CN111118051B

CN111118051B - 一种基于酿酒酵母的双链rna合成优化与应用

Info

Publication number: CN111118051B
Application number: CN201911369062.9A
Authority: CN
Inventors: 杨月; 陈贤情; 卓炳照; 朱文博; 夏文豪; 蒿飞; 李琪; 刘毅; 李子鹤; 王筱
Original assignee: Northwestern Polytechnical University
Current assignee: Northwestern Polytechnical University
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2039-12-26
Also published as: CN111118051A

Abstract

本发明提供了一种基于酿酒酵母的双链RNA合成优化与应用。具体地，提供了一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物的结构(5’‑3’)如式I所示：Z1‑Z2‑Z3‑L1‑Z4‑Z5式I；其中，各“‑”独立地为键或核苷酸连接序列；Z1为无或酶切位点；Z2为TDH3启动子；Z3为正向的ofslc35b1基因的核酸序列；L1为无或核苷酸连接序列；Z4为反向的ofslc35b1基因的核酸序列；和Z5为无或酶切位点。本发明还提供了含有此核酸构建物的载体、宿主细胞，及利用此方法产生玉米螟虫致死基因dsRNA的方法。相对于现有技术，本发明显著提高了玉米螟虫致死基因dsRNA的生产效率，并促进了生物农药的广泛应用。

Description

一种基于酿酒酵母的双链RNA合成优化与应用

技术领域

本发明涉及转基因应用领域，具体地，涉及一种基于酿酒酵母的双链RNA合成优化与应用。

背景技术

生物农药是一种利用活性生物体或是代谢产物，有针对性地在农业生产中应用，以此来实现病虫害防治目的。生物农药以其自身独特的优势，被广泛应用在农业病虫害防治中，相较于以往的高毒副农药而言，病虫害防治效果更为突出，还能够有效降低对生态环境的污染。针对我国种植业而言，开发生物农药具有极大的商业价值和市场前景。

RNA干扰(RNA interferencre，RNA干扰)可以作为一种最具潜力的害虫防治新技术、新策略加入到害虫综合防治策略中，从而减少化学农药带来的环境压力，改善传统农药作用靶标单一，污染严重，害虫抗药性增长快的现状。目前通过喂食或注射dsRNA，已经发现在多种昆虫中发现了RNA干扰效应，包括蜚蠊目，双翅目，半翅目等。

因此，本领域急需一种高效且稳定发挥昆虫RNA干扰作用的生产方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效且稳定发挥昆虫RNA干扰作用的生产方案。

本发明的第一方面，提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物的结构(5'-3')如式I所示：

Z1-Z2-Z3-L1-Z4-Z5 式I

其中，

Z1为无或酶切位点；

Z2为TDH3启动子；

Z3为正向的、编码dsRNA分子的核酸序列；

L1为无或核苷酸连接序列；

Z4为反向的、用于编码所述dsRNA分子的核酸序列，其中，Z3和Z4是互补形成所述的dsRNA；和

Z5为无或酶切位点，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。

在另一优选例中，所述的编码dsRNA分子的核酸序列为ofslc35b1基因。

在另一优选例中，所述的ofslc35b1基因的核酸序列选自下组：

(a)所述核酸序列如SEQ ID NO.:1所示；

(b)所述核酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％；和

(c)与(a)或(b)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述表达ofslc35b1基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在另一优选例中，所述的TDH3启动子选自与SEQ ID NO:2有至少95％同源性的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的TDH3启动子的序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第二方面，提供了一种载体，所述载体含有如第一方面所述的核酸构建物。

在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述的载体为质粒。

在另一优选例中，所述的质粒选自下组：YCplac33、v195。

在另一优选例中，所述载体用于表达ofslc35b1基因的dsRNA。

本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如第二方面所述的载体或其染色体中整合有外源的如第一方面所述的核酸构建物。

在另一优选例中，所述宿主细胞为酵母细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：酿酒酵母、毕赤酵母、或其组合。

本发明的第四方面，提供了一种dsRNA的生产方法，所述的方法包括步骤：培养如第三方面所述的宿主细胞，从而得到ofslc35b1基因的dsRNA。

本发明的第五方面，提供了如第一方面所述的核酸构建物、如第二方面所述的载体、或如第三方面所述的宿主细胞的用途，用于制备一农用组合物，所述的农用组合物用于抑制棉田害虫。

在另一优选例中，所述的棉田害虫包括玉米螟虫、甜菜夜蛾。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为技术路线流程图。

图2为玉米螟致死基因查询。

图3为构建质粒图。

图4为核酸PCR验证图。

图5为荧光定量pcr结果图

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外地开发了一种可高效大量稳定生产dsRNA分子的构建物和载体，本发明的构建物和载体特别适合用于在酵母细胞中大量产生外源的dsRNA分子，尤其是具有农用价值(如抗害虫，如抗昆虫)的dsRNA分子。在此基础上完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。

RNA干扰

RNA干扰是由Fire于1998年发现的，Fire等将正义链和反义链的混合物(含有双链RNA，double stranded RNA，dsRNA)注入线虫，发现dsRNA可特异性显著抑制特定基因的表达，引起基因抑制现象。并且其引起的基因沉默效应比应用反义RNA或正义RNA都要强得多，Fire等将这种由dsRNA引发的特定基因表达受抑现象称为RNA干扰作用(RNAinterference，RNAi)。

RNA干扰的作用机制可以被分为三个主要步骤：

(1)表达的或导入的长链dsRNA被RNA酶III家族的Dicer切割成21-23个碱基长度的，两段有两个碱基突出的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)；

(2)siRNA的无义链被后续降解，有义链则与核酸内切酶Argonaut-2(Ago2)结合，形成RNA诱导的沉默复合体RISC(RNA-indcued silence complex)；

(3)通过siRNA的引导链，RISC定位与有义链互补的mRNA序列，与之进行核酸配对，RISC复合体中的Ago2则剪切靶标mRNA，从而抑制目标mRNA的翻译过程。

生物农药

生物农药是一种利用活性生物体或是代谢产物，有针对性地在农业生产中应用，以此来实现病虫害防治目的。生物农药以其自身独特的优势，被广泛应用在农业病虫害防治中，相较于以往的高毒副农药而言，病虫害防治效果更为突出，还能够有效降低对生态环境的污染。针对我国种植业而言，开发生物农药具有极大的商业价值和市场前景。研究表明，RNA干扰(RNA interferencre，RNA干扰)可以作为一种最具潜力的害虫防治新技术、新策略加入到害虫综合防治策略中，从而减少化学农药带来的环境压力，改善传统农药作用靶标单一，污染严重，害虫抗药性增长快的现状。

目前通过喂食或注射dsRNA，已经发现在多种昆虫中发现了RNA干扰效应，包括蜚蠊目，双翅目，半翅目等。对德国小蠊(Blattella germanica)和烟草天蛾(Manduca sexta)的研究发现，通过注射dsRNA能有效降低德国小蠊的基因表达量，而烟草天蛾中由于血淋巴中dsRNA核酸酶的降解导致其对dsRNA的低敏感性。对豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera)，马铃薯甲虫等害虫的研究发现，都可以在极低的浓度下敲除基因而导致受试昆虫的死亡。

