CN111117979B

CN111117979B - 转氨酶突变体、酶制剂、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111117979B
Application number: CN202010036428.7A
Authority: CN
Inventors: 张丽星; 张艺凡; 郭天杰; 马富强; 杨广宇
Original assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Current assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2020-08-21
Anticipated expiration: 2040-01-14
Also published as: CN111117979A

Abstract

本发明涉及一种转氨酶突变体、酶制剂、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用。该转氨酶突变体的氨基酸序列由野生型转氨酶的氨基酸序列发生突变得到，野生型转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，发生突变的氨基酸位点包括第226位氨基酸位点、第281位氨基酸位点、第312位氨基酸位点及第406位氨基酸位点中的至少一个。上述转氨酶突变体的酶活较高。

Description

转氨酶突变体、酶制剂、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种转氨酶突变体、酶制剂、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用。

背景技术

转氨酶(Transaminase,TA，EC 2.6.1X)，又称氨基转移酶(Aminotransferase)，是磷酸吡哆醛(pyridoxal-5′-phosphate，PLP)依赖酶，能够催化酮酸和氨基酸之间的氨基进行可逆的转移反应。转氨酶在自然界中普遍存在，并且在氮代谢中起到了关键性的作用。根据催化反应中的底物和产物的不同，转氨酶可以分为仅催化α-氨基和α-酮酸的α-转氨酶和可以催化具用远端羧酸基团的氨基酸的ω转氨酶。由于ω-转氨酶可以催化酮酸、醛和酮之间的氨基转移，以及有着立体选择性较高和辅因子可再生的优点，所以ω-转氨酶在合成医药(如西他列汀)和农药(如草铵磷)的关键中间体-手性胺领域有着广泛的应用。氨基转氨酶(ATAs)作为ω-转氨酶的一种，可以转化除α-氨基酸和ω-氨基酸外缺少羧酸基团的胺基基团，近年来在生物催化应用领域的研究中格外受到关注。在合成药物或农药工艺中，对合成关键中间体-手性胺的工艺进行优化和提升具用着极高的经济价值，特别是利用转氨酶催化的氨基可逆转移反应，设计反应策略将反应向生成胺的方向推动，以提高生成关键中间体手性胺的效率，降低药物合成和农药生产过程成本，最终可大幅提高产业经济效益。然而，现有的转氨酶的酶活较低，不能满足实际需要。

发明内容

基于此，有必要提供一种酶活较高的转氨酶突变体。

此外，还提供一种转氨酶突变体的应用、酶制剂、重组载体、重组细胞及其制备方法。

一种转氨酶突变体，所述转氨酶突变体的氨基酸序列由野生型转氨酶的氨基酸序列发生突变得到，所述野生型转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，发生所述突变的氨基酸位点包括第226位氨基酸位点、第281位氨基酸位点、第312位氨基酸位点及第406位氨基酸位点中的至少一个。

本研究对转氨酶进行了大量的研究，意料不到的发现，将如SEQ ID No.1所示野生型转氨酶的氨基酸序列中第226位氨基酸位点、第281位氨基酸位点、第312位氨基酸位点及第406位氨基酸位点中的至少一个发生突变，得到的转氨酶突变体具有较高的酶活。经试验验证，上述转氨酶突变体的比活力为10.4U/mg～31.8U/mg，具有较高的酶活。

其中一个实施例中，所述突变的方式包括如下突变方式中的至少一种：T226R、A281S、I312D及R406C。

其中一个实施例中，所所述野生型转氨酶的编码序列如SEQ ID No.2所示。

一种酶制剂，包括上述转氨酶突变体。

一种重组载体，包括上述转氨酶突变体的编码序列。

一种重组细胞，包括上述转氨酶突变体的编码序列。

上述重组细胞的制备方法，包括如下步骤：

对所述野生型转氨酶的编码序列进行易错PCR扩增，酶切后连接到空载体中，得到转氨酶突变库质粒；

将所述转氨酶突变库质粒分别转化到宿主细胞中，得到转化细胞；及

采用IVC-FACS方法对转化细胞进行高通量筛选，得到所述重组细胞。

其中一个实施例中，所述对所述野生型转氨酶的编码序列进行易错PCR扩增的步骤中，采用序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示的引物对进行易错PCR扩增。

其中一个实施例中，所述对所述野生型转氨酶的编码序列进行易错PCR扩增的步骤之前，还包括如下步骤：采用序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示的引物对PCR扩增所述野生型转氨酶的编码序列。

上述转氨酶突变体、上述酶制剂、上述重组载体或者上述重组细胞在制备药物或者检测试剂中的应用。

附图说明

图1为野生型转氨酶的蛋白晶体模型的结构示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一实施方式的转氨酶突变体具有较高的酶活，能够用于制备手性胺，以能够用于制备药物或者检测试剂。其中，药物例如为医药(例如西他列汀)和农药(例如草铵磷)。检测试剂能够用于临床检测或者病理诊断。检测试剂例如为ELISA试剂盒。

