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CN111094536B - 用于3d培养的细胞培养容器及培养3d细胞的方法 - Google Patents

用于3d培养的细胞培养容器及培养3d细胞的方法 Download PDF

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CN111094536B CN201880059692.3A CN201880059692A CN111094536B CN 111094536 B CN111094536 B CN 111094536B CN 201880059692 A CN201880059692 A CN 201880059692A CN 111094536 B CN111094536 B CN 111094536B
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Abstract

一种细胞培养容器(100)，其具有壁以及具有多个微腔体(120)的基材，其中，所述多个微腔体中的每个微腔体包括凹形孔穴和开口以使微腔体填充有液体。凸缘(170)围绕具有微腔体阵列的基材。通道(175、176)围绕凸缘，从而提供围绕微腔体基材的壕沟。凸缘是成角度的。还提供了在所述细胞培养容器中培养细胞的方法。

Description

用于3D培养的细胞培养容器及培养3D细胞的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下申请的优先权权益：2018年3月13日提交的题为“CellCultureContainer and Methods of Culturing Cells(细胞培养容器和培养细胞的方法)”的系列号为62/642,400的美国临时申请；2017年7月14日提交的题为“CellCulture Containersand Methods of Culturing Cells(细胞培养容器及培养细胞的方法)”的系列号为62/532,639的美国临时申请；2017年7月14日提交的题为“Cell Culture Container andMethods of Culturing Cells(细胞培养容器和培养细胞的方法)”的系列号为62/532,648的美国临时申请；以及2017年7月14日提交的题为“Cell Culture Containers andMethods of Culturing Cells(细胞培养容器和培养细胞的方法)”的系列号为62/532,671的美国临时申请；本文以上述临时申请的内容为基础，并通过参考将其全文纳入本文。
技术领域
本公开一般涉及细胞培养容器和培养细胞的方法，更具体地，涉及用于容纳三维细胞的细胞培养容器以及在所述细胞培养容器中培养三维细胞的方法。
背景技术
在细胞培养容器中容纳三维细胞是已知的。在细胞培养容器中培养三维细胞也是已知的。
发明内容
下文给出了本公开的简化归纳，以便提供对具体实施方式所描述的一些示例性实施方式的基本理解。
在实施方式中，本公开提供了用于培养三维构造的细胞的细胞培养容器，其具有微腔体，所述微腔体可以以阵列存在于基材中。为了使细胞阵列以三维构造生长成球体或类器官，在细胞培养容器中提供基材以使所有细胞均保持在微腔体中是重要的。当细胞在微腔体中生长时，它们形成受微腔体束缚并且尺寸受限的球体。当细胞从微腔体逸出或者沉降到细胞培养容器内侧的表面上，并且所述表面未被结构化和布置成使细胞以所需的三维构造生长时，细胞将不受束缚地生长。如果细胞培养容器中的细胞能够不受束缚地生长，则它们将形成不均匀的细胞群。
对于一些应用，期望在细胞培养容器内侧生长和培养均匀的球体群。例如，期望在均匀的细胞群中进行分析，以控制由于不一致的细胞形态学导致的细胞生理学的变化。而且，当细胞治疗剂是球体培养的期望结果时，同样期望均匀的细胞来提供受控、可预测的治疗结果。
当球体彼此触碰时，它们往往聚集，结果形成大的、不均匀的细胞结构。在培养基更换期间，细胞可从微腔体逸出，例如，当培养基流入容器中或从容器流出时产生湍流并造成球体逸出微腔体的界限。结果，可形成不规则的细胞团聚物。细胞培养容器的结构对于提供微腔体室阵列以将细胞限制成以期望的三维构造生长而球体不从它们的微腔体中移出以及形成不规则细胞结构来说是重要的。在实施方式中，本公开提供了形成壕沟的凸缘和通道，所述壕沟允许培养基缓和地填充容器而不会产生过度的湍流。
当细胞培养容器的内部除了具有微腔体之外还具有平坦表面时，细胞可沉降到平坦表面上并且可生长成不是均匀的球体而是非均匀的细胞结构的结构。为了确保细胞培养容器提供促进培养均匀球体的环境，在实施方式中，提供了平坦表面减少的细胞培养容器。提供了具有通道和成角度的凸缘的壕沟结构来作为围绕多个微腔体的基材外周界。并且，这些通道或壕沟结构减少了细胞培养区域中的平坦表面。在一些实施方式中，一种方法可包括在细胞培养容器中培养细胞。
以上实施方式是示例性的，并且可单独或与本文提供的任意一个或多个实施方式以任意形式组合来提供而不会偏离本公开的范围。另外，应当理解的是，前面的一般性描述和以下的具体实施方式都呈现了本公开的实施方式，且都旨在提供用于理解所描述和所要求保护的实施方式的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对实施方式的进一步理解，附图结合于本说明书中并构成说明书的一部分。附图例示了本公开的各个实施方式，并与说明书一起用来解释其原理和操作。
附图说明
当参照附图阅读时，可以进一步理解本公开的这些特征、实施方式和优点以及其他特征、实施方式和优点，附图中：
图1根据本公开的实施方式，示意性例示了第一示例性细胞培养容器的侧视图；
图2A和2B是如图1中“2”所示的放大区域示图的两个实施方式；
图3A和3B是图2A和图2B所示的在平坦结构上生长的细胞构造的照片；
图4根据本公开的实施方式，示出了包括凸缘和通道的图1的细胞培养容器的截面图的一个实施方式；
图5根据本公开的实施方式，示出了在线5-5处截取的包括凸缘和通道的图1的细胞培养容器的截面图的一个实施方式；
图6根据本公开的实施方式，例示了以图5的视图6获取的细胞培养容器的一部分的放大示意图，其示出了具有多个微腔体的基材；
图7根据本公开的实施方式，示出了细胞培养容器的一部分的截面图，其示出了图6的具有多个微腔体的基材；
图8根据本公开的实施方式，示出了具有图6的多个微腔体的细胞培养容器的部分的截面图的替代示例性实施方式；
图9根据本公开的实施方式，示出了在图4中所示的区域“9”的放大图；
图10根据本公开的实施方式，示出了图4的细胞培养容器的一个实施方式，其包括在第一示例性细胞培养容器中培养细胞的方法；
图11根据本公开的实施方式，示出了图4的细胞培养容器的一个实施方式，其包括利用分配端口向通道添加材料的方法；
图12根据本公开的实施方式，示出了图4的细胞培养容器的一个实施方式，其包括利用收集端口从通道移除材料的方法；
图13根据本公开的实施方式，示出了利用收集端口从图4的细胞培养容器的通道移除材料的方法中的一个步骤；
图14根据本公开的实施方式，示出了利用收集端口从图4的细胞培养容器的通道移除材料的方法中的一个步骤；
