CN111139300B - 一组结肠癌预后相关基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明基于人结肠癌中一组15个预后相关基因谱的发现和其在临床肿瘤样本中表达水平的检测，根据这些特定基因的预后相关系数计算患者的预后评分，来评估结肠癌患者的临床预后及其相关应用。此系统的预后预测能力要两倍于目前唯一在美国临床应用中的Oncotype DX(Genomic Health公司)的评分系统。根据此系统和不同的检测技术平台，设计开发相应的15基因表达测量试剂盒。此系统和产品可辅助评估结肠癌患者对治疗干预的反应，从而判断患者是否从化学或靶向治疗中获益，用于基于个体化风险的精准治疗。

Description

一组结肠癌预后相关基因的应用

技术领域

本发明属于肿瘤基因检测技术领域，具体涉及一组人结肠癌相关预后基因及其在临床精准医学中的应用。

背景技术

结肠癌(Colon cancer)为消化道常见恶性肿瘤之一，在美国结肠癌居肿瘤发病率的第三位，每年新发140,000例，并有60,000人死亡。在中国，随着人民生活饮食习惯的改变，近二十年来发病率呈上升趋势，趋向老龄化。发病率与死亡率的中国地理分布特征为：沿海东部地区比内陆西北地区高发，最高发的是经济发达地区的长江中下游。目前结肠癌发病率仅次于肺癌而排在恶性肿瘤的第二位，其中男性占第五位，女性第六。结肠癌的发病与很多因素有关，包括年龄、饮食习惯、种族、遗传及结肠炎症和腺瘤等，后者如慢性溃疡性结肠炎、家族性结肠腺瘤病。

结肠癌主要影响大肠，包括结肠和直肠。最常见的为散发性(非遗传性)结直肠癌。遗传性结直肠癌指的是相关肿瘤基因在家族世代交替中得以保留下来，其患者的子女患癌的危险性比一般人高2-4倍。

结直肠癌共分为四期，病理类型以腺癌为主，占90％以上。Ⅰ期患者的临床治愈率约为80％，II-Ⅲ期治愈率为60％，而IV治愈率约 20％。因此早期诊断和早期治疗是关键。目前结肠癌的治疗原则是以手术为主，手术后根据病理分期来决定是否进行其他辅助治疗。对中晚期的患者，术后可以选择化疗、放疗、免疫治疗和中医中药等。随着辅助化放疗的发展,结直肠癌的治疗效果得到改善，但局部复发和远处转移仍是治疗失败的主要原因，据报道II期和III期结直肠癌根治切除后的局部复发率高达20％～40％。

结肠癌患者，尤其是转移性结直肠癌的总生存期(OS)在过去20 年中一直在改善，现平均已达到30个月以上。这种增加是由几个因素驱动的，包括改善一线治疗以及增加其它的可用选择。转移性结直肠癌患者的一线和二线治疗选择包括双重或三联化疗(氟嘧啶5-FU，奥沙利铂和伊立替康为基础的化疗)加上靶向药，如抗血管生成药物 (抗VEGF)，如果是RAS野生型(WT)患者，则是抗表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂。而在结直肠癌三线和后期线，新型多激酶抑制剂如瑞戈菲尼(regorafenib)可应用。它显示能显著延长处于进展期的转移性结直肠癌亚洲患者的总生存期。此药在美国、欧洲、日本等已被批准用于治疗结直肠癌。

结肠癌和其他肿瘤一样，是多因素起因、多步骤发展的。即使是同一类型的结肠癌，不同个体间在分子水平上也存在着高度的异质性。不同的结肠癌患者，即使其病理类型、分期分级乃至所接受的治疗均相同，其生存期仍然会呈现很大的差异。肿瘤的这种异质性 (heterogeneity)，存在于相同类型肿瘤不同患者间和个体肿瘤内细胞之间。不同的遗传背景、内在因素和环境因素构成了患者间的肿瘤异质性。伴随着高通量技术和单细胞测序技术的广泛推广应用，肿瘤异质性已然是目前肿瘤领域的一个研究热点。

