CN111139285A - 一种高通量检测多个待测样本中不同目的蛋白含量的方法及其专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高通量检测多个待测样本中不同目的蛋白含量的方法及其专用试剂盒。本发明的发明人结合PEA和DNA测序技术可实现对多样本多蛋白含量的同时检测，具体方法为：针对不同种类的抗体标记不同序列的ss‑DNA(蛋白条码)，由ss‑DNA序列的不同来区分蛋白种类；借助PEA技术将蛋白信息转化为DNA信息；建库时针对不同的样本再加上一段不同的Barcode标记序列(样本条码)，用于区分不同样本；测序仪分别检测出样本条码序列、蛋白条码序列以及蛋白条码序列的数目，由此便实现了多个样本多种蛋白含量的同时检测。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种高通量检测多个待测样本中不同目的蛋白含量的方法及 其专用试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高通量检测多个待测样本中不同目的蛋白含量的方法及其专用试剂盒。

背景技术

对于多蛋白微量检测的方法主要有路明克斯(Luminex)技术、伯乐悬浮芯片(biorad bio-plex)技术和蛋白芯片技术。

Luminex技术综合了微球和流式细胞仪，利用带有颜色编码的微球共价交联单克隆抗体，与被测定的目标分子结合后加入荧光素标记的检测抗体，再通过激光扫描荧光编码来识别单个微球和检测荧光强度来确定被测分子的浓度。由于不同颜色编码的微球可以用来检测不同的蛋白，这样在一次实验中可以同时完成多个目标分子的分析。但检测仪器昂贵，检测试剂中需用到生物修饰的荧光微球，同时检测样本量为10-20μL，反应抗体耗量多，导致最终检测成本过高。

biorad bio-plex技术综合了微球和悬浮芯片技术：在液相芯片中，把针对不同检测物的不同颜色微球(微球上有针对不同检测物的蛋白质)混合，然后加入被检测物，在悬液中微球与被检测物特异性结合，并加上荧光标记，从而在同一反应体系中可以同时对同一份标本的多个指标进行检测。该方法可检测同一样本中的多种蛋白，却不能对多份含有多个指标的标本进行同时检测。此外，由于借鉴了Luminex的微球技术，同样会造成试剂成本高的问题。

蛋白芯片技术是将已知的多种的蛋白分子同时固定在不同种类的固相载体上，制成的高密度蛋白微阵列。通常先把待测蛋白质分子与芯片进行一段时间的孵育反应，再加入标记好的蛋白分子，使之与芯片-蛋白分子复合物进行反应。由于每个分子的位置及序列为己知的，通过生物芯片扫描仪检测蛋白的浓度或存在情况便可以知道各种蛋白分子的分布情况。这种方法的优点是可作为一种定量检测方法，并且保证了蛋白质的高级结构可以被检测到；缺点是有时很难找到一对能连接在相同分子上并且匹配的蛋白分子，此外使用该方法难以制备高密度的微阵列，要实现高通量的检测具有很大的挑战性。

邻位延伸分析技术(Proximity Extension Assay，PEA)是在一对抗体上分别修饰上单链DNA(ss-DNA)，当待检测的蛋白分子与抗体发生特异性反应后，拉近了抗体对上ss-DNA的距离，继而产生可扩增的检测信号，从而将蛋白质的检测转变成对DNA的检测，实现了微量蛋白的分析。同时对多种不同序列的DNA进行定量的方法一般采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，QPCR)。

发明内容

本发明的目的是同时检测多个待测样本中不同目的蛋白含量。

本发明首先保护一种检测待测样本中不同目的蛋白含量的试剂盒，可包括若干个用于检测不同目的蛋白的试剂、建库PCR上游引物、建库PCR下游引物、测序引物甲和测序引物乙；

每个用于检测目的蛋白的试剂可包括单链DNA分子甲、目的蛋白抗体甲、单链DNA分子乙和目的蛋白抗体乙；

所述单链DNA分子甲从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3；所述单链DNA分子乙从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段4、DNA片段5和DNA片段6；所述DNA片段3和所述DNA片段6反向互补；每个用于检测目的蛋白的试剂中，所述DNA片段2和所述DNA片段5的核苷酸序列均不同，用于检测不同的目的蛋白；

所述建库PCR上游引物从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段a和DNA片段b；所述DNA片段b和所述DNA片段1完全一致；

所述建库PCR下游引物从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段c和DNA片段d；所述DNA片段d和所述DNA片段4的5’末端完全一致；

所述测序引物甲从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段X和DNA片段Y；所述DNA片段X与所述DNA片段c反向互补，所述DNA片段Y与所述DNA片段a完全一致；

所述测序引物乙与所述DNA片段4序列反向互补。

上述试剂盒中，所述单链DNA分子甲从5’末端到3’末端具体可由DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3组成。所述单链DNA分子乙从5’末端到3’末端具体可由DNA片段4、DNA片段5和DNA片段6组成。

上述试剂盒中，所述建库PCR上游引物从5’末端到3’末端具体可由所述DNA片段a(测序接头序列甲)和所述DNA片段b组成。在本发明的实施例中，采用BGI500平台测序进行测序。相应的，测序接头序列甲的核苷酸序列(从5’至3’)可为GAACGACATGGCTACGATCCGACTT。建库PCR上游引物中，添加测序接头序列甲的目的是为了便于进行测序，用于检测单链DNA分子甲和单链DNA分子乙的延伸产物，获得蛋白条码(目的为区分不同蛋白)的信息。根据测序平台的不同，也可以替换成由其它核苷酸序列组成的测序接头序列。