图15根据本公开的实施方式，示出了图4的细胞培养容器的一个实施方式，其包括利用分配端口向通道添加材料的方法；
图16根据本公开的实施方式，例示了以图15的视图16获取的细胞培养容器的一部分的一个实施方式的放大示意图，其包括凸缘，通道，以及利用分配端口向通道添加材料的方法；
图17根据本公开的实施方式，例示了以图15的视图16获取的细胞培养容器的一部分的一个实施方式的放大示意图，其包括凸缘，通道，以及利用收集端口从通道移除材料的方法；
图18A是在不具有凸缘和通道结构的T175烧瓶中生长的球体的照片；图18B是根据实施方式，在具有凸缘和通道结构的烧瓶中生长的球体的照片。
图19A、19B、19C和19D是在14天的培养后，从对照烧瓶(图19A和19B)和例如图4的实验烧瓶(图19C和图19D)收获的细胞的照片。
具体实施方式
下文将参照附图更完整地描述各个特征，附图中示出了本公开的示例性实施方式。只要可能，在所有附图中使用相同的附图标记来表示相同或类似的部分。但是，本公开可以以许多不同的形式实施并且不应被解读成限于本文中提出的实施方式。
细胞培养容器(例如烧瓶)可提供用于培养细胞的无菌细胞培养室。在一些实施方式中，培养细胞可提供关于疾病和毒理学研究，药剂和治疗的功效，肿瘤特性、生物体、遗传学以及细胞和与细胞相关的其他科学、生物学和化学原理的信息。细胞培养容器可包括基材，其包括多个微腔体(例如，微腔体、微尺寸孔穴、亚毫米尺寸孔穴)，它们例如以阵列来布置。基材可被放置在烧瓶中或者可形成烧瓶的边界壁的一部分。也就是说，基材可与烧瓶成一体。例如，在细胞培养容器的底部内表面中可形成微腔体的阵列。或者，具有微腔体阵列的基材可被插入到细胞培养容器中，并且可位于细胞培养容器的底表面上或是通过胶粘、激光焊接、超声焊接或某种其他方法固定于细胞培养容器的底表面。基材可包括顶侧和/或底侧，其包括形成多个微腔体的波状(例如正弦曲线形)表面。在一些实施方式中，烧瓶可填充有促进三维细胞培养物(例如细胞团、球体)的生长的材料(例如，培养基、固体、液体、气体)。例如，可向容器的细胞培养室添加包含悬浮在液体中的细胞的培养基。悬浮的细胞可被聚集在多个微腔体中并且可形成(例如，生长)为细胞组或细胞簇。这些细胞组或细胞簇为球体或类器官。
例如，在一些实施方式中，至少基于重力——所述重力造成悬浮在液体中的一个或多个细胞降落通过液体并沉积在每个微腔体中，在多个微腔体的每个微腔体中可形成单个球体。微腔体的形状(例如，限定孔穴的凹表面)，以及防止细胞粘附于表面的微腔体的表面涂层也可促进在每个微腔体中的三维细胞培养物的生长。也就是说，细胞形成球体并且受制于微腔体的尺寸而生长到某尺寸。在培养期间，球体可消耗培养基(例如，养料、营养物)并且产生作为副产物的代谢物(例如废物)。因此，在一些实施方式中，在培养期间可向细胞培养室添加养料培养基，并且在培养期间可从细胞培养室移除废培养基。当添加和移除培养基时可尝试避免使球体从微腔体移位，以及促进对球体进行期望的细胞培养。
相比于二维细胞培养物，在一些实施方式中，三维细胞培养物可产生多细胞结构，其在生理学上更精确，并且相比于实验室中的模拟条件更逼真地代表细胞可在实际生命应用中存在和生长的环境。例如，发现三维细胞培养物更接近地提供模拟“体内”(即，在活体内，在真实环境中)细胞生长的真实环境；而发现二维细胞培养物提供模拟“体外”(即，在玻璃中，在实验室环境中)细胞生长的环境，其不能那么好地代表实验室外发生的真实环境。通过与三维细胞培养物的相互作用以及观察其性质和行为，可实现关于以下方面的细胞理解的进步，例如，疾病和毒理学研究，药剂和治疗的功效，肿瘤特性、生物体、遗传学以及细胞和与细胞相关的其他科学、生物学和化学原理。
参考图1-15描述了示例性细胞培养容器100以及在示例性细胞培养容器100中培养细胞的方法的实施方式。例如，图1示意性例示了细胞培养容器100的侧视图，所述细胞培养容器100具有顶部101、底部108、端壁107、颈部112和开口或孔105，所述开口或孔105在图1中显示被盖子104覆盖。顶部101、底部108、端壁107和颈部各自具有内表面。也就是说，顶部101具有内表面201，底部具有内表面208，颈部112具有内表面212，端壁107具有内表面207。细胞培养室103是容器的内表面内侧包含的容器区域。在实施方式中，底部108的内表面208具有微腔体阵列115。
图2A和图2B是图1的圆圈“2”所示区域的示意图。图2A和2B例示了导致不均匀的细胞培养的对照容器。例如，如果在细胞培养室103中具有细胞可以沉降并且具有平坦表面202的的区域，则细胞250可聚集在平坦表面上而不是沉降在微腔体120中，并且细胞可形成不规则的细胞聚集团801。例如，如果在微腔体阵列的周围围绕有框架，在此处，包含微腔体阵列的基材附接于细胞培养室103的壁，并且所述框架是平坦的档，则当细胞掉落通过培养基并沉降在表面上时，细胞可沉降在平坦表面上而不是沉降到微腔体120中。图2A和图2B示意性示出了这些未被容纳的不规则细胞聚集团801的实例。这些细胞还可侵入附近的微腔体并破坏微腔体120中容纳的球体250的培养。相反，容纳在微腔体120中的细胞形成规则、均匀的球体250(例如参见图18B)。
图3A和3B是根据下文所述的实施例1的在具有平坦部分的细胞培养容器的这些平坦部分上形成的不规则细胞聚集团的照片。
回到图1，在一些实施方式中，容器100可包括盖子104，其被取向成覆盖孔105以密封和/或阻塞孔105，从而阻挡从容器100外侧经过孔105到达细胞培养室103中的路径。为了清楚起见，将盖子104移除，因此，在其他附图中未示出盖子104，但是应理解，在一些实施方式中，可提供盖子104并将其选择性地添加到容器100的孔105中或从中移除而不偏离本公开的范围。在一些实施方式中，盖子204可包括过滤器，其允许气体传递到容器100的细胞培养室103中和/或从中传递出。例如，在一些实施方式中，盖子104可包括透气性过滤器，其被取向成调节细胞培养室103中的气体压力，从而防止细胞培养室103相对于容器100外侧的环境(例如，大气)的压力而加压(例如，超压)。
如图4所示，以及如示出了沿着图4的线5-5的替代性截面图的图5所示，在一些实施方式中，细胞培养容器100可包括围绕微腔体阵列115的至少一部分的凸缘170。在图4和图5中，微腔体阵列115(也被称为“基材”)由单独的微腔体120(参见图6-8)构成。因此，除非另有说明，否则应理解，在实施方式中，基材115可包括微腔体120a、120b、120c(参见图6-8)的一个或多个特征。此外，在实施方式中，细胞培养容器100可包括围绕凸缘170的至少一部分的通道175。通道175具有开口176。如图5所示，在一些实施方式中，凸缘170可围绕微腔体阵列115中的所有微腔体。然而，在一些实施方式中，凸缘170可围绕所述多个微腔体120中的不到所有(例如，至少一部分的)的微腔体。同样地，在一些实施方式中，通道175的开口176可围绕整个凸缘170；但是在一些实施方式中，通道175的开口176可围绕凸缘170中的不到全部的凸缘170(例如，至少一部分的凸缘170)。也就是说，在一些实施方式中，通道175在一些区域中可以关闭。在一些实施方式中，凸缘170和/或通道175可作为细胞培养容器100的整体部件来形成(例如，制造)。或者，在一些实施方式中，凸缘170和/或通道175可作为可附接于细胞培养容器100的独立部件来提供，以例如改造现有的细胞培养容器，从而使现有的细胞培养容器具备本公开实施方式的凸缘170和通道175的一个或多个特征。在实施方式中，微腔体阵列115与容器的底部108的内表面208是一体的。如图4所示，微腔体阵列可以由插入件提供，所述插入件是引入到烧瓶中或固定到烧瓶中的独立材料。例如，具有微腔体阵列115的基材可被插入到细胞培养容器100中，并且可位于细胞培养容器的底表面上或是通过胶粘、激光焊接、超声焊接或某种其他方法固定于细胞培养容器的底表面。
