CN111110835A - 一种肠碱性磷酸酶的新应用及其制剂的细胞活性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明采用新鲜提取的人白细胞分泌炎症因子TNF‑α和IL‑6的细胞模型，在存在和不存在LPS的条件下研究了肠碱性磷酸酶对人白细胞分泌炎症因子的抑制作用，发现肠碱性磷酸酶可以在不存在LPS的条件下(不依赖内毒素)抑制人白细胞的TNF‑α和IL‑6分泌，且其作用机制是使相应底物脱磷酸产生腺苷等物质进而抑制TNF‑α和IL‑6分泌。基于上述研究本发明公开了一种肠碱性磷酸酶作为非内毒素依赖的人白细胞的TNF‑α和/或IL‑6分泌抑制剂的应用，以及肠碱性磷酸酶在制备治疗非内毒素依赖的人白细胞疾病部位TNF‑α和/或IL‑6分泌增多相关炎症性疾病药物中的应用以及一种产业化或商业化的肠碱性磷酸酶制剂的细胞活性检测方法，本发明大大拓宽了碱性磷酸酶的应用。

Description

一种肠碱性磷酸酶的新应用及其制剂的细胞活性检测方法

技术领域

本发明涉及碱性磷酸酶领域，特别是涉及一种肠碱性磷酸酶的新应用及其制剂的细胞活性检测方法。

背景技术

碱性磷酸酶分多个亚型(TNAP、IAP、PLAP)，广泛分布于人体的不同组织，包括心、脑、胎盘血管的上皮细胞、肠道粘膜、肝脏细胞等(参考文献1、2、3、4、5)。然而，肠碱性磷酸酶的生理功能半世纪来尚不明确。最早普遍认为碱性磷酸酶的功能是参与骨钙化(参考文献6)。发明人在90年代早期采用基因转移技术使碱性磷酸酶基因进入不同细胞，发现碱性磷酸酶与病理性血管钙化有关(参考文献7、8)。如此广泛分布的碱性磷酸酶的主要生理功能是什么呢？荷兰科学家Poelstra和Meijer揭开了谜底(参考文献9)，肠碱性磷酸酶灭活内毒素的活性被首次报道。这个研究提示广泛分布的碱性磷酸酶能抑制体内和体表由内毒素引发的炎症。通过将肠碱性磷酸酶基因敲除，Bhan和Sonoko发现没有肠碱性磷酸酶的动物发生糖尿病(10)和高血脂(11)。荷兰的生物制药公司AM-Pharma的Peters和Lukas使用重组人肠碱性磷酸酶治疗内毒素相关的脓毒血症肾损伤和结肠炎(1213)。

大量研究表明白细胞中的中性粒细胞是引发人类炎症性疾病的重要细胞(参考文献14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24)，中性粒细胞迁移到发炎组织中的行为就像一把双刃剑，虽然帮助去除入侵微生物，但是引发炎症性疾病，其作用机制之一是通过分泌主要炎症因子TNF-α而引发炎症性疾病。

上述对应的参考文献分别为：

1.Schultz-Hector S,Balz K,

M,et al.Cellular localization ofendothelial alkaline phosphatase reaction product and enzyme protein in themyocardium[J].Journal of Histochemistry&Cytochemistry Official Journal of theHistochemistry Society,1993,41(12):1813.

2.Bell M A,Scarrow W G.Staining for microvascular alkalinephosphatase in thick celloidin sections of nervous tissue:Morphometric andpathological applications[J].Microvascular Research,1984,27(2):189-203

3.Birgit H,Sarah C,Nina M,et al.Relation of placental alkalinephosphatase expression in human term placenta with maternal and offspring fatmass[J].International Journal of Obesity,2018.

4.Bell L,Williams L.Histochemical demonstration of alkalinephosphatase in human intestine,normal and diseased[J].Histochemistry,1979,60(1):85-89.

5.HAGerstrand I,Lindholm K,Lindroth Y.Endothelial and BileCanalicular Alkaline Phosphatase in Human Liver and Serum[J].ScandinavianJournal of Clinical&Laboratory Investigation,1976,36(2):131-135.

6.Millan JL,Whyte MP(2016),Alkaline phosphatase and hypophosphatasia,Calcif Tissue Int 98(4):398-416.

7.Hui M,Li SQ,Holmyard D,Cheng PT(1997)Stable transfection of non-osteo-genic cell lines with tissue non specific alkaline phosphatase enhancesmineral deposition both in the presence and absence of beta glycerophosphate:Possible role for alkaline phosphatase in pathologi-cal mineralization.CalcifTissue Int 60:467-472.

8.Hui M,TenenbaumH C.New face of an old enzyme:Alkaline phosphatasemay contribute to human tissue aging by inducing tissue hardening andcalcification[J].Anatomical Record,1998,253(3):91-94.

9.Poelstra K,Bakker WW,Klok PA,Hardonk MJ,Meijer DK(1997),Aphysiologic function for alkaline phosphatase:endotoxin detoxification.LabInvest,76:319–327.

10.Bhan A,Alam S N,Raychowdhury A,et al.Intestinal alkalinephosphatase prevents metabolic syndrome in mice.[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(17):7003-7008.

11.Sonoko Narisawa,Lei Huang,Arata Iwasaki,Hideaki Hasegawa,DavidH.Alpers,and Jose Luis Millan(2003),Accelerated Fat Absorption in IntestinalAlkaline Phosphatase Knockout Mice.MOLECULAR AND CELLULAR B IOLOGY,23(21):7525–7530.

