CN111100117B - 氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型a及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型A，以2θ角度表示的X‑射线粉末衍射在11.06±0.2°，12.57±0.2°，13.74±0.2°，14.65±0.2°，15.48±0.2°，16.58±0.2°，17.83±0.2°，19.20±0.2°，19.79±0.2°，20.88±0.2°，22.05±0.2°，23.06±0.2°，24.23±0.2°，25.10±0.2°，25.71±0.2°，26.15±0.2°，27.37±0.2°，27.42±0.2°附近处具有衍射峰(如附图3)。还提供了该晶型A的制备方法，本发明氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型A具有良好的溶解度，在动物体内的生物利用度高。其可用于治疗或预防哺乳动物尤其人类由表皮生长因子(EGFR)的突变(激活或耐药型)介导的疾病或医学病症，特别是癌症的药物组合中的应用。

Description

氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型A及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物合成领域，具体涉及氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型A及其制备方法和应用。

背景技术

表皮生长因子受体(EGFR)是人体内的一类跨膜受体酪氨酸激酶，该区域的激活(即磷酸化)对肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有重要意义。EGFR激酶与大部分的癌症的疾病进程有关，这些受体会在许多主要的人体肿瘤中过度表达。这些家族成员的过度表达、突变或者与之结合的配体的高度表达，都会导致一些肿瘤疾病的产生，如非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、头颈癌、宫颈癌、膀胱癌、甲状腺癌、胃癌和肾癌等。

近年来表皮生长因子受体酪氨酸激酶已成为当今抗肿瘤药物研究最引人注目的靶点之一。2003年，美国FDA批准了第一个表皮生长受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)类药物易瑞沙

(吉非替尼)用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)，掀开了第一代EGFR抑制剂的开发。众多临床试验证实对于EGFR阳性突变非小细胞肺癌患者分子靶向药物治疗效果显著优于传统化疗。

虽然第一代EGFR抑制类靶向药物对众多非小细胞肺癌(NSCLC)患者的初期治疗响应良好，但大多数患者最终会由于产生抗药性(如EGFR二级T790M突变)而发生疾病进展。抗药性的产生是在原有EGFR通路活性突变的基础上通过各种不同的机制所致。针对第一代EGFR抑制剂的耐药研究，研究前沿的已经是不可逆的第三代EFGR抑制剂。

但截至目前为止，在全球范围内第三代EGFR抑制剂，除了阿斯利康公司的奥希替尼(泰瑞沙

)开发成功，尚无有效针对T790M耐药突变患者的药物获批供临床治疗使用，若干针对T790M突变的候选药物正处于临床开发阶段。这类第三代EGFR抑制剂化学结构与第一代截然不同。与第一代EGFR抑制剂的主要不同点在于它们均使用高选择性核心结构替代第一，二代EGFR-TKI的低选择性氨基喹啉核心结构。相对于野生型EGFR，这些第三代化合物均对EGFR阳性耐药后T790M突变具有高度特异选择性。

本公司专利申请CN201580067776.8公开如下式I结构化合物，该化合物亦属于第三代EGFR-TKI类小分子靶向药物。该化合物对于具有单活性突变及T790M双突变EGFR的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞均有高度抑制作用，其有效抑制浓度显著低于抑制野生型EGFR酪氨酸激酶活性所需的浓度。具有选择性好，毒副作用较低，安全性好的特点。

本公司专利申请CN201780050034.3亦公开如上式I结构化合物的各种盐及对应晶型，其实施例2披露了式I化合物甲磺酸盐的两种晶体形式，分别为2A和2B。

发明内容

本发明的目的在于提供氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的新的晶型A及其制备方法和应用。涉及式I化合物的甲磺酸盐，基本上纯的新晶型，和药学上可接受的盐。

与本公司已公开CN201780050034.3专利实施例2披露晶体2A和2B对比，本申请晶型从XPRD特征峰数目、位置及强度均有不同，熔点亦具有显著差异，其制备工艺下得到的晶型具有纯度更高、更稳定，更有利于其在医药领域的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型A，所述氨基嘧啶类化合物为式I化合物，该晶型的XRPD图谱在2θ(±0.2°)为11.06，12.57，13.74，14.65，15.48，16.58，17.83，19.20，19.79，20.88，22.05，23.06，24.23，25.10，25.71，26.15，27.37，27.42(相对强度大于10％)处有衍射峰，

优选地，所述晶型A的XRPD图谱如图3所示。

优选地，所述晶型A的红外光谱图如图6所示。

本发明还提供了氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型A的制备方法，包括：用有机溶剂溶解式Ⅰ化合物甲磺酸盐，搅拌析晶、过滤、干燥后得目标晶型A，所述有机溶剂包括二甲基亚砜、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺。

优选地，还包括：将式I化合物和甲磺酸按照投料摩尔比1.05-0.97制得式Ⅰ化合物甲磺酸盐。

优选地，加入反溶剂搅拌析晶，所述反溶剂包括甲基叔丁基醚、乙酸异丙酯、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、乙腈、甲苯、丙酮和水。

优选地，过滤后在30-70℃(更优选40-50℃)下进行常压或真空干燥。

本发明还提供了一种药物组合物，包含氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型A和药学上可接受的载体。

本发明又提供了氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型A，上述药物组合物或联合用药在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为肺癌。