图5是一些实施方式中的容器的俯视图。图5例示了在实施方式中，凸缘170围绕微腔体阵列115，并且通道175围绕凸缘170。
图6-8根据本公开的实施方式，显示了以图5的视图6获取的细胞培养容器的一部分的放大示意图，自上而下的透视图以及沿着图6的线7的截面透视图(图7和图8)，其示出了具有多个微腔体120的基材。如图6-8所示，在一些实施方式中，多个微腔体120中的每个微腔体120a、120b、120c可包括限定孔穴122a、122b、122c的凹表面121a、121b、121c(参见图7和图8)。此外，每个微腔体120a、120b、120c可包括开口123a、123b、123c(例如，在基材115的第一侧125中)，以允许液体和细胞进入微孔穴122a、122b、122c。如图7所示，在一些实施方式中，基材115的第一侧125可包括非线性(例如，波状、正弦曲线形)轮廓，并且基材115的第二侧126可包括平面(例如平坦)轮廓。类似地，如图8所示，在一些实施方式中，基材115的第一侧125和第二侧126均可包括非平面(例如，波状、正弦曲线形)轮廓。
在图7所示的基材115中，基材115的第一侧125包括非线性(例如，波状、正弦曲线形)轮廓且基材115的第二侧126包括平面(例如，平坦)轮廓，在图8所示的基材115中，基材115的第一侧125和第二侧126均包括非平面(例如，波状、正弦曲线形)轮廓，将图7所示的基材115与图8所示的基材115进行比较可知，在一些实施方式中，基材115的第一侧125和第二侧126均包括非平面(例如，波状、正弦曲线形)轮廓的基材115的厚度可得到减小。因此，在一些实施方式中，使基材115的第一侧125和第二侧126均具备非平面(例如，波状、正弦曲线形)轮廓(图8)可减少用于制造基材115的材料量，并且相比于例如基材115的第一侧125包括非线性(例如，波状、正弦曲线形)轮廓而基材115的第二侧126包括平面(例如，平坦)轮廓(图7)的具有微腔体阵列115的基材，其可提供具有微腔体阵列115并且所述微腔体阵列115包括壁更薄的微腔体120a、120b、120c的基材。在实施方式中，壁更薄的微腔体120a、120b、120c可以允许基材具有更高的气体传递率(例如，渗透性)，以在细胞培养期间将更多的气体提供到孔穴122a、122b、122c中以及使更多气体从孔穴122a、122b、122c中出来。因此，在一些实施方式中，使基材115的第一侧125和第二侧126均具有非平面(例如，波状、正弦曲线形)轮廓(图8)可提供更加健康的细胞培养环境，从而改进细胞在微腔体120a、120b、120c中的培养。
在一些实施方式中，基材115可包含聚合材料，包括但不限于聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚苯乙烯共聚物、含氟聚合物、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯丁二烯共聚物、完全氢化的苯乙烯类聚合物、聚碳酸酯PDMS共聚物和聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚丙烯共聚物和环烯烃共聚物。另外，在一些实施方式中，由凹表面121a、121b、121c限定的孔穴122a、122b、122c的至少一部分可涂覆有超低结合性材料，从而使所述孔穴122a、122b、122c的至少一部分对细胞无粘附性。例如，在一些实施方式中，可向由凹表面121a、121b、121c限定的孔穴122a、122b、122c的至少一部分施涂以下中的一种或多种：全氟聚合物，烯烃，琼脂糖，非离子性水凝胶，例如聚丙烯酰胺，聚醚，例如聚环氧乙烷，多元醇，例如聚乙烯醇，或者它们的混合物。
另外，在一些实施方式中，所述多个微腔体120中的每个微腔体120a、120b、120c可包括各种特征及这些特征的变化形式而不偏离本公开的范围。例如，在一些实施方式中，所述多个微腔体120可被布置成阵列，包括线性阵列(如图所示)、对角阵列、矩形阵列、圆形阵列、径向阵列、六角密堆布置等。此外，在一些实施方式中，开口123a、123b、123c可包含各种形状。在一些实施方式中，开口123a、123b、123c可包括圆形、椭圆形、矩形、四边形、六边形及其他多边形形状中的一种或多种。此外，在一些实施方式中，开口123a、123b、123c可包括约100微米(μm)至约5000μm的尺寸(例如，直径、宽度、正方形或矩形的对角线等)。例如，在一些实施方式中，开口123a、123b、123c可包括以下尺寸：100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm、1500μm、2000μm、2500μm、3000μm、3500μm、4000μm、4500μm、5000μm，以及在约100μm至约5000μm的范围中涵盖的任何尺寸或尺寸范围。
在一些实施方式中，由凹表面121a、121b、121c限定的孔穴122a、122b、122c可包括各种形状。在一些实施方式中，由凹表面121a、121b、121c限定的孔穴122a、122b、122c可包括圆形、椭圆形、抛物线形、双曲线形、人字形、倾斜的或其他截面轮廓形状中的一种或多种形状。此外，在一些实施方式中，孔穴122a、122b、122c的深度(例如，从由开口123a、123b、123c限定的平面到凹表面121a、121b、121c的深度)可包括约100微米(μm)至约5000μm的尺寸。例如，在一些实施方式中，孔穴122a、122b、122c的深度可包括以下尺寸：100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm、1500μm、2000μm、2500μm、3000μm、3500μm、4000μm、4500μm、5000μm，在约100μm至约5000μm的范围中涵盖的任何尺寸或尺寸范围。
在一些实施方式中，可在多个微腔体120中的至少一个微腔体120a、120b、120c中培养的三维细胞150(例如，球体、类器官150a、150b、150c)可包括约50μm至约5000μm的尺寸(例如直径)，以及在约50μm至约5000μm范围内涵盖的任何尺寸或尺寸范围。在一些实施方式中，可提供比所公开的确切尺寸更大或更小的尺寸，因此，除非另有说明，否则比所公开的确切尺寸更大或更小的尺寸被认为是在本公开的范围内。例如，在一些实施方式中，开口123a、123b、123c的一种或多种尺寸，孔穴122a、122b、122c的深度，以及三维细胞150(例如球体150a、150b、150c)的尺寸可以比所公开的确切尺寸更大或更小而不偏离本公开的范围。
