acgtacgtaa gaaaaaaact 600
atcgacacta catttgagct tgcagacatt gtacgttccg tggtatctcg cggaaaaagc 660
aagattgatc ctgcaactag gacatttcaa gcaatcagaa tatgggtaaa cgatgagctt 720
agagagcttg aaaagggtat taaagctgca tccaaaatct taaataggaa tggcaagctg 780
attgtcatta cttttcattc cttggaagat cgtatagtca agaccttttt taaaggctta 840
tgtgagccaa aattcaccaa ctgtagaacg ttttctcttc tgaataaaaa agtaatcaag 900
gcaagcgcag aagaaataag tgcaaatcca cgtgcgcgtt cagcaaaact aagagctata 960
caaaggttat tatga 975
<210> 33
<211> 1505
<212> DNA
<213> Snodgrassella alvi
<400> 33
gagagtttga tcctggctca gattgaacgc tggcggcatg ccttacacat gcaagtcgaa 60
cggcagcacg gagagcttgc tctctggtgg cgagtggcga acgggtgagt aatgcatcgg 120
aacgtaccga gtaatggggg ataactgtcc gaaaggatgg ctaataccgc atacgccctg 180
agggggaaag cgggggatcg aaagacctcg cgttatttga gcggccgatg ttggattagc 240
tagttggtgg ggtaaaggcc taccaaggcg acgatccata gcgggtctga gaggatgatc 300
cgccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt ggggaatttt 360
ggacaatggg gggaaccctg atccagccat gccgcgtgtc tgaagaaggc cttcgggttg 420
taaaggactt ttgttaggga agaaaagccg ggtgttaata ccatctggtg ctgacggtac 480
ctaaagaata agcaccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggtgcgag 540
cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcga gcgcagacgg ttaattaagt cagatgtgaa 600
atccccgagc tcaacttggg acgtgcattt gaaactggtt aactagagtg tgtcagaggg 660
aggtagaatt ccacgtgtag cagtgaaatg cgtagagatg tggaggaata ccgatggcga 720
aggcagcctc ctgggataac actgacgttc atgctcgaaa gcgtgggtag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccac gccctaaacg atgacaatta gctgttggga cactagatgt 840
cttagtagcg aagctaacgc gtgaaattgt ccgcctgggg agtacggtcg caagattaaa 900
actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcggtggatg atgtggatta attcgatgca 960
acgcgaagaa ccttacctgg tcttgacatg tacggaatct cttagagata ggagagtgcc 1020
ttcgggaacc gtaacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080
gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt cattagttgc catcattaag ttgggcactc 1140
taatgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc 1200
cttatgacca gggcttcaca cgtcatacaa tggtcggtac agagggtagc gaagccgcga 1260
ggtgaagcca atctcagaaa gccgatcgta gtccggattg cactctgcaa ctcgagtgca 1320
tgaagtcgga atcgctagta atcgcaggtc agcatactgc ggtgaatacg ttcccgggtc 1380
ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tgggggatac cagaattggg tagactaacc 1440
gcaaggaggt cgcttaacac ggtatgcttc atgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc 1500
cgtag 1505
<210> 34
<211> 1541
<212> DNA
<213> Gilliamella apicola
<400> 34
ttaaattgaa gagtttgatc atggctcaga ttgaacgctg gcggcaggct taacacatgc 60
aagtcgaacg gtaacatgag tgcttgcact tgatgacgag tggcggacgg gtgagtaaag 120
tatggggatc tgccgaatgg agggggacaa cagttggaaa cgactgctaa taccgcataa 180
agttgagaga ccaaagcatg ggaccttcgg gccatgcgcc atttgatgaa cccatatggg 240
attagctagt tggtagggta atggcttacc aaggcgacga tctctagctg gtctgagagg 300
atgaccagcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 360
aatattgcac aatgggggaa accctgatgc agccatgccg cgtgtatgaa gaaggccttc 420
gggttgtaaa gtactttcgg tgatgaggaa ggtggtgtat ctaataggtg catcaattga 480
cgttaattac agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg 540
tgcgagcgtt aatcggaatg actgggcgta aagggcatgt aggcggataa ttaagttagg 600
tgtgaaagcc ctgggctcaa cctaggaatt gcacttaaaa ctggttaact agagtattgt 660
agaggaaggt agaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaataccgg 720
tggcgaaggc ggccttctgg acagatactg acgctgagat gcgaaagcgt ggggagcaaa 780
caggattaga taccctggta gtccacgctg taaacgatgt cgatttggag tttgttgcct 840
agagtgatgg gctccgaagc taacgcgata aatcgaccgc ctggggagta cggccgcaag 900
gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960
gatgcaacgc gaagaacctt acctggtctt gacatccaca gaatcttgca gagatgcggg 1020
agtgccttcg ggaactgtga gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa 1080
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatcctt tgttgccatc ggttaggccg 1140
ggaactcaaa ggagactgcc gttgataaag cggaggaagg tggggacgac gtcaagtcat 1200
catggccctt acgaccaggg ctacacacgt gctacaatgg cgtatacaaa gggaggcgac 1260
ctcgcgagag caagcggacc tcataaagta cgtctaagtc cggattggag tctgcaactc 1320
gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gtgaatcaga atgtcacggt gaatacgttc 1380
ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaccag aagtagatag 1440
cttaaccttc gggagggcgt ttaccacggt gtggtccatg actggggtga agtcgtaaca 1500
aggtaaccgt aggggaacct gcggttggat cacctcctta c 1541
<210> 35
<211> 1528
<212> DNA
<213> Bartonella apis
<400> 35
aagccaaaat caaattttca acttgagagt ttgatcctgg ctcagaacga acgctggcgg 60
caggcttaac acatgcaagt cgaacgcact tttcggagtg agtggcagac gggtgagtaa 120
cgcgtgggaa tctacctatt tctacggaat aacgcagaga aatttgtgct aataccgtat 180
acgtccttcg ggagaaagat ttatcggaga tagatgagcc cgcgttggat tagctagttg 240
gtgaggtaat ggcccaccaa ggcgacgatc catagctggt ctgagaggat gaccagccac 300
attgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa 360
tgggcgcaag cctgatccag ccatgccgcg tgagtgatga aggccctagg gttgtaaagc 420
tctttcaccg gtgaagataa tgacggtaac cggagaagaa gccccggcta acttcgtgcc 480
agcagccgcg gtaatacgaa gggggctagc gttgttcgga tttactgggc gtaaagcgca 540
cgtaggcgga tatttaagtc aggggtgaaa tcccggggct caaccccgga actgcctttg 600
atactggata tcttgagtat ggaagaggta agtggaattc cgagtgtaga ggtgaaattc 660
gtagatattc ggaggaacac cagtggcgaa ggcggcttac tggtccatta ctgacgctga 720
ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ctgtaaacga 780
tgaatgttag ccgttggaca gtttactgtt cggtggcgca gctaacgcat taaacattcc 840
gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900
ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgcagaacc ttaccagccc ttgacatccc 960
gatcgcggat ggtggagaca ccgtctttca gttcggctgg atcggtgaca ggtgctgcat 1020
ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc 1080
gcccttagtt gccatcattt agttgggcac tctaagggga ctgccggtga taagccgaga 1140
ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttacgg gctgggctac acacgtgcta 1200
caatggtggt gacagtgggc agcgagaccg cgaggtcgag ctaatctcca aaagccatct 1260
cagttcggat tgcactctgc aactcgagtg catgaagttg gaatcgctag taatcgtgga 1320
tcagcatgcc acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg 1380
agttggtttt acccgaaggt gctgtgctaa ccgcaaggag gcaggcaacc acggtagggt 1440
cagcgactgg ggtgaagtcg taacaaggta gccgtagggg aacctgcggc tggatcacct 1500
cctttctaag gaagatgaag aattggaa 1528
<210> 36
<211> 1390
<212> DNA
<213> Parasaccharibacter apium
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (643)..(756)
<223> n是a、g、c或t
<400> 36
ctaccatgca agtcgcacga aacctttcgg ggttagtggc ggacgggtga gtaacgcgtt 60
aggaacctat ctggaggtgg gggataacat cgggaaactg gtgctaatac cgcatgatgc 120
ctgagggcca aaggagagat ccgccattgg aggggcctgc gttcgattag ctagttggtt 180
gggtaaaggc tgaccaaggc gatgatcgat agctggtttg agaggatgat cagccacact 240
gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg 300