上述试剂盒中，所述建库PCR下游引物从5’末端到3’末端具体可由所述DNA片段c(测序接头序列乙)和所述DNA片段d组成。在本发明的实施例中，采用BGI500平台测序进行测序。相应的，测序接头序列乙的核苷酸序列(从5’至3’)可为TGTGAGCCAAGGAGTTG。根据测序平台的不同，也可以替换成由其它核苷酸序列组成的测序接头序列。

上述试剂盒中，所述测序引物甲从5’末端到3’末端具体可由所述DNA片段X和所述DNA片段Y组成。

上述试剂盒中，所述目的蛋白抗体甲和所述目的蛋白抗体乙可以一个为目的蛋白捕获抗体，一个为目的蛋白检测抗体。

上述试剂盒中，所述用于检测不同目的蛋白的试剂之间没有交叉反应。

上述任一所述试剂盒具体可由若干个用于检测不同目的蛋白的试剂、建库PCR上游引物、建库PCR下游引物、测序引物甲和测序引物乙组成。每个用于检测目的蛋白的试剂具体可由所述单链DNA分子甲、所述目的蛋白抗体甲、所述单链DNA分子乙和所述目的蛋白抗体乙组成。

所述DNA片段1和所述DNA片段4均可为20-35个(如20-23个、23-32个、32-35个、20个、23个、32个或35个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述DNA片段2和所述DNA片段5均可为5-9个(如5-7个、7-9个、5个、7个或9个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述DNA片段3和所述DNA片段6均可为5-11个(如5-9个、9-11个、5个、9个或11个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述DNA片段a可为15-30个(如15-25个、25-30个、15个、25个或30个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述DNA片段c可为15-30个(如15-17个、17-30个、15个、17个或30个)核苷酸组成的单链DNA分子。

上文中，所述DNA片段d和所述DNA片段4的5’末端完全一致具体可为所述DNA片段d和所述DNA片段4的5’末端的20-35个(如20-23个、23-32个、32-35个、20个、23个、32个或35个)核苷酸完全一致，具体可为21个核苷酸完全一致。

所述单链DNA分子甲可为30-50个(如30-39个、39-50个、30个、30个或50个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述单链DNA分子乙可为30-50个(如30-39个、39-50个、30个、30个或50个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述建库PCR上游引物可为45-50个(如45-48个、48-50个、45个、48个或50个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述建库PCR下游引物可为45-50个(如45-48个、48-50个、45个、48个或50个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述测序引物甲可为40-50个(如40-42个、42-50个、40个、42个或50个)核苷酸组成的单链DNA分子。

所述单链DNA分子甲和所述单链DNA分子乙的5’末端可进行叠氮或氨基修饰。

所述建库PCR下游引物还可包括Barcode标记序列；所述Barcode标记序列位于所述DNA片段c的下游、所述DNA片段d的上游。

所述建库PCR下游引物中，添加Barcode标记序列的目的是为了测序时用于检测多个待测样本条码的信息(区分不同待测样本)，从而检测(高通量检测)多个待测样本中不同目的蛋白的含量。

所述建库PCR下游引物从5’末端到3’末端依次可包括所述DNA片段c、所述Barcode标记序列和所述DNA片段d。所述建库PCR下游引物从5’末端到3’末端具体可由所述DNA片段c、所述Barcode标记序列和所述DNA片段d组成。

上述任一所述试剂盒还可包括用于检测DNA标准品的试剂；所述用于检测DNA标准品的试剂可包括DNA标准品、建库PCR上游引物-标准品和建库PCR下游引物-标准品。所述建库PCR上游引物-标准品和所述建库PCR下游引物-标准品可用于检测DNA标准品。所述用于检测DNA标准品的试剂可作为阳性对照。

所述DNA标准品可含有特异DNA分子(双链)。所述特异DNA分子从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段m、随机DNA片段和DNA片段n。所述建库PCR上游引物-标准品从5’末端到3’末端依次可包括所述DNA片段a和DNA片段M。所述DNA片段M和所述DNA片段m完全一致。所述建库PCR下游引物-标准品从5’末端到3’末端依次可包括所述DNA片段c和DNA片段N。所述DNA片段N和所述DNA片段n的3’末端反向互补。

所述用于检测DNA标准品的试剂具体可由所述DNA标准品、所述建库PCR上游引物-标准品和所述建库PCR下游引物-标准品组成。

所述建库PCR下游引物-标准品还可包括Barcode标记序列；所述Barcode标记序列位于所述DNA片段c的下游、所述DNA片段N的上游。

所述DNA标准品可为特异DNA分子(双链)溶液。所述DNA标准品的溶剂具体可为水。所述特异DNA分子从5’末端到3’末端具体可由所述DNA片段m、所述随机DNA片段和所述DNA片段n组成。

所述特异DNA分子(双链)的每条链可由60-100个(如60-80个、80-100个、60个、80个或100个)核苷酸组成。所述DNA片段m可为15-30个(如15-19个、19-30个、15个、19个或30个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述DNA片段n可为25-50个(如25-32个、32-50个、25个、32个或50个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述随机DNA片段可为25-50个(如25-29个、29-50个、25个、29个或50个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述建库PCR上游引物-标准品可为40-50个(如40-44个、44-50个、40个、44个或50个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述建库PCR下游引物-标准品可为45-50个(如45-48个、48-50个、45个、48个或50个)核苷酸组成的单链DNA分子。