图9示出了在图4的区域“9”处的细胞培养容器100的放大图，其包括凸缘170和通道175的示例性部分。例如，在一些实施方式中，凸缘170可包括内面171，其在远离多个微腔体120中的每个微腔体120a、120b、120c的凹表面121a、121b、121c(参见图6-8)的方向上从基材115延伸到通道175的开口176的周界173。回到图5，在一些实施方式中，内面171可围绕所述多个微腔体120中的所有微腔体；但是在一些实施方式中，内面171可围绕所述多个微腔体120中的不到所有的微腔体(例如，至少一部分的微腔体)。同样地，在一些实施方式中，通道175的开口176可围绕整个内面171；但是在一些实施方式中，通道175的开口176可围绕不到全部(例如，至少一部分)的内面171。
如图9所示，在一些实施方式中，通道175的开口176的周界173在远离多个微腔体120中的每个微腔体120a、120b、120c的凹表面121a、121b、121c(参见图6-8)的方向上可与基材115的部分123间隔距离“d8”。在一些实施方式中，距离“d8”可在约2毫米(mm)至约8mm的范围内，例如，约4mm至约8mm，但是在另一些实施方式中可提供其他数值(例如，小于2mm或大于8mm)而不会偏离本公开的范围。此外，在一些实施方式中，通道175的开口176的周界173在朝向基材115的部分123的方向上可与壁101的内表面102间隔距离“d9”。因此，在一些实施方式中，通道175的开口176可被限定在端壁107的内表面207与周界173之间。在一些实施方式中，通道175可包括外面172，其在朝向多个微腔体120中的每个微腔体120a、120b、120c的凹表面121a、121b、121c(参见图6-8)的方向上，从通道175的开口176的周界173延伸到通道175的基底174。如图5所示，在一些实施方式中，外面172可围绕所述多个微腔体120中的所有微腔体；但是在一些实施方式中，外面172可围绕所述多个微腔体120中的不到所有的微腔体(例如，至少一部分的微腔体)。同样地，在一些实施方式中，通道175的基底174可围绕整个外面172；但是在一些实施方式中，通道175的基底174可围绕不到全部(例如，至少一部分)的外面172。
现将参考图10-17描述在包括凸缘170和通道175的细胞培养容器100中培养细胞的方法。例如，如图10所示，在一些实施方式中，所述方法可包括：在细胞培养室103的区域142中容纳预定量的液体180，并且所述预定量的液体180中的液体不接触通道175。在一些实施方式中，区域142可至少部分基于凸缘170和基材115来限定。例如，在一些实施方式中，区域142可至少部分基于凸缘170的内面171和基材115的部分123来限定。在一些实施方式中，在所述方法的这一阶段，防止预定量的液体180中的液体接触通道175可提供多个优点，例如，其促进改进了细胞150的培养。例如，在一些实施方式中，至少一部分的预定量的液体180可包括培养溶液或者培养基，其包括含有悬浮在液体中的固体颗粒(例如细胞)的液体。因此，在一些实施方式中，所述方法可包括：在多个微腔体120的至少一个微腔体120a、120b、120c中沉积预定量的液体180中的液体140(参见图10)，以及在所述至少一个微腔体120a、120b、120c中沉积液体140后，在至少一个微腔体120a、120b、120c中培养细胞150(例如，球体150a、球体150b、球体150c)。仅出于例示的目的，从图10-17中省略了包括多个微腔体120的微腔体阵列115的结构，并且应理解，除非另有说明，否则在一些实施方式中，基材115(参见图6-8)的一个或多个特征可单独来提供或与第一示例性细胞培养容器100的一个或多个特征组合来提供而不会偏离本公开的范围。
回到图9，在一些实施方式中，凸缘170的内面171可包括垂直取向(例如，基本上在重力的方向上延伸)；然而，在一些实施方式中，内面171可相对于重力方向倾斜，以例如将细胞引导向微腔体120a、120b、120c的开口123a、123b、123c(参见图6-8)。另外，在一些实施方式中，例如，微腔体120a的开口123a可邻接凸缘170的内面171定位。例如，在一些实施方式中，微腔体120a的开口123a可与凸缘170的内面171齐平，使得悬浮在液体中的细胞将掉落(例如，至少基于重力)和/或通过内面171被引导到微腔体120a的储器122a中而不会沉降或粘附在容器100的表面上，包括但不限于通道175的基底174上。
在一些实施方式中，沉降或粘附在容器100的表面(包括但不限于通道175的基底174)上的细胞可在微腔体120a、120b、120c之外积聚并生长(例如，繁殖)，从而引起与在微腔体120a、120b、120c内进行期望的三维细胞生长有关的问题。例如，在一些实施方式中，未掉落(至少基于重力)到储器122a、122b、122c中并且积聚或粘附于容器100的其他表面(包括但不限于通道175的基底174)的细胞可在储器122a、122b、122c之外生长，并且破坏(例如，阻碍、改变、减慢或阻止)储器122a、122b、122c内的三维细胞的期望的生长。类似地，在一些实施方式中，积聚或粘附于容器100的其他表面(包括但不限于通道175的基底174)的细胞可生长并且将储器122a、122b、122c中的三维细胞移出，从而破坏或毁坏在储器122a、122b、122c内的三维细胞的期望的生长并且改变细胞的期望的尺寸均匀性。因此，在一些实施方式中，通过在细胞培养室103的区域142中容纳预定量的液体180并且所述预定量的液体180中的液体不接触通道175，悬浮在液体中的所有细胞均可被引导到储器122a、122b、122c中，因此减少并消除了如果细胞粘附于储器122a、122b、122c之外的容器100的表面(包括但不限于通道175的基底174)而可能发生的问题。
因此，在一些实施方式中，所述方法可包括：使预定量的液体180中的液体140沉积在被凸缘170围绕的微腔体阵列115上(参见图10)。由此，沉积在微腔体阵列115中的多个微腔体120的至少一个微腔体120a、120b、120c上，以及在使液体140沉积在微腔体阵列115上之后，在所述至少一个微腔体120a、120b、120c中培养细胞150(例如，球体150a、150b、150c，示于图7和8)。另外，在一些实施方式中，在培养期间，球体150a、150b、150c可消耗培养基(例如，养料、营养物)并且产生作为副产物的代谢物(例如废物)。因此，在一些实施方式中，在培养期间可向细胞培养室103添加养料培养基，并且在培养期间可从细胞培养室103移除废培养基。如下文更完整论述的，在一些实施方式中，当添加和移除培养基时可尝试避免使球体150a、150b、150c从微腔体120a、120b、120c移位，以及促进对球体150a、150b、150c进行期望的细胞培养。