本发明的有益效果如下：

经实验发现，本发明的氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型A纯度高，且性质稳定，具有良好的溶解度，在动物体内的生物利用度高。其可用于治疗或预防哺乳动物尤其人类由表皮生长因子(EGFR)的突变(激活或耐药型)介导的疾病或医学病症，特别是癌症的药物组合和联合用药中的应用。

附图说明

图1是式I化合物的核磁氢谱图谱。

图2是晶型A的核磁氢谱图谱。

图3是晶型A的XRPD图谱及表。

图4是晶型A的差示扫描量热(DSC)图谱。

图5是晶型A热重分析(TGA)图谱。

图6是晶型A的红外光谱图(IR)图谱。

图7是不同制备方法得到晶型A的粉末X-射线衍射图(XPRD)对比图。

图8是SD大鼠单次给药后血药浓度-时间曲线图。

图9是实施例2制备得到式(I)化合物的甲磺酸盐(即晶型A)在单次和联合给药下的人肺癌H1975裸小鼠皮下移植瘤的肿瘤体积变化-时间曲线图。

图10是实施例2制备得到式(I)化合物的甲磺酸盐(即晶型A)在单次和联合给药下的下的人肺癌H1975裸小鼠的体重变化-时间曲线图。

具体实施方式

现通过以下实施例来进一步描述本发明的有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰，也包含在本发明范围之类。

以下各实施例中“室温”在15-25℃均可。

(一)N-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)-4-甲氧基-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰胺(式I化合物)的制备

已知的(例如可参见CN201580067776.8)N-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)-4-甲氧基-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰胺(式I化合物)可通过下述合成路线制备得到：

步骤1-中间体J的制备：

制备：10L反应瓶中，加入6L无水四氢呋喃溶剂，氮气保护，冷却至0℃。搅拌状态下，缓慢加入101g钠氢(101g，2.52mol)，内温不超过10℃，加入234g二甲氨基乙醇(234g，2.62mol)。加毕，温度调整至室温，制备得到醇钠溶液。

30L反应瓶中，加入N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-嘧啶胺(起始物料B)(430g，1.10mol)，然后加入9L的四氢呋喃，开启搅拌下，溶清，控制温度在10±10℃，缓慢滴加制备好的醇钠溶液。控制温度在10±10℃，保温5.0h。当原料含量≤0.5％，反应结束。控制温度在10±10℃，缓慢滴加3％盐酸溶液，调整溶液PH至6-7，搅拌1.5h后静置分层，分出有机相，浓缩至15～20V。降温至20±5℃后，缓慢滴加4.3kg的水，过滤，烘干，得497g黄色粉末中间体J，收率为98.0％，HPLC纯度为99.3％。MS m/z：463.2[M+1]。核磁数据：¹HNMR(d6-DMSO)：δppm：8.78(s，1H)；8.42-8.28(m，3H)；8.16(s，1H)；7.53(d，1H,J＝8.28)；7.29-7.20(m，2H)；7.13-7.07(m，1H)；7.01(s，1H)；4.33(t，2H,J＝5.65)；4.02(s，3H)；3.88(s，3H)；2.71(t,2H,J＝5.77)；2.27(s，6H)。

步骤2-中间体K的制备：

制备：10L氢化反应釜中，加入四氢呋喃5L和中间体J(350g，108mmol)，加入湿钯炭17.5g，对氢化釜进行氢气置换，调整压力值0.2Mpa，控制温度在25℃，保温反应9h，HPLC监控反应进度，底物≤0.5％，停止反应。过滤，滤液减压浓缩，至溶剂体积剩余约2L，调整内温至室温，在4-7小时内缓慢滴加正庚烷4L，过滤减压干燥，得285g类白色粉末中间体K，收率为86％，HPLC纯度为99.60％。MS m/z：433.3[M+1]。

核磁数据：¹HNMR(CDCl₃)：δppm：8.42(d,1H,J＝7.78)，8.28(s,1H),8.26-8.23(m,1H),7.78(s,1H),7.51(d,1H,J＝8.28),7.41(s,1H),7.26-7.23(m,1H),7.19-7.11(m,2H),6.72(s,1H),4.38(br,2H),4.06(t,2H,J＝5.77),3.88(s,3H),3.75(s,3H),2.63(t,2H,J＝5.77),2.26(s,6H).

步骤3-式I化合物的制备：

制备：反应瓶中，加入250mL无水四氢呋喃溶剂和中间体K(14g，32mmol)搅拌，冷却至0-5℃，加入10％盐酸(12ml)，搅拌20分钟。0-5度下，缓慢滴加3-氯丙酰氯(5.6g，45mmol)到反应瓶中。搅拌3小时，取样测试(K/(U+K)≤0.5％)合格后，加入36％氢氧化钾水溶液(75ml，480mmol)，升温至23-25度，搅拌12小时。升温至50-60度，搅拌4小时。取样测试(U/(U+L)≤0.1％)合格后，静置分液。分出有机相，10％食盐水洗涤三次后，干燥，过滤，浓缩有机相至150ml。升温至40度，缓慢滴加正庚烷150ml，降至室温，析出晶体。过滤，干燥，得到浅棕色固体(式I化合物)10.71g,产率68％，HPLC纯度：99.8％(所有单杂不超过0.15％)。MS m/z：487.3[M+1]。