昆虫RNA干扰效应能被siRNA或dsRNA高效、特异地诱导。其中siRNA的设计和筛选成本较高。建立siRNA的方法有很多，例如：化学合成法，体外转录法，RNaseⅢ酶切法，构建siRNA载体法，PCR siRNA表达框法等。在昆虫中通常用体外转录的dsRNA来诱导RNA干扰。由于喂食法需要大量的dsRNA，并且体外合成的成本较高。有研究开发利用了大肠杆菌(Escherichia coli)作为dsRNA的表达载体，将dsRNA转入该菌菌体内，并诱导dsRNA在菌体内表达，实现dsRNA的生产。

本发明中，设计用酿酒酵母生产玉米螟致死基因dsRNA。玉米螟致死基因dsRNA直接影响玉米螟虫体内的关键基因表达，从而杀死玉米螟虫。具体地，所述dsRNA能沉默玉米螟虫体内的关键基因表达，其基因表达水平被部分沉默，引起内质网应激反应的发生，虫体的稳态环境可能遭受到破坏。

在一个优选例中，采用酵母高效表达载体v195构建质粒，进行dsRNA表达，成功提高其稳定性和表达产率。

昆虫致死基因

本文中，昆虫致死基因是指影响昆虫的正常生长、移动、交配、产卵、摄食等活动能力显著下降，甚至导致昆虫短期内死亡的各种基因。所述昆虫致死基因的作用方式包括喷洒至昆虫活动、寄居或接触的环境中，或直接将其通过喂食、注射入昆虫体内。所述的昆虫主要代指对危害人类本身或农林作物、畜牧作物的生物，即“害虫”。

常见的害虫包括：农业害虫、家畜害虫、森林害虫、卫生害虫、贮谷害虫、以及非昆虫类如蜗牛、蛞蝓、鼠妇、蜈蚣、马陆、蟎。所述的农业害虫包括：蚜虫、蝗虫、蓟马、介壳虫、木虱(Psyllidae)、卜泥(Booklice,Psocoptera)、叶蝉、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、小菜蛾、玉米螟(Ostrinia spp.)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、纹白蝶(Pieris rapae)、东方果实蝇(Bactocera dorsalis)。所述的家畜害虫包括：牛虻。所述的森林害虫包括：天牛、松毛虫(Dendrolimus spp.)、舞毒蛾(Lymantria dispar)。

本发明的一个优选例中，针对玉米螟(Ostrinia furnacalis(Asian cornborer))致死基因设计了dsRNA。所述玉米螟致死基因ofslc35b1登录号为kc896828，其核酸序列全长1472bp，核酸序列如下SEQ ID NO.:1所示；已得到的开放阅读框为776bp，基因编码258个氨基酸。

在本发明中，基于dsRNA理论，对棉田其他害虫如甜菜夜蛾的致病基因也可用作本发明构建物中的Z3或Z4。

酵母(saccharomyce)

酵母是一种单细胞真菌，在有氧和无氧环境下都能生存，属于兼性厌氧菌。酵母是基因克隆实验中常用的真核生物受体细胞，酵母克隆载体的种类也很多。酵母菌质粒也称为2μm质粒，约6 300bp。

单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母(Saccharomyces.Cerevisiae)在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母(methylotrophic yeast)为代表的第二代酵母表达系统。甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等。以Pichia pastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。

本发明的一个实施例中，使用的是酿酒酵母。酿酒酵母又称面包酵母或出芽酵母，革兰氏染色呈阳性，单细胞形态为球形或椭球形，菌落扁平，光滑，湿润，具有酒酿气味，由于具有生长周期短，繁殖快易于大规模生长培养，基因操作技术成熟，且具有RNA含量远高于其DNA含量的特点，因而非常适用将酿酒酵母作为制取RNA的宿主。

本发明的主要优点包括：

1.利用RNA干扰效应开发的生物农药，可以低浓度的dsRNA便可以发生明显的抑制效应，即少量的dsRNA分子就可以使大量的内源性mRNA降解，达到阻抑靶基因表达的效果。

2.本发明提供了生物合成双链RNA的方法，该方法具有绿色环保、高效高产、双链RNA稳定、特异性强等优点。

3.本发明通过大量实验数据证明，相比于大肠杆菌，酵母细胞是RNA生产的最佳地盘生物，本发明提供的采用酵母高效表达载体YCplac33构建质粒，进行dsRNA表达，能够提高其稳定性和表达产率。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

材料和方法

1.细胞培养基CM：

YNB w/o AA：0.67％，

葡萄糖：2％，

Dropout powder：0.083％，其中含(mg/L)：

L-苏氨酸	150	L-酪氨酸	30	L-缬氨酸	150
						L-赖氨酸	30	L-谷氨酸	100	L-丝氨酸	150
L-天冬氨酸	100	L-甲硫氨酸	20	L-苯丙氨酸	50
						L-异亮氨酸	30	L-精氨酸	20

其它营养成分(mg/L)：

腺嘌呤	50	尿嘧啶	50	L-组氨酸	100
						L-亮氨酸	100	L-色氨酸	100

液体培养基调pH5.6，固体培养基加1.5％的琼脂粉，调pH6.5

2.细胞培养基CM-URA：

YNB w/o AA：0.67％

葡萄糖：2％，

Dropout powder：0.083％，其中含(mg/L)：

其它营养成分(mg/L)：

腺嘌呤	50	L-组氨酸	100
				L-亮氨酸	100	L-色氨酸	100

液体培养基调pH5.6，固体培养基加1.5％的琼脂粉，调pH6.5

实施例1害虫RNA序列查询及确定

根据数据库NCBI，查询农业害虫的相关致死或者绝育基因，玉米螟的致死基因ofslc35b1主要位于细胞内膜结构及转运功能细胞器上，其核酸序列如SEQ ID NO.:1所述序列。

实施例2质粒构建及验证

构建质粒的方法如下：

2.1分别以酿酒酵母表达载体Yplac33和玉米螟基因组DNA为模板，进行表达载体线性化和玉米螟致死基因ofslc35b1的克隆。

克隆操作如下：

1)利用引物和模板进行PCR

利用Fusion酶体系扩增，全程在冰上操作，手拿管上沿，避免失活。

PCR体系如下：

ddH2O	200μL
		5X GC buffer	40μL
dNTPs	16μL
		MgCl2	10μL
DMSO	6μL
		5F/3R	8μL
Fusion酶	2μL
		模板	2μL

