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CN111139261B - 一种利用基因编辑降低小麦籽粒多酚氧化酶含量的方法 - Google Patents

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CN111139261B CN202010119498.9A CN202010119498A CN111139261B CN 111139261 B CN111139261 B CN 111139261B CN 202010119498 A CN202010119498 A CN 202010119498A CN 111139261 B CN111139261 B CN 111139261B
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Abstract

本发明公开了一种利用基因编辑降低小麦籽粒多酚氧化酶含量的方法。本发明通过特异性引导单链gRNA的设计，构建了可以实现PPO基因体内编辑的表达载体，可以敲除小麦PPO基因。在实际应用中，通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平胚乳特异表达PPO基因的沉默，从而降低小麦籽粒多酚氧化酶含量，减少面粉褐变，提高面粉白度。为利用基因工程技术改良小麦面粉的白度，提高小麦加工品质提供有力的工具。

Description

一种利用基因编辑降低小麦籽粒多酚氧化酶含量的方法
技术领域
本发明涉及一种利用基因编辑降低小麦籽粒多酚氧化酶含量的方法，属于基因工程领域。
背景技术
小麦胚乳中多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)容易引起面团褐变，从而影响面制品的白度。小麦面粉中的PPO活性仅占全籽粒的3％左右，但可以解释面粉及面制品加工和贮存过程中色泽褐变的50-70％。我国很多小麦品种的面粉色泽不能满足加工要求，面粉生产及食品加工企业采用向面粉中添加增白剂的方式，增加其产品的白度。过氧化苯甲酰(Bezoyl peroxide,BPO)是一种氧化剂，为当前使用最广泛的面粉增白剂。BPO的分解产物苯甲酸和苯酚均需在肝脏中进行解毒，长期食用BPO超标的面粉及其制品会引起慢性中毒。因此，人们很久以来就期待着无增白剂面制品的问世，低PPO小麦品种的培育，将对面制品的加工工艺产生重要影响，无增白剂食品将具有巨大的市场空间和产业化前景。因此，培育具有低PPO活性的小麦品种是对面制品色泽性状进行改良的重要途径。
小麦籽粒PPO活性主要受位于第二同源群上基因的调控，分别位于2AL和2DL，其中2AL上的QTL的效应较大，贡献率37.9-50.0％；位于2DL上的QTL贡献率为25.0-29.1％(D.J.Sun,Z.H.He,X.C.Xia,L.P.Zhang,C.F.Morris,R.Appels,W.J.Ma,H.Wang.A novelSTS marker for polyphenol oxidase activity in bread wheat.Mol Breeding,2005,16:209–218)。利用电子克隆技术克隆2A和2D染色体上小麦籽粒PPO基因的全部编码序列，并利用模式植物对基因的功能进行了初步验证。Ppo-A1、Ppo-D1均包含一个1731bp的读码框(X.Y.He,Z.H.He,L.P.Zhang,D.J.Sun,C.F.Morris,E.P.Furerst,and X.C.Xia.Allelicvariation of polyphenol oxidase(PPO)genes located on chromosomes 2A and 2Dand development of functional markers for the PPO genes in common wheat,TheorAppl Genet,2007,115:47-58.)，可编码一条含577个氨基酸的多肽(64kD)，其基因编码区序列相似性达95％以上，这不仅显示了它们的同源进化关系，也为利用RNAi技术同步沉默2A和2D上的PPO基因提供了便利。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种利用基因编辑降低小麦籽粒多酚氧化酶含量的方法。本发明的方法通过构建具有敲除PPO基因功能的表达载体pBUE411-PPO，通过基因转化过程降低胚乳中PPO基因的表达的水平。
一种具有敲除PPO基因功能的pBUE411-PPO双元载体，包括表达盒A和表达盒B；
所述表达盒A具体自上游至下游依次包括如下元件：所述来自小麦的TaU3启动子A，所述PPO基因的sgRNA、终止子A；
所述表达盒B具体自上游至下游依次包括如下元件：所述启动子B、所述玉米Cas9编码序列、所述终止子B。
进一步的，所述PPO基因的sgRNA的序列如SEQ10所示；
所述玉米Cas9编码序列如SEQ13所示；
所述启动子A的序列如SEQ1所示；
所述启动子B序列如SEQ2所示；
所述终止子A序列如SEQ3所示；
所述终止子B序列如SEQ4所示。
进一步的，所述表达盒A具体可如序列SEQ5所示；
所述表达盒B具体可如序列SEQ6所示；
所述表达盒A位于所述表达盒B的上游，表达盒A和表达盒B相互串联。
进一步的，所述pBUE411-PPO双元载体还含有抗性标记基因，如bar基因。
进一步的，所述pBUE411-PPO双元载体的核苷酸序列如SEQ7所示。
一种构建上述pBUE411-PPO双元载体的方法，包括如下步骤：
S11根据靶向PPO基因设计其sgRNA，sgRNA的寡核苷酸对应的是PPO-gR1-TaU3-F和PPO-gR1-TaU3-R，即PPO-gR1-TaU3-F序列如SEQ8所示，PPO-gR1-TaU3-R序列如SEQ9所示；
S12将步骤①合成的sgRNA的2条寡核苷酸进行磷酸化和退火形成双链，获得带有粘性末端的双链sgRNA；
S13利用限制性内切酶BsaI酶切pBUE411载体，回收含有所述启动子A、所述终止子A、所述启动子B、所述终止子B的载体片段；
S14将步骤S13回收的pBUE411载体片段和双链sgRNA通过T4连接酶进行连接反应，获得最终的pBUE411-PPO双元载体。
进一步的，所述PPO基因可为GENBANK ACCESSION NUMBER：EF070147.1(VERSIONABK62801.1)所示的DNA。