12.Peters E,Mehta R L,Murray P T,et al.Study protocol for amulticentre randomised controlled trial:Safety,Tolerability,efficacy andquality of life Of a human recombinant alkaline Phosphatase in patients withsepsis-associated Acute Kidney Injury(STOP-AKI)[J].BMJ Open,2016,6(9):e012371

13.Lukas M1,Drastich P,Konecny M,Gionchetti P,Urban O,Cantoni F,Bortlik M,Duricova D,Bulitta M.，Exogenous alkaline phosphatase for thetreatment of patients with moderate to severe ulcerative colitis[J].Inflammatory Bowel Diseases,2010,16(7):1180-1186.

14.Moritz Peiseler,Paul Kubes.More friend than foe:the emerging roleof neutrophils in tissue repair[J].The journal of clinical investigation,2019,129(7):2629-2639.

15.Suzuki K,Exhaustive Exercise-Induced Neutrophil-Associated TissueDamage and Possibility of its Prevention[J].Journal of Nanomedicine&Biotherapeutic Discovery,2017,07(02).

16.Davalyn R.Powell,Anna Huttenlocher.Neutrophils in the TumorMicroenvironment[J].Trends in Immunology,2016,37(1):41-52.

17.Alice E Jasper,William J McIver,Elizabeth Sapey,etc.Understandingthe role of neutrophils in chronic inflammatory airway disease[J].F1000Research,2019,8:557-574.

18.Kovtun A,Messerer D A C,Scharffetter-Kochanek K,et al.Neutrophilsin Tissue Trauma of the Skin,Bone,and Lung:Two Sides of the Same Coin[J].Journal of Immunology Research,2018,2018:1-12.

19.Williams A E,Chambers R C.Neutrophils and tissue damage:is hypoxiathe key to excessive degranulation？[J].Thorax,2016,71(11):977-978.

20.Wright H L,Moots R J,Bucknall R C,et al.Neutrophil function ininflammation and inflammatory diseases[J].Rheumatology,2010,49(9):1618-1631.

21.Katsuhiko Suzuki.Involvement of neutrophils in exercise-inducedmuscle damage and its modulation[J].General Internal Medicine and ClinicalInnovations,2018，3(3):1-8.

22.Can Yang Zhang,Xinyue Dong,Jin Gao,etc.Nanoparticle-inducedneutrophil apoptosis increases survival in sepsis and alleviates neurologicaldamage in stroke[J].Sci.Adv.,2019,5(11):2375-2548.

23.Esmaeil Mortaz,Shamila D.Alipoor,Ian M.Adcock,etc.Update onNeutrophil Function in Severe Inflammation[J].Front Immunol,2018,9:2171-2185.

24.Peters E,Heuberger J A A C,Tiessen R,et al.PharmacokineticModeling and Dose Selection in a Randomized,Double-Blind,Placebo-ControlledTrial of a Human Recombinant Alkaline Phosphatase in Healthy Volunteers[J].Clinical Pharmacokinetics,2016,55(10):1227-1237.

由此可见，上述现有技术对碱性磷酸酶的生物活性、生理功能以及临床应用的研究还较为有限，还有进一步开发的空间。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种碱性磷酸酶的新应用。

为解决上述技术问题，本发明主要通过建立一个人体细胞活性实验来研究肠碱性磷酸酶的未知生物活性、生理功能和新临床应用。本发明使用新鲜提取的人白细胞分泌炎症因子TNF-α和IL-6的细胞学方法，在存在和不存在LPS的条件下研究了肠碱性磷酸酶对人白细胞炎症因子的抑制作用_。通过相应研究发现，肠碱性磷酸酶可以在不存在LPS的条件下(不依赖内毒素)抑制人白细胞的TNF-α和/或IL-6分泌。

基于上述研究获得本发明的碱性磷酸酶的新应用，包括如下技术方案：

一种肠碱性磷酸酶作为在没有内毒素存在的情况下人白细胞的TNF-α和/或IL-6分泌抑制剂的应用。

作为本发明进一步地改进，所述肠碱性磷酸酶通过使底物ATP、ADP和/或AMP去磷酸化，产生的腺苷或AMP抑制人白细胞TNF-α和/或IL-6分泌。

进一步地，所述肠碱性磷酸酶通过使底物去磷酸化抑制人白细胞TNF-α和/或IL-6分泌；所述底物为细胞降解产物中的GTP、CTP、TTP、UTP、以及GDP、GMP、CDP、CMP、TDP、TMP、UDP、UMP中的任一种；或所述底物为细胞表面蛋白。

进一步地，所述肠碱性磷酸酶在人白细胞移走聚集所在的疾病部位起作用。

进一步地，所述肠碱性磷酸酶采用注射液形式。

进一步地，所述肠碱性磷酸酶为重组或提取的肠碱性磷酸酶。

另一方面，基于上述研究，本发明还提供了一种肠碱性磷酸酶在制备治疗在没有内毒素存在的情况下人白细胞疾病部位TNF-α和/或IL-6分泌增多相关炎症性疾病药物中的应用以及其在治疗在没有内毒素存在的情况下人白细胞移走聚集所在的疾病部位分泌TNF-α和/或IL-6增多相关炎症性疾病中的应用。

再一方面，基于上述研究，本发明还提供了一种产业化或商业化的肠碱性磷酸酶制剂的细胞活性检测方法，采用人或动物白细胞TNF-α和IL-6分泌的细胞模型进行细胞活性检测；通过检测在没有内毒素存在的情况下人或动物白细胞分泌TNF-α和IL-6的水平来判断肠碱性磷酸酶制剂活性。