gggcaaccct gatccagcaa tgccgcgtgt gtgaagaagg tcttcggatt gtaaagcact 360
ttcactaggg aagatgatga cggtacctag agaagaagcc ccggctaact tcgtgccagc 420
agccgcggta atacgaaggg ggctagcgtt gctcggaatg actgggcgta aagggcgcgt 480
aggctgtttg tacagtcaga tgtgaaatcc ccgggcttaa cctgggaact gcatttgata 540
cgtgcagact agagtccgag agagggttgt ggaattccca gtgtagaggt gaaattcgta 600
gatattggga agaacaccgg ttgcgaaggc ggcaacctgg ctnnnnnnnn nnnnnnnnnn 660
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 720
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnngagc taacgcgtta agcacaccgc 780
ctggggagta cggccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 840
tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gcagaacctt accagggctt gcatggggag 900
gctgtattca gagatggata tttcttcgga cctcccgcac aggtgctgca tggctgtcgt 960
cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgtctttagt 1020
tgccatcacg tctgggtggg cactctagag agactgccgg tgacaagccg gaggaaggtg 1080
gggatgacgt caagtcctca tggcccttat gtcctgggct acacacgtgc tacaatggcg 1140
gtgacagagg gatgctacat ggtgacatgg tgctgatctc aaaaaaccgt ctcagttcgg 1200
attgtactct gcaactcgag tgcatgaagg tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg 1260
ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagttggtt 1320
tgaccttaag ccggtgagcg aaccgcaagg aacgcagccg accaccggtt cgggttcagc 1380
gactggggga 1390
<210> 37
<211> 1583
<212> DNA
<213> 昆仑乳杆菌
<400> 37
ttccttagaa aggaggtgat ccagccgcag gttctcctac ggctaccttg ttacgacttc 60
accctaatca tctgtcccac cttagacgac tagctcctaa aaggttaccc catcgtcttt 120
gggtgttaca aactctcatg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca 180
ccgtggcatg ctgatccacg attactagtg attccaactt catgcaggcg agttgcagcc 240
tgcaatccga actgagaatg gctttaagag attagcttga cctcgcggtt tcgcgactcg 300
ttgtaccatc cattgtagca cgtgtgtagc ccagctcata aggggcatga tgatttgacg 360
tcgtccccac cttcctccgg tttatcaccg gcagtctcac tagagtgccc aactaaatgc 420
tggcaactaa taataagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg 480
agctgacgac aaccatgcac cacctgtcat tctgtccccg aagggaacgc ccaatctctt 540
gggttggcag aagatgtcaa gagctggtaa ggttcttcgc gtagcatcga attaaaccac 600
atgctccacc acttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcaacct tgcggtcgta 660
ctccccaggc ggaatactta atgcgttagc tgcggcactg aagggcggaa accctccaac 720
acctagtatt catcgtttac ggcatggact accagggtat ctaatcctgt tcgctaccca 780
tgctttcgag cctcagcgtc agtaacagac cagaaagccg ccttcgccac tggtgttctt 840
ccatatatct acgcatttca ccgctacaca tggagttcca ctttcctctt ctgtactcaa 900
gttttgtagt ttccactgca cttcctcagt tgagctgagg gctttcacag cagacttaca 960
aaaccgcctg cgctcgcttt acgcccaata aatccggaca acgcttgcca cctacgtatt 1020
accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctggt taaataccgt caaagtgtta 1080
acagttactc taacacttgt tcttctttaa caacagagtt ttacgatccg aaaaccttca 1140
tcactcacgc ggcgttgctc catcagactt tcgtccattg tggaagattc cctactgctg 1200
cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccaatgtg gccgattacc ctctcaggtc 1260
ggctacgtat catcgtcttg gtgggctttt atctcaccaa ctaactaata cggcgcgggt 1320
ccatcccaaa gtgatagcaa agccatcttt caagttggaa ccatgcggtt ccaactaatt 1380
atgcggtatt agcacttgtt tccaaatgtt atcccccgct tcggggcagg ttacccacgt 1440
gttactcacc agttcgccac tcgctccgaa tccaaaaatc atttatgcaa gcataaaatc 1500
aatttgggag aactcgttcg acttgcatgt attaggcacg ccgccagcgt tcgtcctgag 1560
ccaggatcaa actctcatct taa 1583
<210> 38
<211> 1395
<212> DNA
<213> 乳杆菌Firm-4
<400> 38
acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg cgggaagtca gggaagcctt 60
cgggtggaac tggtggaacg agcggcggat gggtgagtaa cacgtaggta acctgcccta 120
aagcggggga taccatctgg aaacaggtgc taataccgca taaacccagc agtcacatga 180
gtgctggttg aaagacggct tcggctgtca ctttaggatg gacctgcggc gtattagcta 240
gttggtggag taacggttca ccaaggcaat gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg 300
ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 360
acaatggacg caagtctgat ggagcaacgc cgcgtggatg aagaaggtct tcggatcgta 420
aaatcctgtt gttgaagaag aacggttgtg agagtaactg ctcataacgt gacggtaatc 480
aaccagaaag tcacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 540
ttgtccggat ttattgggcg taaagggagc gcaggcggtc ttttaagtct gaatgtgaaa 600
gccctcagct taactgagga agagcatcgg aaactgagag acttgagtgc agaagaggag 660
agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa 720
ggcggctctc tggtctgtta ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc gaacaggatt 780
agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttgggag gtttccgcct 840
ctcagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa 900
actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 960
acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc tcctgcaagc ctaagagatt aggggttccc 1020
ttcggggaca ggaagacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080
gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt tactagttgc cagcattaag ttgggcactc 1140
tagtgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggac gacgtcaaat catcatgccc 1200
cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggatggtac aatgagaagc gaactcgcga 1260
ggggaagctg atctctgaaa accattctca gttcggattg caggctgcaa ctcgcctgca 1320
tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1380
ttgtacacac cgccc 1395
<210> 39
<211> 1549
<212> DNA
<213> 肠球菌属
<400> 39
aggtgatcca gccgcacctt ccgatacggc taccttgtta cgacttcacc ccaatcatct 60
atcccacctt aggcggctgg ctccaaaaag gttacctcac cgacttcggg tgttacaaac 120
tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcgtgctg 180
atccgcgatt actagcgatt ccggcttcat gcaggcgagt tgcagcctgc aatccgaact 240
gagagaagct ttaagagatt tgcatgacct cgcggtctag cgactcgttg tacttcccat 300
tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt 360
cctccggttt gtcaccggca gtctcgctag agtgcccaac taaatgatgg caactaacaa 420
taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 480
catgcaccac ctgtcacttt gtccccgaag ggaaagctct atctctagag tggtcaaagg 540
atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct 600
tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcaaccttgc ggtcgtactc cccaggcgga 660
gtgcttaatg cgtttgctgc agcactgaag ggcggaaacc ctccaacact tagcactcat 720
cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgtttg ctccccacgc tttcgagcct 780
cagcgtcagt tacagaccag agagccgcct tcgccactgg tgttcctcca tatatctacg 840
catttcaccg ctacacatgg aattccactc tcctcttctg cactcaagtc tcccagtttc 900
caatgaccct ccccggttga gccgggggct ttcacatcag acttaagaaa ccgcctgcgc 960
tcgctttacg cccaataaat ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg 1020
gcacgtagtt agccgtggct ttctggttag ataccgtcag gggacgttca gttactaacg 1080
tccttgttct tctctaacaa cagagtttta cgatccgaaa accttcttca ctcacgcggc 1140
gttgctcggt cagactttcg tccattgccg aagattccct actgctgcct cccgtaggag 1200
tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc gatcaccctc tcaggtcggc tatgcatcgt 1260
