CN111100847A - 安全性更高的端粒基因治疗产品使人体健康逆转衰老 - Google Patents

Abstract

在人体细胞中，细胞每分裂一次，染色体顶端的端粒就缩短一次，当端粒不能再缩短时，细胞就无法继续分裂了。这时候细胞也就到了普遍认为的分裂100次的极限并开始死亡。因此端粒被科学家们视为“生命时钟”端粒不仅有保护染色体稳定性，和细胞更新分裂识别起点重要作用，端粒的长短达到了启动子和沉默子功能，作用于调控染色体下游蛋白表达，这些蛋白的表达和衰老有这各种关联，延长端粒对健康逆转衰老十分重要，此项发明是本人第二种端粒基因治疗发明，安全性更高。使用腺病毒基为因治疗载体，严格把控端粒酶活性，使致癌风险降为零。为了解决端粒基因治疗载体的生产问题，附加一种批量包装腺病毒基因治疗载体的方法。

Description

安全性更高的端粒基因治疗产品使人体健康逆转衰老

发明领域：

此项发明是根据基因治疗技术领域，和基因工程技术技术领域的发明的成果。

技术背景：

基因治疗是将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。也包括转基因等方面的技术应用。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。

体细胞基因治疗：体细胞基因治疗是将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗目的。这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体特定基因座位，用健康的基因确切地替换异常的基因，使其发挥治疗作用。

病毒介导基因转移，病毒介导基因转移是通过转换方式完成基因转移，即以病毒为载体，将外源目的基因通过基因重组技术，将其组装于病毒上，让这种重组病毒去感染受体宿主细胞，这种病毒称为病毒运载体。

DNA病毒介导载体：有人发现，因缺少E1区而致复制缺陷的腺病毒，可在表达E1基因的细胞中繁殖。后来证明，载有外源DNA的复制缺陷腺病毒呈现相同繁殖的特点。1993年美法等国成功采用腺病毒载体进行心、脑、肺、肝内胆管和肌肉组织的体内基因转移。它代表了基因治疗的新方向，采用复制缺陷的腺病毒进行基因治疗有以下优点：

①该病毒可感染分裂和非分裂的细胞，并能得到大量基因产物，对神经细胞、心肌细胞等基因缺陷的纠正有特殊意义；

②病毒颗粒相对稳定，并易于纯化和浓缩，且感染力不降低；

③可有效转导多种靶细胞后而少游离于细胞基因组外，并持续表达；

④已用于基因治疗的Ad5属腺病毒C亚群，无致癌性。

前述的新腺病毒载体还有一大优点是可以成功地运载48000bp的基因，而其它病毒只能运输7000bp的基因。这些优点显示了腺病毒介导载体的广阔应用前景。

基因治疗目标：

端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构，作用是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期。端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。

端粒其长度反映细胞复制史及复制潜能，被称作细胞寿命的“有丝分裂钟”。

端粒是短的多重复的非转录序列(TTAGGG)及一些结合蛋白组成特殊结构，除了提供非转录DNA的缓冲物外，它还能保护染色体末端免于融合和退化，在染色体定位、复制、保护和控制细胞生长及寿命方面具有重要作用，并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。当细胞分裂一次，每条染色体的端粒就会逐次变短一些。

构成端粒的一部分基因约50～200个核苷酸，会因多次细胞分裂而不能达到完全复制(丢失)，以至细胞终止其功能不稳定。

细胞分裂次数越多，其端粒磨损越多，细胞寿命越短。

端粒DNA是由简单的DNA高度重复序列组成的，染色体末端沿着5′到3′方向的链富含GT。在酵母和人体中，端粒序列分别为C1-3A/TG1-3和TTAGGG/CCCTAA，并有许多蛋白与端粒DNA结合，

端粒酶作用的模式

端粒DNA主要功能有：

第一，保护染色体不被核酸酶降解；

第二，防止染色体相互融合；

第三，为端粒酶提供底物，解决DNA复制的末端隐缩，保证染色体的完全复制。

端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。同时，端粒又是基因调控的特殊位点，常可抑制位于端粒附近基因的转录活性(称为端粒的位置效应，TPE)。