进一步地，所述人或动物白细胞TNF-α和IL-6分泌的细胞模型采用：白细胞和人脐静脉内皮细胞系(HUVECs)相互作用模型；或白细胞、红细胞和人脐静脉内皮细胞系间相互作用模型；所述动物为犬。

通过采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：

1、本发明首次发现肠碱性磷酸酶可以不依赖LPS抑制人白细胞TNF-α和IL-6的分泌，进而可以用于治疗白细胞移走聚集所在的疾病部位分泌TNF-α和/或IL-6增多相关炎症性疾病，属于一种广谱抗炎药，大大拓宽了现有肠碱性磷酸酶的应用，使其不仅限于对内毒素诱发的TNF-α和IL-6炎症因子起治疗作用。

2、本发明的肠碱性磷酸酶主要在血液中起作用，在血液中ATP作为能量而非致炎因子存在(在肠道中ATP作为致炎因子存在)，肠碱性磷酸酶通过将血液中的ATP去磷酸化获得中间产物AMP及终产物腺苷，其中终产物腺苷可以抑制新鲜提取的人白细胞分泌TNF-α和IL-6，中间产物AMP可以部分抑制人白细胞分泌TNF-α和IL-6。

3、本发明针对新发现的上述肠碱性磷酸酶作用机制，提供了其对应的产业化或商业化制剂的细胞活性检测方法，用于产品是否合格的质量控制。

附图说明

上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

图1是除热原后含有高浓度recIAP的溶液用SDS-PAGE电泳检测结果图；

图2是除热原后含有高浓度recIAP的溶液用高压液相HPLC分子筛柱检测结果图；

图3是recIAP与LPS共孵育3小时后LPS活力的降低与recIAP的剂量关系检测结果图；

图4是利用人白细胞和HUVECs以及白细胞、红细胞和HUVECs互相间作用模型研究LPS对TNF-α分泌的影响的检测结果图；

图5(A、B、C、D、E、F)是肠碱性磷酸酶在有或没有LPS存在的情况下抑制人白细胞(主要是人中性粒细胞)分泌的炎症因子TNF-α和IL-6的检测结果图；

图6(A、B、C、D)是提取牛肠碱性磷酸酶(bIAP)和recIAP在有或无LPS的情况下抑制人白细胞分泌TNF-α和IL-6的检测结果图；

图7(A、B、C)是recIAP在不同PH值条件下使ATP、ADP、AMP脱磷并制造产物ADP、AMP和腺苷的检测结果图；

图8(A、B、C、D)是ATP及其脱磷的产物ADP、AMP、和腺苷对白细胞分泌的TNF-α的抑制效果检测结果图。

图9(A、B、C、D)是recIAP(0.043U/mL)在不同pH条件下对0.5mM GTP、CTP、UTP和TTP的脱磷效果。

图10(A、B、C、D)是GTP、CTP、UTP和TTP的脱磷产物鸟苷、胞苷、尿苷和胸苷对白细胞分泌的TNF-α的抑制效果检测结果图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明进行说明，此处所描述的实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

目的：重组人肠碱性磷酸酶表达和生产

方法：本发明使用一种嵌合型重组人肠碱性磷酸酶(recIAP)cDNA(参考文献24、25)构建表达载体pMH3-recIAP(参考文献26)，然后将构建的pMH3-recIAP转入CHO-S细胞(CVCL_7183，Life Technologies)。使用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液经过G418加压筛选获得稳定高表达的细胞克隆作为收获蛋白的种子细胞系，经动物细胞生物反应器扩大培养，获取丰收液进行纯化处理，既将丰收液离心浓缩加入阴离子柱(QXK50，GEHealthcare)，收集含有高浓度recIAP部分的洗脱液经中空纤维柱(博格隆生物技术有限公司)除热原后备用。将除热原后含有高浓度recIAP的溶液用SDS-PAGE电泳和高压液相HPLC分子筛柱做纯度检测，将获得的纯度92.45％的recIAP蛋白液用于以下研究。

讨论：AM-Pharma的recIAP每支注射液的浓度为7036U(11.26mg)/ml(参考文献24)，比活性为625U/mg，注射液纯度为99％。本发明使用的recIAP比活性为578U/mg，纯度为92.45％,接近AM-Pharma的recIAP的比活性。

结论：由图1、2所示的结果可知，本发明获得了纯度92.45％的recIAP蛋白液用于以下实施例研究。

参考文献：

25.Tina K M,Sheen C R,Silva G K C D,et al.Catalytic Signature of aHeat-Stable,Chimeric Human Alkaline Phosphatase with Therapeutic Potential[J].PLoS ONE,2014,9(2):e89374-.

26.Qian Jia,HongTao Wu,XingJun Zhou,Jian Gao,Wei Zhao,JouDi Aziz,JingShuang Wei,Lihua Hou,Shuyin Wu,Ying Zhang,XiangFeng Dong,YanMin Huang,WeiYuan Jin,HongJie Zhu,XinHui Zhao,ChunHua Huang,LiPing Xing,Liwen Li,JunMa,Xiyan Liu,Ran Tao,ShuaiDong Ye,YiGao Song,LingLing Song,GuanPing Chen,ChunLing Du,XueTing Zhang,Bo Li,YanTao Wang,Wei Yang,Gilbert Rishton,YuYangTeng,GouQing Leng,LuanFeng Li,WenXi an Liu,Li Jun Cheng,QiuBo Liang,ZhengWuLi,XiuQin Zhang,Yajun Zuo,We i Chen,Huicheng Li,Matthew(Mizhou)Hui.A“GC-rich”method for mammalian gene expression:a dominant role of non-coding DNA GCcontent inregulation of mammalian gene expression.Science China Life Science,2010,53(1):94–100.