核磁数据(附图1)：¹HNMR(d6-DMSO)：δppm：9.84(s,1H),8.90～8.82(m,1H),8.32-8.25(m,2H),7.89(s,1H),7.51(d,1H,J＝8.25),7.27～7.10(m,1H),6.94(s,1H),6.49(dd,1H,J＝16.88,10.13),6.25(dd,1H,J＝16.95,1.81),5.80～5.75(m,1H),4.19(t,2H,J＝5.57),3.88(d,6H,J＝14.63,6H),3.34(s,3H),2.58(d,2H,J＝5.5),2.28(s,6H)。

(二)N-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)-4-甲氧基-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰胺甲磺酸盐(晶型A)的制备

实施例1

式I化合物(3g，6.1mmol)溶解在24ml二甲基亚砜DMSO溶剂中，升温至65度，搅拌溶清。向体系中加入等当量甲磺酸(0.59g，6.1mmol)。降温至50度，缓慢加入12ml醋酸异丙酯IPAc。50度下搅拌1小时，然后降温至15度。4小时加入21ml IPAc。溶液在15度下搅拌析晶，减压抽滤，醋酸异丙酯洗涤滤饼，丙酮打浆洗涤，降低DMSO溶剂残留。50度下鼓风干燥(或50度真空减压干燥)，得到淡黄色固体(晶型A)3.16g。HPLC纯度100％，收率88％，DMSO:<100ppm；IPAc:<100ppm。MS m/z：487.2[M+1-MsOH]。熔点：242-244℃。

核磁数据(附图2)：¹HNMR(d6-DMSO)：δppm：9.57(brs,1H),9.40(s,1H),8.71(s,1H),8.48(s,1H),8.32(d,1H,J＝7.9),8.29(d,1H,J＝5.3),7.96(s,1H),7.51(d,1H,J＝8.2),7.23(ddd,1H,J＝7.9,7.1,0.8),7.19(d,1H,J＝5.4),7.15(ddd,1H,J＝7.8,7.3,0.5),6.94(s,1H),6.67(dd,1H,J＝16.9,10.2),6.27(dd,1H,J＝16.9,1.8),5.57(dd,1H,J＝16.9,1.7),4.44(t,2H,J＝4.6),3.89(s,3H),3.88(s,3H),3.58(t,2H,J＝4.6),2.93(s,6H),2.39(s,3H)。

经检测，本实施例得到晶型A粉末X衍射图在衍射角2θ值为11.06±0.2°，12.57±0.2°，13.74±0.2°，14.65±0.2°，15.48±0.2°，16.58±0.2°，17.83±0.2°，19.20±0.2°，19.79±0.2°，20.88±0.2°，22.05±0.2°，23.06±0.2°，24.23±0.2°，25.10±0.2°，25.71±0.2°，26.15±0.2°，27.37±0.2°，27.42±0.2°处具有特征峰；其XRPD图谱如图3及附表，DSC图如图4，TGA图如图5，红外光谱IR图如图6。

实施例2

式I化合物(28.25g，58.1mmol)溶解在224ml二甲基亚砜DMSO溶剂中，升温至15-35度，搅拌溶清。向体系中分批加入0.97当量的甲磺酸(5.4g，0.97mmol)。缓慢加入448ml甲基异丁基酮(MIBK)。搅拌1小时，然后降温至10-15度。溶液在10-15度下成盐反应，取样，HPLC检测母液中式I化合物残留(≤0.4％)。反应结束，减压抽滤，得到式I化合物甲磺酸盐粗品32g。

将式I化合物甲磺酸盐粗品3g加入24ml二甲基亚砜DMSO溶剂中，65度搅拌溶清后，降温，缓慢滴加48ml甲基异丁基酮(MIBK)，搅拌析晶6-8小时，减压抽滤，60度下鼓风干燥(或60度真空减压干燥)得到目标晶型A。熔点：242-244℃。其晶型XRPD图谱与图3吻合(附图7)，所有特征峰均在误差范围内。

实施例3

将式I化合物甲磺酸盐粗品(参考实施例2制得)3g加入24ml二甲基亚砜DMSO溶剂中，65度搅拌溶清后，降温，缓慢滴加48ml乙酸乙酯，搅拌析晶6-8小时，减压抽滤，乙酸乙酯洗涤滤饼，70度下鼓风干燥(或60度真空减压干燥)得到目标2.8g晶型A。熔点：242-244℃。其晶型XRPD图谱与图3吻合，所有特征峰均在误差范围内。

实施例4

将式I化合物甲磺酸盐粗品3g加入24ml二甲基亚砜DMSO溶剂中，65度搅拌溶清后，降温，缓慢滴加12ml甲基叔丁基醚(MTBK)，搅拌析晶6-8小时，减压抽滤，50度下鼓风干燥(或30度真空减压干燥)得到目标晶型A。熔点：242-244℃。其晶型XRPD图谱与图3吻合，所有特征峰均在误差范围内。

实施例5

将式I化合物甲磺酸盐粗品3g加入24ml二甲基亚砜DMSO溶剂中，65度搅拌溶清后，降温，缓慢滴加48ml乙腈(ACN)，搅拌析晶6-8小时，减压抽滤，50度下鼓风干燥(或60度真空减压干燥)得到目标晶型A。熔点：242-244℃。其晶型XRPD图谱与图3吻合，所有特征峰均在误差范围内。