含有所述pBUE411-PPO双元载体的转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述pBUE411-PPO双元载体可应用于降低小麦胚乳中PPO基因表达水平。
所述pBUE411-PPO双元载体在小麦面粉色泽改良中的应用。
所述pBUE411-PPO双元载体在培育转基因小麦中的应用；与转基因前小麦相比，所述转基因小麦的面粉白度增加。
本发明还保护一段DNA片段Ⅰ，所述DNA片段Ⅰ由PPO基因的引导sgRNA组成，其序列具体可如序列SEQ10所示。
一种利用基因编辑降低小麦籽粒多酚氧化酶含量的方法，包括如下步骤：
S1构建一种pBUE411-PPO双元载体；
S2将步骤S1获得的pBUE411-PPO双元载体通过农杆菌转化到普通小麦中，获得转基因小麦。
有益效果：
本发明通过特异性引导单链gRNA的设计，构建了可以实现PPO基因体内编辑的表达载体，可以敲除小麦PPO基因。在实际应用中，通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平胚乳特异表达PPO基因的沉默，从而降低小麦籽粒多酚氧化酶含量，减少面粉褐变，提高面粉白度。本发明为利用基因工程技术改良小麦面粉的白度，提高小麦加工品质提供有力的工具。
附图说明
图1PPO基因的编码区。
图2pBUE411载体BsaI酶切电泳图。
图3靶向PPO基因CRISPR/Cas9重组载体pBUE411-PPO测序结果。
图4Bar试纸条检测转基因小麦植株。
图5野生型小麦PPO基因的推导氨基酸序列。
图6突变型小麦PPO基因的推导氨基酸序列。
图7野生型和突变型的PPO基因核苷酸序列比对图。
图8野生型和突变型的PPO基因的推导氨基酸序列比对图。
图9Hi-tom检测转基因株系PPO基因编辑位点图。
图10基因编辑株系及对照植株籽粒PPO基因相对表达。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。PCR扩增所需的高保真酶、DNA片段连接所需的T4连接酶、酶切片段回收所需的凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒均购自大连宝生物公司。质粒提取试剂盒购自天根生物，培养基配制所需的无机盐购自国药集团，维生素和抗生素以及激素购自Sigma公司。植物CRISPR/Cas9基因编辑载体为pBUE411,含有小麦U3启动子TaU3，用以启动sgRNA，Cas9p模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征，是设计合成的植物优化密码子基因。本实验室所用的大肠杆菌菌株是E.coli DH5α。
T4连接酶、DNA Marker DL2000等试剂购自Takara公司；FastPfu、2*Taq Mix、DH5α等购自北京全式金公司；限制性内切酶BsaI-HF购自NEB公司；所使用的引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，序列如下：
表1本研究中使用的引物
Figure BDA0002392528170000021
小麦品种JW1是山东省农科院作物所自行选育的具有良好组织培养能力的新种质，公众可从山东省农业科学院作物研究所获得
质粒pBUE411如序列表的序列7所示(17430bp)，由中国农业大学孙其信课题组提供；公众可从中国农业大学获得。
实验例1表达载体的构建
1.靶向PPO的sgRNA的设计
在小麦品种JW1里扩增TaPPO基因的序列，扩增序列见图1所示，下划线标记序列为靶向PPO基因的gRNA序列，下划线部分后三位标记为PAM序列，与NCBI数据库中的小麦的该基因序列100％相似。该基因全长1734个碱基，通过网站CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)在PPO基因的编码区寻找1个适合的打靶位点，在PAM结构前找到20bp序列片段设定为靶序列，sgRNA序列选定为GAAGAAGACGCTGCTGTTCC。
2.sgRNA的退火及双链的形成
PPO基因的sgRNA的2条oligo是由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，其中sgRNA的寡核苷酸对应的是PPO-gR1-TaU3-F和PPO-gR1-TaU3-R(表1)，引物中的下划线碱基部分是与pBUE411载体中的序列匹配。分别将sgRNA的2条oligo进行磷酸化，直接退火形成双链，体系为：PPO-gR1-TaU3-F(10μM)：4μL,PPO-gR1-TaU3-R(10uM)：4μL,10×T4 PNKbuffer:1.5μL,PNK:1μL,ATP:1μL,ddH2O补足15μL。程序在PCR仪中按下列条件运行：37℃,30min；95℃,5min；ramp to 25℃at5℃/min(0.08℃/s)。或者是沸水中煮5min，之后自然冷却至室温。
3.pBUE411载体的线性化
用BsaI的内切酶酶切pBUE411载体3h，电泳后回收线性载体片段，回收含有所述启动子A、所述终止子A、所述启动子B、所述终止子B的载体片段酶切电泳图如图2所示，1为pBUE411用BsaI酶切；2为DL2000 Marker；3为1kb Marker。
4.pBUE411载体与sgRNA的连接反应
连接反应体系为：5×ligation Buffer 2μL，annealed oligo duplex 4μL，pBUE411/BsaI 2ul(100ng)，T4 ligase 1μL，ddH2O补足10μL，25℃30min进行连接反应。
5.转化
将连接产物转化大肠杆菌，重组质粒经转化到DH5α感受态细胞，之后于LB(kan)平板上培养至克隆长出后，挑单克隆进行菌液PCR鉴定及测序，引物用的是pBUE411-F和pBUE411-R。测序结果(如图3)检测到了sgRNA的靶序列，同时在靶序列上游都检测到了TaU3启动子序列，测序结果说明sgRNA表达盒构建成功，并成功的组装进入pBUE411双元表达载体，证明了PPO的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建成功。
实验例2基因编辑载体的转化普通小麦
1.培养基配制：见文献Kan Wang(ed.),Agrobacterium Protocals:Volume 1,Methods in Molecular Biology,vol.1223DOI10.007/978-1-4939-1695-5_15,SpringScience+Businedd Media New York 2015