具体地，转氨酶突变体的氨基酸序列由野生型转氨酶的氨基酸序列的发生突变得到，野生型转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，发生突变的氨基酸位点包括第226位氨基酸位点、第281位氨基酸位点、第312位氨基酸位点及第406位氨基酸位点中的至少一个。

本研究对转氨酶进行了大量的研究，意料不到的发现，将如SEQ ID No.1所示野生型转氨酶的氨基酸序列中第226位氨基酸位点、第281位氨基酸位点、第312位氨基酸位点及第406位氨基酸位点中的至少一个发生突变，得到的转氨酶突变体具有较高的酶活。

其中，如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列为野生型转氨酶WP_0532423951.1的氨基酸序列。该野生型转氨酶为无色杆菌(Achromobacter sp.DMS1)分泌的天冬氨酸转氨酶家族酶(aspartate aminotransferase family protein)，能够耐受的温度范围为55℃～95℃，具有相对较好的热稳定性。

具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为：MSAAKLPDLSHLWMPFTANRQFKANPRLLASAKGMYYTSFDGRQILDGTAGLWCVNAGHCREEIVSAIASQAGVMDYAPGFQLGHPLAFEAATAVAGLMPQGLDRVFFTNSGSESVDTALKIALAYHRARGEAQRTRLIGRERGYHGVGFGGISVGGISPNRKTFSGALLPAVDHLPHTHSLEHNAFTRGQPEWGAHLADELERIIALHDASTIAAVIVEPMAGSTGVLVPPKGYLEKLREITARHGILLIFDEVITAYGRLGEATAAAYFGVTPDLITMAKGVSNAAVPAGAVAVRREVHDAIVNGPQGGIEFFHGYTYSAHPLAAAAVLATLDIYRREDLFARARKLSAPFEEAAHSLKGAPHVIDVRNIGLVAGIELSPREGAPGARAAEAFQKCFDTGLMVRYTGDILAVSPPLIVDENQIGQIFEGIGKVLKEVA。

进一步地，突变的方式包括如下突变方式中的至少一种：T226R、A281S、I312D及R406C。其中，T226R表示如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第226位的苏氨酸被精氨酸替代。A281S表示如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第281位的丙氨酸被丝氨酸替代。I312D表示如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第312位的异亮氨酸被天冬氨酸替代。R406C表示如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第406位的精氨酸被半胱氨酸替代。此种设置得到的转氨酶突变体具有较高的酶活。

在一个具体示例中，转氨酶突变体的氨基酸序列由如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第226位的苏氨酸突变为精氨酸得到。

在一个具体示例中，转氨酶突变体的氨基酸序列由如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第281位的丙氨酸突变为丝氨酸得到。

在一个具体示例中，转氨酶突变体的氨基酸序列由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第312位的异亮氨酸突变为天冬氨酸得到。

在一个具体示例中，转氨酶突变体的氨基酸序列由如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第406位的精氨酸突变为半胱氨酸得到。

在一个具体示例中，转氨酶突变体的氨基酸序列由如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第226位的苏氨酸突变为精氨酸且第281位的丙氨酸突变为丝氨酸得到。

在一个具体示例中，转氨酶突变体的氨基酸序列由如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第226位的苏氨酸突变为精氨酸且第406位的精氨酸突变为半胱氨酸得到。

在一个具体示例中，转氨酶突变体的氨基酸序列由如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第312位的异亮氨酸突变为天冬氨酸且第406位的精氨酸突变为半胱氨酸得到。

在一个具体示例中，转氨酶突变体的氨基酸序列由如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第226位的苏氨酸突变为精氨酸、第281位的丙氨酸突变为丝氨酸且第312位的异亮氨酸突变为天冬氨酸得到。