实施例6

将式I化合物甲磺酸盐粗品3g加入24ml二甲基亚砜DMSO溶剂中，65度搅拌溶清后，降温，缓慢滴加48ml甲苯(PhMe)，搅拌析晶6-8小时，减压抽滤，50度下鼓风干燥(或50度真空减压干燥)得到目标晶型A。熔点：242-244℃。其晶型XRPD图谱与图3吻合，所有特征峰均在误差范围内。

实施例7

将式I化合物甲磺酸盐粗品10g加入100ml四氢呋喃THF溶剂中，65度搅拌溶清后，降温至室温，搅拌析晶6-8小时，过滤，50度干燥得到8.8g目标晶型A。熔点：242-244℃。其晶型XRPD图谱与图3吻合，所有特征峰均在误差范围内。

实施例8

将式I化合物甲磺酸盐粗品2g加入20ml N-甲基吡咯烷酮NMP溶剂中，65度搅拌溶清后，降温至室温，搅拌析晶6-8小时，减压抽滤，50度下鼓风干燥(或50度真空减压干燥)得到目标晶型A。熔点：242-244℃。其晶型XRPD图谱与图3吻合，所有特征峰均在误差范围内。

实施例9

将式I化合物甲磺酸盐粗品2g加入30ml N,N-二甲基甲酰胺DMF溶剂中，65度搅拌溶清后，降温至室温，搅拌析晶6-8小时，减压抽滤，65度下鼓风干燥(或60度真空减压干燥)得到目标晶型A。熔点：242-244℃。其晶型XRPD图谱与图3吻合，所有特征峰均在误差范围内。

实施例10

将式I化合物甲磺酸盐粗品2g加入50ml N,N-二甲基乙酰胺DMAc溶剂中，65度搅拌溶清后，降温至室温，搅拌析晶6-8小时，减压抽滤，60度下鼓风干燥(或60度真空减压干燥)得到目标晶型A。熔点：242-244℃。其晶型XRPD图谱与图3吻合，所有特征峰均在误差范围内。

实施例11

将式I化合物甲磺酸盐粗品2g加入50ml丙酮/水混合溶剂(丙酮/水＝1/1v/v)中，升温至50度搅拌打浆，降温至室温，搅拌析晶6-8小时，减压抽滤，50度下鼓风干燥(或50度真空减压干燥)得到目标晶型A。熔点：242-244℃。其晶型XRPD图谱与图3吻合，所有特征峰均在误差范围内。

(三)N-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)-4-甲氧基-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰胺甲磺酸盐(晶型A)的结构确认研究

采用实施例2方法制备的晶型A(纯度大于99.80％)，采用以下实例方法，进行晶型A的结构确定测试。

测试例1

采用元素分析法，分别测试晶型A中含有的C、H、N、S元素的百分含量，平行测试两次，取其平均值。

CHN测试仪器：Elementar Vario EL III型元素分析仪(C、H、N测定)；

CHN测试方法：样品经燃烧分解，定量转换，检测，再经数据处理得到C、H、N的百分含量；

S滴定方法：精密称取晶型A样品，分别用无灰滤纸包紧，经燃烧法进行分解，用纯水和30％H₂O₂作为吸收液吸收。吸收完全后转移至250mL容量瓶中，用乙醇冲洗燃烧瓶，冲洗液也转移至250mL容量瓶中。然后加入一定量的已知浓度的HNO₃和偶氮氯膦III指示剂，然后用已知浓度的Ba(ClO₄)₂·3H₂O滴定，直到溶液颜色由紫红色变为蓝色。记录Ba(ClO₄)₂·3H₂O消耗体积，计算S的百分含量。

表1.晶型A的元素分析测试结果

测定结果表明，晶型A(C₂₇H₃₀N₆O₃·CH₄O₃S)样品的C、H、N和S含量的实测值与理论值之差均小于0.3％，表明实测值与理论值一致，是带有1分子甲磺酸的盐。与本公司较早披露专利CN201780050034.3实施例2报道值数据吻合。

测试例2

目的：采用粉末X-射线衍射分析法，测试晶型A的特定晶体结构。

仪器：Bruker D8 Advance粉末X-射线衍射仪

表2.测试条件参数表

测定结果和解析：由晶型A的粉末X-射线衍射图(附图3及附表)可知：本化合物具有特定的晶体结构。其2θ角(°)在11.06，12.57，13.74，14.65，15.48，16.58，17.83，19.20，19.79，20.88，22.05，23.06，24.23，25.10，25.71，26.15，27.37，27.42有较强峰(相对强度大于10％)。