2.农杆菌转化：取授粉15天左右的小麦穗子，取粒剥胚。在试验前一天农杆菌悬浮液摇菌，160r，28度培养24小时，穗子准备好后，开始准备农杆菌悬浮液取1ml菌液于1.5ml离心管中，加入1.4ul乙酰丁香酮(0.1M)混匀。加入准备好的菌液侵染5分钟后放到共培培养基上，23度暗培养3天。共培后放到休息培养基上暗培养5天，25度。将愈伤转移至筛选培养基1上。用封口膜封好培养皿，在25.5度培养箱中暗培养2周。将愈伤切割后转移到筛选培养基2上。
用封口膜封好培养皿，在25.5度培养箱中暗培养2周。愈伤切割筛选2周后，表现有抗性的愈伤转移到再生培养基上。抗性愈伤一般有绿芽或者绿点，或者有美丽的米黄色球状结构。
糊状的和褐色的愈伤不要转移。有增生的愈伤可以再切成更小的愈伤。来自同一个愈伤的小块应该再摆到同一条线上。注意愈伤的方向，例如，绿芽和绿点朝上。
封好培养皿，放到25度培养箱中光照(16h)培养2周。再生2周后，将健康成长的小苗转移到新的抗性再生小盒里。待苗长到一定大小可以取样检测。
3.转基因苗的突变体检测
3.1T0代转基因株系阳性鉴定及突变体筛选
由于此次转化所用载体上T-DNA区域有cas9、bar和gRNA三个表达框，其中bar基因的表达检测已经非常成熟，已经有商业化的检测试剂条，样品经过粗磨后用试剂条在10分钟内就可以判断是否带有bar基因，比PCR扩增快速高效。因此，我们以未转基因植株作为阴性对照，利用bar基因检测试剂盒quickstixTM对转基因小麦T0植株进行检测，筛选阳性转基因苗子具体操作如下：
取转基因苗3-5cm,放入1.5m离心管中，用研磨棒研磨后加入Buffer 500μL，插入Bar试纸条，静置5min，根据试条显示带数纪录数据，2条带表示阳性，1条带代表阴性。上述试剂盒购自麦蒂森科技有限公司。
结果如图4所示，样品1-10为T0代再生苗，11为阳性对照，12为阴性对照，其中样品1,3,4,5,6,7,8,10出现两条带，与阳性对照11结果一致，为阳性苗；2,9出现一条带，与阴性对照一致数字1-10，分别代表ePPO-01，-02，-03,-04，-05，06，-07，-08，-09,-10。
3.2T0代转基因植株PSY基因的特异性扩增和突变体鉴定
目标基因编辑是否成功需要测序进行鉴定，本实验采用天津诺禾致源公司生产的Hi-TOM基因编辑位点检测试剂盒。该试剂盒通过PCR法自动完成高通量建库过程，并用Hi-TOM在线软件直接解析出多样品多位点的变异信息。利用靶向序列两侧的特异性引物(表1中的Primer-F和Primer-R)对PPO进行扩增，扩增产物建库后送到诺禾致源测序。目的基因小麦PPO基因的野生型核苷酸序列如SEQ11所示，其推导的氨基酸序列如图5所示，突变体的目的基因核苷酸序列如SEQ12所示，其推导的氨基酸序列如图6所示，如经比对，ePPO-2发生在+887处的核苷酸减少2个碱基GT，在突变序列的+1113处出现TGA，变成了终止密码子，造成蛋白质翻译的提前终止，核苷酸序列的比对结果如图7所示，标记为加粗下划线的部分为野生型和突变体有差异的部分，氨基酸序列比对结果如图8所示，标记为浅灰色的部分为野生型和突变体有差异的部分。
第一轮PCR反应体系：以转pBUE411-PPO基因的小麦植株叶片DNA为模板1μL，试剂盒中的2×Taq Master Mix 10μL,Primer-F和Primer-R(表1)(10μM)各0.5μL，Nuclease-free Water补足体积至20μL。PCR反应条件为：94℃变性2min；94℃变性30s，65℃复性30s，72℃延伸20s，共33个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后取5μL琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确保目标产物存在且特异性良好。
之后进行第二轮PCR反应，试剂盒中的Hi-TOM Mix 12μL，以第一轮PCR产物为模板加入1μL，Nuclease-free Water补足体积至20μL。PCR反应程序：94℃变性2min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸25s，共33个循环；最后72℃延伸5min。
扩增产物建库后送到诺禾致源测序。如图9所示(样品1-12为不同的转基因株系，M为DL2000 marker，——表示的是突变位点碱基变化)，在此处确实2个碱基GT，经比对，ePPO-2发生在+887处的核苷酸减少2个碱基GT，在突变序列的+1113处出现TGA，变成了终止密码子，造成蛋白质翻译的提前终止。
3.3基因编辑株系中PPO基因的表达量分析
应用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(天根，北京，中国)提取转基因植株和对照植株不同发育时期(7、14、21和28DPA)籽粒总RNA，检测各转基因株系在籽粒不同发育时期PPO基因的相对表达量。基于小麦籽粒PPO同源基因cDNA序列间的保守性和差异性，设计能同时扩增A、B、D基因组同源基因的保守性引物，用于qRT-PCR检测。普通小麦β-actin基因作为内参基因。qRT-PCR反应体系：2×SYBR Green Mix 5μL,Primer-F和Primer-R(表1)(10μM)各0.5μL，50ng cDNA,Nuclease-free Water补足体积至10μL。反应程序：95℃变性5min；95℃变性15s，60℃复性20s，72℃延伸20s，共40个循环。每个转基因株系选取3个生物学重复，每个样本3次技术重复。结果表明如图10所示(*表示P<0.05，WT表示野生型)，基因编辑株系中PPO基因的表达量显著降低。
表2 引物序列(二)
Figure BDA0002392528170000041
3.4PPO活性测定
称取0.25g面粉样品，以邻苯二酚为底物，加入3ml pH6.5的50mmol/L MOPS缓冲液，振荡浸提30min，然后加入1mL120mmol/L邻苯二酚，振荡反应20min，于10000g/min离心10min，以缓冲液加邻苯二酚作对照，取上清液在405nm测定吸光值。每个转基因系测定3个生物学重复，每个样品重复检测三次。结果表明，与未转基因对照小麦相比(13.16min-1g-1)，基因编辑株系籽粒中多酚氧化酶(PPO活性)显著降低(8.72min-1g-1)。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院蔬菜所
<120> 一种利用基因编辑降低小麦籽粒多酚氧化酶含量的方法