PCR程序如下：

然后将PCR产物进行核酸电泳及切胶回收。

2)核酸电泳及胶回收

a)配置0.8％～1％的agarose琼脂糖溶液；

b)倒板制胶；

c)插上加样梳；

d)待胶凝固后拔下加样梳，凝胶托盘与胶一同取下，放入电泳槽中；

e)加入1X TAE至液面没过胶块；

f)在凝胶成像仪中打开紫外灯，用小刀切下目的条带，放入2ml离心管中，用胶回收试剂盒回收目的片段。

将切胶回收的片段进行连接，本发明所用实验方法为Gibson assembling方法。

2.2为了得到玉米螟虫的致死基因的dsRNA，在质粒中得到高质量的稳定表达的dsRNA，本发明将玉米螟的致死基因双向构建在Y33载体上，获得双向表达的dsRNA。

对于启动子的选择，通过大量筛选和实验。发明人利用多种启动子引导所述致死基因目的片段在质粒中表达。

TEF2、TDH3、ADH1、2HXT7、PGK1，GAL1在内的6种启动子诱导重组片段的效果如图5所示。

结果表明，绝大多数的启动子都无法高效地形成外源dsRNA分子。然而，出乎意料的是，启动子TDH3居然能够高效地、高质量表达所述致死基因目的片段，得到致死基因的dsRNA，并在酵母细胞中稳定存在。由此确定了如图3所示的重组质粒的构建图。

所述的插入的dsRNA片段为ofslc35b1基因的核酸序列如SEQ ID NO.:1所示，其序列如下：

GATATCGCGCGTTACCATATATGGTGACAAAAACTGAGTCAGCCCGCGATTGGTGGAAAAACAAACTGGAGCCGATACTGTGTAAATTGTGATAACGGCTCTTTTATATAGTTTATCCTCACGAGTCGGTTCTCATTTACTAAGGTGTGCTCGAACAGTGCGCATTCGCATCTACGTACTTGTCACTTATTTAATAATACTATGTAAGTTTTAATTTTAAAATTGCGAAAGAAAAAAAAACATATTTATTTATTTGTAAAATTTGAATTTCGAAGGTTCTCCGTCCCTTTACCTTTAAGTATTACATATGTTTGAGTGTTTTTTTTTTTTAATAATACGCTAATGATAACGTGTTACGTTACATAATTGTTGCATAACTAGTGAAGTGAAATTTTTTATAAAAAAAAACAGTTTTCGGAATTAGTGTACTGCAGATGTTAATAAACACTACTAAATAAGAAATAAGTTTATTGGACGCACATTTCAAAGTGTCCACTCGCATCGATCAATTCGGAAACAGAAATTGGGAACAGTGAATTATGAATCTTATACAGTTTTCTTTAACGTCACTAAATAGATGGACGCAAATAAATTTGTCGTTTACTTAGTATAATGTATGGAATGAGAATGTAGTTTGAATTGTTTTTTTTCTTTTCTTGCAGACTAATTCAGGTACCATGGCTAAGAGCAGCACGGAATTTCGATTCATATTTTATGCCGGCTCTATTTTTACATGTTACTTTATTTATGGAATGCTTCAAGAAAAAGTAACTAGAGGAGTATATGGTAATAATGAGAAATTTACGGCCACCTTATCATTAGTTCTCGTACAATGTACAGTGAATTACATCTTTGCTCAAATTTTAATGTTATCTTGGAAACATGAAAAAGACAATACCAAGAAAATTTACTACTTCTCTTCTGCTCTAACGTATCTTTTGGGTATGGTCTGCTCTAACATGGCGTTGCAATGGGTCAACTACCCTACTCAGGTTGTGGGAAAAGCGGCAAAACCCATCCCAGTCCTGATGCTCGGTGTCCTTCTTGGTCGCAAGTCATATCCTCTGAAGAAATACCTGTTTGTATTTCTTATTGTTATTGGTGTTGTGCTATTCATGTACAAAGACCAAAAGAGAGTAACTGATGAAACACCAGGCATCGGAATTGGAGAACTACTCTTGATATTGTCACTTCTCATGGATGGCCTGACAGGTGCTGTGCAGGAACGGATTAAAAGCGAACATTCTCCAACTGCGTACGCAATGATGTTGAACACGAACTGGTGGTCTACTATAATTCTAACGATCGGCGTGGTATTGAGCGGTGAAATATTCCAGTTTATCCGTTTCGTGTCTGTGTACCCCGAAGTCATCGTATTTATCATCAGCTTGGCTCTAATGGGAGCTCTAGGCCAACTGTTTATATTTTATATGGTTTCGGAATTCGGTCCACT(SEQ ID NO.:1)

所述的启动子TDH3的核酸序列如SEQ ID NO.:2所示，其序列如下：ATACTAGCGTTGAATGTTAGCGTCAACAACAAGAAGTTTAATGACGCGGAGGCCAAGGCAAAAAGATTCCTTGATTACGTAAGGGAGTTAGAATCATTTTGAATAAAAAACACGCTTTTTCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAAATTAGCCTTTTAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAA(SEQ ID NO.:2)

应用以下引物构建yplac33-tdh3-slc质粒

Y33-TDH3-Slc-F	ACACACATAAACAAACAAAGATATCGCGCG	SEQ ID NO.:4
			Y33-Slc-R	CAGTtcaGAATTCGATATCGCGCGTTACCATA	SEQ ID NO.:5
Slc-Y33-F	AACGCGCGATATCGAATTCtgaACTGGCCGTC	SEQ ID NO.:6
			Slc-TDH3-Y33-R	ACGCGCGATATCTTTGTTTGTTTATGTGT	SEQ ID NO.:7
TDH3-Y33-R	CATTCAACGCTAGTATAAGCTTGGCGTAATCATGGTCA	SEQ ID NO.:8
			Y33-TDH3-R	GTGAATTCATACTAGCGTTGAAT	SEQ ID NO.:9

基因表达载体的构建操作如下：

a)将5μl PCR消化后的产物与15μl Gibson体系混合，然后在50℃金属浴中1h。

b)用纯化试剂盒将连接产物纯化至10μl。

c)转化：(10μl纯化产物+50μl DH5α大肠杆菌感受态)→冰浴30min→42℃热击45s→冰浴2min→加入200μl LB复苏45min→涂于相应平板37℃培养16h

方法中所用gibson体系配制方法为：

Gibson体系配方如下：

5X ISO buffer	320μl
		10U/μl T5 exonuclease	0.64μl
2U/μl Phusion polymerase	20μl
		40U/μl Taq ligase	160μl
ddH2O	加至终体积1.2ml