ggccttggtg agccgttacc tcaccaacta gctaatgcac cgcgggtcca tccatcagcg 1320
acacccgaaa gcgcctttca ctcttatgcc atgcggcata aactgttatg cggtattagc 1380
acctgtttcc aagtgttatc cccctctgat gggtaggtta cccacgtgtt actcacccgt 1440
ccgccactcc tctttccaat tgagtgcaag cactcgggag gaaagaagcg ttcgacttgc 1500
atgtattagg cacgccgcca gcgttcgtcc tgagccagga tcaaactct 1549
<210> 40
<211> 1541
<212> DNA
<213> 戴尔福特菌属
<400> 40
cagaaaggag gtgatccagc cgcaccttcc gatacggcta ccttgttacg acttcacccc 60
agtcacgaac cccgccgtgg taagcgccct ccttgcggtt aggctaccta cttctggcga 120
gacccgctcc catggtgtga cgggcggtgt gtacaagacc cgggaacgta ttcaccgcgg 180
catgctgatc cgcgattact agcgattccg acttcacgca gtcgagttgc agactgcgat 240
ccggactacg actggtttta tgggattagc tccccctcgc gggttggcaa ccctctgtac 300
cagccattgt atgacgtgtg tagccccacc tataagggcc atgaggactt gacgtcatcc 360
ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc tcattagagt gctcaactga atgtagcaac 420
taatgacaag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 480
gacagccatg cagcacctgt gtgcaggttc tctttcgagc acgaatccat ctctggaaac 540
ttcctgccat gtcaaaggtg ggtaaggttt ttcgcgttgc atcgaattaa accacatcat 600
ccaccgcttg tgcgggtccc cgtcaattcc tttgagtttc aaccttgcgg ccgtactccc 660
caggcggtca acttcacgcg ttagcttcgt tactgagaaa actaattccc aacaaccagt 720
tgacatcgtt tagggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc 780
gtgcatgagc gtcagtacag gtccagggga ttgccttcgc catcggtgtt cctccgcata 840
tctacgcatt tcactgctac acgcggaatt ccatccccct ctaccgtact ctagccatgc 900
agtcacaaat gcagttccca ggttgagccc ggggatttca catctgtctt acataaccgc 960
ctgcgcacgc tttacgccca gtaattccga ttaacgctcg caccctacgt attaccgcgg 1020
ctgctggcac gtagttagcc ggtgcttatt cttacggtac cgtcatgggc cccctgtatt 1080
agaaggagct ttttcgttcc gtacaaaagc agtttacaac ccgaaggcct tcatcctgca 1140
cgcggcattg ctggatcagg ctttcgccca ttgtccaaaa ttccccactg ctgcctcccg 1200
taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt gtggctggtc gtcctctcag accagctaca 1260
gatcgtcggc ttggtaagct tttatcccac caactaccta atctgccatc ggccgctcca 1320
atcgcgcgag gcccgaaggg cccccgcttt catcctcaga tcgtatgcgg tattagctac 1380
tctttcgagt agttatcccc cacgactggg cacgttccga tgtattactc acccgttcgc 1440
cactcgtcag cgtccgaaga cctgttaccg ttcgacttgc atgtgtaagg catgccgcca 1500
gcgttcaatc tgagccagga tcaaactcta cagttcgatc t 1541
<210> 41
<211> 1502
<212> DNA
<213> Pelomonas
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (192)..(193)
<223> n是a、g、c或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (832)..(833)
<223> n是a、g、c或t
<400> 41
atcctggctc agattgaacg ctggcggcat gccttacaca tgcaagtcga acggtaacag 60
gttaagctga cgagtggcga acgggtgagt aatatatcgg aacgtgccca gtcgtggggg 120
ataactgctc gaaagagcag ctaataccgc atacgacctg agggtgaaag cgggggatcg 180
caagacctcg cnngattgga gcggccgata tcagattagg tagttggtgg ggtaaaggcc 240
caccaagcca acgatctgta gctggtctga gaggacgacc agccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatttt ggacaatggg cgcaagcctg 360
atccagccat gccgcgtgcg ggaagaaggc cttcgggttg taaaccgctt ttgtcaggga 420
agaaaaggtt ctggttaata cctgggactc atgacggtac ctgaagaata agcaccggct 480
aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg 540
cgtaaagcgt gcgcaggcgg ttatgcaaga cagaggtgaa atccccgggc tcaacctggg 600
aactgccttt gtgactgcat agctagagta cggtagaggg ggatggaatt ccgcgtgtag 660
cagtgaaatg cgtagatatg cggaggaaca ccgatggcga aggcaatccc ctggacctgt 720
actgacgctc atgcacgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780
gccctaaacg atgtcaactg gttgttggga gggtttcttc tcagtaacgt anntaacgcg 840
tgaagttgac cgcctgggga gtacggccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacgggga 900
cccgcacaag cggtggatga tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaaaaac cttacctacc 960
cttgacatgc caggaatcct gaagagattt gggagtgctc gaaagagaac ctggacacag 1020
gtgctgcatg gccgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080
gcaacccttg tcattagttg ctacgaaagg gcactctaat gagactgccg gtgacaaacc 1140
ggaggaaggt ggggatgacg tcaggtcatc atggccctta tgggtagggc tacacacgtc 1200
atacaatggc cgggacagag ggctgccaac ccgcgagggg gagctaatcc cagaaacccg 1260
gtcgtagtcc ggatcgtagt ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg 1320
cggatcagct tgccgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380
tgggagcggg ttctgccaga agtagttagc ctaaccgcaa ggagggcgat taccacggca 1440
gggttcgtga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta tcggaaggtg cggctggatc 1500
ac 1502
<210> 42
<211> 34
<212> PRT
<213> 乳酸乳球菌
<400> 42
Ile Thr Ser Ile Ser Leu Cys Thr Pro Gly Cys Lys Thr Gly Ala Leu
1 5 10 15
Met Gly Cys Asn Met Lys Thr Ala Thr Cys His Cys Ser Ile His Val
20 25 30
Ser Lys
<210> 43
<211> 22
<212> PRT
<213> 表皮葡萄球菌
<400> 43
Ile Ala Ser Lys Phe Ile Cys Thr Pro Gly Cys Ala Lys Thr Gly Ser
1 5 10 15
Phe Asn Ser Tyr Cys Cys
20
<210> 44
<211> 44
<212> PRT
<213> 乳酸片球菌
<400> 44
Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Thr Cys Gly Lys His Ser Cys Ser Val
1 5 10 15
Asp Trp Gly Lys Ala Thr Thr Cys Ile Ile Asn Asn Gly Ala Met Ala
20 25 30
Trp Ala Thr Gly Gly His Gln Gly Asn His Lys Cys
35 40
<210> 45
<211> 44
<212> PRT
<213> 屎肠球菌
<400> 45
Ala Thr Arg Ser Tyr Gly Asn Gly Val Tyr Cys Asn Asn Ser Lys Cys
1 5 10 15
Trp Val Asn Trp Gly Glu Ala Lys Glu Asn Ile Ala Gly Ile Val Ile
20 25 30
Ser Gly Trp Ala Ser Gly Leu Ala Gly Met Gly His
35 40
<210> 46
<211> 39
<212> PRT
<213> 乳酸链球菌
<400> 46
Gly Thr Trp Asp Asp Ile Gly Gln Gly Ile Gly Arg Val Ala Tyr Trp
1 5 10 15
Val Gly Lys Ala Met Gly Asn Met Ser Asp Val Asn Gln Ala Ser Arg
20 25 30
Ile Asn Arg Lys Lys Lys His
35
<210> 47
<211> 48
<212> PRT
<213> 约氏乳杆菌
<400> 47
Asn Arg Trp Gly Asp Thr Val Leu Ser Ala Ala Ser Gly Ala Gly Thr
1 5 10 15
Gly Ile Lys Ala Cys Lys Ser Phe Gly Pro Trp Gly Met Ala Ile Cys
20 25 30
Gly Val Gly Gly Ala Ala Ile Gly Gly Tyr Phe Gly Tyr Thr His Asn
35 40 45
<210> 48
<211> 70
<212> PRT
<213> 粪肠球菌
<400> 48
Met Ala Lys Glu Phe Gly Ile Pro Ala Ala Val Ala Gly Thr Val Leu
1 5 10 15
Asn Val Val Glu Ala Gly Gly Trp Val Thr Thr Ile Val Ser Ile Leu
20 25 30
Thr Ala Val Gly Ser Gly Gly Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Gly Arg
35 40 45
Glu Ser Ile Lys Ala Tyr Leu Lys Lys Glu Ile Lys Lys Lys Gly Lys
50 55 60
Arg Ala Val Ile Ala Trp
65 70
<210> 49
<211> 51
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 49
Met Ser Trp Leu Asn Phe Leu Lys Tyr Ile Ala Lys Tyr Gly Lys Lys
1 5 10 15
Ala Val Ser Ala Ala Trp Lys Tyr Lys Gly Lys Val Leu Glu Trp Leu
20 25 30
Asn Val Gly Pro Thr Leu Glu Trp Val Trp Gln Lys Leu Lys Lys Ile
35 40 45
Ala Gly Leu
50
<210> 50
<211> 43
<212> PRT
<213> 格氏乳球菌
<400> 50
Ile Gly Gly Ala Leu Gly Asn Ala Leu Asn Gly Leu Gly Thr Trp Ala
1 5 10 15
Asn Met Met Asn Gly Gly Gly Phe Val Asn Gln Trp Gln Val Tyr Ala
20 25 30
Asn Lys Gly Lys Ile Asn Gln Tyr Arg Pro Tyr
35 40
<210> 51
<211> 103
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 51