在其中一个实施例中，野生型转氨酶的编码序列如SEQ ID No.2所示。具体地，如SEQ ID No.2所示的序列为：ATGTCTGCTGCTAAACTGCCGGACCTGTCTCACCTGTGGATGCCGTTCACCGCTAACCGTCAGTTCAAAGCTAACCCGCGTCTGCTGGCTTCTGCTAAAGGTATGTACTACACCTCTTTCGACGGTCGTCAGATCCTGGACGGTACCGCTGGTCTGTGGTGCGTTAACGCTGGTCACTGCCGTGAAGAAATCGTTTCTGCTATCGCTTCTCAGGCTGGTGTTATGGACTACGCTCCGGGTTTCCAGCTGGGTCACCCGCTGGCTTTCGAAGCTGCTACCGCTGTTGCTGGTCTGATGCCGCAGGGTCTGGACCGTGTTTTCTTCACCAACTCTGGTTCTGAATCTGTTGACACCGCTCTGAAAATCGCTCTGGCTTACCACCGTGCTCGTGGTGAAGCTCAGCGTACCCGTCTGATCGGTCGTGAACGTGGTTACCACGGTGTTGGTTTCGGTGGTATCTCTGTTGGTGGTATCTCTCCGAACCGTAAAACCTTCTCTGGTGCTCTGCTGCCGGCTGTTGACCACCTGCCGCACACCCACTCTCTGGAACACAACGCTTTCACCCGTGGTCAGCCGGAATGGGGTGCTCACCTGGCTGACGAACTGGAACGTATCATCGCTCTGCACGACGCTTCTACCATCGCTGCTGTTATCGTTGAACCGATGGCTGGTTCTACCGGTGTTCTGGTTCCGCCGAAAGGTTACCTGGAAAAACTGCGTGAAATCACCGCTCGTCACGGTATCCTGCTGATCTTCGACGAAGTTATCACCGCTTACGGTCGTCTGGGTGAAGCTACCGCTGCTGCTTACTTCGGTGTTACCCCGGACCTGATCACCATGGCTAAAGGTGTTTCTAACGCTGCTGTTCCGGCTGGTGCTGTTGCTGTTCGTCGTGAAGTTCACGACGCTATCGTTAACGGTCCGCAGGGTGGTATCGAATTCTTCCACGGTTACACCTACTCTGCTCACCCGCTGGCTGCTGCTGCTGTTCTGGCTACCCTGGACATCTACCGTCGTGAAGACCTGTTCGCTCGTGCTCGTAAACTGTCTGCTCCGTTCGAAGAAGCTGCTCACTCTCTGAAAGGTGCTCCGCACGTTATCGACGTTCGTAACATCGGTCTGGTTGCTGGTATCGAACTGTCTCCGCGTGAAGGTGCTCCGGGTGCTCGTGCTGCTGAAGCTTTCCAGAAATGCTTCGACACCGGTCTGATGGTTCGTTACACCGGTGACATCCTGGCTGTTTCTCCGCCGCTGATCGTTGACGAAAACCAGATCGGTCAGATCTTCGAAGGTATCGGTAAAGTTCTGAAAGAAGTTGCT。

需要说明的是，由于同一氨基酸可由几种不同的密码子来决定，故同一氨基酸可对应不同的编码序列。因此本申请中的如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，除可由如SEQ IDNo.2所示的编码序列所编码，也可由如SEQ ID No.2所示编码序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的编码序列所编码得到。本领域技术人员可以根据本申请公开的如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，根据现有分子生物学技术，采用cDNA克隆和定点突变的方法或其他适合的方法获得本申请的如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，因此，如SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列的编码序列并不仅限于SEQ ID NO.2所示的编码序列。如果编码得到的蛋白与本申请的如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。

此外，由于蛋白编码序列的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现基因突变，编码序列中碱基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、插入、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。因此，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。

功能等同的变异体同样适用于通过缺失、插入和突变等人工手段改变一个或多个密码子，从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。

一般的，功能等同变异体的编码序列是同源的，因此，由至少一种改变(如蛋白质的编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性，因此，如果编码得到的蛋白与本申请的转氨酶突变体没有明显的功能差异，也包括在本申请的范围内。

在其中一个实施例中，转氨酶突变体的作用底物包括α-氨基和α-酮酸。其中，α-氨基为α-氨基酸的α-氨基。α-氨基酸例如可以为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或者组氨酸。α-酮酸为含有氨基酸的碳结构骨架的α-酮酸。α-酮酸例如可以为丙酮酸。

在其中一个实施例中，转氨酶突变体的作用底物包括具用远端羧酸基团的氨基酸。其中，具用远端羧酸基团的氨基酸为谷氨酸或者天冬氨酸。

酶活力的提高能够加快酶反应速率，降低酶的用量。酶热稳定性的提高有利于降低反应条件，节省生产成本。一些研究通过耐受性优化等方式能够一定程度提高酶的热稳定性，但是得到的酶的活力较低。一些研究通过诱变等方法能够一定程度提高酶的活性，但是得到的酶在较高温度下容易失活，热稳定性较差。本研究的转氨酶突变体的最适温度为55℃，兼具较高的热稳定性和较高的酶活。

研究发现，天然的转氨酶具有酶活低、相对较窄的底物谱、较为单一的立体选择性(主要为S型手性胺)等缺点，难以应用于工业化生产中。经试验验证，本研究的转氨酶突变体能够催化α-氨基和α-酮酸，还能够催化具用远端羧酸基团的氨基酸，具有较高的底物特异性，并且能够根据需要进行设计以获得S型手性胺或者R型手性胺，具有较高的立体选择性，最适温度为55℃，具有较高的热稳定性，并且具有较高的手性胺合成效率，非常具有工业应用前景。

一实施方式的酶制剂，包括上述实施方式的转氨酶突变体。

其中，酶制剂为可溶性蛋白或者固定化酶。

上述酶制剂包括上述实施方式的转氨酶突变体，具有较高的酶活，能够用于制备手性胺，以能够用于制备药物或者检测试剂。其中，药物例如为医药(例如西他列汀)和农药(例如草铵磷)。检测试剂能够用于临床检测或者病理诊断。检测试剂例如为ELISA试剂盒。

一实施方式的重组载体，包括上述实施方式的转氨酶突变体的编码序列。

在其中一个实施例中，重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

在其中一个实施例中，重组载体含有纯化标签。通过设置纯化标签，有利于活性肽的分离纯化。进一步地，纯化标签为His标签、GST标签或SUMO标签。需要说明的是，纯化标签不限于上述指出纯化标签，其他常见的纯化标签也可以作用重组载体的纯化标签。