<130> 0
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 527
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catgaatcca aaccacacgg agttcaaatt cccacagatt aaggctcgtc cgtcgcacaa 60
ggtaatgtgt gaatattata tctgtcgtgc aaaattgcct ggcctgcaca attgctgtta 120
tagttggcgg cagggagagt tttaacattg actagcgtgc tgataatttg tgagaaataa 180
taattgacaa gtagatactg acatttgaga agagcttctg aactgttatt agtaacaaaa 240
atggaaagct gatgcacgga aaaaggaaag aaaaagccat actttttttt aggtaggaaa 300
agaaaaagcc atacgagact gatgtctctc agatgggccg ggatctgtct atctagcagg 360
cagcagccca ccaacctcac gggccagcaa ttacgagtcc ttctaaaagc tcccgccgag 420
gggcgctggc gctgctgtgc agcagcacgt ctaacattag tcccacctcg ccagtttaca 480
gggagcagaa ccagcttata agcggaggcg cggcaccaag aagcggc 527
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<211> 1992
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60
agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120
tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180
tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240
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cacgcgcagg aagaatcgca tctgctacct gcaggagatt ttctccaacg agatggcgaa 3600
ggttgacgat tctttcttcc acaggctgga ggagtcattc ctcgtggagg aggataagaa 3660
gcacgagcgg catccaatct tcggcaacat tgtcgacgag gttgcctacc acgagaagta 3720
ccctacgatc taccatctgc ggaagaagct cgtggactcc acagataagg cggacctccg 3780
cctgatctac ctcgctctgg cccacatgat taagttcagg ggccatttcc tgatcgaggg 3840
ggatctcaac ccggacaata gcgatgttga caagctgttc atccagctcg tgcagacgta 3900
caaccagctc ttcgaggaga accccattaa tgcgtcaggc gtcgacgcga aggctatcct 3960
gtccgctagg ctctcgaagt ctcggcgcct cgagaacctg atcgcccagc tgccgggcga 4020
gaagaagaac ggcctgttcg ggaatctcat tgcgctcagc ctggggctca cgcccaactt 4080
caagtcgaat ttcgatctcg ctgaggacgc caagctgcag ctctccaagg acacatacga 4140
cgatgacctg gataacctcc tggcccagat cggcgatcag tacgcggacc tgttcctcgc 4200
tgccaagaat ctgtcggacg ccatcctcct gtctgatatt ctcagggtga acaccgagat 4260
tacgaaggct ccgctctcag cctccatgat caagcgctac gacgagcacc atcaggatct 4320
gaccctcctg aaggcgctgg tcaggcagca gctccccgag aagtacaagg agatcttctt 4380
cgatcagtcg aagaacggct acgctgggta cattgacggc ggggcctctc aggaggagtt 4440
ctacaagttc atcaagccga ttctggagaa gatggacggc acggaggagc tgctggtgaa 4500
gctcaatcgc gaggacctcc tgaggaagca gcggacattc gataacggca gcatcccaca 4560
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cctcaaggat aaccgcgaga agatcgagaa gattctgact ttcaggatcc cgtactacgt 4680
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cctgtactac ctccagaatg gccgcgatat gtatgtggac caggagctgg atattaacag 5820
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tgacaacaag gtcctcacca ggtcggacaa gaaccggggc aagtctgata atgttccttc 5940
agaggaggtc gttaagaaga tgaagaacta ctggcgccag ctcctgaatg ccaagctgat 6000
cacgcagcgg aagttcgata acctcacaaa ggctgagagg ggcgggctct ctgagctgga 6060
caaggcgggc ttcatcaaga ggcagctggt cgagacacgg cagatcacta agcacgttgc 6120