Met Arg Thr Leu Thr Leu Asn Glu Leu Asp Ser Val Ser Gly Gly Ala
1 5 10 15
Ser Gly Arg Asp Ile Ala Met Ala Ile Gly Thr Leu Ser Gly Gln Phe
20 25 30
Val Ala Gly Gly Ile Gly Ala Ala Ala Gly Gly Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ile Tyr Asp Tyr Ala Ser Thr His Lys Pro Asn Pro Ala Met Ser Pro
50 55 60
Ser Gly Leu Gly Gly Thr Ile Lys Gln Lys Pro Glu Gly Ile Pro Ser
65 70 75 80
Glu Ala Trp Asn Tyr Ala Ala Gly Arg Leu Cys Asn Trp Ser Pro Asn
85 90 95
Asn Leu Ser Asp Val Cys Leu
100
<210> 52
<211> 48
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Ser Ser Leu Leu Glu Lys Gly Leu Asp Gly Ala Lys Lys Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Leu Gly Lys Leu Gly Lys Asp Ala Val Glu Asp Leu Glu Ser Val
20 25 30
Gly Lys Gly Ala Val His Asp Val Lys Asp Val Leu Asp Ser Val Leu
35 40 45
<210> 53
<211> 37
<212> PRT
<213> Hyalophora cecropia
<400> 53
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg
1 5 10 15
Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala
20 25 30
Thr Gln Ile Ala Lys
35
<210> 54
<211> 62
<212> PRT
<213> Drosophila teissieri
<400> 54
Met Lys Tyr Phe Ser Val Leu Val Val Leu Thr Leu Ile Leu Ala Ile
1 5 10 15
Val Asp Gln Ser Asp Ala Phe Ile Asn Leu Leu Asp Lys Val Glu Asp
20 25 30
Ala Leu His Thr Gly Ala Gln Ala Gly Phe Lys Leu Ile Arg Pro Val
35 40 45
Glu Arg Gly Ala Thr Pro Lys Lys Ser Glu Lys Pro Glu Lys
50 55 60
<210> 55
<211> 66
<212> PRT
<213> 家蚕
<400> 55
Met Asn Ile Leu Lys Phe Phe Phe Val Phe Ile Val Ala Met Ser Leu
1 5 10 15
Val Ser Cys Ser Thr Ala Ala Pro Ala Lys Ile Pro Ile Lys Ala Ile
20 25 30
Lys Thr Val Gly Lys Ala Val Gly Lys Gly Leu Arg Ala Ile Asn Ile
35 40 45
Ala Ser Thr Ala Asn Asp Val Phe Asn Phe Leu Lys Pro Lys Lys Arg
50 55 60
Lys His
65
<210> 56
<211> 71
<212> PRT
<213> 地中海实蝇
<400> 56
Met Ala Asn Leu Lys Ala Val Phe Leu Ile Cys Ile Val Ala Phe Ile
1 5 10 15
Ala Leu Gln Cys Val Val Ala Glu Pro Ala Ala Glu Asp Ser Val Val
20 25 30
Val Lys Arg Ser Ile Gly Ser Ala Leu Lys Lys Ala Leu Pro Val Ala
35 40 45
Lys Lys Ile Gly Lys Ile Ala Leu Pro Ile Ala Lys Ala Ala Leu Pro
50 55 60
Val Ala Ala Gly Leu Val Gly
65 70
<210> 57
<211> 53
<212> PRT
<213> 西方蜜蜂
<400> 57
Met Lys Val Val Ile Phe Ile Phe Ala Leu Leu Ala Thr Ile Cys Ala
1 5 10 15
Ala Phe Ala Tyr Val Pro Leu Pro Asn Val Pro Gln Pro Gly Arg Arg
20 25 30
Pro Phe Pro Thr Phe Pro Gly Gln Gly Pro Phe Asn Pro Lys Ile Lys
35 40 45
Trp Pro Gln Gly Tyr
50
<210> 58
<211> 283
<212> PRT
<213> 西方蜜蜂
<400> 58
Lys Asn Phe Ala Leu Ala Ile Leu Val Val Thr Phe Val Val Ala Val
1 5 10 15
Phe Gly Asn Thr Asn Leu Asp Pro Pro Thr Arg Pro Thr Arg Leu Arg
20 25 30
Arg Glu Ala Lys Pro Glu Ala Glu Pro Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr
35 40 45
Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro Arg Leu Arg Arg Glu Ala Glu
50 55 60
Pro Glu Ala Glu Pro Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro
65 70 75 80
Arg Pro Pro His Pro Arg Leu Arg Arg Glu Ala Glu Leu Glu Ala Glu
85 90 95
Pro Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Ser Gln Pro Arg Pro Pro His
100 105 110
Pro Arg Leu Arg Arg Glu Ala Glu Pro Glu Ala Glu Pro Gly Asn Asn
115 120 125
Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro Arg Leu Arg
130 135 140
Arg Glu Ala Glu Leu Glu Ala Glu Pro Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr
145 150 155 160
Ile Ser Gln Pro Arg Pro Pro His Pro Arg Leu Arg Arg Glu Ala Glu
165 170 175
Pro Glu Ala Glu Pro Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro
180 185 190
Arg Pro Pro His Pro Arg Leu Arg Arg Glu Ala Glu Pro Glu Ala Glu
195 200 205
Pro Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His
210 215 220
Pro Arg Leu Arg Arg Glu Ala Glu Pro Glu Ala Glu Pro Gly Asn Asn
225 230 235 240
Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro Arg Leu Arg
245 250 255
Arg Glu Ala Lys Pro Glu Ala Lys Pro Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr
260 265 270
Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro Arg Ile
275 280
<210> 59
<211> 228
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 59
Met Glu Thr Gln Arg Ala Ser Leu Cys Leu Gly Arg Trp Ser Leu Trp
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val Val Pro Ser Ala Ser Ala Gln Ala Leu
20 25 30
Ser Tyr Arg Glu Ala Val Leu Arg Ala Val Asp Arg Leu Asn Glu Gln
35 40 45
Ser Ser Glu Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Glu Leu Asp Gln Pro Pro
50 55 60
Lys Ala Asp Glu Asp Pro Gly Thr Pro Lys Pro Val Ser Phe Thr Val
65 70 75 80
Lys Glu Thr Val Cys Pro Arg Pro Thr Arg Arg Pro Pro Glu Leu Cys
85 90 95
Asp Phe Lys Glu Asn Gly Arg Val Lys Gln Cys Val Gly Thr Val Thr
100 105 110
Leu Asp Gln Ile Lys Asp Pro Leu Asp Ile Thr Cys Asn Glu Gly Val
115 120 125
Arg Arg Phe Pro Trp Trp Trp Pro Phe Leu Arg Arg Pro Arg Leu Arg
130 135 140
Arg Gln Ala Phe Pro Pro Pro Asn Val Pro Gly Pro Arg Phe Pro Pro
145 150 155 160
Pro Asn Val Pro Gly Pro Arg Phe Pro Pro Pro Asn Phe Pro Gly Pro
165 170 175
Arg Phe Pro Pro Pro Asn Phe Pro Gly Pro Arg Phe Pro Pro Pro Asn
180 185 190
Phe Pro Gly Pro Pro Phe Pro Pro Pro Ile Phe Pro Gly Pro Trp Phe
195 200 205
Pro Pro Pro Pro Pro Phe Arg Pro Pro Pro Phe Gly Pro Pro Arg Phe
210 215 220
Pro Gly Arg Arg
225
<210> 60
<211> 144
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 60
Met Gln Thr Gln Arg Ala Ser Leu Ser Leu Gly Arg Trp Ser Leu Trp
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Gly Leu Val Val Pro Ser Ala Ser Ala Gln Ala Leu
20 25 30
Ser Tyr Arg Glu Ala Val Leu Arg Ala Val Asp Gln Leu Asn Glu Leu
35 40 45
Ser Ser Glu Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Pro
50 55 60
Lys Asp Asn Glu Asp Leu Gly Thr Arg Lys Pro Val Ser Phe Thr Val
65 70 75 80
Lys Glu Thr Val Cys Pro Arg Thr Ile Gln Gln Pro Ala Glu Gln Cys
85 90 95
Asp Phe Lys Glu Lys Gly Arg Val Lys Gln Cys Val Gly Thr Val Thr
100 105 110
Leu Asp Pro Ser Asn Asp Gln Phe Asp Leu Asn Cys Asn Glu Leu Gln
115 120 125
Ser Val Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Gly
130 135 140
<210> 61
<211> 149
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 61
Met Glu Thr Gln Arg Ala Ser Leu Cys Leu Gly Arg Trp Ser Leu Trp
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val Val Pro Ser Ala Ser Ala Gln Ala Leu
20 25 30
Ser Tyr Arg Glu Ala Val Leu Arg Ala Val Asp Arg Leu Asn Glu Gln
35 40 45
Ser Ser Glu Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Glu Leu Asp Gln Pro Pro
50 55 60
Lys Ala Asp Glu Asp Pro Gly Thr Pro Lys Pro Val Ser Phe Thr Val
65 70 75 80
Lys Glu Thr Val Cys Pro Arg Pro Thr Arg Gln Pro Pro Glu Leu Cys
85 90 95
Asp Phe Lys Glu Asn Gly Arg Val Lys Gln Cys Val Gly Thr Val Thr
100 105 110
Leu Asp Gln Ile Lys Asp Pro Leu Asp Ile Thr Cys Asn Glu Val Gln
115 120 125
Gly Val Arg Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Val