精准医疗的目标是通过对结肠癌患者进行准确分层，从而提供最有效的治疗方案。结肠癌的管理/治疗仍然极具挑战性，尽管使用了基于TNM分期系统的多模式治疗方法，但对患者结局的预测却是十分困难。与病因学研究相比，结肠癌的预后和预测性研究仍处于起步阶段，而将重点放在全基因组关联(GWAS)、血液和肿瘤组织的收集，增强对遗传预后和预测标志物的研发是发展的方向。

目前已经成功应用于临床并已经商业化的预后标志物为两种乳腺癌肿瘤基因标志物产品，不仅可以根据相关分子(ER、HER2等)的不同表达情况进行分型并对不同类型的乳腺癌患者有针对性的实行手术和辅助治疗，还可以通过Oncotype DX 21-基因(美国Genomic Health公司)和MammaPrint 70-基因(挪威Agendia公司)的方法检测多基因表达对淋巴结阴性的乳腺癌的复发和转移等预后情况进行评估以及指导治疗。目前这两项检测均获美国FDA批准上市，其中Oncotyte DX 21-基因已于2015年正式成为NCCN推荐的乳腺癌基因检测方案。Genomic Health也开发了Oncotype DX 7-基因结肠癌多基因测试可预测II期和III期A/B期结肠癌患者的复发风险，医生和患者可以就手术后是否需要化疗(II期)或手术后是否应在治疗方案中加入oxalipapin(III期)做出更明智的决定。

届于目前国内尚没有针对结肠癌预后的基因检测和评分系统可以用于指导治疗方案的选择，此发明基于迄今为止全面且无偏见的结肠癌全基因组数据，采用了一种多步骤生物信息学策略，开发了一组和 7-基因完全不同的15预后相关基因谱。多变量Cox回归分析显示它对总生存率(OS)的判别能力明显优于目前唯一在美国临床应用中的7基因评分系统(见上述)。

发明内容

本发明的目的在于根据一组特定基因表达水平的检测对结肠癌患者进行生存率的预测和治疗方案的评估。

本发明中的样本为结肠癌患者的肿瘤组织，由肿瘤组织样本分离出mRNA，测定15个结肠癌预后相关基因的表达水平，然后通过计算预后评分来预测病人的临床结果。上述15个结肠癌相关基因为 ACOT11,ATAD2,C10ORF99,CD177,IMPA2,KIF13B,MAL,NAT2,OSBPL3, PLA2G16,SCG2,SPP1,TMPRSS2,TTC22和WDR78。对照基因包括 GAPDH，ACTB，GUSB和TFRC。关于这些基因已知的功能和在预后中的可能作用见表一。

为了实现上述目的，本发明提供一组15个结肠癌相关基因在制备用于结肠癌预后预测试剂中的应用。

在实施方案中，本发明提供针对权利要求1的15个结肠癌相关基因在制备用于结肠癌预后预测试剂中的应用所设计的一组基因探针或引物，该基因探针能够通过分子杂交与目标基因结合产生杂交信号，该引物能够通过基于PCR的技术对目标基因进行扩增。

在另一实施方案中，本发明提供一种结肠癌预后预测诊断用组合物，其包括上述基因探针或引物。

在另一实施方案中，本发明提供一种结肠癌预后预测诊断试剂盒，其包括上述组合物。

在一些实施方案中，上述15个结肠癌相关基因的表达可通过定量PCR(RT-qPCR)，基因芯片，二代高通量测序，Panomics或Nanostring技术来检测。

在一些实施方案中，可通过定量PCR，基因芯片，二代高通量测序，Panomics或Nanostring技术来检测上述15个相关基因在结肠癌组织中的mRNA表达水平。

本说明书中使用的术语“基因探针”和“引物”表示寡核苷酸，优选为单链的脱氧核糖核苷酸，包括天然(naturally occurring)dNMP(dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)、变形核苷酸或非天然核苷酸，此外，还可以包含核糖核苷酸。