另外，在一些实施方式中，对于基材115的单位面积(例如，提供可在其上培养一个或多个细胞的相应表面的单位面积)，相比于例如相当的二维细胞培养，三维细胞培养可消耗更多的培养基(例如，养料、营养物)并且产生更多的作为副产物的培养基(例如，废物)。因此，在一些实施方式中，例如，相比于相当的二维细胞培养，对于相当的时间，根据本公开实施方式所述的三维细胞培养可包括更频繁的培养基交换(例如，加入养料、营养物和/或移除废物)。附加或替代性地，在一些实施方式中，例如，相比于相当的二维细胞培养，对于相当的时间，根据本公开实施方式所述的三维细胞培养可包括更大的培养基体积(例如，消耗更多养料、营养物和/或产生更多废物)。因此，在一些实施方式中，如下文更完整论述的，细胞培养容器100以及在细胞培养容器100中培养细胞150的方法的一个或多个特征可提供关于在容器100的细胞培养室103中可容纳的培养基体积，可向细胞培养室103添加的培养基体积，和可从细胞培养室103移除的培养基体积中的一项或多项以及培养基更换的频率的优点，从而提供在其中培养三维细胞的有利、有效的环境。
例如，如图11所示，在一些实施方式中，所述方法可包括：通过将分配端口181插入到孔105中，以及将材料182从分配端口分配到通道175的开口176中，而将材料(例如，养料、营养物)从容器100外侧添加到细胞培养室103中。此外，在一些实施方式中，所述方法可包括：在细胞培养室103的区域142中容纳有预定量的液体180并且所述预定量的液体180中的液体不接触通道175之后，通过将分配端口181插入到孔105中，以及将材料182从分配端口分配到通道175的开口176中，来将材料(例如，养料、营养物)从容器100外侧添加到细胞培养室103中。因此，在一些实施方式中，所述方法可包括：在将材料182从分配端口181分配到通道175的开口176中时，在所述至少一个微腔体120中培养细胞150。
图12示意性示出了向细胞培养室103中添加材料182，以例如向预定量的液体180中包含的细胞150提供养料培养基，在进行培养时，细胞150可消耗所述养料培养基。同样地，如图12所示，在一些实施方式中，所述方法可包括：通过将收集端口183插入到孔105中以及利用收集端口183从通道175收集材料184，将材料(例如废物)从细胞培养室103移除到容器100之外。此外，在一些实施方式中，所述方法可包括：在将材料(例如养料、营养物)添加到细胞培养室103中之后，通过将收集端口183插入到孔105中以及利用收集端口183从通道175收集材料184，从细胞培养室103移除材料(例如废物)。因此，在一些实施方式中，所述方法可包括：在利用收集端口183从通道175收集材料184时，在所述多个微腔体120(参见图7和8)的至少一个微腔体中培养细胞150。
图13示意性示出了从细胞培养室103中移除材料184，以例如从预定量的液体180和材料182中移除废培养基，在进行培养时，细胞150可产生所述废培养基。例如，在一些实施方式中，在培养期间，细胞150可消耗添加到细胞培养室103中的所有或一些养料培养基(例如材料182)，并且产生(例如，作为副产物代谢)从细胞培养室103移除的所有或一些废培养基(例如，材料184)。在一些实施方式中，在培养细胞150时，向细胞培养室103添加养料培养基182(参见图11和图12)以及从细胞培养室103移除废培养基184(参见图12和图13)的方法可提供在其中可培养细胞150的健康环境。例如，在一些实施方式中，相比于不添加养料培养基或不移除废培养基的细胞培养环境，本公开实施方式的向细胞培养室103添加养料培养基182(参见图11和图12)以及从细胞培养室103移除废培养基184(参见图12和图13)的方法至少可部分提高细胞培养过程的质量、持续时间和有效性中的一项或多项。同样地，在一些实施方式中，相比于例如不包括本公开的一个或多个特征的细胞培养容器以及不包括本公开的一个或多个步骤的方法，容器100的一个或多个特征和本公开实施方式的向细胞培养室103添加养料培养基182(参见图11和图12)以及从细胞培养室103移除废培养基184(参见图12和图13)的方法至少部分可更频繁地进行，并且对于细胞培养过程期间容器100的细胞培养室103中可容纳的培养基体积，向细胞培养室103添加的培养基体积以及从细胞培养室103移除的培养基体积中的一项或多项可更加有效。
此外，在一些实施方式中，所述方法可包括移动容器100以及利用收集端口183从通道175收集材料184。例如，在一些实施方式中，移动容器100可包括：平移容器100和/或将容器100从第一取向(例如，图13提供的取向)旋转到第二取向(例如，图14提供的取向)。在一些实施方式中，第一取向(例如，图13提供的取向)可使容器100具备相对于重力“g”的方向基本上垂直延伸的轴线110，但是在另一些实施方式中，可提供轴线110相对于重力“g”的方向的其他取向来限定第一取向。同样地，在一些实施方式中，第二取向(例如，图14提供的取向)可使容器100具备以相对于重力“g”的方向基本上不垂直的角度延伸的轴线110，但是在另一些实施方式中，可提供轴线110相对于重力“g”的方向的其他取向来限定第二取向。
在一些实施方式中，第一取向可提供相对于重力“g”的方向成第一角度的轴线110，所述第一角度与由第二取向提供的轴线110相对于重力“g”的方向的第二角度不相同。另外，在一些实施方式中，在进行将预定量的液体180容纳在细胞培养室103的区域142中(参见图10)，向细胞培养室103添加材料182(参见图11)，以及从细胞培养室103移除材料184(参见图12和图13)中的一项或多项时，容器100的轴线110可基本上垂直于重力“g”的方向延伸。例如，在一些实施方式中，容器100可以被放置在例如水平表面上(未示出)，所述水平表面限定了垂直于重力“g”的方向的主表面，并且容器100的轴线110相对于重力“g”的方向基本上平行于水平表面(未示出)的主表面延伸。附加或替代性地，在一些实施方式中，容器100可由一种或多种结构(例如，框架、底座、人手等)支承(例如，握住、悬挂)并且轴线110基本上在垂直于重力“g”的方向上延伸。同样地，在一些实施方式中，容器100可由一种或多种结构(例如，框架、底座、人手等)支承(例如，握住、悬挂)，并且由于例如在用收集端口183从通道175收集材料184之前和/或期间移动容器100(参见图14)，因此轴线110以相对于重量“g”的方向基本上不垂直的角度延伸。
因此，如图14示意性所示，在一些实施方式中，所述方法可包括：移动容器100以造成至少一部分的预定量液体180和添加的材料182(包括废材料184)从区域142流过凸缘170(例如，流过通道175的开口176的周界173)并且沉积在通道175中。例如，在一些实施方式中，在用收集端口183从通道175收集材料184(参见图13)时，至少一部分的预定量液体180和添加的材料182(包括废材料184)可以保留在细胞培养室103的区域142中，这至少部分是基于容器100的取向和凸缘170的存在，所述凸缘170防止了区域142中的至少一部分的预定量液体180和添加的材料182(包括废材料184)流到通道175中。因此，在一些实施方式中，通过移动容器100以造成至少一部分的预定量液体180和添加的材料182(包括废材料184)从区域142流过凸缘170并且沉积在通道175中，可控制废材料184的移除，并且在一些实施方式中，相对于例如不移动容器100的方法，可增加废材料184的移除。在一些实施方式中，可对由容器100的第二取向所限定的轴线110相对于重力“g”的方向的角度进行选择，以例如引起至少一部分的预定量液体180和添加的材料182(包括废材料184)从区域142流过凸缘170并且沉积在通道175中，而不会造成在多个微腔体120中培养的细胞150移除，从而改进细胞培养过程。