上文中，所述DNA片段N和所述DNA片段n的3’末端反向互补具体可为所述DNA片段N和所述DNA片段n的3’末端的20-35个(如20-23个、23-32个、32-35个、20个、23个、32个或35个)核苷酸反向互补，具体可为21个核苷酸反向互补。

所述建库PCR上游引物-标准品从5’末端到3’末端具体可由所述DNA片段a(测序接头序列甲)和所述DNA片段M组成。建库PCR上游引物-标准品中，添加测序接头序列甲的目的是为了便于进行测序，用于检测不同浓度的DNA标准品。根据测序平台的不同，也可以替换成由其它核苷酸序列组成的测序接头序列。

所述建库PCR下游引物-标准品从5’末端到3’末端具体可由所述DNA片段c和所述DNA片段N组成。所述建库PCR下游引物-标准品从5’末端到3’末端依次可包括所述DNA片段c(测序接头序列乙)、所述Barcode标记序列和所述DNA片段N。所述建库PCR下游引物-标准品从5’末端到3’末端具体可由所述DNA片段c、所述Barcode标记序列和所述DNA片段N组成。

所述建库PCR下游引物中，添加测序接头序列乙和Barcode标记序列的目的是为了便于进行测序，用于检测不同浓度的DNA标准品。

上述任一所述Barcode标记序列的核苷酸序列可为F1)-F8)中的任一种：F1)ACTGGTAAGA；F2)AAGCTCCTGA；F3)CTGGGGCTAT；F4)CCCAGTCAGG；F5)GGATTTGGTT；F6)TACTAATGGC；F7)TTTTCATTTT；F8)CTGAGCTCCT。

上述任一所述试剂盒具体可由若干个用于检测不同目的蛋白的试剂、建库PCR上游引物、建库PCR下游引物、测序引物甲、测序引物乙和所述用于检测DNA标准品的试剂组成。

上述任一所述试剂盒在检测待测样本中不同目的蛋白含量中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种检测待测样本中不同目的蛋白含量的方法，可包括步骤(a)、步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)：

所述步骤(a)可包括如下步骤：

(a-1)将上述任一所述目的蛋白抗体甲和所述单链DNA分子甲连接，得到探针1；将上述任一所述目的蛋白抗体乙和所述单链DNA分子乙连接，得到探针2；

(a-2)完成步骤(a-1)后，将探针1和探针2混合，得到混合探针；

(a-3)按照步骤(a-1)和(a-2)的方法，制备不同的混合探针，不同的混合探针组成混合探针组；混合探针组中的每个混合探针用于检测一种目的蛋白；

所述步骤(b)可包括如下步骤：

(b-1)向混合探针组中的各个混合探针中加入待测样本，混匀，延伸，得到延伸产物；

(b-2)分别以步骤(b-1)得到的各个延伸产物为模板，以上述任一所述建库PCR上游引物和所述建库PCR下游引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(b-3)分别取步骤(b-2)得到的PCR扩增产物，以上述任一所述测序引物甲和测序引物乙进行测序，得到待测样本中不同目的蛋白对应的DNA拷贝数；

所述步骤(c)可包括如下步骤：

(c-1)向混合探针组中的各个混合探针中加入各目的蛋白标准溶液，混匀，延伸，得到延伸产物；

(c-2)分别以步骤(c-1)得到的各个延伸产物为模板，以上述任一所述建库PCR上游引物和所述建库PCR下游引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(c-3)分别取步骤(c-2)得到的PCR扩增产物，以上述任一所述测序引物甲和测序引物乙进行测序，得到各目的蛋白标准溶液中不同目的蛋白对应的DNA拷贝数；

所述步骤(d)：根据各目的蛋白标准溶液中目的蛋白的浓度和相应的拷贝数绘制标准曲线，将所述所述步骤(b-3)得到的拷贝数代入所述标准曲线，得到各待测样本中不同目的蛋白的含量。

所述步骤(a-1)中，所述连接可通过偶联剂进行；所述偶联剂可以提供与目的蛋白抗体和单链DNA分子反应的化学基团。

所述步骤(a-1)中，目的蛋白抗体和单链DNA分子的连接(如目的蛋白抗体甲和单链DNA分子甲连接、或、目的蛋白抗体乙和单链DNA分子乙连接)得到探针可包括如下步骤：

(a-1-1)将偶联剂(可加入过量的偶联剂，目的为所有的目的蛋白抗体甲都能反应)和目的蛋白抗体混合，得到混合体系1；取混合体系1，反应，得到目的蛋白抗体与偶联剂的复合物；

(a-1-3)取完成步骤(a-1-1)的体系，加入单链DNA分子(可加入过量的单链DNA分子，目的为所有的“目的蛋白抗体与偶联剂的复合物”都能反应)，得到混合体系2；取混合体系2，反应，得到目的蛋白抗体、单链DNA分子与偶联剂的复合物(目的蛋白抗体、单链DNA分子与偶联剂的复合物即为探针)。

所述步骤(a-1-1)中，混合体系1中还可含有PBS缓冲液。混合体系1中，偶联剂的浓度可为6-10nmol(如6-8nmol、8-10nmol、6nmol、8nmol或10nmol)。目的蛋白抗体的浓度可为0.8-1.2μg/μL(如0.8-1.0μg/μL、1.0-1.2μg/μL、0.8μg/μL、1.0μg/μL或1.2μg/μL)。反应的条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)静置20-40min(如20-30min、30-40min、20min、30min或40min)。