130 135 140
Cys Val Gly Arg Gly
145
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> Tachypleus gigas
<400> 62
Lys Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg Arg Cys
1 5 10 15
Arg
<210> 63
<211> 102
<212> PRT
<213> Anopheles gambiae
<400> 63
Met Lys Cys Ala Thr Ile Val Cys Thr Ile Ala Val Val Leu Ala Ala
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Gly Ser Val Gln Ala Ala Pro Gln Glu Glu Ala Ala
20 25 30
Leu Ser Gly Gly Ala Asn Leu Asn Thr Leu Leu Asp Glu Leu Pro Glu
35 40 45
Glu Thr His His Ala Ala Leu Glu Asn Tyr Arg Ala Lys Arg Ala Thr
50 55 60
Cys Asp Leu Ala Ser Gly Phe Gly Val Gly Ser Ser Leu Cys Ala Ala
65 70 75 80
His Cys Ile Ala Arg Arg Tyr Arg Gly Gly Tyr Cys Asn Ser Lys Ala
85 90 95
Val Cys Val Cys Arg Asn
100
<210> 64
<211> 70
<212> PRT
<213> 黑腹果蝇
<400> 64
Met Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met Leu
1 5 10 15
Val Val Leu Gly Ala Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg
20 25 30
Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val
35 40 45
Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Cys Trp Cys Glu Gly Cys
65 70
<210> 65
<211> 78
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌
<400> 65
Met Lys Leu Leu His Gly Phe Leu Ile Ile Met Leu Thr Met His Leu
1 5 10 15
Ser Ile Gln Tyr Ala Tyr Gly Gly Pro Phe Leu Thr Lys Tyr Leu Cys
20 25 30
Asp Arg Val Cys His Lys Leu Cys Gly Asp Glu Phe Val Cys Ser Cys
35 40 45
Ile Gln Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Leu Trp Phe Pro His Cys Pro Thr
50 55 60
Gly Lys Ala Ser Val Val Leu His Asn Phe Leu Thr Ser Pro
65 70 75
<210> 66
<211> 77
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌
<400> 66
Met Lys Leu Leu Tyr Gly Phe Leu Ile Ile Met Leu Thr Ile His Leu
1 5 10 15
Ser Val Gln Tyr Phe Glu Ser Pro Phe Glu Thr Lys Tyr Asn Cys Asp
20 25 30
Thr His Cys Asn Lys Leu Cys Gly Lys Ile Asp His Cys Ser Cys Ile
35 40 45
Gln Tyr His Ser Met Glu Gly Leu Trp Phe Pro His Cys Arg Thr Gly
50 55 60
Ser Ala Ala Gln Met Leu His Asp Phe Leu Ser Asn Pro
65 70 75
<210> 67
<211> 86
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌
<400> 67
Met Ser Val Arg Lys Asn Val Leu Pro Thr Met Phe Val Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Met Ser Pro Val Thr Pro Thr Ser Val Phe Ile Ser Ala Val Cys
20 25 30
Tyr Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ala Leu Val Cys Phe Val Ser Asn Gly
35 40 45
Ile Thr Asn Gly Leu Asp Tyr Phe Lys Ser Ser Ala Pro Leu Ser Thr
50 55 60
Ser Glu Thr Ser Cys Gly Glu Ala Phe Asp Thr Cys Thr Asp His Cys
65 70 75 80
Leu Ala Asn Phe Lys Phe
85
<210> 68
<211> 69
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌
<400> 68
Met Arg Leu Leu Tyr Gly Phe Leu Ile Ile Met Leu Thr Ile Tyr Leu
1 5 10 15
Ser Val Gln Asp Phe Asp Pro Thr Glu Phe Lys Gly Pro Phe Pro Thr
20 25 30
Ile Glu Ile Cys Ser Lys Tyr Cys Ala Val Val Cys Asn Tyr Thr Ser
35 40 45
Arg Pro Cys Tyr Cys Val Glu Ala Ala Lys Glu Arg Asp Gln Trp Phe
50 55 60
Pro Tyr Cys Tyr Asp
65
<210> 69
<211> 77
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌
<400> 69
Met Arg Leu Leu Tyr Gly Phe Leu Ile Ile Met Leu Thr Ile His Leu
1 5 10 15
Ser Val Gln Asp Ile Asp Pro Asn Thr Leu Arg Gly Pro Tyr Pro Thr
20 25 30
Lys Glu Ile Cys Ser Lys Tyr Cys Glu Tyr Asn Val Val Cys Gly Ala
35 40 45
Ser Leu Pro Cys Ile Cys Val Gln Asp Ala Arg Gln Leu Asp His Trp
50 55 60
Phe Ala Cys Cys Tyr Asp Gly Gly Pro Glu Met Leu Met
65 70 75
<210> 70
<211> 108
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌
<400> 70
Met Lys Leu Phe Val Val Val Val Leu Val Ala Val Gly Ile Met Phe
1 5 10 15
Val Phe Ala Ser Asp Thr Ala Ala Ala Pro Thr Asp Tyr Glu Asp Thr
20 25 30
Asn Asp Met Ile Ser Leu Ser Ser Leu Val Gly Asp Asn Ser Pro Tyr
35 40 45
Val Arg Val Ser Ser Ala Asp Ser Gly Gly Ser Ser Lys Thr Ser Ser
50 55 60
Lys Asn Pro Ile Leu Gly Leu Leu Lys Ser Val Ile Lys Leu Leu Thr
65 70 75 80
Lys Ile Phe Gly Thr Tyr Ser Asp Ala Ala Pro Ala Met Pro Pro Ile
85 90 95
Pro Pro Ala Leu Arg Lys Asn Arg Gly Met Leu Ala
100 105
<210> 71
<211> 178
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌
<400> 71
Met Val Ala Cys Lys Val Ile Leu Ala Val Ala Val Val Phe Val Ala
1 5 10 15
Ala Val Gln Gly Arg Pro Gly Gly Glu Pro Glu Trp Ala Ala Pro Ile
20 25 30
Phe Ala Glu Leu Lys Ser Val Ser Asp Asn Ile Thr Asn Leu Val Gly
35 40 45
Leu Asp Asn Ala Gly Glu Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Asn Asn Leu Asn
50 55 60
Ala Phe Ala Glu Ser Leu Lys Thr Glu Ala Ala Val Phe Ser Lys Ser
65 70 75 80
Phe Glu Gly Lys Ala Ser Ala Ser Asp Val Phe Lys Glu Ser Thr Lys
85 90 95
Asn Phe Gln Ala Val Val Asp Thr Tyr Ile Lys Asn Leu Pro Lys Asp
100 105 110
Leu Thr Leu Lys Asp Phe Thr Glu Lys Ser Glu Gln Ala Leu Lys Tyr
115 120 125
Met Val Glu His Gly Thr Glu Ile Thr Lys Lys Ala Gln Gly Asn Thr
130 135 140
Glu Thr Glu Lys Glu Ile Lys Glu Phe Phe Lys Lys Gln Ile Glu Asn
145 150 155 160
Leu Ile Gly Gln Gly Lys Ala Leu Gln Ala Lys Ile Ala Glu Ala Lys
165 170 175
Lys Ala
<210> 72
<211> 311
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌
<400> 72
Met Lys Thr Ser Ser Ser Lys Val Phe Ala Ser Cys Val Ala Ile Val
1 5 10 15
Cys Leu Ala Ser Val Ala Asn Ala Leu Pro Val Gln Lys Ser Val Ala
20 25 30
Ala Thr Thr Glu Asn Pro Ile Val Glu Lys His Gly Cys Arg Ala His
35 40 45
Lys Asn Leu Val Arg Gln Asn Val Val Asp Leu Lys Thr Tyr Asp Ser
50 55 60
Met Leu Ile Thr Asn Glu Val Val Gln Lys Gln Ser Asn Glu Val Gln
65 70 75 80
Ser Ser Glu Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser Glu Gln Ser Asn Glu
85 90 95
Gly Gln Asn Ser Glu Gln Ser Asn Glu Val Gln Ser Ser Glu His Ser
100 105 110
Asn Glu Gly Gln Asn Ser Lys Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser Glu
115 120 125
Gln Ser Asn Glu Val Gln Ser Ser Glu His Ser Asn Glu Gly Gln Asn
130 135 140
Ser Glu Gln Ser Asn Glu Val Gln Ser Ser Glu His Ser Asn Glu Gly
145 150 155 160
Gln Asn Ser Lys Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Glu Val Gln Ser Ser Glu His Trp Asn Glu Gly Gln Asn Ser Lys Gln
180 185 190
Ser Asn Glu Asp Gln Asn Ser Glu Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser
195 200 205
Lys Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser Lys Gln Ser Asn Glu Asp Gln
210 215 220
Asn Ser Glu Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser Lys Gln Ser Asn Glu
225 230 235 240
Val Gln Ser Ser Glu Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser Lys Gln Ser
245 250 255
Asn Glu Gly Gln Ser Ser Glu Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser Lys
260 265 270
Gln Ser Asn Glu Val Gln Ser Pro Glu Glu His Tyr Asp Leu Pro Asp
275 280 285
Pro Glu Ser Ser Tyr Glu Ser Glu Glu Thr Lys Gly Ser His Glu Ser
290 295 300
Gly Asp Asp Ser Glu His Arg
305 310
<210> 73
<211> 431
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌
