CN111094976B

CN111094976B - 用于测序的设备

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Publication number: CN111094976B
Application number: CN201980003304.4A
Authority: CN
Inventors: B·博扬诺瓦; J·冈拉克
Original assignee: Illumina Inc
Current assignee: Illumina Inc
Priority date: 2018-02-16
Filing date: 2019-02-13
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2039-02-13
Also published as: NZ759671A; KR102351743B1; US20210156819A1; US20220299469A1; KR20200015620A; CN111094976A; JP2020525762A; US11774400B2; AU2019222673A1; AU2019222673B2; CA3066469A1; JP7018460B2; EP3752830A4; EP3752830A1; CA3066469C; US11391693B2; WO2019160925A1

Abstract

示例设备包括与顺式电极相关联的顺式井、与反式电极相关联的反式井以及位于顺式井与反式井之间的场效应晶体管(FET)。场效应晶体管(FET)的示例包括限定在其中的流体系统。流体系统包括面向顺式井的第一腔、与反式井流体连接的第二腔以及从第一腔延伸穿过场效应晶体管的通孔。第一纳米级开口将顺式井和第一腔流体连接，第一纳米级开口具有内径。第二纳米级开口将通孔和第二腔流体连接，第二纳米级开口具有内径。第二纳米级开口内径大于第一纳米级开口内径。

Description

用于测序的设备

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年2月16日提交的美国临时申请序列号62/710,350的权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

各种多核苷酸测序技术涉及在局部支撑表面上或在预限定反应室内执行大量受控反应。然后可以观察或检测指定反应，并且随后的分析可以帮助标识或揭示反应中所涉及的多核苷酸的性质。已开发了利用纳米孔的另一多核苷酸测序技术，纳米孔可以向离子电流提供通道。多核苷酸被驱动穿过纳米孔，并且当多核苷酸穿过纳米孔时，它破坏了穿过纳米孔的电流。每个通过的核苷酸或核苷酸系列产生特性电流，并且电流电平的记录对应于多核苷酸序列。

发明内容

本文公开的第一方面是设备。在一个示例中，设备包括：与顺式电极相关联的顺式井；与反式电极相关联的反式井；位于顺式井与反式井之间的场效应晶体管(FET)，场效应晶体管(FET)包括被限定在其中的流体系统，流体系统包括面向顺式井的第一腔、流体地连接至反式井的第二腔、以及从第一腔延伸穿过场效应晶体管的通孔；将顺式井和第一腔流体地连接的第一纳米级开口，第一纳米级开口具有内径；以及将通孔和第二腔流体地连接的第二纳米级开口，第二纳米级开口具有内径，其中第二纳米级开口的内径大于第一纳米级开口的内径。

在设备的一个示例中，第二纳米级开口的内径是第一纳米级开口的内径的约至少两倍；第一纳米级开口的内径的范围是从约1nm至约3nm；并且第二纳米级开口的内径的范围是从约2nm至约20nm。

在设备的一个示例中，第二纳米级开口的内径的范围是从第一纳米级开口的内径的约两倍到第一纳米级开口的内径的约五倍。

在设备的一个示例中，第一纳米级开口的内径的范围是从约0.5nm至约3nm；并且第二纳米级开口的内径的范围是从约10nm至约20nm。

在设备的一个示例中，第二纳米级开口的内径是第一纳米级开口的内径的约三倍；第一纳米级开口的内径的范围是从约1nm至约2nm；并且第二纳米级开口的内径的范围是从约10nm至约20nm。

设备的一个示例还包括位于顺式井与第一腔之间的膜，其中第一纳米级开口延伸穿过膜。作为一个示例，膜可以选自由脂质和脂质的仿生等同物组成的组。在该示例中，第一纳米级开口延伸穿过：设置在膜中的多核苷酸纳米孔、多肽纳米孔或碳纳米管。作为另一示例，膜是合成膜，并且第一纳米级开口是固态纳米孔。

在设备的一个示例中，第一纳米级开口具有可变电阻；且第二纳米级开口具有至少基本上固定的电阻。

在一个示例中，设备包括纳米孔测序仪。在该示例中，阵列可以包括多个纳米孔测序仪，并且其中：多个纳米孔测序仪中的每一个共享共用的顺式电极和共用的反式电极；或者多个纳米孔测序仪中的每一个具有不同的顺式电极和不同的反式电极；或者多个纳米孔测序仪中的每一个共享共用的顺式电极并具有不同的反式电极；或者多个纳米孔测序仪中的每一个具有不同的顺式电极并共享共用的反式电极。

要理解，本文公开的设备和/或阵列的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。

本文公开的第二方面是使用本文公开的设备的示例的方法。在一个示例中，使用设备的方法包括：将电解质引入顺式井、反式井、第一腔、FET的通孔和第二腔中的每一个中；在顺式电极和反式电极之间施加电压偏置，电压偏置足以驱动多核苷酸穿过第一纳米级开口，其中第一纳米级开口的电阻响应于多核苷酸中碱基的身份而变化，并且其中FET的通孔中的电解质的势响应于第一纳米级开口的电阻的变化而变化；以及随着多核苷酸被驱动穿过第一纳米级开口，测量FET的响应，以标识多核苷酸中的碱基。

在使用设备的方法的一个示例中，FET还包括源极、漏极和通道，并且其中测量FET的响应包括：测量源极-漏极电流；或者测量在源极、漏极、或源极和漏极两者处的势；或者测量通道的电阻；或者其组合。

要理解，使用设备的方法的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，要理解，该方法和/或设备和/或阵列的特征的任何组合可以一起使用，和/或可以与本文公开的任何示例进行组合。

本文公开的第三方面是方法。在一个示例中，方法包括：制造场效应晶体管；在其中限定流体系统，流体系统包括具有入口端和出口端的第一腔、以及与第一腔相对的第二腔；限定从第一腔的出口端朝向第二腔、穿过场效应晶体管的通孔；限定在第一腔的入口端之上的膜，膜具有穿过它的第一纳米级开口，第一纳米级开口具有内径；以及限定穿过场效应晶体管的基部衬底的第二纳米级开口，以将通孔与第二腔流体地连接，第二纳米级开口具有内径，其中第二纳米级开口的内径大于第一纳米级开口的内径。

方法的一个示例还包括：将顺式井流体地连接到第一纳米级开口，顺式井与顺式电极相关联；将反式井流体地连接到第二腔，反式井与反式电极相关联，从而形成纳米孔测序仪；以及将纳米孔测序仪浸入电解质中。

在方法的一个示例中，制造场效应晶体管包括：在绝缘体上硅衬底的硅层中限定源极、漏极和通道；将硅层的表面氧化，以在源极、漏极和通道上形成栅极氧化物；在通道上的栅极氧化物上形成牺牲层；沉积蚀刻停止材料，以在源极和漏极上的栅极氧化物以及牺牲层上形成层，并形成基部衬底；以及制造部分地封装在绝缘材料中的垂直互连通路(via)和金属互连，via将源极和漏极电连接到金属互连。

在该示例中，在沉积蚀刻停止材料之前，方法还包括：通过蚀刻穿第二硅层的一部分、直到绝缘体上硅衬底的绝缘体层，来限定流体系统的第二腔，其中被蚀刻走的部分与通道相对。

在该示例中，蚀刻停止材料是固态材料，固态材料被沉积在绝缘体层的暴露部分和第二硅层上，以形成基部衬底。在该示例中，通过蚀刻穿固态材料的一部分，来限定第二纳米级开口。

同样在该示例中，限定第一腔可以包括：蚀刻穿绝缘材料的区、直到牺牲层，其中区毗邻通道，以及蚀刻牺牲层，以暴露通道上的栅极氧化物；并且限定通孔可以包括：蚀刻穿栅极氧化物、绝缘体上硅衬底的硅层和绝缘体上硅衬底的绝缘层中的每一个的相应部分，以暴露固态材料。方法的该示例可以进一步包括将绝缘体上硅衬底上的硅层在通孔中的暴露部分氧化。方法的该示例可以进一步包括在绝缘体上硅衬底的硅层在通孔中的暴露部分上沉积或生长绝缘层。

要理解，该方法的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，要理解，该方法和/或使用设备的方法和/或设备和/或阵列的特征的任何组合可以一起使用，和/或可以与本文中所公开的示例中的任何示例进行组合。

再进一步地，要理解，任何设备和/或阵列和/或任何方法的任何特征或特征组合可以以任何期望的方式组合在一起，和/或可以与本文中所公开的示例中的任何示例进行组合。

附图说明

通过参考以下详细描述和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，在附图中，相同的附图标记对应于相似、但可能不相同的组件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标记或特征可以结合或可以不结合它们出现在其中的其他附图来描述。