实施例2

目的：重组人肠碱性磷酸酶灭活LPS依赖pH和剂量

方法：

1.肠碱性磷酸酶活性检测

使用磷酸苯二钠比色法(TE0007，北京雷根生物技术有限公司)测定碱性磷酸酶活性。磷酸苯二钠在碱性条件下被碱性磷酸酶水解，形成游离酚和磷酸。在碱性条件下酚与氨基安替比林结合，并经氧化生成呈深浅不一的红色醌式结构物。在510nm处检测吸光值，通过比色分析计算碱性磷酸酶活性水平。一个活性单位(U/L)定义为37℃下100ml待测样品与磷酸苯二钠作用15min，产生1mg酚。

2.重组人肠碱性磷酸酶对LPS的灭活效果测定

使用不同pH(6.0-8.0)的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液将recIAP稀释为50U/mL。取990μl recIAP和10μl LPS溶液(大肠杆菌0111：B4，Sigma)混合均匀(LPS终浓度为1ug/mL)，37℃孵育3小时。通过TAL法(试管定量基质显色法鲎试剂盒，EC32545S，厦门鲎试剂生物科技有限公司)测定545nm处的吸光值，与标准曲线对比确定LPS活性单位。生理pH7.4条件下，recIAP(酶活为1、5、10U/ml)与LPS(5ng/ml)37℃孵育3小时，再测一次LPS含量。使用只含有recIAP的不同pH(6.0-8.0)的Tris-HCl缓冲溶液65℃处理60分钟后做空白对照。

结果：

recIAP在pH7.0-8.0时灭活LPS效果显著，在pH6.5时灭活LPS效果不显著(表1)，提示肠碱性磷酸酶对LPS的灭活作用在人体的细胞外液和血液pH的一般变动范围内才有效。37℃孵育3小时后recIAP(10U/ml)使LPS(5ng/ml)的活力降低50％以上(图3)。

表1重组人肠碱性磷酸酶(50U/ml)有效灭活内毒素(EU/ml)的pH范围

注：pH7.0和7.5时LPS活力降低了60％左右；pH8.0时LPS活力降低了76.85％。表中数据表示为平均值±标准差(n＝3)，recIAP+LPS组与LPS组相比P<0.05*和P<0.0001***。

如图3所示，浓度分别为1、5、10U/ml的recIAP与5ng/ml的LPS 37℃下孵育3小时，结果表明LPS活力的降低与recIAP的剂量正相关。数据表示为平均值±标准差(n＝3)，recIAP+LPS组与LPS组相比P<0.05*。

讨论：大量研究表明中性粒细胞是引发人类炎症性疾病的重要细胞(参考文献14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24)，中性粒细胞迁移到发炎组织中的行为就像一把双刃剑，虽然帮助去除入侵微生物，但是引发炎症性疾病。本文建立了肠碱性磷酸酶对依赖或不依赖LPS诱导人白细胞分泌TNF-α和IL-6影响的细胞学活性方法(图4、图5-CDEF)。LPS刺激人白细胞(主要是人中性粒细胞)分泌炎症因子TNF-α和IL-6。肠碱性磷酸酶可以在pH7.0-8.0的范围内有效灭活LPS(表1)。

结论：1.本发明建立了剂量依赖型LPS刺激人白细胞(主要是人中性粒细胞)分泌炎症因子TNF-α模型。2.肠碱性磷酸酶可以在pH7.0-8.0的范围内有效灭活LPS(表1)

实施例3

目的：LPS刺激人血白细胞TNF-α和IL-6分泌模型

方法：

1.人静脉血白细胞分离

健康志愿者共6人，年龄26±5岁，采血经长春嘉和外科医院医学伦理委员会批准和本人同意。本发明采用糖密度梯度离心法，既人静脉血白细胞分离试剂盒(内毒素<0.1EU，天津灏洋华科生物科技有限公司)，分离静脉血。常温下采集人静脉血1800rpm离心25min，吸取单核细胞层(淋巴细胞和少部分单核细胞)和多核细胞层(中性粒细胞为主)混合，充分裂解红细胞，反复清洗两次，用3ml含10％FBS的1640培养基重悬备用。采用白细胞分类染色液染色观察细胞形态，调整密度至1×10⁶个/ml，再备用。每次采集不同志愿者的血液排除个体差异和确保实验可重复。

2.人白细胞分泌炎症因子TNF-α/IL-6模型

人脐静脉内皮细胞系(HUVECs)用含有10％FBS的DMEM/F12培养基37℃贴壁培养，用胰蛋白酶消化悬浮，调整细胞密度至1×10⁵个/ml。每孔加入细胞100ul，接种于96孔板，37℃培养24h。实验当天，将新鲜提取的人静脉血白细胞单独培养或加入单层培养的HUVECs的96孔板中，建立白细胞和HUVECs以及白细胞、红细胞(白细胞：红细胞＝1：5)和HUVECs间相互作用模型。LPS(0.00、0.05、0.10、0.50ng/ml)与两种细胞模型培养24小时后检测TNF-α和IL-6的分泌水平。实验完成后，再新鲜提取另外一人静脉血白细胞重复实验，确保实验结果可重复。