在其中一个实施例中，重组载体包括基因工程载体。编码上述转氨酶突变体的核苷酸插入基因工程载体中。进一步地，基因工程载体为pET-32a载体、pET28a载体、pGEX-6P-1载体、pPIC-9K载体或pPIC-Zα载体。需要说明的是，基因工程载体不限于上述指出基因工程载体，其他常见的基因工程载体也可以作用重组载体的基因工程载体。

上述重组载体能够较好地保存编码上述转氨酶突变体的核苷酸，有利于转氨酶突变体的表达，能够应用于制备手性胺。

一种重组细胞，包括上述实施方式的转氨酶突变体的编码序列。

在其中一个实施例中，重组细胞为克隆编码上述转氨酶突变体的编码序列的细胞。

在其中一个实施例中，重组细胞为表达编码上述转氨酶突变体的编码序列的细胞。

在其中一个实施例中，重组细胞包括受体细胞。编码上述转氨酶突变体的编码序列或上述重组载体位于受体细胞内。

在其中一个实施例中，受体细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、放线菌、动物细胞或植物细胞。进一步地，受体细胞为大肠杆菌Escherichia coli 10G、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Top10、大肠杆菌E.coli BL21(DE3)、链霉菌、枯草芽孢杆菌、曲霉菌、毕赤酵母GS115或毕赤酵母SMD1168。

需要说明的是，受体细胞不限于上述指出受体细胞，其他常见的受体细胞也可以作用重组细胞的受体细胞。

上述重组细胞能够克隆或表达上述转氨酶突变体，使得能够大规模的制备该转氨酶突变体，并且通过重组细胞定向表达该转氨酶突变体，以能够获得纯度较高的转氨酶突变体，进而有利于转氨酶突变体的应用，因此，上述重组细胞能够用于制备手性胺，而能够用于制备药物或者检测试剂。其中，药物例如为医药(例如西他列汀)和农药(例如草铵磷)。检测试剂能够用于临床检测或者病理诊断。检测试剂例如为ELISA试剂盒。

上述实施方式的重组细胞的制备方法，包括如下步骤S110～S130：

S110、对上述实施方式的野生型转氨酶的编码序列进行易错PCR扩增，酶切后连接到空载体中，得到转氨酶突变库质粒。

其中，对上述实施方式的野生型转氨酶的编码序列进行易错PCR扩增的步骤中，采用序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示的引物对进行易错PCR扩增。具体地，如SEQ IDNo.3所示的序列为：5’-TACCAGACGACGAcatTTTGACGGCCTGG-3’，其中，带下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点。如SEQ ID No.4所示的序列为：5’-CTTCCATAGCCAAggatccTTCAAGACTTTCTTCAACGA-3’，其中，带下划线碱基为限制性内切酶BamH III识别位点。

其中，易错PCR的反应体系为：0.05U/μL的DreamTaq^TM、250μM的dATP、250μM的dGTP、1050μM的dCTP、1050μM的dTTP、0.4μM的序列如SEQ ID No.3所示的引物、0.4μM的序列如SEQID No.4所示的引物、0.2ng/μL的空载体、0.3mM～0.9mM的氯化镁。

其中，易错PCR的反应条件为：95℃，3min，1个循环；95℃、10s，55℃、35s，72℃、1min，30个循环；72℃，6min，1个循环。

其中，空载体为pET-28a质粒。需要说明的是，空载体不限于为pET-28a质粒，也可以为本领域中其他常用的空载体，例如可以为pUC18质粒或者pUC19质粒。

在其中一个实施例中，对上述实施方式的如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的编码序列进行易错PCR扩增的步骤之前，还包括如下步骤：采用序列如SEQ ID No.3～SEQ IDNo.4所示的引物对PCR扩增如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的编码序列。此种设置有利于富集如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的编码序列，以有利于通过易错PCR扩增构建转氨酶突变库质粒。

其中，如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示的引物对的具体描述详见上文，此处不再赘述。

其中，PCR的反应条件为：98℃，3min，1个循环；98℃、10sec，55℃、10sec，72℃、15sec，30个循环；72℃，5min，1个循环。

S120、将转氨酶突变库质粒分别转化到宿主细胞中，得到转化细胞。

其中，宿主细胞为大肠杆菌。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强等优点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。进一步地，宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。需要说明的是，宿主细胞不限于为上述指出的细胞，也可以为本领域中其他常用的宿主细胞。

其中，转化的方式为电转化。需要说明的是，转化的方式不限于为电转化，也可以为本领域中其他常用的转化方式。

S130、采用IVC-FACS方法对转化细胞进行高通量筛选，得到重组细胞。

定向进化是对酶进行分子改造，从而改善其各方面性质的有力工具。其原理是模拟自然界进化原理，在实验室中人工构建目的蛋白的基因突变库，再利用筛选手段挑选出其中符合预期性质的突变体。然而由于突变库中的阳性率较低，因此，常规的基于微孔板或底物平板的筛选方法由于通量低，费时费力，在定向进化筛选中往往不能得到良好效果。本研究通过建立了基于体外区室化-荧光激活细胞分选(IVC-FACS)技术的超高通量筛选方法，能够对酶突变体进行高效快速的筛选，其筛选通量可达每小时一百万个，能够用于对转氨酶随机突变库的高通量筛选，进而在较短时间内获得活性提高的阳性突变体。