本发明中利用的基因探针和引物包含与靶核酸的目标位置互补的杂交核苷酸序列。术语“互补”的含义是指，在杂交条件下引物或探针与靶核酸序列选择性地进行杂交的充分互补，具有将实质上互补 (substantially complementary)和完全互补(perfectlycomplementary) 全部包括在内的含义，优选地为完全互补。本说明书中使用的术语“实质上互补的序列”不仅包括完全一致的序列，也包括能够在特定靶序列上发挥引物作用且与作为比较对象的序列有部分不一致的序列。

基因探针和引物的序列不需要具有与模板的一部分序列完全互补的序列，只要在能够与模板杂交从而发挥其固有作用的范围内具有充分的互补性即可。因此，本发明中的基因探针和引物不需要具有与作为模板的上述核苷酸序列完全互补的序列，只要在能够与模板杂交从而发挥其固有作用的范围内具有充分的互补性即可。引物和基因探针的设计为本领域技术人员所掌握的技能，例如可以利用引物设计用程序(例如：PRIMER 3程序)。

本发明中mRNA表达水平的测定可以利用本领域公知的方法进行，包括但不限于定量PCR、基因芯片、二代高通量测序、Panomics或Nanostring技术。

本发明提供一种含有本发明的引物对结肠癌的预后预测诊断试剂盒。本发明的试剂盒中，除了针对上述15-基因标记物的引物或基因探针之外，还可以追加含有用于PCR反应、试样的RNA分离和cDNA的合成等本领域公知的工具和/或试剂。本发明的试剂盒可以根据需要追加含有用于各成分的混合的管、微孔板和记载使用方法的指示资料等。

有益效果

本发明通过使用六个多组学数据库成功寻找到预测结肠癌患者总生存期的一组15个特定的生物标记物基因，并首次建立了基于这组基因表达水平的预后评分系统。通过TCGA RNA-seq数据，我们也证实了该系统的预测分值能够准确区分结肠癌患者不同的临床预后。多变量Cox回归分析显示它对总生存率(OS)的判别能力非常显著优于目前在美国临床应用的Oncotype DX 7-基因评分系统(见上述)。此发明可用于辅助预测结肠癌患者对治疗干预的反应，判断患者是否从化疗和靶向治疗中获益，进行治疗选择，避免过度医疗，达成个体化医疗的目的。

附图说明

图1：本发明应用的6个GEO数据集，合计533例样本。

图2：结肠癌基因标签中的代表基因的Kaplan-Meier生存曲线举例。p值通过对比两组之间差别检定(log-rank test)而得到。

图3：A.在筛选中出现10次，11次，12次，13次，15次频率的基因组合。B.基因组合次数基因组合和HR值比较。12次基因组合的HR值最高，因此构成本发明的15-预后基因谱。

图4：15-基因组合的Kaplan-Meier生存曲线。

图5：100次测试集中的危险比(HR)和其95％的HR置信区间。

图6：本发明对结肠癌患者预后的评估效能两倍优于Oncotype DX的7-基因预后标签。

具体实施方式

本发明通过搜索国际通用GEO肿瘤数据库，筛选出6个合适的微阵列表达数据,然后采用了多步骤的生物信息学方法来进行分析。首先确认了970个在正常结肠组织和结肠癌组织中表达有显著差异的基因，通过生存分析，筛选出80个基因与总生存期(OverallSurvival， OS)有显著相关性。利用TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中的病人临床信息和相关基因的表达情况，采用典则判别分析法确定了一组15个结肠癌预后相关的基因标志物，在此基础上建立预后评分系统并验证其评估价值和准确性。通过此TCGA RNA-seq数据，我们也进一步验证了15个基因的预后意义。另外，研究显示我们基于差异表达和预后评价的15-基因的预测效果非常显著优于已经在美国应用中的Oncotype DX(GenomicHealth)7-gene结直肠肿瘤的预后评分系统。

具体而言，本发明从GEO数据库中选取包含肿瘤与非肿瘤结直肠标本的6个国际肿瘤数据集(GSE21510，GSE20916，GSE41328， GSE37364，GSE32323，GSE9348)，合计533例样本(图1)。比较正常结肠组织和结肠癌组织之间的基因表达情况并确定每个数据集中显著差异表达的基因，获取了970个差异表达基因(fold change(FC) ≥1.5，校正后p值<0.05)。

