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CN111109009A - 一种蜜环菌swfu-09及其应用 - Google Patents

一种蜜环菌swfu-09及其应用 Download PDF

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CN111109009A CN201911262598.0A CN201911262598A CN111109009A CN 111109009 A CN111109009 A CN 111109009A CN 201911262598 A CN201911262598 A CN 201911262598A CN 111109009 A CN111109009 A CN 111109009A
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armillaria mellea
swfu
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gastrodia elata
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石卓功
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Southwest Forestry University
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Abstract

本发明公开一种蜜环菌SWFU‑09及其应用，属于微生物技术领域。本发明所述蜜环菌SWFU‑09的保藏编号为：CGMCC No.18149；本发明提供的蜜环菌综合性状较好，生长速度快，性状优良，实用性强，对天麻有很好的促生作用，将SWFU‑09菌株用于栽培天麻，通过母种培养、液体发酵培养、菌材培养和天麻栽培等环节，室内人工栽培天麻，从而实现高效的生产；经西南林业大学、昭通天麻研究院的温室和小草坝的田间小区进行的试验表明，该方法成效显著、稳定，可以有效高产地栽培出天麻，且商品麻的药用成分含量较高。

Description

一种蜜环菌SWFU-09及其应用
技术领域
本发明涉及一种蜜环菌SWFU-09及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
天麻(Gastrodia elata Bl.)，为兰科天麻属多年生异养草本植物。根状茎肥 厚，蒴果椭圆形倒卵状，无绿叶，常以种子或块茎繁殖。被列入《国家重点保护 野生植物名录(第二批)》中，属于Ⅱ级保护植物，是我国名贵中药材之一，以云 南昭通小草坝产者为优。一般在立冬后到第2年清明节前开始采挖，采挖后清洗 干净，蒸透，敞开低温干燥。
现代药物分析表明，天麻中主要存在酚类物质及苷(天麻素、天麻醚苷、天 麻苷元等)、苄醇酯苷类(派立辛A、B、C)、含氮生物碱类、有机酸类(柠 檬酸、琥珀酸等)、甾醇类、微量元素(铬、锰、铁、铜等)、多糖类化合物等 化学成分。天麻的化学成分除了受菌材、品种、产地、采收期等因素影响，还与 其后续加工方法密切相关。