上述重组细胞的制备方法制备的重组细胞能够克隆或表达上述转氨酶突变体，使得能够大规模的制备该转氨酶突变体，并且通过重组细胞定向表达该转氨酶突变体，以能够获得纯度较高的转氨酶突变体，并且具有较优的热稳定性，有利于转氨酶突变体的应用。

研究发现，现有的热稳定性较高的转氨酶主要来自于深海或热泉环境中，天然菌株较少，难以获得，并且培养条件较为严苛，难以简单利用其原始菌株通过发酵获得转氨酶。再者，野生型菌株酶表达水平极低，且难以纯化，故而难以直接应用于工业生产或导致工业生产成本极高。本研究采用模式细胞通过基因工程手段，能够获得培养条件简单、培养周期短、转氨酶突变体的表达量的细胞，并且能够通过添加His等标签使得易于纯化转氨酶突变体，而得到纯度较高的转氨酶突变体。

以下为具体实施例部分。

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

未特别说明，以下实施例中，各引物均生工生物工程(上海)股份有限公司合成。T4DNA连接酶购于NewEngland Biolabs公司；PrimeSTAR Max Premix高保真酶购于TakaRa公司；pET28a质粒购于Novagen公司；DreamTaq DNA聚合酶以及所有限制性内切酶购自于Thermo公司；DNA胶回收试剂盒及小质粒提试剂盒均购于天根生化科技(北京)有限公司。

实施例1

野生转氨酶WP_0532423951.1的编码序列的克隆

野生型转氨酶WP_0532423951.1的编码序列以大肠杆菌为宿主进行密码子优化，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，采用序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示的引物对PCR扩增野生型转氨酶的编码序列，PCR扩增使用Takara公司的PrimeSTAR Max聚合酶。PCR的反应条件为：98℃，3min，1个循环；98℃、10sec，55℃、10sec，72℃、15sec，30个循环；72℃，5min，1个循环。其中，野生型转氨酶WP_0532423951.1的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示；野生型转氨酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

反应结束后，用质量百分含量为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，得到1.0kb的条带，长度符合预期结果。按照DNA胶回收试剂盒的使用说明书回收、纯化该目的片段。使用限制性核酸内切酶Nde I和BamH III对回收片段和pET28a质粒进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素(40ug/mL)的LB培养平板上培养10h。挑取阳性菌株，并采用小质粒提试剂盒提取阳性克隆质粒，进行测序。经测序检测结果显示，克隆的转氨酶WP_0532423951.1基因序列正确，且正确连入pET28a中，将该重组质粒命名为pET28a-WP_0532423951.1。将阳性菌株保存于甘油中。

实施例2

野生转氨酶WP_0532423951.1的表达、纯化及活力测定

将甘油管中的含有pET28a-WP_0532423951.1重组质粒的工程菌按体积比1％接种到含有100ug/mL卡那霉素的4mL LB培养基试管中，37℃、220rpm培养11h。将4mL培养后的菌液转接至含有50ug/mL卡那霉素的1L LB液体培养基中，37℃、220rpm摇瓶培养约2.5h，使OD₆₀₀达到0.8左右，加入0.1mM IPTG诱导剂，25℃、200rpm诱导培养12h。将诱导结束后收获的大肠杆菌悬液固液分离，离心收菌后，将菌液重悬后破碎再次离心，将上清液再经过一步Ni-NTA亲和层析处理后，得到纯度为90％以上的野生型转氨酶。测定野生转氨酶WP_0532423951.1的比活力为8.2U/mg。其中，参考文献Arch Biochem Biophys.2000,373(1):182-92测定转氨酶的比活力。

实施例3

转氨酶的大容量随机突变库的构建

通过连续易错PCR(ep-PCR)的方法构建野生转氨酶WP_0532423951.1的突变库，通过调节PCR体系中的镁离子的浓度来调节其突变率。具体地，采用对实施例1的野生转氨酶WP_0532423951.1的编码序列进行易错PCR扩增。易错PCR的反应体系为：0.05U/μL的DreamTaq^TM(购于Takara公司)、250μM的dATP、250μM的dGTP、1050μM的dCTP、1050μM的dTTP、0.4μM的序列如SEQ ID No.3所示的引物、0.4μM的序列如SEQ ID No.4所示的引物、0.2ng/μL的空载体、0.3mM～0.9mM的氯化镁(即PCR体系中的氯化镁的浓度为0.3mM～0.9mM中的某一值，通过不同浓度的氯化镁调节野生转氨酶WP_0532423951.1的突变率)；每管总体积为25μL，空载体为pET-28a质粒。易错PCR的反应条件为：95℃，3min，1个循环；95℃、10s，55℃、30s，72℃、1min，30个循环；72℃，5min，1个循环。