表3.与本公司较早披露专利CN201780050034.3实施例2的比较表

甲磺酸盐的不同晶型	含特征峰总数目	相对强度大于10％的特征峰数目
			晶型A	44	18
2A	36	16
			2B	12	12

测试例3

目的：采用差热分析DSC法，测试晶型A的熔点。

仪器：TAQ2000差示量热扫描仪

参数：升温范围：30～300℃；升温速率：10℃/min

测定结果和解析：由DSC曲线图(附图4)可知，晶型A的熔点为242-244℃。

表4.与专利CN201780050034.3实施例2甲磺酸盐的比较

甲磺酸盐的不同晶型	熔点
		晶型A	242-244℃
2A	233.3-238.1℃
		2B	157.3-180.2℃

测试例4

目的：采用热重分析法，测试晶型A是否含水或溶剂化合物。

仪器：TAQ5000型热重分析仪

参数：升温范围：30～300℃；升温速率：10℃/min

测定结果和解析：由TSA曲线图(附图5)可知，晶型A在33.40℃～120.00℃仅失重很小，结合DSC和元素分析表明，晶型A不含水或溶剂。

表5.与专利CN201780050034.3实施例2甲磺酸盐的比较

甲磺酸盐的不同晶型	热失重(重量损失wt％)
		晶型A	-0.035％(33.4-120℃)
2A	-0.435％(32.8-210.0℃)
		2B	-8.063％(29.7-193.4℃)

测试例5

目的：采用红外吸收光谱法，测试晶型A的红外谱图。

仪器：Nicolet 380FT-IR型红外光谱仪，YP-2压片机

方法：KBr压片法

测定结果和解析：由红外吸收光谱图(附图6)可知，本品结构中含芳环、芳杂环、烯基、-CH3、-CH2-、胺基、胺盐、酰胺、醚基和磺酸盐结构等。上述红外IR光谱结果与晶型A结构相符。

测试例6

目的：考察本专利方法实施例2制备得到的晶型A化合物的物质稳定性。

方法：参考中国药典(2015版)对原料药稳定性试验的要求，采用影响因素和加速/长期稳定性考察方法，测试晶型A的物质稳定性数据(试验设计如下表6)。

仪器：气候条件箱；光照箱

表6.稳定性试验设计

*备注：影响因素实验只有当60℃的检测结果不符合接受标准才检测40℃的样品。只有当25℃/90％RH的检测结果不符合接受标准才检测25℃/75％RH的样品。

表7.影响因素实验结果--高温试验

表8.影响因素实验结果—高湿试验

表9.影响因素实验结果--光照试验

表10.影响因素实验结果--光照试验

表11.影响因素实验结果—长期试验

测定结果和解析：影响因素、长期和加速稳定性研究数据表明，晶型A长期放置36个月，各项检测指标与0天比较均无显著变化，所有检测指标符合既定标准且没有出现明显不良趋势。说明本工艺制备得到晶型A在现有包装条件下稳定性良好，各项检测指标能符合质量标准的要求。

(四)晶型A的成药性研究

试验例1

目的：评价晶型A在不同生物媒介中的溶解度比较试验

实验设计：分别称取约2.5mg式I化合物、晶型A(式I化合物甲磺酸盐)到3个玻璃瓶中，向瓶中分别加入200μL的SGF，FaSSIF和FeSSIF。搅拌混悬液约30min，37℃。(1)如果变成澄清溶液，继续加入化合物直至成为混悬液；(2)如果不是，继续搅拌混悬液24h。在24h，需要测量PH值及目测其外观。如果24h后还是混悬液，离心分离其中的固体，上清液用50％的乙腈水溶液进行稀释，然后稀释液用HPLC测定浓度，进行含量检测。结果见下表。

表12.式I化合物和晶型A在不同生物媒介中的溶解度比较结果

结论：式I化合物甲磺酸盐的晶型A显示在生物相关介质中的溶解度优于式I化合物，尤其在模拟胃液SGF介质中有显著改善。提示，该晶型A适合于开发口服胃溶速释固体制剂。

试验例2

目的：评价SD大鼠单次口服晶型A和式I化合物后药代动力学参数的比较

实验设计：健康SD大鼠，随机分为式I化合物组(游离碱)和式I化合物甲磺酸盐晶型A组，两组均为雄性，每组21只，体重190-210g。禁食状态下分别单次口服给予60mg/kg的各受试化合物，给药后的0.5、1、2、4、8、12和24小时不同时间点静脉采集全血并分离血浆，采用液相色谱/串联质谱法(LC-MS/MS)检测血浆中的晶型A或式I化合物的药物浓度，并使用非房室模型计算相关药代动力学参数。其主要的药物动力学参数如下表所示：

表13.式I化合物组和式I化合物甲磺酸盐晶型A组主要的药物动力学参数表

药动学参数	游离碱	晶型A
			C<sub>max</sub>(ng/mL)	496	622
T<sub>max</sub>(h)	4.00	2.00
			T<sub>1/2</sub>(h)	5.02	3.31
AUC<sub>0-24</sub>(ng·h/ml)	5899	6754
			AUC<sub>0-∞</sub>(ng·h/ml)	6236	6846
MRT<sub>0-24</sub>(h)	8.29	7.46
			MRT<sub>0-∞</sub>(h)	9.53	7.75

C_max血浆中药物的最高浓度；T_max：药物最高浓度达峰时间；T_1/2：消除半衰期；AUC:血药浓度-时间曲线下面积；MRT:药物平均滞留时间

由上表和图8可以得到结论：晶型A的生物利用度明显优于游离碱的生物利用度。

试验例3

目的：评价晶型A作为肺癌药物的药物活性测试试验

1)对于特定细胞生长的抑制和选择特异性实验

方法：采用荧光细胞增殖技术以及细胞的显微镜可视化检测技术(阿尔玛蓝法)，检测晶型A对人表皮癌细胞(A431，野生型EGFR)、人肺癌细胞(HCC827，EGFR 19号外显子缺失型激活突变)、人肺癌细胞(H1975，EGFR L858R/T790M耐药型突变)是否具有抗增殖活性。