天麻的药用价值和食用营养价值都很高。具有平抑肝阳，息风止痉等功效， 还有镇静安神、增智健脑、提高免疫力、抗晕眩、防辐射等药理保健作用，其作 用被归结为“一改(改善记忆)、两治(治高血压、治老年痴呆)、三镇(镇痉、 镇静、镇痛)、六抗(抗惊厥、抗癌症、抗衰老、抗风湿、抗癫痫和抗抑郁)”。 由于天麻风味独特、肉质肥厚、鲜品脆爽、食用方便，因此以天麻为主要原材料 加工的食品不仅极具营养价值，还是一种既能治病又能滋补保健的特殊药膳，不 仅满足了当代人对美食的追求，又可以延缓衰老、增强记忆、改善心肌血循环、 促进免疫功能的增强和恢复，还可治疗风湿痹痛、半身不遂以及头晕目眩、高血压等心脑血管疾病。
在天麻栽培生产中，由于天麻自身无根、无同化功能的叶片，无法制造养料， 也无法直接吸收周围环境中的营养，除开花结实期外，天麻幼苗的形成、营养器 官的更新以及营养生长转向生殖生长等过程都必须依靠萌发菌和蜜环菌来提供营 养，完成生活史的全过程是天麻种子萌发靠小菇属(Mycena sp.)等种子萌发菌 供给营养，发芽后的原球茎靠同化蜜环菌(Armillaria mellea(Vahl)P.Kumm.)才 能正常生长，蜜环菌在生长过程中能够产生菌索，菌索能够从为其提供营养物质 的树木中伸出，并进入到天麻原球茎中生长，蜜环菌通过分解木质素和纤维素供 给营养，天麻才能进行自身正常的生长发育，所以，天麻与萌发菌和蜜环菌之间 都具有极其密切的营养关系，蜜环菌的生长特性对天麻的产量和品质具有很大影 响，所以寻找新的适合天麻栽培的蜜环菌显得非常必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蜜环菌SWFU-09，该菌株的分类命名为Armillaria mellea，保藏编号为：CGMCC No.18149；该蜜环菌分离自云南省昭通市彝良县小草坝镇，且该蜜环菌SWFU-09已于2019年8月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。将SWFU-09 菌株用于栽培天麻，选择菌索粗长、分支多、生物量大、健壮度高的蜜环菌菌株，经过蜜环菌母种扩大繁殖后接种于粗壮段木，由于不同科属来源的菌材对蜜环菌的生长具有一定影响，对比研究不同菌材上蜜环菌菌索的生长状况，且菌材上蜜环菌菌索的多寡以及健壮程度也直接影响着天麻的产量和质量，通过室内无菌培养发展成长满菌索的菌材，进行蜜环菌伴栽天麻的生产实验，从而获得高产优质、药用价值较高的天麻产品。
本发明的另一目的在于将SWFU-09纯菌株用于栽培天麻，具体包括以下步 骤：
(1)菌种培养：将蜜环菌菌索冲洗干净，经过分离和纯化后得到纯化好的 母种。
(2)菌种扩大培养：将切碎的母种接入液体培养基中，使蜜环菌菌丝和菌 索在培养液中长满。
(3)菌材培养：选择阔叶树树种(可以选用壳斗科、桦木科、蔷薇科的树 种，如青冈、桃树、梨树、苹果树、野樱桃、板栗、水冬瓜、刺槐、槲栎、麻栎、 桦树、法国梧桐、橡树、竹柳等)作为菌材的段木，在段木上打孔或砍出伤口， 在水中充分浸泡透，捞出晾至不滴水后装入聚丙烯袋中，盖上密封盖，进行高压 灭菌，待冷却后，在超净工作台上打开密封盖，向孔内或伤口处接种蜜环菌液体 菌种，培养一段时间即为蜜环菌菌材。
(4)天麻栽培：在栽培容器底部铺一层基础培养料，再铺一层树叶，放一 层蜜环菌菌材，在每一根蜜环菌菌材两端放入麻种，再铺一层基础培养料，最上 层铺树叶，浇透水，然后用土封顶；在20-25℃、湿度80-90％条件下，培养3-5 个月，即可获得长好的天麻。
优选的，本发明步骤(1)中菌种分离和纯化的具体过程为：将蜜环菌菌索 冲洗干净，用无菌水冲洗3次，放入75％酒精中浸泡1min，再用无菌水冲洗3 次，切取0.5-1cm长的小段，浸入浓度为20ug/ml的青霉素液中3-5s，用灭菌滤 纸吸干表面水分后，接种于培养基上培养；当培养基上的蜜环菌产生菌索分枝时， 用接种铲切取长2-3mm生长旺盛而幼嫩的菌索，移入另一培养基(配方同前)， 25℃下恒温培养，待菌丝、菌索长满培养基，即为纯化好的母种。