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ctacaaggtt cgggagatca acaattacca ccatgcccat gacgcgtacc tgaacgcggt 6300
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ctacaaggtt tacgatgtga ggaagatgat cgccaagtcg gagcaggaga ttggcaaggc 6420
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ggccaatggc gagatccgga agcgccccct catcgagacg aacggcgaga cgggggagat 6540
cgtgtgggac aagggcaggg atttcgcgac cgtcaggaag gttctctcca tgccacaagt 6600
gaatatcgtc aagaagacag aggtccagac tggcgggttc tctaaggagt caattctgcc 6660
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caagtccaag aagctcaaga gcgtgaagga gctgctgggg atcacgatta tggagcgctc 6840
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tgttttttct cttatttgtt gtgtgttgaa tttgaaatta taagagatat gcaaacattt 7800
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cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc 9840
tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca aaatccagta ctaaaatcca gatcccccga 9900
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agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca gctccccgac 10020
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tcctgctaag gtatataagc tggtgggaga aaatgaaaac ctatatttaa aaatgacgga 10560
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gcaagtattc tactttatgc gactaaaaca cgcgacaaga aaacgccagg aaaagggcag 16020
ggcggcagcc tgtcgcgtaa cttaggactt gtgcgacatg tcgttttcag aagacggctg 16080
cactgaacgt cagaagccga ctgcactata gcagcggagg ggttggatca aagtactttg 16140
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ttcccggacc tggagctcca gatacacaac tgctggctct tcttcccatg gcacaggttc 600
tacctctact tccacgagag gatcctcggc aagctcatcg gcgacgacac cttcgcgctg 660
cccttctgga actgggacgc gccggccggc atgacgctgc cggccatcta cgccgacagg 720
tcgtcgccgc tctacgacga gaggcgcgac cccgcgcacc agccgccggt gctggtcgac 780
cttgactcca gtgggtccga caccaatatc ccaagagacc agcagatcga cgagaacctc 840
aagatcatgt accgccagat gatttcgaac gcgaagaaga cgctgctgtt cctgggacag 900
ccgtaccgcg ccggcgacca gccggacccg ggcgccggct ccctggagaa cgtgccgcac 960
ggcacggtcc acgtctggac tggcgaccca aggcagccca acttggcgga catgggcaac 1020
ttcttctcgg cggcgcgcga ccccatcttc ttcgcgcacc acggcaacat cgaccgcctg 1080
tggcacgtct ggcgcggcct ccgcccgagc aacactgact tcaccgaccc cgactggctc 1140
gacgccgcct tcctcttcta cgacgaggag gcccgccccg tgcgcgtgcg cgtccgggac 1200
tgcctcgacc cggccgcgct gcggtacatg taccaggacg tcggcctgcc gtggctcaac 1260
gccaggccgg ccaaggcgtc cggcgggacg ccggcgcccg ccaccaccgg taccctccct 1320
gccaccctgg acagcaccat acgggtgacc gtgacgaggc ccagggtgtc gaggagccgc 1380
cgggaaaagg acgaggagga ggaggtgctg gtcgtggagg ggatcgagat cgccgaccat 1440
ttcaacaagt tcatcaagtt cgacgtgctg gtgaacgagc ccgagggagg ggtggacggc 1500
acgccggcga cggcgacggg gtactgcgcc gggagcttcg cgcacacgcc gcacatggtc 1560
cggcccgagg agacgaggaa ggggtcggtc aagacggtgg cgaggttcgg cgtgtgcgac 1620