实验设计：取处于对数生长期的细胞接种在96孔板中(细胞浓度为2000个/孔；细胞悬液200μl/孔)，30℃、5％CO₂培养24小时使细胞贴壁。将受试化合物的DMSO溶液用细胞培养基溶液从高到低稀释到不同溶度，每次稀释3倍，共得到9个不同浓度。将不同浓度的受试药物溶液加入到有上述癌细胞的96孔细胞板中，每个浓度设3个复孔。同时设一个仅含DMSO的细胞培养基溶液的细胞对照孔。继续在37℃、5％CO₂中继续培养72小时后，终止培养。

细胞增殖采用Alamar Blue阿尔玛蓝试剂(刃天青)染色后检测。刃天青(resazurin)会被细胞还原为试卤灵试剂(resorufin)而成为荧光物质(544nm激发，612nm显色)，且荧光强度与细胞数成正比。刃天青试剂溶解在PBS溶液中，配置成浓度为440μM的储备溶液。细胞培养板中加入40μl的440μM刃天青储备液，共孵育5小时后，将细胞培养板恢复到正常培养条件，并使用Cytation3多模式酶标仪(Biotek)在72小时后读取荧光测量值。

荧光检测以无细胞(背景)孔读数进行标准化(normalization)，确定72小时内的总生长与溶媒对照孔的平均值(n＝3)。结果见下表所示：

表14.晶型A和奥希替尼对于特定细胞生长的抑制和选择特异性实验结果

*数据来源：Table 4，P21，PHARMACOLOGY REVIEW(S)，APPLICATION NUMBER:208065Orig1s000，CDER of FDA；https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/ nda/2015/208065Orig1s000PharmR.pdf

结果显示，晶型A化合物对于H1975，HCC827均显示出了优异的抑制癌细胞增殖生长活性，对野生型细胞抑制生长不明显，和国外上市产品(奥希替尼)相当；但晶型A显示出对于H1975和HCC827细胞的更优越的抑制选择性(相对于野生型A431癌细胞)。

2)对于不同激酶靶点的抑制选择性

激酶抑制剂作为药物进行临床治疗，需要避免抑制剂除了靶向激酶以外，还会同时抑制其他一些非靶向激酶，并有可能引起一些细胞毒性反应(即所谓的“脱靶效应”)。本实验通过KINOMEscan's体外竞争结合分析法^*1对97种激酶(与人类疾病相关的突变位点激酶酶谱)进行了高通量筛选(kinase profiling)。

表15.晶型A和奥希替尼对97种激酶酶谱进行高通量筛选的结果

^*1体外结合分析法详细介绍参考：Fabian,M.A.et al.A small molecule-kinaseinteraction map for clinical kinase inhibitors.Nat.Biotechnol.23,329-336(2005).

^*2数据来源：P15，P43，PHARMACOLOGY REVIEW(S)，APPLICATION NUMBER:208065Orig1s000，CDER of FDA；https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/ nda/2015/208065Orig1s000PharmR.pdf

结果显示，晶型A化合物非靶标激酶的抑制活性的选择性要优于已上市药物奥希替尼。

试验例4晶型A的药物安全性评价

1)安全药理学试验

目的：模拟临床用药途径，经单次口服晶型A配置的口服给药制剂后，观察对SD大鼠中枢神经系统、SD大鼠呼吸系统和比格犬心血管系统的影响。旨在研究晶型A化合物在治疗范围内或治疗范围以上剂量时，潜在的不期望出现的对生理(中枢神经系统、呼吸系统和心血管系统)的潜在不良影响。

方法：

【中枢神经实验设计】取7周龄SD大鼠，雌雄各半，体重170-235g之间，共40只SD大鼠(雌雄各20只)，随机分成4组，每组雌雄各5只。动物单次口服给予溶媒(0.5％(w/v)甲基纤维素)，10，40或160mg/kg的溶解于1％(w/v)甲基纤维素(溶媒)的晶型A化合物混悬液，对照组动物仅给予溶媒。所有动物给药体积为10mL/kg。使用功能性观察组合(FOB)，包括对动物的运动功能，行为改变，协调功能，感觉/运动反射和体温的测试，评估不同剂量供试品对动物中枢神经系统功能的影响。实验前、给药后约2小时，4小时及24小时各进行了一次FOB观察。

【呼吸系统实验设计】取7-8周龄SD大鼠，雌雄各半，体重168-287g之间，共40只大鼠(雌雄各20只)大鼠随机分成4组，每组雌雄各5只。动物单次口服给予溶媒(0.5％(w/v)甲基纤维素)，10，40或160mg/kg的溶解于0.5％(w/v)甲基纤维素(溶媒)的晶型A化合物混悬液，对照组动物仅给予溶媒。所有动物给药体积为10mL/kg。给药当天，动物先在数据采集前放置“露头式”的体积描记器中适应至少5分钟，适应后，立刻进行呼吸数据(呼吸频率、潮气量、每分通气量)采集，采集时间点为给药前，给药后约2小时(±10min)，4小时(±10min)和24小时，每次采集持续时间为连续约15分钟。记录给药前后潮气量、呼吸量和呼吸频率的变化。设0h、2h、4h和24h时间点。给药后的各指标与自身对照比较，并进行统计分析。