所述步骤(a-1-3)中，混合体系2中，单链DNA分子甲的浓度可为0.3-0.8nM(如0.3-0.6nM、0.5-0.8nM、0.3nM、0.5nM、0.6nM或0.8nM)。反应的条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)静置3-7h(如3-5h、5-7h、3h、5h或7h)。

所述步骤(a-1)中，完成步骤(a-1-1)之后进行步骤(a-1-3)之前，还可包括步骤(a-1-2)：取完成步骤(a-1-1)的体系，除去多余的偶联剂。所述“除去多余的偶联剂”可通过将完成步骤(a-1-1)的体系超滤离心1-3次(如1次、2次或3次)实现。

所述步骤(a-1)中，还可包括步骤(a-1-4)：取完成步骤(a-1-3)的体系，除去多余的单链DNA分子(目的为保证探针的高纯度)。所述“除去多余的单链DNA分子”可通过将完成步骤(a-1-3)的体系超滤离心1-3次(如1次、2次或3次)实现。

所述步骤(a-1)中，还可包括步骤(a-1-5)：取完成步骤(a-1-4)的体系，加入超纯水稀释。进行此步骤的目的是控制每次制备得到的探针的浓度都是一定的，方便后面做QC。所述步骤(a-1-5)中，探针的浓度可为20-40μg/mL(如20-30μg/mL、30-40μg/mL、20μg/mL、30μg/mL或40μg/mL)

所述步骤(a-2)中，“将探针1和探针2混合”具体可为将1体积份探针1和1体积份探针2混合。

所述步骤(b-1)可包括如下步骤：

(b-1-1)将待测样本和混合探针组中的各个混合探针混合，孵育；

(b-1-2)向完成步骤(b-1-1)的体系中加入DNA聚合酶(如Bst DNA聚合酶)和dNTP，得到反应体系f；

(b-1-3)取反应体系f，延伸，得到延伸产物。

所述步骤(b-1-1)中，所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)静置20-40min(如20-30min、30-40min、20min、30min或40min)。

所述步骤(b-1-1)中，“将待测样本和混合探针组中的各个混合探针混合”具体可为将待测样本、混合探针组中的各个混合探针和PBS缓冲液混合。

所述步骤(b-1-3)中，所述延伸是指探针上所述DNA片段3和探针上所述DNA片段6反向互补结合，在此基础上进行延伸得到延伸产物。延伸产物的一端可为DNA片段1的末端，另一端可为DNA片段4的末端。

所述步骤(c-1)可包括如下步骤：

(c-1-1)将各目的蛋白标准溶液和混合探针组中的各个混合探针混合，孵育；

(c-1-2)向完成步骤(c-1-1)的体系中加入DNA聚合酶(如Bst DNA聚合酶)和dNTP，得到反应体系m；

(c-1-3)取反应体系m，延伸，得到延伸产物。

所述步骤(c-1-1)中，所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)静置20-40min(如20-30min、30-40min、20min、30min或40min)。

所述步骤(c-1-1)中，“将各目的蛋白标准溶液和混合探针组中的各个混合探针混合”具体可为将各目的蛋白标准溶液、混合探针组中的各个混合探针和PBS缓冲液混合。

所述步骤(c-1-3)中，所述延伸是指探针上所述DNA片段3和探针上所述DNA片段6反向互补结合，在此基础上进行延伸得到延伸产物。延伸产物的一端可为DNA片段1的末端，另一端可为DNA片段4的末端。

上述任一延伸条件具体可为：37℃10min，85℃10min。

上述任一所述PBS缓冲液具体可为pH7.2、0.01mM的PBS缓冲液。

上述任一所述偶联剂具体可为DBCO-NHS。

按照上述方法，在本发明的一个实施例中，制备了检测待测样本中甲胎蛋白含量的试剂盒。该试剂盒包括单链DNA分子甲(以下命名为ss-DNA1)、甲胎蛋白抗体甲(具体为AFP捕获抗体)、单链DNA分子乙(以下命名为ss-DNA2)、甲胎蛋白抗体乙(具体为AFP检测抗体)、建库PCR上游引物、建库PCR下游引物(建库PCR下游引物1、建库PCR下游引物2、建库PCR下游引物3或建库PCR下游引物4)、DNA标准品(双链特异DNA分子的水溶液)、建库PCR上游引物-标准品、建库PCR下游引物-标准品(建库PCR下游引物1-标准品、建库PCR下游引物2-标准品、建库PCR下游引物3-标准品或建库PCR下游引物4-标准品)、测序引物甲和测序引物乙。建库PCR上游引物和建库PCR下游引物用于检测ss-DNA1和ss-DNA2的延伸产物。建库PCR上游引物-标准品和建库PCR下游引物-标准品用于检测DNA标准品。各个引物、DNA标准品和单链DNA分子的具体的核苷酸序列和说明详见表1。实验证明，该试剂盒可以检测甲胎蛋白含量，且具有较高的准确性。