图1A是其中未并入场效应晶体管的纳米孔传感器阵列的示意性局部截面图；

图1B是图1A被标示为“参见图1B”的部分的放大图，其示意性地示出了图1A的纳米孔传感器中的离子流的平衡；

图2A是本文所公开的设备的一个示例的剖视示意性局部截面图；

图2B是本文所公开的设备的另一示例的剖视示意性局部截面图；

图3是沿图2B中的3-3线截取的截面俯视图，其示出了源极和漏极、栅极氧化物和通孔的示例；

图4是在使用中的、示意性地示出的图2A的设备的示例的剖视示意性局部截面图；

图5是图示寿命(以小时为单位，Y轴)比对电极直径(以微米为单位，X轴)的曲线图；

图6A是示例设备的示例阵列的剖视示意性局部截面图；

图6B-图6E是示例设备的阵列的示例配置的示意性框图；

图7是图示涉及图4的设备的本文公开的方法的一个示例的流程图；以及

图8A-图8M一起图示了用于制造设备示例的场效应晶体管部分的一个示例的方法的一个示例。

具体实施方式

纳米孔传感器阵列A的示意性局部截面图如图1A所示。纳米孔传感器阵列A包括：具有顺式/顶部电极30的共用顺式井14、和具有可单独寻址的反式/底部电极34的反式井16的阵列。纳米孔18将顺式井14和相应的反式井16流体连接，并且电解质20在顺式井14和反式井16中。电流穿过每个纳米孔18并由底部电极34测量。

在某些情况下，使用可单独寻址的反式电极可能限制图1A所示架构的可缩放性。电极处相关的电化学半反应的一个示例是：

顺式(阴极)：AgCl+e^-→Ag⁰+Cl^-；以及

反式(阳极)：Ag⁰+Cl^-→AgCk+e^-。

对于每单位电流电荷，在反式电极处消耗一个Cl原子。然而，纳米孔18所承载的电流由K⁺和Cl^-离子同等地组成。如图1B中示意性地图示的，这导致反式井中Cl^-的供应和消耗之间的不平衡。

随着时间的流逝，反式井中的Cl^-被电化学反应耗尽，以传输电流。当传感器阵列A被缩放时，每个反式井16的体积通常随着井尺寸的三次幂而耗尽(假设保持恒定的纵横比)。如图5所示，所导致的传感器阵列A可使用寿命的减少可能是显著的。为了实现实用的传感器寿命(例如，约48小时)，反式井的直径应保持高于100μm。但是，由于可以将用于测量电流的电路的节距减小至10μm或更小，传感器阵列A的总体可缩放性可能会受到需要传输电流的限制。

尽管上面讨论是依据NaCl或KCl溶液中的Ag/AgCl电极，但要理解，这些考虑适用于可用于传输电流的任何电极/电解质对。反式电极34上将存在电解质消耗，并且可用电解质20的体积是传感器阵列A的寿命的限制因素。

如下面进一步详细描述的，根据本公开的设备和方法的示例并入了FET，并且不需要包括可单独寻址的反式井和电极。这样，根据本公开的示例的反式井可以比传感器阵列A的反式井大得多，从而允许期望的缩放来改进设备寿命。

纳米孔测序技术使用电流的变化来区分核苷酸碱基。如上所述，在纳米孔测序仪中，一种电解质氧化还原试剂可以在反式井(或室)电极上部分消耗，以支持通过系统的法拉第电流。部分消耗的电解质氧化还原试剂可能在对应的顺式井电极上未被高效地补充，这部分是由于穿过纳米孔的离子输运抑制。例如，由于镀覆，氯阴离子可能在反式侧部分耗尽，并且可能在顺式侧未被充分补充。针对两种电解质氧化还原试剂(例如，阳离子和阴离子)，形成浓度梯度，并且在反式侧的部分耗尽试剂的低得多的浓度处，建立新的均衡。如图1B所示，穿过纳米孔的电解质氧化还原试剂输运比对反式电极上试剂之一的部分消耗的不平衡可以导致电流漂移，这可能不利地影响区分核苷酸碱基的能力。

电解质氧化还原试剂的部分消耗取决于若干因素，包括电解质氧化还原试剂的起始浓度、穿过纳米孔的电流以及反式室的尺寸(例如，较大的室通常与较少的试剂消耗相关联，并且较小的室通常与较多的试剂消耗相关联)。

部分消耗可以通过初始试剂浓度的降低来证明，其中降低大于10倍。在某些情况下，降低范围为20倍至100倍。例如，可以将10μm反式井中初始氯化物浓度约为300mM的电解质的氯化物浓度耗尽至约10mM，并且因此初始浓度降低约30倍。针对另一示例，可以将10μm反式井中初始氯化物浓度约为10mM的电解质的氯化物浓度耗尽至约0.1mM，并且因此初始浓度降低约100倍。要理解，部分消耗/耗尽可以接近100％(即，系统中剩余的电解质氧化还原试剂接近0％)，但是即使在部分消耗试剂这样低的水平处，电解质氧化还原试剂之间也会建立均衡。

如上所述，纳米孔测序技术使用电流变化来区分核苷酸碱基。电解质物种的耗尽导致电流减少(或不期望的移位)，这不利地影响获得针对核苷酸碱基的准确电流读数的能力。通过本公开的示例设备使得具有较大的反式室/井的能力变得可能，导致随着时间流逝存在更多的试剂(例如，与上面提及的示例传感器阵列A相比)。这样，将试剂的消耗或耗尽的影响最小化，减轻了电流漂移，并且增加了电解质、反式电极和反式井的寿命。因此，本文公开的用于测序的设备和方法的示例延长了示例设备的寿命(参见例如图5)，并使得传感器阵列的密度能够降低大于100x(100倍)。

要理解，除非另外说明，否则本文中使用的术语将采用其在相关领域中的普通含义。下面阐述本文中使用的若干术语及其含义。

除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数所指对象。

术语包括、包含、含有以及各种形式的这些术语是彼此同义的，并且意指同等广义的。此外，除非有相反的明确说明，否则包括、包含或具有特定性质的元素或多个元素的示例可以包括附加元素，而无论该附加元素是否具有该性质。

如本文中所使用的，术语“流体地连接”、“流体连通”、“流体地耦合”等指代两个空间区域被连接在一起，使得流体或气体可以在两个空间区域之间流动。例如，一个或多个顺式井可以通过第一腔、通孔和第二腔的方式流体地连接到一个或多个反式井，使得电解质的至少一部分可以在所连接的井之间流动。借助第一和第二纳米级开口、或者借助一个或多个阀、限制器、或将控制或调节穿过系统的流体流量的其他流体组件，两个空间区域可以流体地连通。

如本文所使用的，术语“间隙区域”指代衬底/固体支撑物或膜中的区、或表面上的区，其将与支撑物或膜或表面相关联的其他区、区域、特征分离。例如，膜的间隙区域可以将阵列的一个纳米孔与阵列的另一纳米孔分离。针对另一示例，衬底的间隙区域可以将一个反式井与另一反式井分离。彼此分离的两个区可以是离散的，即，彼此没有物理接触。在许多示例中，间隙区域是连续的，而区是离散的，例如，在其他方面连续的膜中限定的多个纳米孔或在其他方面连续的衬底/支撑物中限定的多个井就是这种情况。由间隙区域提供的分离可以是部分分离或完全分离。间隙区域可以具有与在表面中限定的特征的表面材料不同的表面材料。例如，在间隙区域处的表面材料可以是脂质材料，并且在脂质材料中形成的纳米孔所具有的多肽的量或浓度可以超过在间隙区域处存在的量或浓度。在一些示例中，多肽可以不存在于间隙区域处。

如本文所使用的，术语“膜”指代不可渗透或半渗透的屏障或其他片，其将其中可以包含相同成分或不同成分的两个液体/凝胶室(例如，顺式井和流体腔)分离。膜对任何给定物种的渗透性取决于膜的本质。在一些示例中，膜可以是对离子、电流和/或流体不可渗透的。例如，脂质膜可以是对离子不可渗透的(即，不允许穿过它的任何离子输运)，但是可以对水至少部分地渗透(例如，水扩散率范围为约40μm/s至约100μm/s)。对于另一示例，合成/固态膜(其一个示例是氮化硅)可以对离子、电荷和流体不可渗透(即，所有这些物种的扩散为零)。根据本公开，可以使用任何膜，只要膜可以包括贯穿膜的纳米级开口，并且可以保持跨膜的势差。膜可以是单层或多层膜。多层膜包括两个或更多层，其中每一层是不可渗透或半渗透的材料。