【心血管系统实验设计】取22-24月龄比格犬，雌雄各半，体重9.3-10.5kg之间，共计6只比格犬，预先植入遥感子设备。按照剂量递增方式设计，每只犬给予1次溶媒及10、30、100mg/kg的溶解于0.5％(w/v)甲基纤维素(溶媒)的晶型A化合物混悬液，对照组动物仅给予溶媒。两个剂量之间的间隔为3天(对照除外，对照之间的间隔为2天)。给药体积为5ml/kg,实际给药剂量基于动物最近称量的体重。使用遥测方法，采集给药前、给药后2小时，4小时，6小时，8小时和24小时的心电图数据，其获得心电图数据交由心电图专家兽医评价。

结果：口服晶型A，毒性低，对实验动物的中枢神经系统、呼吸系统及心血管系统试验结果均为阴性，提示不良反应较小，有较高的安全性。

2)遗传毒性试验

目的：遗传毒性试验可用于检测体细胞诱变剂、生殖细胞诱变剂和潜在的致癌物。采用体外和体内遗传毒性试验组合的方法，选择了细菌(包括鼠伤寒沙门氏杆菌和大肠杆菌)回复突变体外试验(Ames试验)、中国仓鼠卵巢细胞染色体畸变体外试验和大鼠灌胃给药骨髓微核体内试验三部分试验对晶型A给药制剂潜在的遗传毒性进行全面的评价。

方法：

【Ames实验设计】通过检测不同剂量晶型A化合物在加和不加外源性代谢活化系统(Aroclor1254诱导的大鼠肝脏S9)的条件下诱导选择的四种组氨酸缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌(TA98，TA100，TA1535和TA1537)和色氨酸缺陷型的大肠杆菌Escherichia Coli WP2uvrA产生回复突变的能力，以评价其潜在的致突变能力。同时还设置了阴性/溶剂对照组及阳性对照组。实验剂量设置为：对于TA98、TA100、TA1535和TA1537的加和不加S9系列为10、25、50、100、250和1000μg/皿；对于WP2 uvrA的加和不加S9系列为100、250、500、1000、2500和5000μg/皿。

【染色体畸变实验设计】通过检测不同剂量晶型A化合物在加和不加外源性代谢活化系统(Aroclor1254诱导的大鼠肝脏S9)的条件下，诱导中国仓鼠卵巢细胞(CHO-WBL)产生染色体畸变的能力。加S9活化实验系统中，细胞给药处理3小时；不加S9实验系统，细胞给药处理3小时和22小时。在给药后培养22小时后，收获所有细胞。同时还设置了阴性/溶剂对照组及阳性对照组。实验剂量设置为：加S9活化系统为：2、5、12和14μg/ml；不加S9非活化系列为1、3和6μg/ml。

【骨髓微核实验设计】取7-8周龄大鼠，体重241-306g之间，共46只大鼠雄性大鼠随机分成7组，每组6只动物(其中5&6组8只)。分别单次口服给予溶媒(0.5％(w/v)甲基纤维素)(1、2组)，500、1000、2000或2000mg/kg的溶解于0.5％(w/v)甲基纤维素(溶媒)的晶型A化合物混悬液(3-6组)，和20mg/kg的阳性对照药(环磷酰胺一水合物的生理盐水溶液，经腹腔单次注射给药)(7组)。所有动物给药体积为10mL/kg。1、3、4、5和7组动物在给药后约24小时剖杀，2和6组动物在给药后约48小时剖杀后，检测其骨髓中含微核的嗜多染红细胞(MN-PCE)的形成率。

结果：晶型A化合物在所有遗传毒性研究中均未发现遗传毒性(Ames试验，小鼠微核试验及染色体畸变试验)结果均为阴性。可以推断晶型A不具有致突变性和明显的遗传危害。表明晶型A无明显的遗传毒性和致突变性作用。

临床应用例1晶型A的人体临床试验

目的：评估晶型A制备的口服制剂对既往接受过EGFR-TKI治疗后疾病进展的局部晚期或转移性非小细胞肺癌中国患者体内的服药安全性和疗效。

材料和方法：采用晶型A制备的胶囊剂(辅料为微晶纤维素、乳糖、交联羧甲基纤维素钠、胶态二氧化硅、硬脂酸镁；3号明胶空心胶囊混匀后按照所需药物剂量直接充填灌装)，对共计128例入组非小细胞肺癌患者进行了安全性和疗效评估。

结果：已经完成了30，60，120，180，240，300mg等6个剂量组的单次和多次口服给药后的临床安全性研究，结果显示30mg-300mg的剂量是安全的。

临床试验中期疗效分析显示从30-300mg每天一次QD，最低开始剂量30mg就显示出疗效(疾病控制率DCR80.0％)，推荐II期剂量180mg的疾病缓解率ORR＝73.1％，高于已上市药物奥希替尼(66.1％)；疾病缓解率DCR为96.2％，亦高于已上市药物奥希替尼(91％)。具体疗效评价如下表：