表1

本发明的发明人结合PEA和DNA测序技术可实现对多样本多蛋白含量的同时检测，具体为：1、针对不同种类的抗体标记不同序列的ss-DNA(蛋白条码)，由ss-DNA序列的不同来区分蛋白种类；2、借助PEA技术将蛋白信息转化为DNA信息；3、建库时针对不同的样本再加上一段不同的Barcode标记序列(样本条码)，用于区分不同样本；4、测序仪分别检测出样本条码序列、蛋白条码序列以及蛋白条码序列的数目，由此便实现了多个样本多种蛋白含量的同时检测。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为高通量测序检测多蛋白质含量的原理。

图2为以AFP浓度为X轴，拷贝数为Y轴，进行线性回归作图。

图3为以DNA标准品的投入量为X轴，拷贝数为Y轴，进行线性回归作图。

图4为以AFP浓度的对数为X轴，CT平均值为Y轴，进行线性回归作图。

图5为QPCR定量检测和测序仪定量检测AFP的相关性分析。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

AFP捕获抗体和AFP检测抗体均为深圳市菲鹏生物股份有限公司的产品，货号分别为MAB-AFP-7和MAB-AFP-28。Bst DNA聚合酶为NEB公司的产品，货号为M0275S。dNTP(10mM)为ENZYMATICS公司的产品，货号为N205L-1000。

实施例1、高通量测序检测多样本多蛋白质含量的试剂盒的制备

本发明的发明人基于PEA技术和DNA测序技术，制备了高通量测序检测多样本多蛋白质含量的试剂盒。该试剂盒可以对多个待测样本(即多样本)中的多种蛋白质的同时检测，而且检测成本较低。该试剂盒高通量测序检测多样本多蛋白质含量的原理见图1：图1中A为混合探针的制备过程。图1中B为通过免疫、延伸及PCR扩增等反应，将蛋白信息转化为DNA信息。图1中C为高通量测序检测多样本多蛋白质的原理。

高通量测序检测多样本多蛋白质含量的试剂盒由若干个用于检测不同目的蛋白的试剂、建库PCR上游引物、建库PCR下游引物、测序引物甲和测序引物乙组成。用于检测不同目的蛋白的试剂之间没有交叉反应。每个用于检测目的蛋白的试剂包括单链DNA分子甲、目的蛋白抗体甲、单链DNA分子乙和目的蛋白抗体乙。

单链DNA分子甲(从5’到3’)由DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3组成。

单链DNA分子甲为30-50个(如39个)核苷酸组成的单链DNA分子。

单链DNA分子乙(从5’到3’)由DNA片段4、DNA片段5和DNA片段6组成。

单链DNA分子乙为30-50个(如50个)核苷酸组成的单链DNA分子。

单链DNA分子甲和单链DNA分子乙的5’末端进行叠氮或氨基修饰。

DNA片段1和DNA片段4均为20-35个(如23个、32个)核苷酸组成的单链DNA分子。

DNA片段2和DNA片段5均为5-9个(如7个、9个)核苷酸组成的单链DNA分子。

DNA片段3和DNA片段6均为5-11个(如9个)核苷酸组成的单链DNA分子。

DNA片段3和DNA片段6反向互补。

每个用于检测目的蛋白的试剂中，所述DNA片段2和所述DNA片段5的核苷酸序列均不同，因此可以检测不同的目的蛋白；

建库PCR上游引物(从5’到3’)由DNA片段a(测序接头序列甲)和DNA片段b组成。DNA片段b和DNA片段1完全一致。建库PCR上游引物的5’末端进行磷酸化修饰。

建库PCR下游引物(从5’到3’)由DNA片段c(测序接头序列乙)、Barcode标记序列和DNA片段d组成。DNA片段d和DNA片段4的5’末端完全一致。

DNA片段a为15-30个(如25个)核苷酸组成的单链DNA分子。

DNA片段c为15-30个(如17个)核苷酸组成的单链DNA分子。

建库PCR上游引物为45-50个(如48个)核苷酸组成的单链DNA分子。

建库PCR下游引物为45-50个(如48个)核苷酸组成的单链DNA分子。

建库PCR上游引物中，添加测序接头序列甲的目的是为了便于进行测序，用于检测ss-DNA，即蛋白条码(区分不同蛋白)的信息。根据测序平台的不同，也可以替换成由其它核苷酸序列组成的测序接头序列。在本发明的实施例中，采用BGI500平台测序进行测序。相应的，测序接头序列甲的核苷酸序列(从5’至3’)为GAACGACATGGCTACGATCCGACTT。

建库PCR下游引物中，添加测序接头序列乙和Barcode标记序列的目的是为了便于进行测序，用于检测样本条码(区分不同样本)的信息。根据测序平台的不同，也可以替换成由其它核苷酸序列组成的测序接头序列。在本发明的实施例中，采用BGI500平台测序进行测序。相应的，测序接头序列乙的核苷酸序列(从5’至3’)为TGTGAGCCAAGGAGTTG。

测序引物甲(从5’到3’)由DNA片段X和DNA片段Y组成。DNA片段X与DNA片段c(测序接头序列乙)反向互补，DNA片段Y与DNA片段a(测序接头序列甲)完全一致。因为本发明使用的是BGI500平台测序，文库为环状，在DNA片段a和DNA片段c处环化起来，故测序引物甲由DNA片段c的反向互补序列和DNA片段a组成。测序引物甲的核苷酸序列(从5’至3’)为CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT。