将易错PCR获得的扩增产物经经琼脂糖电泳，切胶方法纯化后，用Nde I和BamHIII进行双酶切，然后用T4连接酶克隆到pET28a质粒上，再将纯化后的连接体系电转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。转化细胞经复苏后接种到50mL的LB液体培养基(含有50μg/mL的卡那霉素)中，在37℃培养过夜。取培养液并采用小质粒提试剂盒提取质粒，得到突变库质粒。同时，取培养液涂布含有20μg/mL的卡那霉素的LB琼脂糖平板上在37℃培养12h，计算突变库质粒的库容量约为100万个。取若干克隆采用本领域的常规方法测定突变率，发现镁离子浓度为0.7mM时，获得突变率大约为平均每个基因2个变氨基酸残基。突变库的质粒转化宿主BL21(DE3)，经LB液体培养、诱导、表达，得到表达转氨酶突变库的BL21(DE3)细胞。

实施例4

转氨酶随机突变库的IVC-FACS高通量筛选

将表达转氨酶突变库的BL21(DE3)细胞包裹入w/o/w(水包油包水型)二级微液滴进行酶反应。

具体地，采用微型膜挤出仪(Avanti Polar Lipids，AL，USA)，配套的两只注射器(Gastight 1001syringe，1mL，Hamilton,NV,USA)以及孔径为8微米的Track-Etch聚碳酸酯膜(Millipore，USA)来制备微液滴。

首先，将膜固定在膜挤出仪中，然后用注射器吸取0.5mL的油相(油相成分为：含有体积百分含量为2.9％的ABIL EM90乳化剂的轻石蜡油)润洗膜两次。乳化时，将100μL的内水相(即Escherichia coli BL21(DE3)-CodonPlus细胞悬液，其中，细胞浓度以OD值(即光密度值)表示时，OD600为0.6～0.8)与400μL的油相(油相成分为：含有体积百分含量为2.9％的ABIL EM90乳化剂的轻石蜡油)吸取到同一支注射器中，混合体系经膜挤出仪推注到另一个注射器中，然后再推回到第一个注射器中，这一过程称为一次乳化，生成w/o(油包水型)一级微液。生成的w/o一级微液滴通过显微镜(50i，Nikon，Japan，40×object)实时观察，通过优化乳化次数，使微液滴的直径分布在3～5μm。

制备的w/o一级微液滴通过8μm孔径的膜分散到次水相(即含有体积百分含量为1％TritonX-102的1×PBS，pH7.4)中，生成w/o/w二级微液滴。具体步骤为：将一片新的膜置于膜挤出仪中，用0.5mL次水相润洗两遍。将200μL的w/o一级微液滴和400μL的次水相分别吸取到两支注射器中；具体地，首先，将w/o一级微液滴通过膜挤出仪注入第二支注射器的次水相中，再通过膜挤出仪将混合体系推回原注射器中，完成一次乳化。生成的w/o/w二级微液滴的形态分布通过显微镜进行实时观察，通过优化乳化次数，使得最终w/o/w二级微液滴的直径在10μm左右且大小相对均一。在向0.2mL的含有w/o/w二级微液滴的外水相(外水相为水，w/o/w二级微液滴的含量为80％)中加入0.02mL的荧光底物(即含有10mM的可产生高荧光的试卤灵的Amplite ADHP中，购于Aladin公司)，在37℃、1000rpm的金属浴上震荡孵育30min，以进行酶反应，荧光底物Amplite ADHP的终浓度为0.5mM。

用分选型流式细胞仪(BD FACSAria^TM II)检测反应体系的荧光信号，喷嘴的内径为100μm，样品的检测速度为10000滴/sec具有最高荧光强度的液滴(约占含细胞液滴的0.1％)被分选入空的2mL eppendorf管中，以此为模板将阳性基因进行PCR扩增，PCR反应体系为：0.05U/μL的DreamTaq^TM(购于Takara)、250μM的dATP、250μM的dGTP、250μM的dCTP、250μM的dTTP、0.4μM的序列如SEQ ID No.3所示的引物、0.4μM的序列如SEQ ID No.4所示的引物。其中，1000个细胞的分选后体积约为5μL。PCR反应条件为：95℃，3min，1个循环；95℃、15s，55℃、30s，72℃、1min，30个循环；72℃，5min，1个循环。

将PCR产物重新克隆到pET-28a(+)质粒中，并平板培养后，将获得单克隆挑入96孔板中37℃、400rpm进行培养，每个孔含有200μL LB培养基；当细胞OD600达到0.6～0.8时加入1.0mM的IPTG，25℃诱导20h。诱导结束后，3000rpm离心30min收集细胞，弃上清。采用高压匀质机在800bar、4℃下将细胞通过冻融裂解，向裂解后得到的裂解液中加入200μL的PBS混匀，3000rpm离心30min，取上清，得粗酶液。取10μL粗酶液与10μL的4-硝基苯基丁酸酯的乙腈溶液(4-硝基苯基丁酸酯的浓度为10mM，购于Sigma公司)及180μL的PBS在新的96孔板中37℃反应5min，反应结束后采用分光光度计在波长为405nm下检测不同克隆的酶活性。选择活性高于野生型转氨酶的转氨酶突变体并进行测序，并将阳性突变体经大量培养表达后用镍柱亲和层析进行纯化，得到表1所示的八种转氨酶突变体。