细胞培养液中TNF-α和IL-6的含量检测使用人体酶联免疫吸附测定试剂盒，具体方法详见制造商的说明(TNF-αElisa kit，美国R&D system；IL-6 Elisa kit，华美CSB-E04638h)。

结果：

TNF-α和IL-6主要由人中性粒细胞分泌。含有少量单核细胞和大量淋巴细胞的人新鲜血提取的单个核细胞和人血管内皮细胞HUVECs也有少量TNF-α分泌。红细胞基本没有TNF-α和IL-6分泌。

表2.含有中性粒和淋巴细胞的人白细胞、人血管内皮细胞和人红细胞分泌TNF-α和IL-6的情况。

注：人白细胞经密度梯度离心分离出人中性粒细胞、单个核细胞和红细胞三种细胞。

本发明建立人白细胞、HUVECs以及白细胞、红细胞和HUVECs互相间作用模型(图4)，用来研究肠碱性磷酸酶对人的新生物活性、新生理功能和潜在的新临床效果。

如图4所示，本发明建立人白细胞和HUVECs以及白细胞、红细胞和HUVECs互相间作用模型用来研究肠碱性磷酸酶对人的新抗炎生物活性。本研究还表明在红细胞和HUVECs存在的情况下，LPS在浓度0.0-0.5ng/ml的范围内呈剂量依赖型促进白细胞分泌TNF-α。注：数据表示为平均值±标准差(n＝4)。人白细胞和HUVECs模型中，LPS组与对照组相比P<0.05*和P<0.0001***。人白细胞、红细胞和HUVECs模型中，LPS组与对照组相比P<0.05#和P<0.0001###。

讨论：大量研究表明中性粒细胞是引发人类炎症性疾病的重要细胞(参考文献14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24)，中性粒细胞迁移到发炎组织中的行为就像一把双刃剑，虽然帮助去除入侵微生物，但是引发炎症性疾病。本发明建立人白细胞、HUVECs以及白细胞、红细胞和HUVECs互相间作用模型(图4)，用来研究肠碱性磷酸酶对人的新生物活性、新生理功能和潜在的新临床效果。

结论：1.LPS刺激人血白细胞TNF-α分泌模型。2.本发明表明0-0.5ng/ml浓度的LPS在白细胞、红细胞和HUVECs存在条件下呈剂量依赖型促进TNF-α分泌。

实施例4

目的：重组人肠碱性磷酸酶抑制白细胞分泌TNF-α和IL-6不依赖LPS

方法：

1.人静脉血白细胞分离：同实施例3。

2.HUVECs培养方法：同实例3。

3.实验当天，recIAP(5、10、20U/ml)与0.5ng/ml LPS提前孵育3小时或与LPS同时加入刺激白细胞，37℃培养24小时后收集培养液上清检测TNF-α。recIAP(0.5、1.0、2.0、4.0U/ml)与0.5ng/ml LPS同时加入刺激白细胞，培养24小时后用ELISA法检测TNF-α和IL-6水平。

结果：

首先recIAP与LPS提前孵育3小时或与LPS同时加入白细胞刺激TNF-α分泌，其刺激TNF-α分泌程度类似(图5AB)，提示重组人肠碱性磷酸酶抑制白细胞分泌TNF-α不依赖LPS。在没有LPS的情况下recIAP也能抑制白细胞分泌TNF-α(图5CD)，表明在LPS存在或者不存在的条件下，recIAP都能明显减少TNF-α的分泌。进一步地，在没有LPS的情况下recIAP也能抑制白细胞分泌IL-6(图5EF)，表明在LPS存在或者不存在的条件下，recIAP都能明显减少IL-6的分泌。

如图5所示，recIAP对炎症因子TNF-α和IL-6的抑制作用不依赖于LPS。recIAP(5、10、20U/ml)与LPS(0.5ng/ml)提前孵育3小时或与LPS同时加入刺激白细胞分泌TNF-α，TNF-α分泌程度类似(A B)。在没有LPS的情况下recIAP(5U/ml)也能抑制白细胞分泌TNF-α(CD)，表明在LPS存在或者不存在的条件下，recIAP(5U/ml)都能明显减少TNF-α的分泌。进一步地，在没有LPS的情况下recIAP(5U/ml)也能抑制白细胞分泌IL-6(E F)，表明在LPS存在或者不存在的条件下，recIAP(5U/ml)都能明显减少IL-6的分泌。其中，白细胞、红细胞和HUVECs互相间作用模型(ACE)；白细胞和HUVECs互相间作用模型(BDF)。本发明数据表示为平均值±标准差(n＝4)，recIAP组和对照组相比P<0.0001###。recIAP+LPS组和LPS组相比P<0.0001***。LPS组和对照组相比P<0.0001^^^。

讨论：本发明最早发现LPS与肠碱性磷酸酶提前孵育和与肠碱性磷酸酶同时加入细胞培养同等程度抑制了人白细胞(主要是人中性粒细胞)分泌的炎症因子TNF-α，提示肠碱性磷酸酶的对人白细胞分泌TNF-α的抑制作用与肠碱性磷酸酶灭活LPS的程度的关系不密切。本发明表明肠碱性磷酸酶抑制LPS诱导的人白细胞(主要是人中性粒细胞)分泌的炎症因子TNF-α和IL-6。本发明发现肠碱性磷酸酶在没有LPS存在的情况下仍然抑制人白细胞(主要是人中性粒细胞)分泌的炎症因子TNF-α和IL-6(图5-C和D、E和F)。以上研究结果表明肠碱性磷酸酶抑制人白细胞分泌TNF-α和IL-6不是通过灭活LPS，而是直接抑制人中性粒细胞分泌炎症因子TNF-α和IL-6。因此，重组人或提取肠碱性磷酸酶可以用来候选制造治疗炎症性疾病的注射液。同时，以上肠碱性磷酸酶不依赖LPS抑制人白细胞分泌TNF-α和IL-6的细胞模型可以用来做注射用碱性磷酸酶产品活性的新测定方法。