测序引物甲为40-50个(如42个)核苷酸组成的单链DNA分子。

测序引物乙与DNA片段4序列反向互补。因为采用DNB测序，生成的DNB为原序列(即DNA片段4)一致，故测序引物乙与原序列(即DNA片段4)反向互补。测序引物乙的核苷酸序列(从5’至3’)为AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA。

高通量测序检测多样本多蛋白质含量的试剂盒还可含有DNA标准品、用于检测DNA标准品的建库PCR上游引物和建库PCR下游引物，分别命名为建库PCR上游引物-标准品和建库PCR下游引物-标准品。

DNA标准品为双链特异DNA分子溶液。溶剂可为水。

双链特异DNA分子(从5’到3’)由DNA片段m、随机DNA片段和DNA片段n组成。

双链特异DNA分子的每条链由60-100个(如80个)核苷酸组成。

DNA片段m由15-30个(如19个)核苷酸组成。

DNA片段n由25-50个(如32个)核苷酸组成。

随机DNA片段由25-50个(如29个)核苷酸组成。

建库PCR上游引物-标准品(从5’到3’)由DNA片段a(测序接头序列甲)和DNA片段M组成。DNA片段M和DNA片段m完全一致。

建库PCR下游引物-标准品(从5’到3’)由DNA片段c(测序接头序列乙)、Barcode标记序列和DNA片段N组成。DNA片段N和DNA片段n的3’末端反向互补。

建库PCR上游引物-标准品为45-50个(如44个)核苷酸组成的单链DNA分子。

建库PCR下游引物-标准品为45-50个(如48个)核苷酸组成的单链DNA分子。

实施例2、高通量测序检测甲胎蛋白含量的试剂盒的制备

本发明的发明人制备了高通量测序检测甲胎蛋白含量的试剂盒。该试剂盒包括单链DNA分子甲(以下命名为ss-DNA1)、甲胎蛋白抗体甲(具体为AFP捕获抗体)、单链DNA分子乙(以下命名为ss-DNA2)、甲胎蛋白抗体乙(具体为AFP检测抗体)、建库PCR上游引物、建库PCR下游引物(建库PCR下游引物1、建库PCR下游引物2、建库PCR下游引物3或建库PCR下游引物4)、DNA标准品(双链特异DNA分子的水溶液)、建库PCR上游引物-标准品、建库PCR下游引物-标准品(建库PCR下游引物1-标准品、建库PCR下游引物2-标准品、建库PCR下游引物3-标准品或建库PCR下游引物4-标准品)、测序引物甲和测序引物乙。建库PCR上游引物和建库PCR下游引物用于检测ss-DNA1和ss-DNA2的延伸产物。建库PCR上游引物-标准品和建库PCR下游引物-标准品用于检测DNA标准品。引物、DNA标准品和单链DNA分子的具体的核苷酸序列见表1。

表1

实施例3、采用实施例2制备的试剂盒检测甲胎蛋白含量的方法的建立

一、混合探针的制备

1、向30μL pH7.2、0.01mM的PBS缓冲液中加入DBCO-NHS和30μg AFP捕获抗体，得到反应体系；该反应体系中，DBCO-NHS的浓度为8nmol。

2、取步骤1得到的反应体系，37℃静置30min，然后超滤离心2次。

3、完成步骤2后，加入ss-DNA1，得到反应体系；该反应体系中，ss-DNA1的浓度为0.5nM。

4、取步骤3得到的反应体系，37℃静置5h，然后超滤离心2次。

5、完成步骤4后，加入超纯水稀释，得到DNA浓度为30μg/mL的AFP捕获抗体-ss-DNA1探针。

6、按照上述步骤1-5，将AFP捕获抗体替换为AFP检测抗体，ss-DNA1替换为ss-DNA2，其它步骤均不变，得到DNA浓度为30μg/mL的AFP检测抗体-ss-DNA2探针。

7、将1体积份AFP捕获抗体-ss-DNA1探针和1体积份AFP检测抗体-ss-DNA2探针混合，得到混合探针。

二、延伸反应

1、将1μL待测样本(浓度为2ng/mL的AFP水溶液1、浓度为8ng/mL的AFP水溶液2、浓度为32ng/mL的AFP水溶液3或浓度为128ng/mL的AFP水溶液4)、2μL混合探针和17μL pH7.2、0.01mM的PBS缓冲液混合，然后37℃静置30min。

2、向完成步骤1的体系中加入1μLBst DNA聚合酶、2μL dNTP(10mM)和17μL pH7.2、0.01mM的PBS缓冲液，得到反应体系。

3、完成步骤2后，取所述反应体系，延伸(延伸条件为：37℃10min，85℃10min)，得到延伸产物。

三、PCR扩增

1、配制反应体系甲和反应体系乙

反应体系甲为20μL，由4μL 5×Taq DNA聚合酶缓冲液、1μL dNTP(10mM)、0.2μLTaq DNA聚合酶(浓度为1U/μL)、2μL建库PCR上游引物的水溶液、2μL建库PCR下游引物(不同待测样本对应不同的建库PCR下游引物)的水溶液、4μL延伸产物和6.8μL H₂O组成。反应体系甲中，建库PCR上游引物和建库PCR下游引物的浓度均为10μM。

反应体系乙为20μL，由4μL 5×Taq DNA聚合酶缓冲液、1μL dNTP(10mM)、0.2μLTaq DNA聚合酶(浓度为1U/μL)、2μL建库PCR上游引物-标准品的水溶液、2μL建库PCR下游引物-标准品(DNA标准品不同投入量对应不同的建库PCR下游引物-标准品)的水溶液、4μLDNA标准品(投入量为12.5fmol、50fmol、200fmol或800fmol)和6.8μL H2O组成。反应体系乙中，建库PCR上游引物-标准品和建库PCR下游引物-标准品的浓度均为10μM。