因此，在一些实施方式中，相比于其他方法，包括但不限于不移动容器100(例如保持静止)的方法，根据本公开的实施方式移动容器100以造成至少一部分的预定量液体180和添加的材料182(包括废材料184)从区域142流过凸缘170并且沉积在通道175中，以及利用收集端口183从通道175收集材料184可从细胞培养室103移除所有或者至少更大量的废材料184。在一些实施方式中，在用收集端口183从通道175收集材料184时，容器100的轴线110的取向(例如，相对于重力“g”的方向的取向)在一段持续时间期间可保持不变。或者，在一些实施方式中，在用收集端口183从通道175收集材料184时，容器100的轴线110的取向(例如，相对于重力“g”的方向的取向)在一段持续时间期间可改变一次或多次。
此外，如图15所示，在一些实施方式中，所述方法可包括：在从细胞培养室103移除材料184(例如废物)(参见图12-14)之后，通过将分配端口181插入到孔105中并将材料185从分配端口分配到通道175的开口176中，而将材料(例如，养料、营养物)添加到细胞培养室103中。例如，图15示意性示出了在用收集端口183从通道175收集材料184之后(参见图69)以及移动容器100以造成至少一部分的预定量液体180和添加的材料182(包括废材料184)从区域142流过凸缘170并沉积在通道175中(参见图14)之后，从细胞培养室103移除的废材料184。在一些实施方式中，添加的材料185例如可向细胞培养环境补充细胞150已经消耗和/或耗尽的养料和营养物。因此，在一些实施方式中，根据例如在容器100中进行细胞培养的类型，材料182和材料185可包括相同或相似的组成或不同的组成。另外，在一些实施方式中，在培养细胞150时，由于球体150a,150b,150c在细胞培养过程期间不断(例如反复)消耗培养基(例如养料、营养物)和/或产生作为副产物的代谢物(例如废物)，添加材料182(例如养料、营养物)(参见图11和图12)，移除材料184(例如废物)(参见图12-14)和添加更多的材料185(例如养料、营养物)(参见图15)的方法可选择性地进行一次或多次。
在一些实施方式中，当添加和移除培养基(参见图11-15)时，凸缘170和通道175的一个或多个特征可提供优点，以避免球体150a、150b、150c从微腔体120a、120b、120c移位，以及促进对球体150a、150b、150c(参见图7和图8)进行期望的细胞培养。例如，图16例示了以图15的视图16获取的细胞培养容器100的一部分的放大示意图，其包括通过将分配端口181插入到孔105中，以及将材料185从分配端口181分配到通道175的开口176中，而将材料185(例如，养料、营养物)添加到细胞培养室103中的方法。类似地，图73例示了以图68的视图73获取的细胞培养容器100的一部分的放大示意图，其包括通过将收集端口183插入到孔105中，以及利用收集端口183从通道175收集材料184，而从细胞培养室103移除材料184(例如，废物)的方法。
如图16所示，在一些实施方式中，通过将分配端口181插入到孔105中并将材料185从分配端口分配到通道175的开口176中而将材料185(例如，养料、营养物)添加到细胞培养室103中的方法可包括阻挡材料185沿着第一流动路径185a、185b流动。例如，在一些实施方式中，阻挡沿着第一流动路径185a、185b的流动可包括：使用凸缘170使沿着第一流动路径185a、185b的流动转向。在一些实施方式中，使用凸缘170使沿着第一流动路径185a,185b的流动转向可包括，例如，沿着第一流动路径185a用材料185填充通道175，然后材料185沿着第一流动路径185b从通道175流到细胞培养室103的区域142中。例如，在一些实施方式中，材料185可从分配端口181被分配到通道175的开口176中，以沿着第一流动路径185a用材料185逐渐填充通道175，所述第一流动路径185a是沿着通道175的外面172从通道175的基底174到通道175的开口176的周界173。此外，在一些实施方式中，一旦用材料185填充通道175，则材料185可接着沿着第一流动路径185b流过通道175的开口176的周界173而进入到细胞培养室103的区域142中。
因此，在一些实施方式中，在将材料185从分配端口181分配到通道175的开口176中时，至少一部分的区域142(至少部分由凸缘170的内面171和基材115的部分123限定)以及至少一部分的细胞培养室103可逐渐填充有材料185。虽然是关于向细胞培养室103添加材料185来进行描述的，但应理解，除非另有说明，否则，在将材料182从分配端口181分配到通道175的开口176中(如图11所示)时，至少一部分的区域142(至少部分由凸缘170的内面171和基材115的部分123限定)以及至少一部分的细胞培养室103可逐渐填充有材料182。
同样地，如图17所示，在一些实施方式中，通过将收集端口183插入到孔105中以及利用收集端口183从通道175收集材料184而从细胞培养室103移除材料(例如废物)的方法可包括：沿着第二流动路径184a、184b阻挡材料184的流动。例如，在一些实施方式中，阻挡沿着第二流动路径184a、184b的流动可包括：使用凸缘170使沿着第二流动路径184a、184b的流动转向。在一些实施方式中，使用凸缘170使沿着第二流动路径184a、184b的流动转向可包括，例如，在材料184沿着第二流动路径184b流动时，沿着第二流动路径184a从通道175移除材料184。在一些实施方式中，第二流动路径184b可从细胞培养室103的区域142延伸到通道175中。附加或替代性地，至少部分基于例如细胞培养室103中容纳的材料180、182、184的体积，在一些实施方式中，第二流动路径184b可从细胞培养室103(例如，区域142外侧)延伸到通道175中。
因此，在一些实施方式中，可用收集端口183从通道175收集材料184，以沿着第二流动路径184a、184b从通道175逐渐移除材料184。此外，在一些实施方式中，例如，在移动容器100以造成至少一部分的预定量液体180和添加的材料182(包括废材料184)从区域142流过凸缘170并且沉积在通道175中(参见图14)之后，可利用收集端口183从通道175收集材料184，从而沿着第二流动路径184a、184b从通道175逐渐移除材料184。例如，可沿着第二流动路径184a从通道175逐渐移除材料184，所述第二流动路径184a沿着通道175的外面172从通道175的开口176的周界173到通道175的基底174。因此，在一些实施方式中，在用收集端口183从通道175收集材料184时，可从至少一部分的细胞培养室103以及从至少一部分的区域142(其至少部分由凸缘170的内面171和基材115的部分123限定)逐渐移除材料184。