通过Swiss-modle软件构建野生转氨酶WP_0532423951.1的蛋白晶体模型，详见图1。图1中，虚线方框所框处的结构即为野生型转氨酶的如下四个突变位点：第226位氨基酸位点、第281位氨基酸位点、第312位氨基酸位点及第406位氨基酸位点。

测定上述八种转氨酶突变体和野生转氨酶WP_0532423951.1的酶活，并计算转氨酶突变体的酶活与野生型转氨酶的酶活之比。参考文献Arch Biochem Biophys.2000,373(1):182-92测定转氨酶的比活力。测定结果详见表1。表1中，倍数为转氨酶突变体的酶活相对于野生型转氨酶的酶活的倍数，“T226R/A281S”表示同时存在T226R和A281S两种突变，“T226R/R406C”表示同时存在T226R和R406C两种突变，“I312D/R406C”表示同时存在I312D和R406C两种突变，“T226R/A281S/I312D”表示同时存在T226R、A281S和I312D三种突变。

表1野生型转氨酶和转氨酶突变体的酶活力

经筛选，得到表1中八种转氨酶突变体，该八种转氨酶突变体的比活力为10.4U/mg～31.8U/mg，是野生型转氨酶突变体的比活力的1.26倍～3.88倍，说明上述实施方式的转氨酶突变体具有较高的酶活。

采用本领域的常规方法测定T226R、A281S、I312D、R406C、T226R/A281S、T226R/R406C、I312D/R406C、T226R/A281S/I312D八种转氨酶突变体及野生转氨酶WP_0532423951.1的最适温度。

经测定，上述八种转氨酶突变体及野生转氨酶WP_0532423951.1的最适温度均为55℃，说明上述八种转氨酶突变体具有与野生转氨酶WP_0532423951.1相当的热稳定性，进而说明上述八种转氨酶突变体兼具较高的酶活和较高的热稳定性。

综上，上述转氨酶突变体具有较高的酶活，能够催化α-氨基和α-酮酸，还能够催化具用远端羧酸基团的氨基酸，具有较高的底物特异性和较高的立体选择性，最适温度为55℃，具有较高的热稳定性，并且具有较高的手性胺合成效率，能够用于制备药物或者检测试剂，非常具有工业应用前景。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所

<120> 转氨酶突变体、酶制剂、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Ala Ala Lys Leu Pro Asp Leu Ser His Leu Trp Met Pro Phe

1 5 10 15

Thr Ala Asn Arg Gln Phe Lys Ala Asn Pro Arg Leu Leu Ala Ser Ala

20 25 30

Lys Gly Met Tyr Tyr Thr Ser Phe Asp Gly Arg Gln Ile Leu Asp Gly

35 40 45

Thr Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Ala Gly His Cys Arg Glu Glu Ile

50 55 60

Val Ser Ala Ile Ala Ser Gln Ala Gly Val Met Asp Tyr Ala Pro Gly

65 70 75 80

Phe Gln Leu Gly His Pro Leu Ala Phe Glu Ala Ala Thr Ala Val Ala

85 90 95

Gly Leu Met Pro Gln Gly Leu Asp Arg Val Phe Phe Thr Asn Ser Gly

100 105 110

Ser Glu Ser Val Asp Thr Ala Leu Lys Ile Ala Leu Ala Tyr His Arg

115 120 125

Ala Arg Gly Glu Ala Gln Arg Thr Arg Leu Ile Gly Arg Glu Arg Gly

130 135 140

Tyr His Gly Val Gly Phe Gly Gly Ile Ser Val Gly Gly Ile Ser Pro

145 150 155 160

Asn Arg Lys Thr Phe Ser Gly Ala Leu Leu Pro Ala Val Asp His Leu

165 170 175

Pro His Thr His Ser Leu Glu His Asn Ala Phe Thr Arg Gly Gln Pro

180 185 190

Glu Trp Gly Ala His Leu Ala Asp Glu Leu Glu Arg Ile Ile Ala Leu

195 200 205

His Asp Ala Ser Thr Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Met Ala Gly