AM-Pharma的recIAP的人体临床安全使用剂量250、500、1000U/kg(12)，放大到一个平均体重50kg的人，每人次治疗需要12500、25000、50000U。本发明使用recIAP抑制人白细胞分泌的炎症因子TNF-α和IL-6的有效剂量是2.5-5U/ml，放大到一个平均体重50kg的人(5L血液，3L血浆)，每次治疗需要7500-15000U。AM-Pharma的recIAP每支注射液的浓度为7036U(11.26mg)/ml(参考文献24)，比活性为625U/mg，注射液纯度为99％。本文使用的recIAP比活性为578U/mg，纯度为92.45％,接近AM-Pharma的recIAP的比活性。本文使用的recIAP在已知的人体安全剂量范围内，至少证明了recIAP可用于治疗人白细胞TNF-α分泌过多的相关炎症。

结论：本发明表明肠碱性磷酸酶抑制LPS诱导的人白细胞(主要是人中性粒细胞)分泌的炎症因子TNF-α和IL-6。本发明发现肠碱性磷酸酶在没有LPS存在的情况下仍然抑制人白细胞(主要是人中性粒细胞)分泌的炎症因子TNF-α和IL-6(图5-C和D、E和F)。以上研究结果表明肠碱性磷酸酶抑制人白细胞分泌TNF-α和IL-6不是通过灭活LPS，而是直接抑制人中性粒细胞分泌炎症因子TNF-α和IL-6。

实施例5

目的：提取牛肠碱性磷酸酶和重组人肠碱性磷酸酶一样抑制人白细胞分泌TNF-α和IL-6。

方法：

1.人静脉血白细胞分离：同实施例3。

2.HUVECs培养方法：同实例3。

3.实验当天，5U/ml的recIAP和bIAP(P6774-2KU，Sigma)与0.5ng/ml LPS同时加入刺激白细胞，收集培养24小时后的培养液用ELISA法检测TNF-α和IL-6。

结果：

提取牛肠碱性磷酸酶(bIAP)和recIAP在有无LPS的情况下均抑制人白细胞分泌TNF-α和IL-6(图6ABCD)，提示肠碱性磷酸酶在肠粘膜有抑制炎症因子和抗炎效果。

如图6所示，bIAP和recIAP一样在有无LPS的情况下均抑制人白细胞分泌TNF-α和IL-6(图6ABCD)。其中，白细胞、红细胞和HUVECs互相间作用模型(AC)；白细胞和HUVECs互相间作用模型(BD)。本发明数据表示为平均值±标准差(n＝4)，和对照组相比P<0.0001###。和LPS组相比P<0.0001***。LPS组和对照组相比P<0.0001^^^。

讨论：bIAP和recIAP一样也被用来治疗人类LPS相关疾病，其效果和recIAP基本一样。

结果：bIAP和recIAP一样在有无LPS的情况下均抑制人白细胞分泌TNF-α和IL-6。

实施例6

目的：重组人肠碱性磷酸酶抑制白细胞分泌TNF-α的作用机制

方法：

1.磷钼酸法测定肠碱性磷酸酶基质游离磷释放量

使用不同pH(6.0-8.0)的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液配制10mM的不同pH(6.0-8.0)的ATP、ADP、AMP溶液(ATP，Biotopped；ADP和AMP，上海源叶生物)；取recIAP(1000U/ml)梯度稀释为0.5、5.0、50.0U/ml；取950μl不同浓度的recIAP和50μl的不同pH(6.0-8.0)的ATP、ADP、AMP溶液(终浓度均为0.5mM)，混合均匀后37℃孵育60分钟。使用只含有recIAP的不同pH(6.0-8.0)的Tris-HCl缓冲溶液65℃处理60分钟后做空白对照。使用无机磷测试盒(C006-1-1，南京建成生物工程研究所)检测recIAP处理过的不同pH的ATP、ADP、AMP溶液(终浓度0.5mM)释放的游离磷Pi含量。

2.人静脉血白细胞分离：同实施例3。

3.HUVECs培养方法：同实例3。

4.实验当天，将低浓度(0.10、0.25、0.50、1.00uM)ATP、ADP、AMP、腺苷加入白细胞和血管内皮细胞互相间作用模型，培养24小时后收集培养液上清测定TNF-α分泌水平。

结果：

AM-Pharma的Lukas使用重组人肠碱性磷酸酶治疗内毒素相关的结肠炎(参考文献13)，提示recIAP通过使ATP脱磷以抑制肠道微生物分泌ATP诱发的炎症，但ATP在肠道中不同于血液中，在肠道中其起到致炎因子的作用，在血液中是用于提供能量，不致炎，参考文献中是通过降低致炎因子的浓度从而减少其诱发炎症因子的数量；而本发明中是通过使非致炎因子脱磷酸变成腺苷，产物腺苷对已经生成的炎症因子进行抑制。另外，本发明结果表明recIAP呈剂量依赖型使ATP、ADP、AMP脱磷，并制造产物ADP、AMP和腺苷(图7ABC)。本发明还发现ATP脱磷的产物AMP和腺苷有部分抑制人白细胞分泌的TNF-α作用(图8CD)。