将按照上述方法获得的Gibson体系分装15μL一管，-20℃保存，备用。

2.3重组质粒的验证

所述重组质粒yplac33-tdh3-slc的核酸序列如SEQ ID NO.:3所示，其核酸序列如下：

GCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTATACTAGCGTTGAATGTTAGCGTCAACAACAAGAAGTTTAATGACGCGGAGGCCAAGGCAAAAAGATTCCTTGATTACGTAAGGGAGTTAGAATCATTTTGAATAAAAAACACGCTTTTTCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAAATTAGCCTTTTAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAGATATCGCGCGTTACCATATATGGTGACAAAAACTGAGTCAGCCCGCGATTGGTGGAAAAACAAACTGGAGCCGATACTGTGTAAATTGTGATAACGGCTCTTTTATATAGTTTATCCTCACGAGTCGGTTCTCATTTACTAAGGTGTGCTCGAACAGTGCGCATTCGCATCTACGTACTTGTCACTTATTTAATAATACTATGTAAGTTTTAATTTTAAAATTGCGAAAGAAAAAAAAACATATTTATTTATTTGTAAAATTTGAATTTCGAAGGTTCTCCGTCCCTTTACCTTTAAGTATTACATATGTTTGAGTGTTTTTTTTTTTTAATAATACGCTAATGATAACGTGTTACGTTACATAATTGTTGCATAACTAGTGAAGTGAAATTTTTTATAAAAAAAAACAGTTTTCGGAATTAGTGTACTGCAGATGTTAATAAACACTACTAAATAAGAAATAAGTTTATTGGACGCACATTTCAAAGTGTCCACTCGCATCGATCAATTCGGAAACAGAAATTGGGAACAGTGAATTATGAATCTTATACAGTTTTCTTTAACGTCACTAAATAGATGGACGCAAATAAATTTGTCGTTTACTTAGTATAATGTATGGAATGAGAATGTAGTTTGAATTGTTTTTTTTCTTTTCTTGCAGACTAATTCAGGTACCATGGCTAAGAGCAGCACGGAATTTCGATTCATATTTTATGCCGGCTCTATTTTTACATGTTACTTTATTTATGGAATGCTTCAAGAAAAAGTAACTAGAGGAGTATATGGTAATAATGAGAAATTTACGGCCACCTTATCATTAGTTCTCGTACAATGTACAGTGAATTACATCTTTGCTCAAATTTTAATGTTATCTTGGAAACATGAAAAAGACAATACCAAGAAAATTTACTACTTCTCTTCTGCTCTAACGTATCTTTTGGGTATGGTCTGCTCTAACATGGCGTTGCAATGGGTCAACTACCCTACTCAGGTTGTGGGAAAAGCGGCAAAACCCATCCCAGTCCTGATGCTCGGTGTCCTTCTTGGTCGCAAGTCATATCCTCTGAAGAAATACCTGTTTGTATTTCTTATTGTTATTGGTGTTGTGCTATTCATGTACAAAGACCAAAAGAGAGTAACTGATGAAACACCAGGCATCGGAATTGGAGAACTACTCTTGATATTGTCACTTCTCATGGATGGCCTGACAGGTGCTGTGCAGGAACGGATTAAAAGCGAACATTCTCCAACTGCGTACGCAATGATGTTGAACACGAACTGGTGGTCTACTATAATTCTAACGATCGGCGTGGTATTGAGCGGTGAAATATTCCAGTTTATCCGTTTCGTGTCTGTGTACCCCGAAGTCATCGTATTTATCATCAGCTTGGCTCTAATGGGAGCTCTAGGCCAACTGTTTATATTTTATATGGTTTCGGAATTCGGTCCACTAGTGGACCGAATTCCGAAACCATATAAAATATAAACAGTTGGCCTAGAGCTCCCATTAGAGCCAAGCTGATGATAAATACGATGACTTCGGGGTACACAGACACGAAACGGATAAACTGGAATATTTCACCGCTCAATACCACGCCGATCGTTAGAATTATAGTAGACCACCAGTTCGTGTTCAACATCATTGCGTACGCAGTTGGAGAATGTTCGCTTTTAATCCGTTCCTGCACAGCACCTGTCAGGCCATCCATGAGAAGTGACAATATCAAGAGTAGTTCTCCAATTCCGATGCCTGGTGTTTCATCAGTTACTCTCTTTTGGTCTTTGTACATGAATAGCACAACACCAATAACAATAAGAAATACAAACAGGTATTTCTTCAGAGGATATGACTTGCGACCAAGAAGGACACCGAGCATCAGGACTGGGATGGGTTTTGCCGCTTTTCCCACAACCTGAGTAGGGTAGTTGACCCATTGCAACGCCATGTTAGAGCAGACCATACCCAAAAGATACGTTAGAGCAGAAGAGAAGTAGTAAATTTTCTTGGTATTGTCTTTTTCATGTTTCCAAGATAACATTAAAATTTGAGCAAAGATGTAATTCACTGTACATTGTACGAGAACTAATGATAAGGTGGCCGTAAATTTCTCATTATTACCATATACTCCTCTAGTTACTTTTTCTTGAAGCATTCCATAAATAAAGTAACATGTAAAAATAGAGCCGGCATAAAATATGAATCGAAATTCCGTGCTGCTCTTAGCCATGGTACCTGAATTAGTCTGCAAGAAAAGAAAAAAAACAATTCAAACTACATTCTCATTCCATACATTATACTAAGTAAACGACAAATTTATTTGCGTCCATCTATTTAGTGACGTTAAAGAAAACTGTATAAGATTCATAATTCACTGTTCCCAATTTCTGTTTCCGAATTGATCGATGCGAGTGGACACTTTGAAATGTGCGTCCAATAAACTTATTTCTTATTTAGTAGTGTTTATTAACATCTGCAGTACACTAATTCCGAAAACTGTTTTTTTTTATAAAAAATTTCACTTCACTAGTTATGCAACAATTATGTAACGTAACACGTTATCATTAGCGTATTATTAAAAAAAAAAAACACTCAAACATATGTAATACTTAAAGGTAAAGGGACGGAGAACCTTCGAAATTCAAATTTTACAAATAAATAAATATGTTTTTTTTTCTTTCGCAATTTTAAAATTAAAACTTACATAGTATTATTAAATAAGTGACAAGTACGTAGATGCGAATGCGCACTGTTCGAGCACACCTTAGTAAATGAGAACCGACTCGTGAGGATAAACTATATAAAAGAGCCGTTATCACAATTTACACAGTATCGGCTCCAGTTTGTTTTTCCACCAATCGCGGGCTGACTCAGTTTTTGTCACCATATATGGTAACGCGCGATATCGAATTCtgaACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATCGGATCGTACTTGTTACCCATCATTGAATTTTGAACATCCGAACCTGGGAGTTTTCCCTGAAACAGATAGTATATTTGAACCTGTATAATAATATATAGTCTAGCGCTTTACGGAAGACAATGTATGTATTTCGGTTCCTGGAGAAACTATTGCATCTATTGCATAGGTAATCTTGCACGTCGCATCCCCGGTTCATTTTCTGCGTTTCCATCTTGCACTTCAATAGCATATCTTTGTTAACGAAGCATCTGTGCTTCATTTTGTAGAACAAAAATGCAACGCGAGAGCGCTAATTTTTCAAACAAAGAATCTGAGCTGCATTTTTACAGAACAGAAATGCAACGCGAAAGCGCTATTTTACCAACGAAGAATCTGTGCTTCATTTTTGTAAAACAAAAATGCAACGCGAGAGCGCTAATTTTTCAAACAAAGAATCTGAGCTGCATTTTTACAGAACAGAAATGCAACGCGAGAGCGCTATTTTACCAACAAAGAATCTATACTTCTTTTTTGTTCTACAAAAATGCATCCCGAGAGCGCTATTTTTCTAACAAAGCATCTTAGATTACTTTTTTTCTCCTTTGTGCGCTCTATAATGCAGTCTCTTGATAACTTTTTGCACTGTAGGTCCGTTAAGGTTAGAAGAAGGCTACTTTGGTGTCTATTTTCTCTTCCATAAAAAAAGCCTGACTCCACTTCCCGCGTTTACTGATTACTAGCGAAGCTGCGGGTGCATTTTTTCAAGATAAAGGCATCCCCGATTATATTCTATACCGATGTGGATTGCGCATACTTTGTGAACAGAAAGTGATAGCGTTGATGATTCTTCATTGGTCAGAAAATTATGAACGGTTTCTTCTATTTTGTCTCTATATACTACGTATAGGAAATGTTTACATTTTCGTATTGTTTTCGATTCACTCTATGAATAGTTCTTACTACAATTTTTTTGTCTAAAGAGTAATACTAGAGATAAACATAAAAAATGTAGAGGTCGAGTTTAGATGCAAGTTCAAGGAGCGAAAGGTGGATGGGTAGGTTATATAGGGATATAGCACAGAGATATATAGCAAAGAGATACTTTTGAGCAATGTTTGTGGAAGCGGTATTCGCAATATTTTAGTAGCTCGTTACAGTCCGGTGCGTTTTTGGTTTTTTGAAAGTGCGTCTTCAGAGCGCTTTTGGTTTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTCCTATACTTTCTAGCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCAAAGCGTTTCCGAAAACGAGCGCTTCCGAAAATGCAACGCGAGCTGCGCACATACAGCTCACTGTTCACGTCGCACCTATATCTGCGTGTTGCCTGTATATATATATACATGAGAAGAACGGCATAGTGCGTGTTTATGCTTAAATGCGTACTTATATGCGTCTATTTATGTAGGATGAAAGGTAGTCTAGTACCTCCTGTGATATTATCCCATTCCATGCGGGGTATCGTATGCTTCCTTCAGCACTACCCTTTAGCTGTTCTATATGCTGCCACTCCTCAATTGGATTAGTCTCATCCTTCAATGCTATCATTTCCTTTGATATTGGATCGATCCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAGCTCTAATTTGTGAGTTTAGTATACATGCATTTACTTATAATACAGTTTTTTAGTTTTGCTGGCCGCATCTTCTCAAATATGCTTCCCAGCCTGCTTTTCTGTAACGTTCACCCTCTACCTTAGCATCCCTTCCCTTTGCAAATAGTCCTCTTCCAACAATAATAATGTCAGATCCTGTAGAGACCACATCATCCACGGTTCTATACTGTTGACCCAATGCGTCTCCCTTGTCATCTAAACCCACACCGGGTGTCATAATCAACCAATCGTAACCTTCATCTCTTCCACCCATGTCTCTTTGAGCAATAAAGCCGATAACAAAATCTTTGTCGCTCTTCGCAATGTCAACAGTACCCTTAGTATATTCTCCAGTAGATAGGGAGCCCTTGCATGACAATTCTGCTAACATCAAAAGGCCTCTAGGTTCCTTTGTTACTTCTTCTGCCGCCTGCTTCAAACCGCTAACAATACCTGGGCCCACCACACCGTGTGCATTCGTAATGTCTGCCCATTCTGCTATTCTGTATACACCCGCAGAGTACTGCAATTTGACTGTATTACCAATGTCAGCAAATTTTCTGTCTTCGAAGAGTAAAAAATTGTACTTGGCGGATAATGCCTTTAGCGGCTTAACTGTGCCCTCCATGGAAAAATCAGTCAAGATATCCACATGTGTTTTTAGTAAACAAATTTTGGGACCTAATGCTTCAACTAACTCCAGTAATTCCTTGGTGGTACGAACATCCAATGAAGCACACAAGTTTGTTTGCTTTTCGTGCATGATATTAAATAGCTTGGCAGCAACAGGACTAGGATGAGTAGCAGCACGTTCCTTATATGTAGCTTTCGACATGATTTATCTTCGTTTCCTGCATGTTTTTGTTCTGTGCAGTTGGGTTAAGAATACTGGGCAATTTCATGTTTCTTCAACACTACATATGCGTATATATACCAATCTAAGTCTGTGCTCCTTCCTTCGTTCTTCCTTCTGTTCGGAGATTACCGAATCAAAAAAATTTCAAAGAAACCGAAATCAAAAAAAAGAATAAAAAAAAAATGATGAATTGAATTGAAAAGCTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGA(SEQ ID NO.:3)