优选的，本发明步骤(1)中培养基的配方：马铃薯200-300g/L、葡萄糖 15-20g/L、蛋白胨2-4g/L、酵母膏1-4g/L、磷酸二氢钾0.1-5g/L、硫酸镁0.1-5g/L、 维生素B15-10mg/L、琼脂15-20g/L、pH值5.5-7。
优选的，本发明步骤(2)中液体培养基的配方为：麦麸10-60g/L、玉米粉 10-30g/L、蔗糖5-20g/L、磷酸二氢钾0.5-5g/L、硫酸镁0.5-5g/L、维生素 B110-20mg/L、pH值5.5-7；培养条件为：在25℃恒温条件下震荡培养10-20d， 转数120-160r/min。
优选的，本发明步骤(3)中段木的直径为5-15cm，长度为10-25cm；在段 木上打孔或砍出伤口的深度以露出木质部0.4～0.6cm。
优选的，本发明步骤(3)培养条件为：在温度为20-25℃湿度为80-90％条 件下培养3-5月。
本发明所述方法全过程均在室内人为控制温湿度条件下完成，所使用的栽培 材料均经过消毒灭菌，且每个操作程序均保证在超净工作环境中进行，可以提高 生产效益，大大缩短天麻栽培时间，同时避免栽培过程中的污染问题，实现高效 生产，满足市场需求，带动经济发展。
本发明所述蜜环菌SWFU-09的菌落特性：
菌落初期白色、圆形，厚度中等，绒毛状，后期颜色变深；菌丝细，较密， 平均萌发率57％；菌索幼嫩时乳白色，成熟后棕色至红褐色，根状，圆形或扁平， 多分枝，粗0.1-0.4cm，平均萌发率100％，15-20天长满皿，如图1所示。
本发明所述蜜环菌SWFU-09的分子鉴定试验
(1)材料：
无火焰高温灭菌器、离心机、离心管、移液枪、移液枪头、剪刀、锥形瓶、 1200ml大瓶子、微波炉、蒸馏水、ITS4引物、ITS5引物、实验服、口罩、橡胶 手套、琼脂糖、BM2000+DNAMaker试剂、荧光染料、溴酚蓝染料溶液、TAE 电泳缓冲液、mix、无菌水、无水乙醇、液氮、研钵、研磨棒、手术刀、消毒酒 精、脱脂棉花、电子秤、PCR仪、D3195-01HP Fungal DNA MiniKit(50)试剂盒。
(2)DNA提取
CTAB法提取DNA步骤。
a.将样品放入研钵中加入适量的液氮进行研磨破壁处理。放入相应编号的 2.0ml的离心管中。
b.分别加入600μl BufferCP试剂和10μl的β-巯基乙醇(在通风橱中操作)。
c.65℃金属浴30分钟，每隔10分钟摇匀一次。
d.加入600μl(氯仿：异戊醇24：1)混合溶液，并且上下翻转5～10秒；10000 转离心5分钟。
e.取上清液移入装有150μl BufferCXD与300μl无水乙醇混合溶液的离心管 中，并且利用移液枪混合。
f.吸取600μl的混合液至HiBindDNA吸附柱上；10000转离心1分钟。
g.摒弃收集管中的液体，加入650μl SPW Wash Buffer试剂离心10000转1 分钟处理，此步骤重复两次。
h.12000转离心干燥处理5分钟。
i.加入50μlElution Buffer试剂静置5分钟后12000转离心2分钟；此步骤重 复两次。
j.开盖静置5分钟以挥发其中的无水乙醇。
k样品-20℃进行保存。
(3)PCR扩增和电泳检测
PCR扩增反应体系选用25μl反应体系(如图2所示)，其中包括10x扩增 缓冲液含mix试剂12.5μl，引物正向与反向各0.5μl，DNA样品1.0μl，用ddH2O 10.5μl定容至25μl。