膜可以由生物或非生物来源的材料形成。具有生物来源的材料是指从生物环境(诸如，生物体或细胞)得到或隔离的材料，或生物可用结构的合成制造版本(例如，仿生材料)。

由生物来源的材料制成的示例膜包括由双脂脂质(bolalipid)形成的单层。由生物来源的材料制成的另一示例膜包括脂质双层。合适的脂质双层包括例如细胞膜、细胞器的膜、脂质体、平面脂质双层和被支撑的脂质双层。脂质双层可以例如由两个相对的磷脂层形成，这两个相对的磷脂层被布置成使得它们的疏水性尾基团彼此面对，以形成疏水内部，而脂质的亲水性头基团朝外面对在双层的每一侧的水环境。脂质双层还可以例如通过以下方法形成：其中脂质单层被承载在水溶液/空气界面上，经过垂直于该界面的孔径的任一侧。通常通过首先将脂质溶解在有机溶剂中，并且然后允许溶剂滴在孔径的任一侧上在水溶液的表面上蒸发，来将脂质添加到电解质水溶液的表面。一旦有机溶剂至少部分地蒸发，则在孔径的任一侧的溶液/空气界面被物理地上下移动经过孔径，直到形成双层。双层形成的其他合适方法包括尖端浸渍、刷涂双层、和脂质体双层的膜片钳。还可以使用用于获得或生成脂质双层的任何其他方法。

非生物来源的材料也可以用作膜。这些材料中的一些是固态材料，并且可以形成固态膜，而这些材料中的其他一些材料可以形成液体薄膜或膜。固态膜可以是单层，诸如在支撑衬底(即，固体支撑物)上的涂层或膜、或者自立式元件。固态膜还可以是夹层配置中的多层材料的复合物。可以使用任何非生物来源的材料，只要所得的膜可以包括贯穿膜的纳米级开口，并且可以保持跨膜的势差。膜可包括有机材料、无机材料或两者。合适的固态材料的示例包括例如：微电子材料、绝缘材料(例如，氮化硅(Si₃N₄)、氧化铝(Al₂O₃)、氧化铪(HfO₂)、五氧化钽(Ta₂O₅)、氧化硅(SiO₂)等)、一些有机和无机聚合物(例如，聚酰胺、诸如聚四氟乙烯(PTFE)的塑料、或诸如两组分加成固化硅橡胶的弹性体)和玻璃。此外，固态膜可以由以下制成：单层石墨烯(其是致密堆积成二维蜂窝晶格的碳原子的原子级薄片)、多层石墨烯、或与其他固态材料的一个或多个层混合的一层或多层石墨烯。包含石墨烯的固态膜可以包括至少一个石墨烯层，该至少一个石墨烯层是石墨烯纳米带或石墨烯纳米间隙，其可以用作表征目标多核苷酸的电传感器。要理解，可以通过任何合适的方法(例如，化学气相沉积(CVD))来制作固态膜。在一个示例中，可以通过CVD或从石墨剥离来制备石墨烯膜。可以使用的合适的薄膜液体材料的示例包括二嵌段共聚物或三嵌段共聚物，诸如两亲性PMOXA-PDMS-PMOXA ABA三嵌段共聚物。

如本文所使用的，术语“纳米孔”旨在意指与膜离散或被限定在膜中、并跨膜延伸的中空结构，中空结构允许离子、电流和/或流体从膜的一侧穿越到膜的另一侧。例如，抑制离子或水溶性分子传输的膜可以包括跨膜延伸的纳米孔结构，以允许离子或水溶性分子(穿过纳米级开口/通道，该纳米级开口/通道延伸穿过纳米孔结构)从膜的一侧传输到膜的另一侧。延伸穿过纳米孔结构的纳米级开口/通道的直径可以沿其长度(即，从膜的一侧到膜的另一侧)变化，但在任何点处都处于纳米级(即，从约1nm至约100nm，或小于1000nm)。纳米孔的示例包括例如生物纳米孔、固态纳米孔、以及生物和固态混杂纳米孔。

如本文所使用的，术语“直径”旨在意指穿过纳米级开口的截面的形心的、可在纳米级开口的截面中内接的最长直线。要理解，纳米级开口可以具有或可以不具有圆形或基本上圆形的截面(纳米级开口的截面与顺式/反式电极基本上平行)。此外，截面可以是规则或不规则形状的。

如本文所使用的，术语“生物纳米孔”旨在意指其结构部分由生物来源的材料制成的纳米孔。生物来源是指从生物环境(诸如，生物体或细胞)得到或隔离的材料、或生物可用结构的合成制造版本。生物纳米孔包括例如多肽纳米孔和多核苷酸纳米孔。

如本文所使用的，术语“多肽纳米孔”旨在意指蛋白质/多肽，其跨膜延伸，并允许离子、电流和/或流体穿过它从膜的一侧流到膜的另一侧。多肽纳米孔可以是单体、均聚物或杂聚物。多肽纳米孔的结构包括例如α-螺旋束纳米孔和β-桶纳米孔。示例多肽纳米孔包括α-溶血素、耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)、短杆菌肽A、麦芽孔蛋白、OmpF、OmpC、PhoE、Tsx、F-菌毛等。蛋白质α-溶血素天然存在于细胞膜中，它在细胞膜中充当离子或分子被输运进出细胞的通道。耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)是由分枝杆菌产生的膜孔蛋白，它允许亲水性分子进入细菌。MspA形成紧密互连的八聚体和贯穿膜的β-桶，该贯穿膜的β-桶类似于高脚杯并包含中心通道/孔。

多肽纳米孔可以是合成的。合成的多肽纳米孔包括自然界中不存在的蛋白质状的氨基酸序列。蛋白质状的氨基酸序列可以包括已知存在但不形成蛋白质基础的一些氨基酸(即，非蛋白原氨基酸)。蛋白质状的氨基酸序列可以人工合成，而不是在生物体中表达、然后纯化/隔离。

如本文所使用的，术语“多核苷酸纳米孔”旨在包括多核苷酸，其跨膜延伸，并允许离子、电流和/或流体从膜的一侧流到膜的另一侧。多核苷酸孔可以包括例如多核苷酸折纸(例如，DNA的纳米级折叠，以创建纳米孔)。

还如本文所使用的，术语“固态纳米孔”旨在意指其结构部分由固态膜限定并且包括非生物来源的材料(即，不是生物来源的材料)的纳米孔。固态纳米孔可以由无机或有机材料形成。固态纳米孔包括例如氮化硅纳米孔、二氧化硅纳米孔和石墨烯纳米孔。

本文所公开的纳米孔可以是混杂纳米孔。“混杂纳米孔”是指包括生物来源的材料和非生物来源的材料两者的纳米孔。混杂纳米孔的示例包括多肽-固态混杂纳米孔和多核苷酸-固态纳米孔。

如本文所使用的，术语“纳米孔测序仪”是指本文所公开的可用于纳米孔测序的任何设备。在本文所公开的示例中，在纳米孔测序期间，将纳米孔浸入本文所公开的电解质的示例中，并且跨膜施加势差。在一个示例中，势差是电势差或电化学势差。可以经由电压源跨膜施加电势差，电压源将电流注入或施用到在顺式井或反式井中的一个或多个反式井中包含的电解质的离子中的至少一个离子。可以通过顺式井和反式井的离子成分的差异与电势的组合，来建立电化学势差。不同的离子成分可以是例如每个井中的不同离子或每个井中相同离子的不同浓度。

跨纳米孔施加势差可以迫使核酸穿过第一纳米级开口23(例如，在图2A中示出并且在下面更详细地描述)的易位。生成与核苷酸穿过纳米孔的易位相对应的一个或多个信号。因此，当目标多核苷酸或当单核苷酸或从目标多核苷酸或单核苷酸得到的探头经过纳米孔时，跨膜的电流由于例如收缩部的碱基相关(或探头相关)的阻断而改变。可以使用多种方法中的任何方法来测量来自该电流改变的信号。每个信号对于纳米孔中的核苷酸(或探头)的物种是唯一的，使得所得信号可用于确定多核苷酸的特性。例如，可以确定产生特性信号的核苷酸(或探头)的一个或多个物种的身份。

如本文所使用的，“核苷酸”包括含氮的杂环碱基、糖和一个或多个磷酸基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。核苷酸的示例包括例如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在核糖核苷酸(RNA)中，糖是核糖，而在脱氧核糖核苷酸(DNA)中，糖是脱氧核糖(即，缺少在核糖中的2'位置处存在的羟基的糖)。含氮杂环碱基可以是嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)及其改性衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)及其改性衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9结合。磷酸基团可以是单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯的形式。这些核苷酸是天然核苷酸，但是应进一步理解，也可以使用非天然核苷酸、改性核苷酸或上述核苷酸的类似物。

如本文所使用的，术语“信号”旨在意指表示信息的指示器。信号包括例如电信号和光信号。术语“电信号”是指表示信息的电质量的指示器。指示器可以是例如电流、电压、隧穿、电阻、势、电压、电导率或横向电效应。“电流(electronic current/electriccurrent)”是指电荷流。在一个示例中，电信号可以是穿过纳米孔的电流，并且当跨纳米孔施加电势差时电流可以流动。