将上述质粒转化进入大肠杆菌DH5α细胞内后，涂板过夜培养，挑取菌落进行培养，送测序。将测序结果正确的菌株保存甘油菌。

实施例3酵母细胞转化过程

通过培养实施例2中得到的测序结果正确的大肠杆菌DH5α，提取扩增的质粒。将提取的质粒转入酵母中，对酵母细胞进行培养，诱导表达。酿酒酵母转化方法用常用的醋酸锂转化方法。转化步骤如下：

a)挑取酵母野生型W303菌株单菌落在CM培养基中过夜摇陪12h(试管4ml)；

b)分光光度计测得菌液OD600的值；

c)以初始OD600值为0.2OD转接到50mL(总体积)新鲜的YPAD培养基；

50×0.2＝OD值(测得)×稀释倍数(接种时记录)×转接体积(计算得到)，活化4～5h，待菌液OD600值在0.8～0.9,此时酵母菌增殖两代；

d)3600rpm 5min收集菌体，20ml ddH2O清洗两次；

e)1ml无菌水重悬至1.5ml离心管中；

f)12000rpm 30s收集；

g)1ml无菌水重悬分装每管100μl用于转化，将分装的菌液掌上离心20s，弃上清液加转化体系，转化体系配方如下：

PEG 3350(50％(w/v过滤除菌))	240μl
		LiAc 1.0M(过滤除菌)	36μl
ssDNA(2.0mg/ml)	50μl
		DNA片段和水	34μl(29μl+5μl)
总计	360μl

混合好的转化体系重悬菌液，于30℃保温20min；

h)42℃热击40min后涂板(筛选板CM-URA)，倒置于36℃培养箱中2～3d，待转化子长出，挑选单克隆，提取基因组，使用M13引物进行PCR验证。

实施例4酵母细胞培养表达及收集

酵母细胞的摇瓶培养，酵母细胞培养和收集步骤如下：

a)挑取玉米螟致死干扰RNA单克隆酵母细胞至5ml CM-URA培养基中培养48h。CM-URA培养基配方：(1L)6.7g YNB，20g葡萄糖，0.84g Dropout powder，0.05g腺嘌呤，0.1g组氨酸，0.1g亮氨酸，0.05g色氨酸，pH调至5.6；等量的固体培养基需再加入15g琼脂，pH调至6.5。

b)接种液体酵母细胞至1000ml三角瓶中培养，培养基200ml，发酵条件为：接种量为10-20％，30℃条件下，220rpm转培养15-45h。

c)离心收集菌体：离心收集玉米螟致死干扰RNA的酵母。

实施例5酵母细胞qtPCR验证

5.1酵母细胞RNA提取的操作如下：

收集酵母细胞。加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。4℃离心，12000g×15min，取上清。加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。4℃离心，12000g×10min，弃上清。加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10min，DEPC处理水40μl加入，中枪打匀，55-60℃水浴10min溶解总RNA，测OD值。