将上述提取和扩增出的DNA取3.0μl与0.3μl溴酚蓝溶液(40％蔗糖，0.25％ 溴酚蓝)混匀，在含5‰Super GelRed核酸染料的1％琼脂糖凝胶于1.0×TAE缓 冲液中电泳，电泳电压90V，电泳30分钟后停止，将凝胶取出后在凝胶成像系 统观察所得PCR的分子量，记录并保存结果，PCR样品部分电泳检测图如图3 所示。
(4)测序
将PCR成功获得的ITS扩增片段样品送至北京擎科生物技术有限公司进行 测序，最终得到样品的双向的ITS序列片段文件。
(5)数据分析
得到测序的文件后首先通过BioEdit软件打开观察峰值，每个峰值对应一个 碱基，筛选其中没有杂峰污染的序列进行复制；通过利用NCBI网站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST来估计其遗传距离，下载并保存NCBI 中用到的比对基因库数值，将每个物种的序列与研究物种的所有其他序列进行比 对。
结果表明，该菌与其他蜜环菌相似度均在99％以下；用这株蜜环菌SWFU-09 (M-9)的分子数据构建系统发育树，其中该菌株与蜜环菌(Armillaria mellea) 亲缘关系最近，如图4所示；结果表明，该蜜环菌与其他蜜环菌亲缘关系较远， 说明多种蜜环菌能与天麻形成共生关系。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的蜜环菌综合性状较好，生长速度快，性状优良，实用性 强，对天麻有很好的促生作用，适用于天麻生产。
(2)本发明所述方法高效、无毒、安全、简便，通过母种培养、液体发酵 培养、菌材培养和天麻栽培等环节，室内人工栽培天麻，从而实现高效的生产； 经西南林业大学、昭通天麻研究院的温室和小草坝的田间小区进行的试验表明， 该方法成效显著、稳定，可以有效高产地栽培出天麻，且商品麻的药用成分含量 较高。
附图说明
图1为蜜环菌SWFU-09的菌落特性图；
图2为PCR反应体系；
图3为PCR样品部分电泳检测图；
图4为系统发育树；
图5为实施例1中蜜环菌菌材的示意图；
图6为实施例2中蜜环菌菌材的示意图；
图7为实施例3中蜜环菌菌材的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不 限于所述内容。
实施例1
将SWFU-09纯菌株用于栽培天麻，具体包括以下步骤：
(1)菌种培养
将蜜环菌菌索冲洗干净，用无菌水冲洗3次，放入75％酒精中浸泡1min， 再用无菌水冲洗3次，切取0.5cm长的小段，浸入青霉素液(20ug/ml)中5s， 用灭菌滤纸吸干表面水分后，接种于培养基上培养。
培养基配方为：马铃薯200g/L、葡萄糖15g/L、蛋白胨4g/L、酵母膏4g/L、 磷酸二氢钾0.1g/L、硫酸镁0.1g/L、维生素B15mg/L、琼脂15g/L、pH值7。
当培养基上的蜜环菌产生菌索分枝时，用接种铲切取长2mm生长旺盛而幼 嫩的菌索，移入另一培养基(配方同上)，25℃下培养，待菌丝、菌索长满培养 基，即为纯化好的母种。
(2)菌种扩大培养
将切碎的母种接入液体培养基中，在25℃条件下，160r/min，震荡培养10-20d 后，蜜环菌菌丝和菌索在培养液中长满。
培养液配方：麦麸10g/L、玉米粉10g/L、蔗糖20g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、 硫酸镁0.5g/L、维生素B110mg/L、pH值6.5。
(3)菌材培养
本实施例中用作菌材的段木为青冈，段木的直径为5-10cm，长度为10-25cm 接种蜜环菌后长出菌索，即可用于培养天麻。