术语“衬底”是指刚性固体支撑物，其不溶于水性液体，并且在没有孔径、端口或其他类似液体导管的情况下，不能传输液体。在本文所公开的示例中，衬底可具有被限定在其中的井或室。合适的衬底的示例包括玻璃和改性玻璃或功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯以及苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(PTFE)(诸如，来自科慕(Chemours)的

)、环烯烃类/环烯烃聚合物(COP)(诸如，来自瑞翁(Zeon)的

)、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅和改性硅、碳、金属、无机玻璃和光纤束。

术语顶、底、下、上、在……上等在本文中用于描述设备/纳米孔测序仪和/或设备的各种组件。要理解，这些方向性术语并不意味着暗指特定的定向，而是用于指定组件之间的相对定向。方向性术语的使用不应解释为将本文所公开的示例限制为任何特定定向。

如本文中所使用的，术语“井”、“腔”和“室”同义地使用，并且是指在设备中限定的、可以包含流体(例如，液体、凝胶、气体)的离散特征。顺式井是包含顺式电极或部分地由顺式电极限定的室，并且还与FET的流体系统流体地连接，FET的流体系统进而流体地连接到反式井/室。本设备的阵列的示例可具有一个顺式井或多个顺式井。反式井是单个室，其包含其自己的反式电极或由其自己的反式电极部分地限定，并且还流体地连接到顺式井。在包括多个反式井的示例中，每个反式井与每个其他反式井电隔离。此外，要理解，平行于至少部分地限定井的衬底的表面截取的井的截面可以是弯曲的、正方形的、多边形的、双曲线的、锥形的、成角度的等。

鉴于以上限定，可以理解本文阐述的和权利要求中记载的方面和示例。

现在参考图2A和图2B，描绘了根据本公开的一个示例的设备10。示例设备10包括：与顺式电极30相关联的顺式井14、与反式电极34相关联的反式井16、以及位于顺式井14与反式井16之间的场效应晶体管(FET)22。FET 22包括源极50、漏极52和通道54(例如参见图3)。

FET 22的一个示例还包括被限定在其中的流体系统。流体系统包括面向顺式井14的第一腔15。第二腔17流体地连接至反式井16，并且通孔21从第一腔15延伸穿过FET 22。

设备10的示例还包括将顺式井14和第一腔15流体连接的第一纳米级开口23，第一纳米级开口23具有内径23'。第二纳米级开口25将通孔21和第二腔17流体地连接，第二纳米级开口25具有内径25'。第二纳米级开口的内径25'大于第一纳米级开口的内径23'。

在一个示例中，第二纳米级开口的内径25'是第一纳米级开口的内径23'的约至少两倍。在另一示例中，第二纳米级开口的内径是第一纳米级开口的内径23'的约三倍。在又一示例中，第二纳米级开口的内径25'的范围是从第一纳米级开口的内径23'的约两倍到第一纳米级开口的内径23'的约五倍。

在一个示例中，第二纳米级开口25的面积的范围是第一纳米级开口23的面积的约五倍至约十倍。

此外，在一个示例中，第一纳米级开口内径23'的范围为约0.5nm至约3nm，并且第二纳米级开口内径25'的范围为约10nm至约20nm。在另一示例中，第一纳米级开口内径23'的范围为约1nm至约2nm，并且第二纳米级开口内径25'的范围为约10nm至约20nm。在又一示例中，第一纳米级开口内径23'的范围为约1nm至约3nm，并且第二纳米级开口内径25'的范围为约2nm至约20nm。

示例设备10进一步包括位于顺式井14和第一腔15之间的膜24。第一纳米级开口23延伸穿过膜24。要理解，膜24可以由如本文所述的任何合适的天然或合成材料形成。在一个示例中，膜24选自由脂质和脂质的仿生等同物(其示例在上面讨论了)组成的组。在另一示例中，如图2B所示，膜24是合成膜(例如，固态膜，其一个示例是氮化硅)，并且第一纳米级开口23是延伸穿过膜24的固态纳米孔18'。

图3是沿图2B中的线3-3截取的截面俯视图，其示出了源极50和漏极52以及通孔21的侧壁上的栅极氧化物56'的一个示例。为了图3中的例示性目的，在通道54上未示出绝缘材料68。在该视图中，还可以看到通孔21中的电解质20(通孔21中的点状区)。

在一个示例中，例如，第一纳米级开口23延伸穿过设置在膜中的多核苷酸纳米孔、多肽纳米孔或碳纳米管。多核苷酸纳米孔/多肽纳米孔在图2A中以18示意性示出，而固态纳米孔(例如，碳纳米管)在图2B中以18'用幻影示意性示出。

在一个示例中，设备10是纳米孔测序仪。

衬底12(在图2B中剖视并且以幻影示出)可以包括被限定在其中的反式井16。在一个示例中，通过FET 22的流体系统以及相应的第二纳米级开口25和第一纳米级开口23，反式井16流体连接至顺式井14。尽管在图2A中示出了一个共用的顺式井14和一个共用的反式井16，但是要理解，设备10的阵列100(参见例如图6A)可以包括若干顺式井14，该若干顺式井14彼此流体地隔离，并且流体地连接到相应的一个或多个反式井16，该相应的一个或多个反式井16彼此流体隔离，并被限定在衬底12中。多个顺式井14可能是期望的，例如以使得能够在单个衬底12上测量多个样本。

穿过第一纳米级开口23/纳米孔18的流体连通由图6A中的箭头指示。而且，如图6A所示，膜24可以位于顺式井14和第一腔15之间，并且纳米孔18可以位于膜24中，并延伸穿过膜24，以在顺式井14和第一腔15之间建立流体连接。

顺式井14是流体室，其通过侧壁13被限定在例如衬底12的一部分上，侧壁13连接至衬底12。在一些示例中，侧壁13和衬底12可以一体式形成，使得它们13、12由材料(例如，玻璃或塑料)的连续块形成。在其他一些示例中，侧壁13和衬底12可以是彼此耦合的单独组件。在一个示例中，侧壁13是可光图案化的聚合物。

在图6A所示的示例中，顺式井14具有由侧壁13限定的内壁26、26'、由顺式电极30限定的上表面28、以及由膜24和间隙区域32限定的下表面28'。因此，在由顺式电极30、衬底12的部分和膜24限定的空间内形成了顺式井14。要理解，下表面28'具有穿过第一纳米级开口23的开口，第一纳米级开口23延伸穿过膜24。顺式井14可具有任何合适的尺寸。在一个示例中，顺式井14的范围为约1mm×1mm至约3cm×3cm。

其内表面是顺式井14的上表面28的顺式电极30可以物理地连接到侧壁13。例如，通过粘合剂或其他合适的紧固机制，顺式电极30可以物理地连接到侧壁13。顺式电极30与侧壁13之间的界面可以将顺式井14的上部分密封。

所使用的顺式电极30至少部分取决于电解质20中的氧化还原对。作为示例，顺式电极30可以是金(Au)、铂(Pt)、碳(C)(例如，石墨、金刚石等)、钯(Pd)、银(Ag)、铜(Cu)等。在一个示例中，顺式电极30可以是银/氯化银(Ag/AgCl)电极。

顺式井14能够保持电解质20与第一纳米级开口23接触。在一个示例中，顺式井14与纳米孔18的阵列接触，并且因此能够保持电解质20与阵列中的每个纳米孔18接触。

如图6A所示，设备10/阵列100包括共用的反式井16。反式井16是可以限定在衬底12的一部分中的流体室。反式井16可以延伸穿过衬底12的厚度，并且可以在衬底12的相对端(例如，顶端38和底端40)处具有开口。在另一示例设备10/阵列100'中，如图6A中以幻影所示的，存在两个或更多反式井16。每个反式井16具有：由衬底12和/或由衬底12的间隙区域32限定的侧壁31、31'，由反式电极34限定的下表面36，以及由基部衬底62'(将在下面进一步详细讨论)限定的上表面36'。因此，每个反式井16形成在由反式电极34、衬底12的其他部分和/或间隙区域32、以及基部衬底62'限定的空间内。要理解，上表面36'包括穿过基部衬底62'的第二纳米级开口25，以提供与FET 22的流体系统的流体连通。

其内表面是反式井16的下表面36的反式电极34可物理连接到衬底12(例如，连接到衬底12的间隙区域32(如果存在)或内壁)。在形成衬底12的过程中(例如，在形成反式井16期间)，可以制造反式电极34。可用于形成衬底12和反式电极34的微加工技术包括刻法、金属沉积和提离、干燥和/或在膜沉积上旋涂、蚀刻等。反式电极34和衬底12之间的界面可以将反式井16的下部分密封。