2、PCR扩增

分别取步骤1配制的反应体系甲或反应体系乙，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

四、测序仪定量检测

分别取步骤三得到的PCR扩增产物，采用BGISEQ500平台测序。

根据测序结果，获得各个样本的DNA拷贝数。

结果见表2。

表2

样本	DNA拷贝数(条)
		浓度为2ng/mL的AFP水溶液1	85562
浓度为8ng/mL的AFP水溶液2	152631
		浓度为32ng/mL的AFP水溶液3	271119
浓度为128ng/mL的AFP水溶液4	657590
		DNA标准品(投入量为12.5fmol)	227266
DNA标准品(投入量为50fmol)	675476
		DNA标准品(投入量为200fmol)	4918080
DNA标准品(投入量为800fmol)	24661499

以反应体系甲中的抗原(即AFP)浓度为X轴，拷贝数为Y轴，进行线性回归作图。结果见图2。结果表明，AFP浓度与拷贝数成线性，相关系数(R²)值能达到0.99。

以反应体系乙中的DNA标准品的投入量为X轴，拷贝数为Y轴，进行线性回归作图。结果见图3。结果表明，DNA标准品的投入量与拷贝数成线性，相关系数(R²)值能达到0.99。

五、采用实施例2制备的试剂盒检测待测样本中甲胎蛋白含量的方法的建立

采用实施例2制备的试剂盒检测待测样本中甲胎蛋白含量的方法具体如下：

1、配置不同浓度甲胎蛋白的溶液，按照步骤一至四依次进行延伸反应、PCR扩增和测序，然后以不同浓度甲胎蛋白的浓度为横坐标，对应的DNA拷贝数为纵坐标，绘制甲胎蛋白标准曲线。

2、取待测样本，按照步骤一至四依次进行延伸反应、PCR扩增和测序，得到待测样本的对应的DNA拷贝数；然后根据甲胎蛋白标准曲线，得到待测样本中甲胎蛋白的含量。

实施例4、采用QPCR定量检测甲胎蛋白含量

实验重复两次，取平均值。每次重复的步骤如下：

一、混合探针的制备

制备混合探针，制备方法同实施例3中步骤一。

二、延伸反应

1、将1μL待测样本(浓度为2ng/mL的AFP水溶液1、浓度为8ng/mL的AFP水溶液2、浓度为32ng/mL的AFP水溶液3或浓度为128ng/mL的AFP水溶液4)、2μL混合探针和17μL pH7.2、0.01mM的PBS缓冲液混合，然后37℃静置30min。

2、向完成步骤1的体系中加入1μLBst DNA聚合酶、2μL dNTP(10mM)和17μL pH7.2、0.01mM的PBS缓冲液，得到反应体系。

3、完成步骤2后，取所述反应体系，延伸(延伸条件为：37℃20min)，得到延伸产物。

三、QPCR定量检测

1、配制反应体系

反应体系为10μL，由4μL延伸产物、0.25μL上游引物(核苷酸序列为：5’-TGTCATAAGGTTACCTAAGGGACTCACTGAATAAGGC)水溶液、0.25μL下游引物(核苷酸序列为：5’-TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCC-3’)水溶液、5μL Universal SYBR qPCR Master Mix和0.5μLH2O组成。反应体系中，上游引物和下游引物的浓度均为10μM。

Universal SYBR qPCR Master Mix为南京诺唯赞生物科技有限公司的产品，货号为Q711-03。Universal SYBR qPCR Master Mix中含有Taq酶和dNTP混合物等。

2、QPCR检测

取步骤1配制的反应体系，进行QPCR检测，得到各个待测样本的CT值。

反应条件：95℃3s，60℃30s，40个循环。

检测结果见表3。

表3

以抗原(即AFP)浓度的对数为X轴，CT平均值为Y轴，进行线性回归作图。结果见图4。结果表明，AFP浓度与CT值成线性，相关系数(R²)值能达到0.99。

四、QPCR定量检测和测序仪定量检测的相关性

将QPCR定量检测和测序仪定量检测抗原(即AFP)的结果进行相关性分析。

分析结果见图5。结果表明，QPCR定量检测和测序仪定量检测抗原的具有较高的一致性。由此可见，采用实施例2制备的试剂盒可以检测甲胎蛋白含量，具有较高的准确性。

Claims (10)