5.2使用takara反转录试剂盒(RR047A)进行逆转录实验，

5.3使用takara荧光定量PCR试剂盒(DRR820A)进行荧光定量。

使用的引物如下表所示：

结果：如图5所示，根据qtPCR结果，不同的启动子进行dsRNA表达的产物的量不同。在本实验中，启动子TDH3表达的产量最高。在本发明中，成功构建不同启动子表达dsRNA质粒并转化入酵母细胞，成功表达了玉米螟虫致死基因，构建相关菌株。在实验中，得到了表达量最高的启动子为PTDH3。

进行提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西北工业大学

<120> 一种基于酿酒酵母的双链RNA合成优化与应用

<130> P2019-1176

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1453

<212> DNA

<213> 玉米螟（Ostrinia furnacalis）

<400> 1

gatatcgcgc gttaccatat atggtgacaa aaactgagtc agcccgcgat tggtggaaaa 60

acaaactgga gccgatactg tgtaaattgt gataacggct cttttatata gtttatcctc 120

acgagtcggt tctcatttac taaggtgtgc tcgaacagtg cgcattcgca tctacgtact 180

tgtcacttat ttaataatac tatgtaagtt ttaattttaa aattgcgaaa gaaaaaaaaa 240

catatttatt tatttgtaaa atttgaattt cgaaggttct ccgtcccttt acctttaagt 300

attacatatg tttgagtgtt tttttttttt aataatacgc taatgataac gtgttacgtt 360

acataattgt tgcataacta gtgaagtgaa attttttata aaaaaaaaca gttttcggaa 420

ttagtgtact gcagatgtta ataaacacta ctaaataaga aataagttta ttggacgcac 480

atttcaaagt gtccactcgc atcgatcaat tcggaaacag aaattgggaa cagtgaatta 540

tgaatcttat acagttttct ttaacgtcac taaatagatg gacgcaaata aatttgtcgt 600

ttacttagta taatgtatgg aatgagaatg tagtttgaat tgtttttttt cttttcttgc 660

agactaattc aggtaccatg gctaagagca gcacggaatt tcgattcata ttttatgccg 720

gctctatttt tacatgttac tttatttatg gaatgcttca agaaaaagta actagaggag 780

tatatggtaa taatgagaaa tttacggcca ccttatcatt agttctcgta caatgtacag 840

tgaattacat ctttgctcaa attttaatgt tatcttggaa acatgaaaaa gacaatacca 900

agaaaattta ctacttctct tctgctctaa cgtatctttt gggtatggtc tgctctaaca 960

tggcgttgca atgggtcaac taccctactc aggttgtggg aaaagcggca aaacccatcc 1020

cagtcctgat gctcggtgtc cttcttggtc gcaagtcata tcctctgaag aaatacctgt 1080

ttgtatttct tattgttatt ggtgttgtgc tattcatgta caaagaccaa aagagagtaa 1140

ctgatgaaac accaggcatc ggaattggag aactactctt gatattgtca cttctcatgg 1200

atggcctgac aggtgctgtg caggaacgga ttaaaagcga acattctcca actgcgtacg 1260

caatgatgtt gaacacgaac tggtggtcta ctataattct aacgatcggc gtggtattga 1320

gcggtgaaat attccagttt atccgtttcg tgtctgtgta ccccgaagtc atcgtattta 1380

tcatcagctt ggctctaatg ggagctctag gccaactgtt tatattttat atggtttcgg 1440

aattcggtcc act 1453

<210> 2

<211> 800

<212> DNA

<213> 合成序列（Artificial sequence）

<220>

<223> TDH3

<400> 2

atactagcgt tgaatgttag cgtcaacaac aagaagttta atgacgcgga ggccaaggca 60

aaaagattcc ttgattacgt aagggagtta gaatcatttt gaataaaaaa cacgcttttt 120

cagttcgagt ttatcattat caatactgcc atttcaaaga atacgtaaat aattaatagt 180

agtgattttc ctaactttat ttagtcaaaa aattagcctt ttaattctgc tgtaacccgt 240

acatgcccaa aatagggggc gggttacaca gaatatataa catcgtaggt gtctgggtga 300

acagtttatt cctggcatcc actaaatata atggagcccg ctttttaagc tggcatccag 360

aaaaaaaaag aatcccagca ccaaaatatt gttttcttca ccaaccatca gttcataggt 420

ccattctctt agcgcaacta cagagaacag gggcacaaac aggcaaaaaa cgggcacaac 480

ctcaatggag tgatgcaacc tgcctggagt aaatgatgac acaaggcaat tgacccacgc 540

atgtatctat ctcattttct tacaccttct attaccttct gctctctctg atttggaaaa 600

agctgaaaaa aaaggttgaa accagttccc tgaaattatt cccctacttg actaataagt 660

atataaagac ggtaggtatt gattgtaatt ctgtaaatct atttcttaaa cttcttaaat 720

tctactttta tagttagtct tttttttagt tttaaaacac caagaactta gtttcgaata 780

aacacacata aacaaacaaa 800

<210> 3

<211> 8905

<212> DNA

<213> 合成序列（Artificial sequence）

<220>

<223> yplac33-tdh3-slc

<400> 3

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttat 240

actagcgttg aatgttagcg tcaacaacaa gaagtttaat gacgcggagg ccaaggcaaa 300

aagattcctt gattacgtaa gggagttaga atcattttga ataaaaaaca cgctttttca 360

gttcgagttt atcattatca atactgccat ttcaaagaat acgtaaataa ttaatagtag 420

tgattttcct aactttattt agtcaaaaaa ttagcctttt aattctgctg taacccgtac 480

atgcccaaaa tagggggcgg gttacacaga atatataaca tcgtaggtgt ctgggtgaac 540

agtttattcc tggcatccac taaatataat ggagcccgct ttttaagctg gcatccagaa 600

aaaaaaagaa tcccagcacc aaaatattgt tttcttcacc aaccatcagt tcataggtcc 660

attctcttag cgcaactaca gagaacaggg gcacaaacag gcaaaaaacg ggcacaacct 720

caatggagtg atgcaacctg cctggagtaa atgatgacac aaggcaattg acccacgcat 780

gtatctatct cattttctta caccttctat taccttctgc tctctctgat ttggaaaaag 840

ctgaaaaaaa aggttgaaac cagttccctg aaattattcc cctacttgac taataagtat 900

ataaagacgg taggtattga ttgtaattct gtaaatctat ttcttaaact tcttaaattc 960

tacttttata gttagtcttt tttttagttt taaaacacca agaacttagt ttcgaataaa 1020

cacacataaa caaacaaaga tatcgcgcgt taccatatat ggtgacaaaa actgagtcag 1080

cccgcgattg gtggaaaaac aaactggagc cgatactgtg taaattgtga taacggctct 1140

tttatatagt ttatcctcac gagtcggttc tcatttacta aggtgtgctc gaacagtgcg 1200

cattcgcatc tacgtacttg tcacttattt aataatacta tgtaagtttt aattttaaaa 1260

ttgcgaaaga aaaaaaaaca tatttattta tttgtaaaat ttgaatttcg aaggttctcc 1320

gtccctttac ctttaagtat tacatatgtt tgagtgtttt ttttttttaa taatacgcta 1380

atgataacgt gttacgttac ataattgttg cataactagt gaagtgaaat tttttataaa 1440

aaaaaacagt tttcggaatt agtgtactgc agatgttaat aaacactact aaataagaaa 1500

taagtttatt ggacgcacat ttcaaagtgt ccactcgcat cgatcaattc ggaaacagaa 1560

attgggaaca gtgaattatg aatcttatac agttttcttt aacgtcacta aatagatgga 1620

cgcaaataaa tttgtcgttt acttagtata atgtatggaa tgagaatgta gtttgaattg 1680

ttttttttct tttcttgcag actaattcag gtaccatggc taagagcagc acggaatttc 1740

gattcatatt ttatgccggc tctattttta catgttactt tatttatgga atgcttcaag 1800