通过生存预后在线工具Kaplan-Meier曲线软件SurvExpress (http://bioinformatica.mty.itesm.mx:8080/Biomatec/SurvivaX.jsp)，我们进一步评估了上述970个基因的差异表达对结直肠癌预后的影响。首先将上述970个基因分别根据其表达水平分为两组(高或低表达)，使用Cox回归分析、Kaplan-Meier生存曲线和对数秩检验来评价这些基因的高表达水平或低表达水平对总生存期(OS)的影响。发现970 个基因中有80个基因的表达水平与结肠癌患者的总生存期之间存在显著关联(adjusted p-value≤0.05)(表二)。图2显示了四个代表性基因表达水平对病人预后生存的影响。结肠癌预后相关基因标记物将从这80个基因中筛选而来。最后，根据以上单因素分析产生的对数秩检验的p值对这些基因进行排序(见表二)。

下一步为筛选结直肠癌预后的差异表达基因，下载TCGA数据库中有生存信息的373例患者的表达和生存数据。筛选通过内部交叉验证的方法，首先随机抽取373例病人中的2/3(n＝248)作为测试集，剩下1/3(n＝125)作为训练集，重复100次上述抽样以获得100对训练集和测试集。在所有的训练集中对80个差异表达基因进行Cox regression分析，让模型自动纳入80个基因中对生存预后有显著影响的基因。最后统计所有训练集中的基因出现频率。图3是在筛选中出现10次，11次，12次，13次，15次频率的基因组合和以此为判别依据建立的分组对测试，发现出现12次组合的15个基因达到了最大的HR值(图4)，因此构成本发明的15-预后基因谱。

基于上述结果，我们开发了一结肠癌预后评分系统。我们应用逐步的典则判别分析(canonical discriminant analysis)来识别能够以100％的准确性鉴别病人预后的基因标记物，最后确定了一组由15个特定的结肠癌预后基因构成的评分系统，获得了100％的预后预测准确率。这些基因包括：ACOT11,ATAD2,C10ORF99,CD177,IMPA2,KIF13B,MAL,NAT2,OSBPL3,PLA2G16,SCG2,SPP1,TMPRSS2,TTC22和WDR78。各基因为本领域公知的各基因的序列、或各基因的同义词(synonym)的序列，优选为来源于人的各基因的序列，更优选ACOT11为Genbank登记号NM_015547所记载的序列、ATAD2为Genbank登记号 NM_014109所记载的序列、C10ORF99为Genbank登记号NM_207373 所记载的序列、CD177为Genbank登记号NM_020406所记载的序列、 IMPA2为Genbank登记号NM_014214所记载的序列、KIF13B为Genbank登记号NM_015254所记载的序列、MAL为Genbank登记号 NM_002371所记载的序列、NAT2为Genbank登记号NM_000015所记载的序列、OSBPL3为Genbank登记号NM_145320所记载的序列、 PLA2G16为Genbank登记号NM_007069所记载的序列、SCG2为Genbank登记号NM_003469所记载的序列、SPP1为Genbank登记号 NM_000582所记载的序列、TMPRSS2为Genbank登记号NM_005656 所记载的序列、TTC22为Genbank登记号NM_017904所记载的序列、 WDR78为Genbank登记号NM_024763所记载的序列。各基因的同义词及其序列可以通过Genbank或Swissprot进行检索。

上述结肠癌预后评分系统用预测分值来计算患者的生存概率。评分系统被定义为通过Cox风险函数系数为基础的基因表达水平的线性组合。计算公式如下：

注：见表三Cox风险函数系数

每个患者的预后评分可以用来评估其总生存期和死亡风险。对训练组的患者根据其预后评分进行排序，并根据其得分将患者分为三组数量相同的队列，记录相应的截点所对应的预后评分，取各截点评分的平均值作为真实截点得分，根据这两个截点得分将测试组患者分为(预后)“好”、“中”、“差”三组。对100个测试集的三组患者进行 Kaplan-Meier分析和Log-Rank检验，将“中”和“差”组分别与“好”组比较，计算危险比(hazard ratios,HR)，确定三组患者总生存期(overall survival，OS)的差异(图4为四个代表测试集的Kaplan-Meier生存曲线)。在99％的测试集中，“差”组患者的总生存期显著低于“好”组患者(95％置信区间的低值＞1)。这些结果有力地验证了这个15-基因标记物以及预后评分系统对不同预后患者的区分能力，可以很好地将预后良好或较差的患者进行区分。