<400> 73
Met Lys Thr Ile Ile Leu Gly Leu Cys Leu Phe Gly Ala Leu Phe Trp
1 5 10 15
Ser Thr Gln Ser Met Pro Val Gly Glu Val Ala Pro Ala Val Pro Ala
20 25 30
Val Pro Ser Glu Ala Val Pro Gln Lys Gln Val Glu Ala Lys Pro Glu
35 40 45
Thr Asn Ala Ala Ser Pro Val Ser Asp Ala Lys Pro Glu Ser Asp Ser
50 55 60
Lys Pro Val Asp Ala Glu Val Lys Pro Thr Val Ser Glu Val Lys Ala
65 70 75 80
Glu Ser Glu Gln Lys Pro Ser Gly Glu Pro Lys Pro Glu Ser Asp Ala
85 90 95
Lys Pro Val Val Ala Ser Glu Ser Lys Pro Glu Ser Asp Pro Lys Pro
100 105 110
Ala Ala Val Val Glu Ser Lys Pro Glu Asn Asp Ala Val Ala Pro Glu
115 120 125
Thr Asn Asn Asp Ala Lys Pro Glu Asn Ala Ala Ala Pro Val Ser Glu
130 135 140
Asn Lys Pro Ala Thr Asp Ala Lys Ala Glu Thr Glu Leu Ile Ala Gln
145 150 155 160
Ala Lys Pro Glu Ser Lys Pro Ala Ser Asp Leu Lys Ala Glu Pro Glu
165 170 175
Ala Ala Lys Pro Asn Ser Glu Val Pro Val Ala Leu Pro Leu Asn Pro
180 185 190
Thr Glu Thr Lys Ala Thr Gln Gln Ser Val Glu Thr Asn Gln Val Glu
195 200 205
Gln Ala Ala Pro Ala Ala Ala Gln Ala Asp Pro Ala Ala Ala Pro Ala
210 215 220
Ala Asp Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Pro Val Ala Ala Glu Glu
225 230 235 240
Ala Lys Leu Ser Glu Ser Ala Pro Ser Thr Glu Asn Lys Ala Ala Glu
245 250 255
Glu Pro Ser Lys Pro Ala Glu Gln Gln Ser Ala Lys Pro Val Glu Asp
260 265 270
Ala Val Pro Ala Ala Ser Glu Ile Ser Glu Thr Lys Val Ser Pro Ala
275 280 285
Val Pro Ala Val Pro Glu Val Pro Ala Ser Pro Ser Ala Pro Ala Val
290 295 300
Ala Asp Pro Val Ser Ala Pro Glu Ala Glu Lys Asn Ala Glu Pro Ala
305 310 315 320
Lys Ala Ala Asn Ser Ala Glu Pro Ala Val Gln Ser Glu Ala Lys Pro
325 330 335
Ala Glu Asp Ile Gln Lys Ser Gly Ala Val Val Ser Ala Glu Asn Pro
340 345 350
Lys Pro Val Glu Glu Gln Lys Pro Ala Glu Val Ala Lys Pro Ala Glu
355 360 365
Gln Ser Lys Ser Glu Ala Pro Ala Glu Ala Pro Lys Pro Thr Glu Gln
370 375 380
Ser Ala Ala Glu Glu Pro Lys Lys Pro Glu Ser Ala Asn Asp Glu Lys
385 390 395 400
Lys Glu Gln His Ser Val Asn Lys Arg Asp Ala Thr Lys Glu Lys Lys
405 410 415
Pro Thr Asp Ser Ile Met Lys Lys Gln Lys Gln Lys Lys Ala Asn
420 425 430
<210> 74
<211> 160
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌
<400> 74
Met Asn Gly Lys Ile Val Leu Cys Phe Ala Val Val Phe Ile Gly Gln
1 5 10 15
Ala Met Ser Ala Ala Thr Gly Thr Thr Pro Glu Val Glu Asp Ile Lys
20 25 30
Lys Val Ala Glu Gln Met Ser Gln Thr Phe Met Ser Val Ala Asn His
35 40 45
Leu Val Gly Ile Thr Pro Asn Ser Ala Asp Ala Gln Lys Ser Ile Glu
50 55 60
Lys Ile Arg Thr Ile Met Asn Lys Gly Phe Thr Asp Met Glu Thr Glu
65 70 75 80
Ala Asn Lys Met Lys Asp Ile Val Arg Lys Asn Ala Asp Pro Lys Leu
85 90 95
Val Glu Lys Tyr Asp Glu Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys His Leu Ser
100 105 110
Thr Ala Lys Asp Met Phe Glu Asp Lys Val Val Lys Pro Ile Gly Glu
115 120 125
Lys Val Glu Leu Lys Lys Ile Thr Glu Asn Val Ile Lys Thr Thr Lys
130 135 140
Asp Met Glu Ala Thr Met Asn Lys Ala Ile Asp Gly Phe Lys Lys Gln
145 150 155 160
<210> 75
<211> 415
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌
<400> 75
Met His Leu Phe Leu Ala Leu Gly Leu Phe Ile Val Cys Gly Met Val
1 5 10 15
Asp Ala Thr Phe Tyr Asn Pro Arg Ser Gln Thr Phe Asn Gln Leu Met
20 25 30
Glu Arg Arg Gln Arg Ser Ile Pro Ile Pro Tyr Ser Tyr Gly Tyr His
35 40 45
Tyr Asn Pro Ile Glu Pro Ser Ile Asn Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu
50 55 60
Gly Leu Asp Ser Arg Ile Asn Thr Phe Lys Pro Ile Tyr Gln Asn Val
65 70 75 80
Lys Met Ser Thr Gln Asp Val Asn Ser Val Pro Arg Thr Gln Tyr Gln
85 90 95
Pro Lys Asn Ser Leu Tyr Asp Ser Glu Tyr Ile Ser Ala Lys Asp Ile
100 105 110
Pro Ser Leu Phe Pro Glu Glu Asp Ser Tyr Asp Tyr Lys Tyr Leu Gly
115 120 125
Ser Pro Leu Asn Lys Tyr Leu Thr Arg Pro Ser Thr Gln Glu Ser Gly
130 135 140
Ile Ala Ile Asn Leu Val Ala Ile Lys Glu Thr Ser Val Phe Asp Tyr
145 150 155 160
Gly Phe Pro Thr Tyr Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Ser Val Trp Asn
165 170 175
Phe Gly Ser Lys Ile Pro Asn Thr Val Phe Glu Asp Pro Gln Ser Val
180 185 190
Glu Ser Asp Pro Asn Thr Phe Lys Val Ser Ser Pro Thr Ile Lys Ile
195 200 205
Val Lys Leu Leu Pro Glu Thr Pro Glu Gln Glu Ser Ile Ile Thr Thr
210 215 220
Thr Lys Asn Tyr Glu Leu Asn Tyr Lys Thr Thr Gln Glu Thr Pro Thr
225 230 235 240
Glu Ala Glu Leu Tyr Pro Ile Thr Ser Glu Glu Phe Gln Thr Glu Asp
245 250 255
Glu Trp His Pro Met Val Pro Lys Glu Asn Thr Thr Lys Asp Glu Ser
260 265 270
Ser Phe Ile Thr Thr Glu Glu Pro Leu Thr Glu Asp Lys Ser Asn Ser
275 280 285
Ile Thr Ile Glu Lys Thr Gln Thr Glu Asp Glu Ser Asn Ser Ile Glu
290 295 300
Phe Asn Ser Ile Arg Thr Glu Glu Lys Ser Asn Ser Ile Thr Thr Glu
305 310 315 320
Glu Asn Gln Lys Glu Asp Asp Glu Ser Met Ser Thr Thr Ser Gln Glu
325 330 335
Thr Thr Thr Ala Phe Asn Leu Asn Asp Thr Phe Asp Thr Asn Arg Tyr
340 345 350
Ser Ser Ser His Glu Ser Leu Met Leu Arg Ile Arg Glu Leu Met Lys
355 360 365
Asn Ile Ala Asp Gln Gln Asn Lys Ser Gln Phe Arg Thr Val Asp Asn
370 375 380
Ile Pro Ala Lys Ser Gln Ser Asn Leu Ser Ser Asp Glu Ser Thr Asn
385 390 395 400
Gln Gln Phe Glu Pro Gln Leu Val Asn Gly Ala Asp Thr Tyr Lys
405 410 415
<210> 76
<211> 126
<212> PRT
<213> 玉米象
<400> 76
Met Thr Arg Thr Met Leu Phe Leu Ala Cys Val Ala Ala Leu Tyr Val
1 5 10 15
Cys Ile Ser Ala Thr Ala Gly Lys Pro Glu Glu Phe Ala Lys Leu Ser
20 25 30
Asp Glu Ala Pro Ser Asn Asp Gln Ala Met Tyr Glu Ser Ile Gln Arg
35 40 45
Tyr Arg Arg Phe Val Asp Gly Asn Arg Tyr Asn Gly Gly Gln Gln Gln
50 55 60
Gln Gln Gln Pro Lys Gln Trp Glu Val Arg Pro Asp Leu Ser Arg Asp
65 70 75 80
Gln Arg Gly Asn Thr Lys Ala Gln Val Glu Ile Asn Lys Lys Gly Asp
85 90 95
Asn His Asp Ile Asn Ala Gly Trp Gly Lys Asn Ile Asn Gly Pro Asp
100 105 110
Ser His Lys Asp Thr Trp His Val Gly Gly Ser Val Arg Trp
115 120 125
<210> 77
<211> 220
<212> PRT
<213> 豌豆长管蚜
<400> 77
Met Lys Glu Thr Thr Val Val Trp Ala Lys Leu Phe Leu Ile Leu Ile
1 5 10 15
Ile Leu Ala Lys Pro Leu Gly Leu Lys Ala Val Asn Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Leu Gly Asn Asn Ser Cys Arg Ser His Gly Glu Cys Cys Ser Gly Phe
35 40 45
Cys Phe Ile Glu Pro Gly Trp Ala Leu Gly Val Cys Lys Arg Leu Gly
50 55 60
Thr Pro Lys Lys Ser Asp Asp Ser Asn Asn Gly Lys Asn Ile Glu Lys
65 70 75 80
Asn Asn Gly Val His Glu Arg Ile Asp Asp Val Phe Glu Arg Gly Val
85 90 95
Cys Ser Tyr Tyr Lys Gly Pro Ser Ile Thr Ala Asn Gly Asp Val Phe
100 105 110
Asp Glu Asn Glu Met Thr Ala Ala His Arg Thr Leu Pro Phe Asn Thr
115 120 125
Met Val Lys Val Glu Gly Met Gly Thr Ser Val Val Val Lys Ile Asn
130 135 140
Asp Arg Lys Thr Ala Ala Asp Gly Lys Val Met Leu Leu Ser Arg Ala
145 150 155 160
Ala Ala Glu Ser Leu Asn Ile Asp Glu Asn Thr Gly Pro Val Gln Cys
165 170 175
Gln Leu Lys Phe Val Leu Asp Gly Ser Gly Cys Thr Pro Asp Tyr Gly
180 185 190