如图7所示，本发明结果表明recIAP呈剂量和pH依赖型脱磷ATP、ADP、AMP，并制造终产物腺苷。本发明还发现ATP脱磷的产物腺苷和AMP抑制人白细胞部分分泌的TNF-α。本发明数据表示为平均值±标准差(n＝3)，与LPS组相比P<0.0001***。

如图8所示，本发明还发现ATP脱磷的终产物腺苷、ADP和AMP有部分抑制人中性粒细胞分泌的TNF-α作用(ABC)。本发明数据表示为平均值±标准差(n＝3)，处理组与对照组相比P<0.05*和P<0.0001***。

讨论：

除了抑制LPS活性外(图5-A和B)，肠碱性磷酸酶的另一个潜在的对细胞炎症因子TNF-α的抑制机制是ATP的去磷酸化。肠碱性磷酸酶使肠碱性磷酸酶基质ATP去磷酸化并逐步产生ADP、AMP和腺苷。本发明发现在没有LPS存在的情况下碱性磷酸酶通过对ATP、ADP、AMP等底物脱磷酸形成腺苷和AMP来部分抑制人白细胞(主要是人中性粒细胞)分泌的炎症因子TNF-α(图8-D)，表明腺苷具有部分降低人中性粒细胞产生TNF-α的抗炎作用(图8-D)。因此，肠碱性磷酸酶还通过其它基质的脱磷产生抑制人白细胞分泌炎症因子TNF-α的作用，包括细胞的降解产物腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸、胸腺嘧啶核苷三磷酸和RNA的降解产物腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸、尿嘧啶核苷三磷酸。体内RNA降解很快，有大量降解产物，均为肠碱性磷酸酶脱磷的底物。同时，本发明也不能排除细胞表面受体蛋白等也被肠碱性磷酸酶基质脱磷而产生对人白细胞分泌TNF-α和IL-6的生物效应。综上所述，肠碱性磷酸酶使致炎物质(LPS和ATP等)去磷酸化是肠碱性磷酸酶对抗人类炎症性疾病的生理作用段之一。

结论：

本发明结果表明在没有LPS存在的情况下碱性磷酸酶通过对ATP、ADP、AMP等底物脱磷酸形成腺苷和AMP来部分抑制人白细胞(主要是人中性粒细胞)分泌的炎症因子TNF-α。

实施例7

目的：重组人肠碱性磷酸酶降解产物抑制白细胞分泌TNF-α的作用机制

方法：

1.磷钼酸法测定肠碱性磷酸酶基质游离磷释放量

使用不同pH(6.0-8.0)的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液配制10mM的不同pH(6.0-8.0)的CTP、GTP、TTP、UTP(上海源叶生物)溶液；取recIAP(1000U/ml)梯度稀释为0.05U/ml；取950μl的recIAP(0.05U/ml)和50μl的不同pH(6.0-8.0)的CTP、GTP、TTP、UTP溶液(终浓度均为0.5mM)，混合均匀后37℃孵育60分钟。使用只含有recIAP的不同pH(6.0-8.0)的Tris-HCl缓冲溶液65℃处理60分钟后做空白对照。使用无机磷测试盒(C006-1-1，南京建成生物工程研究所)检测recIAP处理过的不同pH的CTP、GTP、TTP、UTP溶液(终浓度0.5mM)释放的游离磷Pi含量。

2.人静脉血白细胞分离：同实施例3。

3.HUVECs培养方法：同实例3。

4.实验当天，将低浓度(0.10、0.25、0.50、1.00uM)鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷加入白细胞和血管内皮细胞互相间作用模型，培养24小时后收集培养液上清测定TNF-α分泌水平。

结果：

AM-Pharma的Lukas使用重组人肠碱性磷酸酶治疗内毒素相关的结肠炎(参考文献13)，提示recIAP通过使ATP脱磷以抑制肠道微生物分泌ATP诱发的炎症，但ATP在肠道中不同于血液中，在肠道中其起到致炎因子的作用，在血液中是用于提供能量，不致炎，参考文献中是通过降低致炎因子的浓度从而减少其诱发炎症因子的数量；而本发明中是通过使非致炎因子脱磷酸变成腺苷，产物腺苷对已经生成的炎症因子进行抑制。另外，本发明结果表明recIAP呈剂量依赖型使ATP、ADP、AMP脱磷，并制造产物ADP、AMP和腺苷(图7ABC)。本发明还发现ATP脱磷的产物AMP和腺苷有部分抑制人白细胞分泌的TNF-α作用(图8CD)。

如图7所示，本发明结果表明recIAP呈剂量和pH依赖型脱磷ATP、ADP、AMP，并制造终产物腺苷。本发明还发现ATP脱磷的产物腺苷和AMP抑制人白细胞部分分泌的TNF-α。本发明数据表示为平均值±标准差(n＝3)，与LPS组相比P<0.0001***。

如图8所示，本发明还发现ATP脱磷的终产物腺苷ADP和AMP有部分抑制人中性粒细胞分泌的TNF-α作用(ABC)。本发明数据表示为平均值±标准差(n＝3)，处理组与对照组相比P<0.05*和P<0.0001***。