在一些实施方式中，在多个微腔体120的至少一个微腔体120a、120b、120c中培养细胞150时，用凸缘170阻挡材料185沿着第一流动路径185a、185b流动以及用凸缘170阻挡材料184沿着第二流动路径184a、184b流动可分别将材料添加到或移除出容器100的细胞培养室103，而不会例如干扰细胞150的培养。例如，如图72所示，在一些实施方式中，通过使材料185沿着第一流动路径185a、185b以某速度从分配端口181流动(例如，分配、吹动、吸入)到通道175中，分配端口181可将材料185加入到细胞培养室103中，从而在通道175中及周围建立正压力。同样地，如图73所示，在一些实施方式中，通过使材料沿着第二流动路径184a、184b以某速度从通道175流动(例如，收集、吸取)到收集端口183中，收集端口183可从细胞培养室103移除材料184，从而在通道175中及周围建立负压力。因此，在一些实施方式中，凸缘170可减慢材料185,184分别沿着第一流动路径185a、185b和第二流动路径184a、184b的流动的速度，从而相应地降低在通道175中及周围的正压力和负压力。
例如，在一些实施方式中，相比于例如不包括凸缘170和通道175的一个或多个特征的方法或细胞培养容器，通过将分配端口181插入到孔105中并将材料185从分配端口分配到通道175的开口176中(参见图16)而将材料(例如养料、营养物)添加到细胞培养室103中的方法可使材料185缓慢、连续并受控(例如非湍流)地流动到细胞培养室103中。同样地，在一些实施方式中，相比于例如不包括凸缘170和通道175的一个或多个特征的方法或细胞培养容器，通过将收集端口183插入到孔105中并从通道175收集材料184(参见图17)而从细胞培养室103移除材料(例如废物)的方法可使材料184缓慢、连续并受控(例如非湍流)地从细胞培养室103流出。在一些实施方式中，通过降低材料185、184分别沿着第一流动路径185a、185b和第二流动路径184a、184b流动的速度，凸缘170和通道175可因此防止在多个微腔体115的至少一个微腔体120a、120b、120c中培养的细胞150移出。例如，在一些实施方式中，如果材料的流动使得一个或多个细胞150移出，则一个或多个微腔体120a、120b、120c可包含不止一个球体或者不包含球体。因此，在一些实施方式中，通过提供缓慢、连续和受控(例如非湍流)的材料流动，至少部分基于凸缘170和通道175的一个或多个特征，根据本公开的方法和实施方式，可降低在容器中培养的细胞150移出的可能性，并且可获得质量更好的细胞培养物以及与细胞培养相关的更精确的科学结果。
实施例1：细胞生长
将结肠癌细胞系HCT116在烧瓶中在完全McCoy's 5a培养基(10％胎牛血清以及10单位/mL青霉素/10ug/mL链霉素)中生长至～80％融合度，以及进行胰蛋白酶处理以将细胞从表面剥离。然后对细胞进行计数并将其以1000个细胞/微腔体的最终细胞浓度重新悬浮在完全McCoy’s培养基中(对于T-75微腔体烧瓶，以～6.5x10^5个细胞/mL的最终浓度添加15mL的细胞)。将微腔体烧瓶放置在室温下以使细胞沉降到微腔体烧瓶的表面中。室温孵育后，将烧瓶放置到具有5％CO2和95％相对湿度的37℃孵育箱中并保持实验的持续时间。在第一个24小时内发生球体形成。
对照烧瓶：将HTC116细胞接种到T75烧瓶中，所述T75烧瓶通过切掉烧瓶的底表面并将具有微腔体阵列的材料固定于烧瓶的底部来制备。由于烧瓶被切掉，因此围绕烧瓶底表面的内周围保留材料的“唇缘”。在对照容器中培养期间，存在该围绕微腔体阵列的周围的平坦表面。
实验烧瓶：还是将HTC116细胞接种到具有例如图4和5所示的凸缘和通道结构的T75烧瓶中。
在将具有悬浮细胞的培养基添加到内部区域中之后，使烧瓶在室温下，在静态条件下保持15分钟以使细胞沉降到微孔穴中。在细胞培养生物学实验室中利用该15分钟孵育步骤来确保均匀的细胞接种以及在随后将容器放置到孵育室中后最大程度地减少边缘效应。在细胞沉降到微腔体中之后，接着向烧瓶添加额外量的细胞培养基。在对照烧瓶中，用移液管将培养基添加到烧瓶的底表面的中心。在实验烧瓶中，例如，如图16所示添加培养基。然后将烧瓶放置到细胞培养孵育箱中并培养14天。在该培养期间，共进行7次培养基更换，并且具有90％的培养基更换效率。
图18A是在对照T75烧瓶中生长的球体的照片。球体不规则并且在一些微腔体中缺失球体(可能在培养基更换期间被移出了)。另外，在对照烧瓶中观察到不规则的细胞聚集团，如图3A和3B所示的细胞聚集团。图18B是示出了在14天培养后，在实验烧瓶中的球体的照片。球体看起来尺寸相似并且所有的孔穴均填充有球体。图18B证明了在培养基更换的情况中，根据实验设计组装的烧瓶中有100％的球体保留。
在培养14天后，从对照烧瓶(图19A和19B)和例如图4的实验烧瓶(图19C和图19D)收获球体。图19A、19B、19C和19D是收获的细胞的照片。如在图19A中见到的，在细胞培养区域中具有平坦表面的容器中，细胞形成了细胞“绳”(参见白色箭头)。在图19B中可见到其他不规则的细胞聚集团。相反，在根据图4的实验烧瓶中生长的球体是规则且均匀的，如图19C和图19D所示。
在实施方式中，本公开在第1方面中提供了一种细胞培养容器，其具有顶部、底部、侧壁和颈缩开口；在容器底部上的包括多个微腔体的基材，所述多个微腔体中的每个微腔体包括孔穴开口和凹形孔穴底部；围绕基材的外周界的成角度的凸缘，其中，所述凸缘具有毗邻基材的内面以及与基材相背的外面。
本文公开了细胞培养容器和培养细胞的方法的多个方面。下文是一些选定方面的概述。
在第2方面中，本公开提供了如方面1所述的细胞培养容器，其中，所述基材固定于容器的底部。
在第3方面中，本公开提供了如方面1所述的细胞培养容器，其中，所述基材与容器的底表面是一体的。
在第4方面中，本公开提供了如方面1所述的细胞培养容器，其中，所述基材与容器的底表面是一体的。
在第4方面中，本公开提供了如方面1所述的细胞培养容器，其中，所述凸缘的外面是成角度的。
在第5方面中，本公开提供了如方面2所述的细胞培养容器，其中，所述凸缘的外面是成角度的。
在第6方面中，本公开提供了如方面3所述的细胞培养容器，其中，所述凸缘的外面是成角度的。
在第7方面中，本公开提供了如方面1所述的细胞培养容器，其还包括通道，所述通道围绕成角度的凸缘的外周界，从而在凸缘的外侧上围绕基材形成壕沟。
在第8方面中，本公开提供了如方面2所述的细胞培养容器，其还包括通道，所述通道围绕成角度的凸缘的外周界，从而在凸缘的外侧上围绕基材形成壕沟。
在第9方面中，本公开提供了如方面3所述的细胞培养容器，其还包括通道，所述通道围绕成角度的凸缘的外周界，从而在凸缘的外侧上围绕基材形成壕沟。
在第10方面中，本公开提供了如方面4所述的细胞培养容器，其还包括通道，所述通道围绕成角度的凸缘的外周界，从而在凸缘的外侧上围绕基材形成壕沟。
在第11方面中，本公开提供了如方面5所述的细胞培养容器，其还包括通道，所述通道围绕成角度的凸缘的外周界，从而在凸缘的外侧上围绕基材形成壕沟。
在第12方面中，本公开提供了如方面6所述的细胞培养容器，其还包括通道，所述通道围绕成角度的凸缘的外周界，从而在凸缘的外侧上围绕基材形成壕沟。
在第13方面中，本公开提供了在如方面1所述的细胞培养容器中培养细胞的方法，其包括：使液体沉积到细胞培养容器中并且在凸缘的颈部侧上；用液体填充容器直到液体溢出凸缘到包括多个微腔体的基材上；在所述多个微腔体中培养细胞。