在大多真核生物中，端粒的延长是由端粒酶催化的。另外，重组机制也介导端粒的延长。端粒酶在细胞中负责端粒的延长的一种酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端，把DNA复制损失的端粒填补起来，使端粒修复延长，可以让端粒不会因细胞分裂而有所损耗，使得细胞分裂的次数增加。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短端粒(缩短的端粒其细胞复制能力受限)，从而增强体外细胞的增殖能力。端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，在肿瘤中被重新激活，从而可能参与恶性转化。端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。端粒酶的存在，就是把DNA复制的缺陷填补起来，即由把端粒修复延长，可以让端粒不会因细胞分裂而有所损耗，使得细胞分裂的次数增加。但是，在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控，只有在造血细胞、干细胞和生殖细胞，这些必须不断分裂的细胞之中，才可以侦测到具有活性的端粒酶。当细胞分化成熟后，必须负责身体中各种不同组织的需求，各司其职，于是，端粒酶的活性就会渐渐的消失，端粒酶是一种由催化蛋白和RNA模板组成的酶，可合成染色体末端的DNA，赋予细胞复制的永生性，细胞愈老，其端粒长度愈短；细胞愈年轻，端粒愈长，端粒与细胞老化有关系。衰老细胞中的一些端粒丢失了大部分端粒重复序列。当细胞端粒的功能受损时，出现衰老。而当端粒缩短至关键长度后，衰老加速，临近死亡。

发明内容：

本发明是在本人以前用于保健抗衰老疗法专利基础上，新增加的一种治疗技术，使用的基因治疗载体是腺病毒载体，腺病毒是一种大分子36kb双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后携带端粒酶逆转录酶基因转移至细胞核内进行基因治疗，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中，载体只保留了腺病毒包装必须元件Ad5Ψ，去掉了带有人体复制起点功能的5LTR和3LTR元件，没有复制起点将很难包装成病毒颗粒，不过有应对方案和批量生产专利，使用和人体细胞完全不相同的复制起点，此复制起点只能在大肠杆菌里起到复制作用，在人体细胞完全失去复制作用，在BJ5183大肠杆菌完成包装，配备了腺病毒所包装的环境，在细菌里包装腺病毒载体的好处就是不会出现其他野生病毒，影响治疗用途载体的安全性，在哺乳动物细胞导入大肠杆菌所需的基因复制因子，DNA聚酶和解旋酶也可以完成包装，相比以前的发明专利都各具有治疗的优势，本发明更加严格控制端粒酶基因的活性，多加一重保障，在多重保障下使致癌的风险为零，治疗的效果可能比以前的专利有所折扣，原因是CMV启动子比TRE3G效率高，为了治疗产品足够的安全性，不得不降低治疗效率提高安全性，端粒酶基因在生物细胞活性受到控制，部分需要大量更新细胞的端粒酶长期具有活性，端粒酶基因长期具有活性致癌几率依然很低，本发明第一重保障和以前专利一样，治疗载体没有人体细胞的复制起点，人体细胞的复制起点需要特定保守的基因序列，因此治疗载体就不会在人体细胞拷贝复制，治疗载体不会传代细胞，分裂出的细胞是不携带治疗载体基因，治疗载体基因是游离于细胞染色体，在没有核小体的保护下，治疗载体基因在一定时间会降解消失，严格的把控了端粒酶基因的活性，所以前的专利技术足够的安全。

本发明增加第二重安全保障，端粒酶基因的表达使用了最严格调控的诱导性启动子TRE3G，Tet3G阻遏蛋白是由rtTA阻遏蛋白改进而来，具有更高的敏感性，Tet3G调控表达系统通过诱导药物(如四环素和强力霉素等)改变调控蛋白的构象，从而达到调控目标蛋白表达的目的。Tet3G调控基因表达系统是以大肠杆菌Tn10转座子上Tet抗性操纵子为基础而建立的。Tet3G阻遏蛋白与TRE3G操纵子，能够特异性结合。当无诱导药物存在时，Tet3G会与TRE3G结合，从而阻断端粒酶基因的表达；当有诱导药物存在时，Tet3G的构象会发生改变，并从TRE3G上脱离下来，使端粒酶基因得以表达，端粒酶活性从而受到严格控制，在基因治疗载体完成细胞端粒延长治疗后，停止服用四环素药物，将不具有端粒酶活性，这是第二重保障。

附图说明

图1腺病毒载体序列特征：

图1载体中的各个元件功能，Ad5Ψ是载体基因包装信号识别点，用于载体包装成病毒颗粒，载体TRE3G诱导性启动子和端粒酶逆转录酶基因用于药物调控转录和翻译端粒酶，端粒酶进入细胞核完成细胞端粒延长治疗，载体Tet3G是结合TRE3G启动子的阻遏蛋白用于开启关闭TREG的功能，载体SV40poly(A)元件负责mRAM的稳定性和出入核孔，载体promoter 元件和AmpR元件负责筛选大肠杆菌用于包装腺病毒颗粒，AmpR只在大肠杆菌里表达，在人体细胞不具备表达功能对人体细胞无影响，载体ori元件是大肠杆菌专属复制起点，负责载体拷贝和包装成腺病毒颗粒，ori复制起点在哺乳动物细胞和其他细菌不具有复制拷贝功能，或者哺乳动物细胞必须经过处理配备ori复制起点的环境才能复制。