ctgatggacg acatcggagc ggacggcgac cagacggtgg tcgtgtcgct cgtacccagg 1680
tgcggcggtg agctggtcac cgtaggcggc gtcagcatca gctacctcaa gtga 1734
<210> 12
<211> 1732
<212> DNA
<213> 序列
<400> 12
atggagagca gtcgcatgcc actgagtgcc acccctcgca tgccatgcag cctccaaacc 60
cttgcgcgcc gcaaccttct ccgtggcctt cacctccgga aggacgcgag gcagccacgg 120
cgtctctcag tctcatgcga ggcgaccggc ggctgccgcg tcgaccgccg tgaggtgctc 180
ctcggtctcg gcggcgccgc ggctgccggt ctggccacgg acaaaggtcg aggcgcgatc 240
gccgcgccca tccaggcccc ggacctccgc aactgccaaa cgcccgagct cccgaacacg 300
ccgccggaca ccaactgctg cccgacgccc ggcaccggca tcaccgactt cgtgctgccg 360
cccgtctcct cgccgctccg cgtgcgtccg gcagcgcacc tggtggacgc ggggtacctg 420
gccaagtacg agagggccgt ggcgctcatg aagcagctgc ccgccgacga cccgcgcagc 480
ttcgagcagc agtggcacgt gcactgcgcc tactgcgacg ccgcctacga ccaggtcggg 540
ttcccggacc tggagctcca gatacacaac tgctggctct tcttcccatg gcacaggttc 600
tacctctact tccacgagag gatcctcggc aagctcatcg gcgacgacac cttcgcgctg 660
cccttctgga actgggacgc gccggccggc atgacgctgc cggccatcta cgccgacagg 720
tcgtcgccgc tctacgacga gaggcgcgac cccgcgcacc agccgccggt gctggtcgac 780
cttgactcca gtgggtccga caccaatatc ccaagagacc agcagatcga cgagaacctc 840
aagatcatgt accgccagat gatttcgaac gcgaagaaga cgctgcttcc tgggacagcc 900
gtaccgcgcc ggcgaccagc cggacccggg cgccggctcc ctggagaacg tgccgcacgg 960
cacggtccac gtctggactg gcgacccaag gcagcccaac ttggcggaca tgggcaactt 1020
cttctcggcg gcgcgcgacc ccatcttctt cgcgcaccac ggcaacatcg accgcctgtg 1080
gcacgtctgg cgcggcctcc gcccgagcaa cactgacttc accgaccccg actggctcga 1140
cgccgccttc ctcttctacg acgaggaggc ccgccccgtg cgcgtgcgcg tccgggactg 1200
cctcgacccg gccgcgctgc ggtacatgta ccaggacgtc ggcctgccgt ggctcaacgc 1260
caggccggcc aaggcgtccg gcgggacgcc ggcgcccgcc accaccggta ccctccctgc 1320
caccctggac agcaccatac gggtgaccgt gacgaggccc agggtgtcga ggagccgccg 1380
ggaaaaggac gaggaggagg aggtgctggt cgtggagggg atcgagatcg ccgaccattt 1440
caacaagttc atcaagttcg acgtgctggt gaacgagccc gagggagggg tggacggcac 1500
gccggcgacg gcgacggggt actgcgccgg gagcttcgcg cacacgccgc acatggtccg 1560
gcccgaggag acgaggaagg ggtcggtcaa gacggtggcg aggttcggcg tgtgcgacct 1620
gatggacgac atcggagcgg acggcgacca gacggtggtc gtgtcgctcg tacccaggtg 1680
cggcggtgag ctggtcaccg taggcggcgt cagcatcagc tacctcaagt ga 1732
<210> 13
<211> 4107
<212> DNA
<213> 序列
<400> 13
atggacaaga agtactcgat cggcctcgat attgggacta actctgttgg ctgggccgtg 60
atcaccgacg agtacaaggt gccctcaaag aagttcaagg tcctgggcaa caccgatcgg 120
cattccatca agaagaatct cattggcgct ctcctgttcg acagcggcga gacggctgag 180
gctacgcggc tcaagcgcac cgcccgcagg cggtacacgc gcaggaagaa tcgcatctgc 240
tacctgcagg agattttctc caacgagatg gcgaaggttg acgattcttt cttccacagg 300
ctggaggagt cattcctcgt ggaggaggat aagaagcacg agcggcatcc aatcttcggc 360
aacattgtcg acgaggttgc ctaccacgag aagtacccta cgatctacca tctgcggaag 420
aagctcgtgg actccacaga taaggcggac ctccgcctga tctacctcgc tctggcccac 480
atgattaagt tcaggggcca tttcctgatc gagggggatc tcaacccgga caatagcgat 540