210 215 220

Ser Thr Gly Val Leu Val Pro Pro Lys Gly Tyr Leu Glu Lys Leu Arg

225 230 235 240

Glu Ile Thr Ala Arg His Gly Ile Leu Leu Ile Phe Asp Glu Val Ile

245 250 255

Thr Ala Tyr Gly Arg Leu Gly Glu Ala Thr Ala Ala Ala Tyr Phe Gly

260 265 270

Val Thr Pro Asp Leu Ile Thr Met Ala Lys Gly Val Ser Asn Ala Ala

275 280 285

Val Pro Ala Gly Ala Val Ala Val Arg Arg Glu Val His Asp Ala Ile

290 295 300

Val Asn Gly Pro Gln Gly Gly Ile Glu Phe Phe His Gly Tyr Thr Tyr

305 310 315 320

Ser Ala His Pro Leu Ala Ala Ala Ala Val Leu Ala Thr Leu Asp Ile

325 330 335

Tyr Arg Arg Glu Asp Leu Phe Ala Arg Ala Arg Lys Leu Ser Ala Pro

340 345 350

Phe Glu Glu Ala Ala His Ser Leu Lys Gly Ala Pro His Val Ile Asp

355 360 365

Val Arg Asn Ile Gly Leu Val Ala Gly Ile Glu Leu Ser Pro Arg Glu

370 375 380

Gly Ala Pro Gly Ala Arg Ala Ala Glu Ala Phe Gln Lys Cys Phe Asp

385 390 395 400

Thr Gly Leu Met Val Arg Tyr Thr Gly Asp Ile Leu Ala Val Ser Pro

405 410 415

Pro Leu Ile Val Asp Glu Asn Gln Ile Gly Gln Ile Phe Glu Gly Ile

420 425 430

Gly Lys Val Leu Lys Glu Val Ala

435 440

<210> 2

<211> 1320

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtctgctg ctaaactgcc ggacctgtct cacctgtgga tgccgttcac cgctaaccgt 60

cagttcaaag ctaacccgcg tctgctggct tctgctaaag gtatgtacta cacctctttc 120

gacggtcgtc agatcctgga cggtaccgct ggtctgtggt gcgttaacgc tggtcactgc 180

cgtgaagaaa tcgtttctgc tatcgcttct caggctggtg ttatggacta cgctccgggt 240

ttccagctgg gtcacccgct ggctttcgaa gctgctaccg ctgttgctgg tctgatgccg 300

cagggtctgg accgtgtttt cttcaccaac tctggttctg aatctgttga caccgctctg 360

aaaatcgctc tggcttacca ccgtgctcgt ggtgaagctc agcgtacccg tctgatcggt 420

cgtgaacgtg gttaccacgg tgttggtttc ggtggtatct ctgttggtgg tatctctccg 480

aaccgtaaaa ccttctctgg tgctctgctg ccggctgttg accacctgcc gcacacccac 540

tctctggaac acaacgcttt cacccgtggt cagccggaat ggggtgctca cctggctgac 600

gaactggaac gtatcatcgc tctgcacgac gcttctacca tcgctgctgt tatcgttgaa 660

ccgatggctg gttctaccgg tgttctggtt ccgccgaaag gttacctgga aaaactgcgt 720

gaaatcaccg ctcgtcacgg tatcctgctg atcttcgacg aagttatcac cgcttacggt 780

cgtctgggtg aagctaccgc tgctgcttac ttcggtgtta ccccggacct gatcaccatg 840

gctaaaggtg tttctaacgc tgctgttccg gctggtgctg ttgctgttcg tcgtgaagtt 900

cacgacgcta tcgttaacgg tccgcagggt ggtatcgaat tcttccacgg ttacacctac 960

tctgctcacc cgctggctgc tgctgctgtt ctggctaccc tggacatcta ccgtcgtgaa 1020

gacctgttcg ctcgtgctcg taaactgtct gctccgttcg aagaagctgc tcactctctg 1080

aaaggtgctc cgcacgttat cgacgttcgt aacatcggtc tggttgctgg tatcgaactg 1140

tctccgcgtg aaggtgctcc gggtgctcgt gctgctgaag ctttccagaa atgcttcgac 1200

accggtctga tggttcgtta caccggtgac atcctggctg tttctccgcc gctgatcgtt 1260

gacgaaaacc agatcggtca gatcttcgaa ggtatcggta aagttctgaa agaagttgct 1320

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taccagacga cgacattttg acggcctgg 29

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttccatagc caaggatcct tcaagacttt cttcaacga 39

Claims

1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体的氨基酸序列由野生型转氨酶的氨基酸序列发生突变得到，所述野生型转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述突变的方式为T226R、A281S、I312D、R406C、T226R/A281S、T226R/R406C、I312D/R406C、T226R/A281S/I312D中的任意一种。

2.一种酶制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的转氨酶突变体。

3.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求1所述的转氨酶突变体的编码序列。

4.一种重组细胞，其特征在于，包括权利要求1所述的转氨酶突变体的编码序列。

5.权利要求4所述的重组细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的重组细胞的制备方法，其特征在于，所述对所述野生型转氨酶的编码序列进行易错PCR扩增的步骤中，采用序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示的引物对进行易错PCR扩增。

7.根据权利要求5～6任一项所述的重组细胞的制备方法，其特征在于，所述对所述野生型转氨酶的编码序列进行易错PCR扩增的步骤之前，还包括如下步骤：采用序列如SEQ IDNo.3～SEQ ID No.4所示的引物对PCR扩增所述野生型转氨酶的编码序列。

8.权利要求1所述的转氨酶突变体、权利要求2所述的酶制剂、权利要求3所述的重组载体或者权利要求4所述的重组细胞在制备药物或者检测试剂中的应用。