aaaaagtaac tagaggagta tatggtaata atgagaaatt tacggccacc ttatcattag 1860

ttctcgtaca atgtacagtg aattacatct ttgctcaaat tttaatgtta tcttggaaac 1920

atgaaaaaga caataccaag aaaatttact acttctcttc tgctctaacg tatcttttgg 1980

gtatggtctg ctctaacatg gcgttgcaat gggtcaacta ccctactcag gttgtgggaa 2040

aagcggcaaa acccatccca gtcctgatgc tcggtgtcct tcttggtcgc aagtcatatc 2100

ctctgaagaa atacctgttt gtatttctta ttgttattgg tgttgtgcta ttcatgtaca 2160

aagaccaaaa gagagtaact gatgaaacac caggcatcgg aattggagaa ctactcttga 2220

tattgtcact tctcatggat ggcctgacag gtgctgtgca ggaacggatt aaaagcgaac 2280

attctccaac tgcgtacgca atgatgttga acacgaactg gtggtctact ataattctaa 2340

cgatcggcgt ggtattgagc ggtgaaatat tccagtttat ccgtttcgtg tctgtgtacc 2400

ccgaagtcat cgtatttatc atcagcttgg ctctaatggg agctctaggc caactgttta 2460

tattttatat ggtttcggaa ttcggtccac tagtggaccg aattccgaaa ccatataaaa 2520

tataaacagt tggcctagag ctcccattag agccaagctg atgataaata cgatgacttc 2580

ggggtacaca gacacgaaac ggataaactg gaatatttca ccgctcaata ccacgccgat 2640

cgttagaatt atagtagacc accagttcgt gttcaacatc attgcgtacg cagttggaga 2700

atgttcgctt ttaatccgtt cctgcacagc acctgtcagg ccatccatga gaagtgacaa 2760

tatcaagagt agttctccaa ttccgatgcc tggtgtttca tcagttactc tcttttggtc 2820

tttgtacatg aatagcacaa caccaataac aataagaaat acaaacaggt atttcttcag 2880

aggatatgac ttgcgaccaa gaaggacacc gagcatcagg actgggatgg gttttgccgc 2940

ttttcccaca acctgagtag ggtagttgac ccattgcaac gccatgttag agcagaccat 3000

acccaaaaga tacgttagag cagaagagaa gtagtaaatt ttcttggtat tgtctttttc 3060

atgtttccaa gataacatta aaatttgagc aaagatgtaa ttcactgtac attgtacgag 3120

aactaatgat aaggtggccg taaatttctc attattacca tatactcctc tagttacttt 3180

ttcttgaagc attccataaa taaagtaaca tgtaaaaata gagccggcat aaaatatgaa 3240

tcgaaattcc gtgctgctct tagccatggt acctgaatta gtctgcaaga aaagaaaaaa 3300

aacaattcaa actacattct cattccatac attatactaa gtaaacgaca aatttatttg 3360

cgtccatcta tttagtgacg ttaaagaaaa ctgtataaga ttcataattc actgttccca 3420

atttctgttt ccgaattgat cgatgcgagt ggacactttg aaatgtgcgt ccaataaact 3480

tatttcttat ttagtagtgt ttattaacat ctgcagtaca ctaattccga aaactgtttt 3540

tttttataaa aaatttcact tcactagtta tgcaacaatt atgtaacgta acacgttatc 3600

attagcgtat tattaaaaaa aaaaaacact caaacatatg taatacttaa aggtaaaggg 3660

acggagaacc ttcgaaattc aaattttaca aataaataaa tatgtttttt tttctttcgc 3720

aattttaaaa ttaaaactta catagtatta ttaaataagt gacaagtacg tagatgcgaa 3780

tgcgcactgt tcgagcacac cttagtaaat gagaaccgac tcgtgaggat aaactatata 3840

aaagagccgt tatcacaatt tacacagtat cggctccagt ttgtttttcc accaatcgcg 3900

ggctgactca gtttttgtca ccatatatgg taacgcgcga tatcgaattc tgaactggcc 3960

gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca 4020

gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 4080

caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 4140

ctgtgcggta tttcacaccg catatatcgg atcgtacttg ttacccatca ttgaattttg 4200

aacatccgaa cctgggagtt ttccctgaaa cagatagtat atttgaacct gtataataat 4260

atatagtcta gcgctttacg gaagacaatg tatgtatttc ggttcctgga gaaactattg 4320

catctattgc ataggtaatc ttgcacgtcg catccccggt tcattttctg cgtttccatc 4380

ttgcacttca atagcatatc tttgttaacg aagcatctgt gcttcatttt gtagaacaaa 4440

aatgcaacgc gagagcgcta atttttcaaa caaagaatct gagctgcatt tttacagaac 4500

agaaatgcaa cgcgaaagcg ctattttacc aacgaagaat ctgtgcttca tttttgtaaa 4560

acaaaaatgc aacgcgagag cgctaatttt tcaaacaaag aatctgagct gcatttttac 4620

agaacagaaa tgcaacgcga gagcgctatt ttaccaacaa agaatctata cttctttttt 4680

gttctacaaa aatgcatccc gagagcgcta tttttctaac aaagcatctt agattacttt 4740

ttttctcctt tgtgcgctct ataatgcagt ctcttgataa ctttttgcac tgtaggtccg 4800

ttaaggttag aagaaggcta ctttggtgtc tattttctct tccataaaaa aagcctgact 4860

ccacttcccg cgtttactga ttactagcga agctgcgggt gcattttttc aagataaagg 4920

catccccgat tatattctat accgatgtgg attgcgcata ctttgtgaac agaaagtgat 4980

agcgttgatg attcttcatt ggtcagaaaa ttatgaacgg tttcttctat tttgtctcta 5040

tatactacgt ataggaaatg tttacatttt cgtattgttt tcgattcact ctatgaatag 5100

ttcttactac aatttttttg tctaaagagt aatactagag ataaacataa aaaatgtaga 5160

ggtcgagttt agatgcaagt tcaaggagcg aaaggtggat gggtaggtta tatagggata 5220

tagcacagag atatatagca aagagatact tttgagcaat gtttgtggaa gcggtattcg 5280

caatatttta gtagctcgtt acagtccggt gcgtttttgg ttttttgaaa gtgcgtcttc 5340

agagcgcttt tggttttcaa aagcgctctg aagttcctat actttctagc tagagaatag 5400

gaacttcgga ataggaactt caaagcgttt ccgaaaacga gcgcttccga aaatgcaacg 5460

cgagctgcgc acatacagct cactgttcac gtcgcaccta tatctgcgtg ttgcctgtat 5520

atatatatac atgagaagaa cggcatagtg cgtgtttatg cttaaatgcg tacttatatg 5580

cgtctattta tgtaggatga aaggtagtct agtacctcct gtgatattat cccattccat 5640

gcggggtatc gtatgcttcc ttcagcacta ccctttagct gttctatatg ctgccactcc 5700

tcaattggat tagtctcatc cttcaatgct atcatttcct ttgatattgg atcgatccga 5760

tgataagctg tcaaacatga gaattgggta ataactgata taattaaatt gaagctctaa 5820

tttgtgagtt tagtatacat gcatttactt ataatacagt tttttagttt tgctggccgc 5880

atcttctcaa atatgcttcc cagcctgctt ttctgtaacg ttcaccctct accttagcat 5940

cccttccctt tgcaaatagt cctcttccaa caataataat gtcagatcct gtagagacca 6000

catcatccac ggttctatac tgttgaccca atgcgtctcc cttgtcatct aaacccacac 6060

cgggtgtcat aatcaaccaa tcgtaacctt catctcttcc acccatgtct ctttgagcaa 6120

taaagccgat aacaaaatct ttgtcgctct tcgcaatgtc aacagtaccc ttagtatatt 6180

ctccagtaga tagggagccc ttgcatgaca attctgctaa catcaaaagg cctctaggtt 6240