批量包装各种基因治疗载体发明内容：

Tet-On3G表达调控系统也可以用于各种病毒包装在细菌和哺乳动物细胞都适用，特点是不用pcr扩增基因，无需每次都需要导入包装质粒，把包装全部所需的质粒导入受体细胞，通过Tet-On3G表达调控系统，控制病毒基因表达，在没有四环素情况下不会产生病毒颗粒，不会影响受体细胞的生长分裂，培养扩增受体细胞，拿出部分受体细胞加入四环素培养，此时病毒基因激活包装产生病毒颗粒，如此可以批量包装各种病毒载体。实验室和生物公司都是采用pcr扩增和基因导入的方法包装，不仅成本高而且效率低，实验方法比如一组腺病毒包装质粒pAAV-RC2、pAAV-MCS、pHelper质粒一起包装成腺相关病毒，pAAV-RC2 的载体含有CAP和REP基因，这些基因可以产生产生传染性病毒所需的衣壳和DNA复制蛋白将该载体共转染到包装细胞系中，制备重组的复制缺陷型AAV病毒，pAAV-RC质粒含有 AAV-2rep和CAP基因，分别编码复制蛋白和病毒衣壳结构蛋白。建立REP和CAP基因产物的正确表达水平是实现高滴度病毒生产的重要步骤。pAAV-RC从两个不同的启动子指导REP 和CAP的表达，把这两个启动子酶切掉换成TRE3G启动子，调控REP和CAP的表达，pAAV-MCS 和pHelper其中一个或两个，插入Tet3G阻遏蛋白基因，先将这两个质粒和目的基因载体导入受体细胞，过一段时间受体细胞表达有足够多的Tet3G阻遏蛋白，在将pAAV-RC2导入受体细胞，培养扩增受体细胞，拿出部分受体细胞加入四环素培养，REP和CAP表达激活，腺病毒载体在受体细胞完成包装，此方法适用于所有的宿主细胞和病毒包装，将部分病毒衣壳蛋白基因用Tet-On3G系统调控表达，可高效率包装出各种病毒载体。

实施方式：

用于端粒延长的基因治疗产品，需要大量的病毒颗粒，足够的多的数量才能达到理想效果，纯化出安全无毒对人体没有影响的基因治疗产品，一次治疗使用的治疗载体数量在5万亿左右，这大约是人体细胞数量的10％，现有包装技术效率低可能无法办到或成本高昂，为了让每个人都能享受治疗的好处，结合本人的两种载体构建包装发明可高效率的包装出治疗载体。降低治疗者免疫功能，在无菌医疗室通过静脉输液的方式输入人体内，治疗者会有发烧的症状，过两天症状就会消除并且完成了治疗恢复免疫能力，治疗者还需要服用1个月的四环素药物，治疗载体刚进入人体细胞，在没有四环素药物下，在一周时间内治疗载体依然会起到治疗效果，因为一周后治疗载体在没有四环素药物情况下会失效，一次基因治疗完成了上千亿细胞的端粒延长，可更新分裂细胞多出上万亿个，寿命提升约百分之一，治疗者只需要半年做一次治疗，就可以保证身体端粒不会耗损，达到健康逆转衰老的治疗效果，随着年龄增加身体端粒耗损过多，会出现一系列衰老的疾病如癌症和中风带来健康的风险，长期保持治疗预计提升寿命可达50％以上，在实验室对单个细胞株只需要延长端粒，已经赋予了这个细胞永生化，对于人体细胞而言会提升寿命是细胞更新的基础，实现最理想的抗衰老治疗，还受身体2％高度分化不可分裂细胞限制，突破寿命极限还需要对不可分裂细胞进行干细胞再生治疗，干细胞再生治疗世界目前有一定成果，本发明对干细胞的安全性的扩增培养有这重要用途。

Claims (6)

1.一种基因治疗用途包含端粒酶逆转录酶基因的腺病毒颗粒。

2.腺病毒治疗载体不包含哺乳动物细胞复制起点。

3.端粒酶逆转录酶的启动子是TRE3G。

4.Tet3G阻遏蛋白基因和TRE3G诱导性启动子构成调控端粒酶逆转录酶的活性。

5.如1、2、3、4所诉用于延长维持人体细胞端粒基因的基因治疗产品，其特征是进入人体细胞不会复制，载体基因不会传代细胞，四环素调控端粒酶逆转录酶活性，避免致癌，表达端粒酶逆转录酶延长端粒基因从而达到保健延长寿命治疗效果。

6.腺病毒载体包括：Ad5Ψ基因、TRE3G基因、端粒酶逆转录酶基因、CMV enhancer基因，CMV promote基因，Sv40 poly(A)基因、ori基因、AmpR promote基因、AmpR基因。

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