所使用的反式电极34至少部分取决于电解质20中的氧化还原对。作为示例，反式电极34可以是金(Au)、铂(Pt)、碳(C)(例如，石墨、金刚石等)、钯(Pd)、银(Ag)、铜(Cu)等。在一个示例中，反式电极34可以是银/氯化银(Ag/AgCl)电极。

可以设想第一纳米级开口23的许多不同的布局，该布局包括规则的、重复的和不规则的图案。在一个示例中，第一纳米级开口23设置在六边形网格中，用于密堆积和提高密度。其他布局可以包括例如直线(即，矩形)布局、三角形布局等。作为示例，布局或图案可以是成行和成列的第一纳米级开口23的x-y格式。在一些其他示例中，布局或图案可以是第一纳米级开口23和/或间隙区域32的重复布置。在再一些其他示例中，布局或图案可以是第一纳米级开口23和/或间隙区域32的随机布置。图案可以包括点、柱、条、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、方格、格子、斜线、箭头、正方形和/或交叉影线。

可以关于第一纳米级开口23的密度(即，衬底12的限定面积中的第一纳米级开口23的数量)来表征布局。例如，第一纳米级开口23可以以如下范围的密度存在：每平方毫米约10个第一纳米级开口23到每平方毫米约1,000,000个第一纳米级开口23。可以将密度调谐为不同的密度，包括例如每平方毫米至少约10个、每平方毫米约5,000个、每平方毫米约10,000个、每平方毫米约10万个或更高的密度。备选地或附加地，可以将密度调谐为不超过每平方毫米约1,000,000个井、每平方毫米约10万个、每平方毫米约10,000个、每平方毫米约5,000个或更少。还要理解，衬底12中的第一纳米级开口23的密度可以在选自上述范围的下限值之一和上限值之一之间。

布局还可以或者备选地在平均节距方面来表征，平均节距即为从第一纳米级开口23的中心到相邻的第一纳米级开口23的中心的间隔(中心到中心的间隔)。图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变化系数较小，或者图案可以是不规则的，在这种情况下，变化系数可以相对较大。在一个示例中，平均节距的范围可以从大约100nm至大约500μm。平均节距可以是例如至少约100nm、约5μm、约10μm、约100μm或更大。备选地或附加地，平均节距可以例如是至多约500μm、约100μm、约50μm、约10μm、约5μm或更小。设备10的示例阵列100的平均节距可以在从上述范围中选择的下限值之一和上限值之一之间。在一个示例中，阵列100具有大约10μm的节距(中心到中心的间隔)。在另一示例中，阵列100具有大约5μm的节距(中心到中心的间隔)。在又一示例中，阵列100具有范围从大约1μm至大约10μm的节距(中心到中心的间隔)。

反式井16可以是微井(具有在微米级的至少一个尺寸，例如，约1μm直至但不包括1000μm)或纳米井(具有在纳米级的至少一个尺寸，例如，约10nm直至但不包括1000nm)。每个井16可以通过其纵横比(例如，在该示例中，宽度或直径除以深度或高度)来表征。

在一个示例中，每个反式井16的纵横比的范围可以从大约1:1至大约1:5。在另一示例中，每个反式井16的纵横比的范围可以从大约1:10至大约1:50。在一个示例中，反式井16的纵横比为约3.3。

可以选择深度/高度和宽度/直径来获得期望的纵横比。每个反式井16的深度/高度可以是至少约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。备选地或附加地，深度可以是至多约1,000μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.1μm或更小。每个反式井16的宽度/直径可以是至少约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。备选地或附加地，宽度/直径可以为至多约1,000μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm、约50nm或更小。

每个反式井16具有足够大以与第二腔17相关联的开口(例如，流体连接到并面向FET 22的第二腔17)。

顺式井14和反式井16可以使用多种技术来制造，包括例如光刻、纳米压印刻法、冲压技术、浮雕技术、成型技术、微蚀刻技术等。如本领域人员将理解的，所使用的技术将取决于衬底12和侧壁13的成分和形状。在一个示例中，顺式井14可以由衬底12的端38处的侧壁13限定，并且反式井16可以借助衬底12来限定。

膜24可以是本文所述的任何不可渗透或半渗透性材料。膜24位于顺式井14和第一腔15之间，并且因此提供在它们之间的屏障。

纳米孔18可以是本文描述的生物纳米孔、固态纳米孔、混杂纳米孔和合成纳米孔中的任何纳米孔。如本文所述，每个纳米孔18将第一腔15流体连接至顺式井14。

纳米孔18具有两个开口端和连接两个开口端的中空芯或孔(即，第一纳米级开口23)。当插入膜24中时，纳米孔18的开口端中的一个开口端面向顺式井14，而纳米孔18的开口端中的另一开口端面向第一腔15。在某些情况下，纳米孔18面向第一腔15的开口端流体连接到通孔21，并且还可以与通孔21的至少一部分对准。在一些其他情况下，纳米孔18面向第一腔15的开口端流体连接至通孔21，但不与通孔21对准。纳米孔18的中空芯使得能够在顺式井14和第一腔15之间进行流体和电连接。中空芯的直径的范围可以从大约1nm直至1μm，并且可以沿纳米孔18的长度变化。在一些示例中，面向顺式井14的开口端可以大于面向腔15的开口端。在一些其他示例中，面向顺式井14的开口端可以小于面向第一腔15的开口端。在任何情况下，上面给出的第一纳米级开口内径23’的示例范围旨在为穿过纳米孔18的纳米级开口23的最小直径。

纳米孔18可以插入到膜24中，或者膜24可以形成在纳米孔18周围。在一个示例中，纳米孔18可以将其自己插入到所形成的脂质双层(膜24的一个示例)中。例如，处于其单体形式或聚合形式(例如，八聚体)的纳米孔18可将其自己插入脂质双层中，并组装成贯穿膜的孔。在另一示例中，可以以期望的浓度将纳米孔18添加到脂质双层的接地侧，在该接地侧处纳米孔18将会将其自己插入到脂质双层中。在又一示例中，可以跨聚四氟乙烯(PTFE)膜中的孔径形成脂质双层，并且脂质双层可以位于顺式井14和第一腔15之间。纳米孔18可以被添加到接地的顺式隔室，并且可以在形成PTFE孔径的区处将其自己插入脂质双层中。在再一示例中，可以将纳米孔18拴系到固体支撑物(例如，硅、氧化硅、石英、氧化铟锡、金、聚合物等)。拴系分子可以是纳米孔18本身的一部分，或者可以附接到纳米孔18，拴系分子可以将纳米孔18附接到固体支撑物。经由拴系分子的附接可以使得单个孔18被固定(例如，在顺式井14和第一腔15之间)。然后可以在纳米孔18周围形成脂质双层。

设备10的示例包括在顺式井14、第一腔15、通孔21、第二腔17和反式井16中的电解质20。电解质20可以是能够离解为抗衡离子(阳离子及其相关联的阴离子)的任何电解质。作为示例，电解质可以是能够离解为钾阳离子(K⁺)或钠阳离子(Na⁺)的任何电解质。该类型的电解质包括钾阳离子和相关联的阴离子，或钠阳离子和相关联的阴离子，或其组合。含钾电解质的示例包括氯化钾(KCl)、铁氰化钾(K₃[Fe(CN)₆]·3H₂O或K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O)或其他含钾电解质(例如，碳酸氢盐(KHCO₃)或磷酸盐(例如，KH₂PO₄、K₂HPO₄、K₃PO₄))。含钠电解质的示例包括氯化钠(NaCl)或其他含钠电解质(诸如，碳酸氢钠(NaHCO₃)、磷酸钠(例如，NaH₂PO₄、Na₂HPO₄或Na₃PO₄)。作为另一示例，电解质可以是能够离解成含钌阳离子(例如钌六胺，诸如[Ru(NH₃)₆]²⁺或[Ru(NH₃)₆]³⁺)的任何电解质。还可以使用能够离解为锂阳离子(Li⁺)、铷阳离子(Rb⁺)、镁阳离子(Mg⁺)或钙阳离子(Ca⁺)的电解质。

再次参考图6A，示意性地示出了设备10的阵列100。如所提到的，设备10可以是纳米孔测序仪。在阵列100的一个示例中，如图6A和图6B示意性所示，多个设备10/纳米孔测序仪中的每一个共享共用的顺式电极30和共用的反式电极34。在阵列100'的另一示例中，如图6A和图6C示意性所示，多个设备10/纳米孔测序仪中的每一个共享共用的顺式电极30，并具有不同的反式电极34。在阵列100″的又一示例中，如图6D示意性所示，多个设备10/纳米孔测序仪中的每一个具有不同的顺式电极30和不同的反式电极34。在阵列100″'的再一示例中，如图6E示意性所示，多个设备10/纳米孔测序仪中的每一个具有不同的顺式电极30，并共享共用的反式电极34。