Asp Thr Cys Val Leu His His Glu Cys Cys Ser Gln Asn Cys Phe Arg
195 200 205
Glu Met Phe Ser Asp Lys Gly Phe Cys Leu Pro Lys
210 215 220
<210> 78
<211> 3
<212> DNA
<213> 酿脓链球菌
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> n是a、g、c或t
<400> 78
ngg 3
<210> 79
<211> 6
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2)
<223> n是a、g、c或t
<400> 79
nnagaa 6
<210> 80
<211> 5
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> n是a、g、c或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> n是a、g、c或t
<400> 80
nggng 5
<210> 81
<211> 7
<212> DNA
<213> 脑膜炎奈瑟菌
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(3)
<223> n是a、g、c或t
<400> 81
nnngatt 7
<210> 82
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 穿膜肽
<400> 82
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 83
<211> 13
<212> PRT
<213> 人类免疫缺陷病毒1型
<400> 83
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 84
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pVEC
<400> 84
Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 85
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 运输蛋白
<400> 85
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
1 5 10 15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
20 25
<210> 86
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MPG
<400> 86
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 87
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pep-1
<400> 87
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 88
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAP
<400> 88
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R6W3
<400> 89
Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg
1 5
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bcr1正向引物
<400> 90
aaactgctgc atggctttct 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bcr1反向引物
<400> 91
acaggccttt caggctttta 20
<210> 92
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7启动子序列
<400> 92
ttaatacgac tcactatagg gaga 24
<210> 93
<211> 478
<212> RNA
<213> 豌豆长管蚜
<400> 93
augaaacugc ugcauggcuu ucugauuauu augcugacca ugcaucugag cauucaguau 60
gcguauggcg gcccguuucu gaccaaauau cugugcgauc gcgugugcca uaaacugugc 120
ggcgaugaau uugugugcag cugcauucag uauaaaagcc ugaaaggccu gugguuuccg 180
cauugcccga ccggcaaagc gagcguggug cugcauaacu uucugaccag cccguuuuuu 240
uuuucgggcu ggucagaaag uuaugcagca ccacgcucgc uuugccgguc gggcaaugcg 300
gaaaccacag gccuuucagg cuuuuauacu gaaugcagcu gcacacaaau ucaucgccgc 360
acaguuuaug gcacacgcga ucgcacagau auuuggucag aaacgggccg ccauacgcau 420
acugaaugcu cagaugcaug gucagcauaa uaaucagaaa gccaugcagc aguuucau 478
<210> 94
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鞘翅目昆虫抗菌肽A (colA)基因
<400> 94
atgacccgca ccatgctgtt tctggcgtgc gtggcggcgc tgtatgtgtg cattagcgcg 60
accgcgggca aaccggaaga atttgcgaaa ctgagcgatg aagcgccgag caacgatcag 120
gcgatgtatg aaagcattca gcgctatcgc cgctttgtgg atggcaaccg ctataacggc 180
ggccagcagc agcagcagca gccgaaacag tgggaagtgc gcccggatct gagccgcgat 240
cagcgcggca acaccaaagc gcaggtggaa attaacaaaa aaggcgataa ccatgatatt 300
aacgcgggct ggggcaaaaa cattaacggc ccggatagcc ataaagatac ctggcatgtg 360
ggcggcagcg tgcgctgg 378
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ColA正向引物
<400> 95
caacgatcag gcgatgtatg 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ColA反向引物
<400> 96
ttaatttcca cctgcgcttt 20
<210> 97
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 布赫纳氏菌属正向引物
<400> 97
gtcggctcat cacatcc 17
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 布赫纳氏菌属反向引物
<400> 98
ttccgtctgt attatctcct 20
<210> 99
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mpcactus正向
<400> 99
taatacgact cactataggg tacacccatt gtgtgcacct 40
<210> 100
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mpcactus反向
<400> 100
taatacgact cactataggg ccactgtcca aggcaatttt 40
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Buch_groES_18F
<400> 101
catgatcgtg tgcttgttaa g 21
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Buch_groES_98R
<400> 102
ctgttcctcg agtcgatttc c 21
<210> 103
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApEF1a 107F
<400> 103
ctgattgtgc cgtgcttatt g 21
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApEF1a 246R
<400> 104
tatggtggtt cagtagagtc c 21
<210> 105
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCR4 (来自BCR4-CPP)
<400> 105
cgtacaataa tctcatgg 18
<210> 106
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tat
<400> 106
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 107
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApBCR-4F
<400> 107
ctctgtcaac caccatgaga tta 23
<210> 108
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApBCR-4R
<400> 108
tgcagactac agcacaatac tt 22
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌动蛋白正向
<400> 109
gatcagcagc cacacacaag 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌动蛋白反向
<400> 110
tttgaaccgg tttacgacga 20
<210> 111
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApGLNT1正向
<400> 111
taatacgact cactataggg caattacaaa aggacggcag 40
<210> 112
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApGLNT1反向
<400> 112
taatacgact cactataggg ccgctctagg aacaccgtat 40
<210> 113
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ACYPI001018-正向
<400> 113
cctgaaatcg acggggtcc 19
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ACYPI001018-反向
<400> 114
agatcggcaa catctgttcg t 21
<210> 115
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小发夹
<400> 115
acacgt 6
<210> 116
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApGlnT1正义正向
<400> 116
ctacaaatct atctctccta ggcaattaca aaaggacggc ag 42
<210> 117
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApGlnT1正义反向
<400> 117
ttacaaactg ggaagaacct ggagacgtgc cgctctagga acaccgtat 49
<210> 118
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApGlnT1反义正向
<400> 118
ttacaaactg ggaagaacct ggaacacgtc ccgctctagg aacaccgtat 50
<210> 119
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApGlnT1反义反向
<400> 119
agaaactaga gcttgtcgat cgttaattaa caattacaaa aggacggcag 50
<210> 120
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApUbx正义正向
<400> 120
ctacaaatct atctctccta ggttttaccg tcacaggcat ca 42
<210> 121
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApUbx正义反向
<400> 121
acgagtgctg aagtccctag ccagacgtgt tcgtgctcgt taccaaatgt 50
<210> 122
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApUbx反义正向
<400> 122
acgagtgctg aagtccctag ccaacacgtc tcgtgctcgt taccaaatgt 50
<210> 123
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApUbx反义反向
<400> 123
agaaactaga gcttgtcgat cgttaattaa ttttaccgtc acaggcatca 50
<210> 124
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApbAs正义正向
<400> 124
ctacaaatct atctctccta ggggtgtcac catcgagacg tt 42
<210> 125
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApbAs正义反向
<400> 125