gttgacaagc tgttcatcca gctcgtgcag acgtacaacc agctcttcga ggagaacccc 600
attaatgcgt caggcgtcga cgcgaaggct atcctgtccg ctaggctctc gaagtctcgg 660
cgcctcgaga acctgatcgc ccagctgccg ggcgagaaga agaacggcct gttcgggaat 720
ctcattgcgc tcagcctggg gctcacgccc aacttcaagt cgaatttcga tctcgctgag 780
gacgccaagc tgcagctctc caaggacaca tacgacgatg acctggataa cctcctggcc 840
cagatcggcg atcagtacgc ggacctgttc ctcgctgcca agaatctgtc ggacgccatc 900
ctcctgtctg atattctcag ggtgaacacc gagattacga aggctccgct ctcagcctcc 960
atgatcaagc gctacgacga gcaccatcag gatctgaccc tcctgaaggc gctggtcagg 1020
cagcagctcc ccgagaagta caaggagatc ttcttcgatc agtcgaagaa cggctacgct 1080
gggtacattg acggcggggc ctctcaggag gagttctaca agttcatcaa gccgattctg 1140
gagaagatgg acggcacgga ggagctgctg gtgaagctca atcgcgagga cctcctgagg 1200
aagcagcgga cattcgataa cggcagcatc ccacaccaga ttcatctcgg ggagctgcac 1260
gctatcctga ggaggcagga ggacttctac cctttcctca aggataaccg cgagaagatc 1320
gagaagattc tgactttcag gatcccgtac tacgtcggcc cactcgctag gggcaactcc 1380
cgcttcgctt ggatgacccg caagtcagag gagacgatca cgccgtggaa cttcgaggag 1440
gtggtcgaca agggcgctag cgctcagtcg ttcatcgaga ggatgacgaa tttcgacaag 1500
aacctgccaa atgagaaggt gctccctaag cactcgctcc tgtacgagta cttcacagtc 1560
tacaacgagc tgactaaggt gaagtatgtg accgagggca tgaggaagcc ggctttcctg 1620
tctggggagc agaagaaggc catcgtggac ctcctgttca agaccaaccg gaaggtcacg 1680
gttaagcagc tcaaggagga ctacttcaag aagattgagt gcttcgattc ggtcgagatc 1740
tctggcgttg aggaccgctt caacgcctcc ctggggacct accacgatct cctgaagatc 1800
attaaggata aggacttcct ggacaacgag gagaatgagg atatcctcga ggacattgtg 1860
ctgacactca ctctgttcga ggaccgggag atgatcgagg agcgcctgaa gacttacgcc 1920
catctcttcg atgacaaggt catgaagcag ctcaagagga ggaggtacac cggctggggg 1980
aggctgagca ggaagctcat caacggcatt cgggacaagc agtccgggaa gacgatcctc 2040
gacttcctga agagcgatgg cttcgcgaac cgcaatttca tgcagctgat tcacgatgac 2100
agcctcacat tcaaggagga tatccagaag gctcaggtga gcggccaggg ggactcgctg 2160
cacgagcata tcgcgaacct cgctggctcg ccagctatca agaaggggat tctgcagacc 2220
gtgaaggttg tggacgagct ggtgaaggtc atgggcaggc acaagcctga gaacatcgtc 2280
attgagatgg cccgggagaa tcagaccacg cagaagggcc agaagaactc acgcgagagg 2340
atgaagagga tcgaggaggg cattaaggag ctggggtccc agatcctcaa ggagcacccg 2400
gtggagaaca cgcagctgca gaatgagaag ctctacctgt actacctcca gaatggccgc 2460
gatatgtatg tggaccagga gctggatatt aacaggctca gcgattacga cgtcgatcat 2520
atcgttccac agtcattcct gaaggatgac tccattgaca acaaggtcct caccaggtcg 2580
gacaagaacc ggggcaagtc tgataatgtt ccttcagagg aggtcgttaa gaagatgaag 2640
aactactggc gccagctcct gaatgccaag ctgatcacgc agcggaagtt cgataacctc 2700
acaaaggctg agaggggcgg gctctctgag ctggacaagg cgggcttcat caagaggcag 2760
ctggtcgaga cacggcagat cactaagcac gttgcgcaga ttctcgactc acggatgaac 2820
actaagtacg atgagaatga caagctgatc cgcgaggtga aggtcatcac cctgaagtca 2880
aagctcgtct ccgacttcag gaaggatttc cagttctaca aggttcggga gatcaacaat 2940