讨论：

除了抑制LPS活性外(图5-A和B)，肠碱性磷酸酶的另一个潜在的对细胞炎症因子TNF-α的抑制机制是ATP的去磷酸化。肠碱性磷酸酶使肠碱性磷酸酶基质ATP去磷酸化并逐步产生ADP、AMP和腺苷。本发明发现在没有LPS存在的情况下碱性磷酸酶通过对ATP、ADP、AMP等底物脱磷酸形成腺苷Adonesine和AMP来部分抑制人白细胞(主要是人中性粒细胞)分泌的炎症因子TNF-α(图8-D)，表明腺苷具有部分降低人中性粒细胞产生TNF-α的抗炎作用(图8-D)。因此，肠碱性磷酸酶还通过其它基质的脱磷产生抑制人白细胞分泌炎症因子TNF-α的作用，包括细胞的降解产物腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸、胸腺嘧啶核苷三磷酸和和RNA的降解产物腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸、尿嘧啶核苷三磷酸(实验结果如图9、10所示)。体内RNA降解很快，有大量降解产物，为均肠碱性磷酸酶脱磷的底物。同时，本发明也不能排除细胞表面蛋白等也被肠碱性磷酸酶基质脱磷而产生对人白细胞分泌TNF-α和IL-6的生物效应。综上所述，肠碱性磷酸酶使致炎物质(LPS和ATP等)去磷酸化是肠碱性磷酸酶对抗人类炎症性疾病的生理作用段之一。

结论：

本发明结果表明在没有LPS存在的情况下碱性磷酸酶通过对ATP、ADP、AMP等底物脱磷酸形成腺苷和AMP来部分抑制人白细胞(主要是人中性粒细胞)分泌的炎症因子TNF-α。

实施例8

目的：应用于以上实施例1-6的统计学分析方法。

方法：所有数据均用平均数±标准差或标准差表示，两组数据均采用批内两组t检验比较，P<0.05和P<0.01分别被认为差异具有明显统计学差异和非常明显统计学差异。细胞培养结果取三个值，至少重复2次。数据分析使用Graph prism 6.0，其结果用表或图表示。

结果：见实施例1-7。

结论：本统计学分析方法简单总结，有效应用于实施例1-6结果的统计学分析。

综上所述，人白细胞中的中性粒细胞是引发人类炎症性疾病的重要炎症细胞，其作用机制之一是通过分泌TNF-α和IL-6等炎症因子。肠碱性磷酸酶通过去磷酸化使内毒素失活，从而减轻内毒素诱发的炎症反应。本发明使用新鲜提取人白细胞建立TNF-α和IL-6分泌的模型，发现内毒素以剂量依赖方式增加人白细胞TNF-α和IL-6的分泌。本发明还发现肠碱性磷酸酶不仅能有效灭活内毒素还能减少内毒素诱发的人白细胞TNF-α和IL-6分泌。本发明进一步发现肠碱性磷酸酶在无内毒素存在情况下仍抑制新鲜提取人白细胞TNF-α和IL-6的分泌，表明肠碱性磷酸酶通过与内毒素无关的机制抑制人白细胞TNF-α和IL-6的分泌，是一种非内毒素依赖人白细胞TNF-α和IL-6分泌抑制剂。这个研究结果提示肠碱性磷酸酶可用于治疗人白细胞移走聚集疾病部位分泌TNF-α和IL-6增多相关疾病和健康问题。本发明建立的人和犬白细胞TNF-α和IL-6分泌的细胞模型还可用于重组或提取的肠碱性磷酸酶商业化制剂的活性检测实验。本发明还发现肠碱性磷酸酶通过使ATP、ADP、AMP等去磷酸化产生腺苷等和AMP等部分抑制了新鲜提取人白细胞分泌TNF-α和IL-6。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种肠碱性磷酸酶作为在没有内毒素存在的情况下人白细胞的TNF-α和/或IL-6分泌抑制剂的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠碱性磷酸酶通过使底物ATP、ADP和/或AMP去磷酸化，产生的腺苷或AMP抑制人白细胞TNF-α和/或IL-6分泌。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠碱性磷酸酶通过使底物去磷酸化抑制人白细胞TNF-α和/或IL-6分泌；

所述底物为细胞降解产物中的GTP、CTP、TTP、UTP以及GDP、GMP、CDP、CMP、TDP、TMP、UDP、UMP中的任一种；

或所述底物为细胞表面蛋白。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠碱性磷酸酶在人白细胞移走聚集所在的疾病部位起作用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠碱性磷酸酶采用注射液形式。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠碱性磷酸酶为重组或提取的肠碱性磷酸酶。

7.一种肠碱性磷酸酶在制备治疗在没有内毒素存在的情况下人白细胞疾病部位TNF-α和/或IL-6分泌增多相关炎症性疾病药物中的应用。

8.一种肠碱性磷酸酶在治疗在没有内毒素存在的情况下人白细胞疾病部位TNF-α和/或IL-6分泌增多相关炎症性疾病中的应用。

9.一种产业化或商业化的肠碱性磷酸酶制剂的细胞活性检测方法，其特征在于，采用人或动物白细胞TNF-α和IL-6分泌的细胞模型进行细胞活性检测；

通过检测在没有内毒素存在的情况下人或动物白细胞分泌TNF-α和IL-6的水平来判断肠碱性磷酸酶制剂活性。

10.根据权利要求9所述的细胞活性检测方法，其特征在于，所述人或动物白细胞TNF-α和IL-6分泌的细胞模型采用：

白细胞和人脐静脉内皮细胞系相互作用模型；

或白细胞、红细胞和人脐静脉内皮细胞系间相互作用模型；

所述动物为犬。

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