根据段木的长度和直径在段木上打孔或砍出伤口(鱼鳞口/环形口/条形口) (深度以露出木质部0.5cm)，在水中充分浸泡透(36h)，捞出晾至不滴水后 装入聚丙烯袋中，盖上密封盖，放入高压灭菌锅内(0.15MPa，121℃)灭菌2h。 待冷却后，在超净工作台上打开密封盖，向孔内或伤口处接种蜜环菌液体菌种。
在恒温(25℃)恒湿(湿度90％)条件下培养2月，长出菌索，带有蜜环菌 菌丝和菌索的段木，即得蜜环菌菌材，如图5所示。
(4)天麻栽培
选择透气性好的基础培养料，需要保水力强，有机质丰富，疏松、易渗水， 酸碱度适宜的基质，可以选用砂质壤土、腐殖土、加沙木屑、加沙腐熟落叶等按 一定比例配制。
培养方法：选择深为40cm，长宽为50cm的栽培容器，在容器底部铺一层 基础培养料，再铺一层树叶，放一层菌材，在每一根菌材两端放入麻种，再铺一 层基础培养料，最上层铺6cm厚的树叶，浇透水，然后用土封顶；在20℃、湿 度90％条件下，培养3-5月，即可获得长好的天麻。
实施例2
将SWFU-09纯菌株用于栽培天麻，具体包括以下步骤：
(1)菌种培养
将蜜环菌菌索冲洗干净，用无菌水冲洗3次，放入75％酒精中浸泡1min， 再用无菌水冲洗3次，切取1cm长的小段，浸入青霉素液(20ug/ml)中3s，用 灭菌滤纸吸干表面水分后，接种于培养基上培养，如图1所示。
培养基配方为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨2g/L、酵母膏1g/L、 磷酸二氢钾5g/L、硫酸镁5g/L、维生素B110mg/L、琼脂15g/L、pH值5.5。
当培养基上的蜜环菌产生菌索分枝时，用接种铲切取长3mm生长旺盛而幼 嫩的菌索，移入另一培养基(配方同上)，25℃下恒温培养，待菌丝、菌索长满 培养基，即为纯化好的母种。
(2)菌种扩大培养
将切碎的母种接入液体培养基中，在25℃恒温条件下，转数120r/min，震 荡培养10-20天后，蜜环菌菌丝和菌索在培养液中长满。
培养液配方：麦麸60g/L、玉米粉30g/L、蔗糖15g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、 硫酸镁0.5g/L、维生素B110mg/L、pH值7。
(3)菌材培养
本实施例中用作菌材的段木为苹果，段木的直径为10-15cm，长度为10-20cm 接种蜜环菌后长出菌索，即可用于培养天麻。
根据段木的长度和直径在段木上打孔或砍出伤口(鱼鳞口/环形口/条形口) (深度以露出木质部0.5cm为宜)，在水中充分浸泡透(48h)，捞出晾至不滴 水后装入聚丙烯袋中，盖上密封盖，放入高压灭菌锅内(0.15MPa，121℃)灭 菌2h；待冷却后，在超净工作台上打开密封盖，向孔内或伤口处接种蜜环菌液 体菌种。
在恒温(25℃)恒湿(湿度90％)条件下培养3月，长出菌索，带有蜜环菌 菌丝和菌索的段木，即得蜜环菌菌材，如图6所示。
(4)天麻栽培
选择透气性好的基础培养料，需要保水力强，有机质丰富，疏松、易渗水， 酸碱度适宜的基质，可以选用砂质壤土、腐殖土、加沙木屑、加沙腐熟落叶等按 一定比例配制。
培养方法：选择深为50cm，长宽为60cm的栽培容器，在容器底部铺一层 基础培养料，再铺一层树叶，放一层菌材，在每一根菌材两端放入麻种，再铺一 层基础培养料，最上层铺10cm厚的树叶，浇透水，然后用土封顶；在25℃、湿 度80％条件下，培养5个月，即可获得长好的天麻。
实施例3
将SWFU-09纯菌株用于栽培天麻，具体包括以下步骤：