现在参考图4和图7，示出了使用设备10的一个示例的等效电路图和操作原理/方法200。将电解质20引入到顺式井14、反式井16、第一腔15、FET通孔21和第二腔17中的每一个中(在图7中的框202处示出)。在顺式电极30和反式电极34之间施加电压偏置27，电压偏置27足以驱动多核苷酸29穿过第一纳米级开口23。第一纳米级开口23的电阻R₁响应于多核苷酸29中碱基的身份而变化。FET通孔21中的电解质20的势响应于第一纳米级开口23的电阻R₁的变化而变化(在图7中的框204处示出)。示例方法200还包括当多核苷酸29被驱动穿过第一纳米级开口23时，测量FET 22的响应，以标识多核苷酸29中的碱基(在图7中的框206处示出)。

在纳米孔测序操作期间，可以执行方法200。跨纳米孔18施加电势(即，由顺式电极30和反式电极34作为电流源提供的偏置)迫使核苷酸29与承载电荷的阴离子一起穿过纳米孔18的易位。取决于偏置，核苷酸29可以从顺式井14输运到第一腔15，或从第一腔15输运到顺式井14。当核苷酸29经过纳米孔18时，例如，跨屏障的电流由于例如收缩部的碱基相关的阻断而改变。可以使用FET 22来测量来自该电流改变的信号。

电压的范围可以选自约-1V至约1V以上。通常施加电压极性，使得带负电荷的核酸被电泳驱动到纳米孔18中。在某些情况下，电压可以减小或反转极性，来便于适当的功能。

在设备10的一个示例中，第一纳米级开口23具有如上所述的可变电阻R₁。第二纳米级开口25具有固定的或至少基本上固定的电阻R₂。

测量FET 22的响应的示例包括：测量源极50-漏极52的电流；或测量在源极50和/或漏极52处的势；或测量通道54的电阻；或其组合。

在一个非限制性示例中，第一纳米级开口23/纳米孔18的电阻R₁可以是大约0.5千兆欧至大约1千兆欧(GΩ)，并且第二纳米级开口25的电阻R₂可以是大约50兆欧(MΩ)。R₁根据穿过第一纳米级开口23的DNA 29而变化。

分压器点M的势随R₁变化，并对FET栅极51处的势进行调制。第二纳米级开口25(其可以是固态纳米孔)的电阻R₂是固定的或至少基本上固定的，并且未由穿过第一纳米级开口23的DNA 29进行调制。

当DNA 29进入第一纳米级开口23的收缩部时，基于DNA链29中碱基的身份，对第一纳米级开口23的电阻R₁进行调制。当不同的DNA碱基穿过第一纳米级开口23时，电阻R₁较大且变化30％-40％。如上所述，大得多的第二纳米级开口25/固态纳米孔的电阻R₂低大约9倍，并且近似固定(不变)。

所得的结构是分压器，其中点M的势是通孔21中的电解质20的势。该势是FET 22的等效栅极势，并建立其操作点。当点M的势随碱基身份改变时，流过FET 22的电流改变，从而提供对流过第一纳米级开口23的电流的测量，并因此提供对DNA碱基身份的测量。

在纳米孔传感器阵列A(诸如，图1A中所示的纳米孔传感器阵列A)中，反式电极34既用于驱动DNA穿过纳米孔18，又用于读出与纳米孔18相关联的电流。因此，每个纳米孔18需要一个反式电极34，其结果是限制了早前讨论的可缩放性。相反，在本文公开的示例设备10中，反式电极34用于驱动DNA 29穿过第一纳米级开口23，但是对DNA 29易位穿过第一纳米级开口23的响应(例如，源极-漏极处的电流)利用FET 22传感器(不是反式电极34)读出。

由于设备10的示例中的第二纳米级开口25/固态纳米孔的功能是在分压器中提供固定电阻R₂(而不是读出与第一纳米级开口23相关联的电流)，因此第二纳米级开口25不需要是原子级精确的。

此外，由于不再需要反式电极34的单独寻址，因此在传感器阵列100中，反式井16可以更大，从而减轻了电解质20的消耗以及对传感器寿命的相关联限制。因此，设备10的示例的可缩放性高得多。

这样，例如通过并入FET 22和分压器，通过包括更大的共用反式井16、而不是较小的可单独寻址的反式井16/电极34，根据本公开的示例的设备10允许纳米孔传感器阵列100的可缩放性。

图8A至图8M图示了用于制作本文所公开的设备10的示例的方法的一个示例。通常，方法包括：制造场效应晶体管22；在其中限定流体系统，流体系统包括具有入口端和出口端的第一腔15，以及与第一腔15相对的第二腔17；从第一腔出口端76朝向第二腔17限定穿过场效应晶体管22的通孔21；在第一腔15的入口端76之上限定膜24，膜24具有穿过它的第一纳米级开口23，第一纳米级开口23具有内径23'；以及限定穿过场效应晶体管22的基部衬底62'的第二纳米级开口25，以将通孔21与第二腔17流体连接，第二纳米级开口25具有内径25'，其中第二纳米级开口内径25'大于第一纳米级开口内径23'。

场效应晶体管22的形成在图8A至图8H中示出。如将在图8A至图8F中讨论的，流体系统组件中的一些可以在场效应晶体管22的形成期间形成。

场效应晶体管22可以部分地被制造在图8A中所示的衬底42中和/或衬底42上。在一些实现中，衬底42可以是绝缘体上硅的晶片。如图8A所示，绝缘体上硅(SOI)衬底42是层状结构，其包括在两个硅层46、48之间的绝缘体层44。虽然示出了绝缘体上硅的晶片，但是要理解，可以使用其他合适的半导体衬底。如图8B所示，可以在衬底42的硅层46之一中限定源极50、漏极52和通道54。源极50、漏极52和通道54可以通过将硅层46图案化(例如，蚀刻)到组件50、52、54中的每一个的期望深度来形成。如图8B所示，绝缘体层44在源极50、漏极52和通道54的形成期间不暴露。

在限定源极50、漏极52和通道54之后，可以将硅层46的表面氧化。这在源极50、漏极52和通道54中的每一个的表面上形成栅极氧化物56。可以通过热氧化来完成氧化，在热氧化中，在炉中以范围从大约700℃至大约1000℃的温度对衬底42进行氧化。可以使用湿法或干法热氧化。在一个示例中，栅极氧化物56的厚度跨源极50、漏极52和通道54可以基本均匀。在一些其他示例中，栅极氧化物56可以沉积在源极50、漏极52和通道54上。可以沉积的合适的栅极氧化物材料的示例包括HfO₂、Al₂O₃、Ta₂O₅等。

如图8D和图8E所示，方法还涉及在通道54上的栅极氧化物56上形成牺牲层58。在一个示例中，牺牲层58可以沉积在栅极氧化物56的整个表面上(如图8D所示)，并且然后可以被图案化以i)重新暴露源极50和漏极52以及在其上形成的栅极氧化物56的部分，以及ii)留下牺牲层58的在通道54上形成的栅氧化物56上的部分。牺牲层58的沉积可以使用化学气相沉积(CVD)或另一合适的沉积技术来完成。图案化导致选择性地从源极50和漏极52区去除牺牲层58。在一个示例中，图案化可以使用反应性离子蚀刻工艺来完成。在另一示例(未示出)中，源极50和漏极52可以利用掩模被覆盖，并且牺牲层58可以沉积在栅极氧化物56的覆盖通道54的部分上。任何合适的牺牲材料(诸如，多晶硅)可以用于层58。如图8E所示，牺牲层58形成在或保留在(图案化后)覆盖通道54的栅极氧化物56上。

在图8F中，限定了流体系统的一部分。更具体地，限定了第二腔17。在该示例中，方法包括通过蚀刻穿衬底42的第二硅层48的一部分、直至衬底42的绝缘体层44，来限定流体系统的第二腔17，其中蚀刻走的部分与通道54相对。可以使用任何合适的硅蚀刻技术，诸如湿法蚀刻(例如，使用氢氧化四甲基铵(TMAH)，或硝酸、乙酸和氢氟酸的混合物)或干法蚀刻(例如，使用HBr)。第二腔17的尺寸可以相对较大，范围从大约100nm到大约1μm。如图所示，第二腔17的侧壁可以是渐窄的或成角度的，并且因此沿第二腔17的深度的尺寸可以变化。