表16.不同剂量组的疗效评价结果

剂量	30mg	60mg	120mg	180mg	240mg	300mg	Total
								入组例数	10	6	26	52	3	2	128
CR	0	0	0	0	0	0	0
								PR	4(40.0)	1(16.7)	16(61.5)	29(55.8)	11(34.4)	1(50.0)	62(48.4)
SD	4(40.0)	3(50.0)	6(23.1)	12(23.1)	13(40.6)	1(50.0)	39(30.5)
								PD	2(20.0)	1(16.7)	2(7.7)	2(3.8)	1(3.1)	0	8(6.3)
ORR,n(％)	4(40.0)	2(33.3)	18(69.2)	38(73.1)	18(56.3)	1(50.0)	81(63.3)
								DCR,n(％)	8(80.0)	5(83.3)	24(92.3)	50(96.2)	31(96.9)	2(100)	120(93.8)

以上涉及的术语，其精确解释为：CR：完全缓解，PR：部分缓解，SD：疾病稳定，PD：疾病进展，ORR：客观缓解率，DCR：疾病控制率。

临床试验中期疗效分析显示从30-300mg每天一次QD，不良反应发生率(比例和种类)明显低于已上市药物奥希替尼。具体安全性评价如下表：

表17.晶型A和奥希替尼不良反应AE发生率对比表

表18.晶型A和奥希替尼大于10％的不良事件TEAE种类对比列表

*数据来源：Page 4，甲磺酸奥希替尼片药品使用说明书及Page 89，MEDICAL&STATISTICAL REVIEW(S)，APPLICATION NUMBER:208065Orig1s000，CDER ofFDA；https:// www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2015/208065Orig1s000MedR.pdf

临床应用例2晶型A的联合用药研究的应用

目的：观察本发明实施例2制备得到的晶型A和本公司自主设计化合物BPI-7722单药或联合用药对人肺癌H1975裸小鼠皮下移植瘤的抑制作用。

材料和方法：

细胞培养：H1975(人肺腺癌)购自中国科学院细胞库，细胞培养于CO₂恒温培养箱中。细胞培养基为改良型RPMI；10％胎牛血清；100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。细胞使用0.25％胰酶进行消化处理，隔天传代。待细胞扩增至所需细胞数且细胞处于对数生长期，收集细胞计数，以供接种。

实验动物：BALB/c nude雄性裸鼠，24只，6-7周，16-18g，每组6只，购自上海灵畅生物科技有限公司。裸鼠接种H1975细胞后21天，选择肿瘤体积在80-254mm³的24只小鼠，根据肿瘤体积和体重随机分成4组，每组6只动物。分别为：组1：0.5％羧甲基纤维素钠溶剂对照组；组2：实施例2晶型A(5mg/kg)单药组；组3：BPI-7722(100mg/kg)单药组；组4：晶型A(5mg/kg)/BPI-7722(25mg/kg)联合用药组。

实验方法：人肺癌H1975细胞株(5×10⁶个/只)接种于实验小鼠于右侧背部皮下，定期观察肿瘤生长情况，用游标卡尺测量移植瘤直径，接种21天后，待肿瘤生长至平均(80～254mm³)时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组。各组按上述剂量灌胃给药，根据小鼠最新体重计算给药量，给药体积10ml/kg。每天给药一次，连续21天。整个实验过程中，每周测量三次小鼠的体重和肿瘤的大小，观察是否出现毒性反应。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积TV(mm³)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径²)。各实验组肿瘤增长生长曲线见下表及附图9，体重曲线见下表及附图10。

表19.各剂量组平均体肿瘤体积-时间关系汇总表

*空白组由于肿瘤负荷过大，动物已经进行了安乐死，故第21天未进行数据采集。

表20.各剂量组平均体重-时间关系汇总表

*空白组由于肿瘤负荷过大，动物已经进行了安乐死，故第21天未进行数据采集。

结论：本发明实施例2的晶型A化合物单药对人肺癌H1975裸小鼠皮下移植瘤的生长具有良好的抑制作用；联合BPI-7722用药后抑制效果明显优于单药抑制肿瘤的生长作用；并且显示良好的安全性。

尽管本发明已通过其实施方式连同参考附图进行了一定程度的描述，但是值得注意的是，在阅读了本申请的上述公开内容之后，本领域技术人员可以无需背离本发明的精神和范围，对本发明作出各种修饰、改动或修改，这样的变化和修改都应该包括在本发明所附权利要求的范围内。

Claims (9)

1.氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型A，其特征在于，所述氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐具有下式所示的结构：

以及

所述晶型A的XRPD图谱如图3所示。

2.根据权利要求1所述的氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型A，其特征在于，所述晶型A的红外光谱图如图6所示。

3.权利要求1或2所述的氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型A的制备方法，包括：用有机溶剂溶解所述氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐，搅拌析晶、过滤、干燥后得所述晶型A，所述有机溶剂包括二甲基亚砜、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括：将氨基嘧啶类化合物和甲磺酸按照投料摩尔比1.05-0.97制得所述氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐，其中所述氨基嘧啶类化合物具有下式：

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，加入反溶剂搅拌析晶，所述反溶剂选自甲基叔丁基醚、乙酸异丙酯、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、乙腈、甲苯、丙酮和水。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，过滤后在30-70℃下进行常压或真空干燥。

7.一种药物组合物，包含权利要求1或2所述的氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型A和药学上可接受的载体。

8.权利要求1或2所述的氨基嘧啶类化合物甲磺酸盐的晶型A或权利要求7所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌。

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