cctttgttac ttcttctgcc gcctgcttca aaccgctaac aatacctggg cccaccacac 6300

cgtgtgcatt cgtaatgtct gcccattctg ctattctgta tacacccgca gagtactgca 6360

atttgactgt attaccaatg tcagcaaatt ttctgtcttc gaagagtaaa aaattgtact 6420

tggcggataa tgcctttagc ggcttaactg tgccctccat ggaaaaatca gtcaagatat 6480

ccacatgtgt ttttagtaaa caaattttgg gacctaatgc ttcaactaac tccagtaatt 6540

ccttggtggt acgaacatcc aatgaagcac acaagtttgt ttgcttttcg tgcatgatat 6600

taaatagctt ggcagcaaca ggactaggat gagtagcagc acgttcctta tatgtagctt 6660

tcgacatgat ttatcttcgt ttcctgcatg tttttgttct gtgcagttgg gttaagaata 6720

ctgggcaatt tcatgtttct tcaacactac atatgcgtat atataccaat ctaagtctgt 6780

gctccttcct tcgttcttcc ttctgttcgg agattaccga atcaaaaaaa tttcaaagaa 6840

accgaaatca aaaaaaagaa taaaaaaaaa atgatgaatt gaattgaaaa gctaattctt 6900

gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 6960

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 7020

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 7080

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 7140

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 7200

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 7260

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7320

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 7380

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 7440

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 7500

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 7560

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 7620

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 7680

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 7740

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 7800

ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 7860

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 7920

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 7980

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 8040

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 8100

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 8160

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 8220

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 8280

ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8340

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8400

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 8460

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 8520

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8580

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 8640

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 8700

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8760

tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc 8820

gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg 8880

agtcagtgag cgaggaagcg gaaga 8905

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 合成序列（Artificial sequence）

<220>

<223> Y33-TDH3-Slc-F

<400> 4

acacacataa acaaacaaag atatcgcgcg 30

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 合成序列（Artificial sequence）

<220>

<223> Y33-Slc-R

<400> 5

cagttcagaa ttcgatatcg cgcgttacca ta 32

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 合成序列（Artificial sequence）

<220>

<223> Slc-Y33-F

<400> 6

aacgcgcgat atcgaattct gaactggccg tc 32

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 合成序列（Artificial sequence）

<220>

<223> Slc- TDH3-Y33-R

<400> 7

acgcgcgata tctttgtttg tttatgtgt 29

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 合成序列（Artificial sequence）

<220>

<223> TDH3-Y33-R

<400> 8

cattcaacgc tagtataagc ttggcgtaat catggtca 38

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列（Artificial sequence）

<220>

<223> Y33-TDH3-R

<400> 9

gtgaattcat actagcgttg aat 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列（Artificial sequence）

<220>

<223> P-Fw

<400> 10

tgatgctcgg tgtccttctt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列（Artificial sequence）

<220>

<223> P-Rev

<400> 11

gcagttggag aatgttcgct 20

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 玉米螟（Ostrinia furnacalis）

<400> 12

cacggatagt ggctttggtg aacaattac 29

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 玉米螟（Ostrinia furnacalis）

<400> 13

tatgattatc tggcagcagg aaagaacttg gg 32

Claims

1. 一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物的结构(5'-3')如式I所示：

Z1-Z2-Z3-L1-Z4-Z5 式I

其中，

Z1为无或酶切位点；

Z2为TDH3启动子；

Z3为正向的、编码dsRNA分子的核酸序列；

L1为无或核苷酸连接序列；

Z5为无或酶切位点，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

并且，所述的编码dsRNA分子的核酸序列为ofslc35b1基因；

所述的ofslc35b1基因的核酸序列如SEQ ID NO: 1所示；

所述的TDH3启动子的序列如SEQ ID NO: 2所示。

2.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求1所述的核酸构建物。

3.如权利要求2所述的载体，其特征在于，所述的载体为质粒。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的质粒选自下组：YCplac33、v195。

5.如权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体用于表达ofslc35b1基因的dsRNA。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求2所述的载体或其染色体中整合有外源的如权利要求1所述的核酸构建物。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为酵母细胞。

8.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自下组：酿酒酵母、毕赤酵母、或其组合。

9.一种dsRNA的生产方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：培养如权利要求6所述的宿主细胞，从而得到ofslc35b1基因的dsRNA。

10.一种如权利要求1所述的核酸构建物、如权利要求2所述的载体或如权利要求6所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于制备一农用组合物，所述的农用组合物用于抑制玉米螟虫。