本发明中，样本为结肠癌患者的肿瘤组织，包括但不限于新鲜活检组织、术后组织、固定后的组织和石蜡包埋的组织。本发明的结肠癌预后预测诊断标签物可通过不同检测技术平台进行检测，包括但不限于定量PCR、基因芯片、二代高通量测序、Panomics和Nanostring技术，并针对不同的技术平台，设计了相应的基因引物(定量PCR) 和探针(基因芯片、二代高通量测序、Panomics和Nanostring技术)。优选方案为目标基因的表达量检测，更优选为目标基因的表达量定量检测。为了检测表达量，需要从试样组织内分离RNA，可以利用本领域公知的分离试样中RNA的方法。我们定义的预测分值计算方法如上，但预测分值的绝对值和分数划界可依不同的技术平台而不同，需要分别确定。

另一方面，本发明提供一种结肠癌预后预测诊断用组合物，其含有基因探针或引物作为有效成分，该基因探针或引物是针对上述 15-基因标记物。

另一方面，本发明提供一种结肠癌预后预测诊断试剂盒，其包括上述组合物。

下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

和现有临床应用基因标志物比较：

如前所述，目前国外市面上已有Oncotype DX 7-基因组评判结肠癌的预后。我们将15个基因评分系统与此系统进行了比较。我们对其7个基因在之前的100个训练集中使用多元Cox回归分析方法进行分析，用同样的方法分别计算每个基因相应的系数并取平均值，用同样的公式计算TCGA 373例结肠癌患者的预后评分。对训练组的患者根据其预后评分进行排序，并根据评分将患者分为三组数量相同的队列，记录相应的截点所对应的预后评分，取各截点对应评分的平均值作为真实截点评分，根据这两个截点评分将测试组患者分为(预后) “好”、“中”、“差”三组。对所有测试集的三组患者的进行Kaplan-Meier 分析和Log-Rank检验，将“中”和“差”组分别与“好”组比较，计算危险比(hazard ratio,HR)，确定三组患者总生存期(overall survival，OS) 的差异。就“差”组和“好”组对比而言，我们的15-基因标记物的中位 (median)HR高出7-基因中位HR达两倍(见图6)。这些结果表明本发明的15-基因标记物对不同预后(总生存期)结肠癌患者的区分的能力非常显著优于7个基因谱。我们是首先对照肿瘤组织和正常组织基因表达的差异筛选出肿瘤相关基因，而其他研究则是仅仅基于肿瘤组织中基因表达的情况。

实施例2

预测临床结肠癌患者的预后效果：

采集临床接收的结肠癌患者的肿瘤组织并提取RNA，肿瘤组织可包括新鲜活检组织，术后组织，固定后的组织和石蜡包埋的组织。然后用本发明开发的试剂盒与相应的仪器定量检测预后评分系统15个基因的表达水平。将15基因的表达水平输入本发明建立的预后评分公式：

在计算出患者的预测分值后，医生根据分数值来预测患者的预后情况，比如5年生存率。目前我们通过回顾性研究建立了模型，成功地在不同数据库进行了验证(表三)。通过计算数据库内所有患者的预后评分，并根据患者的评分对患者进行排名。使用Kaplan-Meier 分析在“好”和“差”预后的患者群组之间的显着差异。我们发现，具有高预后评分的患者的OS显着短于评分低的患者(p<0.05)(图5)。证实15基因预后评分系统可重复预测结肠癌患者的总体生存率。我们也开始实施前瞻性研究来进一步完善评分系统。