taccaccatg cccatgacgc gtacctgaac gcggtggtcg gcacagctct gatcaagaag 3000
tacccaaagc tcgagagcga gttcgtgtac ggggactaca aggtttacga tgtgaggaag 3060
atgatcgcca agtcggagca ggagattggc aaggctaccg ccaagtactt cttctactct 3120
aacattatga atttcttcaa gacagagatc actctggcca atggcgagat ccggaagcgc 3180
cccctcatcg agacgaacgg cgagacgggg gagatcgtgt gggacaaggg cagggatttc 3240
gcgaccgtca ggaaggttct ctccatgcca caagtgaata tcgtcaagaa gacagaggtc 3300
cagactggcg ggttctctaa ggagtcaatt ctgcctaagc ggaacagcga caagctcatc 3360
gcccgcaaga aggactggga tccgaagaag tacggcgggt tcgacagccc cactgtggcc 3420
tactcggtcc tggttgtggc gaaggttgag aagggcaagt ccaagaagct caagagcgtg 3480
aaggagctgc tggggatcac gattatggag cgctccagct tcgagaagaa cccgatcgat 3540
ttcctggagg cgaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tgatcattaa gctccccaag 3600
tactcactct tcgagctgga gaacggcagg aagcggatgc tggcttccgc tggcgagctg 3660
cagaagggga acgagctggc tctgccgtcc aagtatgtga acttcctcta cctggcctcc 3720
cactacgaga agctcaaggg cagccccgag gacaacgagc agaagcagct gttcgtcgag 3780
cagcacaagc attacctcga cgagatcatt gagcagattt ccgagttctc caagcgcgtg 3840
atcctggccg acgcgaatct ggataaggtc ctctccgcgt acaacaagca ccgcgacaag 3900
ccaatcaggg agcaggctga gaatatcatt catctcttca ccctgacgaa cctcggcgcc 3960
cctgctgctt tcaagtactt cgacacaact atcgatcgca agaggtacac aagcactaag 4020
gaggtcctgg acgcgaccct catccaccag tcgattaccg gcctctacga gacgcgcatc 4080
gacctgtctc agctcggggg cgactga 4107

Claims (8)

1.一种具有敲除PPO基因功能的pBUE411-PPO双元载体，其特征在于，包括表达盒A和表达盒B；
所述表达盒A具体自上游至下游依次包括如下元件：来自小麦的TaU3启动子A，所述PPO基因的sgRNA、终止子A；
所述表达盒B具体自上游至下游依次包括如下元件：启动子B、玉米Cas9编码序列、终止子B；
所述PPO基因的sgRNA的序列如SEQ ID NO.10所示；
所述玉米Cas9编码序列如SEQ ID NO.13所示；
所述启动子A的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述启动子B序列如SEQ ID NO.2所示；
所述终止子A序列如SEQ ID NO.3所示；
所述终止子B序列如SEQ ID NO.4所示;
所述pBUE411-PPO双元载体含有抗性标记基因，所述标记基因为bar基因；
所述pBUE411-PPO双元载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.根据权利要求1所述的pBUE411-PPO双元载体，其特征在于，所述表达盒A具体可如序列SEQ ID NO.5所示；
所述表达盒B具体可如序列SEQ ID NO.6所示；
所述表达盒A位于所述表达盒B的上游，表达盒A和表达盒B相互串联。
3.如权利要求1或2所述的pBUE411-PPO双元载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S11：根据靶向PPO基因设计其sgRNA，sgRNA的寡核苷酸对应的是PPO-gR1-TaU3-F和PPO-gR1-TaU3-R，即PPO-gR1-TaU3-F序列如SEQ ID NO.8所示，PPO-gR1-TaU3-R序列如SEQID NO.9所示；
S12：将步骤S11合成的sgRNA的2条寡核苷酸进行磷酸化和退火形成双链，获得带有粘性末端的双链sgRNA；
S13：利用限制性内切酶BsaI酶切pBUE411载体，回收含有所述启动子A、所述终止子A、所述启动子B、所述终止子B的载体片段；
S14：将步骤S13回收的pBUE411载体片段和步骤S12获得的双链sgRNA通过T4连接酶进行连接反应，获得最终的pBUE411-PPO双元载体。
4.根据权利要求3所述的pBUE411-PPO双元载体的构建方法，其特征在于，所述PPO基因为GENBANK ACCESSION NUMBER：EF070147.1所示的DNA。
5.如权利要求1-3任一项所述pBUE411-PPO双元载体在降低小麦胚乳中PPO基因表达水平中的应用。
6.如权利要求1-3任一项所述pBUE411-PPO双元载体在小麦面粉色泽改良中的应用。
7.如权利要求1-3任一项所述pBUE411-PPO双元载体在培育转基因小麦中的应用。
8.一种利用基因编辑降低小麦籽粒多酚氧化酶含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1构建如权利要求1-3任一项所述的pBUE411-PPO双元载体；
S2 将步骤S1获得的pBUE411-PPO双元载体通过农杆菌转化到普通小麦中，获得转基因小麦。
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