FET 22的制造在图8G和8H中继续。在图8G中，沉积蚀刻停止材料，以在栅极氧化物56(位于源极50和漏极52上)上和牺牲层58上形成层60，并形成基部衬底62'。在一些示例中，如图8G所示，例如使用化学气相沉积(CVD)，蚀刻停止材料可以同时沉积在结构的前表面和后表面两者上。在一些其他示例中，蚀刻停止材料可以分开沉积，以在结构的前表面上形成层60，并在结构的后表面上形成基部衬底62'。如图8G所描绘的，蚀刻停止材料(其被示出为固态材料62)沉积在第二硅层48上和绝缘体层44的暴露部分上，以形成(FET22的)基部衬底62'。用于层60和基部衬底62'的蚀刻停止材料的示例包括氮化硅(Si₃N₄)、碳化硅(SiC)、氧化铝(Al₂O₃)、氧化铪(HfO₂)和五氧化钽(Ta₂O₅)。除了CVD之外，针对这些材料的合适沉积技术的示例包括原子层沉积(ALD)等。

如图8H所示，然后可以通过半导体处理方法，来制造FET 22的其余部分，包括部分封装在绝缘材料68中的垂直互连通路(via)64和金属互连66。via 64将FET的源极50和漏极52电连接到金属互连66。在图8H所示的示例中，可以形成与源极50和漏极52分别电接触的相应via 64、64'，并且相应金属互连66、66'可以将相应via 64、64'电连接到外部电路(未示出)。via 64、64'和金属互连66、66'可以是任何合适的金属(例如，铝、铜、锡、钨、锌、金、镍等)、金属合金(例如，AlSiCu)或其他导电材料，并且绝缘材料68可以是任何合适的绝缘体(例如，二氧化硅SiO₂)，其具有与基部衬底62'的期望的蚀刻差异(如下文更详细地讨论的)。

图8I和图8J一起描绘了流体系统的第一腔15的形成。限定第一腔15包括：蚀刻穿绝缘材料68的区70、直到牺牲层58，其中区70毗邻通道54(图8I)；以及蚀刻牺牲层58以暴露通道54上的栅极氧化物56(图8J)。用于绝缘材料68和牺牲层58中的每一个的蚀刻技术可以取决于材料68、58。当绝缘材料68是二氧化硅时，可以例如使用具有高各向异性的蚀刻剂来执行蚀刻，诸如氟化反应性离子蚀刻(例如，CHF₃/O₂、C₂F₆、C₃F₈和C₅F₈/CO/O₂/Ar)。区70的尺寸可以相对较大，例如，高达约1μm(例如，在第一腔15的入口端76处)。如图所示，区70的侧壁可以朝向栅极氧化物56向内渐窄，并因此沿区70的深度的尺寸可以变化。当牺牲层58(图8I)是多晶硅时，可以例如使用湿法蚀刻或反应性离子蚀刻工艺来执行蚀刻。牺牲层58的蚀刻使通道54上的栅极氧化物56重新暴露。

图8K图示了通孔21的形成。通孔21最终将第一腔15流体连接至第二纳米级开口25(参见图8M)。如图8K所示，限定通孔21涉及：蚀刻穿栅极氧化物56、衬底42的硅层46和衬底42的绝缘层44中的每一个的相应部分，以暴露基部衬底62'/固态材料62。所使用的一种或多种蚀刻技术将取决于待蚀刻的材料(例如，56、46、44)。当从栅极氧化物56移动到硅层46、到绝缘层44时，可以切换蚀刻技术或技术中使用的蚀刻剂。在一个示例中，通孔21的直径范围为约35nm至约40nm。在另一示例中，通孔21具有约40nm的直径。

如图8K所描绘的，栅氧化物56、硅层46和绝缘层44的相应部分被去除，以创建穿过FET 22的通道54和其他层(例如，56、44)的开口。该开口(即，通孔21)借助第一腔15的出口端72与第一腔15流体连通。

图8L描绘了在通道54/硅层46的暴露部分74上形成绝缘层56'。在一些示例中，绝缘层56'通过将衬底42的硅层46在通孔21中的暴露部分74氧化而形成。该氧化可以使用热氧化来实现。尽管图8L中示出了暴露部分74的氧化，但是要理解，当利用热氧化时，可能期望在制造via 64、64'和金属互连66、66'之前，形成通孔21并将部分74氧化，这是因为这些组件可能容易受到热氧化的加热条件的损害。在一些其他示例中，通过在衬底42的硅层46在通孔21中的暴露部分74上沉积或生长绝缘层56'，来形成绝缘层56'。当使用沉积或生长技术来在暴露部分74上形成绝缘层56'时，这些技术可以在制造via64、64'和金属互连66、66'之后(如图所示)进行，或者可以在制造via 64、64'和金属互连66、66'之前进行。当绝缘层56'将要暴露于用于形成的高温氧化或用于致密化的高温退火(例如，从约700℃至约1000℃)时，可能特别期望在via 64、64'和金属互连66、66'之前制造通孔21和绝缘层56'。

如上所述，方法包括限定穿过场效应晶体管22的基部衬底62'(即，固态材料62)的第二纳米级开口25，以将通孔21与第二腔17流体连接，其中第二纳米级开口25具有内径25'，并且其中第二纳米级开口内径25'大于第一纳米级开口23的内径23'(例如，参见图2A和图2B)。在图8M中示出了第二纳米级开口25的形成。如所描绘的，第二纳米级开口25被限定在固态材料62(即，基部衬底62')中。可以通过蚀刻穿(针对用于形成基部衬底62'的蚀刻停止材料，使用适当的蚀刻剂)或离子铣穿基部衬底62'的一部分，来限定第二纳米级开口25。被蚀刻的部分延伸穿过基部衬底62'的厚度，使得所形成的开口25将通孔21和第二腔17流体地连接。在一个示例中，第二纳米级开口25的内径25'的范围为从约5nm至约10nm。

在制造设备10时，应理解，选择用于FET 22的蚀刻停止材料(其形成层60和基部衬底62')和绝缘层68的材料，使得材料之间存在显著蚀刻差异。绝缘层68的蚀刻速率应高于蚀刻停止材料(即，层60和基部衬底62')的蚀刻速率。提供合适的蚀刻差异的用于蚀刻停止材料(即，层60和基部衬底62')和绝缘层68的合适材料组合的示例包括Si₃N₄(层60和基部衬底62')和SiO₂(绝缘层68)或SiC(层60和基部衬底62')和Al₂O₃(绝缘层68)。

虽然在图8A至图8M中未示出，但是方法的示例还包括形成第一纳米级开口23(图2A和图2B)。如图8M所示，第一腔15具有入口端76(其与出口端72相对)。膜24(图2A和图2B)可以被限定在第一腔15的入口端76之上。膜24具有穿过它的第一纳米级开口23，并且第一纳米级开口23具有内径23'。用于形成膜24和第一纳米级开口23的技术可以取决于所使用的膜24和纳米级开口23的类型。作为示例，纳米级开口23可以插入膜24中，或者膜24可以形成在纳米级开口23周围。在一个示例中，纳米级开口23可以将其自己插入所形成的脂质双层(膜24的一个示例)中。例如，如上所述，呈其单体形式或聚合形式(例如，八聚体)的纳米级开口23可将其自己插入脂质双层中，并组装成贯穿膜的孔。在另一示例中，纳米级开口23可以以期望的浓度被添加到脂质双层的接地侧(在该处，纳米级开口23将会将其自己插入到脂质双层中)。在又一示例中，脂质双层可以跨聚四氟乙烯(PTFE)膜中的孔径被形成，并位于第一腔15的入口端76处。纳米级开口23可以被添加到脂质双层的接地侧，并且可以在形成PTFE孔径的区处，将其自己插入脂质双层中。在再一示例中，纳米级开口23可以被拴系到固体支撑物(例如，硅、氧化硅、石英、氧化铟锡、金、聚合物等)。拴系分子可以是纳米级开口23本身的一部分或者可以附接到纳米级开口23，拴系分子可以将纳米级开口23附接到固体支撑物。经由拴系分子的附接可以使得单个纳米级开口23被固定在第一腔15的入口端76处。脂质双层然后可以在纳米级开口23的周围形成。纳米级开口23还可以是固态开口。在这些示例中，另一固态材料(例如，62)可以沉积在入口端76之上和绝缘材料68上。纳米级开口23可以在该固态材料中形成，使得其内径具有如本文所公开的期望尺寸。

本文中已提供了用于形成设备10的若干示例技术。应理解，设备10的、具有大于40nm的最小尺寸的任何特征(例如，第一腔15、第二腔17)可以使用常规的(干法)193nm刻法制造。

尽管未示出，但是方法可以进一步包括：将顺式井(例如，顺式井14，图2A和图2B)流体连接至第一纳米级开口23，顺式井14与顺式电极(例如，图2A和图2B的顺式电极30)相关联；将反式井(例如，图2A和图2B的反式井16)流体连接到第二腔17，反式井16与反式电极(例如，图2A和图2B的反式电极34)相关联，从而形成设备10的一个示例(例如，纳米孔测序仪)；以及将纳米孔测序仪/设备10浸入电解质20中。顺式井14、顺式电极30、反式井16和反式电极34的配置可以根据本文所公开的示例中的任何示例。