在第14方面中，本公开提供了如方面13所述的方法，其还包括：在培养后，倾斜细胞培养容器以使细胞液体积聚在通道中；将收集端口插入到容器的孔中并使用收集端口从通道移除液体。
在本公开中，术语“材料”、“液体”和“气体”可用于描述当例如在细胞培养容器中培养细胞时，所用材料的性质。除非另有说明，否则出于本公开的目的，“材料”可包括流体材料(例如，液体或气体)。另外，材料可包括培养溶液或者培养基，其包括含有悬浮在液体中的固体颗粒(例如细胞)的液体。除非另有说明，否则出于本公开的目的，“液体”可包括清洁或清洗溶液、水溶液、或可添加到容器中或从容器中移除的其他液体，例如，用于清洁细胞培养室，对基材和容器的一个或多个特征进行灭菌，为细胞生长准备底物，以及液体的其他用途。另外，液体可包括培养溶液或者培养基，其包括含有悬浮在液体中的固体颗粒(例如细胞)的液体。除非另有说明，否则出于本公开的目的，“气体”可包括空气、经过滤或处理的空气或其他气体。
在本公开中，术语“非渗透性”、“透气性”和“多孔”可用于描述基材的一个或多个特征的性质(例如，材料性质、特性、参数)。
除非另有说明，否则出于本公开的目的，“非渗透性”基材(例如，非渗透性基材材料)被认为是在正常条件下(例如，无外界影响，包括但不限于压力和力)对固体、液体和气体不可渗透，因此，其不允许固体、液体或气体在正常条件下进入、通过或离开非渗透性基材。在一些实施方式中，非渗透性基材可形成容器壁的一部分。另外，当非渗透性基材形成容器壁的一部分时，容器的细胞培养室被认为是无菌的，这是因为，例如细菌不能通过非渗透性基材。然而，当用材料填充基材的多个微腔体时，基于液体的表面张力，气体可被困在非渗透性基材的微腔体中，在一些实施方式中，由此阻止材料填充微腔体并且阻止球体的生长。
除非另有说明，否则出于本公开的目的，“透气性”基材(例如，透气性基材材料)被认为在正常条件下对固体和液体不可渗透，而对气体可渗透。因此，透气性基材不允许固体和液体进入、通过或离开透气性基材，但允许气体进入、通过或离开透气性基材。在一些实施方式中，透气性基材可形成容器壁的一部分。另外，当透气性基材形成容器壁的一部分时，容器的细胞培养室被认为是无菌的，这是因为，例如细菌不能合理地通过透气性基材。然而，虽然基材是透气性的，但是在用材料填充期间，气体仍可被困在微腔体中，这是因为在普通操作条件下，通过透气性基材的气体渗透速率比从微腔体转换气体所需的速度慢，并因此可消耗不可接受的长时间来渗透通过基材。因此，在一些实施方式中，缓慢填充微腔体允许液体前沿以某角度进入每个微腔体，由此在液体填充微腔体时，置换气体。在一些实施方式中，在用液体填充腔体后，气体可渗透(缓慢)通过透气性基材。
除非另有说明，否则出于本公开的目的，“多孔”基材(例如，多孔基材材料)被认为在正常条件下对固体不可渗透，而对液体和气体可渗透。因此，多孔基材不允许固体进入、通过或离开多孔基材，而是允许液体和气体进入、通过或离开多孔基材。多孔基材不能形成容器的一部分，因为细菌可通过多孔基材，因此导致细胞培养室中的无菌性问题。因此，当使用多孔基材时，基材需被包封(完全包封)在容器的无菌细胞培养室中。然而，在用材料填充微腔体期间，气体可通过多孔基材逸出(例如穿过)。因此，可迅速进行微腔体的填充而不会有气体被困在微腔体中的担忧。在一些实施方式中，液体只能在压力增加或物理接触及干扰基材的情况下通过多孔基材。因此，在一些实施方式中，只要基材不暴露于加压或物理接触和干扰的情况中，包含液体的材料可被包含在基材的微腔体中。例如，在一些实施方式中，可将多孔基材支承在细胞培养室中以在填充期间以及培养期间允许气体通过基材，并且使基材与加压或物理接触及被外力干扰(例如，在细胞培养室之外的)隔离。
应理解，各个公开的实施方式可以涉及与特定实施方式一起描述的特定特征、要素或步骤。还应理解，虽然以涉及一个特定实施方式的形式进行描述，但是特定特征、要素或步骤可以与各个未例示的组合或排列方式中的替代性实施方式互换或组合。
应理解的是，本文所用术语“该”、“一个”或“一种”表示“至少一个(一种)”，而不应局限为“仅一个(一种)”，除非有明确相反的说明。因此，例如，提到的“一个部件”包括具有两个或更多个这类部件的实施方式，除非上下文有另外明确的表示。
在本文中，范围可以表述为自“约”某一具体值始和/或至“约”另一具体值止。当表述这种范围时，实施方式包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当使用先行词“约”表示数值为近似值时，应理解，具体数值构成了另一个方面。还应理解，每个范围的端点在与另一个端点有关及独立于另一个端点时都是重要的。
除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任意方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。
虽然使用连接词“包含”可以公开特定实施方式的各个特征、元素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用连接词“由……构成”或“基本上由……构成”描述在内的替代性实施方式。因此，例如，包括A+B+C的设备的暗示替代实施方式包括其中设备由A+B+C组成的实施方式以及其中设备基本上由A+B+C组成的实施方式。
对本领域的技术人员而言，显而易见的是，可以对本公开进行各种修改和变动而不偏离本公开的范围和精神。因此，本公开旨在涵盖对本公开的这些修改和变动，只要这些修改和变动在所附权利要求及其等同方案的范围之内。

Claims (8)

1.一种细胞培养容器，其包括：
顶部、底部、侧壁和颈缩开口；
在容器的底部上的基材，其包括多个微腔体，所述多个微腔体中的每个微腔体包括孔穴开口和凹形孔穴底部；
成角度的凸缘，其围绕一部分的基材并以远离基材的方向延伸从而在凸缘的顶部限定周界；和
通道，所述通道围绕成角度的凸缘的外周界，从而在凸缘的外侧上围绕基材形成壕沟，
其中，凸缘具有毗邻该部分的基材的内面以及与该部分的基材相背的外面，该内面以垂直方向从基材向周界延伸，并且该外面以一角度从周界向基材延伸。
2.如权利要求1所述的细胞培养容器，其中，所述基材固定于容器的底部。
3.如权利要求1所述的细胞培养容器，其中，所述基材与容器的底表面是一体的。
4.如权利要求1所述的细胞培养容器，其中，所述凸缘的外面是从周界向通道的基底成角度的。
5.如权利要求2所述的细胞培养容器，其中，所述凸缘的外面是从周界向通道的基底成角度的。
6.如权利要求3所述的细胞培养容器，其中，所述凸缘的外面是从周界向通道的基底成角度的。
7.一种在如权利要求1所述的细胞培养容器中培养细胞的方法，其包括：
使液体沉积到细胞培养容器中并且在凸缘的颈部侧上；
用液体填充容器直到液体溢过凸缘到包括多个微腔体的基材上；以及
在所述多个微腔体中培养细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其还包括：
在培养后，倾斜细胞培养容器以使细胞液体积聚在通道中；
将收集端口插入到容器的孔中并使用收集端口从通道移除液体。
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