(1)菌种培养
将蜜环菌菌索冲洗干净，用无菌水冲洗3次，放入75％酒精中浸泡1min， 再用无菌水冲洗3次，切取0.7cm长的小段，浸入青霉素液(20ug/ml)中4s， 用灭菌滤纸吸干表面水分后，接种于培养基上培养。
培养基配方为：马铃薯250g/L、葡萄糖18g/L、蛋白胨2g/L、酵母膏3g/L、 磷酸二氢钾4g/L、硫酸镁4g/L、维生素B18mg/L、琼脂15g/L、pH值6。
当培养基上的蜜环菌产生菌索分枝时，用接种铲切取长2-3mm生长旺盛而 幼嫩的菌索，移入另一培养基(配方同上)，25℃下恒温培养，待菌丝、菌索长 满培养基，即为纯化好的母种。
(2)菌种扩大培养
将切碎的母种接入液体培养基中，在25℃恒温条件下，转数150r/min，震 荡培养10-20d后，蜜环菌菌丝和菌索在培养液中长满。
培养液配方：麦麸20g/L、玉米粉20g/L、蔗糖15g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫 酸镁3g/L、维生素B115mg/L、pH值6。
(3)菌材培养
本实施例中用作菌材的段木为竹柳，段木的直径为5cm，长度为10cm接种 蜜环菌后长出菌索，即可用于培养天麻。
根据段木的长度和直径在段木上打孔或砍出伤口(鱼鳞口/环形口/条形口) (深度以露出木质部0.5cm为宜)，在水中充分浸泡透(40h)，捞出晾至不滴 水后装入聚丙烯袋中，盖上密封盖，放入高压灭菌锅内(0.15MPa，121℃)灭 菌2h；待冷却后，在超净工作台上打开密封盖，向孔内或伤口处接种蜜环菌液 体菌种。
在恒温(25℃)恒湿(湿度90％)条件下培养2月，长出菌索，带有蜜环菌 菌丝和菌索的段木，即得蜜环菌菌材，如图7所示。
(4)天麻栽培
选择透气性好的基础培养料，需要保水力强，有机质丰富，疏松、易渗水， 酸碱度适宜的基质，可以选用砂质壤土、腐殖土、加沙木屑、加沙腐熟落叶等按 一定比例配制。
培养方法：选择深约45cm，长宽约55cm的栽培容器，在容器底部铺一层 基础培养料，再铺一层树叶，放一层菌材，在每一根菌材两端放入麻种，再铺一 层基础培养料，最上层铺6-10cm厚的树叶，浇透水，然后用土封顶。在28℃、 湿度90％条件下，培养3月，即可获得长好的天麻。
试验结果与分析
本实施例1～3分别采用青冈、苹果和竹柳3种树材培养蜜环菌菌材，质量栽 培结果见表1。
不同菌材 菌索萌发率(％) 天麻产量(个盆) 天麻重量(g/盆) 天麻素的含量(％) 天麻素总含量(％)
苹果 59.1948 8 216.56 0.7815 1.2167
竹柳 50.6795 6 131.41 0.5201 0.8955
青冈 42.0909 10 564.46 0.7848 1.1015
由表1可知，培养3-5月，蜜环菌SWFU09在3种菌材上的生长都较好， 菌索萌发率均高于40.00％，所产出的天麻数量稳定，每个盆能收天麻6-10个， 天麻重量平均为32g/个，天麻素总含量均高于0.8％，说明本发明方法可用于天 麻的栽培生产，且药用成分含量不低于国家标准(天麻素总含量不少于0.25％)； 本发明所述方法较当地传统方式时间缩短2.4-4.8倍，育种效率提高约3倍。
序列表
<110> 西南林业大学
<120> 一种蜜环菌SWFU-09及其应用
<130> 2019-12-09
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 819
<212> DNA
<213> Armillaria mellea?(Vahl) P. Kumm.