如上面更详细地讨论的，电解质20可以是能够离解为抗衡离子(阳离子及其相关联的阴离子)的任何电解质。

附加说明

应当理解，前述概念和下面更详细讨论的附加概念(假设这样的概念不相互矛盾)的所有组合被认为是本文所公开的发明主题的一部分。特别地，出现在本公开的结尾处的所要求保护的主题的所有组合被认为是本文所公开的发明主题的一部分。还应理解，本文明确采用的、还可能出现在通过引用并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。

在整个说明书中对“一个示例”、“另一示例”、“示例”等的引用意指结合示例描述的特定元素(例如，特征、结构和/或特性)被包括在本文所描述的至少一个示例中，并且在其他示例中可能存在或可能不存在。附加地，应理解，除非上下文另外明确指出，否则在各个示例中，用于任何示例的所述元素可以以任何适当的方式进行组合。

要理解，本文所提供的范围包括所述范围、和在所述范围内的任何值或子范围，就像这样的值或子范围被明确记载。例如，从约2nm到约20nm的范围应被解释为不仅包括明确记载的从约2nm到约20nm的极限，而且还包括诸如约3.5nm、约8nm、约18.2nm等的个体值，以及诸如从约5nm至约10nm等的子范围。此外，当使用“约”和/或“基本上”来描述值时，这意指涵盖与所述值的微小变化(高达+/-10％)。

尽管已详细描述了若干示例，但是要理解，可以修改所公开的示例。因此，前述描述应被认为是非限制性的。

Claims

1.一种测序设备，包括：

与顺式电极相关联的顺式井；

与反式电极相关联的反式井；

位于所述顺式井与所述反式井之间的场效应晶体管(FET)，所述场效应晶体管(FET)包括：

被限定在其中的流体系统，所述流体系统包括：

面向所述顺式井的第一腔；

流体地连接至所述反式井的第二腔；以及

从所述第一腔延伸穿过所述场效应晶体管的通孔；

将所述顺式井和所述第一腔流体地连接的第一纳米级开口，所述第一纳米级开口具有内径；以及

将所述通孔和所述第二腔流体地连接的第二纳米级开口，所述第二纳米级开口具有内径，其中所述第二纳米级开口的内径大于所述第一纳米级开口的内径。

2.根据权利要求1所述的设备，其中：

所述第二纳米级开口的内径是所述第一纳米级开口的内径的约至少两倍；

所述第一纳米级开口的内径的范围是从约1nm至约3nm；并且

所述第二纳米级开口的内径的范围是从约2nm至约20nm。

3.根据权利要求1所述的设备，其中所述第二纳米级开口的内径的范围是从所述第一纳米级开口的内径的约两倍到所述第一纳米级开口的内径的约五倍。

4.根据权利要求1所述的设备，其中：

所述第一纳米级开口的内径的范围是从约0.5nm至约3nm；并且

所述第二纳米级开口的内径的范围是从约10nm至约20nm。

5.根据权利要求1所述的设备，其中：

所述第二纳米级开口的内径是所述第一纳米级开口的内径的约三倍；

所述第一纳米级开口的内径的范围是从约1nm至约2nm；并且

所述第二纳米级开口的内径的范围是从约10nm至约20nm。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的设备，还包括位于所述顺式井与所述第一腔之间的膜，其中所述第一纳米级开口延伸穿过所述膜。

7.根据权利要求6所述的设备，其中所述膜选自由脂质和脂质的仿生等同物组成的组。

8.根据权利要求7所述的设备，其中所述第一纳米级开口延伸穿过：设置在所述膜中的多核苷酸纳米孔、多肽纳米孔或碳纳米管。

9.根据权利要求6所述的设备，其中所述膜是合成膜，并且其中所述第一纳米级开口是固态纳米孔。

10.根据权利要求1-5和7-9中任一项所述的设备，其中：

所述第一纳米级开口具有可变电阻；并且

所述第二纳米级开口具有至少基本上固定的电阻。

11.根据权利要求1-5和7-9中任一项所述的设备，其中所述设备包括纳米孔测序仪。

12.一种多个根据权利要求11所述的纳米孔测序仪的阵列，其中：

所述多个纳米孔测序仪中的每一个共享共用的顺式电极和共用的反式电极；或者

所述多个纳米孔测序仪中的每一个具有不同的顺式电极和不同的反式电极；或者

所述多个纳米孔测序仪中的每一个共享共用的顺式电极并具有不同的反式电极；或者

所述多个纳米孔测序仪中的每一个具有不同的顺式电极并共享共用的反式电极。

13.一种使用根据权利要求1至11中任一项所述的设备或使用根据权利要求12所述的阵列的方法，所述方法包括：

将电解质引入所述顺式井、所述反式井、所述第一腔、FET的所述通孔和所述第二腔中的每一个中；

在所述顺式电极和所述反式电极之间施加电压偏置，所述电压偏置足以驱动多核苷酸穿过所述第一纳米级开口，其中所述第一纳米级开口的电阻响应于所述多核苷酸中碱基的身份而变化，并且其中FET的所述通孔中的所述电解质的势响应于所述第一纳米级开口的电阻的所述变化而变化；以及

随着所述多核苷酸被驱动穿过所述第一纳米级开口，测量所述FET的响应，以标识所述多核苷酸中的所述碱基。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述FET还包括源极、漏极和通道，并且其中测量所述FET的所述响应包括：

测量源极-漏极电流；或者

测量在所述源极、所述漏极、或所述源极和所述漏极两者处的势；或者

测量所述通道的电阻；或者

其组合。

15.一种用于测序的方法，包括：

制造场效应晶体管；

在其中限定流体系统，所述流体系统包括：

具有入口端和出口端的第一腔，以及

与所述第一腔相对的第二腔；

限定从所述第一腔的出口端朝向所述第二腔、穿过所述场效应晶体管的通孔；

限定在所述第一腔的所述入口端之上的膜，所述膜具有穿过它的第一纳米级开口，所述第一纳米级开口具有内径；以及

限定穿过所述场效应晶体管的基部衬底的第二纳米级开口，以将所述通孔与所述第二腔流体地连接，所述第二纳米级开口具有内径，其中所述第二纳米级开口的内径大于所述第一纳米级开口的内径。

16.根据权利要求15所述的方法，还包括：

将顺式井流体地连接到所述第一纳米级开口，所述顺式井与顺式电极相关联；

将反式井流体地连接到所述第二腔，所述反式井与反式电极相关联，从而形成纳米孔测序仪；以及

将所述纳米孔测序仪浸入电解质中。

17.根据权利要求15所述的方法，其中制造所述场效应晶体管包括：

在绝缘体上硅衬底的硅层中限定源极、漏极和通道；

将所述硅层的表面氧化，以在所述源极、所述漏极和所述通道上形成栅极氧化物；

在所述通道上的所述栅极氧化物上形成牺牲层；

沉积蚀刻停止材料，以在所述源极和所述漏极上的所述栅极氧化物以及所述牺牲层上形成层，并形成所述基部衬底；以及

制造部分地封装在绝缘材料中的垂直互连通路(via)和金属互连，所述垂直互连通路(via)将所述源极和所述漏极电连接到所述金属互连。

18.根据权利要求17所述的方法，其中在沉积所述蚀刻停止材料之前，所述方法还包括：通过蚀刻穿第二硅层的一部分、直到所述绝缘体上硅衬底的绝缘体层，来限定所述流体系统的所述第二腔，其中被蚀刻走的所述一部分与所述通道相对。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述蚀刻停止材料是固态材料，所述固态材料被沉积在所述绝缘体层的暴露部分和所述第二硅层上，以形成所述基部衬底。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第二纳米级开口通过蚀刻穿所述固态材料的一部分而被限定。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中：

限定所述第一腔包括：

蚀刻穿所述绝缘材料的区、直到所述牺牲层，其中所述区毗邻所述通道；以及

蚀刻所述牺牲层，以暴露所述通道上的所述栅极氧化物；并且限定所述通孔包括：蚀刻穿所述栅极氧化物、所述绝缘体上硅衬底的所述硅层和所述绝缘体上硅衬底的绝缘层中的每一个的相应部分，以暴露所述固态材料。

22.根据权利要求21所述的方法，还包括将所述绝缘体上硅衬底上的所述硅层在所述通孔中的暴露部分氧化。

23.根据权利要求21所述的方法，还包括在所述绝缘体上硅衬底的所述硅层在所述通孔中的暴露部分上沉积或生长绝缘层。