实施例3

预测临床结肠癌患者对化疗药物5-氟尿嘧啶的反应：未经治疗的转移结肠癌病人的生存期大约为6个月。5-氟尿嘧啶(5-Fu)仍然是结肠癌化疗的核心药物。目前结肠癌化疗复发率高，有效率低，为减少无效或过度用药，降低医疗成本，本发明通过以下方案实施来预测临床结肠癌患者对化疗药物5-FU的反应：对临床接收的结肠癌患者采集肿瘤组织并提取RNA，肿瘤组织可包括新鲜活检组织，术后组织，固定后的组织和石蜡包埋的组织。然后用本发明开发的试剂盒与相应的仪器定量检测预后评分系统15基因的表达水平。将15基因的表达水平输入本发明建立的预后评分公式：

在计算出患者的预测分值后，医生根据分数值来考虑患者是否应接受5-FU化疗。对预测分值标示好预后的患者，可以建议医生酌情考虑5-FU治疗的必要性，对预测分值标示差预后的患者，可以建议医生酌情增大5-FU或其联合应用药物的治疗强度。

实施例4

预测临床结肠癌患者对血管内皮生长因子和表皮生长因子受体等靶向治疗的反应；

针对结肠癌的靶向治疗能明显延长患者的生存期，与传统化疗药物联用提高了疗效。VEGF家族中的VEGF-A已经成为肿瘤靶向治疗的靶点，是一种强烈的血管形成因子。VEGF-A在40％-60％的结肠癌患者中存在过表达，为靶向VEGF-A治疗提供了基础。同样的，EGFR在 60％-80％的结肠癌患者中高表达，而且这种表达与患者的预后有关。

为减少无效或过度应用靶向药，降低医疗成本，本发明通过如下实施来预测临床结肠癌患者对上述靶向治疗药的反应；对临床接收的结肠癌患者采集肿瘤组织并提取RNA，肿瘤组织可包括新鲜活检组织，术后组织，固定后的组织和石蜡包埋的组织。然后用本发明开发的试剂盒与相应的仪器定量检测预后评分系统15基因的表达水平。将15 基因的表达水平输入本发明建立的预后评分公式：

在计算出患者的预测分值后，医生根据分数值来考虑患者是否应接受相应的靶向治疗。对预测分值标示好预后的患者，可以建议医生酌情考虑靶向治疗的必要性，达到避免过度用药，降低医疗成本，达到个体化医疗的目的。

表一、十五基因的编码蛋白和功能

表二、K-M绘图分析结果总结

差异表达基因对结肠癌患者总生存期的影响(如果基因具有多个Affymetrix探针，结果最显著的被列在此表中)

表三、典型判别函数系数

Claims (8)

1.一组15个人结肠癌相关基因在制备用于结肠癌预后预测试剂中的应用，其特征在于，所述15个人结肠癌相关基因为ACOT11,ATAD2,C10ORF99,CD177,IMPA2,KIF13B,MAL,NAT2,OSBPL3,PLA2G16,SCG2,SPP1,TMPRSS2,TTC22和WDR78。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述15个人结肠癌相关基因可通过定量PCR，基因芯片，二代高通量测序，Panomics或Nanostring技术来检测。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，可通过定量PCR，基因芯片，二代高通量测序，Panomics或Nanostring技术来检测所述15个相关基因在结肠癌中的mRNA表达水平。

4.针对权利要求1的15个人结肠癌相关基因在制备用于结肠癌预后预测试剂中的应用所设计的一组基因探针或引物，所述基因探针能够通过分子杂交与所述相关基因结合产生杂交信号，所述引物能够通过基于PCR的技术对所述相关基因进行扩增。

5.根据权利要求4所述的一组基因探针或引物，其特征在于，所述一组基因探针或引物可通过定量PCR，基因芯片，二代高通量测序，Panomics或Nanostring技术来检测所述15人个结肠癌相关基因。

6.根据权利要求5所述的一组基因探针或引物，其特征在于，所述一组基因探针或引物可通过定量PCR，基因芯片，二代高通量测序，Panomics或Nanostring技术来检测所述15个相关基因在结肠癌中的mRNA表达水平。

7.一种用于人结肠癌预后预测诊断的组合物，其特征在于，其包括权利要求4所述的基因探针或引物。

8.一种用于人结肠癌预后预测诊断的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求7所述的组合物。

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