<400> 1
aagatcatta tgaaacttga atcgtagcat cgagaactgt tgctgacctg ttaaagggta 60
tgtgcacgtt cgacgtgttg cgttctattc atccacctgt gcacctttgt agacttgatt 120
aactttcgct ttcgagcggt tagaagggtt gctttcgagc tccctttgtc tatcaagtct 180
atgtctatat aatctcttgt atgtctagaa tgtcttgttt atgggatgca agtcctttaa 240
atcttataca actttcaaca acggatctct tggctctcgc atcgatgaag aacgcagcga 300
aatgcgataa ctaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgagtcttt gaacgcacct 360
tgcgcccttt ggtattccga agggcatgcc tgtttgagtg tcattaaatt ctcaacctcc 420
ccttctttca ttaggagtgc ggcggattgg atatgggggt ttgctggttt ctaacgagat 480
cagctcctct gaaatgcatt agcagaaacc gtttgacttt ggctgctagg ctgtgataat 540
atctacgcct tgtagttggg tcggaatacg agtcatacag tggtaactaa tcaggctttc 600
gggtctggct tagaatcggt ttggaaggtg cttaacggct ccttctgctt tctccctttg 660
cggagatact tgtccaattc taagagagga gttgcttagc gcgggcttag ctttccttga 720
tatttccctt tgactttgta gaaggattca gcttctaacc gtccattgac ttggacaatt 780
tattgactat ttgacctcaa atcaggtagg actacccgc 819

Claims (9)

1.一种蜜环菌SWFU-09，其特征在于：该菌株的保藏编号为：CGMCC No.18149。
2.权利要求1所述的蜜环菌SWFU-09的应用，其特征在于：将SWFU-09菌株用于栽培天麻。
3.根据权利要求2所述的蜜环菌SWFU-09的应用，其特征在于：将SWFU-09纯菌株用于栽培天麻的具体过程为：
(1)菌种培养：将蜜环菌菌索冲洗干净，经过分离和纯化后得到纯化好的母种；
(2)菌种扩大培养：将切碎的母种接入液体培养基中，使蜜环菌菌丝和菌索在培养液中长满；
(3)菌材培养：选择阔叶树树种作为菌材的段木，在段木上打孔或砍出伤口，在水中充分浸泡透，捞出晾至不滴水后装入聚丙烯袋中，盖上密封盖，进行高压灭菌，待冷却后，在超净工作台上打开密封盖，向孔内或伤口处接种蜜环菌液体菌种，培养一段时间即为蜜环菌菌材；
(4)天麻栽培：在栽培容器底部铺一层基础培养料，再铺一层树叶，放一层蜜环菌菌材，在每一根蜜环菌菌材两端放入麻种，再铺一层基础培养料，最上层铺树叶，浇透水，然后用土封顶；在20-25℃、湿度80-90％条件下，培养3-5个月，即可获得长好的天麻，所有步骤均在室内人为控制温湿度条件下完成，且每个操作程序均保证在超净工作环境中进行。
4.根据权利要求3所述蜜环菌SWFU-09的应用，其特征在于：步骤(1)中菌种分离和纯化的具体过程为：将蜜环菌菌索冲洗干净，用无菌水冲洗3次，放入75％酒精中浸泡1min，再用无菌水冲洗3次，切取0.5-1cm长的小段，浸入浓度为20ug/ml的青霉素液中3-5s，用灭菌滤纸吸干表面水分后，接种于培养基上培养；当培养基上的蜜环菌产生菌索分枝时，用接种铲切取长2-3mm菌索，移入另一培养基，培养基配方和之前的相同，25℃下培养，待菌丝、菌索长满培养基，即为纯化好的母种。
5.根据权利要求4所述蜜环菌SWFU-09的应用，其特征在于：培养基的配方：马铃薯200-300g/L、葡萄糖15-20g/L、蛋白胨2-4g/L、酵母膏1-4g/L、磷酸二氢钾0.1-5g/L、硫酸镁0.1-5g/L、维生素B15-10mg/L、琼脂15-20g/L、pH值5.5-7。
6.根据权利要求3所述蜜环菌SWFU-09的应用，其特征在于：步骤(2)中液体培养基的配方为：麦麸10-60g/L、玉米粉10-30g/L、蔗糖15-20g/L、磷酸二氢钾0.5-5g/L、硫酸镁0.5-5g/L、维生素B110-20mg/L、pH值5.5-7；培养条件为：在25℃条件下震荡培养10-20d，转数120-160r/min。
7.根据权利要求3所述蜜环菌SWFU-09的应用，其特征在于：步骤(3)中段木的直径为5-15cm，长度为10-25cm；在段木上打孔或砍出伤口的深度以露出木质部0.4-0.6cm。
8.根据权利要求3所述蜜环菌SWFU-09的应用，其特征在于：步骤(3)培养条件为：在温度为20-25℃，湿度为80-90％条件下培养3-5月。
9.根据权利要求3所述蜜环菌SWFU-09的应用，其特征在于：步骤(3)中阔叶树为壳斗科、桦木科或者蔷薇科。
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