aaaaaccaca tacctcgagt ggggacgtgt catgactctg gcagttgaag tt 52
<210> 126
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApbAs反义正向
<400> 126
aaaaaccaca tacctcgagt gggacacgtc catgactctg gcagttgaag tt 52
<210> 127
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApbAs反义反向
<400> 127
agaaactaga gcttgtcgat cgttaattaa ggtgtcacca tcgagacgtt 50
<210> 128
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Apcactus正义正向
<400> 128
ctacaaatct atctctccta gggtcgtcgt cgtcgtcgta gt 42
<210> 129
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Apcactus正义反向
<400> 129
accaaaattg ccttggacag tgggacgtgt gcacgcacgg aaaacattta 50
<210> 130
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Apcactus反义正向
<400> 130
accaaaattg ccttggacag tggacacgtc gcacgcacgg aaaacattta 50
<210> 131
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Apcactus反义反向
<400> 131
agaaactaga gcttgtcgat cgttaattaa gtcgtcgtcg tcgtcgtagt 50
<210> 132
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MpGlnT1正义正向
<400> 132
ctacaaatct atctctccta ggttggaagg gattggtgtt gtaatgcc 48
<210> 133
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MpGlnT1正义反向
<400> 133
ttacaaactg ggaagaacct ggagacgtgt tccaggttct tcccagtttg taactagatc 60
g 61
<210> 134
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MpGlnT1反义正向
<400> 134
ttacaaactg ggaagaacct ggaacacgtc tccaggttct tcccagtttg taactagatc 60
g 61
<210> 135
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MpGlnT1反义反向
<400> 135
agaaactaga gcttgtcgat cgttaattaa ttggaaggga ttggtgttgt aatgcc 56
<210> 136
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MpUbx正义正向
<400> 136
ctacaaatct atctctccta ggtcgtgtgg agcaagtaca gcg 43
<210> 137
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MpUbx正义反向
<400> 137
acgagtgctg aagtccctag ccagacgtgt tggctaggga cttcagcact cg 52
<210> 138
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MpUbx反义正向
<400> 138
acgagtgctg aagtccctag ccaacacgtc tggctaggga cttcagcact cg 52
<210> 139
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MpUbx反义反向
<400> 139
agaaactaga gcttgtcgat cgttaattaa tcgtgtggag caagtacagc gg 52
<210> 140
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MpbAs正义正向
<400> 140
ctacaaatct atctctccta gggaggaact ccaactgcca gagtcatg 48
<210> 141
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MpbAs正义反向
<400> 141
aaaaaccaca tacctcgagt ggggacgtgt cccactcgag gtatgtggtt tttcctatg 59
<210> 142
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MpbAs反义正向
<400> 142
aaaaaccaca tacctcgagt gggacacgtc cccactcgag gtatgtggtt tttcc 55
<210> 143
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MpbAs反义反向
<400> 143
agaaactaga gcttgtcgat cgttaattaa gaggaactcc aactgccaga gtcatg 56
<210> 144
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mpcactus正义正向
<400> 144
ctacaaatct atctctccta ggtacaccca ttgtgtgcac ctgagtac 48
<210> 145
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mpcactus正义反向
<400> 145
accaaaattg ccttggacag tgggacgtgt ccactgtcca aggcaatttt ggttg 55
<210> 146
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mpcactus反义正向
<400> 146
accaaaattg ccttggacag tggacacgtc ccactgtcca aggcaatttt ggttg 55
<210> 147
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mpcactus反义反向
<400> 147
agaaactaga gcttgtcgat cgttaattaa tacacccatt gtgtgcacct gagtac 56
<210> 148
<211> 172
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C002
<400> 148
ctgaaccgta cgatgagcag gaagaagcgt ctgtcgaatt accgatggag caccgtcagt 60
gcgatgaata caaatcgaag atctgggaca aagcatttag caaccaggag gctatgcagc 120
tgatggaact aacgtttaat acaggtaagg aattaggctc ccacgaagtg tg 172
<210> 149
<211> 266
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApGLNT1
<400> 149
caattacaaa aggacggcag cgatacaact ctcatacaga cagaacagca atattagcgt 60
tgtcaattac agctattagt gtccagtaaa attgttttta aacaaaaaaa cgacaataaa 120
tattttgtac tgattaacta gggtgcaaca gtgaattttg aaaaaaatat aaaaacaaaa 180
tcatggattt tagatattag tcttttatct ttggtcatca gtttttgagt attatattat 240
tatattatac ggtgttccta gagcgg 266
<210> 150
<211> 191
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶
<400> 150
attgcaccga gcagaagact acctataccc ataataatat tacaaggaag aaacctgagg 60
actgtactta gacgtgttat atcataagac ctaataacgt acatgctcga aaatgcattc 120
aactgcatta attactgcag tatgtttagt catttgttcg tgtcttcttc cgaccatcaa 180
tgccaagaaa a 191
<210> 151
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApGLNT1 (来自ApGLNT1-CPP)
<400> 151
tgatgcgaca tagc 14
<210> 152
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApC002 (来自ApC002-CPP)
<400> 152
taacttccca tgttg 15
<210> 153
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCR-4 (来自BCR-4-CPP)
<400> 153
tacaataatc tcatgg 16

Claims (21)

1.一种用于降低昆虫的适合度的方法，该方法包括向该昆虫递送有效量的包含dsRNA的多核苷酸，相对于没有被给予该dsRNA的昆虫，该dsRNA降低了该昆虫中昆虫含菌细胞调节基因或昆虫免疫调节基因的表达。
2.如权利要求1所述的方法，其中该基因编码选自下组的蛋白，该组由以下组成：来自含菌细胞特异性的富含半胱氨酸蛋白BCR家族的蛋白、来自分泌蛋白SP家族的蛋白、BicD(双尾蛋白D)、Cact(cactus)、DIF(Dorsal相关免疫因子)、Toll(Toll相互作用蛋白)、和imd(免疫缺陷蛋白)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该基因编码与表5、表8或表9中列出的蛋白具有至少90％氨基酸序列同一性、至少95％氨基酸序列同一性、或100％氨基酸序列同一性的蛋白。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该dsRNA与该昆虫中该基因的10至30个核苷酸互补。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该方法对于抑制该基因在该昆虫中的表达是有效的。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中相对于没有被递送该药剂的昆虫，该方法对于降低寄宿于该昆虫中的一种或多种微生物的水平、多样性或代谢是有效的。
7.如权利要求6所述的方法，其中该一种或多种微生物是布赫纳氏菌属物种。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中相对于没有被递送该药剂的昆虫，该方法对于降低该昆虫的适合度是有效的。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中将该多核苷酸以配制用于递送至昆虫的组合物递送。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该递送包括递送该多核苷酸至昆虫有害生物生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个生境。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中该递送包括将该多核苷酸喷洒在农作物上。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中将该多核苷酸作为昆虫可食用组合物递送，从而被该昆虫摄取。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中将该多核苷酸与农业上可接受的载体一起配制为液体、固体、气溶胶、膏剂、凝胶、或气体组合物。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中该昆虫是蚜虫。
15.一种被配制用于递送至昆虫的组合物，该组合物包含含有dsRNA的多核苷酸，其中该dsRNA与昆虫含菌细胞调节基因或昆虫免疫调节基因的15至30个核苷酸互补。
16.如权利要求15所述的组合物，其中该基因编码选自下组的蛋白，该组由以下组成：来自含菌细胞特异性的富含半胱氨酸蛋白BCR家族的蛋白、来自分泌蛋白SP家族的蛋白、BicD(双尾蛋白D)、Cact(cactus)、DIF(Dorsal相关免疫因子)、Toll(Toll相互作用蛋白)、和imd(免疫缺陷蛋白)。
17.如权利要求15或16所述的组合物，其中该基因编码与表5、表8或表9中列出的蛋白具有至少90％氨基酸序列同一性、95％氨基酸序列同一性、或100％氨基酸序列同一性的蛋白。
18.一种植物，该植物包含如权利要求15-17中任一项所述的组合物的局部施用。
19.一种在其基因组中具有重组DNA构建体的转基因植物细胞，其中该重组DNA构建体包含可操作地连接至编码RNA的DNA的异源启动子，该RNA包含至少一个双链RNA区域，该双链RNA区域的至少一条链包含与昆虫含菌细胞调节基因或昆虫免疫调节基因的15至30个核苷酸互补的核苷酸序列。
20.如权利要求19所述的转基因植物，其中该基因编码选自下组的蛋白，该组由以下组成：来自含菌细胞特异性的富含半胱氨酸蛋白BCR家族的蛋白、来自分泌蛋白SP家族的蛋白、BicD(双尾蛋白D)、Cact(cactus)、DIF(Dorsal相关免疫因子)、Toll(Toll相互作用蛋白)、和imd(免疫缺陷蛋白)。
21.如权利要求19或20所述的转基因植物，其中该基因编码与表5、表8或表9中列出的蛋白具有至少90％氨基酸序列同一性、95％氨基酸序列同一性、或100％氨基酸序列同一性的蛋白。
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