1.一种检测待测样本中不同目的蛋白含量的试剂盒，包括若干个用于检测不同目的蛋白的试剂、建库PCR上游引物、建库PCR下游引物、测序引物甲和测序引物乙；

每个用于检测目的蛋白的试剂包括单链DNA分子甲、目的蛋白抗体甲、单链DNA分子乙和目的蛋白抗体乙；

所述单链DNA分子甲从5’末端到3’末端依次包括DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3；

所述单链DNA分子乙从5’末端到3’末端依次包括DNA片段4、DNA片段5和DNA片段6；

所述DNA片段3和所述DNA片段6反向互补；

每个用于检测目的蛋白的试剂中，所述DNA片段2和所述DNA片段5的核苷酸序列均不同，用于检测不同的目的蛋白；

所述建库PCR上游引物从5’末端到3’末端依次包括DNA片段a和DNA片段b；所述DNA片段b和所述DNA片段1完全一致；

所述建库PCR下游引物从5’末端到3’末端依次包括DNA片段c和DNA片段d；所述DNA片段d和所述DNA片段4的5’末端完全一致；

所述测序引物甲从5’末端到3’末端依次包括DNA片段X和DNA片段Y；所述DNA片段X与所述DNA片段c反向互补，所述DNA片段Y与所述DNA片段a完全一致；

所述测序引物乙与所述DNA片段4序列反向互补。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

所述DNA片段1和所述DNA片段4均为20-35个核苷酸组成的单链DNA分子；

所述DNA片段2和所述DNA片段5均为5-9个核苷酸组成的单链DNA分子；

所述DNA片段3和所述DNA片段6均为5-11个核苷酸组成的单链DNA分子；

所述DNA片段a为15-30个核苷酸组成的单链DNA分子；

所述DNA片段c为15-30个核苷酸组成的单链DNA分子。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

所述单链DNA分子甲为30-50个核苷酸组成的单链DNA分子；

所述单链DNA分子乙为30-50个核苷酸组成的单链DNA分子；

所述建库PCR上游引物为45-50个核苷酸组成的单链DNA分子；

所述建库PCR下游引物为45-50个核苷酸组成的单链DNA分子；

所述测序引物甲为40-50个核苷酸组成的单链DNA分子。

4.如权利要求1至3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述建库PCR下游引物还包括Barcode标记序列；所述Barcode标记序列位于所述DNA片段c的下游、所述DNA片段d的上游。

5.如权利要求1至4任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于检测DNA标准品的试剂；所述用于检测DNA标准品的试剂包括DNA标准品、建库PCR上游引物-标准品和建库PCR下游引物-标准品；

所述DNA标准品含有特异DNA分子；所述特异DNA分子从5’末端到3’末端依次包括DNA片段m、随机DNA片段和DNA片段n；

所述建库PCR上游引物-标准品从5’末端到3’末端依次包括所述DNA片段a和DNA片段M；所述DNA片段M和所述DNA片段m完全一致；

所述建库PCR下游引物-标准品从5’末端到3’末端依次包括所述DNA片段c和DNA片段N；所述DNA片段N和所述DNA片段n的3’末端反向互补。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述建库PCR下游引物-标准品还包括Barcode标记序列；所述Barcode标记序列位于所述DNA片段c的下游、所述DNA片段N的上游。

7.权利要求1至6任一所述试剂盒在检测待测样本中不同目的蛋白含量中的应用。

8.一种检测待测样本中不同目的蛋白含量的方法，包括步骤(a)、步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)：

所述步骤(a)包括如下步骤：

(a-1)将权利要求1至4中任一所述目的蛋白抗体甲和所述单链DNA分子甲连接，得到探针1；将权利要求1至4中任一所述目的蛋白抗体乙和所述单链DNA分子乙连接，得到探针2；

(a-2)完成步骤(a-1)后，将探针1和探针2混合，得到混合探针；

(a-3)按照步骤(a-1)和(a-2)的方法，制备不同的混合探针，不同的混合探针组成混合探针组；混合探针组中的每个混合探针用于检测一种目的蛋白；

所述步骤(b)包括如下步骤：

(b-1)向混合探针组中的各个混合探针中加入待测样本，混匀，延伸，得到延伸产物；

(b-2)分别以步骤(b-1)得到的各个延伸产物为模板，以权利要求1至4中任一所述建库PCR上游引物和所述建库PCR下游引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(b-3)分别取步骤(b-2)得到的PCR扩增产物，以权利要求1至4中任一所述测序引物甲和测序引物乙进行测序，得到待测样本中不同目的蛋白对应的DNA拷贝数；

所述步骤(c)包括如下步骤：

(c-1)向混合探针组中的各个混合探针中加入各目的蛋白标准溶液，混匀，延伸，得到延伸产物；

(c-2)分别以步骤(c-1)得到的各个延伸产物为模板，以权利要求1至4中任一所述建库PCR上游引物和所述建库PCR下游引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(c-3)分别取步骤(c-2)得到的PCR扩增产物，以权利要求1至4中任一所述测序引物甲和测序引物乙进行测序，得到各目的蛋白标准溶液中不同目的蛋白对应的DNA拷贝数；

所述步骤(d)：根据各目的蛋白标准溶液中目的蛋白的浓度和相应的拷贝数绘制标准曲线，将所述所述步骤(b-3)得到的拷贝数代入所述标准曲线，得到各待测样本中不同目的蛋白的含量。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述步骤(a-1)中，所述连接通过偶联剂进行；所述偶联剂可以提供与目的蛋白抗体和单链DNA分子反应的化学基团。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述步骤(b-1)包括如下步骤：

(b-1-1)将待测样本和混合探针组中的各个混合探针混合，孵育；

(b-1-2)向完成步骤(b-1-1)的体系中加入DNA聚合酶和dNTP，得到反应体系f；

(b-1-3)取反应体系f，延伸，得到延伸产物；

所述步骤(c-1)包括如下步骤：

(c-1-1)将各目的蛋白标准溶液和混合探针组中的各个混合探针混合，孵育；

(c-1-2)向完成步骤(c-1-1)的体系中加入DNA聚合酶和dNTP，得到反应体系m；

(c-1-3)取反应体系m，延伸，得到延伸产物。

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